JP2003514570A - 表面上においてｐｎａ−および／またはｄｎａ−オリゴマーを用いたオリゴマー配列 - Google Patents

表面上においてｐｎａ−および／またはｄｎａ−オリゴマーを用いたオリゴマー配列

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JP2003514570A
JP2003514570A JP2001539907A JP2001539907A JP2003514570A JP 2003514570 A JP2003514570 A JP 2003514570A JP 2001539907 A JP2001539907 A JP 2001539907A JP 2001539907 A JP2001539907 A JP 2001539907A JP 2003514570 A JP2003514570 A JP 2003514570A
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ベルリン，クルト
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エピゲノミクス アーゲー
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    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips

Abstract

(57)【要約】 本発明は、表面上にＰＮＡ（ペプチドヌクレイン酸）および／またはＤＮＡオリゴマーを用いたオリゴマー配列に関する。 【解決手段】 表面にＰＮＡ（ペプチドヌクレイン酸）−および／またはＤＮＡ−オリゴマーを用いたオリゴマー配列であって、各オリゴマー配列は、それぞれ６から２０個のモノマーあるいは核塩基からなるオリゴマーを含み、それぞれが少なくとも一般式DDCGDD、一般式DDTGDD、一般式HHCGHHまたは一般式HHCAHHの配列を含み、前記Hはアデニン（A）、シトシン（C）、または、チミン（T）の塩基のいずれか一つを意味し、前記Dはアデニン（A）、グアニン（G）、または、チミン（T）の塩基のいずれか一つを示し、前記表面上におけるオリゴマーの位置がオリゴマーの配列と関連するオリゴマー配列である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、表面上にＰＮＡ(ペプチドヌクレイン酸)−および／またはＤＮＡ−
オリゴマーを用いたオリゴマー配列に関する。
【０００２】 近年の分子生物学における方法の開発により、詳しく研究されている監視レベ
ルとして、遺伝子自体、これらの遺伝子のＲＮＡへの翻訳、及びその結果生じる
蛋白質がある。 個体が発達する間に、どの遺伝子が発現されているか、特定の細胞や組織のあ
る遺伝子がどう活性化され、あるいは抑制されているかは、遺伝子あるいはゲノ
ムのメチル化の程度や特性と相関している。 この意味で、病因となる状態は、個々の遺伝子あるいはゲノムのメチル化様式
の変化に反映されているという仮説は説得力を持っている。
【０００３】 ５−メチルシトシンは有核細胞のＤＮＡの中で、共有結合で修飾された塩基と
しては最も多数存在する。それは、例えば、転写の制御、ゲノム・インプリンテ
ィングや腫瘍発生に関与している。それゆえ遺伝情報の現状としての５−メチル
シトシンの把握には、多大の関心が寄せられている。
【０００４】 しかしながら、５−メチルシトシンの位置はシーケンシング（配列読み取り）
によっては同定できず、5−メチルシトシンはハイブリダイゼーションに際して
はシトシンと同じ塩基対形成様式を示す。従って、どのシトシンが5−メチルシ
トシンとなっているかというエピジェネティックな情報はPCR増幅では完全に失
われてしまう。
【０００５】 ゲノム塩基シトシンの５’−メチルシトシンへの変異は今日まで最も重要で研
究されてきたエピジェネティックなパラメーターである。それにもかかわらず今
日まで細胞や個体の全ての遺伝子型をつきとめるという研究方法では、大規模に
