JP2003525039A - 特に微小手術用生体材料として使用するための微生物産生成形セルロースの製造方法および装置 - Google Patents
特に微小手術用生体材料として使用するための微生物産生成形セルロースの製造方法および装置Info
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Abstract
Description
は神経線維被覆用のカフ等として微小手術に使用し得る微生物産生成形セルロー
スの製造方法および製造装置に関する。
肪組織等の組織移植などの外科用途に微生物産生セルロースを外科用生体材料と
して使用することが知られている(例えばJP3-165774 A1)。
、円筒、リボン等々の形態に成形できることも知られている(JP8-1266
97 A2、EP186,495 A2、JP63-205109 A1、JP3-1
65774 A1等)。
養を実施し、管の断面積が培養液の空気と接する部分の面積に等しいセルロース
中空管を形成する。 −通気性材料(合成または天然高分子)上に一定形状のセルロースを微生物を用
いて形成する方法において、該材料の一面を酸素含有ガスに、他面を培養液に接
触させ、後者上に微生物産生セルロースを形成させ分離する。 −分離膜の外面(または内面)に培養液を供給して多孔質表面(高分子化合物)
を微生物産生セルロースで被覆し、ついで中空繊維の内部(または外部)空間に
空気を通すことにより複合中空繊維膜を形成する。
題がある。 −乾燥。 −中空円筒内面のセルロース層形成が不均一となりセルロースの一部が脱落する
危険(血管、特に微小領域には使用できない)を伴う構造。 −セルロース以外の物質を含有する複合物質からなる構造(バイオアベイラビリ
ティに影響する)。
コーン、セラミックス、不織布、繊維等)上で培養を行うことにより血管プロテ
ーゼを形成した生体材料を、小口径の血管の代替物として用いることも知られて
いる(JP3-272772 A2等)。
プロテーゼとして使用したときに血栓が付着する可能性があるという欠点を有す
る。この内表面の品質は血管プロテーゼの直径が小さいほど重要であり、特に小
口径の血管は沈着した血栓により容易に閉塞し得る。したがってこのプロテーゼ
を直径1〜3mmあるいはそれ以下の血管の微小手術に使用することは、全く不
可能ではないにせよ極めて問題が大きい。
及びこのセルロースから形成される血管を記載している。
コーン、セラミックス、不織布または通常の布等の酸素透過性中空支持体の内面
及び/又は外面上でセルロース生産性微生物を培養するものである。これらの酸
素透過性中空支持体を培養液に浸漬し、セルロース生産性微生物及び培地を中空
支持体の内面及び/又は外面に供給し、さらに酸素含有ガス(または液体)を同
様に前記中空支持体の内面及び/又は外面に供給して培養を実施すると、厚さ0
.01〜20mmのゼリー状のセルロースが中空支持体表面に形成される。セル
ロース生産性微生物と生成したセルロースと中空支持体との相互作用によりセル
ロースと中空支持体の複合材が形成される。セルロースが支持体と結合状態にな
ければ、合成後にセルロースを分離し、セルロースのみから成る中空成形体が得
られる。
独または混合物として用いて洗浄し、微生物細胞または培養液成分を除去する。
ルロースの一部が脱落する可能性がある(血管、特に微小領域への適用に問題を
生ずる)ことにある。
後処理、および微生物により産生されたセルロースの切断から成る方法がEP3
96,344 A3に記載されている。容器に満たした培養液に微生物を接種し、
生成した微生物産生セルロースに適当な媒体を含浸させ、必要に応じて後処理、
凍結、圧縮等の操作を行うことにより微生物産生セルロースを形成する繊維の間
の液体成分を保持し、液体成分の自由な移動を防止し、ついで切断を行う。使用
可能な媒体としてはグリセリン、エリスリン、グリコール、ソルビトール、マル
