JP2003526344A5

JP2003526344A5 -

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Publication number: JP2003526344A5
Application number: JP2001561783A
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Filing date: 2001-02-22
Publication date: 2008-04-17
Anticipated expiration: 2021-02-22

Description

【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸テンプレート鎖上で所望の核酸鎖を合成する加ピロリン酸分解活性化重合（ＰＡＰ）方法であって、以下のステップ：
（ａ）非伸長可能３’末端があり、３’末端又はその近くにテンプレート鎖上の対応するヌクレオチドとミスマッチするヌクレオチドがない相補的活性化可能オリゴヌクレオチドＰ^＊を、オリゴヌクレオチドＰ^＊がアニールする場合に、非伸長可能３’末端がテンプレート鎖とハイブリダイズするように、テンプレート鎖とアニーリングすること、
（ｂ）加リン酸分解活性があり、ハイブリダイズした非伸長可能３’末端を除去してオリゴヌクレオチドＰ^＊を活性化する酵素及びピロホスファターゼを用いて、結果として生じた二本鎖を加ピロリン酸分解すること、及び
（ｃ）４のヌクレオシド三リン酸及び核酸ポリメラーゼの存在下で、テンプレート鎖上の活性化オリゴヌクレオチドＰ^＊を伸長させて重合し、所望の核酸鎖を合成すること、
を連続的に含む、前記方法。
【請求項２】
請求項１記載の加ピロリン酸分解活性化重合方法であって、以下のステップ：
（ｄ）テンプレート鎖からステップ（ｃ）の所望の核酸鎖を分離すること；及び
（ｅ）所望の核酸鎖の増幅の所望のレベルが達成されるまでステップ（ａ）〜（ｄ）を繰り返すこと、
によって所望の核酸鎖を増幅することを含む、前記方法。
【請求項３】
請求項２記載の加ピロリン酸分解活性化重合方法であって、増幅が指数関数的になるように、ステップ（ａ）で、ステップ（ｄ）の分離された所望の核酸鎖産生物とアニールする第２のオリゴヌクレオチドの存在下で実行され、ここでステップ（ｃ）が、所望の核酸鎖上で第２のオリゴヌクレオチドを伸長することにより重合して核酸テンプレート鎖のコピーを合成することを含み、ステップ（ｄ）が、所望の核酸鎖から合成された核酸テンプレート鎖を分離することを含む、前記方法。
【請求項４】
ステップ（ａ）〜（ｃ）が、サーモサイクラー上で２又はそれ以上の温度ステージで連続的に行われる、請求項２又は３記載の加ピロリン酸分解活性化重合方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）〜（ｃ）が、サーモサイクラー上で１の温度ステージで行われる、請求項２又は３記載の加ピロリン酸分解活性化重合方法。
【請求項６】
アリル特異的増幅に適用される請求項２〜４の加ピロリン酸分解活性化重合方法であって、核酸テンプレート鎖が前記テンプレート鎖とは異なる第２のアリル核酸鎖との混合物中に存在し、ステップ（ａ）で、オリゴヌクレオチドＰ^＊の非伸長可能３’末端がアリル鎖とはハイブリダイズしないように、活性化可能オリゴヌクレオチドＰ^＊にはアリル鎖の対応するヌクレオチドをミスマッチする少なくとも１のヌクレオチドが３’末端又はその近くにあり；及び従って、ステップ（ｂ）で、ピロリン酸及び加ピロリン酸分解活性がある酵素は活性化可能オリゴヌクレオチドＰ^＊からハイブリダイズしなかった非伸長可能３’末端を実質的には除去せず；ステップ（ｃ）で、オリゴヌクレオチドＰ^＊はアリル鎖上の重合では実質的には伸長せず、それによってテンプレート鎖上で合成される所望の核酸鎖はアリル鎖上合成されるあらゆる核酸鎖よりも選択的に増幅される、前記方法。
【請求項７】
活性化可能オリゴヌクレオチドＰ^＊及びテンプレート鎖の間のミスマッチが、非伸長可能３’末端又は非伸長可能３’末端から最初若しくは２番目のヌクレオチドで起こる、請求項６記載の加ピロリン酸分解活性化重合方法。
【請求項８】
活性化可能オリゴヌクレオチドＰ^＊及びテンプレート鎖の間のミスマッチが、非伸長可能３’末端で起こる、請求項６記載の加ピロリン酸分解活性化重合方法。
