CN1166777C

CN1166777C - 人sel-10多肽及编码其的多核苷酸

Info

Publication number: CN1166777C
Application number: CNB988119137A
Authority: CN
Inventors: Me; M·E·古尼; 李金河; A·M·保利
Original assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1997-12-19
Filing date: 1998-12-17
Publication date: 2004-09-15
Anticipated expiration: 2018-12-17
Also published as: US6638731B2; EP1037990B1; US20020164683A1; EP1037990B8; WO1999032623A1; CN1281508A; US20040115700A1; CN1597988A; DE69830074D1; CA2309391A1; JP2003520012A; EP1037990A1; US20040110202A1; NZ505252A; KR20010033327A; ATE294862T1; AU2000799A; AU755140B2; US20050095671A1

Abstract

本发明提供了包含编码人sel-10的两种可选择剪接变异体中任意一个的多核苷酸之分离的核酸分子，这两种变异体中的一个在海马区中表达，一个在乳腺细胞中表达。本发明还提供了分离的sel-10多肽和其中Aβ加工被改变的表达所述多肽的细胞系。

Description

人sel-10多肽及编码其的多核苷酸

发明领域

本发明提供了包含编码人sel-10的两个可选择剪接变异体中的任何一个的多核苷酸的分离的核酸分子，这两个变异体中的一个在海马细胞中表达，另一个在乳腺细胞中表达。本发明也提供了分离的sel-10多肽。

发明背景

早老性痴呆(AD)是在中老年阶段引起进行性记忆和识别衰退的中枢神经系统变性疾病。此病伴随广泛的神经病理学特征，包括细胞外淀粉样空斑和神经元内神经纤维缠结(Sherrington，R.，等；自然(Nature)375：754-60(1995))。尽管并不完全了解导致AD的致病途径，但已知几个遗传位点与此病的发展有关。

通过使用在早期发病的AD家族中的图谱研究，已鉴定了与早期发病的早老性痴呆(AD)有关的基因。这些研究表明，在染色体1和14上的遗传位点可能与AD有关。染色体14位点的定位克隆鉴定了编码8跨膜结构域蛋白质的一种新的突变基因，此基因后来被命名为早老素(presenilin)-1(PS-1)(Sherrington，R.等，自然375：754-60(1995))。人EST数据库的blast搜寻揭示了与PS-1显示同源性的单个EST，称之为早老素-2(PS-2)，经证明其是染色体1上与AD有关的基因。(Levy-Lahad，E.等，科学(Science)269：937-977(1995)；Rogaev，E.I.，等，自然376：775-8(1995)；Li，J.等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)92：12180-12184(1995))。

在PS-1和PS-2上与早老性痴呆有关的突变主要是错义突变。PS-1和PS-2都经历了蛋白酶解加工，其能通过在家族性早老性痴呆中发现的点突变而被改变[Perez-Tur，J.等，神经报告(Neuroreport)7：297-301(1995)；Mercken，M.等，FEBS Lett.389：297-303(1996)]。PS-1基因表达广泛分布在组织中，而在胰和骨骼肌中发现PS-2 mRNA的水平最高。(Li，J.等，美国国家科学院院报92：12180-12184(1995)；Jinhe Li，私人通信)。然而，在脑中发现了PS-2蛋白质的水平最高(Jinhe Li，私人通信)。PS-1和PS-2蛋白质都局限于内质网、高尔基体和核膜。(Jinhe Li，私人通信；Kovacs，D.M.等，自然杂志医药分册(Nat.Med.)2：224-229(1996)；Doan，A.等，神经元(Neuron)17：1023-1030(1996))。在PS-1基因或PS-2基因任一个中的突变改变了淀粉样蛋白质前体(APP)的加工，以至增加了Aβ_1-42相应于Aβ_1-40的比例(Scheuner，D，等，自然杂志医药分册2：864-870(1996))。当在转基因小鼠中与人APP协同表达，相对于Aβ_1-40观察到Aβ_1-42比例的类似增加(Borchelt，D.R.等，神经元17：1005-1013(1996)；Citron，M.等，自然杂志医药分册3：67-72(1997)；Duff，K.等，自然383：710-713(1996))，以及在淀粉样斑中Aβ沉淀的加速(Borchelt等，神经元19：939(1997))。

尽管有关于在AD中PS-1和PS-2所扮演的角色的上述资料，仍不知道它们的生物学功能，它们与大量人类疾病基因一样也具有未知的生物学功能。在对于基因或其产物的功能未知的情况下，模式生物体中的遗传分析可能用于把这些基因置于已知的生化或遗传途径中。通过筛选抑制或增强所分析基因中的突变效应的外源突变可以达此目的。例如，在疾病基因中，丧失功能型突变的基因外抑制基因可以打开受影响突变基因下游的遗传或生化途径，而获得功能型突变的抑制基因可能关闭此途径。

可以用于阐明早老素基因功能的模式生物体是秀丽新杆线虫(C.elegans)，其包含与PS-1和PS-2具有同源性的三个基因，其中sel-12与编码人早老素的基因具有最高程度的同源性。在筛选激活的缺刻受体lin-12(d)的遗传抑制基因的过程中发现了sel-12(Levitan，D.等，自然377：351-354(1995))。lin-12在模式细胞谱系的发展中起作用。增加lin-12活性的超效等位基因突变，例如lin-12(d)，引起“多阴门”表型，而降低活性的减效基因突变引起外阴外翻，以及在另外几个细胞谱系中的同源异型改变(Greenwald，I.等，自然346：197-199(1990)；Sundram，M.等，遗传学(Genetics)135：755-763(1993))。sel-12突变抑制超效等位基因的lin-12(d)突变，但仅在lin-12(d)突变通过完整的lin-12(d)受体激活信号传递时起作用(Levitan，D.等，自然377：351-354(1995))。切断受体胞浆结构域的lin-12突变也激活信号传递(Greenwald，I.，等，自然346：197-199(1990))，但不被sel-12突变所抑制(Levitan，D.等，自然377：351-354(1995))。这提示sel-12突变可能通过降低出现在质膜上的功能性lin-12受体数目，在lin-12信号传递途径上游区起作用。除了抑制一些lin-12超效等位基因突变外，sel-12突变还引起产卵功能丧失，并因此导致卵的体内蓄积，尽管此变异体在其他方面看起来是解剖学正常的(Levitan，D.等，自然377：351-354(1995))。sel-12突变体能被PS-1或PS-2之一营救，表明sel-12、PS-1和PS-2是功能上的同系物(Levitan，D.等，美国国家科学院院报93：14940-14944(1996))。

在lin-12减效基因突变之抑制基因的独立遗传筛选中已鉴定了另一种基因，sel-10。在sel-10中的丧失功能型突变通过lin-12减效基因突变体恢复信号传递。由于sel-10活性的降低提高了lin-12活性，可以推断sel-10充当lin-12信号传递的负调节基因。sel-10也可充当秀丽新杆线虫早老素同系物sel-12的负调节基因(Levy-Lahad，E.等，科学269：937-977(1995))。sel-10活性的丧失抑制了与sel-12中的减效基因突变有关的产卵缺陷(Iva Greenwald，私人通信)。sel-10的丧失功能型突变对lin-12突变和sel-12突变的作用表明，sel-10充当lin-12/缺刻和早老素活性的负调节基因。因此，可以预期秀丽新杆线虫sel-10的人同系物以与早老性痴呆发病机理有关的方式，可以同人早老素基因发生遗传学和/或生理学相互作用。

综上所述，显然始终需要鉴定与AD有关的基因，以及需要发展鉴定能干扰导致AD的生物学途径的因子的测定法。

信息公开

Hubbard EJA，Wu G，Kitajewski J和Greenwald I(1997)秀丽新杆线虫(Caenorhabditis elegans)中lin-12活性的一种负调节基因Sel-10，其编码蛋白质CDC₄家族的成员。基因和发育(Genes & Dev)11：3182-3193。

Greenwald-I；Seydoux-G(1990)秀丽新杆线虫的lin-12基因的获得功能型突变的分析。自然。346：197-9。

Kim T-W，Pettingell WH，Hallmark OG，Moir RD，Wasco W，Tanzi R(1997)在转染细胞中早老素2的内切蛋白酶解切割和蛋白酶体降解。生物化学杂志(J Biol Chem)272：11006-11010。

Levitan-D；Greenwald-I(1995)通过sel-12(秀丽新杆线虫S182早老性痴呆基因)促进lin-12介导的信号传递。自然。377：351-4。

Levitan-D；Doyle-TG；Brousseau-D；Le-MK；Thinakaran-G；Slunt-HH；Sisodia-SS；Greenwald-I(1996)在秀丽新杆线虫中正常的和突变的人早老素功能的评定。美国国家科学院院报93：14940-4。Sundaram-M；Greenwald-I(1993)lin-12减效基因的抑制基因限定与秀丽新杆线虫中lin-12和glp-1两者都相互作用的基因。遗传学。135：765-83。

Sundaram-M；Greenwald-I(1993)在秀丽新杆线虫中减效基因lin-12突变体的遗传和表型研究。遗传学。135：755-63。

F55B12.3 GenPep报告(WMBL位点CEF55B12，载入号z79757)。WO 97/11956

发明概述

本发明提供了包含编码在海马区和乳腺细胞中表达的人sel-10的多核苷酸之分离的核酸分子。除非另外特别提到，任何此处提及的sel-10应理解为指人sel-10，并且既包括海马区sel-10，也包括乳腺sel-10。也提供了海马区(hippocampal)sel-10和乳腺sel-10的片段。

在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含的多核苷酸编码能改变Aβ加工活性的蛋白，其与选自以下序列的序列有至少95％的相同：

(a)编码人sel-10多肽的核苷酸序列，sel-10多肽具有选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQID NO：7的或由包含在ATCC保藏物第98978号中的cDNA克隆编码的完整氨基酸序列；

(b)编码人sel-10多肽的核苷酸序列，sel-10多肽具有选自SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的或由包含在ATCC保藏物第98979号中的cDNA克隆编码的完整氨基酸序列；和

(c)与(a)或(b)的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

另一方面，本发明提供了包含在严格条件下可与编码sel-10的多核苷酸或其片段杂交的多核苷酸之分离的核酸分子。

本发明也提供了包含本发明分离的核酸分子的载体、导入了此类载体的宿主细胞和获得sel-10多肽的重组方法，其包括培养所述的宿主细胞和分离sel-10多肽。

另一方面，本发明提供了分离的sel-10多肽及其片段。在一个优选的实施方案中，sel-10多肽具有选自SEQ ID NO：3、4、5、6、7、8、9及10的氨基酸序列。也提供了可特异性结合sel-10多肽的分离的抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体。

附图简述

图1A和1B：图1A和1B是Western印迹，显示了在用PS1-C-FLAG、6-myc-N-sel-10和APP695NL-KK cDNA转染的HEK293细胞中的蛋白质表达。

发明详述

本发明提供了包含编码人sel-10的多核苷酸之分离的核酸分子。在SEQ ID NO：1中给出的人海马区sel-10(hhsel-10)的核苷酸序列编码5种hhsel-10多肽(hhsel-10-(1)、hhsel-10(2)、hhsel-10(3)、hhsel-10(4)和hhsel-10(5)，此处共同称作hhsel-10)。在SEQ IDNO：2中给出的人乳腺sel-10(hmsel-10)的核苷酸序列编码3种hmsel-10多肽(hmsel-10-(1)、hmsel-10(2)及hmsel-10(3)，此处共同称作hmsel-10)。hhsel-10多肽的核苷酸序列在SEQ ID NO：1中给出，其中SEQ ID NO：1的核苷酸残基45-1928相当于hhsel-10-(1)，SEQ ID NO：1的核苷酸残基150-1928相当于hhsel-10-(2)，SEQ ID NO：1的核苷酸残基267-1928相当于hhsel-10-(3)，SEQ IDNO：1的核苷酸残基291-1928相当于hhsel-10-(4)，以及SEQ ID NO：1的核苷酸残基306-1928相当于hhsel-10-(5)。hmsel-10多肽的核苷酸序列在SEQ ID NO：2中给出，其中SEQ ID NO：2的核苷酸残基180-1949相当于hmsel-10-(1)，SEQ ID NO：2的核苷酸残基270-1949相当于hmsel-10-(2)，以及SEQ ID NO：2的核苷酸残基327-1949相当于hmsel-10-(3)。由hhsel-10和hmsel-10核酸分子编码的多肽的氨基酸序列如下：SEQ ID NO：3、4、5、6和7分别相应于hhsel-10-(1)、hhsel-10(2)、hhsel-10(3)、hhsel-10(4)和hhsel-10(5)多肽，而SEQ ID NO：8、9和10分别相应于hmsel-10-(1)、hmsel-10(2)和hmsel-10(3)。除非另外特殊提到，任何此处提及的sel-10应理解为指人sel-10，并且包括所有海马区和乳腺sel-10核酸分子(就涉及sel-10核酸、多核苷酸、DNA、RNA或基因而言)或多肽(就涉及sel-10蛋白质、多肽、氨基酸序列而言)。也提供了海马区sel-10及乳腺sel-10的核酸分子和多肽的片段。

如实施例1所述获得了SEQ ID NO：1的核苷酸序列，且其包含在cDNA克隆PNV 102-1中，后者于1998年11月9日保藏在美国典型培养物保藏中心，10801University Blvd，Manassas，VA20110中，保藏号为98978。如实施例2所述获得了SEQ ID NO：2的核苷酸序列，且其包含在cDNA克隆PNV 108-2中，后者于1998年11月9日保藏在美国典型培养保藏中心，10801 University Blvd，Manassas，VA20110中，保藏号为98979。

本发明的人sel-10多肽同秀丽新杆线虫sel-10以及同包括酵母CDC4和人LIS-1在内的β-转导素蛋白质家族的成员具有同源性。此家族以存在F-盒和多重WD-40重复体为特征(Li，J.，等，美国国家科学院院报92：12180-12184(1995))。此重复体长度为20至40个氨基酸，并同甘氨酸-组氨酸(GH)和色氨酸-天冬氨酸(WD)残基结合。β-转导素的三维结构表明，WD40重复体组成七叶螺旋桨样结构的臂(Sondek，J.，等.自然379：369-374(1996))。每一叶由具有一对在蛋白质基元中形成一个内部β链界限的保守天冬氨酸残基的β-片层四个交替的折叠构成。在代表多样化功能类别的27种以上不同的蛋白质中发现了WD40重复体(Neer，E.J.，等，自然371：297-300(1994))。这些重复体调节包括细胞分裂、细胞命运决定、基因转录、信号转导、蛋白质降解、mRNA修饰和囊泡融合在内的细胞功能。在功能上的多样性得出了如下假设：β-转导素家族成员提供能在其上装配多蛋白质复合体的共同支架。

