JP2003526791A - エポキシドポリマーの表面 - Google Patents
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Abstract
Description
支持表面に関する。発明の背景 支持表面上へのデオキシリボ核酸(DNA)の固定化は、DNA分析の微細成形アレイ
の開発を含め、DNAに基づく分析評価システム開発の重要な観点になっている。
たとえば、「The Development of Microfabricated Arrays of DNA Sequencing
and Analysis」、O’Donnell-Maloneyら、TIBTECH 14:401-407(1996)を参照。
一般に、こうした方法は、マイクロウエル・プレート、チューブ、ビーズ、顕微
鏡スライド、シリコン・ウエハー又は膜の表面で行われる。
ガラスにポリリシンを被覆し、次にDNAを塗布し、そして紫外線を照射しポリリ
シン上にDNAを光により架橋させる(たとえば、Schena M,Shalon D,Heller R,Cha
i A,Brown PO,Davis RW「Parallel Human Genome Analysis :Microarray-based
Expression Monitoring of 1000Genes」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA93(20):1
0614-9(1996)を参照)。この方法の1つの欠点として、紫外線で架橋すると、固定
に極めて都合の悪い、望ましくないDNAの損傷を引き起こす。この方法のもう1つ
の欠点は、紫外線にて架橋されると、cDNA’s及びPCR産生物(そして合成によっ
て典型的に形成され有意的に短い核酸で、「オリゴヌクレオチド」と称するもの
と対照的に)から提供されるように、有意的に長い核酸(たとえば、約100-mers以
上)に対し制限される傾向がある。紫外線照射で誘発される損傷の可能性が非常
に大きく、そして/又は固定化程度が不十分なため、有意的に短い核酸を使用で
きない。しかしながら、紫外線で架橋された場合でも、有意的に長い核酸の集団
が、通常、正確にハイブリットダイズできるに損傷のない充分な領域を提供し得
る。
的わずかしか見受けられなかった。マイクロウエル・プレート上にオリゴヌクレ
オチドを固定するこうした生成物の1つは、「NucleoLinkTM」として知られてお
り、Nalge Nunc International(たとえばNunc Teck Note vol.3,No17を参照)か
ら入手できる。この生成物では、DNAをカルボジイミドと反応させ、5’のリン酸
基を活性化させ、次にその表面の官能基と反応させる。この方法の欠点は、カル
ボジイミド試薬の添加という特別な工程、及びDNAの固定に反応時間を5時間必要
とし、それが1つのタイプの基材材料に限定されることである。
tion-Reacti-BindTMDNA Coating Solutions」1/1997を参照)として知られた商品
名のDNA固定製品を導入した。この製品を、DNAとの混合溶液として、ポリスチレ
ンやポリプロピレンなどの表面に塗布する。一昼夜インキュベート後、溶液を取
り出して、その表面を緩衝液で洗浄し、そして乾燥し、その後ハイブリット化を
準備する。本製品に関し文献には、実験に使用される全てのプラスチック表面に
共通して有用であると記載されているが、それには幾つかの制限がある。たとえ
ば、出願人には、製造業者の示す指示事項を用いて、ポリプロピレン上にDNAの
有効な固定が実証できなかった。さらにこの製品には、大量のDNAが必要である
。こうした指示事項には、DNAが、0.5と5μg/mlの濃度で使用すべきことを示唆
している。
照」)のウエル表面にDNAを結合させる際に使用するため、コーニング社(Corning
)は、DNA-BINDTMと称する製品を販売した。このDNA-BINDTMの表面は、非電荷で
、非重合性、低分子量のN-オキシコハク酸イミド(NOS)反応基を含むヘテロ2官能
試薬により被覆されている。この基が、一級アミンなどの求核試薬と反応する。
ヘテロ2官能性被覆試薬は、ポリスチレン・プレートの表面に反応基を共有結合
させる光化学反応基及びスペーサ・アームも含む。次にアミン修飾されたDNAが
、NOS表面と共有結合できる。新生オリゴマーに合成過程中か、酵素的に配列の
前調製中のいずれかの過程で、一級アミンを添加することによりDNAが修飾され
る。DNA-BINDTM製品が、ポリスチレン・ベースであるから、こうした熱サイクリ
ングなど温度上昇の必要な適用例には、使用が制限される。コーニング社(Corni
ng)は、アミノシランで被覆したスライド・ガラスを、CMT-GAPSTMという商品名
で販売しており、それは、マイクロアレイ(microarray)にDNA固定のため、ポリ
リシン被覆スライドと同じ手順を使用する。
アミノ・シラン被覆スライドを販売した。検出に蛍光が用いられると、アルデヒ
ド・シラン被覆スライドは、極めて高いバックグラウンドを有する。これらは、
固定を安定化させるために追加的な還元工程も必要である。
るアミン反応性エステル基を含む親水性ポリマーから成る被覆スライド・ガラス
を、商品名3D-LinkTMとして導入した。最良の結果を得るために、この製品は、
固定化されるDNAのアミン修飾も必要である。しかしながら、予期されるように
、反応性エステル基は、加水分解に不安定な傾向があり、アレイの時間の量的な
制限があり、プリントする場合、ほぼ8時間を過ぎるとなんらかの性能を失うこ
とがある。
基の役割が、記載されてきた。たとえば、Shiらの米国特許第5,919,626号では、
シラン化固相表面に未修飾核酸の結合を記載している。この方法は、ガラス表面
上にOH基とシロキサンとの結合を形成し、その表面に結合するメルカプト・シラ
ンやエポキシ・シランなど従来の非重合試薬の使用を含む。
o Medical Devices Surfaces」)を参照、それは、組織や本体の流動体と接触す
るため、改良した生物適応性を与えるため、医薬装置の表面に固定される生物分
子の被覆形成方法を提供する。こうした方法の1つは、置換のないアミン成分を
含む生物分子をアミン官能基材料に転化して、そのアミン官能基材料との化学的
結合の形成できる化学成分(たとえば、その化学成分が、アミン官能材料と化学
的な結合形成ができるアルデヒド成分、エポキシ成分、イソシアナート成分、リ
ン酸成分、硫黄成分、又はカルボキシル成分など)を含む医学装置生物材料表面
とアミン官能基材料と組み合わせ、二つの材料をたがいに結合させて、医学装置
生物材料の表面上に固定した生物分子を形成できる。本特許に有用であるとして
記載された生物分子の一連の文献中に含まれるものには、「DNAセグメント、RNA
セグメント、核酸」などがある。
が、DNA抗体の免疫吸着剤としてDNAの固定にエピクロロヒドリン又はビスオキシ
ラン(共にエポキシ基を提供する)にて活性化セファローズ(Sepharoses)の使用を
記載している。Wheatleyら、J.Chromatog.A726:77-90(1996)及びPotuzakら、Nuc
l.Acids Res.5:297-303(1978)も参照。
損傷(架橋放射に暴露させることによる)及び誘導化されない核酸及び/又は有意