【請求項９】
所望の核酸鎖、テンプレート鎖、及びアリル鎖がＤＮＡ鎖であり、活性化可能オリゴヌクレオチドＰ^＊が２’−デオキシオリゴヌクレオチドであり、３’末端のデオキシヌクレオチドが非伸長可能末端であり、４のヌクレオシド三リン酸が２’−デオキシヌクレオシド三リン酸であり、及び核酸ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼである、請求項６〜８のいずれか１項記載の加ピロリン酸分解活性化重合方法。
【請求項１０】
所望の核酸鎖、テンプレート鎖、及びアリル鎖がＤＮＡ鎖であり、活性化可能オリゴヌクレオチドＰ^＊及び第２のオリゴヌクレオチドの両方が２’−デオキシオリゴヌクレオチドであり、３’末端のデオキシヌクレオチドが非伸長可能３’末端であり、４のヌクレオシド三リン酸が２’−デオキシヌクレオシド三リン酸であり、核酸ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼである、請求項６〜８のいずれか１項記載の加ピロリン酸分解活性化重合方法。
【請求項１１】
Ｐ^＊はｎ＞３の長さのヌクレオチドである３’特異的部分配列があり、そのテンプレート鎖に対する１つ又はそれ以上のミスマッチが３’特異的部分配列内に位置する場合はＰ^＊は実質的に増幅されないが、３’特異的部分配列内に完全にマッチするテンプレート鎖ではＰ^＊は実質的に増幅される、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
３’特異的部分配列におけるミスマッチが、Ｐ^＊の３’末端の１６ヌクレオチド以内である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ＰＡＰが、１のＰ^＊又は２のオリゴヌクレオチドで適用される、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
異なる３’特異的部分配列を備えるＰ^＊のセットがＰＡＰに適用される、２のＤＮＡ配列を比較するための又は遺伝子発現プロファイリングをモニターするための、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
各々のＰ^＊に３’特異的部分配列がある、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
Ｐ^＊のセットが異なる３’特異的部分配列には不完全である、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
Ｐ^＊のセットを用いた特異的ＰＡＰ増幅のリストが記録されて、そして核酸のテンプレート鎖に相補的なＤＮＡ配列が３’特異的部分配列を整理することにより決定される、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
ＰＡＰが、１のＰ^＊又は２のオリゴヌクレオチドを用いて適用される、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
野生型アリルとの混合物中に存在する変異アリルの指数関数的増幅のための加ピロリン酸分解活性化重合方法であって、アリルごとの一本鎖ＤＮＡを作製すること、アリルごとに１の一本鎖ＤＮＡをテンプレート鎖とし、他方を相補鎖とすること、次に以下のステップ、
（ａ）非伸長可能３’末端があり、３’末端又はその近くに変異アリルのテンプレート鎖上で２’−デオキシヌクレオチドとミスマッチする２’−デオキシヌクレオチドはないが、３’末端又はその近くに野生型アリルのテンプレート鎖上で対応する２’−デオキシヌクレオチドとミスマッチする少なくとも１の２’−デオキシヌクレオチドがある相補的な活性化可能２’−デオキシオリゴヌクレオチドＰ^＊と各アリルのテンプレート鎖が、２’−デオキシオリゴヌクレオチドＰ^＊がアニーリングする場合、非伸長可能３’末端が変異体テンプレート鎖とはハイブリダイズするが、野生型テンプレート鎖とはハイブリダイズしないように、アニーリングすると同時に、活性化可能２’−デオキシオリゴヌクレオチドＰ^＊及び第２の２’−デオキシオリゴヌクレオチドが増幅すべき遺伝子の領域に隣接する、第２の相補的２’−デオキシオリゴヌクレオチドと各アリルの相補鎖がアニーリングすること；
