JP2003512859A - イヌおよびウサギモチリン受容体オーソログ - Google Patents

イヌおよびウサギモチリン受容体オーソログ

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JP2003512859A JP2001535408A JP2001535408A JP2003512859A JP 2003512859 A JP2003512859 A JP 2003512859A JP 2001535408 A JP2001535408 A JP 2001535408A JP 2001535408 A JP2001535408 A JP 2001535408A JP 2003512859 A JP2003512859 A JP 2003512859A
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マツキー，カレン
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、イヌおよびウサギモチリン受容体に関連したポリペプチドおよび核酸、ならびにそのようなポリペプチドおよび核酸の用途を主題とする。イヌモチリン受容体エキソン１アミノ酸配列は配列番号１により示され、ウサギモチリン受容体アミノ酸配列は配列番号２により示され、イヌモチリン受容体のエキソン１をコードする核酸配列は配列番号３により示され、ウサギモチリン受容体をコードする核酸配列は配列番号４により示される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の背景） 本明細書中に引用する参考文献が本発明の先行技術であると認めるものではな
い。
【０００２】 モチリンは、胃の運動性に影響を及ぼす２２アミノ酸のペプチドホルモンであ
る。モチリンは、ヒト、ネコ、ウサギ、イヌおよびニワトリを含む種々の種の胃
腸管の平滑筋収縮を誘導することが判明している（ＰｅｅｔｅｒｓおよびＤｅｐ
ｏｏｒｔｅｒｅ，Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎ
ｅｓ ３９：７６５−７８５，１９９４；Ｖａｎ Ａｓｓｃｈｅら，Ｅｕｒｏｐ
ｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３３７：２６７−
２７４，１９９７；ＤｅｐｏｏｒｔｅｒｅおよびＰｅｔｅｒｓ，Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２７２：Ｇ９９４（１９９
７）；Ｋｉｔａｚａｗａら，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ １６：１２４３−１２５２，１
９９５；ならびにＩｔｏｈ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ １８：５９３−６０８，１９９
７）。
【０００３】 モチリンの作用には、消化間（ｉｎｔｅｒｄｉｇｅｓｔｉｖｅ）（ＩＩＩ相）
洞および十二指腸収縮の誘導が含まれる（Ｉｔｏｈ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ １８：
５９３−６０８，１９９７；Ｐｏｉｔｒａｓ，ｉｎ Ｇｕｔ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ
：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｈ．Ｗａｌ
ｓｈおよびＧ．Ｊ．Ｄｏｃｋｒａｙ編（Ｒａｖｅｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９
４），ｐｐ．２６１−３０４；ならびにＴｏｎｉｎｉ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒ
ｅｓ．３３：２１７−２２６，１９９６）。抗生物質エリスロマイシンは、モチ
リン受容体に媒介されうる同様の作用を誘導する（Ｉｔｏｈら，Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２４７：Ｇ６８８−Ｇ６９
４，１９８４；ならびにＷｅｂｅｒら，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８８：４８５−４９０，１９９３）。
エリスロマイシンは、嘔吐、吐き気、下痢および腹部不快感を含む副作用を引き
起こす（Ｔｏｎｉｎｉ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．３３：２１７−２２６，
１９９６）。
【０００４】 （発明の概要） 本発明は、イヌおよびウサギモチリン受容体に関連したポリペプチドおよび核
酸、ならびにそのようなポリペプチドおよび核酸の用途を主題とする。イヌモチ
リン受容体エキソン１アミノ酸配列は配列番号１により示され、ウサギモチリン
受容体アミノ酸配列は配列番号２により示され、イヌモチリン受容体のエキソン
１をコードする核酸配列は配列番号３により示され、ウサギモチリン受容体をコ
ードする核酸配列は配列番号４により示される。
【０００５】 該イヌまたはウサギモチリン受容体に関連したポリペプチドは、該イヌまたは
ウサギモチリン受容体内に存在する少なくとも９個の連続的なアミノ酸の領域を
含有する。そのようなポリペプチドは、該イヌまたはウサギモチリン受容体内に
存在する又は存在しない領域を含む追加的な領域を含有しうる。
【０００６】 該イヌまたはウサギモチリン受容体に関連した核酸は、該イヌまたはウサギモ
チリン受容体核酸またはその相補体内に存在する少なくとも１８個の連続的なヌ
クレオチドの領域を含有する。そのような核酸は、該イヌまたはウサギモチリン
受容体核酸内に存在する又は存在しない領域を含む追加的な領域を含有しうる。
【０００７】 したがって、本発明の第１の態様は、イヌまたはウサギモチリン受容体の特有
アミノ酸領域を含む精製されたポリペプチドを記載する。該特有領域は少なくと
も９アミノ酸長である。
【０００８】 「特有アミノ酸領域」は、配列番号１または２に存在し配列番号５または６に
は存在しない連続的なアミノ酸の領域である。配列番号５はヒトモチリン受容体
のアミノ酸配列であり、配列番号６はスフェロイデス・ネフェルス（Ｓｐｈｅｒ
ｏｉｄｅｓ ｎｅｐｈｅｌｕｓ）７５Ｅ７のアミノ酸配列である。該特有領域は
、示されている特有領域サイズより小さな配列番号５または６に存在する連続的
なアミノ酸のセグメントを含有しうる。
【０００９】 「精製されたポリペプチド」は、サンプルまたは調製物中に存在する全タンパ
ク質の少なくとも１０％を意味する。好ましい実施形態においては、精製された
ポリペプチドは、サンプルまたは調製物中の全タンパク質の少なくとも約５０％
、少なくとも約７５％または少なくとも約９５％を意味する。「精製されたポリ
ペプチド」に対する言及は、該ポリペプチドがいずれかの精製を受けていること
を要するものではなく、例えば、精製されていない化学合成されたポリペプチド
を含みうる。
【００１０】 本発明のもう１つの態様は、該イヌまたはウサギモチリン受容体からの特有ア
ミノ酸領域をコードするヌクレオチド配列またはその相補体を含む精製された核
酸を記載する。該コード領域は少なくとも９アミノ酸長である。
【００１１】 「精製された核酸」は、サンプルまたは調製物中に存在する全核酸の少なくと
も１０％を意味する。好ましい実施形態においては、精製された核酸は、サンプ
ルまたは調製物中の全核酸の少なくとも約５０％、少なくとも約７５％または少
なくとも約９５％を意味する。「精製された核酸」に対する言及は、該核酸がい
ずれかの精製を受けていることを要するものではなく、例えば、精製されていな
い化学合成されたポリペプチドを含みうる。
【００１２】 本発明のもう１つの態様は、イヌまたはウサギモチリン受容体核酸配列の特有
ヌクレオチド配列領域を含む精製された核酸を記載する。該特有ヌクレオチド配