エピゲノタイプ的な情報そのものを発生し、しかも解析することのできる一定し
た手がかりは見いだされていない。
【０００６】 ＤＮＡ上の5−メチルシトシンについて、比較的新しく、と同時に、最も頻繁
に応用されている検出方法は、重亜硫酸塩がシトシンに特異的に反応することに
基づいている。 シトシンは、アルカリ加水分解の直後にウラシルに置換されるが、ウラシルは
、塩基対をつくる際の様式としてはチミジンに相当する。これに対して、5−メ
チルシトシンは、このような条件下では、修飾されない。このため、元のＤＮＡ
が置換されても、ハイブリダイゼーション様式としては本来シトシンと区別され
得ないメチルシトシンは、「従来」の分子生物学的技術、例えば増幅とハイブリ
ダイゼーションあるいは配列読み取りによって、本来の、そして単一のシトシン
として検出される。 これらの技法は全て、塩基対形成に基づいており、今日広く活用されている。
この技術の感度面での水準は次の方法で定義される。 標的のＤＮＡをアガロース・マトリックスに包入し、こうしてＤＮＡの拡散と
再結合を防止する（重亜硫酸塩は一本鎖ＤＮＡとのみ反応する）。そして全ての
沈殿と洗浄処理を高速透析によって行う(Olek, A.ら、Nucl. Acids. Res., 24,
5064−5066)。この方法によって、ひとつひとつの細胞を調べることができ、こ
の手法の潜在的能力を評価できる。 事実、現在までのところ、約3000塩基対長ぐらいまでの個別領域しか調べられ
ておらず、何千という細胞を全体的にメチル化分析することは可能ではなかった
。また、この手法は微量の試料中の小さい断片について信頼できる分析結果を出
すことができなかった。これは、マトリックスによる拡散防止にもかかわらず、
喪失がおきるためである。
【０００７】 5−メチルシトシンを検出するという、一般的な課題の解決法に関する考察が
次のレビューに掲載されている：Rein, T., DePamphilis M. L., Zorbas, H., N
ucleic Acid Res., 26, 2255（1998）。
【０００８】 基本的には、表面上にオリゴマー配列を行う多くの様々な方法が考えられる。
即ち、
【０００９】 １．従来の方法では、試験管内あるいは特殊な自動合成装置内で多数かつ比較
的大きな分量を占める全てのオリゴマーは、その後個々のピペットで担体上に取
り出される。一般的には自動化された高精密なマイクロピペットロボットが使用
される。この利点のため、この方法は最適化された標準方法や標準器具に広く応
用されている。これにより非常に純粋なオリゴマーを用いて定性の高いＤＮＡ配
列の製造が可能となり、配列を用いて達成される検出感度や検出信頼性に非常に
明確な影響を及ぼすものである。この方法の重大な欠点は、この方法が非常に複
雑であり、従って高価であることである。これは特に大量に単一のオリゴマーを
合成するのに適している。
【００１０】 ２．オリゴマーは、ピペット操作によってその微量が直接基盤上に合成される
。そこで指定したオリゴマー鎖はそれぞれの格子の中点上で核塩基毎に形成され
る。ピペット操作には、１）の工程と同じように特殊なマイクロピペットロボッ
トまたは、例えば配列されたそれぞれの中点に一つの合成成分を供給する挿管を
有する装置を用いる（EP−A ０９１５８９７）。化学的な合成方法は自動合成装
置における従来通りのオリゴマー合成の場合と基本的に同じである。異なる点は
、全てのオリゴマーを個別かつ同時に、単一の自動装置によって直接予め備えた
場所に作成する事である。方法１）によるオリゴマー合成の作業段階とは分けて
考えられており、今やマイクロピペット操作は単独の作業段階として考えられて
いる。器具や手作業に係る経費は方法１）と比べ著しく低くなっている。
【００１１】 ３．オリゴマーは、方法２）の様に直接基盤上に合成され、正確な格子の中点
に正確な核塩基を直截に結合するには、連続的で狙いの正確なピペット操作を行
う代わりに、完全に平行的な技術である、半導体製造から派生したフォトリソグ
ラフ技術を用いる。この方法は、一定波長の光によってオリゴヌクレオチドの５
’−ＯＨ保護基を直接離脱できるという事に基づく。 適切な局所照射試料によってオリゴヌクレオチドの端部とそれぞれの格子の中
