KR20010033327A - 인간 ｓｅｌ-10 폴리펩티드 및 그를 암호화하는폴리뉴클레오티드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 sel-10의 두가지 선택적 스플라이싱 변형체, 즉 해마 세포에서 발현되는 변형체 및 유방 세포에서 발현되는 변형체 중 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 또한, 본 발명은 단리된 sel-10 폴리펩티드 및 Aβ프로세싱이 변경된, sel-10 폴리펩티드를 발현시키는 세포 라인을 제공한다.

Description

인간 ＳＥＬ-10 폴리펩티드 및 그를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 {Human Sel-10 Polypeptides And Polynucleotides That Encode Them}

알쯔하이머 병(AD)은 중년 내지 노년에 점진적인 기억력 및 인지력 감퇴를 일으키는 중추신경계의 퇴행성 질환이다. 이 질환에는 세포의 아밀로이드반(斑) 및 신경 세포 내의 신경섬유 얽힘을 비롯한 광범위한 신경병리학적 특징을 수반한다[쉐링턴(Sherrington, R) 등의 문헌[Nature 375: 754-60(1995)]]. AD를 유발하는 병리적 경로가 잘 밝혀지진 않았지만, 몇몇 유전자좌가 이 질병의 발병에 관련된 것으로 알려져 있다.

초기 발병(early onset) AD 환자 군에 대한 유전자지도 작성 연구를 이용하여 초기 발병 알쯔하이머 병(AD)에 관련된 유전자를 확인하였다. 이 연구 결과, 1번 염색체 및 14번 염색체 상 유전자좌가 AD에 관여할 가능성이 있음이 밝혀졌다. 14번 염색체 유전자좌에 대한 위치상 클로닝으로 이후에 프레세닐린-1(PS-1)로 명명된, 8-막관통 도메인 단백질을 암호화하는 새로운 돌연변이 유전자를 확인하였다[쉐링턴(Sherrington, R.) 등의 문헌[Nature 375: 754-60(1995)]]. 인간 EST 데이타베이스에 대한 블라스트(Blast) 연구 결과, 프레세닐린-2(PS-2)라고 명명된, 1번 염색체상의 AD 관련 유전자로 알려진 PS-1와 상동성을 보이는 하나의 EST를 찾았다[레비-라하드(Levy-Lahad, E.) 등의 문헌[Science 269:973-977 (1995)], 로개브(Rogaev, E. I.) 등의 문헌[Nature 376:775-8 (1995)], 리(Li, J) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 12180-12184 (1995)]].

알쯔하이머 병과 관련된 PS-1 및 PS-2에서의 돌연변이는 주로 미스센스 돌연변이이다. PS-1 및 PS-2 모두 가족성 알쯔하이머 병에서 나타나는 점 돌연변이에 의해 변경될 수 있는 단백질분해 과정을 거친다[페레쯔-투르(Perez-Tur, J.) 등의 문헌[Neuroreport 7:297-301 (1995)], 머켄(Mercken, M) 등의 문헌[FEBS Lett. 389:297-303 (1996)]]. PS-1 유전자 발현은 조직들간에 폭넓게 분포하나, 췌장 및 골격 근육에서 PS-2 mRNA가 가장 높은 수준으로 발현되는 것으로 나타난다[리(Li, J) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 12180-12184 (1995)], 진헤(Jinhe Li)의 개인 서신]. 그러나, PS-2 단백질은 뇌에서 가장 높은 수준으로 발현되는 것으로 나타났다[진헤(Jinhe Li)의 개인 서신]. PS-1 및 PS-2 단백질은 두가지 모두 소포체, 골지체 및 핵막에 편재되어 있다[진헤(Jinhe Li)의 개인 서신, 코바크스(Kovacs, D.M.) 등의 문헌[Nat. Med. 2:224-229 (1996)], 도안(Doan, A.) 등의 문헌[Neuron 17:1023-1030(1996)]]. PS-1 유전자 또는 PS-2 유전자에서의 돌연변이는 아밀로이드 단백질 전구체(APP)의 프로세싱을 변경시켜 A-베타_1-40에 비해 A-베타_1-42의 비율이 증가된다[슈너(Scheuner, D.)등의 문헌[Nat. Med. 2:864-870 (1996)]]. 인간 APP를 유전자 도입한 마우스에서 동시발현시켰을 때도, 아밀로이드반에 A-베타 침착의 가속화와 함께 A-베타_1-40에 비해 A-베타_1-42의 비율이 마찬가지로 증가함이 관찰되었다[보첼트(Borchelt, D.R.) 등의 문헌[Neuron 17:1005-1013 (1996)] 및 문헌[Neuron 19:939 (1997)], 시트론(Citron, M.) 등의 문헌[Nat. Med. 3:67-72 (1997)], 두프(Duff, K.)등의 문헌[Nature 383:710-713 (1996)]].

AD에서 PS-1 및 PS-2의 역할에 대한 상기 기재된 관찰 결과에도 불구하고, 그의 생물학적 기능은 알려져 있지 않아 미지의 생물학적 기능을 가진 다수의 인간 질병 유전자들에 그를 포함시켰다. 어떤 유전자의 또는 그의 생성물의 기능이 알려져있지 않은 경우, 유기체 모델에서의 유전자 분석은 이 유전자를 알려진 생화학 또는 유전학적 경로에 포함시키는데 유용하다. 분석 중인 유전자의 돌연변이 효과를 억제하거나 또는 강화하는 외인성 돌연변이를 스크리닝함으로써 이를 수행한다. 예를 들어, 어떤 질병 유전자의 기능 상실 돌연변이에 대한 외래 억제자는 돌연변이 유전자의 이후에 영향을 받는 유전 또는 생화학적 경로를 개시할 수 있을 것이나, 기능 획득 돌연변이 억제자는 이 경로를 종결시킬 것이다.

프레세닐린 유전자의 기능 설명에 사용될 수 있는 한 유기체 모델은 PS-1 및 PS-2와 유사한 3개의 유전자를 포함하는 씨. 엘레간스(C. elegans)이고, sel-12는 인간 프레세닐린을 암호화하는 유전자에 가장 높은 유사성을 가진다. Sel-12는 활성화 노치 수용체인 lin-12(d)의 유전적 억제자를 스크리닝하는 중에 발견되었다[레비탄(Levitan, D.)등의 문헌[Nature 377:351-354 (1995)]]. Lin-12는 세포 계보 패턴 전개에 기능한다. 다형성 돌연변이, 예를 들어 lin-12 활성을 증가시키는 lin-12(d)는 "다중 음문" 표현형을 일으키나, 활성을 감소시키는 소형성 돌연변이는 음문의 외번(eversion) 및 몇가지 다른 세포 계보의 항상성 변화를 일으킨다[그린발트(Greenwald, I.) 등의 문헌[Nature 346:197-199(1990)], 순다람(Sundaram, M.) 등의 문헌[Genetics 135:755-763 (1993)]]. Sel-12 돌연변이는 lin-12(d) 돌연변이가 원형 lin-12(d) 수용체에 의한 신호를 활성화시키는 경우에만 소형성(hypomorphic) lin-12(d) 돌연변이를 억제한다[레비탄(Levitan, D.) 등의 문헌[Nature 377:351-354 (1995)]]. 수용체의 세포질 도메인을 자르는 Lin-12 돌연변이도 신호 발생을 활성화시키나[그린발트(Greenwald, I.) 등의 문헌[Nature 346:197-199 (1990)]], sel-12 돌연변이에 의해 억제되지는 않는다[레비탄(Levitan, D.) 등의 문헌[Nature 377:351-354 (1995)]]. 이는 sel-12 돌연변이가 아마도 플라스마막에 있는 기능성 lin-12 수용체의 양을 감소시킴으로써 lin-12 신호 발생 경로의 상위쪽에서 작용함을 암시한다. 몇가지 lin-12 다형성 돌연변이를 억제하는 것 외에도, sel-12에 대한 돌연변이는 산란에 대한 기능 상실을 일으키므로, 돌연변이체가 그 외에 해부학적으로는 정상으로 보임에도 난자의 내부 축적을 일으킨다[레비탄(Levitan, D.) 등의 문헌[Nature 377:351-354 (1995)]]. Sel-12 돌연변이체는 인간 PS-1 또는 PS-2에 의해 구제될 수 있고, 이는 sel-12, PS-1 및 PS-2가 기능상 상동성임을 나타낸다[레비탄(Levitan, D.) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 93:14940-14944 (1996)]].

두번째 유전자인 sel-10은 lin-12 소형성 돌연변이의 억제자에 대한 별도의 유전자 스크리닝으로 확인되었다. sel-10의 기능 상실 돌연변이는 lin-12 소형성 돌연변이체에 의한 신호 발생을 복구시킨다. sel-10 활성 감소가 lin-12 활성을 증가시키므로, sel-10은 lin-12 신호 발생의 음성 조절자로서 작용한다고 결론지을 수 있다. sel-10은 또한 씨. 엘레간스(C. elegans) 프레셀린 상동체인 sel-12의 음성 조절자로 작용한다[레비-라하트(Levy-Lahad, E.) 등의 문헌[Science 269:973-977 (1995)]]. sel-10 활성 상실은 sel-12 돌연변이의 소형성 돌연변이와 관련된 산란 결함을 억제한다[이바 그린발트(Iva Greenwald) 개인 서신]. lin-12에 대한 sel-10의 기능 상실 돌연변이 및 sel-12의 효과는 sel-10이 lin-12/노치 및 프레세닐린 활성 모두에 대한 음성 조절자로서 작용함을 보여준다. 따라서, 씨. 엘레간스(C. elegans) sel-10의 인간 상동체는 알쯔하이머 병의 병원성에 관련되는 식으로 인간 프레세닐린 유전자에 유전적 및(또는) 생리적으로 상호작용할 것으로 예상된다.

상기 기재된 바와 같이, AD와 관련된 유전자의 확인 및 생물학적인 AD 유발 경로를 저해할 수 있는 작용제 확인에 대한 분석법 개발에 대한 지속적인 요구가 있음은 분명하다.

정보 공개

허바드(Hubbard EJA), 우(Wu G), 키타쥬스키(Kitajewski J) 및 그린발트(Greenwald I) (1997): 씨. 엘레간스(Caenorhabditis elegans)의 lin-12 활성에 대한 음성 조절자 Sel-10은 CDC4 단백질 군의 일원을 암호화한다. [Genes ＆ Dev 11:3182-3193].

그린발트(Greenwald-I), 세이도욱스(Seydoux-G) (1990): 씨. 엘레간스의 lin-12 유전자의 기능 획득 돌연변이에 대한 분석. [Nature. 346:197-9].

김(Kim T-W), 페틴겔(Pettingell WH), 홀마크(Hallmark OG), 모르(Moir RD), 바스코(Wasco W), 탄찌(Tanzi R) (1997): 형질감염 세포에서 프레세닐린 2의 단백질내 분해 및 프로테아솜 분해. [J. Biol Chem 272:11006-11010].

레비탄(Levitan-D), 그린발트(Greenwald-I) (1995): 씨. 엘레간스(C. elegans) S182 알쯔하이머 병 유전자인 sel-12에 의한 lin-12 매개 신호 발생의 촉진. [Nature. 377:351-4]

레비탄(Levitan-D), 도일(Doyle-TG), 브로우슈(Brousseau-D), 리(Lee-MK), 티나카란(Thinakaran-G), 슬런트(Slunt-HH), 시소디아(Sisodia-SS), 그린발트(Greenwald-I) (1996): 씨. 엘레간스의 정상 및 돌연변이체 인간 프레세닐린 기능에 대한 평가. [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:14940-4]

순다람(Sundaram-M), 그린발트(Greenwald-I) (1993): 소형성(hypomorphic) lin-12 억제자는 씨. 엘레간스의 lin-12 및 glp-1 두가지 모두에 상호작용하는 유전자를 규정함. [Genetics. 135:765-83]

순다람(Sundaram-M), 그린발트(Greenwald-I) (1993): 씨. 엘레간스의 소형성 lin-12 돌연변이에 대한 유전 및 표현형 연구. [Genetics. 135:755-63]

F55B12.3 GenPep Report (WMBL 인자좌 CEF55B12, 이름 z79757)

WO 97/11956

〈발명의 개요〉

본 발명은 해마 세포 및 유방 세포에서 발현되는 인간 sel-10을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 다른 언급이 없는 한, 본 명세서에서 sel-10을 언급하는 부분은 모두 인간 sel-10를 칭하는 것이고 해마 및 유방 sel-10 모두를 포함하는 것이다.

한 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 ⒜ SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 및 SEQ ID NO:7로 이루어진 군으로부터 선택되거나 또는 ATCC 기탁번호 제98978호에 포함된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 완전한 아미노산 서열을 가지는 인간 sel-10 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, ⒝ SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 및 SEQ ID NO:10으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 또는 ATCC 기탁번호 제98979호에 포함된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 완전한 아미노산 서열을 가지는 인간 sel-10 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 ⒞ ⒜ 또는 ⒝의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 95 % 이상 동일한 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.

다른 면으로는, 본 발명은 엄격한 조건 하에, sel-10 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터, 이 벡터가 도입되어 있는 숙주 세포 및 상기 기재된 숙주 세포를 배양하고 sel-10 폴리펩티드를 단리함을 포함하는, sel-10 폴리펩티드를 얻는 재조합 방법을 제공한다.

또다른 측면으로는, 본 발명은 단리된 sel-10 폴리펩티드 및 그의 단편을 제공한다. 바람직한 실시태양으로는, sel-10 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진다. 또한, 특히 sel-10 폴리펩티드에 결합하는 단리된 항체, 즉 다클론 및 단일클론 항체 모두가 제공된다.

본 발명은 인간 sel-10의 두가지 선택적 스플라이싱 변형체, 즉 해마 세포에서 발현되는 변형체 및 유방 세포에서 발현되는 변형체 중 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 또한, 본 발명은 단리된 sel-10 폴리펩티드를 제공한다.

도 1A 및 1B: 도 1A 및 1B는 PS1-C-FLAG, 6-myc-N-sel-10 및 APP695NL-KK cDNA로 형질감염된 HEK293 세포의 단백질 발현을 보여주는 웨스턴 블롯이다.

본 발명은 인간 sel-10를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. SEQ ID NO:1에 나타낸 서열인 인간 해마 sel-10(hhsel-10)의 뉴클레오티드 서열은 다섯개의 hhsel-10 폴리펩티드(hhsel-10-(1), hhsel-10-(2), hhsel-10-(3), hhsel-10-(4) 및 hhsel-10-(5), 본 명세서에서 hhsel-10로 총칭하여 언급함)를 암호화한다. SEQ ID NO:2에 나타낸 인간 유방 sel-10(hmsel-10)의 뉴클레오티드 서열은 세개의 hmsel-10 폴리펩티드(hmSel-10-(1), hmSel-10-(2) 및 hmSel-10-(3), 본 명세서에서 hmsel-10로 총칭하여 언급함)를 암호화한다. hhsel-10 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1에 나타나 있으며 여기서, SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 잔기 45 내지 1928은 hhsel-10-(1)에 상응하고 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 잔기 150 내지 1928은 hhSel-10-(2)에 상응하고 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 잔기 267 내지 1928은 hhsel-10-(3)에 상응하고 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 잔기 291 내지 1928은 hhsel-10-(4)에 상응하고 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 잔기 306 내지 1928은 hhSel-10-(5)에 상응한다. hmSel-10 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2에 나타나 있으며 여기서, SEQ ID NO:2의 뉴클레오티드 잔기 180 내지 1949는 hmSel-10-(1)에 상응하고 SEQ ID NO:2의 뉴클레오티드 잔기 270 내지 1949는 hmSel-10-(2)에 상응하고 SEQ ID NO:2의 뉴클레오티드 잔기 327 내지 1949는 hmSel-10-(3)에 상응한다. hhSel-10 및 hm-Sel-10 핵산 분자에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 아미노산 서열은 하기와 같다. SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 및 7은 hhSel-10-(1), hhSel-10-(2), hhSel-10-(3), hhSel-10-(4) 및 hhSel-10-(5) 폴리펩티드에 각각 상응하고 SEQ ID NO:8, 9 및 10은 hmSel-10-(1), hmSel-10-(2) 및 hmSel-10-(3) 폴리펩티드에 각각 상응한다. 따로 언급하지 않는 한, 본 명세서에서 sel-10를 언급한 부분은 모두 인간 sel-10를 칭하는 것이며 모든 해마 및 유방 sel-10 핵산 분자(sel-10 핵산, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA 또는 유전자를 언급하는 경우임) 또는 폴리펩티드(sel-10 단백질, 폴리펩티드, 아미노산 서열을 언급하는 경우임)를 포괄한다. 또한, 해마 sel-10 및 유방 sel-10 핵산 분자 및 폴리펩티드의 단편이 제공된다.

SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 서열은 실시예 1에 기재된 바와 같이 얻어졌고, 미국 20110 버지니아주 마나사스 유니버시티 빌딩 10801 소재의 ATCC(American Type Culture Collection)에 1998년 11월 9일자로 기탁되었고 기탁 번호 98978번을 배정받은 cDNA 클론 PNV 102-1에 포함된다. SEQ ID NO:2의 뉴클레오티드 서열은 실시예 1에 기재된 바와 같이 얻어졌고, 미국 20110 버지니아주 마나사스 대학 빌딩 10801 소재의 ATCC(American Type Culture Collection)에 1998년 11월 9일자로 기탁되었고 기탁 번호 98979번을 배정받은 cDNA 클론 PNV 108-2에 포함된다.

본 발명의 인간 sel-10 폴리펩티드는 씨. 엘레간스(C. elegans)의 sel-10 및 효모 CDC4를 비롯한 β-트랜스두신 단백질 군의 일원 및 인간 LIS-1와 상동성을 공유한다. 이 군의 특징은 F-박스 및 다수의 WD-40 반복체의 존재이다[리(Li, J.) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:12180-12184 (1995)]]. 이 반복체는 20 내지 40개 아미노산이며 gly-his(GH) 및 trp-asp(WD) 잔기에 의해 결합된다. β-트랜스두신의 3 차원 구조는 WD40 반복체가 7개의 날개가 있는 프로펠러와 같은 구조의 팔을 형성함을 보여준다[손데크(Sondek, J.) 등의 문헌[Nature 379:369-374 (1996)]]. 각 날개는 한개의 내부 베타 스트랜드의 한계를 정하는 단백질 모티프내에 보존된 한쌍의 아스파라긴산 잔기를 지닌 베타-쉬트의 번갈아 있는 4개의 주름에 의해 형성된다. WD40 반복체는 다양한 기능성 군을 대표하는 27가지가 넘는 여러 단백질에서 발견된다[니어(Neer, E.J.) 등의 문헌[Nature 371:297-300 (1994)]]. 이는 세포 분열, 세포 운명 결정, 유전자 전사, 신호 전달, 단백질 분해, mRNA 변형 및 소포 융합 등의 세포 기능을 조절한다. 이러한 기능의 다양성은 β-트랜스두신 군이 공동의 스캐폴딩을 제공하여 다단백질 복합체가 조립될 수 있다는 가설을 이끌었다.

SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 서열은 hhsel-10을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 상응하며, SEQ ID NO:2의 뉴클레오티드 서열은 hmsel-10을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 상응한다. sel-10을 암호화하는 DNA의 단리 및 서열 분석은 하기 실시예 1 및 2에 기술되어 있다.

실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이, 자동 서열 분석 방법을 사용하여 sel-10의 뉴클레오티드 서열을 얻었다. 본 발명의 sel-10 뉴클레오티드 서열은 상기 두 DNA 가닥에 대해 얻어지고 100 % 정확한 것으로 생각된다. 그러나, 당업계에 공지된 바와 같이, 이 자동 분석 방법에 의해 얻어진 뉴클레오티드 서열은 약간의 오류를 포함할 수도 있다. 자동 분석에 의해 결정된 뉴클레오티드 서열은 통상적으로 주어진 핵산 분자의 실제 뉴클레오티드 서열에 대해 약 90 % 이상, 보다 통상적으로는 약 95 % 이상 내지 약 99.9 %이상이 동일하다. 당업계에 잘 알려진 수동 서열 분석 방법을 이용하여 보다 정확하게 실제 서열을 결정할 수 있다. 1개 이상의 뉴클레오티드의 삽입 및 결실을 초래하는 서열의 오류는 번역에서 프레임 변화를 일으켜 돌연변이 지점에서부터 만들어지는 아미노산 서열이 핵산 분자의 실제 뉴클레오티드 서열로부터 예상되는 아미노산 서열과 다를 수도 있을 것이다. 본 발명의 sel-10 DNA에는 cDNA, 화학적으로 합성된 DNA, PCR에 의해 단리된 DNA, 게놈 DNA 및 그의 조합이 포함된다. 게놈 sel-10 DNA는 당업계에 잘 알려진 방법을 이용하여, 본 명세서에 기재된 sel-10 cDNA로 게놈 라이브러리를 스크리닝하여 얻을 수 있다. 또한, sel-10 DNA로부터 전사된 RNA도 본 발명에 포함된다.

유전 암호의 축퇴(degeneracy)로 인해, 두개의 DNA 서열이 달라도 동일한 아미노산 서열을 암호화할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 sel-10 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지닌 단리된 핵산 분자를 제공하며 여기서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:3 내지 10의 완전한 아미노산 서열 또는 그의 단편을 가지는 sel-10 폴리펩티드를 암호화하는 것이다.

또한, 본 명세서에는 정제된 sel-10 폴리펩티드가 재조합적 방법 또는 비재조합적 방법 모두로 제공된다. 또한, sel-10의 임의 생물학적 활성을 유지하는 천연 sel-10 단백질의 변형체 및 유도체도 본 발명의 범위 내이다. 상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 sel-10 폴리펩티드는 효모 CDC4와 상동성이 있다. CDC4가 특정 세포 단백질의 유비퀴틴화를 촉진시키는 것으로 알려져 있듯이[펠드만(Feldman) 등의 문헌[Cell 91:221 (1997)]], sel-10도 이 활성을 지닐 것임을 추론할 수 있다. 이 활성을 증명하는 분석 방법은 잘 알려져 있으며, 효모 단백질 Cdc4p, Cdc53p 및 Skp1p 또는 그의 인간 오르쏠로그(orthologs), 및 E1 효소, E2 효소, cdc34p 또는 그의 인간 오르쏠로그, 유비퀴틴, 표적 단백질 및 ATP 생성계와 함께 정제된 인간 sel-10 단백질을 사용하여 유비퀴틴화계를 재구성하는 과정을 포함한다[펠드만(Feldman) 등 1997]. Skp1p는 F-박스라고 불리는 단백질 도메인을 통해 Cdc4p와 연결된다[바이(Bai) 등의 문헌[Cell 86:263 (1996)]]. F-박스 단백질 모티프는 효모 CDC4, 씨. 엘레간스(C. elegans) sel-10, 마우스 sel-10 및 인간 sel-10에서 발견된다. sel-10 유비퀴틴화계는 효모 성분의 씨. 엘레간스(C. elegans) 상응물, 예를 들어 Cdc53p를 대체하는 cul-1(또한 lin-19로 알려짐) 단백질 [키프레오스(Kipreos) 등의 문헌[Cell 85:829 (1996)]] 및 Skp1p를 대체하는 F46A9 단백질, 또는 그의 포유류 상응물, 예를 들어 Cdc53p를 대체하는 Cul-2 단백질[키프레오스(Kipreos) 등 1996] 및 효모 Skp1p를 대체하는 포유류 Skp1p로 재구성될 수 있다. 또한, 단백질 키나제에 의해 제공되는 인산화도 문헌[펠드만(Feldman) 등(1997)]과 같이 분석 시스템에 포함될 수 있다.

예를 들어 Sel-10 변형체는 천연 sel-10-암호화 뉴클레오티드 서열의 돌연변이에 의해 얻어질 수 있다. 본 명세서에 언급된 바와 같이, sel-10 변형체는 실질적으로 천연 sel-10 단백질에 상동성이나 아미노산 서열 중에 1개 이상의 결실, 삽입 또는 치환으로 인해 천연 sel-10과는 다른 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드이다. 바람직하게는, 변형체 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 천연 sel-10 서열에 대해 약 80 % 이상 동일하고 보다 바람직하게는 약 90 %이상 동일하며 가장 바람직하게는 약 95 % 동일하다. 예컨대, 천연 sel-10 유전자에 대해 100개의 매 뉴클레오티드마다 5개의 점 돌연변이를 포함하는 서열은 천연 단백질에 95 %가 동일한 것이다. 또한 상동성이라 불리는, 천연 및 변형 sel-10 서열 사이의 서열 동일성 %는 또한 예를 들어 이런 목적으로 통상 사용되는 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 스미스(Smith) 및 워터만(Waterman)의 알고리즘[Adv. Appl. Math. 2:482-489 (1981)]이 사용된 Gap 프로그램(위스콘신 서열 분석 패키지, Genetics Computer Group Unix 버전 8, 위스콘신주 메디슨 소재의 University Research Park)을 사용하여 두 서열을 비교함으로써 결정될 수 있다.

많은 공지된 기술 중 어느 기술로도 천연 아미노산 서열을 변형시킬 수 있다. 예를 들어 당업자에게 잘 알려진 방법, 예를 들어 월더(Walder) 등의 문헌[Gene 42:133 (1986)], 바우어(Bauer) 등의 문헌[Gene 37:73 (1985)], 크라이크(Craik) 의 문헌[BioTechniques, January 1985, pp 12-19], 스미스(Smith) 등의 문헌[Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press (1981)] 및 미국 특허 제4,518,584호 및 제4,737,462호에 기재된 올리고뉴클레오티드-유도 돌연변이발생법에 의해 특정 위치에 돌연변이를 도입할 수 있다.

본 발명의 범위내의 Sel-10 변형체는 보존적으로 치환된 서열을 포함할 수 있는데, 이는 sel-10 폴리펩티드의 1개 이상의 아미노산 잔기가 sel-10 폴리펩티드의 2차 및(또는) 3차 구조를 변형시키지 않는 다른 잔기에 의해 대체됨을 의미한다. 이런 치환은 한 아미노산 잔기를 유사한 물리화학적 특성을 갖는 잔기로, 예를 들어 1개의 지방족 잔기(Ile, Val, Leu 또는 Ala)를 다른 지방족 잔기로 치환하거나 염기성 잔기인 Lys 및 Arg, 산성 잔기인 Glu 및 Asp, 아미드 잔기인 Gln 및 Asn, 히드록실 잔기인 Ser 및 Tyr 또는 방향족 잔기인 Phe 및 Tyr들 간에 치환하는 아미노산 대체도 포함한다. 표현형 변화가 없는 아미노산 교체에 관련한 추가 정보는 보위(Bowie) 등의 문헌[Science 247:1306-1310 (1990)]에서 찾을 수 있다. 실질적으로 sel-10의 생물학적 활성을 보유할 수 있는 다른 sel-10 변형체는 아미노산 치환이 이 단백질의 기능성 영역 밖의 지역에서 일어난 변형체이다.

또다른 면에서, 본 발명은 엄격 조건 하에 상기 기재된 핵산 분자 중 하나인 상기 기재된 핵산 분자의 일부, 예를 들어 약 15개 이상의 뉴클레오티드에 혼성화되고, 보다 바람직하게는 약 30개의 뉴클레오티드에 혼성화되며, 가장 바람직하게는 약 30 내지 약 100개 이상의 뉴클레오티드에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 상기 기재된 길이를 가지는 핵산 분자의 이러한 일부분은 기준 핵산 분자의 인접하는 약 15개 이상의 뉴클레오티드를 말한다. 엄격 혼성화 조건이란 약 42 ℃의 6 X SSC/0.1 % SDS 중에서 약 2.5 시간 동안 철야 인큐베이션한 후에, 65 ℃의 1.0 X SSC/0.1 % SDS 중에서 필터를 세척하는 것이다.

본 명세서에 기재된 sel-10-암호화 핵산 분자의 단편 및 이 핵산 분자에 혼성화될 수 있는 폴리뉴클레오티드는 프로브 또는 중합효소 연쇄 반응(PCR)의 프라이머로 사용될 수 있다. 이 프로브는 예를 들어 시험관내 분석에서 sel-10 핵산 존재의 검출 및 서던 및 노던 블롯에 사용될 수 있다. 또한, 이 프로브를 사용하여 sel-10을 발현시키는 세포 유형을 확인할 수 있다. 이 방법은 잘 알려져 있으며 당업자라면 상기 특정 분야에 적합한 길이의 프로브를 선택할 수 있을 것이다. PCR의 경우, 목적하는 sel-10 핵산 분자의 말단에 상응하는 5' 및 3' 프라이머를 사용하여 통상의 기술로 이 서열을 단리하고 증폭한다.

sel-10 핵산 분자의 다른 유용한 단편은 표적 sel-10 mRNA(센스 가닥을 사용함) 또는 sel-10 DNA(안티센스 가닥을 사용함)에 결합할 수 있는 단일 가닥 핵산 서열을 포함하는 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드이다.

다른 면으로는, 본 발명에는 천연 형태 글리코실화를 수반할 수 있는 sel-10 폴리펩티드가 포함된다. 효모 또는 포유류 발현계(하기에 논의됨)에서 발현된 Sel-10은 분자량 및 글리코실화 형태가 천연 sel-10 폴리펩티드와 유사할 수도 상당히 다를 수도 있다. 박테리아 발현계에서 sel-10의 발현은 비-글리코실화 sel-10을 제공할 것이다.

바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드가 단리된 형태로 제공되고 바람직하게는 실질적으로 정제된다. Sel-10 폴리펩티드는 암모늄 술페이트 또는 에탄올 침전, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 히드록실라파티트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는 잘 알려진 방법에 의해 재조합 세포 배지로부터 회수하여 정제할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)가 정제에 이용된다.

또한, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 벡터 및 이 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명의 어느 폴리뉴클레오티드 분자도 숙주에서의 증식을 위해 일반적으로 선택 마커 및 복제의 개시점을 포함하는 벡터에 연결될 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 기재된 폴리뉴클레오티드 분자로부터 발현된 sel-10 폴리펩티드를 제공하고, sel-10의 발현에는 벡터가 바람직하다. 이 벡터는 상기 또는 하기 기재된 임의 sel-10 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함하고, 예를 들어 포유류, 미생물, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유래된 적합한 전사 또는 번역 서열에 작용가능하게 연결된다. 조절 서열의 예에는 전사 프로모터, 오퍼레이터 또는 인핸서, mRNA의 리보좀 결합 부위 및 전사 및 번역을 제어하는 적합한 서열들이 포함된다. 조절 서열이 기능적으로 sel-10을 암호화하는 DNA와 연관성이 있는 경우, 뉴클레오티드 서열이 작용가능하게 연결된다. 따라서, 프로모터 뉴클레오티드 서열이 sel-10 서열의 전사를 유도한다면 프로모터 뉴클레오티드 서열은 sel-10 DNA 서열에 작용 가능하게 연결된다.

물론, sel-10을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자의 클로닝 또는 sel-10 폴리펩티드의 발현에 사용되는 적합한 벡터의 선정은 그 벡터가 형질전환시킬 숙주 세포, 및 해당된다면 sel-10 폴리펩티드가 발현되는 숙주 세포에 따라 결정된다. sel-10 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포에는 원핵 생물, 효모 및 고등 진핵 세포가 포함되고 그의 각각은 하기에 기재되어 있다.

또한, 이 숙주 세포에서 발현되는 sel-10 폴리펩티드는 이종 단백질에서 유래하는 영역을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 이 영역은 예를 들어 폴리펩티드의 분비, 개선된 안정성 또는 촉진된 정제를 가능케 하기 위해 포함될 수 있다. 예를 들어 적합한 신호 펩티드를 암호화하는 서열이 발현 벡터에 포함될 수 있다. 신호 펩티드(분비성 리더)에 대한 DNA 서열은 프레임 내에, sel-10이 신호 펩티드를 포함하는 융합 단백질로 번역되도록 sel-10 서열에 융합될 수 있다. 목적하는 숙주 세포에서 기능하는 신호 펩티드는 sel-10 폴리펩티드의 세포외 분비를 촉진시킨다. 바람직하게는, 세포로부터 sel-10의 분비 후 신호 서열이 sel-10 폴리펩티드로부터 잘릴 것이다. 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 신호 서열의 예에는 효모 I-인자 및 sf9 곤충 세포의 벌꿀 멜라틴 리더가 포함되나 이에 제한되지 않는다.