列領域は少なくとも１８ヌクレオチド長である。
【００１３】 「特有ヌクレオチド配列領域」は、配列番号７または８には存在しない配列番
号３または４の少なくとも１８個の連続的なヌクレオチドを含む領域である。配
列番号７は、ヒトモチリン受容体をコードするヌクレオチド配列であり、配列番
号８は、スフェロイデス・ネフェルス（Ｓｐｈｅｒｏｉｄｅｓ ｎｅｐｈｅｌｕ
ｓ）７５Ｅ７をコードするヌクレオチド配列である。該特有領域は、示されてい
る特有領域サイズより小さな配列番号７または８に存在する連続的なヌクレオチ
ドのセグメントを含有しうる。
【００１４】 本発明のもう１つの態様は、発現ベクターを記載する。該発現ベクターは、イ
ヌまたはウサギモチリン受容体の特有アミノ酸領域をコードする組換えヌクレオ
チド配列を含む。
【００１５】 「組換えヌクレオチド配列」は、天然では付随しない１以上の核酸領域を含有
する核酸上に存在する配列である。存在しうるそのような領域の具体例には、該
配列に天然では付随しない１以上の調節要素、ウイルス要素および選択マーカー
が含まれる。
【００１６】 本発明のもう１つの態様は、イヌまたはウサギモチリン受容体の特有アミノ酸
領域をコードする発現ベクターを含む組換え細胞を記載する。該発現ベクターは
、該細胞内に存在するＲＮＡポリメラーゼにより認識される、該特有領域をコー
ドする核酸に機能的に共役したプロモーターを含有する。
【００１７】 本発明のもう１つの態様は、イヌまたはウサギモチリン受容体の特有アミノ酸
領域をコードする発現ベクターを細胞内に導入することにより製造された組換え
細胞を記載する。該イヌまたはウサギ核酸を該宿主のゲノム内に挿入するために
該発現ベクターを使用しることが可能であり、あるいは該発現ベクターは核酸の
自律的断片として存在することが可能である。
【００１８】 本発明のもう１つの態様は、化合物がモチリン受容体活性に影響を及ぼす能力
の測定方法を記載する。該方法は、特有イヌまたはウサギアミノ酸領域を含有す
る機能的モチリン受容体を組換え核酸から発現する組換え細胞に該化合物を与え
、モチリン受容体活性を測定することを含む。好ましくは、該組換え核酸は発現
ベクター上に存在する。
【００１９】 本発明のもう１つの態様は、モチリン受容体ポリペプチドの製造方法を記載す
る。該方法は、イヌまたはウサギモチリン受容体ポリペプチドを発現しうる組換
え細胞を、該ポリペプチドが発現ベクターから発現される条件下で培養する工程
を含む。
【００２０】 本発明の他の特徴および利点は、種々の実施例を含む本明細書に記載の更なる
説明から明らかである。記載されている実施例では、本発明の実施に有用な種々
の成分および方法を例示する。該実施例は本発明を限定するものではない。本開
示に従い、当業者は、本発明の実施に有用な他の成分および方法を確認し使用す
ることが可能である。
【００２１】 （図面の簡単な記載） 図１は、イヌ（ｄｏｇ）モチリン受容体エキソン１、ウサギ（ｒａｂ）モチリ
ン受容体、ヒト（ｈｕ）モチリン受容体およびスフェロイデス・ネフェルス（Ｓ
ｐｈｅｒｏｉｄｅｓ ｎｅｐｈｅｌｕｓ）（ｆｉｓｈ）７５Ｅ７のタンパク質配
列（それぞれ、配列番号１、配列番号２、配列番号５および配列番号６）の比較
を例示する。
【００２２】 図２Ａ〜Ｃは、イヌ（ｄｏｇ）モチリン受容体エキソン１、ウサギ（ｒａｂ）
モチリン受容体、ヒト（ｈｕ）モチリン受容体およびスフェロイデス・ネフェル
ス（Ｓｐｈｅｒｏｉｄｅｓ ｎｅｐｈｅｌｕｓ）（ｆｉｓｈ）７５Ｅ７をコード
するＤＮＡ配列（それぞれ、配列番号３、配列番号４、配列番号７および配列番
号８）の比較を例示する。
【００２３】 （発明の詳細な記載） 本発明は、イヌおよびウサギモチリン受容体に関連したポリペプチドおよび核
酸を主題とする。好ましいポリペプチドは、ヒトモチリン受容体またはスフェロ
イデス・ネフェルス（Ｓｐｈｅｒｏｉｄｅｓ ｎｅｐｈｅｌｕｓ）７５Ｅ７には
存在しないアミノ酸領域を含有する。好ましい核酸は、ヒトモチリン受容体また
はスフェロイデス・ネフェルス（Ｓｐｈｅｒｏｉｄｅｓ ｎｅｐｈｅｌｕｓ）７
５Ｅ７をコードする核酸には存在しないヌクレオチド領域を含有する。
【００２４】 ヒトモチリン受容体の選択的スプライシングされた２つの形態（ＭＴＬ−Ｒ１
およびＭＴＬ−Ｒ２）のアミノ酸配列およびコード化ＤＮＡ配列は、Ｆｅｉｇｈ
ｎｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４：２１８４−２１８８，１９９９（これが本
発明の先行技術であると認めるものではない）に記載されている。また、「ＧＰ
Ｒ３８」をコードするゲノムＤＮＡのアミノ酸配列は、ＭｃＫｅｅら，Ｇｅｎｏ
ｍｉｃｓ ４６：４２６−４３４，１９９７に記載されている。Ｆｅｉｇｈｎｅ
ｒらは、ＧＰＲ３８をモチリン受容体として同定しており、イントロンの存在を
示している。
【００２５】 スフェロイデス・ネフェルス（Ｓｐｈｅｒｏｉｄｅｓ ｎｅｐｈｅｌｕｓ）遺
伝子７５Ｅ７は、ヒトモチリン受容体に対する高レベルの相同性を有する。７５
Ｅ７のタンパク質配列は、ヒトモチリン受容体（ＭＴＬ−Ｒ１）と５４％同一で
あり、同様のエキソン−イントロン構造を含有する（Ｆｅｉｇｈｎｅｒら，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２８４：２１８４−２１８８，１９９９）。
【００２６】 イヌおよびウサギモチリン受容体ポリペプチドおよび核酸の好ましい用途は、
ある化合物が、該ヒト受容体における場合と異なって該イヌまたはウサギ受容体
において作用するか否かを判定するインビトロ機能アッセイにおけるものである
。ヒト治療用化合物の探索の際に有用な試験系をイヌまたはウサギモデルが与え
るか否かを評価するのに役立てるために、そのようなアッセイを用いることがで
きる。
【００２７】 該モチリン受容体において活性な化合物の治療用途には、胃腸の疾患および障
害、例えば胃運動性障害（内因性ミオパシーまたはニューロパシー）、軽症胃ア
トニー、過敏性腸管症候群および下痢の治療が含まれる。また、該モチリン受容
体において活性な化合物は、モチリン受容体活性を研究するための研究手段とし
て使用することができる。
【００２８】 モチリン受容体関連ポリペプチド 該イヌおよびウサギポリペプチドに関連したポリペプチドは、特有イヌまたは
ウサギアミノ酸領域を含有する。該特有アミノ酸領域に加えて、イヌまたはウサ
ギモチリン受容体ポリペプチドに関連していても関連していなくてもよい領域が
該ポリペプチド内に存在しうる。そのようなポリペプチドは、機能的モチリン受
容体の成分の付与、イヌまたはウサギモチリン受容体に結合する抗体の産生のた
めの免疫原としての使用、該モチリン受容体に結合する化合物を同定するための
標的としての使用および／またはモチリン受容体活性に影響を及ぼす化合物の能
力を測定するためのアッセイにおける使用のような種々の用途を有する。
【００２９】 特有イヌおよびウサギアミノ酸領域は、本明細書に記載のイヌおよびウサギモ
チリン受容体配列とヒトモチリン受容体およびスフェロイデス・ネフェルス（Ｓ
ｐｈｅｒｏｉｄｅｓ ｎｅｐｈｅｌｕｓ）７５Ｅ７タンパク質配列との比較に基
づいて、容易に同定することができる。そのような配列比較を図１に例示する。
特有イヌアミノ酸領域の具体例には、ＧＰＧＮＳＳＤＧＡ（配列番号９）、ＶＣ
ＬＧＬＦＡＶＧＶ（配列番号１０）、ＡＬＬＳＳＲＲＲＡ（配列番号１１）、Ａ
ＰＦＦＦＬＶＧＶＥＱＤＡＧＧ（配列番号１２）およびＣＬＣＶＬＹＧＲＩ（配
列番号１３）が含まれる。特有ウサギアミノ酸領域の具体例には、ＤＰＡＶＦＡ
ＡＰＤＲ（配列番号１４）、ＮＧＴＶＰＬＤＰＳ（配列番号１５）、ＳＰＡＰＡ
ＳＰＰＳＧＰＧ（配列番号１６）、ＲＲＬＬＲＥＳＲＡＧ（配列番号１７）およ
びＳＧＶＣＧＳＲＧＰＥＱＤ（配列番号１８）が含まれる。
【００３０】 特有アミノ酸領域の定義は、ヒトモチリン受容体およびスフェロイデス・ネフ
ェルス（Ｓｐｈｅｒｏｉｄｅｓ ｎｅｐｈｅｌｕｓ）７５Ｅ７タンパク質配列に