チトール等のポリオール類、グルコース、ガラクトース、マンノース、マルトー
ス、ラクトース等の糖類、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ
エチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、寒天、澱粉、アルギン酸塩
、キサンタン、多糖類、オリゴ糖類、コラーゲン、ゼラチン、蛋白質等の天然ま
たは合成高分子、あるいはアセトニトリル、ジオキサン、酢酸、プロピオン酸等
の水溶性極性溶媒が挙げられる。これらは単独で用いても混合物として用いても
よい。
しては以下の欠点を有する。 −生合成の間に直接に成形を行うことができないこと。 −内表面の粗さやバイオアベイラビリティを決定する微生物産生セルロースの親
水性に変化を生ずること。
ガラス管を用いる方法がEP396,344 A3に記載されている。細い管を
太い管に挿入し、両ガラス管の間隙に微生物の培養液を30日間流通させると中
空管状の微生物産生セルロースが形成される。このセルロースは生体器官、特に
血液との親和性が良く、生体内の血管の代替物として用いることができる。血液
親和性(血栓防止能の尺度)を判定するため、雑種成犬を用いて血管移植実験を
行った。この犬の上行大動脈および頚静脈の一部を内径2〜3mmの人工血管で
置換し、1ヶ月後に人工血管を切除して血栓の付着状況を調べたところ、縫合部
に軽微な血栓沈着が認められたほかは、人工血管全体の内壁において問題となる
ほどの血栓の付着は認められなかった(実施例10参照)。この方法により生体
親和性が比較的高く、特に直径6mm未満の血管の代替物に適した中空円筒状の
セルロースが作製できる。しかしながら小口径の血管(上記例では2〜3mm)
においては血栓沈着の危険は無視できず、さらに微小手術においては直径1mm
あるいはそれ以下が要求されるので、この血管プロテーゼは前記内壁への血栓付
着のためには使用不可能であると考えられる。
再現性を有し、確実に血栓の付着を防止できる成形生体材料、特に微小手術にお
いて直径1〜3mm以下の血管の代替物として用いることのできる材料の製造方
法を提供することである。
な限り短時間で使用可能となり、また任意の形状、特に種々の中空円筒状のもの
を製造し得るものでなければならない。
したセルロース層を産生するアセトバクター・キシリヌム(Acetobactor xylinu
m)の菌株を接種し、成形用部材の壁間の間隙内で例えば温度28〜30℃で培
養する。培養によって生成した生体物質(セルロース)は、成形用部材の壁から
分離し洗浄する(EP396,344 A3参照)。
に分離し得るガラス製部材から成るガラスマトリックスの壁間の間隙に満たすの
ではなく、培養期間中に成形用部材(ガラスマトリックス)を接種された培養液
を含む容器に浸漬し、培養液が毛管現象によって成形用物体の壁間の間隙に吸入
されるようにする。これにより容器内のセルロース生産のための高湿度且つ好気
性の条件が培養の全過程を通して確保される。
とその中に軸対称に固定されたガラス製部材から成る自体公知のガラスマトリッ
クスを、例えば三角フラスコに満たした接種済みの培養液に浸漬する。培養終了
後にガラスマトリックスを容器から取り出し解体して産生されたセルロースを回
収する。
るための成形用部材の壁としては、表面状態が極めて良好な未使用の成形用部材
を培養の都度用いる。これにより培養液成分や場合によってはセルロース繊維の
壁への付着が最小限となることが、顕微鏡を用いた観察によって確認される。成
形用部材を繰り返し使用すると、十分洗浄した後であってもこれらの沈着によっ
て、壁面に成長するセルロースの付着条件が変化する可能性がある。円筒状ガラ
スマトリックスの場合は、製造される血管代替物の内壁面を形成するガラス製部
材として、未使用の新規なものを培養の毎にガラス製外管に挿入する。円筒状ガ
ラス製部材としては、市販の標準寸法の融点測定用ガラスチューブを好適に使用