SEQ ID NO：1中给出的核苷酸序列相当于编码hhsel-10的核苷酸序列，而SEQ ID NO：2中给出的核苷酸序列相当于编码hmsel-10的核苷酸序列。编码sel-10的DNA的分离和测序在以下的实施例1和2中有所描述。

如实施例1和2所述，应用自动测序方法获得sel-10的核苷酸序列。获得了本发明sel-10核苷酸序列的两条DNA链，且据信为100％精确。然而，众所周知，通过此类自动化方法获得的核苷酸序列可能包含一些错误。通过自动化确定的核苷酸序列一般至少大约90％，至少大约95％至99.9％与给定核酸分子的实际核苷酸序列相同。实际的序列可以应用本领域众所周知的手工测序方法更精确地测定。导致一个或更多的核苷酸插入或缺失的序列中的错误可能导致翻译中的读框移位，使得推定的氨基酸序列自突变点开始不同于由核酸分子的实际核苷酸序列推定的核苷酸序列。本发明的sel-10 DNA包括cDNA、化学合成DNA、通过PCR分离的DNA、基因组DNA及其组合。应用本领域众所周知的方法，通过筛选具有此处所述的sel-10 cDNA的基因组文库，可以获得基因组sel-10 DNA。由sel-10 DNA转录的RNA也包括在本发明中。

由于遗传密码的简并性，两个DNA序列可以不同但编码相同的氨基酸序列。本发明因此提供了具有编码任一本发明sel-10多肽的多核苷酸序列之分离的核酸分子，其中所述的多核苷酸序列编码具有SEQID NO：3-10的完整氨基酸序列的sel-10多肽或其片段。

此处也提供了纯化的sel-10多肽，包括重组的及非重组的。保留任何sel-10生物学活性的天然sel-10蛋白质的变异体和衍生物也在本发明的范围内。如上所述，本发明的sel-10多肽同酵母CDC4有同源性。由于已知CDC4催化特定细胞蛋白质的遍在蛋白化作用(Feldman等，细胞(Cell)91：221(1997))，可以推断sel-10也具有此活性。证明此类生物活性的测定方法是众所周知的，包括应用纯化人sel-10蛋白质连同酵母蛋白质Cdc4p、Cdc53p和Skp1p(或它们的人类直向同源基因)和E1酶、E2酶Cdc34p(或它们的人类直向同源基因)、遍在蛋白、一种靶蛋白质以及一种ATP再生系统重构遍在蛋白化系统(Feldman等，1997)。Skp1p通过一个称作F-盒的蛋白质结构域同Cdc4p结合(Bai等，细胞86：263(1996))。在酵母CDC4、秀丽新杆线虫sel-10、小鼠sel-10及人sel-10中发现了F-盒蛋白质基元。可以用酵母成分的秀丽新杆线虫对应物，如代替Cdc53p的cul-1(也称作lin-19)蛋白质(Kipreos等，细胞85：829(1996))和代替Skp1p的蛋白质F46A9，或用它们的哺乳动物对应物，如代替Cdc53p的cul-2蛋白质(Kipreos等，1996)和代替酵母Skp1p的哺乳动物Skp1p重构sel-10遍在蛋白化系统。由蛋白激酶提供的磷酸化系统也包括在由Feldman等于1997年创立的测定系统中。

例如，可以通过天然sel-10编码核苷酸序列的突变获得sel-10变异体。此处所述sel-10变异体是同天然sel-10基本同源的多肽，但由于在其氨基酸序列中一个或更多的缺失、插入或替换，其具有不同于天然sel-10的氨基酸序列。变异体的氨基酸或核苷酸序列与天然sel-10序列优选至少大约80％相同，更优选地至少大约90％相同，而最优选地至少大约95％相同。因此，例如同天然sel-10基因相比，每一百个核苷酸含有5个点突变的变异核苷酸序列与天然蛋白质95％相同。在天然和变异的sel-10序列之间的序列相同性的百分比，也称为同源性，其可以例如通过应用任一常用于此目的的计算机程序比较两个序列而确定，诸如此类的程序有应用Smith和Waterman算法(应用数学进展(Adv.Appl.Math.)2：482-489(1981))的Gap程序(Wisconsin序列分析包(Wisconsin Sequence Analysis Package)，Unix第8版，遗传学计算机组，大学科研园，Madison Wisconsin)。

可以通过大量已知技术中的任一种完成天然氨基酸序列的改变。例如，通过熟练技术人员所周知的方法，如由Walder等(基因(Gene)42：133(1986))；Bauer等(基因37：73(1985))；Craik(生物技术(BioTechniques)，1985年1月，第12-19页)；Smith等(遗传工程：原理和方法，Plenum出版社(1981))；和美国专利第4,518,584和4,737,462所描述的寡核苷酸介导的诱变，可以在特定位点引入突变。

在本发明范围内sel-10变异体可以包括保守替换的序列，意思是sel-10多肽的一个或多个氨基酸可被不同的残基替换，而这种替换不改变sel-10多肽的二级和/或三级结构。此类替换可以包括一个氨基酸被具有相似物理化学性质的残基置换，例如替换一个脂肪族残基(异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或丙氨酸)为另一个脂肪族残基，或在碱性残基赖氨酸和精氨酸之间、酸性残基谷氨酸和天冬氨酸之间、酰胺残基谷氨酰胺和天冬酰胺之间、羟基残基丝氨酸和酪氨酸之间或芳香族残基苯丙氨酸和酪氨酸之间替换。关于进行表型沉默的氨基酸交换的进一步资料可以在Bowie等，科学247：1306-1310(1990)中发现。其它可能基本保留sel-10生物学活性的sel-10变异体是那些在蛋白质的功能区域以外的区域进行氨基酸替换的变异体。

另一方面，本发明提供了包含在严格条件下可与上述核酸分子的一部分杂交的多核苷酸之分离的核酸分子，例如，可与前述的核酸分子之一的至少大约15个核苷酸，优选至少大约20个核苷酸，更优选至少大约30个核苷酸，而最优选至少大约从30个到至少大约100个核苷酸杂交。具有上述长度的核酸分子的该部分涉及，例如，对照核酸分子的至少大约15个连续的核苷酸。严格杂交条件，预期是在6XSSC/0.1％SDS中在大约42/C过夜孵育大约2.5小时，接着在65/C1.0XSSC、0.1％SDS中洗涤滤膜。

在此所述的sel-10编码核酸分子的片段以及能同该核酸分子杂交的多核苷酸可以在聚合酶链反应(PCR)中用作探针或引物。该探针可以用于，例如，在体外测定以及Southern和Northern印迹中检测sel-10核酸的存在与否。通过此类探针的使用，也可以鉴定表达sel-10的细胞类型。该方法是众所周知的，且熟练的技术人员将能选择一个长度适于具体应用的探针。对于PCR，应用对应于期望的sel-10核酸分子末端的5′和3′引物应用常规技术以分离和扩增该序列。

sel-10核酸分子的其他有用的片段是包含能同目标sel-10 mRMA(使用有义链)或sel-10 DNA(使用反义链)序列结合的单链核酸序列的反义或有义寡核苷酸。

另一方面，本发明包括具有或不具有相关天然模式糖基化的sel-10多肽。在酵母或哺乳动物表达系统表达的sel-10(下面讨论)可以在分子量和糖基化模式上与天然sel-10多肽相似或明显不同。在细菌表达系统中sel-10的表达将提供非糖基化的sel-10。

本发明的多肽优选以分离的形式提供，并优选为基本上纯的。通过众所周知的方法，包括硫酸铵或乙醇沉淀反应、阴离子或阳离子交换层析法、磷酸纤维素层析法、疏水相互作用层析法、亲和层析法、羟基磷灰石层析法及植物凝集素层析法可以从重组细胞培养物中回收和纯化sel-10多肽。在一个优选的实施方案中，应用高效液相层析法(HPLC)纯化。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸分子的载体，以及用此载体转化的宿主细胞。任一本发明的多核苷酸分子可与一种载体连接，其通常包括一种可选择标志和一个用于在宿主中繁殖的复制起点。因为本发明也提供由上述多核苷酸分子表达的sel-10多肽，所以优选用于sel-10表达的载体。此类载体包括编码任一上述或下面描述的sel-10多肽的DNA，该DNA有效连接到合适的转录或翻译调节序列，诸如源自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的调节序列。调节序列的实例包括转录启动子、操纵基因或增强子、mRNA核糖体结合位点以及控制转录和翻译的合适序列。当调节序列在功能上与编码sel-10的DNA相关时，核苷酸序列为有效连接。因此，如果启动子核苷酸序列指导sel-10序列的转录，则启动子核苷酸序列为有效连接到sel-10 DNA上。

用于克隆编码sel-10的多核苷酸分子或用于表达sel-10多肽的适合载体的选择当然取决于载体转化的宿主细胞以及待表达sel-10多肽的宿主细胞。用于表达sel-10多肽的合适的宿主细胞包括原核生物、酵母及高等真核生物细胞，其中的每一个都将在以下讨论。

在此类宿主细胞中表达的sel-10多肽也可以是包含来自异源蛋白质区域的融合蛋白质。可包括此类区域以使，例如，多肽的分泌、稳定性改善或促进多肽纯化。例如，编码适当的信号肽序列能整合入表达载体。用作信号肽(分泌性前导物)的DNA序列可以符合读框地融合到sel-10序列中，以使sel-10以包含信号肽的融合蛋白质形式得到翻译。在预期的宿主细胞中起作用的信号肽促进了sel-10多肽的细胞外分泌。优选sel-10一旦从细胞分泌，则由sel-10多肽上切除信号序列。能用于实施本发明的信号序列的非限制性实例包括酵母I-因子和在sf9昆虫细胞中的蜜蜂melatin前导区。

在优选的实施方案中，sel-10多肽是包括用于促进多肽纯化的异源区域的融合蛋白质。很多可得到的用于此功能的多肽允许融合蛋白质同结合配体的选择性结合。例如，sel-10多肽可以被修饰为包含一种肽，从而形成可同结合配体或肽标记物特异性结合的融合蛋白质。此类肽标记物的非限制性实例包括6-组氨酸标记物、硫氧还蛋白标记物、FLAG标记物、血凝素标记物、GST标记物以及OmpA信号序列标记物。正如本领域技术人员理解的那样，可识别并同肽结合的结合配体可以是如下任何分子或化合物，包括金属离子(例如金属亲和柱)、抗体或其片段及可同肽结合的任何蛋白质或肽在内。可以通过可同每种类型标记物特异性反应的荧光素或若丹明标记的抗体识别这些标记物。

用于表达sel-10多肽的适合的宿主细胞包括原核生物、酵母及高等真核生物细胞。用于表达sel-10的适合的原核生物宿主包括埃希杆菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)和沙门菌属(Salmonella)的细菌以及假单孢菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和葡萄球菌属(Staphylococcus)的成员。对于在例如大肠杆菌中的表达，sel-10多肽可以包括一个N-端蛋氨酸残基以促进原核生物宿主中重组多肽的表达。之后，可以任选地从表达的sel-10多肽上切除N-端蛋氨酸。

用在原核生物宿主中的表达载体通常包括一个或更多的表型可选择性标志基因。此类基因通常编码，例如赋予抗生素抗性或供给营养缺陷需要的蛋白质。广泛种类的此类载体易于由商业来源得到。实例包括pSPORT载体、pGEM载体(Promega公司)、pPROEX载体(LTI，Bethesda，MD)、Bluescript载体(Stratagene)及pQE载体(Qiagen公司)。

sel-10也可表达在来自包括酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母母属(Pichia)和克鲁维酵母属(Kluveromyces)在内的属的酵母宿主细胞内。优选的酵母宿主是啤酒酵母(S.cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)。酵母载体常包括来自2T酵母质粒的复制序列起点、自主性复制序列(ARS)、启动子区域、用于多腺苷酸化的序列、用于转录终止的序列及可选择的标志基因。

也可以应用既可在酵母也可在大肠杆菌中复制的载体(称为穿梭载体)。除了上面提到的酵母载体的特征，穿梭载体还包括用于在大肠杆菌中复制和筛选的序列。在酵母宿主中表达的sel-10多肽的直接分泌，可以通过在sel-10编码核苷酸序列5′端插入编码酵母I-因子前导区序列来完成。

昆虫宿主细胞培养系统也可以用于Sel-10多肽的表达。在一个优选的实施方案中，应用杆状病毒表达系统表达本发明的sel-10多肽。关于用于昆虫细胞中异源蛋白质表达的杆状病毒系统的用途之进一步资料由Luckow和Summers，生物工艺学(Bio/Techndogy)6：47(1998)综述。

在另一个优选的实施方案中，sel-10多肽在哺乳动物宿主细胞中表达。适合的哺乳动物细胞系的非限制性实例包括猴肾细胞的COS-7系(Gluzman等，细胞23：175(1981)和中华仓鼠卵巢(CHO)细胞。

用于表达本发明sel-10多肽的合适表达载体的选择，当然取决于应用的特定哺乳动物宿主细胞，且应在普遍技术人员的技能范围内。合适的表达载体的实例包括pcDNA3(Invitrogen公司)和pSVL(Parmacia Biotech公司)。用在哺乳动物宿主细胞中的表达载体包括源自病毒基因组的转录和翻译控制序列。可以用在本发明中的常用启动子序列和增强子序列包括但不限于，源自人巨细胞病毒(CMV)、腺病毒2、多瘤病毒及猿猴病毒40(SV40)的那些序列。例如在OKayama和Berg(分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol)3：280(1983))；Cosman等(分子免疫学(Mol Immunol)23：935(1986)；Cosman等(自然312：768(1984))；EP-A-O367566和WO91/18982中公开了用于构建哺乳动物表达载体的方法。

本发明的多肽也可以来培养多克隆和单克隆抗体，其可用于检测sel-10多肽表达的诊断测定。此类抗体可以通过常规方法制备。参见，例如，抗体：实验室手册，Harlow和Land(编)，Cold Spring Harbor实验室出版社，Cold Spring Harbor，纽约(1988)；单克隆抗体，杂交瘤：在生物学分析中的新领域，Kennet等(编)，Plenum出版社，纽约(1980)。

