JP2003520012A - ヒトＳｅｌ−１０ポリペプチドおよびそれをコードするポリヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒトＳｅｌ−１０の２種の択一的なスプライス変異型、そのうちの１種は海馬細胞で発現され、もう１種は乳房細胞で発現される、のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む単離核酸分子を提供する。本発明は、単離Ｓｅｌ−１０ポリペプチドおよびそれを発現する、Ａβプロセシングが改変されたセルラインも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の分野 本発明は、ヒトｓｅｌ−１０の２種の択一的なスプライス変異型、そのうちの
１種は海馬細胞で発現され、他の１種は乳房細胞で発現される、のいずれかをコ
ードするポリヌクレオチドを含む単離核酸分子を提供する。また、本発明は単離
ｓｅｌ−１０ポリペプチドも提供する。

【０００２】 発明の背景 アルツハイマー病（ＡＤ）は、成人生活の中期から後期の間に進行性の記憶お
よび認識の衰退を引起す中枢神経系の変性疾患である。該疾病は細胞外アミロイ
ド病斑および神経細胞内神経原繊維錯綜を含む広範な神経病理学的な特徴を伴う
（Sherrington，R．らによるNature, 375:754−60 (1995)）。ＡＤに通じる病理
経路はよく理解されていないが、幾つかの遺伝子座が該疾病の進展に関与してい
ることが知られている。

【０００３】 若年発病型アルツハイマー病（ＡＤ）に関連する遺伝子が、若年発病型ＡＤを
有する家族におけるマッピング実験の使用によって同定されている。この実験に
より、第１染色体および第１４染色体上の遺伝子座がＡＤに関与しているらしい
ということが示されている。第１４染色体座のポジショナルクローニングにより
、その後にプレセニリン−１（ＰＳ−１）と命名された８回貫膜ドメイン・タン
パク質をコードする新規な突然変異遺伝子が同定された（Sherrington，R．らに
よるNature，375：754−60（1995））。ヒトＥＳＴデータベースのｂｌａｓｔ検
索により、ＰＳ−１に対してホモロジーを示す単一のＥＳＴが明らかとなり、プ
レセニリン−２（ＰＳ−２）と命名され、これは第１染色体上のＡＤと関連する
遺伝子であることが示された（Levy−Lahad，E．らによるScience，269：973−9
77（1995）；Rogaev，E．I．らによるNature，376：775−8（1995）；Li，J．ら
によるProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,92：12180−12184（1995））。

【０００４】 アルツハイマー病に関連するＰＳ−１およびＰＳ−２中の突然変異は、主にミ
スセンス突然変異である。ＰＳ−１およびＰＳ−２は双方ともタンパク質加水分
解プロセシングを受け、それは家族性アルツハイマー病で見出された点突然変異
によって変化され得る[Perez−Tur，J.らによるNeuroreport,7：297−301（1995
）；Mercken，M．らによるFEBS Lett．，389：297−303（1996）]。ＰＳ−１遺
伝子の発現は組織の全域にわたって広範に分布するが、一方のＰＳ−２のｍＲＮ
Ａの最高レベルは膵臓および骨格筋において見出される（Li，J．らによるProc
．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，92：12180−12184（1985）；Jinhe Li，私信）。
しかしながら、ＰＳ−２タンパク質の最高レベルは脳において見出されている（
Jinhe Li，私信）。ＰＳ−１タンパク質およびＰＳ−２タンパク質は双方とも小
胞体、ゴルジ装置および核膜に局在している（Jinhe Li，私信；Kovacs，D．M．
らによるNat．Med．，2：224−229（1996）；Doan，A．らによるNeuron，17：10
23−1030（1996））。ＰＳ−１遺伝子またはＰＳ−２遺伝子のいずれかにおける
突然変異は、Ａβ_1-40に対してＡβ_1-42の比が上昇するようにアミロイドタンパ
ク質前駆体（ＡＰＰ）のプロセシングを変化させる（Scheuner，D．らによるNat
．Med．，2：864−870（1996））。ヒトＡＰＰを有するトランスジェニック・マ
ウスにおいて同時発現させた場合、アミロイド病斑中のＡβの沈着の促進と一緒
に（BorcheltらによるNeuron，19：939（1997））、Ａβ_1-40と比較したＡβ_{1-4 2} の比における同様な上昇が認められている（Borchelt，D．R．らによるNeuron
，17：1005−1013（1996）；Citron，M．らによるNat．Med．，3：67−72（1997
）；Duff，K．らによるNature，383：710−713（1996））。

【０００５】 ＡＤにおけるＰＳ−１およびＰＳ−２の役割に関して上記の知見が得られてい
るにもかかわらず、それらの生物機能は分からないままであり、それらは未知の
生物機能を有する膨大な数のヒト疾病遺伝子と一緒に位置づけられている。遺伝
子またはその産物の機能が分からない場合には、モデル生物における遺伝解析が
かかる遺伝子を既知の生化学的経路または遺伝経路に位置付けるのに有用となり
得る。このことは、分析下において、遺伝子中の突然変異の効果を抑制するかま
たは増強する余分遺伝子（extragene）突然変異につきスクリーニングすること
によって行う。例えば、疾病遺伝子中の機能損失突然変異の遺伝子外サプレッサ
ーは突然変異遺伝子の下流の影響された遺伝的または生化学的経路を活性化し得
、一方、機能獲得突然変異のサプレッサーはおそらくは該経路を不活性化し得る
。

【０００６】 プレセニリン遺伝子の機能を明らかにするのに用いることができる１つのモデ
ル生物は、ＰＳ−１およびＰＳ−２に対してホモロジーを有する３個の遺伝子（
ｓｅｌ−１２がヒト・プレセニリンをコードする遺伝子に対して最高の度合いの
ホモロジーを有するが）を含むシイ・エレガンス（C．elegans）である。ｓｅｌ
−１２は、活性化ｎｏｔｃｈ受容体、ｌｉｎ−１２（ｄ）の遺伝子サプレッサー
についてのスクリーニングで発見された(Levitan，D．らによるNature，377：35
1−354（1995）)。発病におけるｌｉｎ−１２の機能は、細胞系譜をパターン化
することである。ｌｉｎ−１２(ｄ)のごときｌｉｎ−１２活性を増大させるハイ
パーモルフ突然変異が“複数外陰”表現型を生じる一方、活性を低下させるハイ
ポモルフ突然変異は外陰の外転ならびに幾つかの他の細胞系譜におけるホメオテ
ィック変化を生じる（Greenwald，I．らによるNature，346：197−199（1990）
；Sundaram，M．らによるGenetics，135：755−763（1993））。ｓｅｌ−１２突
然変異は、ハイパーモルフｌｉｎ−１２（ｄ）突然変異を抑制するが、該ｌｉｎ
−１２（ｄ）突然変異は無傷のｌｉｎ−１２(ｄ)受容体によるシグナリングを活
性化するだけである（Levitan，D．らによるNature，377：351−354（1995））
。受容体の細胞質ドメインを切頭するｌｉｎ−１２突然変異もシグナリングを活
性化する（Greenwald，I．らによるNature，346：197−199（1990））が、ｓｅ
ｌ−１２の突然変異によって抑制されない（Levitan，D．らによるNature，377
：351−354（1995））。このことは、おそらくは原形質膜に存在する機能性ｌｉ
ｎ−１２受容体の量を減少することによって、ｓｅｌ−１２突然変異がｌｉｎ−
１２シグナリング経路の上流に作用することを意味する。ある種のｌｉｎ−１２
ハイパーモルフ突然変異を抑制することに加えて、ｓｅｌ−１２に対する突然変
異は、当該突然変異が他の点では解剖学的に正常のようであるが、産卵に対する
機能損失を引起し、したがって卵の体内蓄積を引起す（Levitan，D．らによるNa
ture，377：351−354（1995））。ｓｅｌ−１２突然変異はヒトＰＳ−１または
ＰＳ−２のいずれかによって救済され得、このことはｓｅｌ−１２、ＰＳ−１お
よびＰＳ−２が機能的相同物であることを示している（Levitan，D．らによるPr
oc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，93：14940−14944（1996））。

【０００７】 第２の遺伝子ｓｅｌ−１０は、ｌｉｎ−１２ハイポモルフ突然変異のサプレッ
サーについての別の遺伝子スクリーニングで同定された。ｓｅｌ−１０における
機能損失突然変異は、ｌｉｎ−１２ハイポモルフ突然変異によるシグナリングを
回復させる。ｓｅｌ−１０活性の低下がｌｉｎ−１２活性を上昇させるため、ｓ
ｅｌ−１０はｌｉｎ−１２シグナリングの負のレギュレーターとして作用すると
結論付け得る。ｓｅｌ−１０はｓｅｌ−１２、シイ・エレガンス（C．elegans）
のプレセニリン相同物、の負のレギュレーターとしても作用する（Levy−Lahad
，E．らによるScience，269：973−977（1995））。ｓｅｌ−１０活性の損失は
、ｓｅｌ−１２におけるハイポモルフ突然変異と関連する産卵欠損を抑制する（
Iva Greenwald，私信）。ｓｅｌ−１０に対する機能損失突然変異のｌｉｎ−１
２およびｓｅｌ−１２突然変異に対する効果は、ｓｅｌ−１０がｌｉｎ−１２／
ｎｏｔｃｈおよびプレセニリン活性の双方の負のレギュレーターとして作用する
ことを示している。したがって、シイ・エレガンス（C．elegans）のｓｅｌ−１
０ヒト相同物は、アルツハイマー病の病理に関連する方法で、ヒト・プレセニリ
ン遺伝子と遺伝的および／または生理学的に相互作用すると予想される。 前記の見地から、ＡＤに関連する遺伝子の同定に対する、およびＡＤに通じる
生物学的経路を妨害することができる剤を同定するためのアッセイの開発に対す
る継続している要望が存在することは明らかであろう。

【０００８】 情報の開示 Hubbard，EJA．，Wu，G．，Kitajewski，J.およびGreenwald，I．によるSel−
10, a negative regulator of lin−12 acivity in Caenorhabditis elegans, e
ncodes a member of the CDC4 family of proteins. Gene & Dev., 11: 3182−3
193（1997）. Greenwald−I; Seydoux−GによるAnalysis of gain−of−function mutations
of the lin−12 gene of Caenorhabditis elegans. Nature, 346: 197−9（19
90）. Kim, T−W, Pettingell, WH, Hallmark, OG., Moir, RD., Wasco, W., Tanzi,
R.によるEndoproteolytic cleavage and proteasomal degradation of preseni
lin 2 in transfected cells. J. Biol. Chem., 272: 11006−11010 (1997). Levitan−D.;Greenwald−I.によるFacilitation of lin−12 mediated signal
ling by sel−12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzheimer's disease gene. Nature, 377: 351−4 (1995). Levitan−D.; Doyle−TG.; Brousseau−D; Lee−MK; Thinakaran−G; Slunt−
HH; Sisodia−SS; Greenwald−IによるAssessment of normal and mutant human
presenilin function in Caenorhabditis elegans. Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.
A., 93: 14940−4 (1996). Sundaram−M; Greenwald−IによるSuppressors of a lin−12 hypomorph defi
ne genes that interact with both lin−12 and glp−1 in Caenorhabditis el
egans. Genetics, 135: 765−83 (1993). Sundaram−M; Greenwald−IによるGenetic and phenotypic studies of hypom
orphic lin−12 mutants in Caenorhabditis elegans. Genetics. 135: 755−63
(1993). F55B12.3 GenPep Report (WMBL locus CEF55B12, 受入れ番号z79757) ＷＯ９７／１１９５６号

【０００９】 発明の概要 本発明は、海馬細胞および乳房細胞で発現する、ヒトｓｅｌ−１０をコードす
るポリヌクレオチドを含む単離核酸分子を提供する。別段指摘しない限り、本明
細書中にてｓｅｌ−１０に言及する場合は、いずれもヒトｓｅｌ−１０をいい、
海馬ｓｅｌ−１０および乳房ｓｅｌ−１０の双方を包含すると理解されよう。海
馬ｓｅｌ−１０および乳房ｓｅｌ−１０のフラグメントも提供する。

【００１０】 好ましい具体例において、本発明は： （ａ）配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６および配列
番号：７よりなる群から選択されるか、またはＡＴＣＣ受託番号９８９７８に含
まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる完全アミノ酸配列を有するヒトｓ
ｅｌ−１０ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列； （ｂ）配列番号：８、配列番号：９および配列番号：１０よりなる群から選択
されるか、またはＡＴＣＣ受託番号９８９７９に含まれるｃＤＮＡクローンによ
ってコードされる完全アミノ酸配列を有するヒトｓｅｌ−１０ポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列；ならびに （ｃ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列 よりなる群から選択される配列に対して少なくとも９５％同一である配列を有す
るポリヌクレオチドを含む単離核酸分子を提供する。 もう１つの態様において、本発明は、ストリンジェントな条件下において、ｓ
ｅｌ−１０をコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントにハイブリダ
イズするポリヌクレオチドを含む単離核酸分子を提供する。