（ｂ）ハイブリダイズした非伸長可能３’末端を除去して２’−デオキシオリゴヌクレオチドＰ^＊を活性化する加リン酸分解活性がある酵素及びピロリン酸を用いて、変異体テンプレート鎖にアニールする活性化可能２’−デオキシオリゴヌクレオチドＰ^＊を加ピロリン酸分解すること、及び
（ｃ）４のヌクレオシド三リン酸及びＤＮＡポリメラーゼの存在下で変異体テンプレート鎖上で活性化オリゴヌクレオチドＰ^＊を伸長すると同時に変異体及び野生型の相補鎖上で第２の２’−デオキシオリゴヌクレオチドを伸長することにより、重合すること、及び、
（ｄ）ステップ（ｃ）の伸長産生物を分離すること；及び
（ｅ）変異アリルの指数関数的増幅が所望のレベルに達するまでステップ（ａ）〜（ｄ）を繰り返すこと、
を連続的に含む、前記方法。
【請求項２０】
活性化可能２’−デオキシオリゴヌクレオチドＰ^＊及び野生型テンプレート鎖のミスマッチが、非伸長可能３’末端又は非伸長可能３’末端から最初若しくは２番目の２’−デオキシヌクレオチドで起こる、請求項１９記載の加ピロリン酸分解活性化重合方法。
【請求項２１】
活性化可能２’−デオキシオリゴヌクレオチドＰ^＊及び野生型テンプレート鎖のミスマッチが、非伸長可能３’末端で起こる、請求項２０の加ピロリン酸分解活性化重合方法。
【請求項２２】
活性化可能２’−デオキシオリゴヌクレオチドＰ^＊がアリルの相補鎖にアニールし、第２の２’−デオキシオリゴヌクレオチドがテンプレート鎖にアニールする、請求項１９〜２１のいずれか１項記載の加ピロリン酸分解活性化重合方法。
【請求項２３】
（ａ）オリゴヌクレオチドＰ^＊がアニールする場合に、３’末端のヌクレオチドがテンプレート鎖とハイブリダイズするように、非伸長可能３’末端があるがテンプレート鎖上で対応するヌクレオチドとミスマッチするヌクレオチドが３’末端又はその近くにない相補的な活性化可能２’−オリゴヌクレオチドＰ^＊とテンプレート核酸鎖がアニールすること、
（ｂ）ハイブリダイズした３’末端のヌクレオチドを除去することによりオリゴヌクレオチドＰ^＊を活性化する加リン酸分解活性がある酵素及びピロリン酸を用いて、結果として生じた二本鎖を加ピロリン酸分解すること、及び
（ｃ）非伸長可能３’−デオキシヌクレオシド三リン酸及び核酸ポリメラーゼの存在下でテンプレート鎖上で活性化オリゴヌクレオチドＰ^＊を伸長すること、
を連続的に含む、加ピロリン酸分解活性化重合方法。
【請求項２４】
ステップ（ｃ）で、活性化オリゴヌクレオチドＰ^＊が非伸長可能２’，３’−ジデオキシヌクレオシド三リン酸及び４の２’−デオキシ−ヌクレオシド三リン酸の混合物の存在下で伸長する、請求項２３記載の加ピロリン酸分解活性化重合方法。
【請求項２５】
ステップ（ｃ）で、活性化オリゴヌクレオチドＰ^＊が非伸長可能３’−デオキシヌクレオシド三リン酸及び４のヌクレオシド三リン酸の混合物の存在下で伸長する、請求項２３記載の加ピロリン酸分解活性化重合方法。
【請求項２６】
加ピロリン酸分解活性化重合（ＰＡＰ）により核酸配列中の未知の配列変異体のスキャンニング又は核酸中の所定の配列を再度配列決定する方法であって、
（ａ）テンプレート鎖が非伸長可能３’末端と相補的な場合は非伸長可能３’末端がテンプレート鎖とハイブリダイズし、セットの数が配列中のヌクレオチドの数に一致するように、ハイブリダイゼーション条件下で、前記テンプレート鎖とハイブリダイズするのに十分に相補的であるが、各セット内で異なる非伸長可能３’末端がある点で互いに異なる、４の活性化可能オリゴヌクレオチドＰ^＊の複数セットを核酸のテンプレート鎖と混合すること；
（ｂ）テンプレート鎖にハイブリダイズする非伸長可能３’末端があるオリゴヌクレオチドＰ^＊のみを加ピロリン酸分解で活性化する加リン酸分解活性がある酵素及びピロリン酸を用いて、結果として生じた二本鎖を処理すること、
（ｃ）４のヌクレオシド三リン酸及び１の核酸ポリメラーゼの存在下でテンプレート鎖上で活性化オリゴヌクレオチドＰ^＊を伸長することにより重合すること、
（ｄ）ステップ（ｃ）で合成された核酸鎖をテンプレート鎖から分離すること、
（ｅ）増幅が所定のレベルに達するまでステップ（ａ）〜（ｄ）を繰り返すこと、及び
（ｆ）増幅をもたらしたオリゴヌクレオチドＰ^＊の重複を解析することにより順に核酸鎖を整理すること、
を含む、前記方法。
【請求項２７】
ヌクレオチド三リン酸が単一ヌクレオチド伸長のためのＤＮＡポリメラーゼの基質としての、ジデオキシヌクレオチド三リン酸である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