的に短い核酸セグメントを固定化できるなどの特性の最適な組み合わせを提供す
ることが、市販の製品はもとより、先行技術における記載が見受けられない。さ
らに現段階で入手できる製品がないか、誘導される形状か、誘導されない形状の
両方はもちろん、短い核酸か、長い核酸のいずれかの固定に適応され、そして表
面の固定に適したポリマー・ペンダント・エポキシ基の使用できることを提供す
るか、又は示唆する先行技術としての記載が見受けられない。
特に光反応基、たとえば支持表面にポリマー及び他の分子を結合させるための種
々の応用例がこれまで記載している。米国特許第4,722,906号、同4,979,959同5,
217,492,同5,512,329,同5,563,056,同5,637,460,同5,714,360,同5,741,551,
同5,744,515,同5,783,502,同5,858,653,及び同5,942,555を参照。
ウエハー、ビーズ又は膜などの基材表面への標的分子の共有結合方法、及び共有
的結合のためのエポキシを基盤とする試薬組成物を提供する。好ましい例におい
て、その方法及び組成物が、顕微鏡スライド上に核酸プローブを固定化するため
、たとえばDNAマイクロアレイ(microarray)にプリントするために使用される。
本発明の方法及び試薬は、誘導化されているか(たとえばアミン誘導体)又は誘導
化されていない(すなわちエポキシ基と熱化学的反応のため添加される基を持た
ない)核酸のいずれかの共有結合による固定化のために使用可能であり、特に誘
導化されていない核酸には有用である。本発明の固定方法は、実施に極めて都合
の良いものである。好ましい例において、本方法は、本発明の試薬による支持体
の被覆、核酸アレイのプリンテング、多湿な環境でのスライドのインキュベート
、過剰なエポキシ基のブロッキング、及びスライドの洗浄を含み、その後のハイ
ブリット・アッセイを行う。
温度依存の反応速度を有する反応基)を含む試薬を使用して、基材表面に標的分
子を共有結合させる包括的な方法及び試薬組成物を記載している。適した反応基
は、N-オキシコハク酸イミド(「NOS」)、エポキサイド、アズラクトン(azlacton
e)、活性化ヒドロキシル基、及びマレイミド基から成る群から選択される。
てさらなる試料及びこうしたエポキシを基盤とする試薬の使用に関する利点を提
供する。こうした利点は、たとえば、特許出願USSN09/227,913に記載のようにア
ミン又は他の反応基を含むように誘導されるDNAに加えて、誘導化されていないD
NAに結合させるための試薬を使用できること含む。こうした利点は、たとえばNO
S基と比較して、エポキシドで実証される改良された耐加水分解性も含む。
生物分子の固定方法を提供し、この方法は、 a)表面を有する固体支持体を提供する工程、 b)1又は複数のエポキシ基を含み、そして所望により1又は複数の光反応基
も含む試薬を提供する工程、 c)支持表面に試薬を被覆する工程(たとえば、光反応基の活性化により支持
表面にポリマー試薬を共有結合させる) d)対応する熱化学反応基を有する生物ポリマーを提供する工程、 e)結合したエポキシ基と対応する反応基とを反応させることで、その支持表
面に生物ポリマーを結合させる工程、 f)所望により残留エポキシ基をブロックする工程(たとえば、アミン試薬を
用いて)、及び g) 意図される目的のため、たとえば核酸など生物分子の固定化のため、生
成物の被覆支持表面を使用する工程、 を含む方法。
ー)が、これまで用いられた方法を介するDNA固定化に対し幾つかの利点があるこ
とを、出願者が見出した。たとえば、シランで修飾されたスライド・ガラス上に
被覆される場合、これらのポリマーが、誘導体化されていないDNAの固定化の改
良方法を提供する。したがって、これらの試薬を使用する場合、アミンや他の官
能基にてDNAを修飾させることが、必ずしも必要でない。さらに、エポキシ基は
、アミン反応性エステル基より加水分解に対して有意的に安定である。ポリリシ
ン又はアミノシラン上にDNAを紫外線で架橋させることと比較すると、本発明の
被覆表面は、使用に対してより都合良く、傾向として望ましくない副反応をほと
んど生じることがなく使用に対してより都合良く、、これによりDNAの修飾が有
意的に少ない結果となる。
懸架する1又は複数のエポキシド基(「オキシラン」としても知られている)を好
適に提供する。所望により、そして好ましくは、試薬組成物が、1又は複数のペ
ンダント光反応基も提供できる。光反応基(photoreactive groups)(別に本明細
書において「光基(photogroups)」とも言及されている)を、光など適切なエネル
ギー源をかけて、支持表面に試薬分子を結合させるために使用してもよい。さら
に、エポキシ基を用いて、標的分子上の適切な官能基と共有結合を形成できる。
法で提供できる。こうした例において、試薬組成物を、基材表面への標的分子の
結合のため使用でき、そして、試薬に標的分子を引き寄せる1又は複数の反応基
,及び引き寄せられた標的分子上に対応する官能基との共有結合を形成する1又
は複数のエポキシ基を含んでいる。所望により、こうした組成物が、表面に組成
物を結合する際使用する光反応基をさらに提供する。たとえば、1つの実施例に
おいて、複数の光反応基及び複数のイオン基(たとえば陽イオン基)を親水性ポリ
マー骨格に結合させる。次にこのポリマーを、標的分子の固定化のため上記エポ
キシ基を提供する第二のポリマー骨格と同時に固定化できる。適切なイオン基に
は、4級アンモニウム塩、プロトン化3級アミン、及びホスホニウム化合物など他
の陽イオン基を含む。また、酸性環境下に置かれたとき、プロトン化できる3級
アミン基も含まれている。4級アンモニウム塩は、[3−(メタクリロイルアミノ
)プロピル]トリメチルアンモニウム・クロライド(MAPTAC)などを有するキル4級
アンモニウム化合物、及びピリジニウム化合物など芳香族4級アンモニウム基を
含んでいる。
イドなどのモノマーから調製されるポリマーを含み、J.Appl.Polymer Sci.53:12
37(1994)に記載され、その開示内容を引例としても組み込まれている。
せる方法をさらに提供する。次に、本発明は、こうした試薬で結合される核酸な
どの標的分子を有する表面、及びこうした表面を提供する材料(たとえば、顕微
鏡スライド)を提供する。
結合ポリマーと隣接して結合できるような適切な条件下で、標的分子(たとえば
核酸など)を結合試薬と接触させる。標的分子が、結合試薬の反応基と標的分子
の適切な官能基との間の反応によって、結合試薬に熱化学的に結合される。
の標的分子の結合方法を提供する。本明細書で使用する場合、本発明の記載に関
して、「オリゴヌクレオチド」(又は「オリゴ」)という語句は、合成による核酸
(酵素材料より調製されたものと対照的に)に対し言うべきであり、そして酵素
材料的に形成されたcDNA又はPCR産生物より通常有意的に短い(100-merのオーダ
かそれ以下の)ものを言うべきである。次に、「核酸」という語句は、全ての産
生物を集合的に示している。
うした表面を提供する材料(たとえばスライド又はマイクロウエル・プレート)を
提供する。さらに別な観点において、本発明は、試薬の熱化学反応基と反応する
1又は複数の官能基を含む標的分子との組み合わせて、本発明の試薬を含む組成
物を提供する。
するため適合される1又は複数のペンダント・エポキシ基を生成する親水性ポリ