【００１１】 また、本発明は、本発明の単離核酸分子を含むベクター、かかるベクターが導
入された宿主細胞、ならびに上記宿主細胞を培養し、ついでｓｅｌ−１０ポリペ
プチドを単離することからなるｓｅｌ−１０ポリペプチドを得る組換え法も提供
する。

【００１２】 もう１つの態様において、本発明は、単離ｓｅｌ−１０ポリペプチドならびに
そのフラグメントを提供する。好ましい具体例において、ｓｅｌ−１０ポリペプ
チドは、配列番号：３、４、５、６、７、８、９および１０よりなる群から選択
されるアミノ酸配列を有する。ｓｅｌ−１０ポリペプチドに特異的に結合する、
ポリクローナルおよびモノクローナル双方の単離抗体も提供する。

【００１３】 発明の詳細な説明 本発明は、ヒトｓｅｌ−１０をコードするポリヌクレオチドを含む単離核酸分
子を提供する。配列を配列番号：１に示すヒト海馬ｓｅｌ−１０（ｈｈｓｅｌ−
１０）のヌクレオチド配列は、５種のｈｈｓｅｌ−１０ポリペプチド（ｈｈｓｅ
ｌ−１０−（１）、ｈｈｓｅｌ−１０−（２）、ｈｈｓｅｌ−１０−（３）、ｈ
ｈｓｅｌ−１０−（４）およびｈｈｓｅｌ−１０−（５）、本明細書中ではひと
まとめにしてｈｈｓｅｌ−１０という）をコードする。配列を配列番号：２に示
すヒト乳房ｓｅｌ−１０（ｈｍｓｅｌ−１０）のヌクレオチド配列は、３種のｈ
ｍｓｅｌ−１０ポリペプチド（ｈｍＳｅｌ−１０−（１）、ｈｍＳｅｌ−１０−
（２）、およびｈｍＳｅｌ−１０−（３）、本明細書中ではひとまとめにしてｈ
ｍｓｅｌ−１０という）をコードする。ｈｈｓｅｌ−１０ポリヌクレオチドのヌ
クレオチド配列を配列番号：１に示すが、ここで配列番号：１のヌクレオチド残
基４５−１９２８がｈｈｓｅｌ−１０−（１）に対応し、配列番号：１のヌクレ
オチド残基１５０−１９２８がｈｈＳｅｌ−１０−（２）に対応し、配列番号：
１のヌクレオチド残基２６７−１９２８がｈｈＳｅｌ−１０−（３）に対応し、
配列番号：１のヌクレオチド残基２９１−１９２８がｈｈＳｅｌ−１０−（４）
に対応し、配列番号：１のヌクレオチド残基３０６−１９２８がｈｈＳｅｌ−１
０−（５）に対応する。ｈｍＳｅｌ−１０ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列
を配列番号：２に示すが、ここで配列番号：２のヌクレオチド残基１８０−１９
４９がｈｍＳｅｌ−１０−（１）に対応し、配列番号：２のヌクレオチド残基２
７０−１９４９がｈｈｍＳｅｌ−１０−（２）に対応し、配列番号：２のヌクレ
オチド残基３２７−１９４９がｈｍＳｅｌ−１０−（３）に対応する。ｈｈｓｅ
ｌ−１０およびｈｍＳｅｌ−１０核酸分子によってコードされるポリペプチドの
アミノ酸配列は以下のように示される：配列番号：３、４、５、６および７は、
各々、ｈｈＳｅｌ−１０−（１）、ｈｈＳｅｌ−１０−（２）、ｈｈＳｅｌ−１
０−（３）、ｈｈＳｅｌ−１０−（４）およびｈｈＳｅｌ−１０−（５）ポリペ
プチドに対応し、配列番号：８、９および１０は、各々、ｈｍＳｅｌ−１０−（
１）、ｈｍＳｅｌ−１０−（２）およびｈｍＳｅｌ−１０−（３）ポリペプチド
に対応する。別段指摘しない限り、本明細書中においてｓｅｌ−１０に言及する
場合は、いずれもヒトｓｅｌ−１０をいい、しかも（ｓｅｌ−１０の核酸、ポリ
ヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは遺伝子に言及する場合には）海馬および乳
房のｓｅｌ−１０核酸分子、あるいは（ｓｅｌ−１０タンパク質、ポリペプチド
、アミノ酸配列に言及する場合には）ポリペプチドのすべてを包含するように理
解されよう。海馬ｓｅｌ−１０および乳房ｓｅｌ−１０の核酸分子ならびにポリ
ペプチドのフラグメントも提供する。

【００１４】 配列番号：１のヌクレオチド配列は、実施例１に記載するごとく得たものであ
り、１９９８年１１月９日に10801 University Blvd., Manassas, VA 20110のア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託し、受託番号９８９７８が
付与されたｃＤＮＡクローンＰＮＶ １０２−１に含まれる。配列番号：２のヌ
クレオチド配列は、実施例１に記載するごとく得たものであり、１９９８年１１
月９日に10801 University Blvd., Manassas, VA 20110のアメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクションに寄託し、受託番号９８９７９が付与されたｃＤＮＡ
クローンＰＮＶ １０８−２に含まれる。

【００１５】 本発明のヒトｓｅｌ−１０ポリペプチドは、シイ・エレガンス（C．elegans）
のｓｅｌ−１０、ならびに酵母ＣＤＣ４およびヒトＬＩＳ−１を含むβ−トラン
スデューシン・タンパク質ファミリーのメンバーとホモロジーを共有する。この
ファミリーは、Ｆ−ボックスおよび複数のＷＤ−４０リピートの存在によって特
徴付けられる（Li，J．らによるProc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，92：12180−1
2184(1995)）。該リピートは２０−４０アミノ酸長であって、ｇｌｙ−ｈｉｓ（
ＧＨ）およびｔｒｐ−ａｓｐ（ＷＤ）残基によって結合されている。β−トラン
スデューシンの三次元構造は、ＷＤ４０リピートが７枚ブレードのプロペラ様構
造のアームを形成することを示している（Sondek，J．らによるNature，379：36
9−374(1996)）。各ブレードは１個の内部β鎖の境界を形成するタンパク質モチ
ーフ中にペアの保存アスパラギン酸残基を有するβシートの４枚の交互プリーツ
によって形成されている。ＷＤ４０リピートは、多様な機能クラスを表す２７種
の異なるタンパク質にわたって見出されている（Neer，E．J．らによるNature，
371：297−300（1994））。これらは、細胞分裂、細胞寿命の決定、遺伝子転写
、シグナル伝達、タンパク質分解、ｍＲＮＡ修飾および小胞融合を含む細胞機能
を調節している。機能におけるこの多様性は、β−トランスデューシン・ファミ
リーメンバーが、複数のタンパク質の複合体が会合し得る共通のスカフォールド
を供しているという仮説に通じた。

【００１６】 配列番号：１に示すヌクレオチド配列はｈｈｓｅｌ−１０をコードするヌクレ
オチド配列に対応し、一方、配列番号：２に示すヌクレオチド配列はｈｍｓｅｌ
−１０をコードするヌクレオチド配列に対応する。ｓｅｌ−１０をコードするＤ
ＮＡの単離および配列決定は実施例１および２に後記する。

【００１７】 実施例１および２に記載するごとく、自動化配列決定法を用いてｓｅｌ−１０
のヌクレオチド配列を得た。本発明のｓｅｌ−１０ヌクレオチド配列は双方のＤ
ＮＡ鎖について得、１００％正確であると考えられる。しかしながら、当該技術
分野で知られているごとく、かかる自動化法によって得られたヌクレオチド配列
は幾つかのエラーを含み得る。自動化によって決定したヌクレオチド配列は、得
られた核酸分子の実際のヌクレオチド配列に対して、典型的には少なくとも約９
０％、より典型的には少なくとも約９５％ないし少なくとも約９９.９％同一で
ある。実際の配列は、当該技術分野でよく知られている手動配列決定法を用いて
より正確に決定し得る。１またはそれを超えるヌクレオチドの挿入または欠失を
生じる配列中のエラーは、予想されるアミノ酸配列が核酸分子の実際のヌクレオ
チド配列から予想されるものとは異なるような、突然変異点で開始する翻訳にお
けるフレームシフトを生じ得る。本発明のｓｅｌ−１０のＤＮＡには、ｃＤＮＡ
、化学合成ＤＮＡ、ＰＣＲによって単離したＤＮＡ、ゲノミックＤＮＡ、および
それらの組合せが含まれる。ゲノミックｓｅｌ−１０ ＤＮＡは、当該技術分野
でよく知られている方法を用いて、本明細書中に記載したｓｅｌ−１０ ｃＤＮ
Ａでゲノミックライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができ
る。ｓｅｌ−１０ ＤＮＡから転写されたＲＮＡも本発明によって包含される。

【００１８】 遺伝コードの縮重により、２個のＤＮＡ配列が異なることも、なお同一のアミ
ノ酸配列をコードすることもある。したがって、本発明は、本発明のいずれかの
ｓｅｌ−１０ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を有する単離核酸
分子を提供し、ここに該ポリヌクレオチド配列は配列番号：３−１０の完全なア
ミノ酸配列を有するｓｅｌ−１０ポリペプチドまたはそのフラグメントをコード
する。

【００１９】 また、組換え体および非組換え体の双方の、精製ｓｅｌ−１０ポリペプチドも
ここに提供する。ｓｅｌ−１０のいずれかの生物活性を保持している天然ｓｅｌ
−１０タンパク質の変異型および誘導体も、本発明の範囲内に入る。前記したご
とく、本発明のｓｅｌ−１０ポリペプチドは酵母ＣＤＣ４とホモロジーを共有し
ている。ＣＤＣ４は特定の細胞タンパク質のユビキチン化を触媒することが知ら
れている（FeldmanらによるCell，91：221（1997））ため、ｓｅｌ−１０もこの
活性を有していることが推察し得る。かかる活性を実証するためのアッセイ手法
はよく知られており、酵母タンパク質Ｃｄｃ４ｐ、Ｃｄｃ５３ｐおよびＳｋｐ１
ｐまたはそれらのヒト・オーソロガスならびにＥ１酵素、Ｅ２酵素Ｃｄｃ３４ｐ
またはそのヒト・オーソロガス、ユビキチン、標的タンパク質ならびにＡＴＰ再
生系と一緒に精製ヒトｓｅｌ−１０タンパク質を用いるユビキチン化系の復元が
含まれる（Feldmanらによる1997）。Ｓｋｐ１ｐはＦ−ボックスと呼ばれるタン
パク質ドメインを介してＣｄｃ４ｐと会合する（BaiらによるCell，86：263（19
96））。Ｆ−ボックスタンパク質・モチーフは、酵母ＣＤＣ４、シイ・エレガン
スｓｅｌ−１０、マウスｓｅｌ−１０およびヒトｓｅｌ−１０中に見出される。
ｓｅｌ−１０ユビキチン化系は、酵母コンポーネントのシイ・エレガンス相対物
、例えばＣｄｃ５３ｐに代るｃｕｌ−１（ｌｉｎ−１９としても知られている）
タンパク質（KipreosらによるCell，85：829（1996））およびＳｋｐ１ｐに代る
タンパク質Ｆ４６Ａ９、あるいはそれらの哺乳動物相対物、例えばＣｄｃ５３ｐ
に代るＣｕｌ−２タンパク質（Kipreosらによる1996）および酵母Ｓｋｐ１ｐに
代る哺乳動物Ｓｋｐ１ｐを用いて復元し得る。プロテインキナーゼによって供さ
れるリン酸化系も、前掲のFeldmanらによる1997によるアッセイ系に含まれる。