することができる。
に示された時間において、従来と同等の血栓の生成は認められなかった。このよ
うにして得られた、移植後に血液と接触するプロテーゼ材料の表面の質は極めて
高く、かつ再現性を有し、血栓付着の危険度は極めて小さい。したがって本発明
により製造した生体材料は微小手術用の血管代替物、特に直径1〜3mmまたは
それ以下の血管の代替物として極めて好適である。
セルロース層がガラスマトリックス中に形成されている)、また培養液に液状の
基本培養系を接種する(いわゆる液液接種)ため接種された菌の培地中の分布が
均一である利点を有する。
ゼとしてのみならず、神経線維被覆用カフ等としても、また微小手術の訓練用の
材料としても使用することができる。訓練用に使用すれば実験動物の使用数を減
らすことができる。従来使用されている訓練用材料は例えばゴム製であり、可能
な限り現実に近い手術条件を完全に体感することはできない。
発明の方法を実施するための適切な装置が記載されている。ガラスマトリックス
の内管(各回の培養で新品を使用する)の末端にスリーブ状の弾性体製リングを
設けることにより外管に固定する際に位置を安定化し、かつ容易に分離できるよ
うにすることが示されている。この方式によれば、ガラスマトリックスの外管を
反復使用し前記のように内管を交換する際に分解に要する手間と時間を最小限と
することができ、製造された中空円筒状セルロースの表面からの分離も問題なく
行うことができる。この場合、ガラスマトリックスの間隙への培養液および空気
の循環は、ガラスマトリックスの弾性体リングの中間部分に設けた開口部を通じ
て行われる。このような装置を用いれば、次の培養に際してはガラス内管を交換
するだけでよく、煩雑な洗浄工程は不要であるか、あるいは最小限にとどめるこ
とができるので効率的である。
数のガラスマトリックスを同時に浸漬することも可能である。
また微小手術に使用される材料に限定されるものではない。
酵母エキス5.00g、燐酸水素二ナトリウム二水和物3.40g、クエン酸一
水和物1.15gを含み、pH値が6.0〜6.3の範囲にある培養液(シュラ
ム・ヘストリン培地)2(20ml)を容積50mLの容器1に充填し、該培養
液2を120℃で20分間蒸気滅菌した。これに、10日経過後の基本培養系(
シュラム・ヘストリン培地)から得たアセトバクター・キシリヌム菌(AX5、
ライプチヒ生物工学研究所の菌株ライブラリ)を接種した。ついでガラス製外管
4とその中に軸対称に固定した円筒部直径0.8mmの内側ガラス製部材5とか
らなるガラスマトリックス3を滅菌した後、容器1に浸漬した。容器1内の接種
済み培養液2は、毛管現象によりガラス製外管4と内側ガラス製部材5の間隙6
に充填された。培養は28〜30℃において14日間行った。この培養期間中に
白色の微生物産生セルロースが容器1内にも、ガラスマトリックス3の間隙6に
も生成した。
の間隙6に形成された円筒状の微生物産生セルロースを分離し、水で十分洗浄し
た後、沸騰した苛性ソーダ0.1N水溶液で10分間処理し、再度水で十分洗浄
して、内径0.8mm、肉厚0.7mm、長さ1cm以内の微小血管プロテーゼ
を得た。
TARラットの頚動脈の一部を前記製造した人工血管で置換した。膨潤したセル
ロース材に含まれている水分を、手術前に生理食塩水で置換した。手術直後に血
流障害がないことを確認した。
内に微小血管が形成されることにより生体によく一体化され、組織内で完全に貫
通していた。人工血管との吻合部に対して末梢方向の頚動脈の部分、人工プロテ
ーゼ及び吻合部の状態を電子顕微鏡で組織学的に検査した結果、縫合部、挿入物
、血管のいずれにも血栓の形成や増殖現象は認められなかった。
に被覆)されていた(新生内膜の形成)。吻合部の内面は平滑であり、異常は全
く見られなかった。この結果は合計20回の動物実験で確認された。
部材5を未使用のガラス製部材5に交換し、前記の手続を改めて実施した。