関するものである。したがって、特有アミノ酸領域は、ヒトモチリン受容体もし
くはスフェロイデス・ネフェルス（Ｓｐｈｅｒｏｉｄｅｓ ｎｅｐｈｅｌｕｓ）
７５Ｅ７タンパク質配列以外の１以上の種からのモチリン受容体配列内または非
モチリン受容体配列内に存在しうる。例えば、配列番号１０は、イヌおよびウサ
ギの両方のモチリン受容体内に存在する。
【００３１】 別の実施形態においては、イヌまたはウサギモチリン受容体に関連したポリペ
プチドは、少なくとも１８、少なくとも２７または少なくとも５４塩基長の特有
アミノ酸領域を含む又はそれよりなる。好ましくは、該イヌまたはウサギモチリ
ン受容体関連ポリペプチドは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を含
む又はそれよりなる。
【００３２】 ポリペプチドは、化学合成を伴う方法および生化学的合成を伴う方法を含む標
準的な技術を用いて製造することができる。ポリペプチドの化学合成のための技
術は当技術分野でよく知られている（例えば、Ｖｉｎｃｅｎｔ，ｉｎ Ｐｅｐｔ
ｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｄｅｋｋｅｒ，１９９０）。
【００３３】 ポリペプチドの生化学的合成技術も当技術分野でよく知られている。そのよう
な技術は、ポリペプチド合成のために核酸鋳型を使用するものである。特定のア
ミノ酸をコードする核酸トリプレットの配列を与える遺伝暗号は、当技術分野で
よく知られている（例えば、Ｌｅｗｉｎ ＧＥＮＥＳ ＩＶ，ｐ．１１９，Ｏｘ
ｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９０を参照されたい）。細
胞内に核酸を導入し該核酸を発現させてタンパク質を得るための技術は、Ａｕｓ
ｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８，およびＳａｍｂ
ｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９のような参考書に記載されている。
【００３４】 機能的モチリン受容体誘導体 機能的モチリン受容体はモチリンに結合し、細胞内シグナルの変換を行う。機
能的モチリン受容体には、イヌおよびウサギモチリン受容体、ならびに特有イヌ
またはウサギアミノ酸領域を一成分として含有するモチリン受容体活性を有する
受容体が含まれる。
【００３５】 特定の起源から得られたモチリン受容体から出発して、モチリン受容体活性を
有する誘導体を得ることができる。そのような誘導体は、アミノ酸の置換、付加
および欠失を有するポリペプチドを含む。機能的誘導体を得るために施す変化は
、モチリン結合ドメイン以外の部位に施すべきであり、該三次構造を改変しない
様態で施すべきである。ポリペプチドがモチリン受容体活性を有する能力は、Ｇ
タンパク質活性を測定する技術のような技術を用いて確認することができる。
【００３６】 図１に示す配列比較では、ヒト、イヌおよびウサギモチリン受容体間で異なる
アミノ酸が例示されている。そのような可変性アミノ酸は、改変のための良好な
標的である。
【００３７】 また、アミノ酸は、そのＲ基の構造に基づき或る型に分類される。特定のグル
ープ内の種々のアミノ酸の置換、例えば、ロイシンからバリンへの置換、リシン
からアルギニンへの置換およびグルタミンからアスパラギンへの置換は、該ポリ
ペプチドの官能性の変化を引き起こさない可能性がある。
【００３８】 モチリン抗体 イヌまたはウサギモチリン受容体ポリペプチドを認識する抗体は、配列番号１
、配列番号２またはそれらの断片のポリペプチドを免疫原として使用して産生さ
せることができる。断片は、少なくとも９アミノ酸長であるべきであり、好まし
くは、特有アミノ酸領域よりなる。
【００３９】 該モチリン受容体に対する抗体は、モチリン受容体ポリペプチドの存在を確認
するための及びモチリン受容体ポリペプチドを単離するための用途のような種々
の用途を有する。抗体を産生させ使用するための技術の具体例は、Ａｕｓｕｂｅ
ｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８，Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８、およびＫｏｈｌｅ
ｒら，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７，１９７５に記載されている。
【００４０】 結合アッセイ 化合物がイヌまたはモチリン受容体に結合する能力を測定するアッセイは、配
列番号１、配列番号２またはそれらの断片のポリペプチドを標的として使用して
行うことができる。断片は、少なくとも９アミノ酸長であるべきであり、アゴニ
スト、アンタゴニストまたはアロステリックモジュレーターが結合する部位を含
有すべきである。競合および非競合アッセイを含む種々のタイプのアッセイ形式
を用いることができる。
【００４１】 完全長受容体または受容体断片に結合すると確認された化合物を使用して、よ
り短い長さの断片に対する該化合物の結合能を試験することにより結合部位の位
置を決定することができる。例えば、モチリンはモチリン受容体に結合するため
、標識モチリンを使用して、モチリンが結合する該受容体の部分を同定すること
ができる。化合物結合部位を含有することが確認された断片を使用して、該結合
部位に結合する追加的な化合物に関して試験することができる。
【００４２】 結合アッセイに使用する好ましいポリペプチド断片は、特有アミノ酸領域より
なる。しかし、追加的なアミノ酸配列を含有する断片を使用して、例えば、カラ
ムへの結合を促進することができる。
【００４３】 結合アッセイは、個々の化合物を使用して又は種々の化合物を含有する調製物
を使用して行うことができる。１以上の化合物が該モチリン受容体に結合する種
々の化合物を含有する調製物は、該モチリン受容体に結合する化合物を同定する
ために、より小さなグループに分けることができる。本発明の実施形態において
は、少なくとも１０個の化合物を含有する試験調製物を結合アッセイに使用する
。
【００４４】 結合アッセイは、種々の環境中に存在する組換え的に産生されたモチリン受容
体ポリペプチドを使用して行うことができる。そのような環境には、例えば、異
なる環境中に導入された組換え手段により産生された精製されたモチリン受容体
ポリペプチドの使用、および組換え核酸から発現されたモチリン受容体ポリペプ
チドを含有する細胞抽出物および精製された細胞抽出物が含まれる。
【００４５】 機能的アッセイ 機能的イヌまたはウサギモチリン受容体が関与するアッセイを用いて、該モチ
リン受容体において活性な化合物に関して選択し、化合物が受容体活性に影響を
及ぼす能力を評価することができる。モチリン受容体活性は、該モチリン受容体
の細胞内コンホメーションの変化の検出、タンパク質活性の測定または細胞内メ
ッセンジャーのレベルの測定のような種々の技術を用いて測定することができる
。
【００４６】 ある化合物が該モチリン受容体または別の受容体において活性であるか否かの
判定を促進するために、組換え的に発現されたモチリン受容体ポリペプチドを使
用することができる。例えば、該モチリン受容体は、該受容体を通常は発現しな
いＨＥＫ ２９３、ＣＯＳ ７およびＣＨＯのような細胞系内で発現ベクターに
より発現させることが可能であり、この場合、該発現ベクターを伴わない又はモ
チリン受容体をコードしない発現ベクターを伴うその同じ細胞系が対照として作
用しうる。
【００４７】 モチリン受容体はホスホリパーゼＣシグナル伝達経路を活性化するらしい。該
ホスホリパーゼＣシグナル伝達経路の活性化は、細胞内Ｃａ２＋を測定する技術
のような標準的な技術を用いて測定することができる。Ｃａ２＋を測定するため
に用いられうる当技術分野でよく知られた技術の具体例には、フラ−２のような
色素の使用、およびエクオリンのようなＣａ２＋−生物発光感受性受容体タンパ