【００２０】 ｓｅｌ−１０変異型は、例えば、天然ｓｅｌ−１０をコードするヌクレオチド
配列の突然変異によって得ることができる。本明細書中でいうｓｅｌ−１０変異
型とは、天然ｓｅｌ−１０と実質的に相同性であるが、アミノ酸配列中に１また
はそれを超える欠失、挿入または置換を有するため、天然ｓｅｌ−１０のアミノ
酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。該変異型アミノ酸
またはヌクレオチド配列は、天然ｓｅｌ−１０配列に対して、好ましくは少なく
とも約８０％同一、より好ましくは少なくとも約９０％同一であって、最も好ま
しくは少なくとも約９５％同一である。したがって、例えば、天然ｓｅｌ−１０
遺伝子と比較して、１００ヌクレオチド毎に５個の点突然変異を含む変異型ヌク
レオチド配列は天然タンパク質に対して９５％同一であろう。天然ｓｅｌ−１０
配列と変異型ｓｅｌ−１０配列との間の、ホモロジーとも呼ばれる配列同一性の
パーセントは、例えばSmithおよびWatermanのアルゴリズム（Adv．Appl．Math．
，2： 482−489（1981））を用いるＧａｐプログラム（Wisconsin Sequence Ana
lysis Package，Version 8 for Unix，Genetics Computer Group社，University
Research Park，Madison，Wisconsin）のごとき、この目的に通常利用されてい
るいずれかのコンピュータ・プログラムを用いて２つの配列を比較することによ
って決定することもできる。

【００２１】 天然アミノ酸配列の改変は、いずれかの多種の公知技術によって行い得る。例
えば、Walderら（Gene，42：133（1986））；Bauerら(Gene，37：73（1985））
；Craik（BioTechniques，１９８５年１月、pp.12−19）；Smithら（Genetic En
gineering：Principles and Methods, Plenum Press社(1981)；および米国特許
第４,５１８,５８４号および第４,７３７,４６２号によって記載されているオリ
ゴヌクレオチド−特異的突然変異のごとき当業者によく知られている手法によっ
て特定の位置に突然変異を導入することができる。

【００２２】 本発明の範囲内のｓｅｌ−１０変異型は、保存置換された配列を含むことがあ
り、これは、ｓｅｌ−１０ポリペプチドの１またはそれを超えるアミノ酸残基が
ｓｅｌ−１０ポリペプチドの二次元構造および／または三次元構造を変化させな
い異なる残基によって置き換えられることを意味する。かかる置換には、１つの
脂肪族残基（Ile、Val、LeuまたはAla）をもう１つの残基に置換すること、また
は塩基性残基LysおよびArg、酸性残基GluおよびAsp、アミド残基GlnおよびAsn、
ヒドロキシル残基SerおよびTyr、または芳香族残基PheおよびTyrの間の置換のご
とき、同様の物理化学的特性を有する残基によるアミノ酸の置き換えが含まれ得
る。表現的にサイレントなアミノ酸交換の作製に関するさらなる情報は、Bowie
らによるScience，247：1306−1310（1990）に見出すことができる。ｓｅｌ−１
０の生物活性を実質的に保持し得る他のｓｅｌ−１０変異型は、当該タンパク質
の機能領域の外側の領域にアミノ酸置換が起こっているものである。

【００２３】 もう１つの態様において、本発明は、ストリンジェントな条件下で、前記の核
酸分子の一部分、例えば、以前に記載した核酸分子のうちの１つの少なくとも約
１５ヌクレオチドまで、好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドまで、より好
ましくは少なくとも約３０ヌクレオチドまで、なおより好ましくは少なくとも約
３０から少なくとも約１００ヌクレオチドまで、にハイブリダイズするポリヌク
レオチドを含む単離核酸分子を提供する。記載した長さを有する核酸分子のかか
る部分は、例えば、基準核酸分子の少なくとも約１５個の隣接ヌクレオチドとい
う。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、６×ＳＳＣ／０.１
％ＳＤＳ中、約４２℃にて約２.５時間につづく、０.１％ＳＤＳを含む１.０×
ＳＳＣ中、６５℃にてのフィルターの洗浄の一晩インキュベーションを意図する
。

【００２４】 本明細書中に記載したｓｅｌ−１０をコードする核酸分子のフラグメント、な
らびにかかる核酸分子にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、
プローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるプライマーとして用い
ることができる。かかるプローブを用いて、例えばイン・ビトロ(in vitro)アッ
セイ、ならびにサザンブロットおよびノザンブロットにおいてｓｅｌ−１０核酸
の存在を検出することができる。ｓｅｌ−１０を発現している細胞のタイプも、
かかるプローブを用いることによって同定し得る。かかる手法はよく知られてお
り、当業者であれば特定の用途に好適な長さのプローブを選択することができる
であろう。ＰＣＲについては、目的のｓｅｌ−１０核酸分子の末端に対応する５
'および３'プライマーを利用し、従来の技術を用いてその配列を単離し、増幅さ
せる。

【００２５】 ｓｅｌ−１０核酸分子のほかの有用なフラグメントは、（センス鎖を用いて）
標的ｓｅｌ−１０のｍＲＮＡまたは（アンチセンス鎖を用いて）ｓｅｌ−１０の
ＤＮＡ配列に結合することができる一本鎖核酸配列を含むアンチセンス・オリゴ
ヌクレオチドまたはセンス・オリゴヌクレオチドである。

【００２６】 もう１つの態様において、本発明は、会合した天然パターンのグリコシル化を
有するかまたは有しないｓｅｌ−１０ポリペプチドを含む。酵母または哺乳動物
の発現系（後に論じる）で発現させたｓｅｌ−１０は、分子量およびグリコシル
化パターンにおいて天然のｓｅｌ−１０ポリペプチドと同様であるかまたはかな
り異なり得る。細菌発現系におけるｓｅｌ−１０の発現は、非グリコシル化ｓｅ
ｌ−１０を供するであろう。

【００２７】 本発明のポリペプチドは好ましくは単離形態で提供され、好ましくは実質的に
精製されている。ｓｅｌ−１０ポリペプチドは、硫安またはエタノール沈殿、ア
ニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロース・クロマトグ
ラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、アフィニティー・クロマトグラフ
ィー、ヒドロキシルアパタイト・クロマトグラフィーおよびレクチン・クロマト
グラフィーを含むよく知られた方法によって、組換え細胞培養物から回収し精製
することができる。好ましい具体例において、高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）を精製に利用する。

【００２８】 また、本発明は、本発明のポリヌクレオチド分子を含むベクター、ならびにか
かるベクターで形質転換した宿主細胞に関する。本発明のいずれのポリヌクレオ
チド分子もベクターに連結することができ、該ベクターは、一般的に宿主で増殖
するための選択マーカーおよび複製起点を含んでいる。本発明は前記ポリヌクレ
オチド分子から発現されたｓｅｌ−１０ポリペプチドも提供するため、ｓｅｌ−
１０発現用のベクターが好ましい。該ベクターには、哺乳動物、微生物、ウイル
スまたは昆虫遺伝子由来のもののごとき、好適な転写または翻訳調節配列に作動
可能につなげた、前記または後記のいずかのｓｅｌ−１０ポリペプチドをコード
するＤＮＡが含まれる。調節配列の例には、転写プロモーター、オペレーターま
たはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、ならびに転写および翻訳を制
御する適当な配列が含まれる。調節配列がｓｅｌ−１０をコードするＤＮＡに機
能的に関係する場合には、ヌクレオチド配列は作動可能につなげられている。し
たがって、プロモーター・ヌクレオチド配列がｓｅｌ−１０配列の転写を指示す
る場合には、プロモーター・ヌクレオチド配列はｓｅｌ−１０のＤＮＡ配列に作
動可能につなげられている。

【００２９】 ｓｅｌ−１０をコードするポリヌクレオチド分子のクローニング用、またはｓ
ｅｌ−１０ポリペプチドの発現用に用いる好適なベクターの選択は、勿論、当該
ベクターで形質転換する宿主細胞、および適用できる場合には、ｓｅｌ−１０ポ
リペプチドを発現させるべき宿主細胞に依存するであろう。ｓｅｌ−１０ポリペ
プチドの発現に好適な宿主細胞には、原核生物、酵母および高等真核生物の細胞
が含まれ、それらの各々については以下に論じる。

【００３０】 かかる宿主細胞で発現させるべきｓｅｌ−１０ポリペプチドは、外来タンパク
質からの領域を含む融合タンパク質とすることもできる。かかる領域を含ませて
、例えばポリペプチドの分泌、改善された安定性または精製の容易化を許容する
ことができる。例えば、適当なシグナルペプチドをコードする配列を発現ベクタ
ーに組み入れることができる。シグナルペプチド（分泌リーダー）用のＤＮＡ配
列は、ｓｅｌ−１０がシグナルペプチドを含む融合タンパク質として翻訳される
ように、ｓｅｌ−１０配列にインフレームで融合し得る。意図する宿主細胞で機
能的であるシグナルペプチドは、ｓｅｌ−１０ポリペプチドの細胞外分泌を促進
する。好ましくは、該シグナル配列は細胞からｓｅｌ−１０が分泌される際に、
ｓｅｌ−１０ポリペプチドから切断されるであろう。本発明を実施するのに用い
ることができるシグナル配列の非限定的な例には、ｓｆ９昆虫細胞における酵母
Ｉ−因子およびミツバチ・メラチン（melatin）リーダーが含まれる。

【００３１】 好ましい具体例において、ｓｅｌ−１０ポリペプチドは、当該ポリペプチドの
精製を容易にするために用いる外来領域を含む融合タンパク質であろう。かかる
機能に用いる多くの入手可能なペプチドは、結合パートナーに対する融合タンパ
ク質の選択的結合を許容する。例えば、ｓｅｌ−１０ポリペプチドを修飾してペ
プチドを含ませて、結合パートナーまたはペプチド・タグに特異的に結合する融
合タンパク質を形成させ得る。かかるペプチド・タグの非限定的な例には、６−
Hisタグ、チオレドキシン・タグ、ＦＬＡＧタグ、ヘマグルチニン・タグ、ＧＳ
Ｔタグ、およびＯｍｐＡシグナル配列タグが含まれる。当業者によって理解され
るように、該ペプチドを認識し、それに結合する結合パートナーは、金属イオン
（例えば、金属アフィニティーカラム）、抗体またはそのフラグメント、および
該ペプチドに結合するいずれかのタンパク質またはペプチドを含むいずれかの分
子または化合物とし得る。これらのタグは、各タイプのタグと特異的に反応する
フルオレセイン−またはローダミン−標識抗体によって認識され得る。

【００３２】 ｓｅｌ−１０ポリペプチドの発現に好適な宿主細胞には、原核生物、酵母およ
び高等真核生物の細胞が含まれる。ｓｅｌ−１０の発現に用いる好適な原核生物
宿主には、エスシェリキア（Escherichia）、バチルス（Bacillus）およびサル
モネラ（Salmonella）属の細菌、ならびにシュードモナス（Pseudomonas）、ス
トレプトマイセス（Streptomyces）およびスタフィロコッカス（Staphylococcus
）属のメンバーが含まれる。例えば、イー・コリ（E.coli)における発現に関し
ては、ｓｅｌ−１０ポリペプチドはＮ−末端メチオニン残基を含んで、原核生物
宿主中での組換えポリペプチドの発現を促進させ得る。ついで、該Ｎ−末端Met
は所望により、発現されたｓｅｌ−１０ポリペプチドから切断されてもよい。

【００３３】 原核生物宿主で用いる発現ベクターは、一般的に、１またはそれを超える表現
型選択マーカー遺伝子を含んでいる。かかる遺伝子は、一般的に、例えば抗生物
質抵抗性を付与するかまたは栄養要求性要件を供するタンパク質をコードしてい
る。広範な種々のかかるベクターは商業的供給源から容易に入手可能である。例
には、ｐＳＰＯＲＴベクター、ｐＧＥＭベクター（Promega社製）、ｐＰＲＯＥ
Ｘベクター（ＬＴＩ社製、Bethesda，MD）、Bluescriptベクター（Stratagene社
製）およびｐＱＥベクター（Qiagen社製）が含まれるであろう。

【００３４】 ｓｅｌ−１０は、サッカロマイセス（Saccharomyces）、ピチア（Pichia）お
よびクルベロマイセス（Kluveromyces）を含む属からの酵母宿主細胞でも発現さ
せ得る。好ましい酵母宿主は、エス・セレビシア（S．cerevisiae）およびピイ
・パストリス（P．pastoris）である。酵母ベクターには、しばしば２Ｔ酵母プ
ラスミド由来の複製起点配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポ
リアデニル化用の配列、転写終結用の配列、および選択マーカー遺伝子が含まれ
るであろう。

【００３５】 酵母およびイー・コリ（E.coli)の双方で複製可能なベクター（シャトルベク
ターと呼ばれる）も用いることができる。酵母ベクターの前記の特徴に加えて、
シャトルベクターには、イー・コリ（E.coli)における複製用および選択用の配
列も含まれるであろう。酵母宿主で発現させたｓｅｌ−１０ポリペプチドの直接
分泌は、当該ｓｅｌ−１０をコードするヌクレオチド配列の５'末端に酵母Ｉ−
因子リーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含めることによってなし得る
。