한 바람직한 실시 태양에서, sel-10 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드의 정제를 용이하게 하기 위해 사용되는 이종 지역을 포함하는 융합 단백질일 수 있을 것이다. 이 기능에 사용되는 이용할 수 있는 많은 펩티드는 결합 파트너에 융합 단백질이 선택적으로 결합되도록 한다. 예를 들어 이 sel-10 폴리펩티드는 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 융합 단백질을 형성하는 펩티드, 또는 펩티드 태그를 포함하도록 변형될 수 있다. 이 펩티드 태그의 예에는 6-His 태그, 티오레독신 태그, FLAG 태그, 헤마글루티닌 태그, GST 태그 및 OmpA 신호 서열 태그가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 당업자라면 알 수 있듯이, 이 펩티드를 인식하고 이에 결합하는 결합 파트너는 금속 이온(예를 들어 금속 친화성 컬럼), 항체 또는 그의 단편을 포함하는 임의 분자 또는 화합물, 및 이 펩티드에 결합하는 임의 단백질 또는 펩티드일 수 있다. 상기 태그는 각 유형의 태그와 특이적으로 반응하는 플루오레세인 또는 로다민-표지된 항체로 식별될 수 있다.

sel-10 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포에는 원핵 생물, 효모 및 고등 진핵 세포가 포함된다. sel-10의 발현에 사용되는 적합한 원핵 생물 숙주에는 이쉐리키아(Esherichia), 바실러스(Bacillus) 및 살모넬라(Samonella)속의 박테리아 및 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)속의 균주가 포함된다. 예를 들어 이. 콜라이(E. coli)의 발현의 경우, sel-10 폴리펩티드에는 원핵 생물 숙주에서 재조합 폴리펩티드의 발현을 촉진시키는 N-말단부 메티오닌 잔기가 포함될 수 있다. 그 후에, 발현된 sel-10으로부터 N-말단부 Met이 선택적으로 잘릴 수 있다.

원핵 생물 숙주에 사용되는 발현 벡터는 일반적으로 1개 이상의 표현형 선택적 마커 유전자를 포함한다. 이 유전자는 일반적으로 예를 들어 항생제 내성을 나타내거나 또는 영양 요구주 요건을 부여하는 단백질을 암호화한다. 광범위하게 다양한 벡터를 판매원에서 용이하게 구입할 수 있다. 예로는 pSPORT 벡터, pGEM 벡터(Promega), pPROEX 벡터(LTI, Bethesda, MD), Bluescript 벡터(Stratagene) 및 pQE 벡터(Quiagen)이 있다.

또한, Sel-10은 사카로마이세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia) 및 클루베로마이세스(Kluveromyces)속으로부터 유래하는 효모 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 바람직한 효모 숙주에는 에스. 세레비지아(S. cerevisiae) 및 피. 파스토리스(P. pastoris)가 있다. 효모 벡터에는 종종 2T 효모 플라스미드의 복제 개시점 서열, 자동 복제 서열(ARS), 프로모터 영역, 폴리아데닐화 서열, 전사 종결 서열 및 선택 마커 유전자가 포함된다.

또한, 효모 및 이. 콜라이(셔틀 벡터라고 칭함) 모두에서 복제할 수 있는 벡터가 사용될 수 있다. 상기 언급된 효모 벡터의 특징 외에도, 셔틀 벡터에는 또한 이. 콜라이의 복제 및 선택을 위한 서열이 포함될 것이다. 효모 숙주에서 발현되는 sel-10 폴리펩티드의 직접적 분비는 sel-10-암호화 뉴클레오티드 서열의 5' 말단부에 효모 I-인자 리더 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 삽입에 의해 달성될 수 있다.

또한, Sel-10 폴리펩티드의 발현에 곤충 숙주 세포 배양계를 사용할 수 있다. 한 바람직한 실시태양에서는, 바쿨로바이러스 발현계를 사용하여 본 발명의 sel-10 폴리펩티드를 발현시킨다. 곤충 세포에서의 이종 단백질 발현을 위한 바쿨로바이러스계의 사용에 관한 추가 정보는 럭코우(Luckow) 및 섬머(Summers)의 문헌[Bio/Technology 6:47 (1988)]에 개괄되어 있다.

또다른 바람직한 실시태양에서, sel-10 폴리펩티드는 포유류 숙주 세포에서 발현된다. 적합한 포유류 세포 라인의 예에는 원숭이 신장 세포 및 중국산 햄스터 난소(CHO) 세포의 COS-7 라인이 포함되나 이에 제한되지 않는다[글루즈만(Gluzman) 등의 문헌[Cell 23:175 (1981)]].

물론, 본 발명의 sel-10 폴리펩티드 발현에 적합한 발현 벡터의 선택은 사용되는 특정 포유류 숙주 세포에 따라 좌우되며 당업자의 기술 범위 내이다. 적합한 발현 벡터의 예에는 pcDNA3(Invitrogen) 및 pSVL(Pharmacia Biotech)가 포함된다. 포유류 숙주 세포에 사용되는 발현 벡터에는 바이러스 게놈에서 유래하는 전사 및 번역 조절 서열이 포함될 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는, 통상적으로 사용되는 프로모터 서열 및 인핸서 서열에는 인간 시토메칼로바이러스(CMV), 아데노바이러스 2, 폴리오마 바이러스 및 시미안 바이러스 40(SV40)에서 유래하는 서열들이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 포유류 발현 벡터의 작제 방법은 예를 들어 오카야마(Okayama) 및 베르그(Berg)의 문헌[Mol. Cell. Biol. 3:280 (1983)], 코스만(Cosman) 등의 문헌[Mol. Immunol. 23:935 (1986)], 코스만(Cosman) 등의 문헌[Nature 312:768 (1984)], 유럽 특허 공개 제0367566호 및 국제 공개 제WO91/18982호에 개시되어 있다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드를 사용하여 sel-10 폴리펩티드 발현을 검출하는 진단 분석에 사용되는 다클론 및 단일클론 항체를 생성할 수 있다. 통상의 기술에 의해 이 항체를 제조할 수 있다. 예를 들어 항체: 할로우(Harlow) 및 랜드(Land)의 문헌[A Laboratory Manual(eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)], 단일클론 항체, 하이브리도마: 켄네트(Kennet) 등의 문헌[A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, New York (1980)] 참조.

또한, 본 발명의 sel-10 핵산 분자는 인간 염색체의 특정 위치와 혼성화될 수 있기 때문에 염색체 확인에 가치가 있다. 현재로는 염색체의 위치를 표시하는 실제 서열 데이타를 토대로한 염색체 표시 시약(반복 다형성)이 거의 없기 때문에 현재 염색체 상의 특정 부위를 확인할 필요성이 존재한다. 서열이 정확한 염색체의 위치로 지도화되면, 염색체 상 이 서열의 물리적인 위치는 유전적 지도 데이타와 상관관계가 있을 수 있다. 그 후에, 연관성 분석을 통해 동일한 염색체의 영역에 지도화된 질병과 유전자 사이의 관계를 확인할 수 있고, 여기서 물리적으로 인접한 유전자의 공동 유전(coinheritance)이 결정된다. 특정 질병에 관련되는 듯한 유전자가 사실 질병의 원인인지는 그 후에 병에 걸린 개체와 병에 걸리지 않은 개체 사이의 핵산 서열을 비교하여 판단할 수 있다.

또한, 본 발명의 sel-10 폴리펩티드 및 그를 암호화하는 DNA를 사용하여 추가로 AD의 생물 메카니즘을 설명하고 궁극적으로는 이 메카니즘을 변경하는데 사용될 수 있는 화합물을 확인하게 된다. 본 발명의 폴리펩티드는 씨. 엘레간스(C. elegans) sel-10에 47.6 % 동일하고 56.7 % 유사하다. 상기 기재된 바와 같이, 씨. 엘레간스(C. elegans) sel-10에 대한 돌연변이는 sel-12에 대한 돌연변이를 억제시켜 결국 산란 기능을 상실시키며, 또한 lin-12에 대한 몇가지 소형성(hypomorphic) 돌연변이를 억제시키는 것으로 알려져 있다. 또한, 씨. 엘레간스(C. elegans) sel-12에 대한 돌연변이는 인간 AD-관련 유전자인 PS-1(sel-12에 42.7 % 동일함) 또는 PS-2(sel-12에 43.4 % 동일함)에 의해 회복될 수 있다. 그러나, 가족성의 AD-관련 돌연변이체를 가지는 인간 PS-1은 sel-12 돌연변이체를 회복시킬 능력이 낮다[레비탄(Levitan) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14940-14944 (1996)]].

노치 신호 경로에서 인간 및 씨. 엘레간스(C. elegans)의 이러한 증명된 상호교환성은 인간 sel-10의 돌연변이가 특히 sel-10의 예상된 구조 면에서, AD를 유발하는 PS-1 및 PS-2에 대한 돌연변이를 억제시킬 것이라는 예측을 타당하게 만든다. 상기 기재된 바와 같이, AD를 유발하는 PS-1 및 PS-2 돌연변이는 PS-1 또는 PS-2의 단백질분해 프로세싱을 방해하는 변이이다. 본 발명의 sel-10 폴리펩티드는 유비퀴틴-의존성 단배질 분해 경로에서 기능하는 효소의 성분인 효모 CDC4를 포함하는 β-트랜스두신 단백질 군의 요소이다. 따라서, 인간 sel-10은 유비퀴틴 프로테아좀 경로를 통해 프레세닐린 분해를 조절할 수 있다. 이와 달리, 또는 이에 더하여, 인간 sel-10은 프레세닐린 활성의 조절자, 예를 들어 음성 조절자의 유비퀴틴화를 통해 분해를 표적화하여 프레세닐린 기능을 변경시킬 수 있다. 따라서, sel-10에 대한 돌연변이는 PS-1 및 PS-2에 대한 돌연변이의 결과로써 발생하는 PS-1 또는 PS-2의 단백질분해 프로세싱을 역전시킬 수 있거나 또는 프레세닐린 기능을 증가시킬 수 있다. 동일한 이유로, sel-10 활성에 대한 억제는 또한 PS-1 또는 PS-2 돌연변이를 역전시키도록 작용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 인간 sel-10 폴리펩티드의 발현 또는 활성을 억제하는 화합물은 PS-1 또는 PS-2에 대한 돌연변이의 효과를 역전시키고, 따라서 AD의 예방 또는 치료에 유용할 수 있다는 가설을 설정할 수 있다.

따라서, 본 발명의 인간 sel-10 폴리펩티드의 활성 또는 발현을 저해할 수 있는 작용제를 확인하는 유전적 시스템으로 씨. 엘레간스(C. elegans)를 사용할 수 있다. 이 분석에 사용하는 적합한 씨. 엘레간스(C. elegans) 균주는 활성 C. elegans sel-10을 암호화하는 유전자가 결여되어 있고 실활성 sel-12 유전자가 원인인 산란에 대한 기능 상실을 나타낸다. sel-12의 돌연변이로 인해 산란에 대한 기능을 상실한 씨. 엘레간스(C. elegans) 균주의 작제는 sel-12의 서열(Genebank accession number U35660) 및 산란에 대한 기능 상실로 나타나는 sel-12에 대한 돌연변이[레비탄(Levitan) 등의 문헌[Nature 377:351-354 (1995)] 참조. 이는 씨. 엘레간스(C. elegans) sel-12(ar171)의 작제를 기술함]가 알려져 있으므로 통상의 방법을 이용하여 달성될 수 있다. 또한, 이 균주를 만드는 방법의 예는 레비탄(Levitan) 등의 문헌[Nature 377:351-354 (1995)]에 개시되어 있다. 또한, 씨. 엘레간스(C. elegans) sel-12(ar171) 중 야생형 씨. 엘레간스(C. elegans)는 일상적인 방법, 예를 들어 레비탄(Levitan) 등의 문헌[supra]의 sel-12 돌연변이 발생에서 사용되는 기술을 이용하여 변이된다.

인간 sel-10 활성을 저해하는 화합물을 확인하기 위해, 상기 기재된 씨. 엘레간스(C. elegans) 균주에 본 발명의 임의 야생형 인간 sel-10 단백질을 암호화하는 인간 sel-10 유전자를 포함하는 DNA 벡터를 도입하였다. 바람직한 실시태양으로는, 씨. 엘레간스(C. elegans) 게놈에 이종 인간 sel-10 유전자를 융합시켰다. 그 후에, 레비탄(Levitan) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14940-14944 (1996)]에 개시된 기술을 이용하여 이 유전자를 발현시켰다. 그 후에, 주어진 작용제가 sel-10 활성을 억제하여 산란 결함으로 나타나는 sel-12 또는 lin-12에 대한 변이를 억제시킬 수 있는지를 결정하기 위해 이 균주에 시험 화합물을 투여한다. 그 후에, 예를 들어 레비탄(Levitan) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14940-14944 (1996)]에 개시된 분석법에 의해 이 균주의 산란 여부를 결정한다. 산란에 대한 시험 화합물의 효과가 sel-10 활성 억제로 인한 것인지를 확인하기 위해, sel-10의 기능 상실 돌연변이에 의해 영향받는 것으로 알려진 제2의 생화학적 또는 유전적 경로로 이 화합물의 작용을 시험할 수 있다(예를 들어 lin-12⒟ 소형성 균주의 lin-12 활성 추가 증가). 순다람(Sundaram) 및 그린발트(Greenwald)의 문헌[Genetics 135:765-783 (1993)]에 개시된 바와 같이 상기 분석을 수행할 수 있다.

또는, E3 유비퀴틴 결합 효소를 저해하는 화합물의 능력에 대해 화합물을 시험하였다. 이 활성을 증명하는 분석 방법은 잘 알려져 있고 효모 단백질인 Cdc4p, Cdc53p 및 Skp1p와 E1 효소, E2 효소 Cdc34p, 유비퀴틴, 표적 단백질 및 ATP 재발생 시스템과 함께 정제 인간 sel-10 단백질을 사용하여 유비퀴틴화 시스템을 재구성하는 것이 포함된다[펠드만(Feldman) 등 1997]. 또한, Cdc53p[키프레오스(Kipreos) 등의 문헌[Cell 85:829 (1996)]] 대신으로 cul-1(lin-19로도 알려짐) 및 Skp1p 대신으로 단백질 F46A9을 가지고 재구성될 수 있거나 또는 그의 포유류 대응물, 예를 들어 Cdc53p 대신으로 Cul-2 단백질[키프레오스(Kipreos) 등의 문헌[ibid]] 및 효모 Skp1p 대신으로 포유류 Skp1p를 가지고 재구성될 수 있다. 단백질 키나제에 의해 제공되는 인산화 시스템은 문헌[펠드만(Feldman) 등 1997]에 따른 분석 시스템에 포함될 수 있다.

또는, 인간 sel-10 cDNA을 이용한 형질전환으로 인해 인간 sel-10을 발현시키며 그 결과, APP 프로세싱 및 Aβ_1-40또는 Aβ_1-42의 형성이 증가된 세포 라인을 실시예 3에서와 같은 분석에 사용할 수 있다. sel-10 형질전환된 세포 라인에서 관찰되는 증가된 Aβ프로세싱을 감소시키는 화합물의 능력에 대해 시험할 수 있다.

그 후에, 산란 결함을 회복시키거나 또는 E3 유비퀴틴 결합 효소를 저해하는 화합물을 인간 세포 라인의 Aβ_1-40또는 Aβ_1-42의 생산 감소를 일으키는 그의 능력에 관련하여 스크리닝 한다. 시험 화합물을 Aβ_1-40또는 Aβ_1-42을 생산하는 것으로 알려진 IMR-32 또는 다른 인간 세포 라인[아사미-오카다(Asami-Okada) 등의 문헌[Biochemistry 34:10272-10278 (1995)]] 또는 높은 수준으로 인간 APP를 발현시키도록 설계된 인간 세포 라인에 노출시킨다. 이 분석에서, Aβ_1-40또는 Aβ_1-42는 세포 추출물 중 또는 배지로부터 분리한 후 당업계에 공지된 ELISA 또는 다른 분석에 의해 측정된다[보쉘트(Borchelt) 등의 문헌[Neuron 17:1005-1013 (1996)], 시트론(Citron) 등의 문헌[Nat. Med. 3:67-72 (1997)]].

일반적으로 본 발명에 기재된 바는 설명으로 제공되는 하기 실시예를 참고로 보다 쉽게 이해될 것이나 본 발명은 이에 제한되지 않는다.

실시예 1: 씨. 엘레간스(C. elegans) sel-10에 대한 인간 상동 유전자의 확인

결과

ACEDB에서 sel-10의 확인: sel-10은 him-5의 바로 왼쪽인 클로닝된 다형성 arP3 및 TCPARI 사이에 표시된다[ACEDB 엔트리 wm95p536]. 인터발, F53C11, F09F3 및 F55B12을 거쳐 세가지 람다 파지 클론을 서열 분석하였다. sel-10은 효모 cdc4와 상동성을 가지는 것으로 보고되었다[ACEDB 등록 wm97ab259]. 블라스트 써치 결과, 젠펩(GenPep) 엔트리 F55B12.3에 상응하는 arP3 및 TCPARI에 의해 정의된 인터발 내의 효모 cdc4(CC4_YST)에 상동성을 갖는 1개의 ORF가 밝혀졌다. 효모 cdc4와 마찬가지로, F55B12.3은 β-트랜스두신 단백질 군의 요소이다. 이 군은 다중 WD40 반복체의 존재가 특징이다[니어(Neer, E.J.) 등의 문헌[Nature 371:297-300 (1994)]].