る目的で、更に生成したセルロースを回収する際にガラスマトリックス3を簡易
に、且つ材料を損傷することなく取り外し得るようにする目的で、ガラス製部材
5とガラス管4の固定にはスリーブ状のシリコーン製リング7を用いる。ただし
培養液の交換8および空気循環9を可能にするため、ガラス管4にはシリコーン
製リング7の間に開口部10を設ける。滅菌状態を確保し、容器1内の高湿度、
好気的環境を維持するため、培養期間中は容器1を蓋11で密封する。
は従属請求項に記述する。 公知の方法によれば、培養液を滅菌し、セルロース生産菌、例えば形状の安定
したセルロース層を産生するアセトバクター・キシリヌム(Acetobactor xylinu
m)の菌株を接種し、成形用部材の壁間の間隙内で例えば温度28〜30℃で培
養する。培養によって生成した生体物質(セルロース)は、成形用部材の壁から
分離し洗浄する(EP396,344 A3参照)。
Claims (7)
- 【請求項1】 セルロース生産性微生物、例えば安定な形状のセルロース層
を生産するアセトバクター・キシリヌムの菌株を滅菌済み培養液に接種し、該バ
クテリアを成形用部材の壁間の間隙で培養し、培養によって生成した生体材料を
成形用部材から分離し洗浄することによる、特に微小手術に使用し得る微生物産
生成形セルロースの製造方法において、成形用部材の壁を、接種済みの培養液を
含む容器に浸漬し、微生物を容器内および成形用部材の壁間の空間においてセル
ロース産生のための高湿度・好気性環境下で培養し、更に製造プロセス毎に、高
い表面品質を有する未使用の成形用部材を、該生体材料使用時に血液と接触する
プロテーゼ材料の表面を形成するための成形用部材の壁として使用することを特
徴とする微生物産生成形セルロースの製造方法。 - 【請求項2】 請求項1に記載の微生物産生成形セルロースの製造方法にお
いて、該壁間の間隙内で微生物を培養する成形用部材の壁として、特に互いに分
離可能なガラス製部材からなるガラスマトリックスを使用することを特徴とする
微生物産生成形セルロースの製造方法。 - 【請求項3】 請求項2に記載の微生物産生成形セルロースの製造方法にお
いて、中空円筒状の生体材料を製造するために、外側ガラス管と、これに軸対称
に挿入された直径のより小さいガラス製部材とからなるガラスマトリックスを、
接種済み培養液を満たした容器に浸漬することを特徴とする微生物産生成形セル
ロースの製造方法。 - 【請求項4】 請求項2に記載の微生物産生成形セルロースの製造方法にお
いて、複数の生体材料を同時に製造するために、複数のガラスマトリックスを接
種済み培養液を満たした容器に浸漬することを特徴とする微生物産生成形セルロ
ースの製造方法。 - 【請求項5】 外側ガラス管(4)と、これに軸対称に挿入された直径のよ
り小さいガラス製部材(5)とからなる少なくとも1個のガラスマトリックス(
3)を、接種済み培養液(2)を満たした容器(1)に浸漬し、製造される生体
材料が形成されるガラスマトリックス(3)の間隙(6)内部における、または
内部と外部との間における培養液の交換(8)および空気循環(9)を確保しつ
つ、ガラス管(4)へのガラス製部材(5)の軸対称位置での取り付けを容易且
つ位置安定的とし容易に取り外せるようにするために、特にシリコーン製の複数
の弾性リング(7)を内側ガラス製部材(5)に取り付けることを特徴とする請
求項3に記載の方法を実施するための装置。 - 【請求項6】 前記培養液交換(8)及び空気循環(9)がガラスマトリッ
クス(3)の弾性リング(7)の間の部分の外側ガラス管(4)に設けた少なく
とも1個の開口部(10)を通じて行われることを特徴とする請求項5に記載の
装置。 - 【請求項7】 ガラスマトリックス(3)を浸漬する容器(1)として公知
の三角フラスコを使用することを特徴とする請求項5に記載の装置。
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