【００３６】 昆虫宿主細胞培養系もｓｅｌ−１０ポリペプチドの発現用に用いることができ
る。好ましい具体例において、本発明のｓｅｌ−１０ポリペプチドは、バキュロ
ウイルス発現系を用いて発現する。昆虫細胞において外来タンパク質を発現させ
るためのバキュロウイルス系の使用に関するさらなる情報は、LuckowおよびSumm
ersによるBio／Technology，6：47（1988）によって概説されている。 もう１つの好ましい具体例において、ｓｅｌ−１０ポリペプチドは哺乳動物宿
主細胞で発現される。好適な哺乳動物セルラインの非限定的な例には、サル腎臓
細胞のＣＯＳ−７ライン（GluzmanらによるCell，23：175（1981））およびチャ
イニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が含まれる。

【００３７】 本発明のｓｅｌ−１０ポリペプチドを発現させるための好適な発現ベクターの
選択は、勿論、用いる特定の哺乳動物宿主細胞に依存し、これは当業者のスキル
の範囲内にある。好適な発現ベクターの例には、ｐｃＤＮＡ３（Invitrogen社製
）およびｐＳＶＬ（Pharmacia Biotech社製）が含まれる。哺乳動物宿主細胞に
おいて用いる発現ベクターには、ウイルスゲノム由来の転写および翻訳制御配列
が含まれ得る。本発明で使用し得る一般的に用いられるプロモーター配列および
エンハンサー配列には、限定されるものではないが、ヒト・サイトメガロウイル
ス（ＣＭＶ）、２型アデノウイルス、ポリオーマウイルスおよびＳＶ４０由来の
ものが含まれる。哺乳動物発現ベクターの構築方法は、例えば、OkayamaおよびB
erg（Mol．Cell．Biol．，3：280（1983））；Cosmanら（Mol．Immunol．，23：
935（1986））；Cosmanら（Nature，312：768（1984））；ＥＰ−Ａ−０３６７
５６６；およびＷＯ９１／１８９８２号に開示されている。

【００３８】 本発明のポリペプチドを用いて、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗
体を生起することもでき、これらはｓｅｌ−１０ポリペプチド発現を検出するた
めの診断アッセイにおいて有用である。かかる抗体は従来技術によって調製し得
る。例えば、Antibodies：A Laboratory Manual，HarlowおよびLand（編者），C
old Spring Harbor Laboratory Press社，Cold Spring Harbor，N．Y．，(1988
）； Monoclonal Antibodies，Hybridomas：A New Dimension in Biological An
alyses，Kennetら（編者），Plenum Press社，New York（1980）。

【００３９】 本発明のｓｅｌ−１０核酸分子は、それがヒト染色体上の特定の位置とハイブ
リダイズし得るため、染色体同定にも価値がある。染色体位置を作成するのに現
在利用可能である実際の配列データ（繰返し多形性）に基く染色体作成試薬（ch
romosome making reagent）がほとんどないため、染色体上の特定のサイトを同
定する現在の要望が存在する。配列が正確な染色体位置にマッピングされれば、
染色体上の該配列の物理位置を遺伝マップデータと関係付けることができる。つ
いで、同一の染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾病との間の関係を、物理
的に近接する遺伝子の同時遺伝を決定する連鎖解析を介して同定することができ
る。ついで、特定の疾病に関連しているようである遺伝子が実際に疾病の原因で
あるか否かを、影響されている個体と影響されていない個体との間の核酸配列を
比較することによって決定し得る。

【００４０】 また、本発明のｓｅｌ−１０ポリペプチドおよびそれをコードするＤＮＡを用
いてＡＤの生物学的機作をさらに明らかにすることができ、最終的には、かかる
機作を変化させるために用いることができる化合物の同定に通じ得る。本発明の
ｓｅｌ−１０ポリペプチドはシイ・エレガンス（C．elegans）のｓｅｌ−１０に
４７．６％同一であって５６.７％類似する。前記したごとく、シイ・エレガン
スのｓｅｌ−１０に対する突然変異は、産卵に関する機能損失を生じるｓｅｌ−
１２に対する突然変異を抑制し、またｌｉｎ−１２に対する特定のハイポモルフ
突然変異も抑制することが知られている。シイ・エレガンスのｓｅｌ−１２に対
する突然変異は、ヒトＡＤ−連鎖遺伝子ＰＳ−１（ｓｅｌ−１２に対して４２.
７％同一）またはＰＳ−２（ｓｅｌ−１２に対して４３.４％同一）のいずれか
によっても救済され得る。しかしながら、家族性ＡＤ−連鎖突然変異を有するヒ
トＰＳ−１は、ｓｅｌ−１２突然変異体を救済する能力が低下している（Levita
n，D．らによるProc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，93：14940−14944（1996））
。

【００４１】 このことは、特にｓｅｌ−１０の予想構造に照らして、ｎｏｔｃｈシグナリン
グ経路におけるヒトおよびシイ・エレガンス遺伝子の相互交換性が、ヒトｓｅｌ
−１０の突然変異がＡＤに通じるＰＳ−１またはＰＳ−２に対する突然変異を抑
制するであろうという予想をより妥当なものとすることを示した。前記したごと
く、ＡＤに通じるＰＳ−１およびＰＳ−２突然変異はＰＳ−１またはＰＳ−２の
タンパク質加水分解プロセシングを妨害するものである。本発明のｓｅｌ−１０
ポリペプチドは、酵母ＣＤＣ４、ユビキチン−依存性タンパク質分解経路におい
て機能する酵素のコンポーネント、を含むβ−トランスデューシンタンパク質フ
ァミリーのメンバーである。したがって、ヒトｓｅｌ−１０は、ユビキチン−プ
ロテアソーム経路を介してプレセニリン分解を調節し得る。それとは別にまたは
それに加えて、ヒトｓｅｌ−１０は、ユビキチン化を介する分解の間にプレセニ
リン活性のモジュレーター、例えば負のレギュレーターを標的化することによっ
て、プレセニリン機能を変化させることができる。したがって、ｓｅｌ−１０に
対する突然変異は、ＰＳ−１またはＰＳ−２に対する突然変異の結果として生じ
るＰＳ−１またはＰＳ−２の誤ったタンパク質加水分解プロセシングを逆転し得
るか、さもなければプレセニリン機能を高め得る。同じ理由で、ｓｅｌ−１０活
性の阻害もＰＳ−１またはＰＳ−２突然変異を逆転するように作用し得る。した
がって、本発明のヒトｓｅｌ−１０ポリペプチドの発現または活性のいずれかを
阻害する化合物はＰＳ−１またはＰＳ−２に対する突然変異の効果を逆転し得、
したがってＡＤの予防または治療に有用であると仮定し得る。

【００４２】 したがって、シイ・エレガンス（C．elegans）は、本発明のヒトｓｅｌ−１０
ポリペプチドの活性または発現を阻害することができる剤を同定するための遺伝
系として用い得る。かかるアッセイにおいて用いるのに好適なシイ・エレガンス
株は、活性シイ・エレガンスｓｅｌ−１０をコードする遺伝子を欠失し、不活性
化ｓｅｌ−１２遺伝子から生じる産卵の機能損失を示す。ｓｅｌ−１２の突然変
異に起因する産卵の機能損失を有するシイ・エレガンス株の構築は、ｓｅｌ−１
２の配列（Genebank受入番号Ｕ３５６６０）および産卵に関する機能損失を生じ
るｓｅｌ−１２に対する突然変異の双方が知られているため、ルーチンの方法を
用いてなし得る（シイ・エレガンス（C．elegans）のｓｅｌ−１２（ar171）の
構築を記載するLevitanらによるNature，377：351−354（1995）を参照されたし
）。かかる株をいかに作製するかの例も、Levitanらに記載されている（Nature
，377：351−354（1995））。シイ・エレガンスのｓｅｌ−１２（ar171）中の野
生型シイ・エレガンスのｓｅｌ−１０も、Levitanらによる前掲におけるｓｅｌ
−１２突然変異導入に用いた技術のごときルーチンの方法を用いて突然変異導入
する。

【００４３】 ヒトｓｅｌ−１０活性を阻害する化合物を同定するために、本発明のいずれか
の野生型ヒトｓｅｌ−１０タンパク質をコードするヒトｓｅｌ−１０遺伝子を含
むＤＮＡベクターを、前記シイ・エレガンス株に導入する。好ましい具体例にお
いて、外来ヒトｓｅｌ−１０遺伝子はシイ・エレガンスのゲノムに組込む。つい
で、Levitanら（Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，93：14940−14944（1996））
に記載されている技術を用いて、該遺伝子を発現させる。ついで、与えられた剤
が、産卵欠損を生じるｓｅｌ−１２またはｌｉｎ−１２に対する突然変異を抑制
するようにｓｅｌ−１０活性を阻害することができるか否かを判定するために、
供試化合物をこの株に投与する。ついで、この株における産卵を、例えばLevita
nら（Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，93：14940−14944(1996)）に記載されて
いるアッセイによって判定する。産卵に対する該化合物の効果がｓｅｌ−１０活
性の阻害に起因することを確認するために、ｓｅｌ−１０における機能損失突然
変異によって影響されることが知られている第二の生化学的または遺伝的経路（
例えば、ｌｉｎ−１２(ｄ)ハイポモルフ株におけるｌｉｎ−１２活性のさらなる
上昇）で、該化合物の作用を試験することができる。かかるアッセイはSundarem
およびGreenwald（Genetics，135：765−783（1993））に記載されているごとく
行い得る。

【００４４】 別法として、化合物をＥ３ユビキチン連結酵素を阻害するその能力について試
験する。かかる活性を実証するアッセイ手法はよく知られており、酵母タンパク
質Ｃｄｃ４ｐ、Ｃｄｃ５３ｐおよびＳｋｐ１ｐならびにＥ１酵素、Ｅ２酵素Ｃｄ
ｃ３４ｐ、ユビキチン、標的タンパク質およびＡＴＰ再生系と一緒に精製ヒトｓ
ｅｌ−１０タンパク質を用いるユビキチン化系の復元が含まれる（Feldmanら，1
997）。ｓｅｌ−１０ユビキチン化系は、酵母コンポーネントのシイ・エレガン
ス相対物、例えばＣｄｃ５３ｐに代る（ｌｉｎ−１９としても知られている）ｃ
ｕｌ−１タンパク質（KipreosらによるCell，85：829（1996））およびＳｋｐ１
ｐに代るタンパク質Ｆ４６Ａ９、またはそれらの哺乳動物相対物、例えばＣｄｃ
５３ｐに代るＣｕｌ−２タンパク質（Kipreosら，前掲）および酵母Ｓｋｐ１ｐ
に代る哺乳動物Ｓｋｐ１ｐでも復元し得る。プロテインキナーゼによって提供さ
れるリン酸化系も、Feldmanら，1997記載のごとく、該アッセイ系に含まれる。

【００４５】 別法として、ヒトｓｅｌ−１０のｃＤＮＡでの形質転換に起因してヒトｓｅｌ
−１０を発現し、その結果ＡＰＰプロセシングの上昇およびＡβ_1-40またはＡβ _1-42 の形成を有するセルラインも、実施例３のごときアッセイに用いることがで
きる。化合物は、ｓｅｌ−１０形質転換セルラインに見られるＡβプロセシング
の上昇を低下させるその能力について試験し得る。

【００４６】 ついで、産卵欠損を救済するかまたはＥ３ユビキチン連結酵素を阻害する化合
物を、ヒト・セルラインにおけるＡβ_1-40またはＡβ_1-42の産生の低下を引起す
その能力についてスクリーニングする。試験化合物を用いて、Ａβ_1-40またはＡ
β_1-42を産生することが知られているＩＭＲ−３２または他のヒト・セルライン
（Asami−OkadaらによるBiochemistry，34：10272−10278(1995)）、または高レ
ベルでヒトＡＰＰを発現するように設計されたヒト・セルラインに暴露する。こ
れらのアッセイにおいては、Ａβ_1-40またはＡβ_1-42を細胞抽出物中または培地
に放出された後に、ＥＬＩＳＡまたは当該技術分野で知られている他のアッセイ
によって測定する（BorcheltらによるNeuron，17：1005−1013（1996）；Citron
らによるNat.Med．，3：67−72（1997））。

【００４７】 本発明を概略的に記載したが、同発明は、説明の方法で供するものであって限
定することを意図するものではない以下の実施例に参照することによってより容
易に理解されるであろう。