인간 sel-10 상동 유전자인 Incyte 028971의 확인: 젠펩 엔트리 F55B12.3을 사용하여 tblastn을 사용한 LifeSeq, LifeSeq FL 및 EMBL 데이타베이스를 조사하였다. 조사 결과, 밀러-디커(Miller-Dieker) 뇌회결손에 관여하는 유전자인 LIS-1(S36113 및 P43035), 제노푸스 래비스(Xenopus laevis) 유전자인 TRCPXEN(U63921) 및 LifeSeq FL, 028971의 인간 콘티그를 포함하는 β-트랜스두신 군 요소에 대한 많은 상동체가 밝혀졌다. 또한, 씨. 엘레간스(C. elegans) 게놈 내에 여러 β-트랜스두신 군 요소가 있으므로 많은 블라스트 써치를 이용하여 이를 수집한 후에 sel-10 후보 유전자와 함께 모았다. 클러스탈(Clustal) 방법을 이용하여 DNAStar 프로그램 메갈린(Megalign)을 가지고 다중 정렬(multiple alignment)을 수행하였다. 그 결과, LIS-1은 다른 β-트랜스두신 군 요소인 T03F6.F와 함께 합해지므로 sel-10 상동 유전자 후보에서 제외되었다. TRCPXEN은 또한 F55B12.3 및 CC4YST와 함께 합해진 유전자인 K10B2.1과 함께 합해지나, Incyte 028971은 sel-10과 함께 합해진다. 따라서, Incyte 028971은 씨. 엘레간스(C. elegans) sel-10의 인간 상동 유전자를 암호화하는 듯이 보인다. sel-10 및 028971 사이 서열 상동성은 WD40 모티프의 7 반복 서열 함유 단백질 영역에서 가장 강했다. Incyte 028971 콘티그는 췌장, 폐, T-림프구, 섬유아세포, 가슴, 해마, 심근, 결장 및 다른 조직을 포함하는 다수의 라이브러리로부터의 44EST를 포함한다.

공개 EST: TREMBLP 데이타세트에 대해 DNA 서열 028971을 가지는 Blastx 연구로 IMAGE 라이브러리, 소아레스(Soares) 마우스 배 NbME13.5-14.5로부터의 한개의 상동 마우스 EST(W85144)를 확인하였다. 028971을 W85144 및 다음에 F55B12.3와 blastx 정렬한 결과, 028971의 리딩 프레임에서의 변화가 있었는데, 이는 서열 분석 오류에 인한 것 같다.

028971 DNA 서열과 EMBL EST 데이타베이스의 블라스트 써치 결과, W85144 외에도 028971의 코딩 서열과 함께 정렬한 3가지 인간 EST 및 028971 서열의 3' 번역되지 않는 영역과 함께 정렬한 6가지 EST가 밝혀졌다.

단백질 모티프: 효모 cdc4, 마우스 w85144 및 인간 028971와 공유하고 있는 두가지 단백질 모티프가 F55B12.3에서 확인되었다. N-말단부 도메인에는 F-박스가 있었고, C-말단부 도메인에는 7개의 β-트랜스두신 반복체가 있었다.

토의

sel-10 유전자는 β-트랜스두신 단백질 군의 일원를 암호화한다. 이 군의 특징은 다수의 WD40 반복체의 존재이다[니어(Neer,E.J.) 등의 문헌[Nature 371:297-300 (1994)]]. 이 반복체는 20 내지 40개 아미노산이며 gly-his(GH) 및 trp-asp(WD) 잔기에 의해 결합된다. β-트랜스두신의 3차원 구조를 풀어보면 WD40 반복체가 7개의 날개가 있는 프로펠러와 같은 구조의 팔을 형성함을 보여준다[손데크(Sondek, J.) 등의 문헌[Nature 379:369-74 (1996)]]. 각 날개는 한개의 내부 베타 스트랜드의 한계를 정하는 단백질 모티프내에 보존된 한쌍의 아스파라긴산 잔기를 지닌 베타-쉬트의 번갈아 있는 4개의 주름에 의해 형성된다. WD40 반복체는 다양한 기능성 군을 대표하는 27가지가 넘는 여러 단백질에서 발견되었다[니어(Neer, E.J.) 등의 문헌[Nature 371:297-300 (1994)]]. 이는 세포 분열, 세포 운명 결정, 유전자 전사, 신호 전달, 단백질 분해, mRNA 변형 및 소포 융합 등의 세포 기능을 조절한다. 이러한 기능의 다양성은 β-트랜스두신 군이 공동의 스캐폴딩을 제공하여 다단백질 복합체가 조립될 수 있다는 가설을 이끌었다.

효모 cdc4 유전자에 대한 sel-10, 28971 및 W85144의 상동성은 단백질의 세포내 분해에서 유비퀴틴-프로테아솜 경로의 기능적 역할을 시사한다. 효모 cdc4 유전자의 돌연변이는 S-기 싸이클린/cdk 복합체의 저해제인 Sic1의 분해를 차폐시켜 세포 주기 정체를 유발한다[킹(King, R.W.) 등의 문헌[Science 274:1652-9 (1996)]]. Sic1의 인산화는 유비퀴틴-프로테아솜 경로를 통한 분해를 위해 그를 표적으로 설정한다. 이 경로는 다중단백질 복합체에 의해 촉진되는 3개의 연결된 효소 반응으로 이루어진다[시차노버(Ciechanover, A.)의 문헌[Cell 79:13-21 (1994)], 시차노버(Ciechanover, A.) 및 슈바르쯔(A.L. Schwartz)의 문헌[FASEB J.8:182-91 (1994)]]. 먼저, ATP에 의해 유비퀴틴의 C-말단부 글리신이 활성화되어 유비퀴틴-활성화 효소 E1에 의해 촉진된 반응에서 고에너지 티올 에스테르 중간체가 형성된다. 활성화에 이어, E2 효소(유비퀴틴 결합 효소)는 E1으로부터 단백질 표적으로 유비퀴틴을 전달한다. 어떤 경우에는, E2가 단독으로 작용한다. 다른 경우에는, 단백질 기질과 결합하며 유비퀴틴화를 촉진시키는 E2를 회복시키는 E3 유비퀴틴-결합 효소와 조화하여 E2가 작용한다. E2 유비퀴틴-결합 효소는 분명히 보존된 유전자 군을 포함하나, E3 효소는 서열에서 차이가 난다[시차노버(Ciechanover, A.)의 문헌[Cell 79:13-21 (1994)]시차노버(Ciechanover, A.) 및 슈바르쯔(A.L. Schwartz)의 문헌[FASEB J.8:182-91 (1994)]].

효모에서, E2 유비퀴틴-결합 효소의 돌연변이인 cdc34는 S-기 싸이클린/cdk 복합체의 저해제인 Sci1 분해 실패를 통해 세포 주기 정체를 유발한다[킹(King, R.W.) 등의 문헌[Science 274:1652-9 (1996)]]. 통상 Sic1은 세포가 G1-S기 전환에 진입할 때 분해되나, cdc34의 부재시에는 Sci1은 분해되지 않으며 그의 축적으로 세포 주기 정체가 일어난다. cdc34뿐 아니라, cdc4도 G1-S기 전환에 필요한 3가지 다른 단백질 중 하나이다. 다른 두가지 단백질은 cdc53 및 Skp1p이다. 상기 논의된 바와 같이, cdc4는 Skp1에 대한 상호작용 도메인인, 싸이클린 F와 공유되는 두개의 구조적 모티프, 7개의 WD40 반복체(이는 이 단백질이 베타-프로펠러를 형성함을 암시함) 및 한개의 구조적 모티프를 포함한다[바이(Bai, C.) 등의 문헌[Cell 86:263-74 (1996)]]. cdc53, cdc4 및 skp1을 포함하는 곤충 세포 용해물(유비퀴틴, cdc34 및 E1을 포함하기도 함)은 유비퀴틴을 Sic1에 전달할 수 있으며 이는 이 성분 중 1개 이상이 E3 유비퀴틴 결합 효소로 기능함을 시사한다[킹(King, R.W.) 등의 문헌[Science 274:1652-9 (1996)]. cdc4 또는 Skp1 중 하나의 발현 증가는 부분적으로 나머지 하나의 손실을 구제한다.

씨. 엘레간스(C. elegans)에서, sel-10의 돌연변이는 가시적 표현형을 가지지 않는데, 이는 sel-10이 세포 주기 조절에 역할이 없음을 나타낸다. 밀접하게 관련되는 씨. 엘레간스(C. elegans) β-트랜스두신 군 요소인 K10B2.6은 그가 싸이클린 B 분해 실패로 인한 세포 주기의 후반기에 정체된 효모 세포 주기 돌연변이체를 구제하는 제노푸스 래비스로부터의 유전자 TRCP_XEN과 함께 합해질 때는 조절 작용할 수도 있다[스페바크(Spevak, W.) 등의 문헌[Mol. Cell. Biol. 13:4953-66 (1993)]]. sel-10이 E3-유비퀴틴 결합 효소의 한 성분을 암호화하지 않는다면 sel-10이 어떻게 sel-12를 억제하고 lin-12 돌연변이를 증진시킬 수 있는가? 가장 간단한 가설은 sel-10이 유비퀴틴-프로테아솜 경로를 통해 두 단백질의 분해를 조절한다는 것이다. sel-12 및 lin-12는 모두 막관통 단백질이다. Sel-12는 막을 8회 가로지르므로 Sel-12의 N-말단부 및 C-말단부가 세포질과 마주하나[김(Kim, T.W.) 등의 문헌[J.Biol.Chem. 272:11006-10 (1997)]], lin-12는 유형1의 막관통 단백질이다[그린발트(Greenwald, I.) 및 세이도욱스(G.Seydoux)의 문헌[Nature 346:197-9 (1990)]]. 두가지 모두 유비퀴틴화되며 인간 PS2의 경우, 프로테아솜의 저해제, N-아세틸-L-류시날-L-노르류시날 및 락타시스틴으로 처리된 세포에서 안정 상태 수준이 증가한다[리(Li, X.) 및 그린발트(I.Greenwald)의 문헌[Neuron. 17:1015-21 (1996)]]. 또한, sel-10은 프레세닐린 기능의 음성 조절자의 분해를 표적으로 할 수 있다.

유전적 분석 및 cdc4에 대한 상동성에 의해 시사되는 단백질 기능은 인간 sel-10의 약물 저해제가 인간 프레세닐린의 안정 상태 수준을 증가시킬 수 있음을 시사한다. 이는 프레세닐린 경로의 활성을 증가시키고 알쯔하이머 병의 치료 중재에 대한 방법을 제공한다.

실시예 2: 씨. 엘레간스(C. elegans)의 프레세닐린 돌연변이의 외부발생 억제자인 sel-10을 암호화하는 인간 cDNA의 5' RACE 클로닝.

재료 및 방법

씨. 엘레간스(C. elegans) sel-10에 대한 코딩 서열과 같이 실시예 1에서 확인된 F55B12.3의 서열을 기준으로 씨. 엘레간스(C. elegans) cDNA로부터의 서열을 코딩하는 sel-10의 증폭에 대한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 작제하였다. 작제된 프라이머는 5'-CGGGATCCACCATGGATGATGGATCGATGACACC-3'(SEQ ID NO:11) 및 5'-GGAATTCCTTAAGGGTATACAGCATCAAAGTCG-3'(SEQ ID NO:12)였다. BRL 수퍼스크립트 Ⅱ 프리암플리피케이션 키트(BRL Superscript Ⅱ Preamplification kit)를 이용하여 씨. 엘레간스(C. elegans) mRNA를 cDNA로 전환시켰다. BamHI 및 EcoRI(LTI, Gaithersberg, MD)으로 이 PCR 생성물을 잘랐으며 pcDNA3.1(Invitrogen)에 클로닝하였다. 단리된 두 생성물의 서열을 분석하였다(ABI, Perkin-Elmer Corp).

Incyte 클론 028971의 서열(씨. 엘레간스(C. elegans) sel-10의 인간 상동 유전자의 일부를 암호화함)을 사용하여 인간 sel-10의 손실된 5' 말단을 증폭시키는 4가지 안티센스 올리고뉴클레오티드 프라이머 5'-TCACTTCATGTCCACATCAAAGTCC-3'(SEQ ID NO:13), 5'-GGTAATTACAAGTTCTTGTTGAACTG-3'(SEQ ID NO:14), 5'-CCCTGCAACGTGTGTAGACAGG-3'(SEQ ID NO:15) 및 5'-CCAGTCTCTGCATTCCACACTTTG-3'(SEQ ID NO:16)를 설계하였다. Incyte LifeSeq "일렉트로닉 노던(Electronic Northern)"분석법을 이용하여 sel-10이 발현되는 조직을 확인하였다. 클론테크 마라톤 키트(CloneTech Marathon kit)를 사용하는 5' RACE 클로닝의 경우, 이 중 두 조직인 해마 및 유선을 선정하여 해마 및 유선 유래의 마라톤-레디(Marathon-ready) cDNA를 만들었다. TA 벡터 pCR3.1(인비트로젠)에 PCR 생성물을 클로닝하였으며 단리된 것들의 서열을 분석하였다. 또한, 해마 sel-10 서열인 5'-CTCAGACAGGTCAGGACATTTGG-3'과 다른 5' 말단을 가지는 Incyte 클론을 토대로 다른 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하였다.

Blastn을 사용하여 Incyte 데이타베이스 LifeSeq 및 LifeSeqFL을 조사하였다. GCG 프로그램으로 갭 정렬 및 번역을 수행하였다(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wisconsin).

결과

씨. 엘레간스(C. elegans) sel-10의 코딩 서열: 원래 세인트루이스 소재의 워싱턴 대학의 게놈 서열 분석 센터(Genomic Sequencing Center, Washington University, St.Louis)에서 게놈 코스미드 F55B12의 인트론 및 엑손을 예언하는 컴퓨터 프로그램 진파인더(GeneFinder)를 사용하여 씨. 엘레간스(C. elegans) sel-10의 예상된 코딩 서열 F55B12.3을 결정하였다. 씨. 엘레간스(C. elegans) cDNA 유래의 이 영역을 증폭시키고 클로닝하고 서열 분석하여 가설의 상기 cDNA 서열을 확인하였다.

인간 sel-10 상동 유전자의 코딩 서열: 모든 028971 안티센스 올리고뉴클레오티드는 인간 해마 및 유방 cDNA 유래 5' RACE 생성물을 증폭시켰다. 해마 반응 유래의 가장 긴 PCR 생성물을 클로닝하고 서열 분석하였다. 이 PCR 반응을 설계하여 예상되는 정지 코돈에서 종결하는 생성물을 발생시켰다. 두 단리된 서열은 028971 서열 시작 전 880번째 염기에서 시작하는 동일한 서열을 포함하였다. 연결된 Incyte cDNA 클론과 비교하여 이 서열을 확인하였다. 인간 및 씨. 엘레간스(C. elegans) 유전자 사이의 이 영역의 상동성은 낮았고 이 클론 및 부가된 클론 사이의 중첩은 너무 적었으므로 인간 sel-10 상동 유전자의 5' 말단을 연결한 Incyte 클론은 F55B12.3와 같이 부가되지 않았으며 028971 서열을 가지는 Incyte 데이타베이스를 블라스팅하여 Incyte 데이타베이스에 그들을 밀집시키거나 또는 노출시킬 수 없었다.

인간 sel-10의 예상된 단백질 서열은 씨. 엘레간스(C. elegans) sel-10에 47.6 % 동일하였고 56.7 % 유사하였다. 인간 sel-10 서열의 N-말단부는 프레임내 메티오닌 4개로 시작되었다. 상기 기재된 WD40 반복 외에, 인간 서열은 sel-10 상동 유전자의 경우 예상되는 바와 같이 Skp1에 결합하는 CDC4 F-박스에 상동인 영역을 포함하기도 했다.

유방 및 해마 조직에서 발현되는, 인간의 다른 sel-10 mRNA

해마 유래 서열과는 다른 여러 추가의 인간 sel-10 EST가 확인되었다. 이들은 정확히 일치하였는데, 이는 아마도 다른 전사체가 있음을 나타낸다. 이 서열과 인간 해마 sel-10 서열과 비교 결과, 프레임 내 4번째 메티오닌 앞에서 차이를 나타냈으며 그 이후로는 정확한 서열 일치를 나타냈다. 이 전사체의 다른 전사체 5' 말단에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머는 유방 유래의 생성물은 증폭시키나 해마 유래 cDNA는 증폭시키지 않는 것으로 나타났다. 이는 인간 sel-10 전사체가 조직-특이적인 방식으로 다른 스플라이싱을 수행하거나 또는 이 유전자가 다중의 조직 특이적인 프로모터를 포함함을 지시한다.