ク質の使用が含まれる。Ｇタンパク質活性を測定するためにエクオリンを使用す
る細胞系の一例としては、ＨＥＫ２９３／ａｅｑ１７が挙げられる（Ｂｕｔｔｏ
ｎら，Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ １４：６６３−６７１，１９９３およびＦｅ
ｉｇｈｎｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４：２１８４−２１８８，１９９９（そ
れらの両方を参照により本明細書に組み入れることとする））。
【００４８】 他のＧタンパク質由来のポリペプチドに機能的に共役したモチリン結合領域を
含有するキメラ受容体も、モチリン受容体活性を測定するために使用することが
できる。そのようなキメラ受容体は、好ましくは、少なくとも１つの特有イヌま
たはウサギアミノ酸領域を含有する。キメラモチリン受容体は、Ｎ末端細胞外ド
メイン；膜貫通領域、細胞外ループ領域および細胞内ループ領域から構成される
膜貫通ドメイン；および細胞内カルボキシ末端を含有する。好ましいキメラは、
モチリンイヌまたはウサギ受容体の細胞外ドメインを含有する。
【００４９】 Ｇタンパク質共役の特異性は細胞内ドメインにより決定される。特定のＧタン
パク質（例えば、Ｇｑタンパク質またはＧｉタンパク質）に機能的に共役するよ
うにキメラＧタンパク質共役受容体を製造することができる。そのようなシグナ
ル交換は、ＧｑまたはＧｉの活性を測定することによりモチリン受容体活性の検
出を可能にする。キメラ受容体を製造しＧタンパク質共役応答を測定するための
技術は、例えば、国際出願ＷＯ ９７／０５２５２および米国特許第５，２６４
，５６５号（それらの両方を参照により本明細書に組み入れることとする）に記
載されている。
【００５０】 機能的アッセイは、個々の化合物を使用して又は種々の化合物を含有する調製
物を使用して行うことができる。１以上の化合物がモチリン受容体活性に影響を
及ぼす種々の化合物を含有する調製物は、モチリン受容体活性に影響を及ぼす化
合物を同定するための、より小さな化合物群に分類することができる。本発明の
実施形態においては、少なくとも１０個の化合物を含有する試験調製物を機能的
アッセイにおいて使用する。
【００５１】 機能的アッセイは、種々の環境中に存在する組換え的に産生されたモチリン受
容体ポリペプチドを使用して行うことができる。そのような環境には、例えば、
種々の環境中に導入された組換え手段により産生された精製されたモチリン受容
体ポリペプチドの使用、および組換え核酸から発現されたモチリン受容体ポリペ
プチドを含有する細胞抽出物および精製された細胞抽出物が含まれる。
【００５２】 モチリン受容体関連核酸 該イヌおよびウサギモチリン受容体核酸に関連した核酸は、特有イヌまたはウ
サギヌクレオチド配列領域を含有する。そのような核酸は種々の用途を有し、そ
のような用途としては、例えば、イヌまたはウサギモチリン核酸の存在を同定す
るためのハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプライマーとしての使用
、種々の起源に由来するモチリン受容体に関連した受容体をコードする核酸を同
定するためのハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプライマーとしての
使用、および／またはイヌまたはウサギモチリン受容体ポリペプチドの組換え発
現のための使用が挙げられる。
【００５３】 特有イヌおよびウサギ核酸領域は、本明細書に記載のイヌおよびウサギモチリ
ン受容体核酸配列をヒトモチリン受容体およびセフェロイデス・ネフェルス（Ｓ
ｐｈｅｒｏｉｄｅｓ ｎｅｐｈｅｌｕｓ）７５Ｅ７核酸と比較することに基づき
、容易に同定することができる。そのような配列比較を図２に例示する。
【００５４】 特有イヌ核酸領域の具体例には以下のものが含まれる。
【化５】
【００５５】 特有ウサギ核酸領域の具体例には以下のものが含まれる。
【化６】
【００５６】 本出願に記載している指針を用いて、完全長イヌモチリン受容体をコードする
核酸配列を得たり、別の起源由来のモチリン受容体をコードする核酸を得たり、
モチリン受容体を人工的に製造することができる。異なる起源由来のモチリン受
容体をコードする核酸の入手は、縮重プローブおよびプライマーのセットを使用
することにより及びハイブリダイゼーション条件の適切な選択により促進される
。縮重プローブおよびプライマーのセットは、遺伝暗号の縮重を考慮して製造す
る。ハイブリダイゼーション条件の調節は、類似配列を有する核酸に対するハイ
ブリダイゼーションを可能にするプローブまたはプライマーの特異性を制御する
のに有用である。
【００５７】 ハイブリダイゼーション検出およびＰＣＲクローニングに用いる技術は当技術
分野でよく知られている。核酸検出技術は、例えば、Ｓａｍｂｏｏｋら，Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第
２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅ
ｓｓ，１９８９に記載されている。ＰＣＲクローニング技術は、例えば、Ｗｈｉ
ｔｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｖｏｌｕ
ｍｅ ６７，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９７に記載されている。
【００５８】 モチリン受容体のプローブおよびプライマーは、例えばゲノムＤＮＡまたはｃ
ＤＮＡを含有する核酸ライブラリーをスクリーニングするために使用することが
できる。そのようなライブラリーは商業的に入手可能であり、例えばＡｕｓｕｂ
ｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８に記載されているよう
な技術を用いて製造することができる。
【００５９】 特定のモチリン受容体アミノ酸配列および遺伝暗号の公知縮重から、多数の異
なるコード化核酸配列を得ることができる。遺伝暗号の縮重は、ほとんどすべて
のアミノ酸が、異なる組合せのヌクレオチドトリプレットによりコードされるた
めに生じる。特定のアミノ酸への特定のコドンの翻訳は当技術分野でよく知られ
ている（例えば、Ｌｅｗｉｎ ＧＥＮＥＳ ＩＶ，ｐ．１１９，Ｏｘｆｏｒｄ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９０を参照されたい）。アミノ酸は、
以下のとおりにコドンによりコードされる。 Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＵ。 Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドンＵＧＣ、ＵＧＵ。 Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドンＧＡＣ、ＧＡＵ。 Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：コドンＧＡＡ、ＧＡＧ。 Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドンＵＵＣ、ＵＵＵ。 Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン：コドンＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＵ。 Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドンＣＡＣ、ＣＡＵ。 Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン：コドンＡＵＡ、ＡＵＣ、ＡＵＵ。 Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン：コドンＡＡＡ、ＡＡＧ。 Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン：コドンＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＡ、ＣＵＣ、ＣＵＧ、ＣＵ