【００４８】 実施例 実施例１：シイ・エレガンス（C．elegans）のｓｅｌ−１０のヒト相同物の同定
結果 ＡＣＥＤＢにおけるｓｅｌ−１０の同定： ｓｅｌ−１０は、クローン化多形ａ
ｒＰ３とｈｉｍ−５のすぐ左のＴＣＰＡＲＩ[ＡＣＥＤＢエントリーｗｍ９５ｐ
５３６]との間にマッピングされている。３種のファージ・ラムダクローンが、
インターバル、Ｆ５３Ｃ１１、Ｆ０９Ｆ３およびＦ５５Ｂ１２を横切って配列決
定された。ｓｅｌ−１０は酵母ｃｄｃ４に対してホモロジーを有すると報告され
ている[ＡＣＥＤＢエントリーｗｍ９７ａｂ２５９]。Ｂｌａｓｔ検索により、ａ
ｒＰ３とＧｅｎＰｅｐエントリーＦ５５Ｂ１２.３に対応するＴＣＰＡＲＩとに
よって画定されるインターバル内の酵母ｃｄｃ４（ＣＣ４ ＹＳＴ）にホモロジ
ーを有する単一のＯＲＦが明らかとなった。Ｆ５５Ｂ１２.３は、酵母ｃｄｃ４
と同様に、β−トランスデューシンタンパク質・ファミリーのメンバーである。
このファミリーは、複数のＷＤ４０リピートの存在によって特徴付けられる[Nee
r,E.J.らによるNature，371：297−300（1994）]。

【００４９】 ヒトｓｅｌ−１０相同物、Ｉｎｃｙｔｅ０２８９７１の同定： ＧｅｎＰｅｐエ
ントリーＦ５５Ｂ１２.３を用い、ｔｂｌａｓｔｎを用いてＬｉｆｅＳｅｑ、Ｌ
ｉｆｅＳｅｑ ＦＬおよびＥＭＢＬデータベースを検索した。この検索により、
ＬＩＳ−１（Ｓ３６１１３およびＰ４３０３５）、Miller−Diekerリッセンスフ
ァリー（lissencephaly）において触れられた遺伝子、ゼノプス・ラエビス（Xen
opus laevis）遺伝子、ＴＲＣＰＸＥＮ（Ｕ６３９２１）およびＬｉｆｅＳｅｑ
ＦＬ、０２８９７１におけるヒト・コンティグを含むβ−トランスデューシン・
ファミリーメンバーに対する複数のホモロジーが明かとなった。また、シイ・エ
レガンスのゲノム内には複数のβ−トランスデューシン・ファミリーメンバーが
存在するため、これらを多重ｂｌａｓｔ検索を用いて収集し、ついでｓｅｌ−１
０候補遺伝子で群分けした。多重アライメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ法を用いたＤ
ＮＡＳｔａｒプログラムＭｅｇａｌｉｇｎで行った。これにより、ＬＩＳ−１は
Ｔ０３Ｆ６.Ｆ、異なるβ−トランスデューシン・ファミリーメンバーで群分け
されることが明らかとなり、したがって候補ｓｅｌ−１０相同物としてそれを排
除した。ＴＲＣＰＸＥＮは、Ｆ５５Ｂ１２.３およびＣＣ４ＹＳＴでも群分けさ
れる遺伝子である遺伝子であるＫ１０Ｂ２.１で群分けされ、一方Ｉｎｃｙｔｅ
０２８９７１はｓｅｌ−１０で群分けされた。したがって、Ｉｎｃｙｔｅ０２８
９７１はシイ・エレガンスｓｅｌ−１０のヒト相同物をコードするようである。
ｓｅｌ−１０と０２８９７１との間の配列ホモロジーは、ＷＤ４０モチーフの７
リピートを含むタンパク質の領域中で最強である。Ｉｎｃｙｔｅ０２８９７１コ
ンティグは、膵臓、肺、Ｔ−リンパ球、繊維芽細胞、乳房、海馬、心筋、腸ほか
を含む複数のライブラリーからの４４個のＥＴＳを含む。

【００５０】 パブリック用ＥＳＴ： ＴＲＥＭＢＬＰデータセットに対するＤＮＡ配列０２８
９７１を用いたｂｌａｓｔｘ検索により、ＩＭＡＧＥライブラリーからの単一相
同物マウスＥＳＴ（Ｗ８５１４４）、ソアレス（Soares）マウス胚ＮｂＭＥ１３
.５が同定された。Ｗ８５１４４についでＦ５５Ｂ１２.３を用いた０２８９７１
のｂｌａｓｔｘアライメントにより、おそらくは配列決定エラーに起因する０２
８９７１のリーディングフレーム中の変化が明かとなった。

【００５１】 ０２８９７１ＤＮＡ配列を用いたＥＭＢＬ ＥＳＴデータベースのｂｌａｓｔ
ｎ検索により、Ｗ８５１４４に加えて、０２８９７１のコード配列と整列する３
個のヒトＥＳＴおよび０２８９７１配列の３'非翻訳領域と整列する６個のＥＳ
Ｔが明かとなった。

【００５２】 タンパク質モチーフ： ２種のタンパク質モチーフがＦ５５Ｂ１２.３中に同定
され、それらは酵母ｃｄｃ４、マウスｗ８５１４４およびヒト０２８９７１と共
有していた。これらは、Ｎ−末端ドメイン中のＦ−ボックスおよびＣ−末端ドメ
イン中の７個のβ−トランスデューシン・リピートである。

【００５３】 ディスカッション ｓｅｌ−１０遺伝子は、β−トランスデューシンタンパク質ファミリーのメン
バーをコードする。これらは、複数のＷＤ４０リピートの存在によって特徴付け
られる[Neer，E．J．らによるNature，371：297−300（1994）]。該リピートは
２０−４０アミノ酸長であって、ｇｌｙ−ｈｉｓ（ＧＨ）およびｔｒｐ−ａｓｐ
（ＷＤ）残基によって結合されている。β−トランスデューシンの三次元構造の
解釈は、ＷＤ４０リピートが７枚ブレードのプロペラ様構造のアームを形成する
ことを示している[Sondek，J.らによるNature，379：369−74（1996）]。各ブレ
ードは、１個の内部β鎖の境界を形成するタンパク質モチーフ中のペアの保存ア
スパラギン酸残基とβ−シートの４個の交互プリーツによって形成されている。
ＷＤ４０リピートは、多様な機能クラスを表す２７種の異なるタンパク質にわた
って見出されている[Neer，E.J.らによるNature，371：297−300（1994）]。こ
れらは、細胞分裂、細胞寿命の決定、遺伝子転写、シグナル伝達、タンパク質分
解、ｍＲＮＡ修飾および小胞融合を含む細胞機能を調節している。機能における
この多様性は、そこに複数のタンパク質複合体が会合し得る共通のスカフォール
ドをβ−トランスデューシン・ファミリーメンバーが供しているという仮説に通
じた。

【００５４】 酵母ｃｄｃ４遺伝子に対するｓｅｌ−１０、２８９７１およびＷ８５１４４の
ホモロジーは、タンパク質の細胞内分解のためのユビキチン−プロテアソーム経
路における機能的な役割を示唆している。酵母ｃｄｃ４遺伝子の突然変異は、Ｓ
−期サイクリン／ｃｄｋ複合体のインヒビターであるＳｉｃ１の分解を遮断する
ことによって細胞周期拘束を引起す[King，R．W．らによるScience，274：1652
−9（1996）]。Ｓｉｃ１のリン酸化は、ユビキチン−プロテアソーム経路を介し
た破壊にそれを標的化する。この経路は複数のタンパク質複合体によって触媒さ
れる３種のリンクした酵素反応よりなる[Ciechanover，A.によるCell，79：13−
21（1994）；Ciechanover，A.およびA.L.SchwartzによるFASEB J.，8：182−91
（1994）]。最初に、ユビキチンのＣ−末端グリシンがＡＴＰによって活性化さ
れて、ユビキチン−活性化酵素、Ｅ１によって触媒される反応において、高エネ
ルギーチオールエステル中間体を形成する。活性化後に、Ｅ２酵素（ユビキチン
コンジュゲート酵素）がＥ１からタンパク質標的へユビキチンを移行する。幾つ
かの場合においては、Ｅ２が単独で作用する。他の場合においては、それはタン
パク質基質を結合するＥ３ユビキチン連結酵素と協同して作用し、ついでＥ２を
回復させてユビキチン化を触媒する。Ｅ２ユビキチン−コンジュゲート酵素は、
かなり保存された遺伝子ファミリーを含み、一方Ｅ３酵素は配列中で拡散してい
る[Ciechanover，A.によるCell，79：13−21（1994）；Ciechanover，A.およびA
.L.SchwartzによるFASEB，J.，8：182−91（1994）]。

【００５５】 酵母においては、Ｅ２ユビキチン−コンジュゲート酵素、ｃｄｃ３４の突然変
異は、Ｓ−期サイクリン／ｃｄｋ複合体のＳｉｃ１インヒビター分解の不実行を
介して細胞周期拘束を引起す[King，R．W．らによるSience，274：1652−9（199
6）]。Ｓｉｃ１は、通常、細胞がＧ１−Ｓ期移行に入るにつれて分解されるが、
ｃｄｃ３４が存在しなければＳｉｃ１は分解を回避し、その蓄積が細胞周期拘束
を引起す。ｃｄｃ３４のほかには、ｃｄｃ４がＧ１−Ｓ期移行に必要な３種のほ
かのタンパク質のうちの１種である。ほかの２種はｃｄｃ５３およびＳｋｐ１で
ある。前記で論じたごとく、ｃｄｃ４は２個の構造モチーフ、（当該タンパク質
がβ−プロペラを形成することを示唆する）７個のＷＤ４０リピート、およびＳ
ｋｐ１に対する相互作用ドメインであるサイクリンＦと共有する構造モチーフを
含む[Bai，C．らによるCell，86：263−74（1996）]。ｃｄｃ５３、ｃｄｃ４お
よびｓｋｐ１（ならびにユビキチン、ｃｄｃ３４およびＥ１も）含有する昆虫細
胞ライゼートがユビキチンをＳｉｃ１に移行することができることは、これらの
コンポーネントのうちの１種またはそれを超えるものがＥ３ユビキチン連結酵素
として機能することを示唆している[King，R．W．らによるScience，274：1652
−9（1996）]。ｃｄｃ４またはＳｋｐ１のいずれかの発現の増大は、部分的に他
のものの損失を救済する。

【００５６】 シイ・エレガンスにおいて、ｓｅｌ−１０の突然変異が目に見える表現型を何
ら有しないことは、ｓｅｌ−１０が細胞周期の調節において役割を演じていない
ことを示している。極めて関連の深いシイ・エレガンスのβ−トランスデューシ
ン・ファミリーメンバー、Ｋ１０Ｂ２.６は、サイクリンＢ分解の不実行に起因
する末期の後期に拘束された酵母細胞周期突然変異体を救済するゼノプス・ラエ
ビスからの遺伝子ＴＲＣＰ ＸＥＮとそれが群分けされるため、その役割を演じ
得る[Spevak，W.らによるMol．Cell．Biol.，13：4953−66（1993）]。ｓｅｌ−
１０がＥ３−ユビキチン連結酵素のコンポーネントを実際にコードしている場合
には、いかにしてそれはｓｅｌ−１２を抑制し、ｌｉｎ−１２突然変異を増大し
得るのであろうか？基も単純な仮説は、ｓｅｌ−１０がユビキチン−プロテアソ
ーム経路を介した双方のタンパク質の分解を調節しているということである。ｓ
ｅｌ−１２およびｌｉｎ−１２は双方とも貫膜タンパク質である。ｓｅｌ−１２
はそのＮ−およびＣ−末端がサイトゾルに面するように８回膜を貫通し[Kim，T.
W.らによるJ.Biol.Chem.，272：11006−10（1997）]、一方ｌｉｎ−１２はＩ型
貫膜タンパク質である（Greenwald，I．およびG．SeydouxによるNature，346：1
97−9（1990））。双方ともユビキチン化され、ヒトＰＳ２の場合には、プロテ
アソームのインヒビター、Ｎ−アセチル−Ｌ−ロイシナル−Ｌ−ノルロイシナル
およびラクタシスチンで処理した細胞において安定状態レベルが増大する（Li，
X.およびI．GreenwaldによるNeuron．，17：1015−21（1996））。それとは別に
、ｓｅｌ−１０はプレセニリン機能の負のレギュレーターの分解を標的化し得る
。

【００５７】 ｃｄｃ４に対するホモロジーによって示唆された遺伝解析およびタンパク質機
能は、ヒトｓｅｌ−１０の薬剤インヒビターがヒト・プレセニリンの安定状態レ
ベルを増大し得ることを意味している。これは、プレセニリン経路の活性を強化
し、アルツハイマー病における臨床的仲介の方法を提供し得る。