토의

5' RACE 및 PCR 증폭을 이용하여 씨. 엘레간스(C. elegans) 유전자 sel-10의 인간 상동체를 암호화하는 전체-길이 cDNA를 클로닝하였다. 서열 분석 결과, sel-10은 F-박스 및 WD40 반복 도메인을 포함하는 단백질의 CDC4 군의 요소라는 초기의 가설이 확인되었다. 번역 개시의 분명한 부위 앞의 5' 서열에서 다른, 해마 및 유선 유래 인간 sel-10 cDNA의 두 변형체를 클로닝하였다. 이는 이 유전자가 조직-특이적인 전사 개시에 대한 2개 이상의 시작 부위를 가지거나 또는 엑손 스플라이싱의 패턴은 조직-특이적임을 암시하였다.

실시예 3: 인간 세포에서 에피톱-태그 sel-10의 발현 및 인간 sel-10에 의한 아밀로이드 β펩티드 프로세싱 혼란

재료 및 방법

에피톱-태그 sel-10의 작제: 서브클로닝, 세포 생장 및 형질감염:

올리고뉴클레오티드 237(5'-GGAATTCCATGAAAAGATTGGACCATGGTTCTG-3')(SEQ ID NO:18) 및 206(5'-GGAATTCCTCACTTCATGTCACATCAAAGTCCAG-3')(SEQ ID NO:19)로 개시된 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하여 인간 sel-10 cDNA의 프레임 내에 EcoRI 부위를 도입하였다. 벡터 pCS2+MT의 EcoRI 부위에 상기 생성된 PCR 생성물을 도입하였다. 이는 해마 유래 sel-10 cDNA의 5번째 메티오닌, 즉 SEQ ID NO:1에 주어진 서열에 대해 뉴클레오티드 306개 상류에 대한 프레임 내의 5' 6myc 에피톱 태그와 융합하였다. 6myc-N-sel-10으로 표시되는 이 작제물의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:20에 주어져 있으나, 그에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:21에 주어져 있다. 해마 및 유방 sel-10 cDNA는 이 메티오닌의 상류부가 다르다. pcDNA3.1 벡터에 3'-FLAG 태그를 가지는 PS1 cDNA(PS1-C-FLAG)를 서브클로닝하였다. 벡터 pIRES-EGFP에 스웨덴 NL 돌연변이 및 APP695의 C-말단부에 디-라이실 모티프 첨가로 이루어진 감소된 ER 보유 서열(APP695NL-KK) 함유 APP cDNA를 클로닝하였다[물란(Mullan) 등의 문헌[Nat Genet 1992 Aug;1(5):345-7]]. 10 % FBS 함유 DMEM 중 HEK293 및 IMR32 세포를 배양하여 80 % 합류하였고 이 세포를 상기 cDNA로 형질감염시켰다. 1개의 플라스미드로 형질감염시키는데 총 10 mg 총 DNA/6x10⁶세포를 사용하였다. 여러개 플라스미드의 동시 형질감염의 경우, LipofectAmine(BRL)을 이용한 총 10 mg DNA에 동량의 각 플라스미드를 사용하였다.

C-말단부 V5 his 태그 sel-10 및 C-말단부 mychis 태그 sel-10을 작제하기 위해, 5' 프라이머 5'-GGGTACCCCTCATTATTCCCTCGAGTTCTTC-3'(SEQ IN NO:22) 상 KpnI 제한 부위 및 3' 프라이머 5'-GGAATTCCTTCATGTCCACATCAAAGTCC-3'(SEQ ID NO:23) 상 EcoRI 제한 부위 함유 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 인간 해마 sel-10의 코딩 서열을 증폭시켰으며 최초 인간 sel-10 RACE PCR 생성물을 주형으로 사용하였다. 이 생성물을 KpnI 및 EcoRI 모두로 자르고 벡터 pcDNA6/V5 또는 pcDNA3.1/Myc-His(+)A(인비트로젠)에 클로닝하였다. 디데옥시 서열 분석에 의해 각 단리체의 뉴클레오티드 서열을 확인하였다. C-말단부 V5 히스 태그 sel-10의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:24에 주어져 있으나, 그에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:25에 주어져 있다. 디데옥시 서열 분석에 의해 각 단리체의 뉴클레오티드 서열을 확인하였다. C-말단부 mychis 태그 sel-10의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:26에 주어져 있으나, 그에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:27에 주어져 있다.

FACS에 의해 형질전환된 세포의 클론의 선택: 공냉식 아르곤 레이져에 의해 공급되는 여기 라인(488 nm)을 갖춘 EPICS Elite ESP 플로우 사이토미터(Coulter, Hialeah, FL) 상 세포 샘플을 분석하였다. 525 nm band-pass 필터를 통해 EGFP 방출을 측정하였으며 전방 및 직각의 빛 산란에 의해 결정된 바와 같이 살아있는 세포 상에 모은 후에 4-디케이드 로그 척도 상 형광 세기를 나타냈다. 단일 녹색 세포들을 G418 없는 배양 배지 함유 96 웰 플레이트의 각 웰에 나누어 넣었다. 4일의 회복 기간 후에, 최종 농도 400 mg/ml로 G418을 배지에 첨가하였다. 클론 함유 웰을 96 웰 플레이트에서 24 웰 플레이트로 확장시킨 후에, 각 통로에서 확장에 선택된 초고속 배양 콜로니 함유 6 웰 플레이트로 확장시켰다.

면역형광법: 얼음 상 30분 동안 PBS의 4 % 포름알데히드 및 0.1 % Triton X-100을 가지고 형질감염시키고 48시간 후에 슬라이드에서 배양된 세포를 고정시켰고 실온(즉, 25 ℃)에서 1시간 동안 PBS(차폐 용액)의 10 % 염소 혈청으로 이 세포를 차폐시킨 후에, 4 ℃에서 밤새 마우스 항-myc(10 mg/ml) 또는 토끼 항-FLAG(0.5 mg/ml) 항체와 함께 인큐베이션한 후에, 25 ℃에서 1시간 동안 차폐 용액에 형광-표지 염소 항-마우스 항체 또는 항-토끼 항체(5 mg/ml)와 함께 인큐베이션하였다.

웨스턴 블롯팅: 얼음 상 10분 동안 100 ml TENT(50 mM Tris-HCl pH 8.0, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1x 프로테아제 저해제 혼합물)와 함께 10⁵세포를 인큐베이션하여 형질감염시킨 후 48시간 지나 세포 용해물을 만든 후에 14,000 g에서 원심분리하였다. 이 상등액을 4 내지 12 % NuPage 겔(50 mg 단백질/레인)에 로딩하였으며 XcellⅡMini-Cell 시스템(Novex)을 이용하여 전기영동 및 전달을 수행하였다. 실온에서 1시간 동안 PBS 중 5 % 밀크를 가지고 이 블롯을 차폐시켰으며 항-myc 또는 항-FLAG 항체(상기에 "면역형광"으로 기재됨)와 함께 4 ℃에서 밤새 인큐베이션한 후에, 실온에서 1시간 동안 양 항-마우스 항체-HRP 또는 항-토끼 항체-HRP(0.1 mg/ml)와 함께 인큐베이션한 후에, Supersignal(Pierce) 검출하였다.

ELISA: 배양 상등액 중 Aβ_1-40및 Aβ_1-42펩티드의 수준을 검출할 수 있는 하기 이중 항체 샌드위치 ELISA로 세포 배양 상등액 또는 세포 용해물(100 ml 포름산/10⁶세포)을 분석하였다.

이중 항체 샌드위치 ELISA에서 단일 항체(mAb)6E10(Senetek, St.Louis, MO) 및 비오티닐화(biotinylated) 토끼 항혈청 162 또는 164(NYS Institute for Basic Research, Staten Island, NY)를 사용하여 인간 Aβ1-40 또는 Aβ1-42를 측정하였다. 포착된 항체 6E10은 hAβ의 N-말단부 아미노산 잔기 1 내지 16번 상 존재하는 에피톱에 특이적이었다. 결합된 검출 항체 162 및 164 는 hAβ1-40 및 hAβ1-42에 각각 특이적이었다. 피르틸라(Pirtila) 등의 문헌[Neurobiology of Aging 18:121-7 (1997)]의 방법에 따라 이 샌드위치 ELISA를 수행하였다. 요컨대, 0.1 M 탄산-중탄산 완충액(pH 9.6) 중 희석된 100 ㎕/웰의 mAb 6E10(5㎍/ml)로 Nunc Maxisorp 96 웰 면역플레이트를 코팅하였으며 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 0.05 %의 Tween-20(DPBST) 함유 0.01M DPBS(Modified Dulbecco's Phosphate Buffered Saline(0.008 M 소듐 포스페이트, 0.002 M 포타슘 포스페이트, 0.14 M 소듐 클로라이드, 0.01 M 포타슘 클로라이드, pH 7.4))로 플레이트를 3회 세척한 후에, 비특이적 결합을 회피하기 위해 0.01 DPBS 중 10 % 정상 양 혈청(Sigma) 200 ㎕으로 60분 동안 플레이트를 차폐시켰다. 플레이트 세척 후에, 비형질감염 상태 세포 배지 중 DMSO의 1 mg/ml 저장 용액으로부터의 인간 Aβ1-40 또는 Aβ1-42 기준 100㎕/웰을 첨가하였으며 형질감염된 세포의 상태의 배지 100 ㎕/웰을 여과시켰다. 실온 및 4 ℃에서 2시간 동안 이 플레이트를 인큐베이션하였다. 다음 날, 플레이트 세척 후에, DPBST+0.5 % BSA 중 희석된 비오티닐화 토끼 항혈청 162 1:400 또는 164 1:50 100 ㎕/웰을 첨가하였고 실온에서 1시간 15분 동안 인큐베이션하였다. 세척 후에, DPBST 중 1:10,000으로 희석된 뉴크라비딘-호르세라디쉬(neutravidin-horseadish) 페록시다제(Pierce, Rockford, Ⅱ) 100 ㎕/웰을 가하였으며 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 최종 세척 후에, 50 mM 시트르산/100 mM 소듐 포스페이트 완충액(Sigma Chemicals, St.Louis, MO) 중 o-페닐네디아민 디히드로클로라이드(Sigma Chemicals, St.Louis, MO) 100 ㎕/웰을 기질로 첨가하였으며 Soft max Pro 소프트웨어를 사용하여 20분 동안 키네틱 마이크로플레이트 리더의 450 nm에서 발색을 관찰하였다.

결과

HEK293 세포의 형질감염: 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현시키는 벡터 사용을 통하거나 또는 에피톱-태그 sel-10 또는 PS-1의 면역형광 검출에 의해 형질감염 효율을 관찰하였다. N-말단부 6-myc 에피톱을 사용하여 인간 sel-10(6myc-N-sel-10)을 태그하였는데, 이 PS1은 C-말단부 FLAG 에피톱(PS1-C-FLAG)으로 태그되었다. Aβ프로세싱 및 C-말단부 디-라이신 모티프(APP695NL-KK)로 이루어진 감소된 소포체(ER) 보유 신호를 증가시키는 스웨덴 NL 돌연변이에의해 APP695가 변경되었다. 디-라이신 모티프는 Aβ프로세싱을 약 2배로 증가시켰다. GFP(pIRES-EGFP, 인비트로젠) 함유 비시스트로닉 벡터 중 첫번째 시스트론에 APP695NL-KK 작제물을 주입하여 형질감염 효율을 관찰하는 것이 가능하였다. 1개의 플라스미드 DNA로 형질감염시키는 경우, HEK293 세포의 형질감염 효율은 약 50 %였다. 2개의 플라스미드로 동시 형질감염시키는 경우, 이중 면역형광법에 의해 검출된 바와 같이 세포의 약 30 내지 40%가 두 단백질 모두를 발현시켰다.

PS1-C-FLAG 및 6myc-N-sel-10의 경우 예시된 바와 같이 웨스턴 블롯에 의해 형질감염된 HEK293 세포의 재조합 단백질의 발현을 확인하였다(도 1A). 3개의 플라스미드(PS1-C-FLAG+6myc-N-sel-10+APP)로 동시 형질감염시키는 경우, 적합한 항체를 사용하여 웨스턴 블롯(도 1B)에 의해 동일한 세포 용해물 중 3개의 단백질 모두를 검출하였다.

Aβ프로세싱에 대한 6myc-N-sel-10 및 PS1-C-FLAG의 효과: HEK293 세포에 6myc-N-sel-10 및 PS1-C-FLAG과 함께 APP695NL-KK를 동시 형질감염시킨 결과, APP695NL-KK만으로 형질감염시킨 것보다 배양액의 상등액 중 2 내지 3배의 Ab1-40 및 Ab1-42 펩티드가 방출되었다(표 1). 6myc-N-sel-10 및 PS1-C-FLAG 모두로 APP695NL-KK를 동시 형질감염시킨 결과, Ab 방출이 훨신 증가하였다(즉, 4 내지 6배가 증가함). 대조적으로, 상기 상등액으로 방출된 Ab1-42/(Ab1-40+Ab1-42) 비율은 약 50 % 감소하였다. Ab1-42/(Ab1-40+Ab1-42) 비율의 미세한 감소는 Ab1-42에 상대적으로 Ab1-40에서의 큰 증가를 반영한다. 6myc-N-sel-10 또는 PS1-C-FLAG의 어느 것도 HEK293 세포의 내생적 Ab 생산에 영향을 주지 않았다. IMR32 세포에서도 유사한 관찰 결과가 얻어졌다(표 2). 그러나, IMR32 세포는 HEK293 세포보다 충분치 못하게 형질감염되었으므로, 6myc-N-sel-10 또는 PS1-C-FLAG으로 동시 형질감염에 의한 APP695NL-KK 프로세싱의 촉진은 낮았다.

APP695NL-KK로 형질감염된 HEK293 세포에서 발현된 Ab1-40의 수준은 배양 상등액 및 세포 펠릿 모두에서의 Ab 펩티드를 측정하기에 충분했다.

APP695NL-KK만으로 형질감염된 세포의 상등액에서보다 HEK293 세포 펠릿의 상등액에서 상당히 더 많은 Ab1-40이 검출되었다. 6myc-N-sel-10 또는 PS1-C-FLAG으로 동시 형질감염시킨 결과, 비례적으로 세포 펠릿의 Ab1-40이 감소하였으며 배양 상등액의 Ab가 증가하였다. 이는 6myc-N-sel-10 및 PS1-C-FLAG가 APP의 프로세싱 또는 트래픽킹을 변경시켜 비례적으로 더 많은 Ab가 세포로부터 방출됨을 암시한다.

내생적 Aβ프로세싱에 대한 6myc-N-sel-10 및 PS1-C-FLAG의 효과: 6myc-N-sel-10 단백질을 발현시키는, 안정하게 형질전환된 HEK293 세포 라인을 생성시켜 인체 세포에 의한 내생적 APP의 프로세싱에 대한 6myc-N-sel-10의 효과를 평가하였다. 6myc-N-sel-10을 발현시키는 2개의 세포 라인(sel-10/2 및 sel-10/6)이 유도되었으며 대조군 세포 라인은 pcDNA3.1 벡터 DNA로 형질전환되었다. 두 6myc-N-sel-10 세포 라인 모두 웨스턴 블롯 분석에 의해 나타난 바와 같이 이 단백질을 발현시켰다. 벡터 DNA로 형질전환된 세포와는 대조적으로 Ab1-40의 내생적 생산은 6myc-N-sel-10 세포 라인 모두에서 증가하였다(표 3). 또한, APP695NL-KK 플라스미드 DNA로 형질감염시킨 후에, 6myc-N-sel-10의 안정한 발현은 Ab 생산을 상당히 증가시켰다(표 3). PS1-C-FLAG를 발현시키는 6개의 안정한 세포 라인에서 마찬가지 결과가 얻어졌다. APP695NL-KK로 형질감염시킨 후에, 6개의 세포 라인 모두 내생적 Aβ프로세싱의 상당한 증가를 나타냈으며 이들 모두 강화된 Ab 프로세싱을 나타내기도 했다(표 3). 또한, 6myc-N-sel-10에서 나타나는 Aβ프로세싱의 증가로도 mychis 또는 v5his의 C-말단부에 sel-10가 태그됨을 알 수 있었다(표 4 참조). C-말단부 및 N-말단부 태그 모두 Aβ프로세싱을 증가시키는 것으로 나타났다.