Ｕ。 Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドンＡＵＧ。 Ｎ＝Ａｓｐ＝アスパラギン：コドンＡＡＣ、ＡＡＵ。 Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドンＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＵ。 Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドンＣＡＡ、ＣＡＧ。 Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドンＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、Ｃ
ＧＵ。 Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドンＡＧＣ、ＡＧＵ、ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＧ、ＵＣＵ
。Ｔ＝Ｔｈｒ＝トレオニン：コドンＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＣＵ。 Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン：コドンＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ、ＧＵＵ。 Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドンＵＧＧ。 Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドンＵＡＣ、ＵＡＵ。
【００６０】 異なる実施形態においては、イヌまたはウサギモチリン受容体関連核酸は、少
なくとも２７または少なくとも５４塩基長の特有核酸領域を含む又はそれよりな
る。好ましくは、該イヌまたはウサギモチリン受容体関連核酸は、配列番号３ま
たは配列番号４の核酸配列を含む又はそれよりなる。
【００６１】 化学的および生化学的技術を用いて、所望の配列を有する核酸を合成すること
ができる。化学的技術の具体例は、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅ
ｙ，１９８７−１９９８、およびＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９に
記載されている。
【００６２】 生化学的合成技術は、核酸鋳型、ならびに適当な酵素、例えばＤＮＡおよび／
またはＲＮＡポリメラーゼの使用を含む。そのような技術の具体例には、インビ
トロ増幅技術、例えばＰＣＲおよび転写に基づく増幅、およびインビボ核酸複製
が含まれる。適当な技術の具体例は、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ
ｅｙ，１９８７−１９９８、およびＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９
、およびＫａｃｉａｎら，米国特許第５，４８０，７８４号に記載されている。
【００６３】 モチリン受容体プローブ イヌまたはウサギモチリン受容体に関する検出プローブは、好ましくは、特有
イヌまたはウサギ核酸領域、またはその相補体を含有する。そのようなプローブ
は、イヌまたはウサギモチリン受容体核酸に相補的であっても相補的でなくても
よい追加的な核酸を含有しうる。好ましくは、存在する追加的な核酸は、特定の
目的（例えば、特異性の増加をもたらすこと、レポーター配列となること、また
は捕捉配列となること）を有する。
【００６４】 該モチリン受容体に対するプローブは、適当なハイブリダイゼーション条件下
でモチリン受容体標的核酸に特異的にハイブリダイズしうる（すなわち、１以上
の非標的核酸分子から標的核酸を識別しうる）。好ましい非標的核酸は、ヒトモ
チリン受容体をコードする核酸またはその相補体である。ハイブリダイゼーショ
ンは、該プローブおよびモチリン受容体核酸上に存在する相補的ヌクレオチド塩
基を介して生じる。２つの分子が安定なハイブリッドの形成のために十分に強力
な相互作用を有するかどうかは、ハイブリダイゼーション条件によって決まる。
【００６５】 プローブは、核酸またはその誘導体（例えば、修飾核酸およびペプチド核酸）
から構成される。修飾核酸には、１以上の改変された糖基、改変されたヌクレオ
チド間連結および／または改変されたヌクレオチドプリンもしくはピリミジン塩
基を有する核酸が含まれる。修飾核酸を記載している参考文献には、ＷＯ ９８
／０２５８２、米国特許第５，８５９，２２１号および米国特許第５，８５２，
１８８号（それらのそれぞれを参照により本明細書に組み入れることとする）が
含まれる。
【００６６】 互いにハイブリダイズする２つの分子間の相互作用の程度は、生じたハイブリ
ッドのＴｍにより表される。Ｔｍが高ければ高いほど、その相互作用は強力であ
り、そのハイブリッドは安定である。Ｔｍは、当技術分野でよく知られた多数の
要因、例えば、相補性の程度、存在する相補的塩基のタイプ（例えば、Ａ−Ｔハ
イブリダイゼーションなのかＧ−Ｃハイブリダイゼーションなのか）、核酸バッ
クボーンの構造、および溶液成分に影響される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，１９８９）。
【００６７】 特定の組合せのハイブリダイゼーションアッセイ条件下で用いる温度よりハイ
ブリッドのＴｍのほうが高い場合に、安定なハイブリッドが形成される。ハイブ
リダイゼーションのストリンジェンシー条件を調節することにより、プローブの
特異性の程度は様々となりうる。プローブハイブリダイゼーションの検出は、検
出可能な標識の使用により促進される。検出可能な標識の具体例には、蛍光、酵
素および放射能標識が含まれる。
【００６８】 ストリンジェンシー条件の具体例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９
８９に記載されている。高いストリンジェンシー条件の一例は以下のとおりであ
る。ＤＮＡを含有するフィルターのプレハイブリダイゼーションを、６×ＳＳＣ
、５×デンハルト液および１００μｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡを含むバッフ
ァー中、６５℃で２時間〜一晩行なう。１００μｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡ
および５〜２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを含有するプレハイブリダ
イゼーション混合物中、フィルターを６５℃で１２〜４８時間ハイブリダイズさ
せる。２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを含有する溶液中、３７℃で１時間、フィ
ルターの洗浄を行なう。この後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中、５０℃
で４５分間の洗浄を行ない、ついでオートラジオグラフィーに付す。高いストリ
ンジェンシーの条件を用いる他の方法は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト
液、５０％ ホルムアミド中、４２℃で１２〜４８時間行なうハイブリダイゼー
ション工程、または０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ ＳＤＳ中、６５℃で３０〜６