３’末端ヌクレオチドが野生型の塩基又は３つの可能性のある単一塩基置換の１つと対応する１のＰ^＊がある、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
３’末端にｄｄＡＭＰ、ｄｄＴＭＰ、ｄｄＧＭＰあるいはｄｄＣＭＰのいずれかが野生型の塩基及び３つの可能性のある単一塩基置換と対応すること以外は同一な配列である４のＰ^＊がある、請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
４のＰ^＊が単一スポット上で固定される、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
Ｐ^＊のセットを用いた特異的ＰＡＰ増幅のリストを記録して、そして次に核酸のテンプレート鎖に相補的なＤＮＡ配列を、ワトソン−クリック対法則を用いて再構築する、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
ＰＡＰが１のＰ^＊又は２のオリゴヌクレオチドを用いて適用される、請求項２９記載の方法。
【請求項３３】
加ピロリン酸分解活性化重合（ＰＡＰ）により核酸の配列をｄｅｎｏｖｏに決定する方法であって、
（ａ）ヌクレオチドが全て同数のｎ個でありヌクレオチドがｎ個である全ての可能性のある配列から集合的に構成され、全てが非伸長可能３’末端であり、それにより十分に相補的なオリゴヌクレオチドＰ^＊のいずれかがテンプレート鎖とハイブリダイズし、テンプレート鎖が３’末端の対応する位置で相補的である場合にのみ、非伸長可能３’末端がテンプレート鎖とハイブリダイズするような、複数の活性化可能オリゴヌクレオチドＰ^＊を核酸のテンプレート鎖とハイブリダイゼーション条件下で混合すること、
（ｂ）テンプレート鎖にハイブリダイズする非伸長可能３’末端があるハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドＰ^＊のみを活性化する加リン酸分解活性がある酵素及びピロリン酸を用いて、ハイブリダイズした非伸長可能３’末端の加ピロリン酸分解により結果として生じた二本鎖を処理すること、
（ｃ）４のヌクレオシド三リン酸及び１の核酸ポリメラーゼの存在下でテンプレート鎖上で活性化オリゴヌクレオチドＰ^＊を伸長することにより重合すること、
（ｄ）ステップ（ｃ）で合成された核酸鎖をテンプレート鎖から分離すること、
（ｅ）増幅が所望のレベルに達するまでステップ（ａ）〜（ｄ）を繰り返すこと、及び
（ｆ）増幅をもたらしたオリゴヌクレオチドＰ^＊の配列を決定し、次にこれらのオリゴヌクレオチドの重複を解析することにより順に核酸鎖を整理すること、
を含む、前記方法。
【請求項３４】
ヌクレオチド三リン酸が単一ヌクレオチド伸長のためのＤＮＡポリメラーゼの基質としての、ジデオキシヌクレオチド三リン酸である、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
Ｐ ^＊の３’末端のジデオキシヌクレオチドが色素で標識された、請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
異なる３’特異的部分配列があるＰ^＊のセットがＰＡＰに適用される、請求項３３記載の方法。
【請求項３７】
各２の連続するＰ ^＊が、必要なＰ^＊の数を減らすために、
【数１】

と整理されて積み重ねられる、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
各Ｐ^＊に３’特異的部分配列がある、請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
Ｐ^＊のセットが異なる３’特異的部分配列の完全なセット又は異なる３’特異的部分配列の不完全なセットである、請求項３６記載の方法。
【請求項４０】
Ｐ^＊のセットを用いた特異的ＰＡＰ増幅のリストを記録して、そしてワトソン−クリック対法則を用いて３’特異的部分配列を整えることにより核酸のテンプレート鎖と相補的なＤＮＡ配列を再構築する、請求項３６記載の方法。
【請求項４１】
ＰＡＰが１若しくは２のＰ^＊又は２のオリゴヌクレオチドを用いて適用される、請求項３６記載の方法。
【請求項４２】