マー,及び試薬と標的分子との間の反応前、反応中、反応後のいずれかにより、
表面に試薬を結合させるため、使用されるよう適応された1又は複数のペンダン
ト光反応基も生成する親水性ポリマーを含む。所望により、組成物は、ペンダン
ト・イオン基などを有するポリマーなど、試薬ポリマー成分に加えて,他の成分
を含むことができる。
さらには標的分子を固定することできる。たとえば、被覆される材料の表面に、
熱化学的な反応基を具えることができ、それが、上記エポキシ基を有する親水性
ポリマーを固定化するために使用できる。たとえば、表面をアンモニアプラズマ
により処理し、材料表面上に反応性アミン数を限定して導入してもよい。次にこ
の表面が、エポキシ基を有する親水性ポリマーにより処理されると、そのポリマ
ーを、その表面のアミンとエポキシ基との反応により固定することができる。核
酸配列と結合できるための十分な数の反応基は、以下の固定化を確実に維持する
ために、ポリマーのエポキシ基の濃度を、表面上のアミン濃度より十分に過剰に
することが好ましい。重合体の骨格が、合成か天然のいずれかによる生成でもよ
いが、エポキシ・モノマーと付加、又は縮合重合から得られる希釈物又は他のモ
ノマーとの合成によるコポリマーが好ましい。多糖類やポリペプチドなど天然か
ら生成ポリマーを同様に用いることができる。
使用に対して有害である生物的機能を提供しないという点において、生物学的に
不活性であることが好ましい。
エチル・アクリレイト、ヒドロキシルエチル・メタクリレイト、グリセリルアク
リレイト、グリセリル・メタクリレイトなどのアクリル類;アクリルアミド、メ
タクリルアミド、及びアクリル・モルホリンなどのアクリルアミド誘導体を含む
。他の合成ポリマーは、ポリビニル・ピロリドン及びポリビニル・アルコールな
どのビニール類;ポリカプロラクタム、ポリラウリル・ラクタム、ポリヘキサメ
チレン・アジポアミド及びポリヘキサメチレン・ドデカンジアミドなどのナイロ
ン類;ポリウレタン及びポリエチレン・オキサイド及びその組み合わせ、又はそ
のコポリマーを含め、本明細書記載の方法によりペンダントエポキシ基を含むよ
う合成することができる。
基の所望する平均数を生ずる親水性ポリマーを含むことが好ましく,その組み合
わせは、選択される試薬に依存する。エポキシド・モノマーは、重合体の骨格と
エポキシ基との間を所望する有効な空間を与えるため選択することもできる。こ
の方法で試薬が、表面又は隣接する試薬分子に結合でき、最適な活性を示すため
に、充分に自由な動きを他の反応基に提供することができる。希釈剤としてのコ
モノマーは、親水性(たとえば水溶性)が好ましく、アクリルアミド及びビニルピ
ロリドンが特に好ましい。
クリレート、アリルグリシジルエーテル及びグリシジルビニルエーテルなどのモ
ノマーから調製できる。有用なモノマーが、種々の資源、たとえばグリシジルア
クリレート、 (Pfaltz & Bauer Chemicals,cat.#G03480),グリシジルメタクリレ
ート(Aldrich cat.#15,123-8), アリルグリシジルエーテル(Aldrich,cat#A3,260
-8),グリシジルビニルエーテル(Aldrich,cat.#45,865-1),及びグリシジルビニル
ベンジルエーテル(Aldrich cat.#45,867-8)から入手可能である。
リレイトとの反応によっても生成できる。エポキシポリマーが、エピクロロヒド
リンとヒドロキシルポリマー(たとえばポリヒドロキシルプロピルアクリルアミ
ド)との反応によっても調製できる。他のエポキシモノマー及びポリマーは、当
業者により作成され、種々の長さと、種々の極性を備えたスペーサを有すること
ができる。適切なモノマーの他の例は、米国特許第5763,629号に記載されている
。
ーとを反応させることによっても合成できる。現段階では、1,4-ブタンジオルジ
グリシジル・エーテルとセファローズ(Sepharose)・ゲル・ビーズとを反応させ
ることにより生成されるエポキシ活性のセファローズ(Sepharose)が、利用可能
(Sigma)である。これか又は他のジエポキシド、(たとえば、エチレン・グリコル
ジグリシジル・エーテル、ジエポキシオクタン又はジエポキシデカン)が、ポリ
エポキサイドの作成のためにアミン又はヒドロキシルポリマーのいずれかにより
誘導体化するために使用できる。たとえば、ポリヒドロキシプロピルアクリルア
ミド又は光モノマーを含むコポリマーを、過剰な1,4-ブタンジオルジグリシジル
・エーテルと反応させて、後に表面を固定化できるポリエポキシドの生成ができ
る。
ましくは以下の群:
ないDNAを共有結合方式により固定化するため使用することができ、そしてシト
シン及びアデニンなどのプリン及びピリミジン環のアミン基、又ヒドロキシル末
端基との反応機構に起因するものと考えられれることが明らかになであろう。
在的なペンダント反応基(好ましくは光反応性)を移送する。光化学反応基が、本
明細において画定され、そして好ましい反応基は、こうした特性を保持する条件
下で貯蔵するには十分安定性がある。これらの開示は、本明細書に文献として組
み入れられている開示文献とて、たとえば、米国特許第5,002,582号を参照。電
気磁気スペクトラムの種々の地点に応答する潜在性反応基を、選択することがで
き、紫外部や可視部のスペクトルに応答(本明細書に「光化学反応性」と記載さ
れる)するものが特に好ましい。
ことになり、その生成物が、たとえば同じか又は異なる分子によって提供される
ように、隣接する化学構造体に共有結合する。光反応基が、蓄積(storage)状態
の下では変化せず共有結合を保持するが、外部エネルギー源での活性化により他
の分子と共有結合を形成する分子中の原子におけるこれらの反応基である。
磁気エネルギーの吸収によるケトンの励起状態を生成する。光化学反応基は、電
気磁気スペクトルの種々の部位に対し応答性を有するよう選択でき、たとえば、
紫外部及び可視部スペクトルに応答性を有する光反応基が好ましく、そして「光
化学基(photochemical group)又は「光基(photogroup)」として本明細書にしば
しば言及されている。
ノン、アントロン、及びアントロン様複素環(すなわち10の部位にN,O又はSを有
するものなど複素環のアントロン類似物)、あるいはそれらの(たとえば置換を受
けた環)置換誘導体などが好ましい。こうしたケトンの官能基が好ましい、その
理由は、本明細書記載の活性化/不活性化/再活性化のサイクルを容易に受けるこ
とができるからである。ベンゾフェノンが、特に好ましい光反応成分であり、そ
の理由は、最初に一重項の励起状態を形成し三重項状態に項間交差を受ける一重
項の励起状態を最初に形成し、光化学的に励起することができる。この励起され
た三重項状態を、水素原子の引き抜きにより(たとえば支持表面から)炭素−水素
結合に挿入することがで、したがって遊離対を生成する。その後遊離対が崩れる
と、新たな炭素-炭素結合を形成する。反応による結合(たとえば炭素−水素)が
、結合のため利用できないと、紫外線で誘発されるベンゾフェノン基の励起は、
可逆的であり、その分子がエネルギー源の取り出しにより、基底状態のエネルギ
ー準位に戻る。ベンゾフェノン及びアセトフェノンなどの光活性化アリール・ケ
トンは、これらの反応基が水中で複数の反応を受け、そのため被覆効率の増大を