点との反応が可能となり、次にヌクレオチド成分を新たに結合する。ヌクレオチ
ド成分溶液で配列表面を完全に湿潤することによって、前もって光をあてた場所
だけに核塩基が結合し、未露出の全ての場所は変化しない。 マイクロ写真技術の黒白マスクを基盤と光源との間に設けて全ての格子部分を
覆い反応が起こらないようにすることによって、局部的に露出した試料を製作す
る。 オリゴマー鎖の延長は核塩基を中心に全ての格子の中点上で発現し、その後は
次のようになる。 即ち、第１のマスク操作によって、４種の可能である核塩基の内１つ目（例え
ばＣ）により拡張されるべき、それぞれの格子の中点が正確に露光される。その
後、配列は適切なヌクレオチド成分の溶液で湿潤され、照射された中点だけがこ
の塩基により拡張される。新たに付帯したヌクレオチド成分は全てに未だ保護基
が付いているのでその保護基が次の照射によって分解するまでは、次の工程にお
いても更なる反応は生じない。 この反応工程の後で配列は洗浄される。第２のマスクを使用することによって
、４つの可能である核塩基の内２つ目（例えばＴ）により拡張されるべき、それ
ぞれの正確な格子が照射される。その後、配列は再度適切なヌクレオチド成分溶
液で湿潤され、さらに照射箇所はこの塩基により延長される。残る二つの核塩基
（ＧとＡ）を同様に処理する。全てのオリゴマーを核塩基1つ分延長させるため
には４段階の照射と４枚の写真マスクが必要である。
【００１２】 この方法は光軸平行度が高いので非常に早く加工処理ができ、しかも効率的で
あり、それは高精密性によるものであるが、これはフォトリソグラフによって達
成することができ、非常に高い格子密度を作り上げるために良く適合している。
【００１３】 オリゴマー配列製造における技術水準についての展望に関しては1999年1月にN
ature Geneticsの臨時増刊として刊行されている(Nature Genetics Supplement,
Volume 21,January 1999)ので、その引用文献を借用する。
【００１４】 オリゴマー配列並びにフォトリソグラフのマスクデザインの応用に関する一般
的な特許には、例えばUS−A 5,837,832, US−A 5,856,174, WO−A 98/27430 お
よび US−A 5,856,101 がある。物質特許と製法特許が幾つか存在し、感光性保
護基の使用をヌクレオチドだけに制限している。例としてWO−A98/39348とUS−A
5,763,599が挙げられる。
【００１５】 ＤＮＡを定着させる為に様々な方法が存在する。最も良く知られている方法は
、ビオチンを用いて機能化されたＤＮＡをストレプタビディンで覆われた表面に
固相化することである。このシステムの結合は化学的共有結合ではないが、その
結合力は化学的共有結合に合致している。標的ＤＮＡが、化学的に処理した表面
と共有結合を結ぶことができる為には、標的ＤＮＡに相応の官能性が必要となる
。ＤＮＡ自体には適応した官能性はない。標的ＤＮＡに適応した官能性を取り入
れた様々な変異体が存在する。即ち二つの容易に操作し得る官能化は脂肪性第一
アミンとチオールである。 このようなアミンは定量的にＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルによって
置換され、そしてチオールは適応した条件下で定量的にアルキルヨウ化物と反応
する。ここでの難しさはＤＮＡの中にそのような官能性を取り入れる事にある。
最も簡単な変異体は、ＰＣＲのプライマーを経由して導入することである。この
変異体には−５’−に変位したプライマー（NH2とSH）と二官能性リンカーを用
いる。
【００１６】 表面に定着させる主要な成分はそのものの性状にある。現在まで記述されてい
るシステムは主にシリコン又は金属（磁気ビーズ）を材料としている。標的ＤＮ
Ａを定着させる為の別の方法は、表面に定着させたオリゴヌクレオチドにハイブ
リダイゼーションを行う為、標的ＤＮＡの短い認識配列（例えば２０塩基）を利
用することに基づく。
【００１７】 オリゴマー配列の表面に定着されるプローブとして該オリゴヌクレオチドがあ