核酸テンプレート鎖上で所望の核酸鎖を合成する加ピロリン酸分解活性化重合（ＰＡＰ）方法であって、以下のステップ、
（ａ）非伸長可能３’末端があり、テンプレート鎖上の対応するヌクレオチドについて非伸長可能３’末端又は非伸長可能３’末端から最初若しくは２番目のヌクレオチドにミスマッチがある相補的活性化可能オリゴヌクレオチドＰ^＊をテンプレート鎖とアニーリングすること；
（ｂ）加リン酸分解活性があり、ハイブリダイズした非伸長可能３’末端ヌクレオチドを除去してオリゴヌクレオチドＰ^＊を活性化する酵素及びピロホスファターゼを用いて、結果として生じた二本鎖を加ピロリン酸分解すること、及び
（ｃ）４のヌクレオシド三リン酸及び１の核酸ポリメラーゼの存在下で、テンプレート鎖上の活性化オリゴヌクレオチドＰ^＊を伸長させることにより重合して、所望の核酸鎖を合成すること、
を連続的に含む、前記方法。
【請求項４３】
請求項４２記載の加ピロリン酸分解活性化重合方法であって、以下のステップ、
（ｄ）テンプレート鎖からステップ（ｃ）の所望の核酸鎖を分離すること、及び
（ｅ）所望の核酸鎖の増幅が所望のレベルに達するまでステップ（ａ）〜（ｄ）を繰り返すこと、
によって所望の核酸鎖を増幅することを含む、前記方法。
【請求項４４】
ステップ（ａ）で、ステップ（ｄ）で分離された所望の核酸鎖産生物にアニールする第２のオリゴヌクレオチドの存在下で実行される請求項４３記載の加ピロリン酸分解活性化重合方法であって、ここで増幅が指数関数的であるように、ステップ（ｃ）が、所望の核酸鎖上で第２のオリゴヌクレオチドを伸長することにより重合して、核酸テンプレート鎖のコピーを合成することを含み、ステップ（ｄ）が、所望の核酸鎖から合成された核酸テンプレート鎖を分離することを含む、前記方法。
【請求項４５】
活性化可能オリゴヌクレオチドＰ^＊及びテンプレート鎖のミスマッチが、末端３’−デオキシヌクレオチドで起こる、請求項４２〜４４のいずれか１項に記載の加ピロリン酸分解活性化重合方法。
【請求項４６】
ステップ（ａ）〜（ｃ）が、サーモサイクラー上で２又はそれ以上の温度ステージで連続的に行われる、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の加ピロリン酸分解活性化重合方法。
【請求項４７】
活性化可能オリゴヌクレオチドＰ^＊及びテンプレート鎖のミスマッチが、末端３’−デオキシヌクレオチドで起こる、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の加ピロリン酸分解活性化重合方法。
【請求項４８】
ステップ（ａ）〜（ｃ）が、サーモサイクラー上で１の温度ステージで行われる、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の加ピロリン酸分解活性化重合方法。
【請求項４９】
ステップ（ｃ）で用いられる核酸ポリメラーゼが、耐熱性のＴｆｌ若しくはＴａｑ、又は、ＡｍｐｌｉＴａｑＦＳ、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ及びＴａｑＦＳ中のＦ６６７Ｙ変異と同等の活性部位に変異を含むように改変されたＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される遺伝子操作されたＤＮＡポリメラーゼである、請求項１〜４８のいずれか１項記載の方法。
【請求項５０】
ＰＡＰ効率が亢進されるか、又はＰＡＰ効率がＰ^＊の３’末端でいかなる種類の非伸長可能３’末端に対してもあまり差異がない、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
ＤＮＡポリメラーゼがまた加ピロリン酸分解活性がある酵素である、請求項１〜５０のいずれか１項記載の加ピロリン酸分解活性化重合方法。
【請求項５２】
ＤＮＡポリメラーゼが、耐熱性のＴｆｌ若しくはＴａｑ、又は、ＡｍｐｌｉＴａｑＦＳ、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ又は、ＴａｑＦＳ中のＦ６６７Ｙ変異と同等の活性部位に変異を含むように改変されたＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される遺伝子操作されたＤＮＡポリメラーゼである、請求項５１記載の加ピロリン酸分解活性化重合方法。
【請求項５３】