もたらすから、特に重要である。そのため、光反応性アリール・ケトンが特に好
ましい。
び特に4-フルオロ-3-ニトロフェニル・アジドなどのアリールアジド(C6R5N3)
、ベンゾイル・アジド及びp-メチルベンゾイル・アジドなどのアシル・アジド類
(-CO-N3)、エチル・アジドフォルメイト、フェニル・アジドフォルメイトなど
のアジド・フォルメイト類(−O-CO-N3),ベンゼン・スルフォニル・アジドなど
のスルフォニル・アジド(-SO2-N3),及びジフェニル・フォスフォリル・アジ
ド及びジエチル・フォスフォリル・アジドなどのフォスフォリル・アジド類((RO
)2PON3を含む。ジアゾ化合物が光反応基の別の種別を構成し、ジアゾメタン及
びジフェニル・ジアゾメタンなどのジアゾアルカン(-CHN2)、ジアゾアセトフェ
ノン及び1-トリフルオロメチル-1-ジアゾ-2-ペンタノンなどのジアゾケトン類(-
CO-CHN2)、t-ブチル・ジアゾアセテート及びフェニル・ジアゾアセテートなど
のジアゾアセテート類(-O-CO-CHN2)、及びt-ブチル・アルファ・ジアゾアセト
アセテートなどのベーターケト・アルファ・ジアゾアセテート(-CO-CN2-CO-O-)
を含む。他の光反応基は、3-トリフルオロ-3-フェニルジアジリンなどのジアジ
リン類(-CHN2)、及びケテン及びジフェニルケテンなどのケテン類(-CH=C=O)を
含む。ベンゾフェノン及びアセトフェノンなどの光活性となり得るアリール・ケ
トンが、これらの反応基が水中で複数の再活性化を受け、そのため被覆効率の増
大をもたらすことから、特に重要である。
反応基の残基を介し共有結合によって材料表面に共有結合される。例示的な光反
応基、及び活性化によるこれらの残基を以下に示す。
用して、調製することができる。2,2’アゾビス・イソブチルロニトリル(AIBN)
などのアゾ重合開始剤又はベンゾイルパーオキサイドなどの過酸化物を用い、エ
ポキシモノマー及びコモノマーは、ビニル基の遊離ラジカル重合を受けることが
好ましい。重合化のために選択されるコモノマーは、最終的なポリマー生成物の
性質に基づいて選択される。たとえば、エポキシ基を含んでいる光反応性ポリマ
ーは、光反応基を含む1又は複数のモノマー、及びエポキシ基を含む1又は複数
の第二のモノマーを含むモノマー混合体の使用により調製することができる。本
発明のエポキシ官能化重合試薬が、予め形成されたポリマーの適切な誘導化によ
り調製でき、又はより好ましくは所望の置換パターンを与えるために1組のコモ
ノマーの重合化により所望の置換パターンを得ることができる。コモノマーを種
々の割合に変えることが容易であり、ポリマーへの組み込みレベルを制御できる
ことで、後者の方法が好ましい。
きる。典型的には、エポキシ・モノマーが、重合化反応の総モノマー含量のうち
比較的低いモルパーセントの光モノマーから成る組成物の残留物、及び核酸配列
に対し光反応性も、熱化学的な反応性もないモノマーの残留物と共に使用される
。こうしたモノマーの例は、アクリルアミド、アクリル酸、及びN-ビニルピロリ
ドンを含むがそれに限定されない。使用モノマーの相対的な反応性により、骨格
に沿ったモノマーの分布が、非常に無作為である。
エポキシ・モノマー(より好ましくは約10モル%と約20モル%との間);約0.1モル%
と約5モル%との間の光モノマー(より好ましくは0.5モル%と約2モル%)、他のモノ
マーよりの残留物(100モル%に対して)より形成される。
前処理されたシリコン、水素化シリコン又はプラスチックなど、基材表面に標的
分子を共有結合方法及びそのための試薬組成物を提供する。1つの実施例におい
て、方法及び組成物は、マイクロウエル・プレートなどのプラスチック材料上に
核酸プローブ固定のため、たとえば、ハイブリダイゼーション評価法の使用に用
いられる。好ましい例において、方法及び組成物を、有機シランによる前処理ガ
ラス、有機シランによる前処理シリコン、水素化シリコン又はプラスチックから
(たとえば、ポリメチルメタクリレイト、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポ
リエチレン又はポリプロピレン)で提供されたものなど実質的に平らな表面か、
型成形された表面での使用に適応される。次に試薬組成物が、生物分子(たとえ
ば核酸)などの標的分子を共有結合するために使用でき、さらにその生物分子が
特異的な結合反応(たとえば、核酸をその相補鎖にハイブリダイズするため)のた
め使用できる。
ポリエチレン、ポリプロピレン、アセタール樹脂、ナイロン、及び熱可塑性ポリ
エステル)及び非晶質熱可塑性樹脂(ポリカーボネート及びポリメチルメタクリレ
イト)から成る群から選択されるプラスチック材料を含むがそれに限定されない
種々の材料から調製される。適切なプラスチック又はガラス材料が、剛性、表面
の均一性、長期間に対する耐変形性、熱に対する耐劣化性などの所望の特性を組
み合わせて提供される。
される特定物質の固定方法を提供し、その方法は、以下の工程を含み、すなわち
: a)表面を有する固体支持体を提供する工程、 b)1又は複数のエポキシ基を含み,そして所望による1又は複数の光反応基
も含む試薬を提供する工程、 c)支持表面上に試薬を被覆して(たとえば、デップする、噴霧する、ロール
被覆又はナイフによる被覆)、そして支持表面に重合試薬、たとえば光反応基を
活性にすることによる共有結合する工程、 d)1又は複数の対応する熱化学反応基(たとえば、アミン、ヒドロキシル、
スルフィドリル)を有する生物ポリマー(たとえば核酸、タンパク質、多糖類)を
提供する工程、 e)結合したエポキシ基とその対応する反応基とを反応させることによる、支
持体に生物ポリマーを結合させる工程、 f)残っている未反応エポキシ基(たとえばアミン試薬の使用による)を所望に
よりブロックする工程、及び g)その意図する目的のため、たとえばハイブリット化に(たとえばアレイ用
スライド上、又はマイクロプレート・ウエルにおいて)使用のため、核酸など生
物分子を固定するために、生成物の被覆支持表面を使用する工程、を含んでいる
。
する、その方法は、 a)標的分子上に対応する官能基と共有結合の形成に適応される1又は複数の
ペンダントエポキシ基を有する重合体の骨格を含む試薬組成物を提供する工程、 b)基材表面に試薬組成物を被覆及び固定する工程、 c)試薬組成物によって提供される対応するエポキシ基と熱化学的に反応性を
有する1又は複数の官能基を有し、標的分子を含む溶液を提供する工程、 d)基材面の表面上に所定量の溶液(たとえば、試料の微小容量のスポットに
おいて個別に分離された形成において)を塗布する工程、 e)試薬組成物により提供されるエポキシ基が、表面に標的分子を結合させる
ため、標的分子により提供される対応する官能基と共有結合を形成できるよう適
切な条件下で組み合わせてインキュベートする工程、を含んでいる。
使用するため、試薬が、 i)試薬被覆表面にスポットを個別に分離された形に、塗布されるよう標的分
子を含む溶液の微量試料を可能にすること ii)官能基とエポキシ基との間を反応させることにより結合試薬に試料容量中
に存在する標的分子が共有結合できること、 iii)スポットの周辺領域に量標的分子の検知可能な過剰量ではなく、実質的
に全ての未結合な標的分子をそのスポットが洗浄可能にする方法で表面の被覆、
及び固定化されるよう適応される。
リ性のpH(たとえば、150mMのリン酸緩衝液、pH8.5)の溶液にエポキシポリマー被