るが、ヌクレイン酸の変異体もある。例えばペプチド核酸（Peptide Nucleic Ac
ids ＝ ＰＮＡ）、(Nielsen, P.E., Buchardt, O., Egholm, M. とBerg,R.H. 19
93.ペプチドヌクレイン酸.米国特許 5,539,082 ; Buchardt, O., Egholm, M., B
erg, R.H. と Nielsen, P.E. 1993. Peptide nucleic acids and their potenti
al applications in biotechnology. Trends in Biotechnology, 11: 384−386)
、ホスホロチオエート型オリゴヌクレオチド又はメチルホスホン酸オリゴヌクレ
オチド。 プローブの特性は非常に重要である。ペプチド核酸は骨格に電荷が無く、これ
は同時に化学的に通常のヌクレイン酸の糖リン酸骨格構造とは異なる。ＰＮＡの
骨格は一般的なＤＮＡの糖リン酸骨格の代わりにアミド配列を有する。ＰＮＡは
相補的配列のＤＮＡと非常に良くハイブリッド形成する。ＰＮＡ／ＤＮＡハイブ
リッドの融点は同等のＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの融点よりも高く、しかもハ
イブリッド形成する際の緩衝塩との関与は比較的に小さい。
【００１８】 マトリックス支援レーザー脱離イオン化−質量分析法（Matrix−assistierte
Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie ＝ MALDI）はバイオ分子
の分析にとって斬新で、非常に高い効率を発揮する(Karas,M. and Hillenkamp,F
. 1988. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses ex
ceeding 10.000 daltoons.Anal.Chem. 60: 2299−2301)。分析される分子はUV吸
収性マトリックスに組み込まれる。 短いレーザーパルスによってマトリックスは減圧下で気化するのでこの分析は
気相においてそれほど破断することなく進められる。設定した電圧がフィールド
フリーの導管内でイオンを加速する。質量が異なるためイオンは様々に強く加速
される。小さなイオンは大きなものよりも早く検出器に到達するため、飛行時間
はイオンの質量により換算される。
【００１９】 本発明の課題は、メチル化したシトシンを検出するために好適なオリゴマー配
列を提供することにある。
【００２０】 本発明は、この課題をオリゴマー−配列をＰＮＡ−（ペプチドヌクレイン酸）
−および／またはＤＮＡ−オリゴマーを使って表面上で形成する事によって解決
するものであり、モノマーがそれぞれ６から２０の間からなるオリゴマーを含み
、その際それぞれ少なくともその一般式DDCGDD、一般式DDTGDD、一般式HHCGHHま
たは一般式HHCAHHの配列を包み、 その際 Hはアデニン（A）、シトシン（C）、又はチミン（T）の塩基の一つを意味し、さ
らに、 Dはアデニン（A）、グアニン（G）、又はチミン（T）の塩基の一つを示し、 そしてその際にオリゴマー配列によって表面上のオリゴマーの位置は相関関係に
ある。
【００２１】 本発明の好適な実施態様においては、少なくともオリゴヌクレオチドの１０％
は一般的配列形式DDCGDD、一般式DDTGDD、一般式HHCGHHまたは一般式HHCAHHを含
む。
【００２２】 また、本発明の好適な実施態様においては、少なくともオリゴヌクレオチドの
２５％は一般式DDCGDD、一般式DDTGDD、一般式HHCGHHまたは一般式HHCAHHを含む
。
【００２３】 さらに本発明の好適な実施態様においては、少なくともオリゴヌクレオチドの
５０％は一般式DDCGDD、一般式DDTGDD、一般式HHCGHHまたは一般式HHCAHHを含む
。
【００２４】 同様に本発明の好適な実施態様においては、少なくともオリゴヌクレオチドの
７５％の一般式DDCGDD、一般式DDTGDD、一般式HHCGHHまたは一般式HHCAHHを含む