非伸長可能３’末端が非伸長可能３’−デオキシヌクレオチドである、請求項１〜５２のいずれか１項記載の加ピロリン酸分解活性化重合方法。
【請求項５４】
Ｐ ^＊の非伸長可能３’末端で非伸長可能３’末端がジデオキシヌクレオチドか又はアシクロヌクレオチドである、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
非伸長可能３’−デオキシヌクレオチド三リン酸が放射性あるいは蛍光標識で標識される、請求項１〜５４のいずれか１項記載の加ピロリン酸分解活性化重合方法。
【請求項５６】
ジデオキシヌクレオチド三リン酸が色素で標識されている、請求項１〜５４のいずれか１項記載の加ピロリン酸分解活性化重合方法。
【請求項５７】
４のヌクレオシド三リン酸及び１の核酸ポリメラーゼの存在下で核酸テンプレート上でオリゴヌクレオチドを伸長することにより核酸を増幅する第２の反応と、除去しなければテンプレート上でオリゴヌクレオチドの伸長を妨げるような３’末端ブロックを除去することによりオリゴヌクレオチドを活性化する第１の反応の、２の反応の連続的な結合を含むプロセスであって、（ｉ）３’末端ブロックが前記オリゴヌクレオチドの３’末端が非伸長可能３’−デオキシヌクレオチドであり、３’末端ブロックが加ピロリン酸分解により除去されるか、又は、（ｉｉ）３’末端ブロックが非メチル化標的鎖とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド中のメチル化認識配列であり、３’末端ブロックがメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼ切断により除去される、前記プロセス。
【請求項５８】
メチル化エンドヌクレアーゼ認識配列がＧ^ｍＡＴＣである、請求項５７のプロセス。
【請求項５９】
制限エンドヌクレアーゼがＤｐｎＩである、請求項５８のプロセス。
【請求項６０】
核酸を検出する方法であって、以下のステップ：
（ａ）核酸とオリゴヌクレオチドＰ ^＊とアニーリングすることであって、オリゴヌクレオチドＰ ^＊には非伸長可能３’末端があり、オリゴヌクレオチドＰ ^＊の非伸長可能３’末端は加ピロリン酸分解により除去される；
（ｂ）オリゴヌクレオチドＰ ^＊の非伸長可能３’末端を加ピロリン酸分解により除去すること；及び
（ｃ）除去されたオリゴヌクレオチドＰ ^＊の非伸長可能３’末端を検出すること；
を含む、前記方法。
【請求項６１】
オリゴヌクレオチドＰ ^＊の非伸長可能３’末端が標識され、オリゴヌクレオチドＰ ^＊から除去された非伸長可能３’末端の検出をオリゴヌクレオチドＰ ^＊の標識が減少したことを検出することにより行う、請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
オリゴヌクレオチドＰ ^＊から除去された非伸長可能３’末端の検出を、
（ａ）ヌクレオチドを核酸ハイブリッドに組み込むことを触媒する酵素及び１又はそれ以上のヌクレオチドを用いてブロックされていないオリゴヌクレオチドを伸長すること；及び
（ｂ）伸長したオリゴヌクレオチドを検出することにより核酸の存在を検出すること；
により行う、請求項６０記載の方法。

（ｂ）ピロリン酸および加ピロリン酸分解活性を有する酵素を用いたアニールされた活性化可能オリゴヌクレオチドＰ^＊の加ピロリン酸分解。これは、ハイブリダイズされた末端３’−デオキシヌクレオチドの除去によりオリゴヌクレオチドＰ^＊を活性化する。

（b）ピロリン酸および加ピロリン酸分解活性を有する酵素を用いた、変異鎖に対してアニールされる活性化可能2'-デオキシオリゴヌクレオチドP^*の加ピロリン酸分解。これは、ハイブリダイズした末端2',3'-デオキシヌクレオチドを除去することにより変異鎖に対してアニールされる2'-デオキシオリゴヌクレオチドP^*を活性化する。それは、変異鎖に対してアニールされる2'-デオキシオリゴヌクレオチドP^*を実質的には活性化しない。なぜなら非ハイブリダイズ末端2',3'-デオキシヌクレオチドが加ピロリン酸分解により実質的には除去されないためである。