由于其能同人类染色体上的特定位点杂交，本发明的sel-10核酸分子对染色体鉴定也是有价值的。由于目前几乎没有可得的基于实际序列资料(重复多态性)的染色体标记试剂用于标记染色体位点，因此需要鉴定染色体上的特定部位。一旦把一个序列绘图定位在精确的染色体位置上，此序列在染色体上的物理位置可同遗传图谱资料相互关联。可通过连锁分析鉴定在基因和已被绘图定位到同一染色体区域的疾病之间的关系，其中确定了物理上相邻的基因的共同遗传。能通过比较患病的和未患病的个体之间的核酸序列，来确定看起来与特定疾病有关的基因实际上是否为疾病的病因。

本发明的sel-10多肽及编码它们的DNA，也可以用于进一步阐明AD的生物学机制，并可最终导致能用于改变该机制的化合物的鉴定。本发明的sel-10多肽与秀丽新杆线虫sel-10有47.6％相同和56.7％相似。如上所述，已知秀丽新杆线虫sel-10的突变抑制了导致sel-12的产卵功能丧失型突变，并也抑制lin-12的某些减效基因突变。也能通过人类早老性痴呆连锁基因PS-1(与sel-12有42.7％相同)或者PS-2(与sel-12有43.4％相同)挽救秀丽新杆线虫sel-12的突变。然而，具有家族性AD-连锁突变体的人PS-1挽救sel-12突变体的能力降低(Levitan，D.等，美国国家科学院院报93：14940-14944(1996))。

这表明，人类和秀丽新杆线虫基因在缺刻信号传递途径的互换性使之可以合理地预言，人sel-10突变将抑制导致AD的PS-1或PS-2突变，尤其是根据sel-10的推定结构。如上所述，导致早老性痴呆的PS-1和PS-2突变是干扰PS-1或PS-2的蛋白分解加工的突变。本发明的sel-10多肽是β-转导素蛋白质家族的成员，该家族中包括酵母CDC4，后者是能在遍在蛋白依赖性蛋白质降解途径起作用的一种酶的成分。因此，人sel-10可以通过遍在蛋白-蛋白酶体途径调节早老素降解。替代地或另外，人sel-10可以改变早老素的功能，方法是通过靶定经过遍在蛋白质化作用降解一种早老素活性的抑制剂，如负调控子。因此，sel-10突变可以逆转作为PS-1或PS-2突变的结果而造成的PS-1或PS-2错误的蛋白酶解加工，或者增加早老素功能。由于相同的原因，sel-10活性的抑制也可以起逆转PS-1或PS-2突变的作用。因此，可以假定，抑制本发明的人sel-10多肽表达或活性的化合物可以逆转PS-1或PS-2突变作用，因此对于AD的预防或治疗有作用。

因此，秀丽新杆线虫可用作鉴定能抑制本发明的人sel-10多肽活性或表达的因子之遗传系统。用在此类测定中的合适的秀丽新杆线虫种系缺乏编码活性秀丽新杆线虫sel-10的基因，并显示了由于sel-10基因失活而产生的产卵功能丧失。sel-12序列(Genebank保藏号U35660)和导致产卵功能丧失的sel-12突变都是已知的(参见Levitan等，自然377：351-354(1995)，其描述了秀丽新杆线虫sel-12(ar171)的构建)，因此，由于sel-10突变而丧失产卵功能的秀丽新杆线虫种系的构建可以应用常规方法完成。如何制备这样一个种系的实例由Levitan等给出(自然377：351-354(1995))。在秀丽新杆线虫sel-12(ar171)中的野生型秀丽新杆线虫sel-10也用常规方法诱变，例如在Levitan等，出处同上中用于sel-12诱变的技术。

为鉴定抑制人sel-10活性的化合物，将包含编码任一本发明野生型人sel-10蛋白质的人sel-10基因之DNA载体引入上述秀丽新杆线虫种系。在一个优选的实施方案中，将异源人sel-10基因整合入秀丽新杆线虫基因组。之后用Levitan等(美国国家科学院院报93：14940-14944(1996))所述的方法表达此基因。然后把试验化合物施予此种系，以便确定一个给定的因子能否抑制sel-10活性，从而抑制导致产卵缺陷的sel-12或lin-12突变。之后，例如通过Levitan等(美国国家科学院院报93：14940-14944(1996))描述的测定法，确定的此种系中的产卵功能。为进一步证实此化合物对于产卵功能的作用是由于sel-10活性的抑制，可以在已知被sel-10中的丧失功能型突变影响的第二生化或遗传途径中检验此化合物的作用(例如，在lin-12(d)减效基因种系中lin-12活性的进一步提高)。可以如Sundarem和Greenwald(遗传学135：765-783(1993))所述施行该测定法。

另外，检测了化合物抑制E3遍在蛋白质连接酶的能力。证明该活性的测定方法是众所周知的，包括应用纯化的人sel-10蛋白质连同酵母蛋白质Cdc4p、Cdc53p及Skplp和一种E1酶、E2酶Cdc34p、遍在蛋白质、一种目标蛋白质及一种ATP再生系统重构遍在蛋白化系统(Feldman等，1997)。sel-10遍在蛋白化系统也可以用酵母元件的秀丽新杆线虫对应物重构，例如，用cul-1(也称为lin-19)蛋白质替换Cdc 53p(Kipreos等，细胞85：829(1996))及蛋白质F46A9替换Skplp，或它们的哺乳动物对应物重构，例如，用Cul-2蛋白质替换Cdc53p(Kipreos等，出处同上)及哺乳动物Skplp替换酵母Skplp。由蛋白质激酶提供的磷酸化系统也包括在如Feldman等，1997所述的测定系统中。

另外，由于用人sel-10 cDNA转化而表达人sel-10，并因此具有APP加工增加和Aβ_1-40或Aβ_1-42形成的细胞系，也可以用于如实施例3描述的此类测定法中。可以检测化合物是否具有对于降低见于sel-10转化细胞系中的Aβ加工增加的能力。

然后，筛选挽救产卵缺陷或抑制E3遍在蛋白质连接酶的化合物是否有引起人细胞系中Aβ_1-40或Aβ_1-42的产生减低的能力。用试验化合物接触已知产生Aβ_1-40或Aβ_1-42的IMR-32或其它人细胞系(Asami-okada等，生物化学(Biochemistry 34：10272-10278(1995))，或接触经工程化以高水平表达人APP的人细胞系。在这些测定法中，通过本领域已知的ELISA或其他测定法测定细胞提取物中(或在释放入培养基后)的Aβ_1-40或Aβ_1-42(Borchelt等，神经元17：1005-1013(1996)；Citron等，自然杂志医药分册3：67-72(1997))。

全面描述了本发明后，参考以下的实施例将更容易理解之，但这些实施例只供例证，并不意在限制。

实施例

实施例1：秀丽新杆线虫sel-10的人同系物的鉴定

结果

ACEDB中sel-10的鉴定：

Sel-10图上位于克隆的多态性arP3和紧邻him-5左侧的TCRARI之间[ACEDB登记wm95p536]。跨越间隔对三个噬菌体λ克隆F35C11、F09F3和F55B12测序。据报道sel-10与酵母cdc4有同源性[ACEDB登记wm97Aβ259]。Blast探查揭示了，单个ORF在由arP3和相应于GenPep登记号F55B12.3的TCPARI所限定的间隔之内与酵母cdc4(CC4 YST)具有同源性。如酵母cdc4一样，F55B12.3是β-转导素蛋白质家族的成员。该家族以存在多倍的WD40重复体为特征[Neer，E.J.等，自然(Nature)371：297-300(1994)]。

人sel-10同系物Incyte028971的鉴定：

应用tblastn将GenPep登记号F55B12.3用于探查LifeSeq、LifeSeq FL和EMBL数据库。该探查揭示了与包括LIS-1(S36113和P43035)、与Miller-Dieker无脑回畸形有关的基因、爪蟾基因、TRCPXEN(U63921)和LifeSeq FL中的人重叠群028971在内的β-转导素家族成员的多种同系物。既然在秀丽新杆线虫基因组中也有多重β-转导素家族成员，用复合blast探查采集这些成员，然后与sel-10侯选基因成簇。用使用Clustal方法的DNAStar程序Megalign进行多重序列对比。这揭示了LIS-1与T03F6.F(一种不同的β-转导素家族成员)成簇，并因此将其排除作为侯选的sel-10同系物。TRCPXEN与K10B2.1(也与F55B12.3和CC4YST成簇的一种基因)成簇，而Incyte 028971与sel-10成簇。因此，Incyte 028971看来编码秀丽新杆线虫sel-10的人同系物。在包含WD40基元的7个重复体的蛋白质区域中，在sel-10和028971之间的序列同源性是最强的。Incyte 028971重叠群包含来自于包括胰腺、肺、T-淋巴细胞、成纤维细胞、乳腺、海马区、心肌、结肠及其它组织在内的多重文库的44个EST。

公共EST：

针对TREMBLP数据组，用DNA序列028971以Blastx探查鉴定了来自于IMAGE文库Soares小鼠胚胎NbME13.5-14.5的单个同源性小鼠EST(W85144)。应用W85144，然后应用F55B12.3的028971的blastx序列对比法，揭示028971中阅读框架的改变，其可能是由于测序错误。

用028971 DNA序列对EMBL EST数据库的Blastn探查揭示了，除了W85144，与028971的编码序列匹配的3个人EST及与028971序列的3′未翻译区匹配的六个EST。

蛋白质基元：

在酵母cdc4、小鼠W85144和人028971共有的F55B12.3中，两个蛋白质基元得到鉴别。这些基元在N-端结构域有一个F-盒，在C-端结构域有7个β-转导素重复体。

讨论：

sel-10基因编码β-转导素蛋白质家族成员，其以多重WD40重复体的存在为特征[Neer，E.J.等，自然371：297-300(1994)]。该重复体长度为20-40个氨基酸，并同甘氨酸-组氨酸(GH)和色氨酸-天冬氨酸(WD)残基结合。β-转导素的三维结构溶液显示WD40重复体形成七叶螺旋浆样结构的臂(Sondek，J，自然379：369-374(1996)。在形成一个内部β链界限的蛋白质基元中，每一个叶片由具有一对保守天冬氨酸残基的β片层的四个交替的折叠形成。WD40重复体见于代表多样化功能类别的超过27种不同的蛋白质中[Near，E，J等，自然371：297-300(1994)]，这些重复体调控包括细胞分裂、细胞命运决定、基因转录、信号转导、蛋白质降解、mRNA修改和囊泡融合在内的细胞功能。这种功能上的多样性导致了β-转导素家族成员提供了多蛋白质复合体能在其上装配的共同支架的假设。

sel-10，28971和W85144与酵母cdc4基因的同源性提示了，在用于细胞内蛋白质降解的遍在蛋白-蛋白酶体途径中起作用的一个角色。通过阻断Sic1(S期细胞周期蛋白/cdk复合物的抑制剂)的降解，酵母cdc4的突变导致细胞周期的停滞[King，R.W.等，科学274：1652-9(1996)]。Sci1的磷酸化作用以通过遍在蛋白-蛋白酶体途径破坏为目标。该途径包括三个由多蛋白复合物催化的连接酶反应[Ciechanover，A.，细胞79：13-21(1994)；Ciechanover，A.和A.L.Schwartz，FASEB J.，8：182-91(1994)]。最初，遍在蛋白的C-端甘氨酸被ATP激活，以在由遍在蛋白激活酶，E1催化的反应中形成高能硫基酯中间物。激活后，E2酶(遍在蛋白偶联酶)将遍在蛋白从E1转移到蛋白质目标。在某些情况下，E2单独起作用。在其它情况下，它与结合蛋白质底物的E3遍在蛋白连接酶一同起作用，重新招募E2以催化遍在蛋白化作用。E2遍在蛋白偶联酶包括一个相当保守的基因家族，而E3酶在序列上是多种多样的[Ciechanover，A.，细胞79：13-21(1994)；Ciechanover，A.和A.L.Schwartz，FASEBJ，8：182-91(1994)]。

在酵母中，E2遍在蛋白偶联酶cdc34的突变，通过不能降解S-期细胞周期蛋白/cdk复合物的Sic1抑制剂，而导致细胞周期停滞[King，R.W.等，科学274：1652-9(1996)]。Sic1通常在细胞进入G1-S期过渡时期降解，但在cdc34缺乏的情况下，Sic1避免了降解，且它的蓄积导致细胞周期停滞。除了cdc34，cdc4是G1-S期过渡所需的另外三个蛋白质之一。另外两个是cdc53和Skp1。如上所述，cdc4含有两个结构基元、7个WD40重复体(这提示着该蛋白质形成β-螺旋)和一个与作为SKP1相互作用结构域的细胞周期蛋白F共有的结构基元。[Bai，C.等，细胞86：263-74(1996)]。包括cdc53、cdc4和Skp1(还有遍在蛋白、cdc34和E1)在内的昆虫细胞裂解产物能够将遍在蛋白转移到Sic1，这提示这些成分中的一种或多种作为E3遍在蛋白连接酶起作用[King，R.W.等，科学274：1652-9(1996)]。不论cdc4还是Skp1的表达增加都部分补偿了另外一个的损失。

在秀丽新杆线虫中，sel-10的突变没有可见的表型，这说明sel-10在细胞周期的调节中不起作用。一个密切相关的秀丽新杆线虫及β-转导素家族成员K10B2.6可具有这种作用，这是因为它可与来自爪蟾的基因TRCP_XEN成簇，该基因可拯救由于不能降解细胞周期蛋白B而在分裂后期阶段停滞的酵母细胞周期突变体。如果sel-10确实编码E3-遍在蛋白连接酶的一种成分，它怎样能抑制sel-12而增强lin12突变呢？。

简单的假设是sel-10通过遍在蛋白-蛋白酶体途径调控这两种蛋白质的降解。sel-12和lin-12都是跨膜蛋白质。sel-12跨膜8次，以至于它的N-端和C-端都面向细胞溶胶[kim，T.W.等，生物化学杂志(J.Biol.Chem)272：11006-10(1997)]，而lin-12是I型跨膜蛋白质(Greenwald，I.和G.Seydoux，自然346：197-9(1990))。两者都是遍在蛋白化的，并且就人类PS2来说，在用蛋白酶体抑制剂N-乙酰-L-亮氨酸-L-正亮氨酸和乳胱氨酸处理过的细胞中稳态水平增高(Li，X.和I.Greenwald，神经元17：1015-21(1996))。或者，sel-10可能以早老素功能的负调节物的降解为目标。

遗传分析和由与cdc4的同源性提示的蛋白质功能暗示，人sel-10的药物抑制剂可能提高人早老素的稳态水平。这能增强早老素途径的潜在活性，并提供了一种治疗性干预早老性痴呆的方法。