覆表面に塗布することが好ましい。最適に結合することが、高湿度 (たとえば相
対湿度が約75%)の表面にてインキュベートにより実現でき、それは、(室温で飽
和NaClを含む)密封した貯蔵ボックス内に表面を数時間又は、最も好ましくは一
昼夜置くことにより実現できる。次に過剰な未結合エポキシ基を、エタノールア
ミン50mM、及びドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含む溶液にて、0.1Mのトリス緩
衝液、pH9、50℃で30分間ブロックした。次に、その表面を脱イオン水でリンス
し、0.1%SDSを含む4Xの標準のクエン酸生理食塩水(「SSC」)(0.6MのNaCl+0.06M
のクエン酸ナトリウム)にて、50℃で約15から約60分間洗浄した。次にその表面
を脱イオン水でリンスし、遠心分離にてスピン乾燥した。
ブ(capture probes) (たとえばオリゴヌクレオチド又はcDNA)を結合させるため
に使用する場合、そのスポット生成には、一般的にアレイ中におけるスポットを
中心から中心間隔が約200μmから約500μm有するように形成するため適応され
るプリンテング・ピンを用いて、こうした捕捉プローブ(capture probes)が、ス
ポット当り約1ナノリットル以下の容量で表面に放出させる。溶液からDNAを結
合させることと違って,被覆されたマイクロプレート・ウエルの表面上にて、ア
レイ中に極めて微小サイズのスポットにプリントされた核酸は、早く乾燥する傾
向があり、これにより変数に変化を与え、核酸が支持部と接触し、そしてその指
示部を結合する方法に影響を与える。プリンテング・ピンの設計及び取り扱いに
加えてその他の要因としては、塩濃度、塩の型、及びプリンテング緩衝液中の湿
潤剤;表面の疎水性/親水性の特性;核酸のサイズ及び/又は濃度;及び環境の乾
燥性を含めスポット・サイズ及び/又は最終的ハイブリット化信号にも影響を及
ぼす可能性もある。
試薬組成物を有する、前記活性化したスライドの調製に使用することができる。
そのスライドは、保存に対して安定性があり、誘導化されないか、又はアミンで
誘導化されたDNAを固定することによるマイクロアレイの調製のために、より後
の期日まで使用できる。表面に捕獲DNAを結合させることが、湿度の高い環境下
において、pHを8-9にして行ない、次にDNA溶液を微小スポット形状にしてプリン
トする。
テング・ロボット(たとえば,Cartesianから入手可能)及びマイクロ・スポッテ
ング・デバイス(たとえば、Tele International社から入手可能な)などの装置
を用いて、マイクロアレイを調製する場合従来の(たとえば、アミノをシリル化
した)スライド・ガラスを取り換えるに特に適している。適切なスポッテング装
置、及びその方法が、「ArrayIt」TMChipMaker3のスポッテング装置など商業的
に入手可能である。この生成物が、48のプリンテング・ピンを用いて、固体基材
(たとえば、1インチx3インチの標準スライド)当り62,000もの試料を誘導する
、初期マイクロ・スポッテング技術の改定版を表すと言われる。
と組み合せて、使用することは、技術的に十分に知られている。たとえば、米国
特許第5,087,522号(Brownら)「Methods for Fabricating Microarrays of Biolo
gical Samples」、及び引用された本明細書の文献を参照、その各開示内容は文
献により本明細書に組み入れられている。
材を提供し、その表面を1又は複数のマイクロアレイを有するようにする。それ
ぞれのマイクロアレイが、少なくとも10/cm2(及び好ましくは、標的分子(たと
えば、ポリヌクレオチド又はポリペプチド生物ポリマー))の少なくとも約100/cm 2 の識別可能性の提供が好ましい。各はっきり識別できる標的分子とは1)、ア
レイ中の画定位置に別々に配置され、2)は、少なくとも10のサブユニットの長
さを有し、3)は、約50アトモルと約10ナノモルとの間の画定量で存在する、及
び4)は、約0.01から約100ナノリッターの容量範囲で選択された容量で配置さ
れる。アレイ内にあるこれらの領域(たとえば、個々別々のスポット)は、一般的
に形状が円形であり、典型的な形が約75ミクロンと約1000ミクロンとの間にあり
(そして、好ましくは約100と約200ミクロンとの間)にて可能である。この領域は
、同じ距離だけ(たとえば中心から中心間隔まで約100ミクロンから約1000ミクロ
ン)アレイの他の領域から隔てていることも好ましい。複数の分析する物特定領
域は、各領域が単一、そして好ましくは相違することの好ましい分析物特定試薬
(「標的分子」)を含むよう提供することができる。
物を識別及び選択ができるであろう。標的分子は、プラスミドDNA,コスミドDNA
,発現された配列タグ(ESTs),バクテリオファージDNA,ゲノムDNA(イースト菌
、ウイルス、細菌、哺乳動物、昆虫を含むがそれに限定されない)、RNA,相補DNA
(cDNA)、ペプチド核酸(PNA),及びオリゴヌクレオチドを含むがそれに限定され
ない。
本発明の精神を逸脱することなく、記載された実施例において作成可能なことが
、当業者にも明らかであろう。従って、本発明の範囲が、請求項の言語の記載に
より実施例及びこれらの実施例に等価なものばかりか、本出願記載の実施例に限
定されるべきでない。別の指示のない限り、全てのパーセントは、重量パーセン
トである。こうした例全体にわたって明示される種々の「化合物」の構造が、以
下に含まれる化合物表1−3より見出だすことができる。
ートン・フラスコ(Morton flask)に、4-ベンゾイル安息香酸(BBA)(1.0kg(4.42
モル))を加え,その後塩化チオニル645ml(8.84モル)とトルエン725mlとを添加し
た。次にジメチルホルムアミド3.5mlを加え、その混合物を還流式に4時間加熱し
た。冷却後溶媒を減圧下により除去し、トルエン3×500mlを用いた3回の蒸発処
理により、残留塩化チオニルを除去した。その生成物をトルエン:ヘキサンの比
1:4にて再結晶し、オーブンで真空乾燥後、988g(91%の収率)を得た。生成物の
融点が92-94℃であった。80MHz(1H NMR(CDCl3))での核磁気共鳴(NMR)分析
では、所望の生成物、すなわち芳香族プロトン7.20-8.25(m、9H)と一致した。総
化学シフト値は、テトラメチルシラン内部標準からppm下降領域(downfield)であ
る。最終化合物が、たとえば、実施例3記載の光活性化(photoactivatable)ポリ
マー合成に使用されるモノマー調製の使用に貯蔵された。
1910g(25.77モル)を、12リットルのモートン・フラスコ(Morton Flask)に添
加し、氷浴上に冷却した。次いで、ジクロルエタン250ml中、t-ブチル・フェニ
ル・カルボネート1000g(5.15モル)溶液を、反応温度を15℃以下に維持する速
度で、滴下により添加した。添加後その混合物を室温に加温し、2時間攪拌した
。その反応混合物を、ジクロロメタン900mlと氷500g中にて希釈し、次に2.2Nの
水酸化ナトリウム2500mlをゆっくり加えた。溶液が塩基性であることの確認試験
後、その生成物を分液漏斗に移し、有機層を取り出し、別に抽出物#1として保