０分間行なう洗浄工程を含むであろう。
【００６９】 組換え発現 モチリン受容体関連ポリペプチドは、適当な宿主内で又は翻訳系を使用して試
験管内で、組換え核酸から発現させることができる。組換え的に発現されたモチ
リン受容体ポリペプチドは、好ましくは、該モチリン受容体に結合し該受容体の
活性をモジュレーションする化合物に関してスクリーニングするためのアッセイ
で使用する。
【００７０】 好ましくは、発現は、発現ベクターを使用して宿主細胞内で達成される。発現
ベクターは、適切な転写およびプロセシングのための調節要素と共に所望のポリ
ペプチドをコードする組換え核酸を含有する。存在しうる調節要素には、該組換
え核酸に天然で付随する調節要素、および該組換え核酸に天然で付随しない外在
性調節要素が含まれる。該外在性プロモーターのような外在性調節要素は、特定
の宿主内での組換え核酸の発現に有用でありうる。
【００７１】 一般に、存在する調節要素には、転写プロモーター、リボソーム結合部位、タ
ーミネーター、および所望により存在しうるオペレーターが含まれる。もう１つ
の好ましい要素は、真核細胞内でのプロセシングをもたらすポリアデニル化シグ
ナルである。好ましくは、発現ベクターはまた、宿主細胞内での自律複製のため
の複製起点、選択マーカー、一定数の有用な制限酵素部位、および高いコピー数
の潜在性を含有する。発現ベクターの具体例としては、クローニングベクター、
修飾クローニングベクター、特別に設計されたプラスミドおよびウイルスが挙げ
られる。
【００７２】 種々の宿主における適当なレベルのポリペプチド発現を得るために使用しうる
発現ベクターは、当技術分野でよく知られている。当技術分野でよく知られた哺
乳類発現ベクターには、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅ
ｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７５９３）
、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅ
ｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ ３
７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（
ＡＴＣＣ ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ ３７４６０）、ｐＣＩ−ｎ
ｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびラムダＺＤ３５（ＡＴＣＣ ３７５６５）が含ま
れる。当技術分野でよく知られた細菌発現ベクターには、ｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖ
ａｇｅｎ）、ラムダｇｔ１１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡＩＩ（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれる
。当技術分野でよく知られた真菌細胞発現ベクターには、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
）が含まれる。当技術分野でよく知られた昆虫細胞発現ベクターには、Ｂｌｕｅ Ｂａｃ ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれる。
【００７３】 組換え宿主細胞は原核性または真核性でありうる。組換え宿主細胞の具体例に
は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌；酵母などの真菌細胞；ヒト、ウシ、ブ
タ、サルおよびげっ歯類などの哺乳類細胞；およびショウジョウバエ（Ｄｒｏｓ
ｏｐｈｉｌａ）およびカイコに由来する細胞系などの昆虫細胞が含まれる。商業
的に入手可能な哺乳類細胞系には、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ．ｓｕｐ−）（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ １．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １．２）、２９３（Ａ
ＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８６）、ＣＶ−１
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、Ｃ
ＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ
６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲ
Ｌ １６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２６）およびＭＲＣ−
５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７１）が含まれる。
【００７４】 発現ベクターは、標準的な技術を用いて宿主細胞内に導入することができる。
そのような技術の具体例には、形質転換、トランスフェクション、リポフェクシ
ョン、プロトプラスト融合およびエレクトロポレーションが含まれる。
【００７５】 モチリン受容体核酸は、発現ベクターを使用することなく、例えば合成ｍＲＮ
Ａまたは天然ｍＲＮＡを使用して、細胞内で発現させることができる。また、ｍ
ＲＮＡは、コムギ胚抽出物、網状赤血球抽出物などの種々の無細胞系内で、また
は細胞に基づく系（例えば、カエル卵母細胞）内で発現されうる。細胞に基づく
系内へのｍＲＮＡの導入は、例えば、マイクロインジェクションにより行うこと
ができる。
【００７６】 （実施例） 本発明の種々の特徴および利点を更に例示するために、以下に実施例を記載す
る。また、実施例には、本発明の実施のための有用な方法を例示する。これらの
実施例は本発明を限定するものではない。
【００７７】 実施例１：ウサギモチリン受容体のクローニング ヒトＭＴＬＲプローブ（エキソンＩ＆ＩＩ，ＧＰＲ３８；ＭｃＫｅｅら，Ｇｅ
ｎｏｍｉｃｓ ４６：４２６−４３４，１９７７（これを参照により本明細書に
組み入れることとする））でのスクリーニングにより、λＤａｓｈＩＩゲノムラ
イブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）からウサギモチ
リン受容体を同定しクローニングした。ハイブリダイゼーションは、以下に示す
低いストリンジェンシーの条件を用いて行った。
【００７８】 １．１×１０６ プラーク形成単位（ｐｆｕ）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ
Ｂｌｕｅ ＭＲＡ（Ｐ２）上にプレーティングし、ナイロンメンブレン（ＮＥＦ
−９７８Ａ；ＮＥＮ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）にトランスファーした。二重のメン
ブレンを、プレハイブリダイゼーション溶液（５０％ ホルムアミド、２×デン
ハルト液、５×ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ サケ精子ＤＮ
Ａ）中、３０℃で一晩インキュベートし、ついでハイブリダイゼーション溶液（
５０％ ホルムアミド、２×デンハルト液、５×ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳ、
１０％ 硫酸デキストラン、１００μｇ／ｍｌ サケ精子ＤＮＡ）中、１×１０ ６ ｃｐｍ／ｍｌ 標識プローブと共に一晩インキュベートし、５５℃、１×Ｓ