实施例2：编码秀丽新杆线虫中早老素突变的外源基因抑制基因sel-10的人cDNA的5′RACE克隆

材料和方法

基于F55B12.3序列，制备用于从来源于秀丽新杆线虫cDNA的sel-10编码序列之扩增的寡核苷酸引物，该F55B12.3序列在实施例2中鉴定为秀丽新杆线虫sel-10的编码序列。

制备的引物是：5′-CGGGATCCACCATGGATGATGGATCGATGACACC-3′(SEQ ID NO：11)和5′-GGAATTCCTTAAGGGTATACAGCATCAAAGTCG-3′(SEQ ID NO：12)。用BALSuperscriptII预扩增试剂盒将秀丽新杆线虫mRNA转变为cDNA。用限制酶BamHI和EcoRI(LTI，Gaithersberg，MD)消化pCR产物，并将其克隆入pcDNA3.1(Invitrogen)。将两个分离物测序(ABI，Perkin-Elmer Corp)。

用Incyte克隆028971的序列(编码秀丽新杆线虫sel-10的人同系物的部分)设计四种反义寡核苷酸引物：5′-TCACTTCATGTCCACATCAAAGTCC-3′(SEQ ID NO：13)、5′-GGTAATTACAAGTTCTTGTTGAACTG-3′(SEQ ID NO：14)、5′-CCCTGCAACGTGTGTAGACAGG-3′(SEQ ID NO：15)和5′-CCAGTCTCTGCATTCCAC-ACTTTG-3′(SEQ IDNO：16)，以扩增人sel-10缺失的5′端。用Incyte LifeSeq“ElectronicNorthern”分析法鉴别在其中表达sel-10的组织。选择这其中的两个，海马区和乳腺，用于应用CloneTech Marathon试剂盒的5′RACE克隆形成，并从海马区和乳腺制备Marathon-ready的cDNA。将PCR产物克隆入TA载体pCR3.1(Invitrogen公司)，并且将分离物测序。在具有基于不同于海马区sel-10序列：5′-CTCAGACAGGTCAGGACATTTGG-3′(SEQ ID NO：17)的5′端的Incyte克隆，也设计出另外的5′寡核苷酸引物。

用Blastn探查Incyte数据库LifeSeq和LifeSeqFL。用GCG程序进行序列比较排列和翻译(Wisconsin序列分析包，Unix第8版，遗传学和计算机组，大学研究所公园，Madison Wisconsin)。

结果

秀丽新杆线虫sel-10的编码序列：

秀丽新杆线虫Sel-10预期的编码序列，F55B12.3最先在圣路易斯华盛顿大学的基因组测序中心得到确定，其是通过应用计算机程序GeneFinder，预测基因组粘粒F55B12中的内含子和外显子。通过扩增来自秀丽新杆线虫cDNA的该区域，并将其克隆、测序，进一步证实了假设的cDNA序列。

人sel-10基因同系物的编码序列：

所有的028971反义寡核苷酸扩增了来源于人海马区和乳腺cDNA的5′RACE产物。克隆并测序来自于海马区反应物的最长的PCR产物。设计该PCR反应以产生在预期的终止密码子上截止的产物。两分离物包含完全相同的序列，其开始于028971序始起始处之前的880碱基。通过与跨越Incyte cDNA克隆的比较进一步证实了该序列。没有将跨越人sel-10同系物的5′端的Incyte克隆命名为F55B12.3，因为在人和秀丽新杆线虫基因之间该区域中的同源性低，且因为这些基因与命名的克隆之间的重叠对它们来讲恰巧非常小，以至于Incyte数据库中不能成簇，或被我们用028971序列Blast探查Incyte数据库所揭露。

人sel-10的预期蛋白质序列与秀丽新杆线虫sel-10有47.6％相同和56.7％相似。人sel-10序列的N-端以4个符合读框的甲硫氨酸起始。除了上述的WD40重复体，人序列也包括与用于结合Skp1(预期为sel-10同系物)的CDC4 F-盒同源的区域。

在乳腺和海马区组织中表达的不同人sel-10 mRNA：

不同于海马区序列的另外几种人sel-10 EST得到鉴定。存在精确的匹配，说明另外可选择的转录本可能是真实的。这些序列与人海马区sel-10序列的比较显示了在第4个符合读框的蛋氨酸之前的差异，从那之后显示出精确的序列匹配。发现了对该选择性转录本的5′端有特异性的寡核苷酸引物，以扩增来源于乳腺而不是海马区cDNA的产物。这说明了人sel-10转录以组织特异性方式经历了不同的剪接，或说明基因包含多种组织特异性的启动子。

讨论

用5′RACE和PCR扩增克隆编码秀丽新杆线虫基因sel-10之人同系物的全长cDNA。序列分析进一步证实了先前的预想，即sel-10是包含F-盒和WD40重复体结构域的蛋白质CDC4家族的成员。人sel-10 cDNA的两种变异体从海马区和乳腺得到克隆，它们在翻译起始位置的表观位点之前的5′序列上不同。这提示该基因也许有两个或更多的转录起始位点，其为组织特异性的，或外显子剪接模式为组织特异性的。

实施例3：人细胞中抗原决定簇标记的sel-10的表达，和由人sel-10产生的淀粉样β肽加工紊乱

材料和方法

抗原决定簇标记的sel-10的构建：亚克隆、细胞生长和转染：

应用经寡核苷酸237(5′-GGAATTCCATGAAAAGATTGGACCATGGTTCTG-3′)(SEQ ID NO：18)和206(5′-GGAATTCCTCACTTCATGTCACATCAAAGTCCAG-3′)(SEQID NO：19)引发的聚合酶链反应(PCR)，将EcoR1位点符合读框地引入人sel-10 cDNA。将产生的PCR产物克隆入载体pCS2+MT的EcoR1位点。这将5′6-myc抗原决定簇标记符合读框地融合入海马区sel-10 cDNA的第5蛋氨酸，即，SEQ ID NO：1中所示序列的核苷酸306的上游区。该构建体的核苷酸序列命名为6-myc-N-sel-10，示于SEQ ID NO：20中，而其编码的多肽的氨基酸序列示于SEQ ID NO：21中。海马区和乳腺sel-10 cDNA在该蛋氨酸上游区不同。将具有3′-FLAG标记的PS1cDNA(PS1-C-FLAG)亚克隆入pcDNA3.1载体。将包含瑞典NL突变的APP cDNA以及含有APP695 C-端的双赖氨酰基元附加物(APP695NL-KK)之稀释的ER保留序列亚克隆入载体pIRES-EGFP(Mullan等，自然遗传学(NatGenet)1992年8月；1(5)：345-7)。HEK293和IMR32细胞在带10％FBS的DMEM中生长为80％铺满，并用上述的cDNA转染。10mg总DNA/6×10⁶细胞总数用于由单一质粒转染。为了多种质粒的共转染，每种质粒采用均等数量，利用LipofectAmine(BKL)，总量为10mg DNA。

为了构建C-端V5组氨酸标记的sel-10和C-端mychis标记的sel-10，用5′引物：5′-GGGTACCCCTCATTATTCCCTCGAGTTCTTC-3′(SEQ ID NO：22)上包含有KPNI限制位点和3′引物：5′-GGAATTCCTTCATGTCCACATCAAAGTCC-3′(SEQ IDNO：23)上包含有EcoRI位点的寡核苷酸作引物，用最初的人sel-10RACE PCR产物作模板，扩增人海马区sel-10的编码序列。产物用KpnI和EcoRI两者消化，并克隆入载体pcDNA6/V5-His A或pcDNA3.1/myc-His(+)A(Invitrogen公司)。通过双脱氧测序法进一步证实了独立的分离物的核苷酸序列。C-端V5组氨酸标记的sel-10的核苷酸序列示于SEQ ID NO：24中，而其编码的多肽的氨基酸序列示于SEQ ID NO：25中。通过双脱氧测序法进一步证实独立的分离物的核苷酸序列。C-端mychis组氨酸标记的sel-10的核苷酸序列示于SEQ ID NO：26中，而其编码的多肽的氨基酸序列示于SEQID NO：27中。

经FACS对转化的细胞的克隆选择：

在装备有由空气冷却的氩激光提供的488nm激发线的EPICSElite ESP流式细胞计数器(Coulter，Hialeah，FL)上分析细胞样本。通过525nm谱带透过滤片测量EGFP发射，并在由前方和右侧角光散射决定的存活细胞上选通后，在4-decade对数坐标上显示荧光强度。单个的绿色细胞经分离进入96孔平板的任一个孔中，其中包含不带G481的生长培养基。四天的恢复期后，将G418加入该培养基中至最终浓度为400mg/ml。具有克隆的孔从96孔平板扩展至24孔平板上生长，然后扩展到6孔平板上生长，其中在每一个阶段选择生长最快的克隆用于扩增。

免疫荧光：

在冰上用溶于PBS中的4％甲醛和0.1％TritonX-100转染30分钟后，在载玻片上固定细胞48小时，并用溶于PBS中的10％山羊血清(封闭液)室温下(即25℃)封闭1小时，接着用小鼠anti-myc(10mg/ml)或兔抗FLAG(0.5mg/ml)抗体在4℃条件下培育过夜，然后在封闭液中用荧光素标记的山羊抗-小鼠或抗-兔抗体(5mg/ml)，在25℃条件下封闭1小时。

Western印迹法：

在冰上用100ml TENT(50mM Tris-HClpH8.0、2mM EDTA、150mM NaCl、1％Triton X-100、1x蛋白酶抑制剂混合物)孵育10⁵个细胞10分钟，接着以14000g离心，转染后48小时制备细胞裂解产物。将上清液置于4-12％NuPage凝胶(50mg蛋白质/泳道)上电泳，并用X室II微室系统(Novex)进行转移。用在PBS中的5％牛奶在室温下封闭此斑点印迹1小时，并在4℃条件下用anti-myc或抗FLAG抗体(如上面的“免疫荧光”所述)培育过夜，然后，在室温下用绵羊抗小鼠或抗兔抗体-HRP(0.1mg/ml)培育1小时，接着用Supersignal(Pierce)检测。

酶联免疫吸附测定(ELISA)：

在下述的能够探查培养物上清液中的Aβ_1-40和Aβ_1-42肽水平的双抗体夹心ELISA中，分析细胞培养物上清液或细胞裂解产物(100ml甲酸/10⁶个细胞)。

在双抗体夹心ELISA中，用单克隆抗体(mAb)6E10(Senetek，st.Louis，MO)和生物素化的兔抗血清162或164(NYS基础研究院，Staten岛，纽约)测量人Aβ_1-40和Aβ_1-42。捕获抗体6E10对存在于人Aβ的N-端氨基酸残基1-16的抗原决定簇是特异的。偶联的探测抗体162和164分别对hAβ1-40和1-42是特异的。根据Pirttila等的方法实施夹心ELISA(衰老的神经生物学(Neurobiology ofAging)18：121-7(1997))。简而言之，将Nunc Maxisorp 96孔免疫平板用稀释于0.1M碳酸盐-磷酸氢盐缓冲液、pH9.6的mAb 6E10(5μg/ml)覆盖(100μl/孔)，并在4℃条件下培育过夜。用含有0.05％吐温-20的0.01M DPBS(Pierce，Rockford，II生产的ModifiedDulbecco′s磷酸缓冲盐液(0.008M磷酸钠、0.002M磷酸钾、0.14M氯化钠、0.01M氯化钾、pH7.4))(DPBST)冲洗该板3次，用溶于0.01M DPBS的10％标准绵羊血清(Sigma公司)200微升封闭该板60分钟，以避免非特异性结合。从1mg/mlDMSO贮存溶液中以非转柒条件的细胞培养液稀释人Aβ_1-40或Aβ_1-42标准(Bachem，Torrance，CA)，洗涤平板后加入上述标准100μl/孔以及100μl/孔样品，即转染细胞的经过滤的条件培养基。该平板在室温下培养2小时，并在4℃培养过夜。第二天，清洗该平板后，加入稀释于DPBST+0.5％BSA的100μl/孔生物素化的免抗血清162(1∶400)或164((1∶50)，并在室温孵育的1小时15分钟。清洗后，加入在DPBST中以1∶10000稀释的100μl/孔neutravidin-辣根过氧化酶(Pierce，Rockford，II)，并在室温下孵育1小时。在最后一次清洗后，加入溶于50mM枸橼酸/100mM磷酸钠缓冲液(Sigma Chemicals，st.louis，MO)，pH5.0的邻-苯二胺二盐酸盐100μl/孔(Sigma Chemicals，st.louis，MO)作为底物，并用Soft max Pro软件在动力学微孔板读数仪中于450nm处监控颜色发生20分钟。

结果

HEK293细胞的转染：

通过应用表达绿色荧光蛋白质(GFP)或者通过用抗原决定簇标记的sel-10或PS1免疫荧光探测检验转染效率。N-端6-myc抗原决定簇用于标记人sel-10(6myc-N-sel-10)，而PS1用C-端FLAG抗原决定簇(PS1-C-FLAG)标记。通过包含提高Aβ加工能力的瑞典NL突变以及包含带有C-端双赖氨酸基元(APP695NL-KK)的稀释的内质网(ER)保留信号，修饰APP695。该双赖氨酸基元提高了Aβ加工能力约2倍。将APP695NL-KK构建体插入包括GFP的双顺反子载体(pIRES-EGFP，Invitrogen)的第一个顺反子，以允许我们监测转染效率。对于用单种质粒DNA的转染，HEK293细胞中的转染效率约为50％。对于用两种质粒转染，当用双免疫荧光检测时，约30-40％的细胞表达两种蛋白质。

通过用于闸明PS-1-C-FLAG和6myc-N-sel-10(图1A)的Western印迹法，证实了在转染的HEK293细胞中重组蛋白质的表达。在三种质粒(PS1-C-FLAG+6myc-N-sel-10+APP)共同转染的情况中，应用合适的抗体通过Western印迹法在同一细胞溶裂产物中探测到全部的三种蛋白质。

6myc-N-sel-10和PS1-C-FLAG对Aβ加工的作用：

用6myc-N-sel-10或PS1-C-FLAG与APP695NL-KK共转染HEK293细胞，与仅用APP695NL-KK的转染相比，增加了2到3倍释放入培养物上清液中的Aβ1-40和Aβ1-42肽(表1)。用6myc-N-sel-10和PS1-C-FLAG两者共转染APP695NL-KK又进一步增加了Aβ的释放(即，增加4-6倍)。相反，释放入上清液的Aβ1-42/(Aβ1-40+Aβ1-42)的比例降低了约50％。Aβ1-42/(Aβ1-40+Aβ1-42)比例的微妙降低，反映了Aβ1-40相对于Aβ1-42增加得更大。6myc-N-sel-10和PS1-C-FLAG都不影响HEK293细胞中的内源性Aβ的生成。在IMR32细胞中也获得了相似的观察结果(表2)。然而，IMR32细胞的转染不如HEK293细胞，所以通过与6myc-N-sel-10或PS1-C-FLAG共转染对APP695NL-KK加工的刺激作用较低。