【００５８】 実施例２： シイ・エレガンスにおけるプレセニリン突然変異の余分遺伝子（ex
tragenic）サプレッサー、ｓel−１０をコードするヒトｃＤＮＡの５'ＲＡＣＥ
クローニング 材料および方法 シイ・エレガンスのｃＤＮＡからのｓｅｌ−１０コード配列の増幅用のオリゴ
ヌクレオチド・プライマーは、実施例１でシイ・エレガンスｓｅｌ−１０に対す
るコード配列として同定したＦ５５Ｂ１２.３の配列に基づいて調製した。調製
したプライマーは： 5’−CGGGATCCACCATGGATGATGGATCGATGACACC−３’（配列番号：１１）および 5’−GGAATTCCTTAAGGGTATACAGCATCAAAGTCG−３’（配列番号：１２）であった。
シイ・エレガンスｍＲＮＡは、ＢＲＬ Superscript II Preamplificationキッ
トを用いてｃＤＮＡに変換した。そのＰＣＲ産物を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥ
ｃｏＲＩ（ＬＴＩ社製，Gaithersberg，MD）で消化し、ｐｃＤＮＡ３.１（Invit
rogen社製）にクローン化した。２種のアイソレートを配列決定した（ＡＢＩ，P
erkin−Elmer Corp．社製）。

【００５９】 （シイ・エレガンスのｓｅｌ−１０のヒト相同物の一部分をコードする）Ｉｎ
ｃｙｔｅクローン０２８９７１の配列を用いて、４種のアンチセンス・オリゴヌ
クレオチドプライマー：5’−TCACTTCATGTCCACATCAAAGTCC−3’（配列番号：１
３）、 5’−GGTAATTACAAGTTCTTGTTGAACTG−3’（配列番号：１４）、 5’−CCCTGCAACGTGTGTAGACAGG−3’（配列番号：１５）、および 5’−CCAGTCTCTGCATTCCACACTTTG−3’（配列番号：１６）を設計して、ヒトｓｅ
ｌ−１０の欠失している５’末端を増幅した。Ｉｎｃｙｔｅ ＬｉｆｅＳｅｑ “
Electronic Northern”分析を用いて、ｓｅｌ−１０が発現した組織を同定した
。これらのうちの２種、海馬および乳腺を、CloneTech Marathonキットを用いる
５’ＲＡＣＥクローニングに選択し、海馬および乳腺からMarathon準備のできた
（ready）ｃＤＮＡを調製した。ＰＣＲ産物をＴＡベクターｐＣＲ３.１（Invitr
ogen社製）にクローン化し、アイソレートを配列決定した。別の５’オリゴヌク
レオチド・プライマーも、海馬ｓｅｌ−１０配列とは異なる５’末端を有するＩ
ｎｃｙｔｅクローンに基づいて設計した： 5’−CTCAGACAGGTCAGGACATTTGG−3’（配列番号：１７）。 ｂｌａｓｔｎを用いてＩｎｃｙｔｅデータベースＬｉｆｅＳｅｑおよびＬｉｆ
ｅＳｅｑＦＬを検索した。ＧＣＧプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Pa
ckage，Version 8 for Unix, Genetics Computer Group社, University Researc
h Park, Madison, Wisconsin）を用いてギャップ・アライメントおよび翻訳を行
った。

【００６０】 結果 シイ・エレガンスのsel−１０のコード配列： シイ・エレガンスのｓｅｌ−１
０の予想コード配列、Ｆ５５Ｂ１２.３は、ゲノミック・コスミドＦ５５Ｂ１２
中のイントロンおよびエキソンを予想するためのコンピュータ・プログラムGene
Finderを用いることによって、Genome Sequencing Center, Washington Univers
ity, St. Louisで元々決定された。推定ｃＤＮＡ配列は、シイ・エレガンスのｃ
ＤＮＡからのこの領域を増幅し、それをクローニングして配列決定することによ
って確認した。

【００６１】 ヒトｓｅｌ−１０遺伝子相同物のコード配列： すべての０２８９７１アンチセ
ンス・オリゴヌクレオチドは、ヒト海馬および乳房のｃＤＮＡからの５’ＲＡＣ
Ｅ産物を増幅した。海馬反応からの最長のＰＣＲ産物をクローン化して配列決定
した。このＰＣＲ反応は、予想終止コドンで終結する産物を生成するように設計
した。該２種のアイソレートは、０２８９７１配列の開始点の前の８８０塩基で
始る同一配列を含んでいた。この配列は、広がるＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡクロー
ンとの比較によって確認した。ヒトのｓｅｌ−１０相同物の５’末端に広がるＩ
ｎｃｙｔｅクローンは、ヒト遺伝子とシイ・エレガンス遺伝子との間のこの領域
におけるホモロジーが低く、かつこのクローンと注釈を付けなかったクローンと
の間の重複が偶然にも、Ｉｎｃｙｔｅデータベース中で群分けされるそれに対し
て小さすぎるか、または０２８９７１配列でのＩｎｃｙｔｅデータベースの我々
のｂｌａｓｔ検索（blasting）によってカバーされなかったため、Ｆ５５Ｂ１２
.３と注釈を付けなかった。

【００６２】 ヒトのｓｅｌ−１０の推定タンパク質配列はシイ・エレガンスのｓｅｌ−１０
に対して４７.６％同一性および５６.７％類似性を有する。ヒトｓｅｌ−１０配
列のＮ−末端は４個のインフレーム・メチオニンで開始する。前記したＷＤ４０
リピートに加えて、ヒト配列は、ｓｅｌ−１０相同物について予想されたごとく
、Ｓｋｐ１結合用のＣＤＣ４ Ｆ−ボックスに相同な領域も含む。

【００６３】 乳房組織および海馬組織で発現された異なるヒトｓｅｌ−１０のｍＲＮＡ： 海馬配列とは異なる幾つかのさらなるヒトｓｅｌ−１０ＥＳＴを同定した。こ
れらは、別の転写物がおそらく真性であるということを示す正確な対合である。
これらの配列とヒト海馬ｓｅｌ−１０配列との比較は、４番目のインフレーム・
メチオニンの前の多様性、およびその後の正確な配列対合を示す。この別の転写
物の５’末端に特異的なオリゴヌクレオチド・プライマーは、乳房ｃＤＮＡから
の産物を増幅するが、海馬ｃＤＮＡからの産物は増幅しないことが判明した。こ
のことは、ヒトｓｅｌ−１０転写物が組織−特異的様式で異なるスプライシング
を受けるか、または該遺伝子が複数の組織特異的プロモーターを含むかのいずれ
かを示す。

【００６４】 ディスカッション ５’ＲＡＣＥおよびＰＣＲ増幅を用いて、シイ・エレガンス遺伝子、ｓｅｌ−
１０のヒト相同物をコードする完全長ｃＤＮＡをクローン化した。配列分析によ
り、ｓｅｌ−１０がＦ−ボックスおよびＷＤ−４０リピートドメインを含むタン
パク質のＣＤＣ４ファミリーのメンバーであるという初期の予想が確認された。
ヒトｓｅｌ−１０のｃＤＮＡの２種の変異型を海馬および乳腺からクローン化し
、これらは翻訳開始の見かけのサイトに先んずる５’配列において異なっていた
。このことは、該遺伝子が組織特異的である転写開始用の２またはそれを超える
出発サイトを有し得ること、またはエキソン・スプライシングのパターンが組織
特異的であることを意味している。

【００６５】 実施例３： ヒト細胞におけるエピトープ−タグドｓｅｌ−１０の発現、および
ヒトｓｅｌ−１０によるアミロイドβペプチドのプロセシングの撹乱 材料および方法 エピトープ−タグドＳｅｌ−１０の構築：サブクローニング、細胞増殖およびト
ランスフェクション： ＥｃｏＲＩサイトを、オリゴヌクレオチド２３７ （5’−GGAATTCCATGAAAAGATTGGACCATGGTTCTG−3’）（配列番号：１８）および
２０６（5’−GGAATTCCTCACTTCATGTCACATCAAAGTCCAG−3’）（配列番号：１９）
で開始させる（prime）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてヒトｓｅｌ−
１０のｃＤＮＡにインフレームで導入した。得られたＰＣＲ産物をベクターｐＣ
Ｓ２＋ＭＴのＥｃｏＲＩサイトにクローン化した。これは、海馬ｓｅｌ−１０の
ｃＤＮＡの５番目のメチオニン、すなわち配列番号：１に示す配列のヌクレオチ
ド３０６の上流にインフレームで５’６−ｍｙｃエピトープ・タグを融合する。
６ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ−１０と命名したこの構築物のヌクレオチド配列を配列番
号：２０に示し、一方それによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を
配列番号：２１に示す。海馬および乳房ｓｅｌ−１０のｃＤＮＡはこのメチオニ
ンの上流で異なる。３'−ＦＬＡＧタグを有するＰＳ１のｃＤＮＡ（ＰＳ１−Ｃ
−ＦＬＡＧ）をｐｃＤＮＡ３.１ベクターにサブクローン化した。スウェディッ
シュＮＬ突然変異およびＡＰＰ６９５のＣ−末端に対するジ−リシル・モチーフ
の付加よりなる低減ＥＲ保持配列を含むＡＰＰのｃＤＮＡ（ＡＰＰ６９５ＮＬ−
ＫＫ）をベクターｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰにクローン化した（MullanらによるNat
．Genet．，１９９２年８月；1（5）：345−7）。ＨＥＫ２９３およびＩＭＲ３
２細胞は、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で８０％密集となるまで増殖させ
、上記ｃＤＮＡでトランスフェクトした。合計１０ｍｇの全ＤＮＡ／６×１０⁶
細胞を、単一プラスミドでのトランスフェクションに用いた。複数のプラスミド
の同時トランスフェクションについては、等量の各プラスミドを、LipofectAmin
e（ＢＲＬ社製）を用いて合計１０ｍｇのＤＮＡに対して用いた。

【００６６】 Ｃ−末端Ｖ５ hisタグドｓｅｌ−１０およびＣ−末端ｍｙｃｈｉｓタグドｓｅ
ｌ−１０を構築するために、ヒト海馬ｓｅｌ−１０のコード配列を、５'プライ
マー上にＫｐｎＩ制限サイトを含むオリゴヌクレオチドプライマー： 5'−GGGTACCCCTCATTATTCCCTCGAGTTCTTC−3'（配列番号：２２）および３'プライ
マー上にＥｃｏＲＩ制限サイトを含むオリゴヌクレオチドプライマー： 5'−GGAATTCCTTCATGTCCACATCAAAGTCC−3'（配列番号：２３）を用い、鋳型とし
て元のヒトｓｅｌ−１０ＲＡＣＥｐｃｒ産物を用いて増幅させた。その産物をＫ
ｐｎＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ベクターｐｃＤＮＡ６／Ｖ５−His Ａまたは
ｐｃＤＮＡ３.１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（＋）Ａ（Invitrogen社製）のいずれかにク
ローン化した。独立アイソレートのヌクレオチド配列をジデオキシ配列決定法に
よって確認した。Ｃ−末端Ｖ５ hisタグドｓｅｌ−１０のヌクレオチド配列を配
列番号：２４に示し、一方それによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配
列を配列番号：２５に示す。独立アイソレートのヌクレオチド配列はジデオキシ
配列決定法によって確認した。Ｃ−末端ｍｙｃｈｉｓタグドｓｅｌ−１０のヌク
レオチド配列を配列番号：２６に示し、一方それによってコードされるポリペプ
チドのアミノ酸配列を配列番号：２７に示す。

【００６７】 ＦＡＣＳによる形質転換細胞のクローナル選択： 細胞試料を、空冷アルゴン
レーザーによって供給される４８８ｎｍ励起ラインを備えたEPICS Elite ESPフ
ローサイトメーター（Coulter社製，Hialeah，FL）上で分析した。EGFP放射は５
２５ｎｍバンド−パスフィルターを通して測定し、蛍光強度は、前方および右方
に角度をなす光散乱によって測定した、能力のある細胞にゲートした（gating）
後に４−桁対数スケールで表示した。単一の緑色細胞が、Ｇ４１８を含まない増
殖培地を含有する１枚の９６ウェルプレートの各ウェルに分離された。４日間の
回復期間の後に、該培地に最終濃度４００ｍｇ／ｍｌでＧ４１８を添加した。ク
ローンを含むウェルを、各継代の拡大につき選択した最速の増殖コロニーでもっ
て、９６ウェルプレートから２４ウェルプレートに、ついで６ウェルプレートに
拡げた。