持した。次に水溶液層を、ジクロロメタン1250mlで3回抽出し、各抽出物を別々
の画分として保持した。次に4つの有機抽出物を、0.6N水酸化ナトリウムの単一
として1250ml部により、画分#1から始め、画分#4まで順次継続して洗浄を進めた
。この洗浄手順を、新しい1250ml部の0.6Nの水酸化ナトリウムにより2回繰り返
した。次にその有機抽出物を混合し、硫酸ナトリウムにより乾燥させた。溶媒を
一定重量にろ過、及び蒸発処理をして、さらに精製することなく使用されるN-モ
ノ-t-BOC-1,3-ジアミノプロパン825gを得た。 クロロホルム1020ml中、メタクリル酸無水物806g(5.23モル)溶液を、オーバヘ
ッド撹拌器を備えた12リットルのモートン・フラスコ(Morton Flask)中に入れ
、氷浴上にて冷却した。フェノチアジン60mgを抑制剤として添加し、次にクロロ
ホルム825ml中、N-モノ-t-BOC-1,3-ジアミノプロパン825g(4.73モル)を滴下によ
り添加した。添加速度を制御し、常時反応温度を10℃以下に維持した。添加が完
了した後、氷浴槽を取り出し、その混合物をその状態において一昼夜攪拌した。
その生成物を水2400mlにて希釈し、分液漏斗に移した。全体をよく混合した後、
水溶液層が塩基性であると適切でないため、水溶液層を取り出し、そして有機層
を2N水酸化ナトリウム2400mlにて洗浄した。次に有機層を硫酸ナトリウム上で乾
燥させ、ろ過により乾燥剤を除去した。生成物と溶媒との混合重量が約3000gに
なるまで、1部のクロロホルム溶媒を、減圧下で除去した。次に、所望の生成物
を、攪拌によるクロロホルム溶液中に11.0リットルのヘキサンをゆっくり添加し
て析出させ、その後4℃で1昼夜保存した。その生成物をろ過で単離し、固形物を
、ヘキサン900mlとクロロホルム150mlとの混合溶液で2回リンスした。固形物を
十分乾燥させて、N−[N’−(t−ブチルオキシカルボニル)−3−アミノプ
ロピル]−メタクリルアミド900gを得、DSCで融点(m.p.)が85.8℃であった。NMR
分光器による分析では、所望の生成物と一致した、すなわち1H NMR(CDCl3)ア
ミドNH’s6.30-6.80,4.55-5.10(m,2H),ビニル・プロトン5.65,5.20(m,2H),N
に隣接するメチレン2.90-3.45(m、4H)、メチル1.95(m、3H)、残っているメチレ
ン1.50-1.90(m、2H)、及びt-ブチル1.4(s、9H)、であった。
チューブが具備された。メタノール700mlをそのフラスコに加え、氷浴上にて冷
却した。攪拌しながら、HClガスを、その溶媒中に、総計40分間に約5リットル/
分の速度で導入(bubbled)した。最終HCL/MeOHの重量モル濃度を、指示薬として
フェノールフタレンを用い、1N水酸化ナトリウムの滴定することにより、8.5M
であると決定した。N−[N’−(t−ブチルオキシカルボニル)−3−アミノ
プロピル]−メタクリルアミド900gを、オーバヘッド撹拌器とガス排出用アダプ
ターを備えた5リットルのモートン・フラスコ(Morton Flask)中に加え、次にメ
タノール溶媒1150mlを加えた。固形物の幾つかが、フラスコの溶媒中に残ってい
た。フェノチアジン30mgを、抑制剤として添加し、次に8.5MのHCl/MeOH溶液655m
l(5.57モル)を添加した。その固形物質がガスの放出に伴いゆっくりと溶解した
が、その反応物が発熱性でなかった。その混合物を室温で1昼夜攪拌し、確実に
反応が完了するようにした。次に、どの固形物もろ過で取り出し、30mgのフェノ
チアジン添加物を加えた。次にその溶媒を、減圧下で除去し、得られた固形残留
物を、減圧下の蒸発乾固体を伴い3X1000mlのイソプロパノールにより共沸処理し
た。最終的に、その生成物を、還流状態のイソプロパノール2000ml中に溶解し、
酢酸エチル、4000mlを攪拌しながらゆっくりと加えた。その混合物をゆっくり冷
却して、4℃で1昼夜保存した。化合物IIをろ過により分離し、一定の重量になる
まで乾燥し、生成物630gを得て、DSCによる融点が124.7℃であった。NMR分光器
による分析では、所望の生成物と一致した、すなわち1H NMR(D2O) ビニル・
プロトン5.60,5.30(m,2H),アミドNに隣接するメチレン3.30(t、2H)、アミンNに
隣接するメチレン2.95(t,2H),メチル1.90(m、3H)、残っているメチレン1.65-2
.10(m、2H)である。最終化合物を、たとえば実施例3記載のように光活性可能ポ
リマーの合成に使用されるモノマー調製に使用するため保存した。
オーバヘッド攪拌器を備え、乾燥させた2リットルの3首丸底フラスコに加えた。
フェノチアジン23-25mgを抑制剤として加え、次にクロオホルム800mlを添加した
。懸濁液を、氷浴上により10℃以下に冷却し、実施例1記載の一般的な方法によ
り調製の化合物I172.5g(0.705モル)を、固形物として加えた。クロロホルム50m
l中に、トリエチルアミン207ml(1.485モル)を、1-1.5時間にわたり滴下により添
加した。その氷浴を取り出し、周囲温度で2.5時間続けて攪拌した。次に生成物
を、0.3NのHCL600ml,と0.07NのHCl2x300mlにより洗浄した。硫酸ナトリウムに
より乾燥後、クロロホルムを減圧下において除去し、そして各生成物を、重合化
の防止のために各再結晶化中にフェノチアジン23-25mgを使用し、トルエン対ク
ロロホルム比を4:1にて2回再結晶させた。化合物III の典型的な収率が90%、融
点が147-151℃であった。NMR分光器による分析では、所望の生成物と一致した、
すなわち1H NMR(CDCl3)芳香族プロトン7.2-7.95(m、9H)、アミドNH6.55(ブロ
ード(broad)t,1H),ビニル・プロトン5.65,5.25(m,2H),アミドに隣接するメ
チレン N’s3.2-3.60(m,4H)、メチル1.95(s、3H)、残っているメチレン1.50-2.0
0(m、2H)である。最終化合物を、たとえば実施例5及び6記載のように光活性可能
ポリマーの合成に使用するため貯蔵した。
、グリシドル(0.50ml、7.51mモル)及びトリエチルアミン(50μl,0.27mモル)を
加えた。この反応物を、室温にて一昼夜攪拌した。生成物をシリカ・ゲルカラム
上で精製し、そしてその構造を、NMRで確認した。収率が293mg(18収量)であった
。
ス(spaced)ポキシド・モノマー(化合物IV)(273μl,1.28mモル)とをテトラヒド
ロフラン(THF)15.6ml中に溶解した。この溶解のために、2,2’-アゾビスイソブ
チルニトリル(AIBN)34mlとN,N,N’, N’-テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)
16μlを加えた。その溶液をヘリウムで4分間スパージし、その後アルゴンを上部
空間部に加え、その後しっかりと蓋を閉めて、オーブン内を55℃にして一昼夜置
いた。析出ポリマーを含む反応混合物を遠心分離にかけ、浮遊物を傾斜沈降(dec
anted)させた。残留物を、新しいTHF20mlで再懸濁、遠心分離、傾斜沈降(decant
ed)処理した。これを繰り返した後、ろ過し、さらにTHF10mlづつ2回でポリマー
を洗浄した。ポリマーを、真空下で一定重量になるまで乾燥した。収量は1.477g