。
【００２５】 本発明によれば、表面が平坦であり、オリゴマーが四角形又は六角形の格子内
にあり、それが配位の割当てを可能にしており、その上に配列することが望まし
い。しかし、別の目的にかなった幾何学上の配位を選択し、そこで例えば円形に
配置して自動化の可能性の向上を補完することも可能である。
【００２６】 オリゴマー配列は、一般式DDCGDD、一般式DDTGDD、一般式HHCGHHおよび一般式
HHCAHHの配列を含むことが望ましい。
【００２７】 特に、オリゴマー配列は、一般式DDCGDDおよび一般式DDTGDDのシーケンス、ま
たは一般式HHCGHHおよび一般式HHCAHHの配列を含むことが望ましい。
【００２８】 これらが、少なくとも１００種のオリゴマーを含むことが望ましい。
【００２９】 本発明において、好適な実施態様のオリゴマー配列は、CG−配列を含むそれぞ
れのオリゴマーに適切に、類似オリゴマーが定着し、前記類似オリゴマーはCG−
配列の代わりにTG−またはCA−配列を含むことのみによって区別されることを特
徴とする。
【００３０】 さらに、表面がガラス製であることが望ましい。
【００３１】 さらに、表面が金属製又は他の伝導性の物質であることが望ましい。特に、タ
ーゲットの表面がMALDI−質量分析計のものであれば非常に望ましい。
【００３２】 従って、上記本発明のオリゴマー配列では、メチル化度合いを検出するために
ゲノムＤＮＡプローブを用いることができる。
【００３３】 本発明のさらなる目的は、予め増幅したＤＮＡ断片のハイブリッド形成に実施
態様のオリゴマー配列を応用することにある。
【００３４】 その際、増幅するＤＮＡは重亜硫酸溶液（又は亜硫酸水素、重亜硫酸水素溶液
）で取り扱われることが望ましい。
【００３５】 本発明の更なる目的は、ゲノムＤＮＡにおけるシトシンのメチル化度合いの検
出に実施態様のオリゴマー配列を応用することにある。
【００３６】 従って、本発明の目的は、配置、特にオリゴマー配列の形式における配置にあ
り、前記配置は表面がＰＮＡ（ペプチド核酸）又はＤＮＡオリゴマーから成り、
前記オリゴマーはそれぞれ６から２０の間のモノマー（又は核塩基）から成り、
一般的な配列形式DDCGDDおよび/または一般式DDTGDDおよび/または一般式HHCGHH
および／または一般式HHCAHHを含み、その表面におけるオリゴマーの位置により
それぞれその配列を逆推論することが可能である。 このタイプのオリゴマー配列は、特にゲノムＤＮＡ内におけるシトシンのメチ
ル化の検出に適している。前記配列のハイブリッド形成は、重亜硫酸による化学
的前処理後、ＤＮＡのメチル化の状態によって激しく変動する。
【００３７】 このハイブリッド形成によって発生する信号により、使用されたオリゴマー配
列をさらに正確に場所決めすることができるために特に望ましいのは、表面が水
平であり、その上でオリゴマーが、座標の形式で割当てを可能とする、四角形又
は六角形の格子の形状に配置されることである。
【００３８】 特に望ましくは、表面上にＰＮＡ（ペプチド核酸）−又はＤＮＡオリゴマーを
配置し、オリゴマー配列がそれぞれ６から２０の間のモノマー（あるいは核塩基
）からなるオリゴマーを含み、一般式DDCGDD、一般式DDTGDD、一般式HHCGHHおよ
び一般式HHCAHHの配列を含むことにより、表面上におけるそれぞれのオリゴマー
の位置によりそれぞれの配列の逆推論が可能となる。
【００３９】 特に望ましくは、表面上にＰＮＡ（ペプチド核酸）−又はＤＮＡオリゴマーを
配置し、オリゴマー配列がそれぞれ、６から２０の間のモノマー（あるいは核塩
基）からなる一般式DDCGDDおよび一般式DDTGDDのオリゴマーを含むことにより、
表面上におけるそれぞれのオリゴマーの位置によりそれぞれの配列の逆推論が可
能となる。
【００４０】 特に望ましくは、表面上にＰＮＡ（ペプチド核酸）−又はＤＮＡオリゴマーを
配置し、オリゴマー配列がそれぞれ、６から２０の間のモノマー（あるいは核塩
基）からなる一般式HHCGHHおよび一般式HHCAHHのオリゴマーを含み、表面上にお