토의

상기 데이타는 과다 발현시 6myc-N-sel-10 및 PS1-C-FLAG는 일시적이며 안정한 발현 시스템 모두에서 Aβ프로세싱을 변경시킴을 암시한다. 상기 실험에서, 웨스턴 블롯 분석에 의해 sel-10 단백질 발현을 검출하는데 6-myc 에피톱 태그를 사용하였다. 효모 CDC4에 대한 sel-10의 서열 상동성이 암시하는 바와 같이, sel-10이 E2-E3 유비퀴틴 리가제라면 유비퀴틴화를 표적으로 하는 단백질을 확인하는 것이 가능하다. 프레세닐린은 유비퀴틴-프로테아솜 경로를 통해 분해되기 때문에, PS1 및 PS2는 sel-10 촉진 유비퀴틴화의 논리적인 표적이다[김(Kim) 등의 문헌[J.Biol. Chem. 272:11006-11010 (1997)]]. sel-10이 Aβ프로세싱에 어떻게 영향을 주는지는 현재로는 이해되지 않는다. 앞으로, APP의 생산, 프로세싱, 운반 또는 턴오버를 변경시켜 sel-10 및 PS1이 Aβ프로세싱을 증가시키는지와 sel-10에 의해 PS-1의 효과가 매개되거나 또는 조절되는지를 결정하는 것이 필요할 것이다.

상기 실험은 sel-10이 AD의 치료시 Ab 수준을 감소시키는데 잠재적인 약물 표적임을 암시하였다. 또한, 상기 실험은 씨. 엘레간스(C. elegans)가 AD 환경의 프레세닐린 생태를 연구하는데 훌륭한 모델 시스템임을 나타냈다. 따라서, 공동 형질감염 실험 및 안정한 형질전환체에 의해 나타난 바와 같이, 6myc-N-sel-10 또는 PS1-C-FLAG의 발현은 Aβ프로세싱을 증가시켰다. APP695NL-KK과 함께 6myc-N-sel-10 또는 PS1-C-FLAG을 공동 형질감염 시킨 후에, Aβ프로세싱에서의 증가는 HEK293 세포 및 IMR32세포 모두에서 나타났다. 6myc-N-sel-10 또는 PS1-C-FLAG을 발현시키는 HEK293 세포의 안정한 형질전환체에서, 내생적 Aβ프로세싱의 증가 및 APP695NL-KK로 형질감염시킨 후에 Aβ프로세싱에서의 증가가 관찰되었다. 이는 sel-10 및(또는) PS1 저해제가 Aβ프로세싱을 감소시킬 수 있으며, 알쯔하이머 병에 대한 치료 잠재력이 있음을 암시한다.

본 발명이 특히 상기 본 발명의 기술 및 실시예에 기재된 바와 달리 실행될 수도 있음은 분명할 것이다.

상기 사항에 비추어 본 발명의 많은 변형 및 변동이 가능하며 따라서, 이는 본 발명의 범위내이다.

본 명세서에 인용된 모든 간행물의 전체 개시물을 본 명세서에 참고문헌으로 인용하였다.

〈110〉 Gurney, Mark E.

Li, Jinhe

Pauley, Adele M.

Pharmacia ＆ Upjohn Company

〈120〉 Human Sel-10 Polypeptides and Polynucleotides that

Encode Them

〈130〉 6142

〈140〉 6142

〈141〉 1997-12-19

〈160〉 27

〈170〉 PatentIn Ver. 2.0

〈210〉 1

〈211〉 3550

〈212〉 DNA

〈213〉 Homo sapiens

〈400〉 1

ctcattattc cctcgagttc ttctcagtca agctgcatgt atgtatgtgt gtcccgagaa 60

gcggtttgat actgagctgc atttgccttt actgtggagt tttgttgccg gttctgctcc 120

ctaatcttcc ttttctgacg tgcctgagca tgtccacatt agaatctgtg acatacctac 180

ctgaaaaagg tttatattgt cagagactgc caagcagccg gacacacggg ggcacagaat 240

cactgaaggg gaaaaataca gaaaatatgg gtttctacgg cacattaaaa atgatttttt 300

acaaaatgaa aagaaagttg gaccatggtt ctgaggtccg ctctttttct ttgggaaaga 360

aaccatgcaa agtctcagaa tatacaagta ccactgggct tgtaccatgt tcagcaacac 420

caacaacttt tggggacctc agagcagcca atggccaagg gcaacaacga cgccgaatta 480

catctgtcca gccacctaca ggcctccagg aatggctaaa aatgtttcag agctggagtg 540

gaccagagaa attgcttgct ttagatgaac tcattgatag ttgtgaacca acacaagtaa 600

aacatatgat gcaagtgata gaaccccagt ttcaacgaga cttcatttca ttgctcccta 660

aagagttggc actctatgtg ctttcattcc tggaacccaa agacctgcta caagcagctc 720

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tcatacacag tccatggaaa agtgcataca tcagacagca cagaattgat actaactgga 900

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catcacaaat gagagacaac atcatcatta gtggatctac agatcggaca ctcaaagtgt 1140

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gggatattga gacaggccag tgtttacatg ttttgatggg tcatgttgca gcagtccgct 1320

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gggatgtgga gacagggaat tgcattcaca cgttaacagg gcaccagtcg ttaacaagtg 1560

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ttccccctgc aaaaagaaaa aaagaaaaga aaaagaaaaa aatcccttgt tctcagtggt 2040

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tttttctgga gtggaaaagc ttaaaaaaat tactgtgaat tgtttttgta cagttatcat 2460

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aaaggtggca agttgtcctg ggttctgtga gtcctgagat ggatttaatt cttgatgctg 2640

gtgctagaag taggtcttca aatatgggat tgttgtccca accctgtact gtactcccag 2700

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tatggtttga ttcacttaga aattttattt tcttataact taagtgcaat aaaatgtgtt 3540

ttttcatgtt 3550

〈210〉 2

〈211〉 3571

〈212〉 DNA

〈213〉 Homo sapiens

〈400〉 2

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ttctcagcct tttaaaaact attattaaat atatattttt aaaatttagt ggttagagct 120

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acaactgtta cagttttatt gctctgagta actgacaaag cagaaactat tcagtttttg 3240

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ttctccaaga gccacaactc aagctgaact gtgaaagtgg tttaacactg tatcctaggc 3360

gatctttttt cctccttctg tttatttttt tgnttgtttt atttatagtc tgatttaaaa 3420

caatcagatt caagttggtt aattttagtt atgtaacaac ctgacatgat ggaggaaaac 3480

aacctttaaa gggattgtgt ctatggtttg attcacttag aaattttatt ttcttataac 3540

ttaagtgcaa taaaatgtgt tttttcatgt t 3571

〈210〉 3

〈211〉 627

〈212〉 PRT

〈213〉 Homo sapiens

〈400〉 3

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625

〈210〉 4

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〈212〉 PRT

〈213〉 Homo sapiens

〈400〉 4

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Lys

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〈210〉 7

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〈400〉 7

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〈400〉 8

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〈210〉 9

〈211〉 559

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〈400〉 9

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325 330 335

Val Trp Asp Ile Glu Thr Gly Gln Cys Leu His Val Leu Met Gly His

340 345 350

Val Ala Ala Val Arg Cys Val Gln Tyr Asp Gly Arg Arg Val Val Ser

355 360 365

Gly Ala Tyr Asp Phe Met Val Lys Val Trp Asp Pro Glu Thr Glu Thr

370 375 380

Cys Leu His Thr Leu Gln Gly His Thr Asn Arg Val Tyr Ser Leu Gln

385 390 395 400

Phe Asp Gly Ile His Val Val Ser Gly Ser Leu Asp Thr Ser Ile Arg

405 410 415

Val Trp Asp Val Glu Thr Gly Asn Cys Ile His Thr Leu Thr Gly His

420 425 430

Gln Ser Leu Thr Ser Gly Met Glu Leu Lys Asp Asn Ile Leu Val Ser

435 440 445

Gly Asn Ala Asp Ser Thr Val Lys Ile Trp Asp Ile Lys Thr Gly Gln

450 455 460

Cys Leu Gln Thr Leu Gln Gly Pro Asn Lys His Gln Ser Ala Val Thr

465 470 475 480

Cys Leu Gln Phe Asn Lys Asn Phe Val Ile Thr Ser Ser Asp Asp Gly

485 490 495

Thr Val Lys Leu Trp Asp Leu Lys Thr Gly Glu Phe Ile Arg Asn Leu

500 505 510

Val Thr Leu Glu Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Val Trp Arg Ile Arg

515 520 525

Ala Ser Asn Thr Lys Leu Val Cys Ala Val Gly Ser Arg Asn Gly Thr

530 535 540

Glu Glu Thr Lys Leu Leu Val Leu Asp Phe Asp Val Asp Met Lys

545 550 555

〈210〉 10

〈211〉 540

〈212〉 PRT

〈213〉 Homo sapiens

〈400〉 10

Met Lys Arg Lys Leu Asp His Gly Ser Glu Val Arg Ser Phe Ser Leu

1 5 10 15

Gly Lys Lys Pro Cys Lys Val Ser Glu Tyr Thr Ser Thr Thr Gly Leu

20 25 30

Val Pro Cys Ser Ala Thr Pro Thr Thr Phe Gly Asp Leu Arg Ala Ala

35 40 45

Asn Gly Gln Gly Gln Gln Arg Arg Arg Ile Thr Ser Val Gln Pro Pro

50 55 60

Thr Gly Leu Gln Glu Trp Leu Lys Met Phe Gln Ser Trp Ser Gly Pro

65 70 75 80

Glu Lys Leu Leu Ala Leu Asp Glu Leu Ile Asp Ser Cys Glu Pro Thr

85 90 95

Gln Val Lys His Met Met Gln Val Ile Glu Pro Gln Phe Gln Arg Asp

100 105 110

Phe Ile Ser Leu Leu Pro Lys Glu Leu Ala Leu Tyr Val Leu Ser Phe

115 120 125

Leu Glu Pro Lys Asp Leu Leu Gln Ala Ala Gln Thr Cys Arg Tyr Trp

130 135 140

Arg Ile Leu Ala Glu Asp Asn Leu Leu Trp Arg Glu Lys Cys Lys Glu

145 150 155 160

Glu Gly Ile Asp Glu Pro Leu His Ile Lys Arg Arg Lys Val Ile Lys

165 170 175

Pro Gly Phe Ile His Ser Pro Trp Lys Ser Ala Tyr Ile Arg Gln His

180 185 190

Arg Ile Asp Thr Asn Trp Arg Arg Gly Glu Leu Lys Ser Pro Lys Val

195 200 205

Leu Lys Gly His Asp Asp His Val Ile Thr Cys Leu Gln Phe Cys Gly

210 215 220

Asn Arg Ile Val Ser Gly Ser Asp Asp Asn Thr Leu Lys Val Trp Ser

225 230 235 240

Ala Val Thr Gly Lys Cys Leu Arg Thr Leu Val Gly His Thr Gly Gly

245 250 255

Val Trp Ser Ser Gln Met Arg Asp Asn Ile Ile Ile Ser Gly Ser Thr

260 265 270

Asp Arg Thr Leu Lys Val Trp Asn Ala Glu Thr Gly Glu Cys Ile His

275 280 285

Thr Leu Tyr Gly His Thr Ser Thr Val Arg Cys Met His Leu His Glu

290 295 300

Lys Arg Val Val Ser Gly Ser Arg Asp Ala Thr Leu Arg Val Trp Asp

305 310 315 320

Ile Glu Thr Gly Gln Cys Leu His Val Leu Met Gly His Val Ala Ala

325 330 335

Val Arg Cys Val Gln Tyr Asp Gly Arg Arg Val Val Ser Gly Ala Tyr

340 345 350

Asp Phe Met Val Lys Val Trp Asp Pro Glu Thr Glu Thr Cys Leu His

355 360 365

Thr Leu Gln Gly His Thr Asn Arg Val Tyr Ser Leu Gln Phe Asp Gly

370 375 380

Ile His Val Val Ser Gly Ser Leu Asp Thr Ser Ile Arg Val Trp Asp

385 390 395 400

Val Glu Thr Gly Asn Cys Ile His Thr Leu Thr Gly His Gln Ser Leu

405 410 415

Thr Ser Gly Met Glu Leu Lys Asp Asn Ile Leu Val Ser Gly Asn Ala

420 425 430

Asp Ser Thr Val Lys Ile Trp Asp Ile Lys Thr Gly Gln Cys Leu Gln

435 440 445

Thr Leu Gln Gly Pro Asn Lys His Gln Ser Ala Val Thr Cys Leu Gln

450 455 460

Phe Asn Lys Asn Phe Val Ile Thr Ser Ser Asp Asp Gly Thr Val Lys

465 470 475 480

Leu Trp Asp Leu Lys Thr Gly Glu Phe Ile Arg Asn Leu Val Thr Leu

485 490 495

Glu Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Val Trp Arg Ile Arg Ala Ser Asn

500 505 510

Thr Lys Leu Val Cys Ala Val Gly Ser Arg Asn Gly Thr Glu Glu Thr

515 520 525

Lys Leu Leu Val Leu Asp Phe Asp Val Asp Met Lys

530 535 540

〈210〉 11

〈211〉 34

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Description of Artificial Sequence:

Oligonucleotide primer

〈400〉 11

cgggatccac catggatgat ggatcgatga cacc 34

〈210〉 12

〈211〉 33

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Description of Artificial Sequence:

Oligonucleotide primer

〈400〉 12

ggaattcctt aagggtatac agcatcaaag tcg 33

〈210〉 13

〈211〉 25

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Description of Artificial Sequence:

Oligonucleotide primer

〈400〉 13

tcacttcatg tccacatcaa agtcc 25

〈210〉 14

〈211〉 26

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Description of Artificial Sequence:

Oligonucleotide primer

〈400〉 14

ggtaattaca agttcttgtt gaactg 26

〈210〉 15

〈211〉 22

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Description of Artificial Sequence:

Oligonucleotide primer

〈400〉 15

ccctgcaacg tgtgtagaca gg 22

〈210〉 16

〈211〉 24

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Description of Artificial Sequence:

Oligonucleotide primer

〈400〉 16

ccagtctctg cattccacac tttg 24

〈210〉 17

〈211〉 23

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Description of Artificial Sequence:

Oligonucleotide primer

〈400〉 17

ctcagacagg tcaggacatt tgg 23

〈210〉 18

〈211〉 33

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Description of Artificial Sequence:

Oligonucleotide primer

〈400〉 18

ggaattccat gaaaagattg gaccatggtt ctg 33

〈210〉 19

〈211〉 34

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Description of Artificial Sequence:

Oligonucleotide primer

〈400〉 19

ggaattcctc acttcatgtc acatcaaagt ccag 34

〈210〉 20

〈211〉 1881

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Description of Artificial Sequence: 6 myc tagged

homo sapiens

〈400〉 20

atggagcaaa agctcatttc tgaagaggac ttgaatgaaa tggagcaaaa gctcatttct 60

gaagaggact tgaatgaaat ggagcaaaag ctcatttctg aagaggactt gaatgaaatg 120

gagcaaaagc tcatttctga agaggacttg aatgaaatgg agcaaaagct catttctgaa 180

gaggacttga atgaaatgga gagcttgggc gacctcacca tggagcaaaa gctcatttct 240

gaagaggact tgaattccat gaaaagaaag ttggaccatg gttctgaggt ccgctctttt 300

tctttgggaa agaaaccatg caaagtctca gaatatacaa gtaccactgg gcttgtacca 360

tgttcagcaa caccaacaac ttttggggac ctcagagcag ccaatggcca agggcaacaa 420

cgacgccgaa ttacatctgt ccagccacct acaggcctcc aggaatggct aaaaatgttt 480

cagagctgga gtggaccaga gaaattgctt gctttagatg aactcattga tagttgtgaa 540

ccaacacaag taaaacatat gatgcaagtg atagaacccc agtttcaacg agacttcatt 600

tcattgctcc ctaaagagtt ggcactctat gtgctttcat tcctggaacc caaagacctg 660

ctacaagcag ctcagacatg tcgctactgg agaattttgg ctgaagacaa ccttctctgg 720

agagagaaat gcaaagaaga ggggattgat gaaccattgc acatcaagag aagaaaagta 780

ataaaaccag gtttcataca cagtccatgg aaaagtgcat acatcagaca gcacagaatt 840

gatactaact ggaggcgagg agaactcaaa tctcctaagg tgctgaaagg acatgatgat 900

catgtgatca catgcttaca gttttgtggt aaccgaatag ttagtggttc tgatgacaac 960

actttaaaag tttggtcagc agtcacaggc aaatgtctga gaacattagt gggacataca 1020

ggtggagtat ggtcatcaca aatgagggac aacatcatca ttagtggatc tacagatcgg 1080

acactcaaag tgtggaatgc agagactgga gaatgtatac acaccttata tgggcatact 1140

tccactgtgc gttgtatgca tcttcatgaa aaaagagttg ttagcggttc tcgagatgcc 1200

actcttaggg tttgggatat tgagacaggc cagtgtttac atgttttgat gggtcatgtt 1260

gcagcagtcc gctgtgttca atatgatggc aggagggttg ttagtggagc atatgatttt 1320

atggtaaagg tgtgggatcc agagactgaa acctgtctac acacgttgca ggggcatact 1380

aatagagtct attcattaca gtttgatggt atccatgtgg tgagtggatc tcttgataca 1440

tccatccgtg tttgggatgt ggagacaggg aattgcattc acacgttaac agggcaccag 1500

tcgttaacaa gtggaatgga actcaaagac aatattcttg tctctgggaa tgcagattct 1560

acagttaaaa tctgggatat caaaacagga cagtgtttac aaacattgca aggtcccaac 1620

aagcatcaga gtgctgtgac ctgtttacag ttcaacaaga actttgtaat taccagctca 1680

gatgatggaa ctgtaaaact atgggacttg aaaacgggtg aatttattcg aaacctagtc 1740

acattggaga gtggggggag tgggggagtt gtgtggcgga tcagagcctc aaacacaaag 1800

ctggtgtgtg cagttgggag tcggaatggg actgaagaaa ccaagctgct ggtgctggac 1860

tttgatgtgg acatgaagtg a 1881

〈210〉 21

〈211〉 626

〈212〉 PRT

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Description of Artificial Sequence: 6 myc tagged

homo sapien

〈400〉 21

Met Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Glu Met Glu Gln

1 5 10 15

Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Glu Met Glu Gln Lys Leu Ile

20 25 30

Ser Glu Glu Asp Leu Asn Glu Met Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu

35 40 45

Asp Leu Asn Glu Met Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn

50 55 60

Glu Met Glu Ser Leu Gly Asp Leu Thr Met Glu Gln Lys Leu Ile Ser

65 70 75 80

Glu Glu Asp Leu Asn Ser Met Lys Arg Lys Leu Asp His Gly Ser Glu

85 90 95

Val Arg Ser Phe Ser Leu Gly Lys Lys Pro Cys Lys Val Ser Glu Tyr

100 105 110

Thr Ser Thr Thr Gly Leu Val Pro Cys Ser Ala Thr Pro Thr Thr Phe

115 120 125

Gly Asp Leu Arg Ala Ala Asn Gly Gln Gly Gln Gln Arg Arg Arg Ile

130 135 140

Thr Ser Val Gln Pro Pro Thr Gly Leu Gln Glu Trp Leu Lys Met Phe

145 150 155 160

Gln Ser Trp Ser Gly Pro Glu Lys Leu Leu Ala Leu Asp Glu Leu Ile

165 170 175

Asp Ser Cys Glu Pro Thr Gln Val Lys His Met Met Gln Val Ile Glu

180 185 190

Pro Gln Phe Gln Arg Asp Phe Ile Ser Leu Leu Pro Lys Glu Leu Ala

195 200 205

Leu Tyr Val Leu Ser Phe Leu Glu Pro Lys Asp Leu Leu Gln Ala Ala

210 215 220

Gln Thr Cys Arg Tyr Trp Arg Ile Leu Ala Glu Asp Asn Leu Leu Trp

225 230 235 240

Arg Glu Lys Cys Lys Glu Glu Gly Ile Asp Glu Pro Leu His Ile Lys

245 250 255

Arg Arg Lys Val Ile Lys Pro Gly Phe Ile His Ser Pro Trp Lys Ser

260 265 270

Ala Tyr Ile Arg Gln His Arg Ile Asp Thr Asn Trp Arg Arg Gly Glu

275 280 285

Leu Lys Ser Pro Lys Val Leu Lys Gly His Asp Asp His Val Ile Thr

290 295 300

Cys Leu Gln Phe Cys Gly Asn Arg Ile Val Ser Gly Ser Asp Asp Asn

305 310 315 320

Thr Leu Lys Val Trp Ser Ala Val Thr Gly Lys Cys Leu Arg Thr Leu

325 330 335

Val Gly His Thr Gly Gly Val Trp Ser Ser Gln Met Arg Asp Asn Ile

340 345 350

Ile Ile Ser Gly Ser Thr Asp Arg Thr Leu Lys Val Trp Asn Ala Glu

355 360 365

Thr Gly Glu Cys Ile His Thr Leu Tyr Gly His Thr Ser Thr Val Arg

370 375 380

Cys Met His Leu His Glu Lys Arg Val Val Ser Gly Ser Arg Asp Ala

385 390 395 400

Thr Leu Arg Val Trp Asp Ile Glu Thr Gly Gln Cys Leu His Val Leu

405 410 415

Met Gly His Val Ala Ala Val Arg Cys Val Gln Tyr Asp Gly Arg Arg

420 425 430

Val Val Ser Gly Ala Tyr Asp Phe Met Val Lys Val Trp Asp Pro Glu

435 440 445

Thr Glu Thr Cys Leu His Thr Leu Gln Gly His Thr Asn Arg Val Tyr

450 455 460

Ser Leu Gln Phe Asp Gly Ile His Val Val Ser Gly Ser Leu Asp Thr

465 470 475 480

Ser Ile Arg Val Trp Asp Val Glu Thr Gly Asn Cys Ile His Thr Leu

485 490 495

Thr Gly His Gln Ser Leu Thr Ser Gly Met Glu Leu Lys Asp Asn Ile

500 505 510

Leu Val Ser Gly Asn Ala Asp Ser Thr Val Lys Ile Trp Asp Ile Lys

515 520 525

Thr Gly Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln Gly Pro Asn Lys His Gln Ser

530 535 540

Ala Val Thr Cys Leu Gln Phe Asn Lys Asn Phe Val Ile Thr Ser Ser

545 550 555 560

Asp Asp Gly Thr Val Lys Leu Trp Asp Leu Lys Thr Gly Glu Phe Ile

565 570 575

Arg Asn Leu Val Thr Leu Glu Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Val Trp

580 585 590

Arg Ile Arg Ala Ser Asn Thr Lys Leu Val Cys Ala Val Gly Ser Arg

595 600 605

Asn Gly Thr Glu Glu Thr Lys Leu Leu Val Leu Asp Phe Asp Val Asp

610 615 620

Met Lys

625

〈210〉 22

〈211〉 31

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Description of Artificial Sequence:

Oligonucleotide primer

〈400〉 22

gggtacccct cattattccc tcgagttctt c 31

〈210〉 23

〈211〉 29

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Description of Artificial Sequence:

Oligonucleotide primer

〈400〉 23

ggaattcctt catgtccaca tcaaagtcc 29

〈210〉 24

〈211〉 2010

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Description of Artificial Sequence: V5HIS tagged

homo sapien

〈400〉 24

atgtgtgtcc cgagaagcgg tttgatactg agctgcattt gcctttactg tggagttttg 60

ttgccggttc tgctccctaa tcttcctttt ctgacgtgcc tgagcatgtc cacattagaa 120

tctgtgacat acctacctga aaaaggttta tattgtcaga gactgccaag cagccggaca 180

cacgggggca cagaatcact gaaggggaaa aatacagaaa atatgggttt ctacggcaca 240

ttaaaaatga ttttttacaa aatgaaaaga aagttggacc atggttctga ggtccgctct 300

ttttctttgg gaaagaaacc atgcaaagtc tcagaatata caagtaccac tgggcttgta 360

ccatgttcag caacaccaac aacttttggg gacctcagag cagccaatgg ccaagggcaa 420

caacgacgcc gaattacatc tgtccagcca cctacaggcc tccaggaatg gctaaaaatg 480

tttcagagct ggagtggacc agagaaattg cttgctttag atgaactcat tgatagttgt 540

gaaccaacac aagtaaaaca tatgatgcaa gtgatagaac cccagtttca acgagacttc 600

atttcattgc tccctaaaga gttggcactc tatgtgcttt cattcctgga acccaaagac 660

ctgctacaag cagctcagac atgtcgctac tggagaattt tggctgaaga caaccttctc 720

tggagagaga aatgcaaaga agaggggatt gatgaaccat tgcacatcaa gagaagaaaa 780

gtaataaaac caggtttcat acacagtcca tggaaaagtg catacatcag acagcacaga 840

attgatacta actggaggcg aggagaactc aaatctccta aggtgctgaa aggacatgat 900

gatcatgtga tcacatgctt acagttttgt ggtaaccgaa tagttagtgg ttctgatgac 960

aacactttaa aagtttggtc agcagtcaca ggcaaatgtc tgagaacatt agtgggacat 1020

acaggtggag tatggtcatc acaaatgaga gacaacatca tcattagtgg atctacagat 1080

cggacactca aagtgtggaa tgcagagact ggagaatgta tacacacctt atatgggcat 1140

acttccactg tgcgttgtat gcatcttcat gaaaaaagag ttgttagcgg ttctcgagat 1200

gccactctta gggtttggga tattgagaca ggccagtgtt tacatgtttt gatgggtcat 1260

gttgcagcag tccgctgtgt tcaatatgat ggcaggaggg ttgttagtgg agcatatgat 1320

tttatggtaa aggtgtggga tccagagact gaaacctgtc tacacacgtt gcaggggcat 1380

actaatagag tctattcatt acagtttgat ggtatccatg tggtgagtgg atctcttgat 1440

acatcaatcc gtgtttggga tgtggagaca gggaattgca ttcacacgtt aacagggcac 1500

cagtcgttaa caagtggaat ggaactcaaa gacaatattc ttgtctctgg gaatgcagat 1560

tctacagtta aaatctggga tatcaaaaca ggacagtgtt tacaaacatt gcaaggtccc 1620

aacaagcatc agagtgctgt gacctgttta cagttcaaca agaactttgt aattaccagc 1680

tcagatgatg gaactgtaaa actatgggac ttgaaaacgg gtgaatttat tcgaaaccta 1740

gtcacattgg agagtggggg gagtggggga gttgtgtggc ggatcagagc ctcaaacaca 1800

aagctggtgt gtgcagttgg gagtcggaat gggactgaag aaaccaagct gctggtgctg 1860

gactttgatg tggacatgaa ggaattctgc agatatccag cacagtggcg gccgctcgag 1920

tctagagggc ccttcgaagg taagcctatc cctaaccctc tcctcggtct cgattctacg 1980

cgtaccggtc atcatcacca tcaccattga 2010

〈210〉 25

〈211〉 669

〈212〉 PRT

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Description of Artificial Sequence: V5HIS tagged

homo sapien

〈400〉 25

Met Cys Val Pro Arg Ser Gly Leu Ile Leu Ser Cys Ile Cys Leu Tyr

1 5 10 15

Cys Gly Val Leu Leu Pro Val Leu Leu Pro Asn Leu Pro Phe Leu Thr

20 25 30

Cys Leu Ser Met Ser Thr Leu Glu Ser Val Thr Tyr Leu Pro Glu Lys

35 40 45

Gly Leu Tyr Cys Gln Arg Leu Pro Ser Ser Arg Thr His Gly Gly Thr

50 55 60

Glu Ser Leu Lys Gly Lys Asn Thr Glu Asn Met Gly Phe Tyr Gly Thr

65 70 75 80

Leu Lys Met Ile Phe Tyr Lys Met Lys Arg Lys Leu Asp His Gly Ser

85 90 95

Glu Val Arg Ser Phe Ser Leu Gly Lys Lys Pro Cys Lys Val Ser Glu

100 105 110

Tyr Thr Ser Thr Thr Gly Leu Val Pro Cys Ser Ala Thr Pro Thr Thr

115 120 125

Phe Gly Asp Leu Arg Ala Ala Asn Gly Gln Gly Gln Gln Arg Arg Arg

130 135 140

Ile Thr Ser Val Gln Pro Pro Thr Gly Leu Gln Glu Trp Leu Lys Met

145 150 155 160

Phe Gln Ser Trp Ser Gly Pro Glu Lys Leu Leu Ala Leu Asp Glu Leu

165 170 175

Ile Asp Ser Cys Glu Pro Thr Gln Val Lys His Met Met Gln Val Ile

180 185 190

Glu Pro Gln Phe Gln Arg Asp Phe Ile Ser Leu Leu Pro Lys Glu Leu

195 200 205

Ala Leu Tyr Val Leu Ser Phe Leu Glu Pro Lys Asp Leu Leu Gln Ala

210 215 220

Ala Gln Thr Cys Arg Tyr Trp Arg Ile Leu Ala Glu Asp Asn Leu Leu

225 230 235 240

Trp Arg Glu Lys Cys Lys Glu Glu Gly Ile Asp Glu Pro Leu His Ile

245 250 255

Lys Arg Arg Lys Val Ile Lys Pro Gly Phe Ile His Ser Pro Trp Lys

260 265 270

Ser Ala Tyr Ile Arg Gln His Arg Ile Asp Thr Asn Trp Arg Arg Gly

275 280 285

Glu Leu Lys Ser Pro Lys Val Leu Lys Gly His Asp Asp His Val Ile

290 295 300

Thr Cys Leu Gln Phe Cys Gly Asn Arg Ile Val Ser Gly Ser Asp Asp

305 310 315 320

Asn Thr Leu Lys Val Trp Ser Ala Val Thr Gly Lys Cys Leu Arg Thr

325 330 335

Leu Val Gly His Thr Gly Gly Val Trp Ser Ser Gln Met Arg Asp Asn

340 345 350

Ile Ile Ile Ser Gly Ser Thr Asp Arg Thr Leu Lys Val Trp Asn Ala

355 360 365

Glu Thr Gly Glu Cys Ile His Thr Leu Tyr Gly His Thr Ser Thr Val

370 375 380

Arg Cys Met His Leu His Glu Lys Arg Val Val Ser Gly Ser Arg Asp

385 390 395 400

Ala Thr Leu Arg Val Trp Asp Ile Glu Thr Gly Gln Cys Leu His Val

405 410 415

Leu Met Gly His Val Ala Ala Val Arg Cys Val Gln Tyr Asp Gly Arg

420 425 430

Arg Val Val Ser Gly Ala Tyr Asp Phe Met Val Lys Val Trp Asp Pro

435 440 445

Glu Thr Glu Thr Cys Leu His Thr Leu Gln Gly His Thr Asn Arg Val

450 455 460

Tyr Ser Leu Gln Phe Asp Gly Ile His Val Val Ser Gly Ser Leu Asp

465 470 475 480

Thr Ser Ile Arg Val Trp Asp Val Glu Thr Gly Asn Cys Ile His Thr

485 490 495

Leu Thr Gly His Gln Ser Leu Thr Ser Gly Met Glu Leu Lys Asp Asn

500 505 510

Ile Leu Val Ser Gly Asn Ala Asp Ser Thr Val Lys Ile Trp Asp Ile

515 520 525

Lys Thr Gly Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln Gly Pro Asn Lys His Gln

530 535 540

Ser Ala Val Thr Cys Leu Gln Phe Asn Lys Asn Phe Val Ile Thr Ser

545 550 555 560

Ser Asp Asp Gly Thr Val Lys Leu Trp Asp Leu Lys Thr Gly Glu Phe

565 570 575

Ile Arg Asn Leu Val Thr Leu Glu Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Val