【００６８】 免疫蛍光法： スライド上で増殖させた細胞をトランスフェクトから４８時間
後に、氷上、４％のホルムアルデヒドおよびＰＢＳ中の０.１％のTriton X−100
で３０分間固定し、ついで室温（すなわち、２５℃）下、ＰＢＳ中の１０％ヤギ
血清（ブロッキング溶液）で１時間ブロックし、つづいて４℃ Ｏ／Ｎにてマウ
ス抗−ｍｙｃ抗体（１０ｍｇ／ｍｌ）またはウサギ抗−ＦＬＡＧ抗体（０.５ｍ
ｇ／ｍｌ）と共にインキュベートし、ついで２５℃にてブロッキング溶液中のフ
ルオレセイン−標識ヤギ抗マウス抗体または抗−ウサギ抗体（５ｍｇ／ｍｌ）と
共に１時間インキュベートした。

【００６９】 ウェスタンブロット： 氷上にて１０⁵細胞を１００ｍｌのＴＥＮＴ（５０ｍ
Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.０、２ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、
１％のTriton X−100、１×プロテアーゼインヒビターのカクテル）と１０分間
インキュベートし、つづいて１４,０００×ｇにて遠心することによって、細胞
ライゼートをトランスフェクション４８時間後に作成した。その上清を４−１２
％ NuPageゲルに負荷し（５０ｍｇタンパク質／レーン）、Xcell II Mini−Cell
システム（Novex社製）を用いて電気泳動およびトランスファーを行った。該ブ
ロットをＰＢＳ中の５％ミルクでＲＴにて１時間ブロックし、４℃ Ｏ／Ｎにて
抗−ｍｙｃまたは抗−ＦＬＡＧ抗体（“免疫蛍光法”に前記した）とインキュベ
ートし、ついでヒツジ抗−マウスまたは抗−ウサギ抗体−ＨＲＰ（０.１ｍｇ／
ｍｌ）とＲＴにて１時間インキュベートし、つづいてSupersignal（Pierce社製
）検出した。

【００７０】 ＥＬＩＳＡ： 細胞培養物上清または細胞ライゼート（１００ｍｌのギ酸／１
０⁶細胞）を、培養物上清中のＡβ１−４０およびＡβ１−４２ペプチドのレベ
ルを検出できる以下の二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡでアッセイした。 ヒトＡβ１−４０およびＡβ１−４２は、二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡで
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）６Ｅ１０（Senetek社製，St．Louis，MO）および
ビオチン化ウサギ抗血清１６２または１６４（NYS Institute for Basic Resear
ch社製，Staten Island，NY）を用いて測定した。捕捉抗体６Ｅ１０は、ｈＡβ
のＮ−末端アミノ酸残基１−１６上に存在するエピトープに対して特異的である
。コンジュゲート検出抗体１６２および１６４は、各々、ｈＡβ１−４０および
１−４２に対して特異的である。サンドイッチＥＬＩＳＡは、Pirttilaらの方法
（Neurobiology of Aging，18：121−7（1997））に従って行った。簡単には、N
unc Maxisorp 96ウェルイムノプレートを、０.１Ｍの炭酸塩−重炭酸塩緩衝液、
ｐＨ９.６中で希釈したｍＡｂ ６Ｅ１０（５μｇ／ｍｌ）、１００μｌ／ウェル
でコートし、４℃にて一晩インキュベートした。該プレートを、０.０５％のツ
イーン−２０を含有する０.０１ＭのＤＰＢＳ（修飾ダルベッコリン酸緩衝化生
理食塩水（Pierce社製，Rockford，IL）（０.００８Ｍのリン酸ナトリウム、０.
００２Ｍのリン酸カリウム、０.１４Ｍの塩化ナトリウム、０.０１Ｍの塩化カリ
ウム、ｐＨ７.４））（ＤＰＢＳＴ）で３回洗浄した後、該プレートを０.０１Ｍ
のＤＰＢＳ中の１０％ノーマルヒツジ血清（Sigma社製）２００μｌで６０分間
ブロックして、非特異的な結合を回避した。プラートを洗浄した後に、ＤＭＳＯ
中の１ｍｇ／ｍｌストック溶液から希釈したヒトＡβ１−４０および１−４２標
準１００μｇ／ウェル（Bachem社製，Torrance，CA）を、非トランスフェクト条
件細胞培地、ならびに１００μｌ／ウェルの試料、すなわちトランスフェクト細
胞の濾過した条件培地に添加した。該プレートを室温にて２時間、ついで４℃に
て一晩インキュベートした。翌日に、該プレートを洗浄した後、ＤＰＢＳＴ＋０
.５％のＢＳＡ中に各々１：４００または１：５０で希釈した１００μｌ／ウェ
ルのビオチン化ウサギ抗血清１６２または１６４を添加し、室温にて１時間１５
分間インキュベートした。洗浄後に、ＤＰＢＳＴ中に１：１０,０００で希釈し
た１００μｌ／ウェルのニュートラビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（Pier
ce社製，Rockford，IL）を適用し、室温にて１時間インキュベートした。最後の
洗浄後に、１００μｌ／ウェルの５０ｍＭクエン酸／１００ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液（Sigma Chemicals社製，St．Louis，MO）、ｐＨ５.０中のｏ−フェニ
レンジアミン二塩酸塩（Sigma Chemicals社製，St．Louis，MO）を基質として添
加し、Soft max Pro softwareを用いて、キネティック・マイクロプレートリー
ダーにおいて４５０ｎｍにて２０分間発色をモニターした。

【００７１】 結果 ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクション： トランスフェクション効率は、
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するベクターの使用を介してか、またはエ
ピトープ−タグドｓｅｌ−１０もしくはＰＳ１の免疫蛍光検出によってモニター
した。Ｎ−末端の６−ｍｙｃエピトープを用いてヒトｓｅｌ−１０をタグし（６
ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ−１０）、一方、ＰＳ１はＣ−末端ＦＬＡＧエピトープでタ
グした（ＰＳ１−Ｃ−ＦＬＡＧ）。ＡＰＰ６９５はスウェディッシュＮＬ突然変
異を含めることによって修飾してＡβプロセシングおよびＣ−末端ジ−リシン・
モチーフよりなる軽減小胞体（ＥＲ）保持シグナルを増大させた。該ジ−リシン
・モチーフはＡβプロセシングを約２倍増大させた。ＡＰＰ６９５ＮＬ−ＫＫ構
築物をＧＦＰを含む二シストロンベクター（ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ、Invitrogen
社製）の第１のシストロンに挿入して、我々がトランスフェクション効率をモニ
ターし得るようにした。ＨＥＫ２９３細胞におけるトランスフェクション効率は
、単一のプラスミドＤＮＡでのトランスフェクションについて約５０％であった
。２種のプラスミドを用いた同時トランスフェクションについては、約３０−４
０％の細胞が二重免疫蛍光法によって検出して双方のタンパク質を発現していた
。

【００７２】 トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞における組換えタンパク質の発現は、ＰＳ
１−Ｃ−ＦＬＡＧおよび６ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ−１０について説明したごとくウ
ェスタンブロットによって確認した（図１Ａ）。３種のプラスミド（ＰＳ１−Ｃ
−ＦＬＡＧ＋６ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ−１０＋ＡＰＰ）での同時トランスフェクシ
ョンの場合では、３種すべてのタンパク質が適当な抗体を用いたウェスタンブロ
ットによって同一の細胞ライゼート中に検出された（図１Ｂ）。

【００７３】 Ａβプロセシングに対する６ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ−１０およびＰＳ１−Ｃ−Ｆ
ＬＡＧの効果： ＡＰＰ６９５ＮＬ−ＫＫと６ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ−１０または
ＰＳ１−Ｃ−ＦＬＡＧのＨＥＫ２９３細胞への同時トランスフェクトは、培養物
上清へのＡｂ１−４０およびＡｂ１−４２の放出を、ＡＰＰ６９５ＮＬ−ＫＫの
みでのトランスフェクションよりも２倍ないし３倍増大させた（表１）。ＡＰＰ
６９５ＮＬ−ＫＫと６ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ−１０およびＰＳ１−Ｃ−ＦＬＡＧの
双方との同時トランスフェクトは、Ａｂ放出をなおさらに増大させた（すなわち
、４倍ないし６倍の増大）。それに対して、上清に放出されたＡｂ１−４２／（
Ａｂ１−４０＋Ａｂ１−４２）の比は約５０％低下した。Ａｂ１−４２／（Ａｂ
１−４０＋Ａｂ１−４２）の比における僅かな低下は、Ａｂ１−４２に対するＡ
ｂ１−４０のより大きな増加を反映している。６ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ−１０もＰ
Ｓ１−Ｃ−ＦＬＡＧもＨＥＫ２９３細胞における内因性Ａｂ産生に影響しなかっ
た。同様の知見はＩＭＲ３２細胞でも得られた（表２）。しかしながら、トラン
スフェクトしたＩＭＲ３２細胞はＨＥＫ２９３細胞よりも良好でなく、したがっ
て６ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ−１０またはＰＳ１−Ｃ−ＦＬＡＧでの同時トランスフ
ェクションによるＡＰＰ６９５ＮＬ−ＫＫプロセシングの刺激はより低かった。

【００７４】 ＡＰＰ６９５ＮＬ−ＫＫでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞において発
現されたＡｂ１−４０のレベルは、培養上清および細胞ペレットの双方中のＡｂ
ペプチドを測定するのに十分であった。ＡＰＰ６９５ＮＬ−ＫＫのみでトランス
フェクトした細胞の上清におけるよりも、かなりより多いＡｂ１−４０がＨＥＫ
２９３細胞ペレットで検出された。６ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ−１０またはＰＳ１−
Ｃ−ＦＬＡＧでの同時トランスフェクトは、細胞ペレット中のＡｂ１−４０を比
例して低下させ、かつ、培養上清中のＡｂを増大させた。このことは、６ｍｙｃ
−Ｎ−ｓｅｌ−１０およびＰＳ１−Ｃ−ＦＬＡＧが、比例してより多いＡｂが細
胞から放出されるようにＡＰＰのプロセシングまたは通行（trafficking）を変
化させることを意味している。

【００７５】 内因性Ａβプロセシングに対する６ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ−１０およびＰＳ１−
Ｃ−ＦＬＡＧ発現の効果： ヒト細胞による内因性ＡＰＰのプロセシングに対す
る６ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ−１０の効果を、このタンパク質を発現する安定に形質
転換したＨＥＫ２９３セルラインを作成することによって評価した。６ｍｙｃ−
Ｎ−ｓｅｌ−１０を発現する２種のセルライン（ｓｅｌ−１０／２およびｓｅｌ
−１０／６）を、ｐｃＤＮＡ３.１ベクターＤＮＡで形質転換した対照セルライ
ンと共に誘導した。双方の６ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ−１０セルラインは、ウェスタ
ンブロット分析によって示されたごとく該タンパク質を発現していた。Ａｂ１−
４０の内因性産生は、ベクターＤＮＡで形質転換した細胞とは対照的に、双方の
６ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ−１０セルラインにおいて増大していた（表３）。加えて
、６ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ−１０の安定発現は、ＡＰＰ６９５ＮＬ−ＫＫプラスミ
ドＤＮＡでトランスフェクトした後にＡｂ産生を顕著に増大させた（表３）。同
様の結果が、ＰＳ１−Ｃ−ＦＬＡＧを発現する６種の安定セルラインで得られた
。６種すべてのセルラインは、内因性Ａβプロセシングの顕著な上昇を示し、ま
たすべてが、ＡＰＰ６９５ＮＬ−ＫＫでトランスフェクトした後にＡｂのプロセ
シングの上昇も示した（表３）。加えて、６ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ−１０で示され
たＡβプロセシングの増大は、ｍｙｃｈｉｓまたはｖ５ｈｉｓのいずれかでＣ−
末端でタグしたｓｅｌ−１０でも認められた（表４を参照されたし）。Ｃ−末端
およびＮ−末端の双方のタグは、Ａβプロセシングにおける増大を生じた。

【００７６】 ディスカッション これらのデータは、過剰発現された場合に、６ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ−１０なら
びにＰＳ１−Ｃ−ＦＬＡＧが一過性および安定発現系の双方におけるＡβプロセ
シングを変化させることを示唆している。６ｍｙｃ−エピトープタグをこれらの
実験において用いて、ウェスタンブロット分析によるｓｅｌ−１０タンパク質発
現の検出を可能とした。酵母ＣＤＣ４に対するその配列ホモロジーが示唆するご
とく、ｓｅｌ−１０がＥ２−Ｅ３ユビキチン・リガーゼである場合には、ユビキ
チン化についてそれが標的化するタンパク質を同定することが可能であるにちが
いない。プレセニリンはユビキチン−プロテアソーム経路を介して分解されるた
め、ＰＳ１およびＰＳ２はｓｅｌ−１０触媒ユビキチン化の論理的な標的である
[KimらによるJ．Biol.Chem．，272：11006−11010（1997）]。現時点においては
、いかにしてｓｅｌ−１０がＡβプロセシングに影響するかは理解されていない
。将来、ｓｅｌ−１０およびＰＳ１が、ＡＰＰの産生、プロセシング、輸送また
は代謝を変化させることによってＡβプロセシングを増大させるのか、およびＰ
Ｓ１の効果がｓｅｌ−１０によって媒介または調節されているのかを決定するこ
とが必要であろう。