けるそれぞれのオリゴマーの位置によりそれぞれの配列について結論を出すこと
が可能となる。
【００４１】 その場合、特にこの配置が少なくとも１００の様々なオリゴマーを含むことが
望ましく、それぞれ少なくともDDCGDD、DDTGDD、HHCGHH、あるいはHHCAHHの配列
を含むことが望ましい。
【００４２】 特に、配置の表面はガラスから成る実施態様が望ましい。さらに、配置の表面
は、金属製又は他の伝導性の物質から成る実施態様が望ましい。特に好適な実施
態様においては、配置はターゲットの表面がMALDI−質量分析計のものであるこ
とを特徴とするのが望ましい。
【００４３】 本発明の目的は、表面上のＰＮＡ（ペプチドヌクレイン酸）−又はＤＮＡ−オ
リゴマーの配置に応用することにあり、オリゴマー配列はそれぞれ６から２０の
間のモノマー（あるいは核塩基）からなるオリゴマーを含み、一方、一般式DDCG
DDおよび/または一般式DDTGDDおよび/または一般式HHCGHHおよび／または一般式
HHCAHHの配列を含み、表面上のオリゴマーの位置によりそれぞれその配列の逆推
論が可能であり、事前に増幅されたＤＮＡ断片のハイブリッド形成を行う。
【００４４】 特に、ポリメラーゼ連鎖反応によって生じたＤＮＡ断片の使用が望ましい。
【００４５】 特に望ましくは、表面上のＰＮＡ（ペプチド核酸）−あるいはＤＮＡ−オリゴ
マーの配置を応用することであり、オリゴマー配列がそれぞれ６から２０の間の
モノマー（又は核塩基）を含み、一方、一般式DDCGDDおよび／または一般式DDTG
DDおよび／または一般式HHCGHHおよび／またはHHCAHHの配列を含み、その際表面
のオリゴマーの位置によりそれぞれその配列の逆推論を可能とし、ＤＮＡのハイ
ブリッド形成を行う為に、予め重亜硫酸溶液（又は亜硫酸水素、重亜硫酸水素）
で処理することである。特にＤＮＡは予め増幅させておく。
【００４６】 特に望ましくは、表面におけるＰＮＡ（ペプチドヌクレイン酸）−あるいはＤ
ＮＡ−オリゴマーの配置の応用であり、オリゴマー配列はそれぞれ６から２０の
間のモノマー（あるいは核塩基）からなるオリゴマーを包み、一方一般式DDCGDD
および／または一般式DDTGDDおよび／または一般式HHCGHHおよび／またはHHCAHH
の配列を含み、表面上のオリゴマーの位置によりそれぞれその配列の逆推論を可
能とし、ゲノムＤＮＡにおけるシトシンのメチル化を検出する。
【００４７】 図１ではゲノムＤＮＡにおいてシトシン−メチル化パターンを検出する為の本
発明によるオリゴマー配列の応用を実例で説明している。
【００４８】 図１において、文字Ｈ、ＤおよびＮは以下を意味する。すなわち Ｈ アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）又はチミン（Ｔ）の塩基の一つ、 Ｄ アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）の塩基の一つおよびＮ アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）又はチミン（Ｔ）の塩基の
一つを示す。
【００４９】 シトシンのメチル化のみにより区別されるＤＮＡ塩基配列は、重亜硫酸によっ
て処理した後で核塩基の配列に変化が生じる。 メチル化されたシトシンは重亜硫酸処理によって変化しないが、非メチル化シ
トシンはチミンに変換され、これらを多様な配列に増幅し、相補的な配列が存在
するオリゴマー配列の様々な部位に結合する。このようにして、オリゴマーアレ
イにおける配列が知られていることにより、元のＤＮＡにメチル化されたシトシ
ンが既存していたかについて結論を出すことが可能となる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 表面にＰＮＡ（ペプチドヌクレイン酸）−および／またはＤＮＡ
    −オリゴマーを用いたオリゴマー配列であって、各オリゴマー配列は、それぞれ
    ６から２０個のモノマーあるいは核塩基からなるオリゴマーを含み、それぞれが
    少なくとも一般式DDCGDD、一般式DDTGDD、一般式HHCGHHまたは一般式HHCAHHの配