PAPは、DNA配列決定の新規方法において使用できる。PAPにおいて、DNAポリメラーゼによる加ピロリン酸分解および重合は、3'ジデオキシ末端オリゴヌクレオチドであるP^*により連続的に連結される。この原則はPAPの特異性、および次には3'特異的部分配列の塩基対の特異性に基づいている。3'特異的部分配列のこの特性は、未知の配列変化のスキャンニング、de novo DNA配列の決定、2つのDNA配列の比較、および大きいスケールでの遺伝子発現プロファイリングのモニターに応用することができる。P^*アレイはこれらの方法において可能である。すなわち、P^*の各々は、別々のドットあるいは2次元固体支持体において固定化することができ、従って、全てのPAP反応を同時にプロセスできる。

（b）ピロリン酸、およびテンプレート鎖とハイブリダイズする3'末端非伸長可能ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドP^*のみを加ピロリン酸分解により活性化するための加ピロリン酸分解活性を有する酵素を用いた、結果として生じた二本鎖の処理。

（b）ピロリン酸、およびテンプレート鎖とハイブリダイズする3'末端非伸長可能ヌクレオチドを有するハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドP^*のみを、それらのハイブリダイズされる3'末端非伸長可能ヌクレオチドの加ピロリン酸分解によって活性化するための加ピロリン酸分解活性を有する酵素を用いた、結果として生じた二本鎖の処理。

加ピロリン酸分解活性化重合
TU:UT二本鎖テンプレート内の469-bp領域を、オリゴヌクレオチドP^*およびU、あるいは唯一P^*のみを用いたPAPにより増幅した（表1および図1A）。PU:UP二本鎖産生物は、GenBank X55760におけるヌクレオチド204から672に対応しており、G+G含量は55.6％である。言及しない場合は、PAP反応混合物はTfl DNAポリメラーゼのために25μlの総量：75 mM KCl、20 mM Tris/HCl（pH 7.4）、1.5 mM MgCl₂、各々40μlの4つのdNTP（dATP、dTTP、dGTPおよびdCTP）、0.2μM P^*、0.05μMUオリゴヌクレオチド、300μM Na₄PPi（20 MMストック液はHClによりpH 8.0に調節した）、1μCiの[α-³²P]-dCTP（3000 Ci/nmole、Amersham）、1 UのTfl DNAポリメラーゼ（Promega）および2 ngのTU:UTを含有した。Taq DNAポリメラーゼのために、反応混合物は50 mM KCl、10 mM Tris/HCl（pH 7.4）、2.0 mM MgCl₂および1 UのTaq DNAポリメラーゼ（Boehringer Mannheim）以外は同様であった。PCRおよびその他の対照の混合物は、加えたプライマー以外は同様であった。サイクリング条件は：94℃で15秒間、55℃で1分間、および72℃まで1分間のランピング（ramping）および72℃で2分間、全15サイクルを含んだ。

加ピロリン酸分解活性化重合
TU:UT二本鎖テンプレート内の445から469 bpまでの領域を、オリゴヌクレオチドP^*およびU、あるいはP^*のみを用いたPAPにより増幅した。PU:UP二本鎖産生物は、GenBank X55760におけるヌクレオチド204-228から672に対応しており、そのG+G含量は56％である。PAP反応混合物は25μlの総量：50 mM KCl、10 mM Tris/HCl（pH 7.6）、1.5 mM MgCl₂、各々100μlの4つのdNTP（dATP、dTTP、dGTPおよびdCTP）、0.1μM P^*、0.1μMUオリゴヌクレオチド（TCATACCGGA AAGGGCTGGA GATA（SEQ ID NO:2）、300μM Na₄PPi、2％のDMSO、1μCiの[α-³²P] dCTP（3000 Ci/nmole、Amersham）、1 UのAmpliTaqFS DNAポリメラーゼ（PE Applied Biosystems）あるいはおのおの0.5 UのAmpliTaqFSおよびTaq DNAポリメラーゼ、および10 ngのTU:UTを含有した。ThermoSequenase（Amersham Pharmacia）もまた、8 UのThermoSequenaseあるいは4 UのThermoSequenaseに0.5 U Taqおよび2.5 mM MgCl₂を加えること以外は同条件下でテストした。サイクリング条件は：94℃で10秒間の変性、60℃（ThermoSequenaseでは55℃）で1分間のアニーリング、および72℃で2分間の伸長、全15サイクルを含んだ。