ＳＣの最終洗浄条件を用いた。クローンを２ラウンドのスクリーニング後に同定
し、３７７ ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍサイクルシークエンサー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌ
ｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）上、ＢＩＧ ＤＹＥターミネーター・
サイクル・シークエンシングＲｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で配列決定した。
【００７９】 ウサギモチリン受容体の連続的オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を得
るために、エキソンＩおよびＩＩ上で重複ＰＣＲを行った。エキソンＩおよびＩ
ＩのＰＣＲ産物（それぞれ、その他のエキソンの小部分を含有する）を得た。エ
キソンＩのプライマーである配列番号２９（５’ｇｇｇｃｃｃｇａａｔｔｃｇｃ
ｃｇｃｃＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＴＧＧＡＡＣＧＧＣＡＧＣ）および配列番号
３０（５’ＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡＧＧＡＣＧＣＧＧＡＣＧ
ＧＴＣＴＧ）は、ＥｃｏＲＩ部位および「ＧＣＣ ＧＣＣ」コザック配列を含有
していた。エキソンＩＩのプライマーである配列番号３１（５’ＧＴＣＣＧＣＧ
ＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＣＴＴＴＡＴＡＧＴＧ）および
配列番号３２（５’ａｇｔｔｔａｇｃｇｇｃｃｇｃＣＴＡＴＧＣＡＧＣＣＧＴＣ
ＴＴＴＧＴＧＴＴＡＧＣ３’）はＮｏｔＩ部位を含有していた。ついでエキソン
ＩおよびＩＩ鋳型ならびにプライマー配列番号２９および配列番号３２から、ウ
サギモチリンＯＲＦを得た。
【００８０】 該ＰＣＲ反応においては、一般には、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ｃＤＮＡ ＰＣＲ
キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を製造業者の説明に従
い使用した。２点の例外は、該ＰＣＲ反応に５％ ＤＭＳＯを加えたこと、およ
び以下のＰＣＲサイクリングを用いたことであった：１）９４℃で１分間、２）
９４℃で３０秒間、７２℃で３分間の５サイクル、３）９４℃で３０秒間、７０
℃で３分間の５サイクル、４）９４℃で３０秒間、６８℃で３分間の２０サイク
ル。該ウサギモチリンＯＲＦ断片をＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化し、ゲル精
製し、ｐｃＤＮＡ３ベクター内に連結し、ＳＣＳ１ 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）内に形質転換した。
【００８１】 実施例２：イヌモチリン受容体エキソン１のクローニング イヌラムダＦｉｘＩＩゲノムライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊ
ｏｌｌａ，ＣＡ）をイヌＭＴＬＲプローブ（実施例１を参照されたい）でスクリ
ーニングすることにより、イヌモチリン受容体エキソンを同定しクローニングし
た。本明細書に例示されている技術（例えば、実施例１に記載されている技術）
を用いて、該完全長クローンを容易に得ることが可能である。
【００８２】 低いストリンジェンシーの条件を用いてハイブリダイゼーションを行った。１
回増幅されたライブラリーの１．２×１０６個のファージプラークを大腸菌（Ｅ
．ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＡ上に１５０ｍｍプレート当たり３０，０
００ｐｆｕでプレーティングした。該ファージをナイロンハイブリダイゼーショ
ントランスファーメンブレン（ＮＥＮ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）に二重にトランス
ファーし、それを変性させ、中和し、洗浄し、ランダムプライムド（Ｐｒｉｍｅ
−Ｉｔ ＩＩキット，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）３２Ｐ
ｄＣＴＰ標識ヒトＭＴＬＲエキソンＩおよびエキソンＩＩプローブでプローブ
した。該メンブレンを、２時間プレハイブリダイズさせ（５０％ ホルムアミド
、２×デンハルト液、５×ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ サ
ケ精子ＤＮＡ）、ついでインキュベートした（５０％ ホルムアミド、２×デン
ハルト液、５×ＳＳＰＥ、１０％ 硫酸デキストラン、０．１％ ＳＤＳ、１０
０μｇ／ｍｌ サケ精子ＤＮＡ）（これは、１×１０６ ｃｐｍ／ｍＬのプロー
ブと共に３２℃のインキュベーター中で振とうしながら行った）。該フィルター
を、４×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ溶液中、２３℃で洗浄し、ついで２×ＳＳＣ
、０．１％ ＳＤＳ中、４２℃で洗浄し、最後に１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ
中、５５℃で洗浄した。
【００８３】 ２ラウンドのプラーク精製の後、７個のクローンを単離した。液体ライセート
調製物を使用して、それらの７個のクローンからラムダＤＮＡを単離した。指標
株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＡを溶出ファージで溶菌し、細胞残渣を遠心させた。
該液体ファージストックを３８μｇ／ｍＬのＲＮアーゼＡで３７℃で３０分間処
理し、４℃で一晩、ＰＥＧ沈降（ＳＭバッファー中、１０％ ＰＥＧ８０００／
１Ｍ ＮａＣｌ）させた。ペレット化ファージＤＮＡをプロテイナーゼＫで処理
した（５０μｇ／ｍＬ、６８℃、１５分間）。この後、フェノール／クロロホル
ム抽出およびクロロホルム抽出ならびにエタノール沈殿を行った。
【００８４】 ラムダＤＮＡを、無菌ピペットチップで巻き戻し、７０％ エタノールで洗浄
し、無菌水に再懸濁させた。各ＤＮＡを一群の制限酵素（ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲ
Ｉ、ＮｏｔＩ、ＰｓｔＩ、ＳｍａＩおよびＸｂａＩ）で消化し、１％ Ｓｅａｋ
ｅｍ ＧＴＧ １×ＴＡＥアガロースゲル上で電気泳動し、サザンブロットし、
前記のとおりのヒトＭＴＬＲエキソンＩおよびＩＩプローブでプローブした。ハ
イブリダイズしたバンドをサブクローニングし、ＢｉｇＤｙｅターミネーター予
混合体（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用し
てＡＢＩ ３７７自動シークエンサー上で配列決定した。ついで、得られた配列
情報を、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒプログラムを使用して分析した。これらのうち、ラ
ムダＤＮＡ３５からの２ｋＢのＮｏｔＩ断片が、イヌＭＴＬＲコードエキソンＩ
、スプライス部位およびイントロン配列の最大の断片を含有していた。
【００８５】 実施例３：イヌおよびウサギモチリン受容体配列 配列番号１、２、３および４のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を以下に記載
する。
【００８６】
【化７】
【００８７】 他の実施形態は特許請求の範囲に含まれる。いくつかの実施形態を示し説明し
てきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の修飾が施されう