在用APP695NL-KK转染的HEK293细胞中表达的Aβ1-40的水平足够在培养物上清液和细胞沉淀中都测量到Aβ肽。仅用APP695NL-KK转染的细胞中，HEK293细胞沉淀中检测到的Aβ1-40比上清液中多得多。用6myc-N-sel-10或PS1-C-FLAG共转染成比例地降低在细胞沉淀的Aβ1-40，并增加培养物上清液中Aβ。这提示了6myc-N-sel-10和PS1-C-FLAG改变了APP的加工或运输，以至更多的Aβ成比例地从细胞释放。

6mycN-sel-10和PS1-C-FLAG表达对内源性Aβ加工作用：

6myc-N-sel-10对人细胞中的内源性Aβ的加工作用，通过创建表达这些蛋白的稳定转化的HEK293细胞系评估。产生了两种表达6myc-N-sel-10细胞系(sel-10/2和sel-10/6)及用pcDAN3.1载体DNA转化的控制细胞系。如由Western印迹分析法显示两种6myc-N-sel-10细胞系都表达该蛋白质。在两个6myc-N-sel-10细胞系中Aβ1-40内源性产物同载体DNA转化的细胞相比都有增加(表3)。此外，在用APP695NL-KK质粒DNA转染后，6myc-N-sel-10的稳定表达大大增加了Aβ产生。表达PS1-C-FLAG的6个稳定的细胞系获得了相似的结果。在用APP695NL-KK转染后，6个细胞系全部显示了内源性Aβ加工能力显著提高，还全部显示了Aβ加工能力的增强(表3)。另外，见于利用6myc-N-sel-10转染的Aβ加工的增高也见于C-端用mychis或V5组氨酸标记的sel-10(见图4)。C-端和N-端标记都导致Aβ加工能力的增高。

讨论

这些资料表明，当过度表达时，6myc-N-sel-10以及PS1-C-FLAG在短暂的和稳定的表达系统中都改变了Aβ加工能力，在这些实验中应用6-myc抗原决定簇标记，以允许用Western印迹分析法探测sel-10蛋白质的表达。如果象它的酵母CDC4的序列同系物提示的那样，sel-10是E2-E3遍在蛋白连接酶，应该可能鉴定以遍在蛋白化为目标的蛋白质。由于早老素经遍在蛋白-蛋白酶体路径降解，PS1和PS2是sel-10催化的遍在蛋白化作用的符合逻辑的目标[Kim等，生物化学杂志272：11006-11010(1997)]。在此处sel-10如何影响Aβ加工仍不清楚。今后，需要确定sel-10和PS1是否通过改变APP产生、加工、转运或转化数提高Aβ加工能力，以及PS1的作用是否由sel-10介导或调控。

这些实验表明，sel-10是AD治疗中以降低Aβ水平为目标的潜在药物。它们还显示秀丽新杆线虫是于其中调查AD中早老素生物学的完美模式系统。因此，如由共转染实验显示以及在稳定的转化物中所示，6myc-N-sel-10或PS1-C-FLAG的表达提高了Aβ加工能力。用APP695NL-KK与6myc-N-sel-10或PS1-C-FLAG共转染后，在HEK293细胞和IMR32细胞中都可见Aβ加工能力的提高。在表达6myc-sel-10或PS1-C-FLAG的HEK293细胞的稳定转化物中，观察到内源性Aβ加工能力的提高，以及用APP695NL-KK转染后的Aβ加工能力的提高。这表明sel-10和/或PS1的抑制剂可以降低Aβ加工能力，并可能具有早老性痴呆的治疗潜力。

显而易见，本发明也许会用不同于上述的叙述和实施例中所述的方式实施。

参照上述教导，本发明的大量修饰和变体是有可能的，因此，它们落入本发明的范围内。

在此处引用的所有出版物的全部内容在此处引入作为参考。

表1.6 myc-N-sel-10和PS1-C-FLAG瞬时转染对HEK293细胞上清液中的Ab水平的影响

转染的质粒 Ab1-42 Ab1-40 Ab1-42/总Ab

ng/ml ng/ml ng/ml

pcDNA3 81±20 231±50 0.26±0.05

6myc-N-sel-10 67±7 246±34 0.21±0.03

PS1-C-FLAG 75±18 227±45 0.25±0.03

PS1-C-FLAG+6myc-N-sel-10 77±21 220±26 0.25±0.03

APP695NL-KK 141±27 896±103 0.14±0.02

APP695NL-KK+6myc-N-sel-10 308±17 2576±190 0.11±0.00

APP695NL-KK+PS1-C-FLAG 364±39 3334±337 0.09±0.00

APP695NL-KK+PS1-C-FLAG+6myc-N-sel-10 550±20 5897±388 0.09±0.00

表2.6 myc-N-sel-10和PS1-C-FLAG瞬时转染对IMR32细胞上清液中的Ab水平的影响

转染的质粒 Ab1-42 Ab1-40 Ab1-42/总Ab

ng/ml ng/ml ng/ml

pcDNA3 65±3 319±146 0.19±0.06

6myc-N-scl-10 63±0 246±53 0.21±0.04

PS1-C-FLAG 67±6 307±79 0.18±0.04

PS1-C-FLAG+6myc-N-sel-10 67±6 302±94 0.20±0.08

APP695NL-KK 66±5 348±110 0.17±0.05

APP695NL-KK+6myc-N-sel-10 75±18 448±141 0.15±0.03

APP695NL-KK+PS1-C-FLAG 63±26 466±72 0.12±0.02

APP695NL-KK+PS1-C-FLAG+6myc-N-sel-10 81±26 565±179 0.12±0.01

表3.来源于HEK293细胞的稳定转化物的上清液中的内源和外源Ab1-40和Ab1-42

稳定的细胞系 GFP转染 APP695NL-KK转染

Ab1-40 Ab1-42 Ab1-40 Ab1-42

ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml

6myc-N-sel10/2 297±29 109±17 4877±547 750±32

6myc-N-sel10/6 168±18 85±11 8310±308 1391±19

PS1-C-FLAG/2 97±6 68±8 3348±68 493±21

PS1-C-FLAG/8 118±11 85±17 3516±364 515±36

PS1-C-FLAG/9 83±20 67±16 2369±73 350±12

PS1-C-FLAG/11 152±17 68±13 4771±325 599±25

PS1-C-FLAG/12 141±12 50±10 4095±210 449±21

PS1-C-FLAG/13 270±139 61±28 6983±304 745±41

pcDNA3/1 43±13 75±15 1960±234 61±6

表4.在N-端或C-端具有抗原决定簇标记的sel-10构建体提高了Aβ1-40和Aβ1-42

构建体 Aβ1-40 ％增加 P-值 Aβ1-42 ％增加 P-值

pcDNA 4240±102 614±10

6myc-N-sel-10 7631±465 80％ 3.7×10^-6 1136±73 46％ 7.9×10^-6

sel-10-C-mychis 5485±329 29％ 1.8×10^-4 795±50 29％ 4.0×10^-4

sel-10-C-V5his 6210±498 46％ 1.2×10^-4 906±73 48％ 2.1×10^-4

SEQUENCE LISTING

<110>Gurney，Mark E.

Li，Jinhe

Pauley，Adele M.