mであった。
’-アゾビス(2−メチルブチロニトリル)(「VAZO67」,0.262gm,1.4mモル)を、
THF108ml中に溶解した。この溶液中に、メタクリル酸グリシジル2.4ml(17.7mモ
ル)を加えた。この溶液をヘリウムにより4分間、次にアルゴンで4分間スパージ
し、その後しっかりと蓋を閉めて、混合しながら61℃で一昼夜加熱した。そのポ
リマーをろ過により採集し、次にメタノール中にて懸濁し、混合し、その後再度
ろ過により採集し、そしてクロロホルムで洗浄して,次にオーブンを30℃で真空
乾燥した。
shire)は、アセトン中各1%のp-トリルジメチルクロロシラン(T-Silane)とN-デシ
ルジメチルクロロシラン(D-Silane,United Chemical Technologies,Bristol
,Pennsylvania)との混合物中に、1分間デップしてシラン処理してある。
そのスライドをアセトンにて洗浄し、脱イオン(DI)水によりデップした。さらに
そのスライドをオーブン中で5-10分間乾燥した。
持しながらDymaxランプ(10nmのバンドの国際光放射計上フィルタを通して335nm
に計測されたように25mジュール/cm2)を用いて照射し、水により洗浄し、乾燥
させた。
及び使用 アクチン、グルコース・リン酸塩の脱水素酵素(GPDH)又はβ-ガラクトシター
ゼ遺伝子から誘導されたPCR産生物が、ChipMaker2のマイクロアレイ(microarray
)スポッテング・ピン(Telechem international)を位置決めするためにX,Y,Z移
動制御装置を用い、0.15M、0.1mg/mlのリン酸緩衝液中によりスライド上にプリ
ントされた。そのスライドは、実施例7のように光PA-ポリエポキシドにより被覆
されたものか、公開方法(米国特許第5,087522号(Brounら)「生物学的な試料とし
てのマイクロアレイ(microarray)の成形方法」及び本明細書に引用された文献を
参照)で調製されたポリリシン・スライドかのいずれかである。プリントされた
エポキシド・スライドを、室温で、相対湿度75%にして一昼夜インキュベートし
た。プリントされたポリリシンスライドは、紫外線(UV)で架橋されたものである
。プリント後、エポキシドスライドを、pH9.0の0.1Mのトリス緩衝液中、エタノ
ールアミン50mMによりブロックしそして洗浄した。β-ガラクトシターゼ・mRNA
により1:250,000にてスパイクされるか、プパイクされないかのいずれかの、Cy5
の標識化した総RNAにより、両タイプのスライドをハイブリッドした。次にこの
スライドをレザー・スキャナーにより走査してCy5の蛍光強度を測定した。
び使用 ChipMaker2マイクロアレイ(microarray)スポッテング・ピン(Telechem inter
national)を位置決めするためX,Y,Z移動制御装置を用い、アミン化されているか
、アミン化されていないかいずれかのオリゴヌクレオチドを、0.15Mのリン酸緩
衝液中0.8μMにより、スライド上にプリントした。そのスライドを、実施例7の
ように光PA-ポリエポキシドを用いるか、同じ方法による光-PA-PolyNOSか、公開
方法(実施例8の文献を参照)によるポリリシンのいずれかを用いて被覆した。プ
リントされたエポキシド、及びNOSのスライドを、室温で、相対湿度を75%にして
一昼夜インキュベートした。プリントされたポリリシン・スライドを、公開方法
により進めた。このスライドを走査し、固定された捕獲オリゴ(oligos)のCy3蛍
光強度を測定し、次に捕獲オリゴに対し相補的なCy5により標識化されたオリゴ
ヌクレオチド(1pモル/スライド)を41℃で1昼夜ハイブリダイズした。そのスライ
ドをレザー・スキャナーにより走査して、ハイブリダイズされたオリゴの蛍光強
度を測定した。アミン−シランのスライドにより固定された捕獲オリゴ(capture
oligo)量が、極めて少ないため、これらは、ハイブリット化されていない。
、好ましくは以下の群:
くは以下の群:
選択される非干渉ラジカルである]のものによって、 希釈モノマー又はポリマーが、アクリル、ビニル、ナイロン、ポリウレタン及
びポリエーテルからなる群から選択され、 前記コポリマーがアリールケトンからなる群より選択される1つまたは複数の
ペンダント光反応基をさらに含み、 核酸が誘導されないオリゴヌクレオチドを含み、 前記表面が、有機シランによる前処理ガラス、有機シランによる前処理シリ
コン、水素化ケイ素またはプラスチックから形成されたスライドの表面を含み、 前記マイクロアレイ(microarray)が、長さが少なくとも10ヌクレオチド有す
る少なくとも10/cm2の識別可能な核酸を提供し、前記各核酸が、個別分離され
た領域に50アトモルと約10ナノモルとの間の画定量でスポットされ、そして前
記領域が、おおよそ円形であり、約75ミクロンと約1000ミクロンとの間の径を有
し、アレイにおける中心そばの他の領域から中心に、約100ミクロンから約1000
ミクロンの中心空間に分離されている、 請求項25記載のマイクロアレイ(microarray)。
Claims (28)
- 【請求項1】 基材表面に標的分子を結合させるための試薬組成物であって
、その表面に対し共有結合に適した重合体、及び標的分子上の対応する官能基と
の共有結合の形成に適した1又は複数のペンダントエポキシ基を含む試薬組成物
。 - 【請求項2】 前記試薬が、グリシジルメタクリレート、メタクリル酸グリ
シジル、アリルグリシジル(allylglycidyl)エーテル及びビニルグリシジルエー
テルの群から選択される一又は複数のモノマーの重合化で形成されるポリマーを
含む請求項1記載の試薬組成物。 - 【請求項3】 前記試薬が、一般式の1又は複数のモノマーの重合化により
形成されるポリマーを含み、次に一般式: 【化1】 [式中、R1はCH3又はHのいずれかであり、そしてXは下記の非干渉性ラジ
カル、好ましくは以下の基; 【化2】 (式中、m=2-6及びn=1-10); 【化3】 (式中、n=1-10); 【化4】 (式中、m=0又は1、及び); 【化5】 (式中、m=1-20及びn=1-10)、 から選択される基]のものである請求項1記載の試薬組成物。 - 【請求項4】 前記試薬組成物が、ジエポキシドとヒドロキシル又はアミン
含有ポリマーとの反応による合成ポリマーを含む請求項1記載の試薬組成物。 - 【請求項5】 前記標的分子が核酸を含み、その表面が、有機シランによる
前処理ガラス、有機シランによる前処理シリコン、水素化ケイ素又はプラスチッ
クから形成された支持体の表面を含む請求項1記載の試薬組成物。 - 【請求項6】 前記核酸が、誘導体化されていない核酸を含む請求項5記載
の試薬組成物。 - 【請求項7】 前記誘導体化されていない核酸がオリゴヌクレオチドを含む
請求項6記載の試薬組成物。 - 【請求項8】 前記組成物が、適切な資源からエネルギーをかけて表面に試
薬組成物を共有結合させる光反応基を含む1又は複数の潜在性反応基をさらに含
む請求項1記載の試薬組成物。 - 【請求項9】 前記標的分子が核酸であり、そして前記光反応基が、光反応
性アリール・ケトンなら成る群から選択される請求項8記載の試薬組成物。 - 【請求項10】 重合体骨格が、アクリル樹脂、ビニル、ナイロン、ポリウ
レタン及びポリエーテルからなる群から選択され、そして、前記骨格が、アリー