る。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、イヌ（ｄｏｇ）モチリン受容体エキソン１、ウサギ（ｒａｂ）モチリ
ン受容体、ヒト（ｈｕ）モチリン受容体およびスフェロイデス・ネフェルス（Ｓ
ｐｈｅｒｏｉｄｅｓ ｎｅｐｈｅｌｕｓ）（ｆｉｓｈ）７５Ｅ７のタンパク質配
列（それぞれ、配列番号１、配列番号２、配列番号５および配列番号６）の比較
を例示する。
【図２Ａ】 図２Ａは、イヌ（ｄｏｇ）モチリン受容体エキソン１、ウサギ（ｒａｂ）モチ
リン受容体、ヒト（ｈｕ）モチリン受容体およびスフェロイデス・ネフェルス（
Ｓｐｈｅｒｏｉｄｅｓ ｎｅｐｈｅｌｕｓ）（ｆｉｓｈ）７５Ｅ７をコードする
ＤＮＡ配列（それぞれ、配列番号３、配列番号４、配列番号７および配列番号８
）の比較を例示する。
【図２Ｂ】 図２Ｂは、イヌ（ｄｏｇ）モチリン受容体エキソン１、ウサギ（ｒａｂ）モチ
リン受容体、ヒト（ｈｕ）モチリン受容体およびスフェロイデス・ネフェルス（
Ｓｐｈｅｒｏｉｄｅｓ ｎｅｐｈｅｌｕｓ）（ｆｉｓｈ）７５Ｅ７をコードする
ＤＮＡ配列（それぞれ、配列番号３、配列番号４、配列番号７および配列番号８
）の比較を例示する。
【図２Ｃ】 図２Ｃは、イヌ（ｄｏｇ）モチリン受容体エキソン１、ウサギ（ｒａｂ）モチ
リン受容体、ヒト（ｈｕ）モチリン受容体およびスフェロイデス・ネフェルス（
Ｓｐｈｅｒｏｉｄｅｓ ｎｅｐｈｅｌｕｓ）（ｆｉｓｈ）７５Ｅ７をコードする
ＤＮＡ配列（それぞれ、配列番号３、配列番号４、配列番号７および配列番号８
）の比較を例示する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/02 5/00 Ａ (72)発明者 マツキー，カレン アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065−0907、ローウエイ、イースト・リ ンカーン・アベニユー・126 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA63 CA04 CA09 DA06 EA03 EA04 GA11 HA12 4B063 QA18 QQ79 QR59 QR80 QS24 QS28 4B064 AG20 CA19 CC24 DA13 4B065 AA26X AA90Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA46 4H045 AA10 BA10 CA40 DA50 EA50 FA74

Claims (24)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 連続した少なくとも９アミノ酸長である配列番号１または配
    列番号２の特有アミノ酸領域を含んでなる精製されたポリペプチドであって、該
    特有領域が配列番号５または配列番号６には存在しないことを特徴とするポリペ
    プチド。
  2. 【請求項２】 該特有領域が配列番号１からのものである、請求項１記載の
    ポリペプチド。
  3. 【請求項３】 該特有領域が、 【化１】 よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む、請求項２記載のポリペプチド。
  4. 【請求項４】 該ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項
    ２記載のポリペプチド。
  5. 【請求項５】 該ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列よりなる、請求
    項４記載のポリペプチド。
  6. 【請求項６】 該特有領域が配列番号２からのものである、請求項１記載の
    ポリペプチド。
  7. 【請求項７】 該特有領域が、 【化２】 よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む、請求項６記載のポリペプチド。
  8. 【請求項８】 該ポリペプチドが配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項
    ６記載のポリペプチド。
  9. 【請求項９】 該ポリペプチドが配列番号２のアミノ酸配列よりなる、請求
    項８記載のポリペプチド。
  10. 【請求項１０】 請求項１〜９のいずれか１項記載のポリペプチドをコード
    するヌクレオチド配列を含んでなる精製された核酸。
  11. 【請求項１１】 連続的な少なくとも１８ヌクレオチド長である配列番号３
    または配列番号４の特有ヌクレオチド配列領域またはその相補体を含んでなる精
    製された核酸であって、該特有領域が配列番号７または配列番号８には存在しな
    いことを特徴とする核酸。
  12. 【請求項１２】 該特有配列領域が配列番号３からのものである、請求項１
    １記載の精製された核酸。
  13. 【請求項１３】 該特有領域が、 【化３】 よりなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む、請求項１２記載の精製された
    核酸。
  14. 【請求項１４】 該核酸が配列番号３のヌクレオチド配列を含む、請求項１
    ２記載の精製された核酸。
  15. 【請求項１５】 該核酸が配列番号３のヌクレオチド配列よりなる、請求項
    １４記載の精製された核酸。
  16. 【請求項１６】 該特有配列領域が配列番号４からのものである、請求項１
    １記載の精製された核酸。
  17. 【請求項１７】 該特有領域が、 【化４】 よりなる群から選ばれる配列を含む、請求項１６記載の精製された核酸。
  18. 【請求項１８】 該核酸が配列番号４のヌクレオチド配列を含む、請求項１
    ６記載の精製された核酸。
  19. 【請求項１９】 該核酸が配列番号４のヌクレオチド配列よりなる、請求項
    １８記載の精製された核酸。
  20. 【請求項２０】 連続的な少なくとも９アミノ酸長である配列番号１または
    配列番号２の特有アミノ酸領域をコードする組換えヌクレオチド配列を含んでな
    る発現ベクターであって、該特有領域が配列番号５または配列番号６には存在し
    ないことを特徴とする発現ベクター。
  21. 【請求項２１】 連続的な少なくとも９アミノ酸長である配列番号１または
    配列番号２の特有アミノ酸領域をコードする発現ベクターを含んでなる組換え細
    胞であって、該特有領域コード配列が、該細胞により認識されるプロモーターに
    機能的に共役しており、該特有領域が配列番号５または配列番号６には存在しな
    いことを特徴とする組換え細胞。
  22. 【請求項２２】 連続的な少なくとも９アミノ酸長である配列番号１または
    配列番号２の特有アミノ酸領域をコードする発現ベクターを細胞内に導入する工
    程を含む製造方法により製造された組換え細胞であって、該特有領域が配列番号
    ５または６には存在しないことを特徴とする組換え細胞。
  23. 【請求項２３】 化合物がモチリン受容体活性に影響を及ぼす能力の測定方
    法であって、 ａ）組換え細胞を該化合物と接触させ（該組換え細胞は、連続的な少なくとも
    ９アミノ酸長である配列番号１または配列番号２の特有アミノ酸領域を含む機能
    的モチリン受容体を発現する組換え核酸を含む。ただし、該特有領域は配列番号
    ５または６には存在しない）、 ｂ）モチリン受容体活性を測定する工程を含んでなる方法。
  24. 【請求項２４】 請求項２１記載の組換え細胞を、該ポリペプチドが該発現
    ベクターから発現される条件下で培養する工程を含んでなる、モチリン受容体ポ
    リペプチドの製造方法。
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