Pharmacia & Upjohn公司

<120>人Sel-10多肽及编码其的多核苷酸

<130>6142

<140>6142

<141>1997-12-19

<160>27

<170>PatentIn Ver.2.0

<210>1

<211>3550

<212>DNA

<213>人

<400>1

ctcattattc cctcgagttc ttctcagtca agctgcatgt atgtatgtgt gtcccgagaa 60

gcggtttgat actgagctgc atttgccttt actgtggagt tttgttgccg gttctgctcc 120

ctaatcttcc ttttctgacg tgcctgagca tgtccacatt agaatctgtg acatacctac 180

ctgaaaaagg tttatattgt cagagactgc caagcagccg gacacacggg ggcacagaat 240

cactgaaggg gaaaaataca gaaaatatgg gtttctacgg cacattaaaa atgatttttt 300

acaaaatgaa aagaaagttg gaccatggtt ctgaggtccg ctctttttct ttgggaaaga 360

aaccatgcaa agtctcagaa tatacaagta ccactgggct tgtaccatgt tcagcaacac 420

caacaacttt tggggacctc agagcagcca atggccaagg gcaacaacga cgccgaatta 480

catctgtcca gccacctaca ggcctccagg aatggctaaa aatgtttcag agctggagtg 540

gaccagagaa attgcttgct ttagatgaac tcattgatag ttgtgaacca acacaagtaa 600

aacatatgat gcaagtgata gaaccccagt ttcaacgaga cttcatttca ttgctcccta 660

aagagttggc actctatgtg ctttcattcc tggaacccaa agacctgcta caagcagctc 720

agacatgtcg ctactggaga attttggctg aagacaacct tctctggaga gagaaatgca 780

aagaagaggg gattgatgaa ccattgcaca tcaagagaag aaaagtaata aaaccaggtt 840

tcatacacag tccatggaaa agtgcataca tcagacagca cagaattgat actaactgga 900

ggcgaggaga actcaaatct cctaaggtgc tgaaaggaca tgatgatcat gtgatcacat 960

gcttacagtt ttgtggtaac cgaatagtta gtggttctga tgacaacact ttaaaagttt 1020

ggtcagcagt cacaggcaaa tgtctgagaa cattagtggg acatacaggt ggagtatggt 1080

catcacaaat gagagacaac atcatcatta gtggatctac agatcggaca ctcaaagtgt 1140

ggaatgcaga gactggagaa tgtatacaca ccttatatgg gcatacttcc actgtgcgtt 1200

gtatgcatct tcatgaaaaa agagttgtta gcggttctcg agatgccact cttagggttt 1260

gggatattga gacaggccag tgtttacatg ttttgatggg tcatgttgca gcagtccgct 1320

gtgttcaata tgatggcagg agggttgtta gtggagcata tgattttatg gtaaaggtgt 1380

gggatccaga gactgaaacc tgtctacaca cgttgcaggg gcatactaat agagtctatt 1440

cattacagtt tgatggtatc catgtggtga gtggatctct tgatacatca atccgtgttt 1500

gggatgtgga gacagggaat tgcattcaca cgttaacagg gcaccagtcg ttaacaagtg 1560

gaatggaact caaagacaat attcttgtct ctgggaatgc agattctaca gttaaaatct 1620

gggatatcaa aacaggacag tgtttacaaa cattgcaagg tcccaacaag catcagagtg 1680

ctgtgacctg tttacagttc aacaagaact ttgtaattac cagctcagat gatggaactg 1740

taaaactatg ggacttgaaa acgggtgaat ttattcgaaa cctagtcaca ttggagagtg 1800

gggggagtgg gggagttgtg tggcggatca gagcctcaaa cacaaagctg gtgtgtgcag 1860

ttgggagtcg gaatgggact gaagaaacca agctgctggt gctggacttt gatgtggaca 1920

tgaagtgaag agcagaaaag atgaatttgt ccaattgtgt agacgatata ctccctgccc 1980

ttccccctgc aaaaagaaaa aaagaaaaga aaaagaaaaa aatcccttgt tctcagtggt 2040

gcaggatgtt ggcttggggc aacagattga aaagacctac agactaagaa ggaaaagaag 2100

aagagatgac aaaccataac tgacaagaga ggcgtctgct gtctcatcac ataaaaggct 2160

tcacttttga ctgagggcag ctttgcaaaa tgagactttc taaatcaaac caggtgcaat 2220

tatttcttta ttttcttctc cagtggtcat tggggcagtg ttaatgctga aacatcatta 2280

cagattctgc tagcctgttc ttttaccact gacagctaga cacctagaaa ggaactgcaa 2340

taatatcaaa acaagtactg gttgactttc taattagaga gcatctgcaa caaaaagtca 2400

tttttctgga gtggaaaagc ttaaaaaaat tactgtgaat tgtttttgta cagttatcat 2460

gaaaagcttt tttttttatt ttttngccaa ccattgccaa tgtcaatcaa tcacagtatt 2520

agcctctgtt aatctattta ctgttgcttc catatacatt cttcaatgca tatgttgctc 2580

aaaggtggca agttgtcctg ggttctgtga gtcctgagat ggatttaatt cttgatgctg 2640

gtgctagaag taggtcttca aatatgggat tgttgtccca accctgtact gtactcccag 2700

tggccaaact tatttatgct gctaaatgaa agaaagaaaa aagcaaatta ttttttttat 2760

tttttttctg ctgtgacgtt ttagtcccag actgaattcc aaatttgctc tagtttggtt 2820

atggaaaaaa gactttttgc cactgaaact tgagccatct gtgcctctaa gaggctgaga 2880

atggaagagt ttcagataat aaagagtgaa gtttgcctgc aagtaaagaa ttgagagtgt 2940

gtgcaaagct tattttcttt tatctgggca aaaattaaaa cacattcctt ggaacagagc 3000

tattacttgc ctgttctgtg gagaaacttt tctttttgag ggctgtggtg aatggatgaa 3060

cgtacatcgt aaaactgaca aaatatttta aaaatatata aaacacaaaa ttaaaataaa 3120

gttgctggtc agtcttagtg ttttacagta tttgggaaaa caactgttac agttttattg 3180

ctctgagtaa ctgacaaagc agaaactatt cagtttttgt agtaaaggcg tcacatgcaa 3240

acaaacaaaa tgaatgaaac agtcaaatgg tttgcctcat tctccaagag ccacaactca 3300

agctgaactg tgaaagtggt ttaacactgt atcctaggcg atcttttttc ctccttctgt 3360

ttattttttt gnttgtttta tttatagtct gatttaaaac aatcagattc aagttggtta 3420

attttagtta tgtaacaacc tgacatgatg gaggaaaaca acctttaaag ggattgtgtc 3480

tatggtttga ttcacttaga aattttattt tcttataact taagtgcaat aaaatgtgtt 3540

ttttcatgtt 3550

<210>2

<211>3571

<212>DNA

<213>人

<400>2

ctcagcaggt caggacattt ggtaggggaa ggttgaaaga caaaagcagc aggccttggg 60

ttctcagcct tttaaaaact attattaaat atatattttt aaaatttagt ggttagagct 120

tttagtaatg tgcctgtatt acatgtagag agtattcgtc aaccaagagg agttttaaaa 180

tgtcaaaacc gggaaaacct actctaaacc atggcttggt tcctgttgat cttaaaagtg 240

caaaagagcc tctaccacat caaaccgtga tgaagatatt tagcattagc atcattgccc 300

aaggcctccc tttttgtcga agacggatga aaagaaagtt ggaccatggt tctgaggtcc 360

gctctttttc tttgggaaag aaaccatgca aagtctcaga atatacaagt accactgggc 420

ttgtaccatg ttcagcaaca ccaacaactt ttggggacct cagagcagcc aatggccaag 480

ggcaacaacg acgccgaatt acatctgtcc agccacctac aggcctccag gaatggctaa 540

aaatgtttca gagctggagt ggaccagaga aattgcttgc tttagatgaa ctcattgata 600

gttgtgaacc aacacaagta aaacatatga tgcaagtgat agaaccccag tttcaacgag 660

acttcatttc attgctccct aaagagttgg cactctatgt gctttcattc ctggaaccca 720

aagacctgct acaagcagct cagacatgtc gctactggag aattttggct gaagacaacc 780

ttctctggag agagaaatgc aaagaagagg ggattgatga accattgcac atcaagagaa 840

gaaaagtaat aaaaccaggt ttcatacaca gtccatggaa aagtgcatac atcagacagc 900

acagaattga tactaactgg aggcgaggag aactcaaatc tcctaaggtg ctgaaaggac 960

atgatgatca tgtgatcaca tgcttacagt tttgtggtaa ccgaatagtt agtggttctg 1020

atgacaacac tttaaaagtt tggtcagcag tcacaggcaa atgtctgaga acattagtgg 1080

gacatacagg tggagtatgg tcatcacaaa tgagagacaa catcatcatt agtggatcta 1140

cagatcggac actcaaagtg tggaatgcag agactggaga atgtatacac accttatatg 1200

ggcatacttc cactgtgcgt tgtatgcatc ttcatgaaaa aagagttgtt agcggttctc 1260

gagatgccac tcttagggtt tgggatattg agacaggcca gtgtttacat gttttgatgg 1320

gtcatgttgc agcagtccgc tgtgttcaat atgatggcag gagggttgtt agtggagcat 1380

atgattttat ggtaaaggtg tgggatccag agactgaaac ctgtctacac acgttgcagg 1440

ggcatactaa tagagtctat tcattacagt ttgatggtat ccatgtggtg agtggatctc 1500

ttgatacatc aatccgtgtt tgggatgtgg agacagggaa ttgcattcac acgttaacag 1560

ggcaccagtc gttaacaagt ggaatggaac tcaaagacaa tattcttgtc tctgggaatg 1620

cagattctac agttaaaatc tgggatatca aaacaggaca gtgtttacaa acattgcaag 1680

gtcccaacaa gcatcagagt gctgtgacct gtttacagtt caacaagaac tttgtaatta 1740

ccagctcaga tgatggaact gtaaaactat gggacttgaa aacgggtgaa tttattcgaa 1800

acctagtcac attggagagt ggggggagtg ggggagttgt gtggcggatc agagcctcaa 1860

acacaaagct ggtgtgtgca gttgggagtc ggaatgggac tgaagaaacc aagctgctgg 1920

tgctggactt tgatgtggac atgaagtgaa gagcagaaaa gatgaatttg tccaattgtg 1980

tagacgatat actccctgcc cttccccctg caaaaagaaa aaaagaaaag aaaaagaaaa 2040

aaatcccttg ttctcagtgg tgcaggatgt tggcttgggg caacagattg aaaagaccta 2100

cagactaaga aggaaaagaa gaagagatga caaaccataa ctgacaagag aggcgtctgc 2160

tgtctcatca cataaaaggc ttcacttttg actgagggca gctttgcaaa atgagacttt 2220

ctaaatcaaa ccaggtgcaa ttatttcttt attttcttct ccagtggtca ttggggcagt 2280

gttaatgctg aaacatcatt acagattctg ctagcctgtt cttttaccac tgacagctag 2340

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Ser Gly Pro Glu Lys Leu Leu Ala Leu Asp Glu Leu Ile Asp Ser Cys

100 105 110

Glu Pro Thr Gln Val Lys His Met Met Gln Val Ile Glu Pro Gln Phe

115 120 125

Gln Arg Asp Phe Ile Ser Leu Leu Pro Lys Glu Leu Ala Leu Tyr Val

130 135 140

Leu Ser Phe Leu Glu Pro Lys Asp Leu Leu Gln Ala Ala Gln Thr Cys

145 150 155 160

Arg Tyr Trp Arg Ile Leu Ala Glu Asp Asn Leu Leu Trp Arg Glu Lys

165 170 175

Cys Lys Glu Glu Gly Ile Asp Glu Pro Leu His Ile Lys Arg Arg Lys

180 185 190

Val Ile Lys Pro Gly Phe Ile His Ser Pro Trp Lys Ser Ala Tyr Ile

195 200 205

Arg Gln His Arg Ile Asp Thr Asn Trp Arg Arg Gly Glu Leu Lys Ser

210 215 220

Pro Lys Val Leu Lys Gly His Asp Asp His Val Ile Thr Cys Leu Gln

225 230 235 240

Phe Cys Gly Asn Arg Ile Val Ser Gly Ser Asp Asp Asn Thr Leu Lys

245 250 255

Val Trp Ser Ala Val Thr Gly Lys Cys Leu Arg Thr Leu Val Gly His

260 265 270

Thr Gly Gly Val Trp Ser Ser Gln Met Arg Asp Asn Ile Ile Ile Ser

275 280 285

Gly Ser Thr Asp Arg Thr Leu Lys Val Trp Asn Ala Glu Thr Gly Glu

290 295 300

Cys Ile His Thr Leu Tyr Gly His Thr Ser Thr Val Arg Cys Met His

305 310 315 320

Leu His Glu Lys Arg Val Val Ser Gly Ser Arg Asp Ala Thr Leu Arg

325 330 335

Val Trp Asp Ile Glu Thr Gly Gln Cys Leu His Val Leu Met Gly His

340 345 350

Val Ala Ala Val Arg Cys Val Gln Tyr Asp Gly Arg Arg Val Val Ser

355 360 365

Gly Ala Tyr Asp Phe Met Val Lys Val Trp Asp Pro Glu Thr Glu Thr

370 375 380

Cys Leu His Thr Leu Gln Gly His Thr Asn Arg Val Tyr Ser Leu Gln

385 390 395 400

Phe Asp Gly Ile His Val Val Ser Gly Ser Leu Asp Thr Ser Ile Arg

405 410 415

Val Trp Asp Val Glu Thr Gly Asn Cys Ile His Thr Leu Thr Gly His

420 425 430

Gln Ser Leu Thr Ser Gly Met Glu Leu Lys Asp Asn Ile Leu Val Ser

435 440 445

Gly Asn Ala Asp Ser Thr Val Lys Ile Trp Asp Ile Lys Thr Gly Gln

450 455 460

Cys Leu Gln Thr Leu Gln Gly Pro Asn Lys His Gln Ser Ala Val Thr

465 470 475 480

Cys Leu Gln Phe Asn Lys Asn Phe Val Ile Thr Ser Ser Asp Asp Gly

485 490 495

Thr Val Lys Leu Trp Asp Leu Lys Thr Gly Glu Phe Ile Arg Asn Leu

500 505 510

Val Thr Leu Glu Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Val Trp Arg Ile Arg

515 520 525

Ala Ser Asn Thr Lys Leu Val Cys Ala Val Gly Ser Arg Asn Gly Thr

530 535 540

Glu Glu Thr Lys Leu Leu Val Leu Asp Phe Asp Val Asp Met Lys

545 550 555

<210>10

<211>540

<212>PRT

<213>人

<400>10

Met Lys Arg Lys Leu Asp His Gly Ser Glu Val Arg Ser Phe Ser Leu

1 5 10 15

Gly Lys Lys Pro Cys Lys Val Ser Glu Tyr Thr Ser Thr Thr Gly Leu

20 25 30

Val Pro Cys Ser Ala Thr Pro Thr Thr Phe Gly Asp Leu Arg Ala Ala

35 40 45

Asn Gly Gln Gly Gln Gln Arg Arg Arg Ile Thr Ser Val Gln Pro Pro

50 55 60

Thr Gly Leu Gln Glu Trp Leu Lys Met Phe Gln Ser Trp Ser Gly Pro

65 70 75 80

Glu Lys Leu Leu Ala Leu Asp Glu Leu Ile Asp Ser Cys Glu Pro Thr

85 90 95

Gln Val Lys His Met Met Gln Val Ile Glu Pro Gln Phe Gln Arg Asp

100 105 110

Phe Ile Ser Leu Leu Pro Lys Glu Leu Ala Leu Tyr Val Leu Ser Phe

115 120 125

Leu Glu Pro Lys Asp Leu Leu Gln Ala Ala Gln Thr Cys Arg Tyr Trp

130 135 140

Arg Ile Leu Ala Glu Asp Asn Leu Leu Trp Arg Glu Lys Cys Lys Glu

145 150 155 160

Glu Gly Ile Asp Glu Pro Leu His Ile Lys Arg Arg Lys Val Ile Lys

165 170 175

Pro Gly Phe Ile His Ser Pro Trp Lys Ser Ala Tyr Ile Arg Gln His

180 185 190

Arg Ile Asp Thr Asn Trp Arg Arg Gly Glu Leu Lys Ser Pro Lys Val

195 200 205

Leu Lys Gly His Asp Asp His Val Ile Thr Cys Leu Gln Phe Cys Gly

210 215 220

Asn Arg Ile Val Ser Gly Ser Asp Asp Asn Thr Leu Lys Val Trp Ser

225 230 235 240

Ala Val Thr Gly Lys Cys Leu Arg Thr Leu Val Gly His Thr Gly Gly

245 250 255

Val Trp Ser Ser Gln Met Arg Asp Asn Ile Ile Ile Ser Gly Ser Thr

260 265 270

Asp Arg Thr Leu Lys Val Trp Asn Ala Glu Thr Gly Glu Cys Ile His

275 280 285

Thr Leu Tyr Gly His Thr Ser Thr Val Arg Cys Met His Leu His Glu

290 295 300

Lys Arg Val Val Ser Gly Ser Arg Asp Ala Thr Leu Arg Val Trp Asp

305 310 315 320

Ile Glu Thr Gly Gln Cys Leu His Val Leu Met Gly His Val Ala Ala

325 330 335

Val Arg Cys Val Gln Tyr Asp Gly Arg Arg Val Val Ser Gly Ala Tyr

340 345 350

Asp Phe Met Val Lys Val Trp Asp Pro Glu Thr Glu Thr Cys Leu His

355 360 365

Thr Leu Gln Gly His Thr Asn Arg Val Tyr Ser Leu Gln Phe Asp Gly

370 375 380

Ile His Val Val Ser Gly Ser Leu Asp Thr Ser Ile Arg Val Trp Asp

385 390 395 400

Val Glu Thr Gly Asn Cys Ile His Thr Leu Thr Gly His Gln Ser Leu

405 410 415

Thr Ser Gly Met Glu Leu Lys Asp Asn Ile Leu Val Ser Gly Asn Ala

420 425 430

Asp Ser Thr Val Lys Ile Trp Asp Ile Lys Thr Gly Gln Cys Leu Gln

435 440 445

Thr Leu Gln Gly Pro Asn Lys His Gln Ser Ala Val Thr Cys Leu Gln

450 455 460

Phe Asn Lys Asn Phe Val Ile Thr Ser Ser Asp Asp Gly Thr Val Lys

465 470 475 480

Leu Trp Asp Leu Lys Thr Gly Glu Phe Ile Arg Asn Leu Val Thr Leu

485 490 495

Glu Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Val Trp Arg Ile Arg Ala Ser Asn

500 505 510

Thr Lys Leu Val Cys Ala Val Gly Ser Arg Asn Gly Thr Glu Glu Thr

515 520 525

Lys Leu Leu Val Leu Asp Phe Asp Val Asp Met Lys

530 535 540

<210>11

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：

寡核苷酸引物

<400>11

cgggatccac catggatgat ggatcgatga cacc 34

<210>12

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：

寡核苷酸引物

<400>12

ggaattcctt aagggtatac agcatcaaag tcg 33

<210>13

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：

寡核苷酸引物

<400>13

tcacttcatg tccacatcaa agtcc 25

<210>14

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：

寡核苷酸引物

<400>14

ggtaattaca agttcttgtt gaactg 26

<210>15

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：

寡核苷酸引物

<400>15

ccctgcaacg tgtgtagaca gg 22

<210>16

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：

寡核苷酸引物

<400>16

ccagtctctg cattccacac tttg 24

<210>17

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：

寡核苷酸引物

<400>17

ctcagacagg tcaggacatt tgg 23

<210>18

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：

寡核苷酸引物

<400>18

ggaattccat gaaaagattg gaccatggtt ctg 33

<210>19

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：

寡核苷酸引物

<400>19

ggaattcctc acttcatgtc acatcaaagt ccag 34

<210>20

<211>1881

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：6myc标记的

人

<400>20

atggagcaaa agctcatttc tgaagaggac ttgaatgaaa tggagcaaaa gctcatttct 60

gaagaggact tgaatgaaat ggagcaaaag ctcatttctg aagaggactt gaatgaaatg 120

gagcaaaagc tcatttctga agaggacttg aatgaaatgg agcaaaagct catttctgaa 180

gaggacttga atgaaatgga gagcttgggc gacctcacca tggagcaaaa gctcatttct 240

gaagaggact tgaattccat gaaaagaaag ttggaccatg gttctgaggt ccgctctttt 300

tctttgggaa agaaaccatg caaagtctca gaatatacaa gtaccactgg gcttgtacca 360

tgttcagcaa caccaacaac ttttggggac ctcagagcag ccaatggcca agggcaacaa 420

cgacgccgaa ttacatctgt ccagccacct acaggcctcc aggaatggct aaaaatgttt 480

cagagctgga gtggaccaga gaaattgctt gctttagatg aactcattga tagttgtgaa 540

ccaacacaag taaaacatat gatgcaagtg atagaacccc agtttcaacg agacttcatt 600

tcattgctcc ctaaagagtt ggcactctat gtgctttcat tcctggaacc caaagacctg 660

ctacaagcag ctcagacatg tcgctactgg agaattttgg ctgaagacaa ccttctctgg 720

agagagaaat gcaaagaaga ggggattgat gaaccattgc acatcaagag aagaaaagta 780

ataaaaccag gtttcataca cagtccatgg aaaagtgcat acatcagaca gcacagaatt 840

gatactaact ggaggcgagg agaactcaaa tctcctaagg tgctgaaagg acatgatgat 900

catgtgatca catgcttaca gttttgtggt aaccgaatag ttagtggttc tgatgacaac 960

actttaaaag tttggtcagc agtcacaggc aaatgtctga gaacattagt gggacataca 1020

ggtggagtat ggtcatcaca aatgagggac aacatcatca ttagtggatc tacagatcgg 1080

acactcaaag tgtggaatgc agagactgga gaatgtatac acaccttata tgggcatact 1140

tccactgtgc gttgtatgca tcttcatgaa aaaagagttg ttagcggttc tcgagatgcc 1200

actcttaggg tttgggatat tgagacaggc cagtgtttac atgttttgat gggtcatgtt 1260

gcagcagtcc gctgtgttca atatgatggc aggagggttg ttagtggagc atatgatttt 1320

atggtaaagg tgtgggatcc agagactgaa acctgtctac acacgttgca ggggcatact 1380

aatagagtct attcattaca gtttgatggt atccatgtgg tgagtggatc tcttgataca 1440

tccatccgtg tttgggatgt ggagacaggg aattgcattc acacgttaac agggcaccag 1500

tcgttaacaa gtggaatgga actcaaagac aatattcttg tctctgggaa tgcagattct 1560

acagttaaaa tctgggatat caaaacagga cagtgtttac aaacattgca aggtcccaac 1620

aagcatcaga gtgctgtgac ctgtttacag ttcaacaaga actttgtaat taccagctca 1680

gatgatggaa ctgtaaaact atgggacttg aaaacgggtg aatttattcg aaacctagtc 1740

acattggaga gtggggggag tgggggagtt gtgtggcgga tcagagcctc aaacacaaag 1800

ctggtgtgtg cagttgggag tcggaatggg actgaagaaa ccaagctgct ggtgctggac 1860

tttgatgtgg acatgaagtg a 1881

<210>21

<211>626

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：6myc标记的

人

<400>21

Met Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Glu Met Glu Gln

1 5 10 15

Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Glu Met Glu Gln Lys Leu Ile

20 25 30

Ser Glu Glu Asp Leu Asn Glu Met Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu

35 40 45

Asp Leu Asn Glu Met Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn

50 55 60

Glu Met Glu Ser Leu Gly Asp Leu Thr Met Glu Gln Lys Leu Ile Ser

65 70 75 80

Glu Glu Asp Leu Asn Ser Met Lys Arg Lys Leu Asp His Gly Ser Glu

85 90 95

Val Arg Ser Phe Ser Leu Gly Lys Lys Pro Cys Lys Val Ser Glu Tyr

100 105 110

Thr Ser Thr Thr Gly Leu Val Pro Cys Ser Ala Thr Pro Thr Thr Phe

115 120 125

Gly Asp Leu Arg Ala Ala Asn Gly Gln Gly Gln Gln Arg Arg Arg Ile

130 135 140

Thr Ser Val Gln Pro Pro Thr Gly Leu Gln Glu Trp Leu Lys Met Phe

145 150 155 160

Gln Ser Trp Ser Gly Pro Glu Lys Leu Leu Ala Leu Asp Glu Leu Ile

165 170 175

Asp Ser Cys Glu Pro Thr Gln Val Lys His Met Met Gln Val Ile Glu

180 185 190

Pro Gln Phe Gln Arg Asp Phe Ile Ser Leu Leu Pro Lys Glu Leu Ala

195 200 205

Leu Tyr Val Leu Ser Phe Leu Glu Pro Lys Asp Leu Leu Gln Ala Ala

210 215 220

Gln Thr Cys Arg Tyr Trp Arg Ile Leu Ala Glu Asp Asn Leu Leu Trp

225 230 235 240

Arg Glu Lys Cys Lys Glu Glu Gly Ile Asp Glu Pro Leu His Ile Lys

245 250 255

Arg Arg Lys Val Ile Lys Pro Gly Phe Ile His Ser Pro Trp Lys Ser

260 265 270

Ala Tyr Ile Arg Gln His Arg Ile Asp Thr Asn Trp Arg Arg Gly Glu

275 280 285

Leu Lys Ser Pro Lys Val Leu Lys Gly His Asp Asp His Val Ile Thr

290 295 300

Cys Leu Gln Phe Cys Gly Asn Arg Ile Val Ser Gly Ser Asp Asp Asn

305 310 315 320

Thr Leu Lys Val Trp Ser Ala Val Thr Gly Lys Cys Leu Arg Thr Leu

325 330 335

Val Gly His Thr Gly Gly Val Trp Ser Ser Gln Met Arg Asp Asn Ile

340 345 350

Ile Ile Ser Gly Ser Thr Asp Arg Thr Leu Lys Val Trp Asn Ala Glu

355 360 365

Thr Gly Glu Cys Ile His Thr Leu Tyr Gly His Thr Ser Thr Val Arg

370 375 380

Cys Met His Leu His Glu Lys Arg Val Val Ser Gly Ser Arg Asp Ala

385 390 395 400

Thr Leu Arg Val Trp Asp Ile Glu Thr Gly Gln Cys Leu His Val Leu

405 410 415

Met Gly His Val Ala Ala Val Arg Cys Val Gln Tyr Asp Gly Arg Arg

420 425 430

Val Val Ser Gly Ala Tyr Asp Phe Met Val Lys Val Trp Asp Pro Glu

435 440 445

Thr Glu Thr Cys Leu His Thr Leu Gln Gly His Thr Asn Arg Val Tyr

450 455 460

Ser Leu Gln Phe Asp Gly Ile His Val Val Ser Gly Ser Leu Asp Thr

465 470 475 480

Ser Ile Arg Val Trp Asp Val Glu Thr Gly Asn Cys Ile His Thr Leu

485 490 495

Thr Gly His Gln Ser Leu Thr Ser Gly Met Glu Leu Lys Asp Asn Ile

500 505 510

Leu Val Ser Gly Asn Ala Asp Ser Thr Val Lys Ile Trp Asp Ile Lys

515 520 525

Thr Gly Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln Gly Pro Asn Lys His Gln Ser

530 535 540

Ala Val Thr Cys Leu Gln Phe Asn Lys Asn Phe Val Ile Thr Ser Ser

545 550 555 560

Asp Asp Gly Thr Val Lys Leu Trp Asp Leu Lys Thr Gly Glu Phe Ile

565 570 575

Arg Asn Leu Val Thr Leu Glu Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Val Trp

580 585 590

Arg Ile Arg Ala Ser Asn Thr Lys Leu Val Cys Ala Val Gly Ser Arg

595 600 605

Asn Gly Thr Glu Glu Thr Lys Leu Leu Val Leu Asp Phe Asp Val Asp

610 615 620

Met Lys

625

<210>22

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：

寡核苷酸引物

<400>22

gggtacccct cattattccc tcgagttctt c 31

<210>23

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：

寡核苷酸引物

<400>23

ggaattcctt catgtccaca tcaaagtcc 29

<210>24

<211>2010

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：V5HIS标记的

人

<400>24

atgtgtgtcc cgagaagcgg tttgatactg agctgcattt gcctttactg tggagttttg 60

ttgccggttc tgctccctaa tcttcctttt ctgacgtgcc tgagcatgtc cacattagaa 120

tctgtgacat acctacctga aaaaggttta tattgtcaga gactgccaag cagccggaca 180

cacgggggca cagaatcact gaaggggaaa aatacagaaa atatgggttt ctacggcaca 240

ttaaaaatga ttttttacaa aatgaaaaga aagttggacc atggttctga ggtccgctct 300

ttttctttgg gaaagaaacc atgcaaagtc tcagaatata caagtaccac tgggcttgta 360

ccatgttcag caacaccaac aacttttggg gacctcagag cagccaatgg ccaagggcaa 420

caacgacgcc gaattacatc tgtccagcca cctacaggcc tccaggaatg gctaaaaatg 480

tttcagagct ggagtggacc agagaaattg cttgctttag atgaactcat tgatagttgt 540

gaaccaacac aagtaaaaca tatgatgcaa gtgatagaac cccagtttca acgagacttc 600

atttcattgc tccctaaaga gttggcactc tatgtgcttt cattcctgga acccaaagac 660

ctgctacaag cagctcagac atgtcgctac tggagaattt tggctgaaga caaccttctc 720

tggagagaga aatgcaaaga agaggggatt gatgaaccat tgcacatcaa gagaagaaaa 780

gtaataaaac caggtttcat acacagtcca tggaaaagtg catacatcag acagcacaga 840

attgatacta actggaggcg aggagaactc aaatctccta aggtgctgaa aggacatgat 900

gatcatgtga tcacatgctt acagttttgt ggtaaccgaa tagttagtgg ttctgatgac 960

aacactttaa aagtttggtc agcagtcaca ggcaaatgtc tgagaacatt agtgggacat 1020

acaggtggag tatggtcatc acaaatgaga gacaacatca tcattagtgg atctacagat 1080

cggacactca aagtgtggaa tgcagagact ggagaatgta tacacacctt atatgggcat 1140

acttccactg tgcgttgtat gcatcttcat gaaaaaagag ttgttagcgg ttctcgagat 1200

gccactctta gggtttggga tattgagaca ggccagtgtt tacatgtttt gatgggtcat 1260

gttgcagcag tccgctgtgt tcaatatgat ggcaggaggg ttgttagtgg agcatatgat 1320

tttatggtaa aggtgtggga tccagagact gaaacctgtc tacacacgtt gcaggggcat 1380

actaatagag tctattcatt acagtttgat ggtatccatg tggtgagtgg atctcttgat 1440

acatcaatcc gtgtttggga tgtggagaca gggaattgca ttcacacgtt aacagggcac 1500

cagtcgttaa caagtggaat ggaactcaaa gacaatattc ttgtctctgg gaatgcagat 1560

tctacagtta aaatctggga tatcaaaaca ggacagtgtt tacaaacatt gcaaggtccc 1620

aacaagcatc agagtgctgt gacctgttta cagttcaaca agaactttgt aattaccagc 1680

tcagatgatg gaactgtaaa actatgggac ttgaaaacgg gtgaatttat tcgaaaccta 1740

gtcacattgg agagtggggg gagtggggga gttgtgtggc ggatcagagc ctcaaacaca 1800

aagctggtgt gtgcagttgg gagtcggaat gggactgaag aaaccaagct gctggtgctg 1860

gactttgatg tggacatgaa ggaattctgc agatatccag cacagtggcg gccgctcgag 1920

tctagagggc ccttcgaagg taagcctatc cctaaccctc tcctcggtct cgattctacg 1980

cgtaccggtc atcatcacca tcaccattga 2010

<210>25

<211>669

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：V5HIS标记的

人

<400>25

Met Cys Val Pro Arg Ser Gly Leu Ile Leu Ser Cys Ile Cys Leu Tyr

1 5 10 15

Cys Gly Val Leu Leu Pro Val Leu Leu Pro Asn Leu Pro Phe Leu Thr

20 25 30

Cys Leu Ser Met Ser Thr Leu Glu Ser Val Thr Tyr Leu Pro Glu Lys

35 40 45

Gly Leu Tyr Cys Gln Arg Leu Pro Ser Ser Arg Thr His Gly Gly Thr

50 55 60

Glu Ser Leu Lys Gly Lys Asn Thr Glu Asn Met Gly Phe Tyr Gly Thr

65 70 75 80

Leu Lys Met Ile Phe Tyr Lys Met Lys Arg Lys Leu Asp His Gly Ser

85 90 95

Glu Val Arg Ser Phe Ser Leu Gly Lys Lys Pro Cys Lys Val Ser Glu

100 105 110

Tyr Thr Ser Thr Thr Gly Leu Val Pro Cys Ser Ala Thr Pro Thr Thr

115 120 125

Phe Gly Asp Leu Arg Ala Ala Asn Gly Gln Gly Gln Gln Arg Arg Arg

130 135 140

Ile Thr Ser Val Gln Pro Pro Thr Gly Leu Gln Glu Trp Leu Lys Met

145 150 155 160

Phe Gln Ser Trp Ser Gly Pro Glu Lys Leu Leu Ala Leu Asp Glu Leu

165 170 175

Ile Asp Ser Cys Glu Pro Thr Gln Val Lys His Met Met Gln Val Ile

180 185 190

Glu Pro Gln Phe Gln Arg Asp Phe Ile Ser Leu Leu Pro Lys Glu Leu

195 200 205

Ala Leu Tyr Val Leu Ser Phe Leu Glu Pro Lys Asp Leu Leu Gln Ala

210 215 220

Ala Gln Thr Cys Arg Tyr Trp Arg Ile Leu Ala Glu Asp Asn Leu Leu

225 230 235 240

Trp Arg Glu Lys Cys Lys Glu Glu Gly Ile Asp Glu Pro Leu His Ile

245 250 255

Lys Arg Arg Lys Val Ile Lys Pro Gly Phe Ile His Ser Pro Trp Lys

260 265 270

Ser Ala Tyr Ile Arg Gln His Arg Ile Asp Thr Asn Trp Arg Arg Gly

275 280 285

Glu Leu Lys Ser Pro Lys Val Leu Lys Gly His Asp Asp His Val Ile

290 295 300

Thr Cys Leu Gln Phe Cys Gly Asn Arg Ile Val Ser Gly Ser Asp Asp

305 310 315 320

Asn Thr Leu Lys Val Trp Ser Ala Val Thr Gly Lys Cys Leu Arg Thr

325 330 335

Leu Val Gly His Thr Gly Gly Val Trp Ser Ser Gln Met Arg Asp Asn

340 345 350

Ile Ile Ile Ser Gly Ser Thr Asp Arg Thr Leu Lys Val Trp Asn Ala

355 360 365

Glu Thr Gly Glu Cys Ile His Thr Leu Tyr Gly His Thr Ser Thr Val

370 375 380

Arg Cys Met His Leu His Glu Lys Arg Val Val Ser Gly Ser Arg Asp

385 390 395 400

Ala Thr Leu Arg Val Trp Asp Ile Glu Thr Gly Gln Cys Leu His Val

405 410 415

Leu Met Gly His Val Ala Ala Val Arg Cys Val Gln Tyr Asp Gly Arg

420 425 430

Arg Val Val Ser Gly Ala Tyr Asp Phe Met Val Lys Val Trp Asp Pro

435 440 445

Glu Thr Glu Thr Cys Leu His Thr Leu Gln Gly His Thr Asn Arg Val

450 455 460

Tyr Ser Leu Gln Phe Asp Gly Ile His Val Val Ser Gly Ser Leu Asp

465 470 475 480

Thr Ser Ile Arg Val Trp Asp Val Glu Thr Gly Asn Cys Ile His Thr

485 490 495

Leu Thr Gly His Gln Ser Leu Thr Ser Gly Met Glu Leu Lys Asp Asn

500 505 510

Ile Leu Val Ser Gly Asn Ala Asp Ser Thr Val Lys Ile Trp Asp Ile

515 520 525

Lys Thr Gly Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln Gly Pro Asn Lys His Gln