【００７７】 これらの実験は、ｓｅｌ−１０がＡＤの治療においてＡｂレベルを低下させる
潜在的な薬物標的であることを示唆している。また、それらは、シイ・エレガン
スがＡＤの状況におけるプレセニリン生物学を調査するための最良のモデル系で
あることも示している。したがって、同時トランスフェクション実験ならびに安
定形質転換体によって示されたごとく、６ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ−１０またはＰＳ
１−Ｃ−ＦＬＡＧの発現はＡβプロセシングを増大させる。Ａβプロセシングに
おける増大は、ＡＰＰ６９５ＮＬ−ＫＫと６ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ−１０またはＰ
Ｓ１−Ｃ−ＦＬＡＧとの同時トランスフェクション後のＨＥＫ２９３細胞および
ＩＭＲ３２細胞の双方において認められた。６ｍｙｃ−Ｓｅｌ１０またはＰＳ１
−Ｃ−ＦＬＡＧを発現するＨＥＫ２９３細胞の安定形質転換体においては、内因
性Ａβプロセシングにおける増大、ならびにＡＰＰ６９５ＮＬ−ＫＫでのトラン
スフェクション後のＡβプロセシングにおける増大が認められた。このことは、
ｓｅｌ−１０および／またはＰＳ１のいずれかのインヒビターがＡβプロセシン
グを低下させ得、アルツハイマー病に対する臨床的可能性を有し得ることを示唆
している。

【００７８】 本発明が前記の説明および例に特に記載した以外にも別の方法で実施できるこ
とは明らかであろう。 本発明の膨大な修飾および変形が前記教示の見地から可能であり、したがって
、これらも本発明の範囲に入る。 本明細書で引用したすべての刊行物の全体的な開示は、出典明示して本明細書
の一部とみなす。

【００７９】

【表１】

【００８０】

【表２】

【００８１】

【表３】

【００８２】

【表４】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１Ａおよび１ＢはＰＳ１−Ｃ−ＦＬＡＧ、６−ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ−１０お
よびＡＰＰ６９５ＮＬ−ＫＫのｃＤＮＡでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細
胞におけるタンパク質発現を示すウェスタンブロットである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ジンヘ・リ アメリカ合衆国49009ミシガン州カラマズ ー、オールド・オーク・サークル8548番 (72)発明者 アデル・エム・ポーリー アメリカ合衆国49080ミシガン州プレイン ウェル、イースト・ブライトン213番 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA61 CA04 DA02 GA11 HA14 HA15 4B063 QA01 QA19 QQ42 QQ79 QS33 4B065 AA90X AA93Y AB01 AB04 AC14 BA01 CA24 CA25 CA44 CA46 4H045 AA10 AA11 BA10 CA40 EA21 FA74

Claims (41)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番
   号：６および配列番号：７よりなる群から選択されるか、またはＡＴＣＣ受託番
   号９８９７８に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる完全アミノ酸配
   列を有するヒトｓｅｌ−１０ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列； （ｂ）配列番号：８、配列番号：９および配列番号：１０よりなる群から選択
   されるか、またはＡＴＣＣ受託番号９８９７９に含まれるｃＤＮＡクローンによ
   ってコードされる完全アミノ酸配列を有するヒトｓｅｌ−１０ポリペプチドをコ
   ードするヌクレオチド配列；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列 よりなる群から選択される配列に対して少なくとも９５％同一である配列を有す
   るポリヌクレオチドを含む単離核酸分子。
2. 【請求項２】 ストリンジェントな条件下で、請求項１記載の（ａ）、（ｂ
   ）または（ｃ）のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズ
   するポリヌクレオチドを含む単離核酸分子。
3. 【請求項３】 該１（ａ）のポリヌクレオチドが、配列番号：３の完全アミ
   ノ酸配列を有するヒトｓｅｌ−１０ポリペプチドをコードすることを特徴とする
   請求項１記載の核酸分子。
4. 【請求項４】 該１（ａ）のポリヌクレオチド分子が、配列番号：１の残基
   ４５−１９２８のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項３記載の核酸
   分子。
5. 【請求項５】 該１（ａ）のポリヌクレオチドが、配列番号：４の完全アミ
   ノ酸配列を有するヒトｓｅｌ−１０ポリペプチドをコードすることを特徴とする
   請求項１記載の核酸分子。
6. 【請求項６】 該１（ａ）のポリヌクレオチド分子が、配列番号：１の残基
   １５０−１９２８のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項５記載の核
   酸分子。
7. 【請求項７】 該１（ａ）のポリヌクレオチドが、配列番号：５の完全アミ
   ノ酸配列を有するヒトｓｅｌ−１０ポリペプチドをコードすることを特徴とする
   請求項１記載の核酸分子。
8. 【請求項８】 該１（ａ）のポリヌクレオチド分子が、配列番号：１の残基
   ２６７−１９２８のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項７記載の核
   酸分子。
9. 【請求項９】 該１（ａ）のポリヌクレオチドが、配列番号：６の完全アミ
   ノ酸配列を有するヒトｓｅｌ−１０ポリペプチドをコードすることを特徴とする
   請求項１記載の核酸分子。
10. 【請求項１０】 該１（ａ）のポリヌクレオチド分子が、配列番号：１の残
    基２９１−１９２８のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項９記載の
    核酸分子。
11. 【請求項１１】 該１（ａ）のポリヌクレオチドが、配列番号：７の完全ア
    ミノ酸配列を有するヒトｓｅｌ−１０ポリペプチドをコードすることを特徴とす
    る請求項１記載の核酸分子。
12. 【請求項１２】 該１（ａ）のポリヌクレオチド分子が、配列番号：１の残
    基３０６−１９２８のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１１記載
    の核酸分子。
13. 【請求項１３】 該１（ｂ）のポリヌクレオチドが、配列番号：８の完全ア
    ミノ酸配列を有するヒトｓｅｌ−１０ポリペプチドをコードすることを特徴とす
    る請求項１記載の核酸分子。
14. 【請求項１４】 該１（ｂ）のポリヌクレオチド分子が、配列番号：２の残
    基１８０−１９４９のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１３記載
    の核酸分子。
15. 【請求項１５】 該１（ｂ）のポリヌクレオチドが、配列番号：９の完全ア
    ミノ酸配列を有するヒトｓｅｌ−１０ポリペプチドをコードすることを特徴とす
    る請求項１記載の核酸分子。
16. 【請求項１６】 該１（ｂ）のポリヌクレオチド分子が、配列番号：２の残
    基２７０−１９４９のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１５記載
    の核酸分子。
17. 【請求項１７】 該１（ｂ）のポリヌクレオチドが、配列番号：１０の完全
    アミノ酸配列を有するヒトｓｅｌ−１０ポリペプチドをコードすることを特徴と
    する請求項１記載の核酸分子。
18. 【請求項１８】 該１（ｂ）のポリヌクレオチド分子が、配列番号：２の残
    基３２７−１９４９のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１７記載
    の核酸分子。
19. 【請求項１９】 請求項１記載の核酸分子を含むベクター。
20. 【請求項２０】 請求項１記載の該核酸分子が、ｓｅｌ−１０ポリペプチド
    を発現させるためのプロモーターに作動可能に連結されていることを特徴とする
    請求項１９記載のベクター。
21. 【請求項２１】 請求項１９記載のベクターを含む宿主細胞。
22. 【請求項２２】 該宿主が真核生物宿主であることを特徴とする請求項２１
    記載の宿主細胞。
23. 【請求項２３】 請求項２２記載の宿主細胞を培養し、ついで該ｓｅｌ−１
    ０ポリペプチドを単離することを含むｓｅｌ−１０ポリペプチドを得る方法。
24. 【請求項２４】 （ａ）配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列
    番号：６および配列番号：７よりなる群から選択されるか、またはＡＴＣＣ受託
    番号９８９７８に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列
    ； （ｂ）配列番号：８、配列番号：９および配列番号：１０よりなる群から選択
    されるか、またはＡＴＣＣ受託番号９８９７９に含まれるｃＤＮＡクローンによ
    ってコードされるアミノ酸配列 を含む単離ｓｅｌ−１０ポリペプチド。
25. 【請求項２５】 該ポリペプチドが、配列番号：３のアミノ酸配列を含むこ
    とを特徴とする請求項２４記載の単離ｓｅｌ−１０ポリペプチド。
26. 【請求項２６】 該ポリペプチドが、配列番号：４のアミノ酸配列を含むこ
    とを特徴とする請求項２４記載の単離ｓｅｌ−１０ポリペプチド。
27. 【請求項２７】 該ポリペプチドが、配列番号：５のアミノ酸配列を含むこ
    とを特徴とする請求項２４記載の単離ｓｅｌ−１０ポリペプチド。
28. 【請求項２８】 該ポリペプチドが、配列番号：６のアミノ酸配列を含むこ
    とを特徴とする請求項２４記載の単離ｓｅｌ−１０ポリペプチド。
29. 【請求項２９】 該ポリペプチドが、配列番号：７のアミノ酸配列を含むこ
    とを特徴とする請求項２４記載の単離ｓｅｌ−１０ポリペプチド。
30. 【請求項３０】 該ポリペプチドが、配列番号：８のアミノ酸配列を含むこ
    とを特徴とする請求項２４記載の単離ｓｅｌ−１０ポリペプチド。
31. 【請求項３１】 該ポリペプチドが、配列番号：９のアミノ酸配列を含むこ
    とを特徴とする請求項２４記載の単離ｓｅｌ−１０ポリペプチド。
32. 【請求項３２】 該ポリペプチドが、配列番号：１０のアミノ酸配列を含む
    ことを特徴とする請求項２４記載の単離ｓｅｌ−１０ポリペプチド。
33. 【請求項３３】 請求項２４記載のｓｅｌ−１０ポリペプチドに対して特異
    的に結合する単離抗体。
34. 【請求項３４】 請求項１記載のいずれかのｓｅｌ−１０単離核酸分子を発
    現する、変化したＡβプロセシングを有するセルライン。
35. 【請求項３５】 該Ａβプロセシングが増大していることを特徴とする請求
    項３４記載のセルライン。
36. 【請求項３６】 該Ａβプロセシングが低下していることを特徴とする請求
    項３４記載のセルライン。
37. 【請求項３７】 ６ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ１０／２であることを特徴とする請
    求項３４記載のセルライン。
38. 【請求項３８】 ６ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ１０／６であることを特徴とする請
    求項３４記載のセルライン。
39. 【請求項３９】 （ａ）請求項３４、３７および３８記載のいずれかのセル
    ラインの試験培養物および対照培養物を得； （ｂ）該試験培養物と供試剤とを接触させ； （ｃ）工程（ｂ）の該試験培養物および該対照培養物によって産生されるＡβ _1-40 およびＡβ_1-42のレベルを測定し； （ｄ）工程（ｃ）で測定したＡβ_1-40およびＡβ_1-42のレベルから該試験培養
    物および該対照培養物についてのＡβ_1-40／Ａβ_1-40＋Ａβ_1-42の比を算出し；
    ついで （ｅ）工程（ｄ）において該試験培養物および該対照培養物について測定した
    Ａβ_1-40／Ａβ_1-40＋Ａβ_1-42の比を比較する工程からなり、 ここに、該試験培養物についてのＡβ_1-40／Ａβ_1-40＋Ａβ_1-42の比が該対照
    培養物についてのＡβ_1-40／Ａβ_1-40＋Ａβ_1-42の比よりも大きいまたは小さい
    という判定が、該供試剤がＡβ_1-40／Ａβ_1-40＋Ａβ_1-42の比を変化させたこと
    を示すことを特徴とする、請求項３４、３７および３８のいずれかのセルライン
    で産生されたＡβ_1-40／Ａβ_1-40＋Ａβ_1-42の比を変化させることができる剤の
    同定法。
40. 【請求項４０】 該Ａβ_1-40／Ａβ_1-40＋Ａβ_1-42の比が該供試剤によって
    増大することを特徴とする請求項３９記載の方法。
41. 【請求項４１】 該Ａβ_1-40／Ａβ_1-40＋Ａβ_1-42の比が該供試剤によって
    低下することを特徴とする請求項３９記載の方法。