580 585 590

Trp Arg Ile Arg Ala Ser Asn Thr Lys Leu Val Cys Ala Val Gly Ser

595 600 605

Arg Asn Gly Thr Glu Glu Thr Lys Leu Leu Val Leu Asp Phe Asp Val

610 615 620

Asp Met Lys Glu Phe Cys Arg Tyr Pro Ala Gln Trp Arg Pro Leu Glu

625 630 635 640

Ser Arg Gly Pro Phe Glu Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly

645 650 655

Leu Asp Ser Thr Arg Thr Gly His His His His His His

660 665

〈210〉 26

〈211〉 2001

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Description of Artificial Sequence: MYCHIS tagged

homo sapiens

〈400〉 26

atgtgtgtcc cgagaagcgg tttgatactg agctgcattt gcctttactg tggagttttg 60

ttgccggttc tgctccctaa tcttcctttt ctgacgtgcc tgagcatgtc cacattagaa 120

tctgtgacat acctacctga aaaaggttta tattgtcaga gactgccaag cagccggaca 180

cacgggggca cagaatcact gaaggggaaa aatacagaaa atatgggttt ctacggcaca 240

ttaaaaatga ttttttacaa aatgaaaaga aagttggacc atggttctga ggtccgctct 300

ttttctttgg gaaagaaacc atgcaaagtc tcagaatata caagtaccac tgggcttgta 360

ccatgttcag caacaccaac aacttttggg gacctcagag cagccaatgg ccaagggcaa 420

caacgacgcc gaattacatc tgtccagcca cctacaggcc tccaggaatg gctaaaaatg 480

tttcagagct ggagtggacc agagaaattg cttgctttag atgaactcat tgatagttgt 540

gaaccaacac aagtaaaaca tatgatgcaa gtgatagaac cccagtttca acgagacttc 600

atttcattgc tccctaaaga gttggcactc tatgtgcttt cattcctgga acccaaagac 660

ctgctacaag cagctcagac atgtcgctac tggagaattt tggctgaaga caaccttctc 720

tggagagaga aatgcaaaga agaggggatt gatgaaccat tgcacatcaa gagaagaaaa 780

gtaataaaac caggtttcat acacagtcca tggaaaagtg catacatcag acagcacaga 840

attgatacta actggaggcg aggagaactc aaatctccta aggtgctgaa aggacatgat 900

gatcatgtga tcacatgctt acagttttgt ggtaaccgaa tagttagtgg ttctgatgac 960

aacactttaa aagtttggtc agcagtcaca ggcaaatgtc tgagaacatt agtgggacat 1020

acaggtggag tatggtcatc acaaatgaga gacaacatca tcattagtgg atctacagat 1080

cggacactca aagtgtggaa tgcagagact ggagaatgta tacacacctt atatgggcat 1140

acttccactg tgcgttgtat gcatcttcat gaaaaaagag ttgttagcgg ttctcgagat 1200

gccactctta gggtttggga tattgagaca ggccagtgtt tacatgtttt gatgggtcat 1260

gttgcagcag tccgctgtgt tcaatatgat ggcaggaggg ttgttagtgg agcatatgat 1320

tttatggtaa aggtgtggga tccagagact gaaacctgtc tacacacgtt gcaggggcat 1380

actaatagag tctattcatt acagtttgat ggtatccatg tggtgagtgg atctcttgat 1440

acatcaatcc gtgtttggga tgtggagaca gggaattgca ttcacacgtt aacagggcac 1500

cagtcgttaa caagtggaat ggaactcaaa gacaatattc ttgtctctgg gaatgcagat 1560

tctacagtta aaatctggga tatcaaaaca ggacagtgtt tacaaacatt gcaaggtccc 1620

aacaagcatc agagtgctgt gacctgttta cagttcaaca agaactttgt aattaccagc 1680

tcagatgatg gaactgtaaa actatgggac ttgaaaacgg gtgaatttat tcgaaaccta 1740

gtcacattgg agagtggggg gagtggggga gttgtgtggc ggatcagagc ctcaaacaca 1800

aagctggtgt gtgcagttgg gagtcggaat gggactgaag aaaccaagct gctggtgctg 1860

gactttgatg tggacatgaa ggaattctgc agatatccag cacagtggcg gccgctcgag 1920

tctagagggc ccttcgaaca aaaactcatc tcagaagagg atctgaatat gcataccggt 1980

catcatcacc atcaccattg a 2001

〈210〉 27

〈211〉 666

〈212〉 PRT

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Description of Artificial Sequence: MYCHIS tagged

homo sapiens

〈400〉 27

Met Cys Val Pro Arg Ser Gly Leu Ile Leu Ser Cys Ile Cys Leu Tyr

1 5 10 15

Cys Gly Val Leu Leu Pro Val Leu Leu Pro Asn Leu Pro Phe Leu Thr

20 25 30

Cys Leu Ser Met Ser Thr Leu Glu Ser Val Thr Tyr Leu Pro Glu Lys

35 40 45

Gly Leu Tyr Cys Gln Arg Leu Pro Ser Ser Arg Thr His Gly Gly Thr

50 55 60

Glu Ser Leu Lys Gly Lys Asn Thr Glu Asn Met Gly Phe Tyr Gly Thr

65 70 75 80

Leu Lys Met Ile Phe Tyr Lys Met Lys Arg Lys Leu Asp His Gly Ser

85 90 95

Glu Val Arg Ser Phe Ser Leu Gly Lys Lys Pro Cys Lys Val Ser Glu

100 105 110

Tyr Thr Ser Thr Thr Gly Leu Val Pro Cys Ser Ala Thr Pro Thr Thr

115 120 125

Phe Gly Asp Leu Arg Ala Ala Asn Gly Gln Gly Gln Gln Arg Arg Arg

130 135 140

Ile Thr Ser Val Gln Pro Pro Thr Gly Leu Gln Glu Trp Leu Lys Met

145 150 155 160

Phe Gln Ser Trp Ser Gly Pro Glu Lys Leu Leu Ala Leu Asp Glu Leu

165 170 175

Ile Asp Ser Cys Glu Pro Thr Gln Val Lys His Met Met Gln Val Ile

180 185 190

Glu Pro Gln Phe Gln Arg Asp Phe Ile Ser Leu Leu Pro Lys Glu Leu

195 200 205

Ala Leu Tyr Val Leu Ser Phe Leu Glu Pro Lys Asp Leu Leu Gln Ala

210 215 220

Ala Gln Thr Cys Arg Tyr Trp Arg Ile Leu Ala Glu Asp Asn Leu Leu

225 230 235 240

Trp Arg Glu Lys Cys Lys Glu Glu Gly Ile Asp Glu Pro Leu His Ile

245 250 255

Lys Arg Arg Lys Val Ile Lys Pro Gly Phe Ile His Ser Pro Trp Lys

260 265 270

Ser Ala Tyr Ile Arg Gln His Arg Ile Asp Thr Asn Trp Arg Arg Gly

275 280 285

Glu Leu Lys Ser Pro Lys Val Leu Lys Gly His Asp Asp His Val Ile

290 295 300

Thr Cys Leu Gln Phe Cys Gly Asn Arg Ile Val Ser Gly Ser Asp Asp

305 310 315 320

Asn Thr Leu Lys Val Trp Ser Ala Val Thr Gly Lys Cys Leu Arg Thr

325 330 335

Leu Val Gly His Thr Gly Gly Val Trp Ser Ser Gln Met Arg Asp Asn

340 345 350

Ile Ile Ile Ser Gly Ser Thr Asp Arg Thr Leu Lys Val Trp Asn Ala

355 360 365

Glu Thr Gly Glu Cys Ile His Thr Leu Tyr Gly His Thr Ser Thr Val

370 375 380

Arg Cys Met His Leu His Glu Lys Arg Val Val Ser Gly Ser Arg Asp

385 390 395 400

Ala Thr Leu Arg Val Trp Asp Ile Glu Thr Gly Gln Cys Leu His Val

405 410 415

Leu Met Gly His Val Ala Ala Val Arg Cys Val Gln Tyr Asp Gly Arg

420 425 430

Arg Val Val Ser Gly Ala Tyr Asp Phe Met Val Lys Val Trp Asp Pro

435 440 445

Glu Thr Glu Thr Cys Leu His Thr Leu Gln Gly His Thr Asn Arg Val

450 455 460

Tyr Ser Leu Gln Phe Asp Gly Ile His Val Val Ser Gly Ser Leu Asp

465 470 475 480

Thr Ser Ile Arg Val Trp Asp Val Glu Thr Gly Asn Cys Ile His Thr

485 490 495

Leu Thr Gly His Gln Ser Leu Thr Ser Gly Met Glu Leu Lys Asp Asn

500 505 510

Ile Leu Val Ser Gly Asn Ala Asp Ser Thr Val Lys Ile Trp Asp Ile

515 520 525

Lys Thr Gly Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln Gly Pro Asn Lys His Gln

530 535 540

Ser Ala Val Thr Cys Leu Gln Phe Asn Lys Asn Phe Val Ile Thr Ser

545 550 555 560

Ser Asp Asp Gly Thr Val Lys Leu Trp Asp Leu Lys Thr Gly Glu Phe

565 570 575

Ile Arg Asn Leu Val Thr Leu Glu Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Val

580 585 590

Trp Arg Ile Arg Ala Ser Asn Thr Lys Leu Val Cys Ala Val Gly Ser

595 600 605

Arg Asn Gly Thr Glu Glu Thr Lys Leu Leu Val Leu Asp Phe Asp Val

610 615 620

Asp Met Lys Glu Phe Cys Arg Tyr Pro Ala Gln Trp Arg Pro Leu Glu

625 630 635 640

Ser Arg Gly Pro Phe Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn

645 650 655

Met His Thr Gly His His His His His His

660 665

1

50

Claims (41)

1. ⒜ SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 및 SEQ ID NO:7로 이루어진 군으로부터 선택되거나 또는 ATCC 기탁 번호 제98978호에 포함된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 완전한 아미노산 서열을 갖는 인간 sel-10 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열,

   ⒝ SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 및 SEQ ID NO:10으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 또는 ATCC 기탁 번호 제98979호에 포함된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 완전한 아미노산 서열을 갖는 인간 sel-10 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및

   ⒞ ⒜ 또는 ⒝의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열

   로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 95 % 이상 동일한 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산 분자.
2. 엄격 조건하에 제1항의 ⒜, ⒝ 또는 ⒞의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와 혼성화되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산 분자.
3. 제1항에 있어서, 상기 ⒜의 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO:3의 완전한 아미노산 서열을 갖는 인간 sel-10 폴리펩티드를 암호화하는 것인 핵산 분자.
4. 제3항에 있어서, 상기 제1항 ⒜의 폴리뉴클레오티드 분자가 SEQ ID NO:1의 45번 내지 1928번 뉴클레오티드 서열 잔기를 포함하는 것인 핵산 분자.
5. 제1항에 있어서, 상기 제1항 ⒜의 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO:4의 완전한 아미노산 서열을 갖는 인간 sel-10 폴리펩티드를 암호화하는 것인 핵산 분자.
6. 제5항에 있어서, 상기 제1항 ⒜의 폴리뉴클레오티드 분자가 SEQ ID NO:1의 150번 내지 1928번 뉴클레오티드 서열 잔기를 포함하는 것인 핵산 분자.
7. 제1항에 있어서, 상기 제1항 ⒜의 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO:5의 완전한 아미노산 서열을 갖는 인간 sel-10 폴리펩티드를 암호화하는 것인 핵산 분자.
8. 제7항에 있어서, 상기 제1항 ⒜의 폴리뉴클레오티드 분자가 SEQ ID NO:1의 267번 내지 1928번 뉴클레오티드 서열 잔기를 포함하는 것인 핵산 분자.
9. 제1항에 있어서, 상기 제1항 ⒜의 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO:6의 완전한 아미노산 서열을 갖는 인간 sel-10 폴리펩티드를 암호화하는 것인 핵산 분자.
10. 제9항에 있어서, 상기 제1항 ⒜의 폴리뉴클레오티드 분자가 SEQ ID NO:1의 291번 내지 1928번 뉴클레오티드 서열 잔기를 포함하는 것인 핵산 분자.
11. 제1항에 있어서, 상기 제1항 ⒜의 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO:7의 완전한 아미노산 서열을 갖는 인간 sel-10 폴리펩티드를 암호화하는 것인 핵산 분자.
12. 제11항에 있어서, 상기 제1항 ⒜의 폴리뉴클레오티드 분자가 SEQ ID NO:1의 306번 내지 1928번 뉴클레오티드 서열 잔기를 포함하는 것인 핵산 분자.
13. 제1항에 있어서, 상기 제1항 ⒝의 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO:8의 완전한 아미노산 서열을 갖는 인간 sel-10 폴리펩티드를 암호화하는 것인 핵산 분자.
14. 제13항에 있어서, 상기 제1항 ⒝의 폴리뉴클레오티드 분자가 SEQ ID NO:2의 180번 내지 1949번 뉴클레오티드 서열 잔기를 포함하는 것인 핵산 분자.
15. 제1항에 있어서, 상기 제1항 ⒝의 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO:9의 완전한 아미노산 서열을 갖는 인간 sel-10 폴리펩티드를 암호화하는 것인 핵산 분자.
16. 제15항에 있어서, 상기 제1항 ⒝의 폴리뉴클레오티드 분자가 SEQ ID NO:2의 270번 내지 1949번 뉴클레오티드 서열 잔기를 포함하는 것인 핵산 분자.
17. 제1항에 있어서, 상기 제1항 ⒝의 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO:10의 완전한 아미노산 서열을 갖는 인간 sel-10 폴리펩티드를 암호화하는 것인 핵산 분자.
18. 제17항에 있어서, 상기 제1항 ⒝의 폴리뉴클레오티드 분자가 SEQ ID NO:2의 327번 내지 1949번 뉴클레오티드 서열 잔기를 포함하는 것인 핵산 분자.
19. 제1항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
20. 제19항에 있어서, 상기 제1항의 핵산 분자가 sel-10 폴리펩티드의 발현을 위한 프로모터에 작용가능하게 연결된 벡터.
21. 제19항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
22. 제21항에 있어서, 상기 숙주가 진핵세포 숙주인 숙주 세포.
23. 제22항의 숙주 세포를 배양하고 sel-10 폴리펩티드를 단리함을 포함하는, sel-10 폴리펩티드를 얻는 방법.
24. ⒜ SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 및 SEQ ID NO:7로 이루어진 군으로부터 선택되거나 또는 ATCC 기탁 번호 제98978호에 포함된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 아미노산 서열,

    ⒝ SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 및 SEQ ID NO:10으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 또는 ATCC 기탁 번호 제98979호에 포함된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 아미노산 서열

    을 포함하는 단리된 sel-10 폴리펩티드.
25. 제24항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 sel-10 폴리펩티드.
26. 제24항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 sel-10 폴리펩티드.
27. 제24항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 sel-10 폴리펩티드.
28. 제24항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 sel-10 폴리펩티드.
29. 제24항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 SEQ ID NO:7의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 sel-10 폴리펩티드.
30. 제24항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 sel-10 폴리펩티드.
31. 제24항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 sel-10 폴리펩티드.
32. 제24항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 sel-10 폴리펩티드.
33. 제24항의 sel-10 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단리된 항체.
34. 제1항의 임의 sel-10 단리된 핵산 분자를 발현시키는 Aβ프로세싱이 변형된 세포 라인.
35. 제34항에 있어서, 상기 Aβ프로세싱이 증가된 세포 라인.
36. 제34항에 있어서, Aβ프로세싱이 감소된 세포 라인.
37. 제34항에 있어서, 세포 라인이 6myc-N-sel 10/2인 세포 라인.
38. 제34항에 있어서, 세포 라인이 6myc-N-sel 10/6인 세포 라인.
39. ⒜ 세포 라인의 시험군 배양물 및 대조군 배양물을 얻는 단계, ⒝ 시험 작용제와 시험 배양물을 접촉시키는 단계, ⒞ 단계 ⒝ 및 상기 대조군 배양물에 의해 생산된 Aβ_1-40및 Aβ_1-42의 수준을 측정하는 단계, ⒟ 단계 ⒞에서 측정된 Aβ_1-40및 Aβ_1-42의 수준으로부터 상기 시험 배양물 및 대조군 배양물에 대한 Aβ_1-40/Aβ_1-40+ Aβ_1-42의 비율을 계산하는 단계 및 ⒠ 단계 ⒟에서 시험 배양물 및 대조군 배양물에 대해 측정된 Aβ_1-40/Aβ_1-40+ Aβ_1-42의 비율을 비교하는 단계를 포함하며, 이로써, 상기 시험 배양물에 대한 Aβ_1-40/Aβ_1-40+ Aβ_1-42의 비율이 상기 대조군 배양물에 대한 Aβ_1-40/Aβ_1-40+ Aβ_1-42의 비율보다 더 높거나 또는 더 낮다는 결과는 시험 작용제가 Aβ_1-40/Aβ_1-40+ Aβ_1-42의 비율을 변경시켰음을 의미하는 것인, 제34항, 제37항 및 제38항의 임의 세포 라인에서 생산된 Aβ_1-40/Aβ_1-40+ Aβ_1-42의 비율을 변경시킬 수 있는 작용제를 확인하는 방법.
40. 제39항에 있어서, 상기 Aβ_1-40/Aβ_1-40+ Aβ_1-42의 비율이 상기 시험 작용제에 의해 증가되는 것인 방법.
41. 제39항에 있어서, 상기 Aβ_1-40/Aβ_1-40+ Aβ_1-42의 비율이 상기 시험 작용제에 의해 감소되는 것인 방법.