530 535 540

Ser Ala Val Thr Cys Leu Gln Phe Asn Lys Asn Phe Val Ile Thr Ser

545 550 555 560

Ser Asp Asp Gly Thr Val Lys Leu Trp Asp Leu Lys Thr Gly Glu Phe

565 570 575

Ile Arg Asn Leu Val Thr Leu Glu Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Val

580 585 590

Trp Arg Ile Arg Ala Ser Asn Thr Lys Leu Val Cys Ala Val Gly Ser

595 600 605

Arg Asn Gly Thr Glu Glu Thr Lys Leu Leu Val Leu Asp Phe Asp Val

610 615 620

Asp Met Lys Glu Phe Cys Arg Tyr Pro Ala Gln Trp Arg Pro Leu Glu

625 630 635 640

Ser Arg Gly Pro Phe Glu Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly

645 650 655

Leu Asp Ser Thr Arg Thr Gly His His His His His His

660 665

<210>26

<211>2001

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：MYCHIS标记的

人

<400>26

atgtgtgtcc cgagaagcgg tttgatactg agctgcattt gcctttactg tggagttttg 60

ttgccggttc tgctccctaa tcttcctttt ctgacgtgcc tgagcatgtc cacattagaa 120

tctgtgacat acctacctga aaaaggttta tattgtcaga gactgccaag cagccggaca 180

cacgggggca cagaatcact gaaggggaaa aatacagaaa atatgggttt ctacggcaca 240

ttaaaaatga ttttttacaa aatgaaaaga aagttggacc atggttctga ggtccgctct 300

ttttctttgg gaaagaaacc atgcaaagtc tcagaatata caagtaccac tgggcttgta 360

ccatgttcag caacaccaac aacttttggg gacctcagag cagccaatgg ccaagggcaa 420

caacgacgcc gaattacatc tgtccagcca cctacaggcc tccaggaatg gctaaaaatg 480

tttcagagct ggagtggacc agagaaattg cttgctttag atgaactcat tgatagttgt 540

gaaccaacac aagtaaaaca tatgatgcaa gtgatagaac cccagtttca acgagacttc 600

atttcattgc tccctaaaga gttggcactc tatgtgcttt cattcctgga acccaaagac 660

ctgctacaag cagctcagac atgtcgctac tggagaattt tggctgaaga caaccttctc 720

tggagagaga aatgcaaaga agaggggatt gatgaaccat tgcacatcaa gagaagaaaa 780

gtaataaaac caggtttcat acacagtcca tggaaaagtg catacatcag acagcacaga 840

attgatacta actggaggcg aggagaactc aaatctccta aggtgctgaa aggacatgat 900

gatcatgtga tcacatgctt acagttttgt ggtaaccgaa tagttagtgg ttctgatgac 960

aacactttaa aagtttggtc agcagtcaca ggcaaatgtc tgagaacatt agtgggacat 1020

acaggtggag tatggtcatc acaaatgaga gacaacatca tcattagtgg atctacagat 1080

cggacactca aagtgtggaa tgcagagact ggagaatgta tacacacctt atatgggcat 1140

acttccactg tgcgttgtat gcatcttcat gaaaaaagag ttgttagcgg ttctcgagat 1200

gccactctta gggtttggga tattgagaca ggccagtgtt tacatgtttt gatgggtcat 1260

gttgcagcag tccgctgtgt tcaatatgat ggcaggaggg ttgttagtgg agcatatgat 1320

tttatggtaa aggtgtggga tccagagact gaaacctgtc tacacacgtt gcaggggcat 1380

actaatagag tctattcatt acagtttgat ggtatccatg tggtgagtgg atctcttgat 1440

acatcaatcc gtgtttggga tgtggagaca gggaattgca ttcacacgtt aacagggcac 1500

cagtcgttaa caagtggaat ggaactcaaa gacaatattc ttgtctctgg gaatgcagat 1560

tctacagtta aaatctggga tatcaaaaca ggacagtgtt tacaaacatt gcaaggtccc 1620

aacaagcatc agagtgctgt gacctgttta cagttcaaca agaactttgt aattaccagc 1680

tcagatgatg gaactgtaaa actatgggac ttgaaaacgg gtgaatttat tcgaaaccta 1740

gtcacattgg agagtggggg gagtggggga gttgtgtggc ggatcagagc ctcaaacaca 1800

aagctggtgt gtgcagttgg gagtcggaat gggactgaag aaaccaagct gctggtgctg 1860

gactttgatg tggacatgaa ggaattctgc agatatccag cacagtggcg gccgctcgag 1920

tctagagggc ccttcgaaca aaaactcatc tcagaagagg atctgaatat gcataccggt 1980

catcatcacc atcaccattg a 2001

<210>27

<211>666

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：MYCHIS标记的

人

<400>27

Met Cys Val Pro Arg Ser Gly Leu Ile Leu Ser Cys Ile Cys Leu Tyr

1 5 10 15

Cys Gly Val Leu Leu Pro Val Leu Leu Pro Asn Leu Pro Phe Leu Thr

20 25 30

Cys Leu Ser Met Ser Thr Leu Glu Ser Val Thr Tyr Leu Pro Glu Lys

35 40 45

Gly Leu Tyr Cys Gln Arg Leu Pro Ser Ser Arg Thr His Gly Gly Thr

50 55 60

Glu Ser Leu Lys Gly Lys Asn Thr Glu Asn Met Gly Phe Tyr Gly Thr

65 70 75 80

Leu Lys Met Ile Phe Tyr Lys Met Lys Arg Lys Leu Asp His Gly Ser

85 90 95

Glu Val Arg Ser Phe Ser Leu Gly Lys Lys Pro Cys Lys Val Ser Glu

100 105 110

Tyr Thr Ser Thr Thr Gly Leu Val Pro Cys Ser Ala Thr Pro Thr Thr

115 120 125

Phe Gly Asp Leu Arg Ala Ala Asn Gly Gln Gly Gln Gln Arg Arg Arg

130 135 140

Ile Thr Ser Val Gln Pro Pro Thr Gly Leu Gln Glu Trp Leu Lys Met

145 150 155 160

Phe Gln Ser Trp Ser Gly Pro Glu Lys Leu Leu Ala Leu Asp Glu Leu

165 170 175

Ile Asp Ser Cys Glu Pro Thr Gln Val Lys His Met Met Gln Val Ile

180 185 190

Glu Pro Gln Phe Gln Arg Asp Phe Ile Ser Leu Leu Pro Lys Glu Leu

195 200 205

Ala Leu Tyr Val Leu Ser Phe Leu Glu Pro Lys Asp Leu Leu Gln Ala

210 215 220

Ala Gln Thr Cys Arg Tyr Trp Arg Ile Leu Ala Glu Asp Asn Leu Leu

225 230 235 240

Trp Arg Glu Lys Cys Lys Glu Glu Gly Ile Asp Glu Pro Leu His Ile

245 250 255

Lys Arg Arg Lys Val Ile Lys Pro Gly Phe Ile His Ser Pro Trp Lys

260 265 270

Ser Ala Tyr Ile Arg Gln His Arg Ile Asp Thr Asn Trp Arg Arg Gly

275 280 285

Glu Leu Lys Ser Pro Lys Val Leu Lys Gly His Asp Asp His Val Ile

290 295 300

Thr Cys Leu Gln Phe Cys Gly Asn Arg Ile Val Ser Gly Ser Asp Asp

305 310 315 320

Asn Thr Leu Lys Val Trp Ser Ala Val Thr Gly Lys Cys Leu Arg Thr

325 330 335

Leu Val Gly His Thr Gly Gly Val Trp Ser Ser Gln Met Arg Asp Asn

340 345 350

Ile Ile Ile Ser Gly Ser Thr Asp Arg Thr Leu Lys Val Trp Asn Ala

355 360 365

Glu Thr Gly Glu Cys Ile His Thr Leu Tyr Gly His Thr Ser Thr Val

370 375 380

Arg Cys Met His Leu His Glu Lys Arg Val Val Ser Gly Ser Arg Asp

385 390 395 400

Ala Thr Leu Arg Val Trp Asp Ile Glu Thr Gly Gln Cys Leu His Val

405 410 415

Leu Met Gly His Val Ala Ala Val Arg Cys Val Gln Tyr Asp Gly Arg

420 425 430

Arg Val Val Ser Gly Ala Tyr Asp Phe Met Val Lys Val Trp Asp Pro

435 440 445

Glu Thr Glu Thr Cys Leu His Thr Leu Gln Gly His Thr Asn Arg Val

450 455 460

Tyr Ser Leu Gln Phe Asp Gly Ile His Val Val Ser Gly Ser Leu Asp

465 470 475 480

Thr Ser Ile Arg Val Trp Asp Val Glu Thr Gly Asn Cys Ile His Thr

485 490 495

Leu Thr Gly His Gln Ser Leu Thr Ser Gly Met Glu Leu Lys Asp Asn

500 505 510

Ile Leu Val Ser Gly Asn Ala Asp Ser Thr Val Lys Ile Trp Asp Ile

515 520 525

Lys Thr Gly Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln Gly Pro Asn Lys His Gln

530 535 540

Ser Ala Val Thr Cys Leu Gln Phe Asn Lys Asn Phe Val Ile Thr Ser

545 550 555 560

Ser Asp Asp Gly Thr Val Lys Leu Trp Asp Leu Lys Thr Gly Glu Phe

565 570 575

Ile Arg Asn Leu Val Thr Leu Glu Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Val

580 585 590

Trp Arg Ile Arg Ala Ser Asn Thr Lys Leu Val Cys Ala Val Gly Ser

595 600 605

Arg Asn Gly Thr Glu Glu Thr Lys Leu Leu Val Leu Asp Phe Asp Val

610 615 620

Asp Met Lys Glu Phe Cys Arg Tyr Pro Ala Gln Trp Arg Pro Leu Glu

625 630 635 640

Ser Arg Gly Pro Phe Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn

645 650 655

Met His Thr Gly His His His His His His

660 665

Claims

1.一种分离的核酸分子，其包含的多核苷酸编码能改变Aβ加工活性的蛋白，其具有与选自下列各组的序列至少有95％相同的序列：

(a) 编码具有sel-10生物活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽具有选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQID NO：6及SEQ ID NO：7的完整氨基酸序列；

(b) 编码具有sel-10生物活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽具有选自SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的完整氨基酸序列；和

(c) 与(a)或(b)中的全长核苷酸序列互补的核苷酸序列。

2.权利要求1的核酸分子，其中所述的1(a)多核苷酸编码具有SEQ ID NO：3的完整氨基酸序列的人sel-10多肽。

3.权利要求2的核酸分子，其中所述的1(a)多核苷酸分子包含SEQ ID NO：1的残基45-1928的核苷酸序列。

4.权利要求1的核酸分子，其中所述的1(a)多核苷酸编码具有SEQ ID NO：4的完整氨基酸序列的人sel-10多肽。

5.权利要求4的核酸分子，其中所述的1(a)多核苷酸分子包含SEQ ID NO：1的残基150-1928的核苷酸序列。

6.权利要求1的核酸分子，其中所述的1(a)多核苷酸编码具有SEQ ID NO：5的完整氨基酸序列的人sel-10多肽。

7.权利要求6的核酸分子，其中所述的1(a)多核苷酸分子包含SEQ ID NO：1的残基267-1928的核苷酸序列。

8.权利要求1的核酸分子，其中所述的1(a)多核苷酸编码具有SEQ ID NO：6的完整氨基酸序列的人sel-10多肽。

9.权利要求8的核酸分子，其中所述的1(a)多核苷酸分子包含SEQ ID NO：1的残基291-1928的核苷酸序列。

10.权利要求1的核酸分子，其中所述的1(a)多核苷酸编码具有SEQ ID NO：7的完整氨基酸序列的人sel-10多肽。

11.权利要求10的核酸分子，其中所述的1(a)多核苷酸分子包含SEQ ID NO：1的残基306-1928的核苷酸序列。

12.权利要求1的核酸分子，其中所述的1(b)多核苷酸编码具有SEQ ID NO：8的完整氨基酸序列的人sel-10多肽。

13.权利要求12的核酸分子，其中所述的1(b)多核苷酸分子包含SEQ ID NO：2的残基180-1949的核苷酸序列。

14.权利要求1的核酸分子，其中所述的1(b)多核苷酸编码具有SEQ ID NO：9的完整氨基酸序列的人sel-10多肽。

15.权利要求14的核酸分子，其中所述的1(b)多核苷酸分子包含SEQ ID NO：2的残基270-1949的核苷酸序列。

16.一种分离的核酸分子，其包含在严格的条件下可同具有权利要求1的(a)、(b)或(c)中所述的核苷酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸，其中所述严格杂交条件包括在6×SSC/0.1％SDS中在42℃下过夜孵育2.5小时，然后在1×SSC和0.1％SDS中65℃下洗涤；其中所述分离的核酸分子编码具有sel-10生物活性的多肽，或者是编码具有sel-10生物活性的多肽之分离的核酸之互补物。

17.一种包含权利要求1的核酸分子的载体。

18.权利要求17的载体，其中为了表达sel-10多肽，所述的权利要求1的核酸分子有效连接到启动子上。

19.一种包含权利要求17的载体的宿主细胞。

20.权利要求19的宿主细胞，其中所述的宿主是真核生物宿主。

21.一种获得sel-10多肽的方法，包括培养权利要求20的宿主细胞并分离所述的sel-10多肽。

22.一种分离的sel-10多肽，其具有

(a) 选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的氨基酸序列；或

(b) 选自SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的氨基酸序列。

23.一种可与权利要求22的sel-10多肽特异性结合的分离的抗体。

24.一种具有改变了的Aβ加工的、表达权利要求1之sel-10核酸分子中的任何一个的细胞系。

25.权利要求24的细胞系，其中所述的Aβ加工得到提高。

26.权利要求24的细胞系，其中所述的Aβ加工得到降低。

27.权利要求24的细胞系，其中所述的细胞系是HEK293细胞系。

28.权利要求24的细胞系，其中所述的细胞系是表达选自如下的sel-10分离的多肽之任一项的HEK293细胞：SEQ ID NO：3，SEQ IDNO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：27。

29.权利要求27的细胞，其中所述细胞系是表达选自如下多肽的HEK293细胞：SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：27。