ル・ケトン類から成る群から選択される1又は複数のペンダント光反応基をさら
に含む請求項1記載の試薬組成物。 - 【請求項11】 標的分子を基材表面に結合させる方法であって、その方法
が: a) 請求項1記載の試薬組成物を提供する工程、 b) 基材表面上に試薬組成物を被覆し、固定化する工程、 c) 試薬組成物で提供される対応するエポキシ基と熱化学的な反応性を有する
1又は複数の官能基を有する標的分子を含む溶液を提供する工程、 d) 基材表面に所定量の溶液を塗布する工程、及び e) 標的分子を前記表面に結合させるため、標的分子により提供される対応す
る官能基と、試薬組成物により提供されるエポキシ基とを、共有結合の形成でき
るようにする工程、 を含む方法。 - 【請求項12】 前記試薬が、グリシジルアクリレート、グリシジルメタク
リレート、アリルグリシジルエーテル及びビニルグリシジル・エーテルの群から
選択される1又は複数のモノマーの重合化により形成されるポリマーを含む請求
項11記載の方法。 - 【請求項13】 前記試薬が、一般式の1又は複数の重合化により形成され
るノマーを含み、下記一般式: 【化6】 [式中、R1はCH3又はHのいずれかであり、そしてXは非干渉ラジカル、好
ましくは以下の群: 【化7】 (式中、m=2-6及びn=1-10); 【化8】 (式中、n=1-10); 【化9】 (式中m=0又は1、及び); 【化10】 (式中、m=1-20及びn=1-10)、 から選択される非干渉ラジカルである]のものである請求項11記載の方法。 - 【請求項14】 前記試薬組成物が、ジエポキシドとヒドロキシル又はアミ
ン含有ポリマーとを反応させて、合成されるポリマーを含む請求項11記載の方法
。 - 【請求項15】 前記標的分子が核酸を含み、そして上記表面が、有機シラ
ンによる前処理ガラス、有機シランによる前処理シリコン、水素化ケイ素又はプ
ラスチックから形成される支持の表面を含む請求項11記載の方法。 - 【請求項16】 前記核酸が、誘導体化されていない核酸を含む請求項15記
載の方法。 - 【請求項17】 前記誘導体化されていない核酸が、オリゴヌクレオチドを
含む請求項16記載の方法。 - 【請求項18】 前記組成物が、適切な資源からエネルギーをかけて表面に
試薬組成物を結合させるために光反応基を含む1又は複数の潜在反応基をさらに
含む請求項11記載の方法。 - 【請求項19】 前記方法が、有機シランによる前処理ガラス、有機シラン
による前処理シリコン、水素化ケイ素又はプラスチックから形成されたスライド
の表面上による核酸の1又は複数のマイクロアレイ(microarray)の調製に用いら
れ、そして各マイクロアレイ(microarray)が、長さが少なくとも10ヌクレオチド
を有する少なくとも約10/cm2の識別可能な核酸を提供し、前記核酸が、それぞ
れ個別に分離した領域で、50アトモルと約10ナノモルとの間の画定量で、スポッ
トされる請求項11記載の方法。 - 【請求項20】 前記領域が、おおよそ円形であり、75ミクロンと1000ミク
ロンとの間の径を有し、アレイにおける中心そばの他の領域から、中心まで約10
0ミクロンから約1000ミクロンの間隔で離れている請求項19記載の方法。 - 【請求項21】 請求項1記載の試薬組成物の結合残基に被覆された平坦な
支持表面を含む活性化スライド。 - 【請求項22】 スライドをマイクロアレイ(microarray)成形のために適合
されており、その標的分子が核酸を含み、その表面が、有機シランによる前処理
ガラス、有機シランによる前処理シリコン、水素化ケイ素又はプラスチックから
形成されるスライド表面を含む請求項21記載の活性化スライド。 - 【請求項23】 前記スライドが、少なくとも10ヌクレオチドの長さを有す
る、少なくとも10/cm2の識別可能な核酸を提供し、その各核酸が、個別に分離
された領域で、そして、50アトモルと約10ナノモルとの間の画定量でスポットさ
れる請求項21記載の活性化スライド。 - 【請求項24】 前記領域が、おおよそ円形で約75ミクロンと約1000ミクロ
ンとの間の径を有し、アレイにおける中心そばの他の領域から、中心まで約100
ミクロンから約1000ミクロンの間隔を有する請求項23記載の活性化スライド。 - 【請求項25】 以下の方法を含む調製されたマイクロアレイ(microarray)
であって、すなわち a) 請求項1記載の試薬組成物を提供する工程、 b) 基材表面上に試薬組成物を被覆し、固定する工程、 c) 試薬組成物により提供される対応するエポキシ基と熱化学的な反応性を有
する1又は複数の官能基を有する標的分子を含む溶液を提供する工程、 d)溶液の1又は複数の個別に分離された小容量の溶液試料のスポットを基材の
表面に塗布する工程、及び e) 標的分子を上記表面に結合させるため、試薬組成物により提供されるエポ
キシ基が、標的分子により提供される対応する官能基と共有結合の形成できるよ
うにする工程、 を含む方法により調製されたマイクロアレイ(microarray)。 - 【請求項26】 前記マイクロアレイ(microarray)が、少なくとも10ヌクレ
オチドの長さを有し、少なくと約10/cm2の識別可能な核酸を提供し、上記各核
酸が、個別に分離された領域で、そして約50アトモルと約10ナノモルとの間の画
定量でスポットされる請求項25記載のマイクロアレイ(microarray)。 - 【請求項27】 上記領域が、おおよそ円形で約75ミクロンと約1000ミクロ
ンとの間の径を有し、アレイにおける中心そばの別領域から、中心まで約100ミ
クロンから約1000ミクロンの間隔で離れている請求項26記載のマイクロアレイ
(microarray)。 - 【請求項28】 前記試薬が、一般式の1又は複数のモノマーを重合化する
ことにより形成されるポリマーを含み、下記の一般式: 【化11】 式中、R1はCH3又はHのいずれかであり、そしてXは非干渉ラジカル、好ま
しくは群: 【化12】 (式中、m=2-6及びn=1-10); 【化13】 (式中、n=1-10); 【化14】 (式中、m=0又は1、及び); 【化15】 (式中、m=1-20及びn=1-10)、 又は、ジエポキシドとヒドロキシル又はアミン含有ポリマーとの反応から選択さ
れる非干渉ラジカルである]のものによる、 重合体の骨格が、アクリル、ビニル、ナイロン、ポリウレタン及びポリエーテ
ルからなる群から選択され、 前記骨格が、アリール・ケトンから成る群より選択される1又は複数のペンダ
ト光反応基を含み、 核酸が誘導されないオリゴヌクレオチドを含み、 その表面が、有機シランによる前処理ガラス、有機シランによる前処理シリコ
ン、水素化ケイ素又はプラスチックから形成されたスライドの表面を含み、 マイクロアレイ(microarray)が、少なくとも10ヌクレオチドの長さを有する少
なくとも10/cm2識別可能な核酸を提供し、その各核酸が、別領域に50アトモル
と約10ナノモルとの間の画定量でスポットされ、 そして上記領域が、おおよそ円形であり、約75ミクロンと約1000ミクロンとの
間の径を有し、アレイにおける中心そばの他の領域から中心に、約100ミクロン
から約1000ミクロン空間に分離されている、 請求項25記載のマイクロアレイ(microarray)。
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