    列を含み、 前記Hはアデニン（A）、シトシン（C）、または、チミン（T）の塩基のいずれ
    か一つを意味し、 前記Dはアデニン（A）、グアニン（G）、または、チミン（T）の塩基のいずれ
    か一つを示し、 前記表面上におけるオリゴマーの位置がオリゴマーの配列と関連することを特
    徴とするオリゴマー配列。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載のオリゴマー配列であって、一般式DDCGDD、一般
    式DDTGDD、一般式HHCGHH、または一般式HHCAHHの配列のオリゴヌクレオチドを少
    なくとも１０％含むことを特徴とするオリゴマー配列。
  3. 【請求項３】 請求項１に記載のオリゴマー配列であって、一般式DDCGDD、一般
    式DDTGDD、一般式HHCGHH、または一般式HHCAHHの配列のオリゴヌクレオチドを少
    なくとも２５％含むことを特徴とするオリゴマー配列。
  4. 【請求項４】 請求項１に記載のオリゴマー配列であって、一般式DDCGDD、一般
    式DDTGDD、一般式HHCGHHまたは一般式HHCAHHの配列のオリゴヌクレオチドを少な
    くとも５０％含むことを特徴とするオリゴマー配列。
  5. 【請求項５】 請求項1によるオリゴマー配列であって一般式DDCGDDまたは一般
    式DDTGDDまたは一般式HHCGHHまたは一般式HHCAHHの配列のオリゴヌクレオチドを
    少なくとも７５％含むことを特徴とするオリゴマー配列。
  6. 【請求項６】 請求項１から５に記載のオリゴマー配列であって、表面が平面で
    あり、その上でオリゴマーが、座標に沿った割当てが可能である四角形または六
    角形の格子の形状に配置することを特徴とするオリゴマー配列。
  7. 【請求項７】 前記いずれかの請求項に記載のオリゴマー配列であって、一般式
    DDCGDD、一般式DDTGDD、一般式HHCGHHおよび一般式HHCAHHの配列を含むことを特
    徴とするオリゴマー配列。
  8. 【請求項８】 請求項１から６に記載のオリゴマー配列であって、一般式DDCGDD
    、一般式DDTGDD、一般式HHCGHHおよび一般式HHCAHHの配列を包むことを特徴とす
    るオリゴマー配列。
  9. 【請求項９】 前記いずれかの請求項に記載のオリゴマーアレイであって、少な
    くとも１００の種々のオリゴマーを包むことを特徴とするオリゴマーアレイ。
  10. 【請求項１０】 前記いずれかの請求項に記載のオリゴマーアレイであって、CG
    −配列を含むそれぞれのオリゴマーに適切に、類似のオリゴマーが定着し、前記
    オリゴマーはCG−配列の代わりにTG−またはCA−配列が含まれることによっての
    み区別されることを特徴とするオリゴマーアレイ。
  11. 【請求項１１】 前記いずれかの請求項に記載のオリゴマーアレイであって、表
    面がガラスで形成されていることを特徴とするオリゴマーアレイ。
  12. 【請求項１２】 請求項１から１０によるオリゴマーアレイは、表面が金属ある
    いは他の伝導性の物質で形成されていることを特徴とするオリゴマーアレイ。
  13. 【請求項１３】 請求項１２に記載のオリゴマーアレイであって、表面がＭＡＬ
    ＤＩ質量分析計のターゲットであることを特徴とするオリゴマーアレイ。
  14. 【請求項１４】 予め増幅したＤＮＡ断片をハイブリッド形成することを特徴と
    する請求項１に記載のオリゴマーアレイの使用法。
  15. 【請求項１５】 増幅前のＤＮＡを重亜硫酸溶液（または亜硫酸水素、重亜硫酸
    水素溶液）で処理したことを特徴とする請求項１４に記載のオリゴマーアレイの
    使用法。
  16. 【請求項１６】 ゲノムＤＮＡにおけるシトシン−メチル化の検出が可能である
    ことを特徴とする請求項１に記載のオリゴマーアレイの使用法。
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