MXPA00009332A - Gen que codifica la proteina sintaxina interactuante - Google Patents
Gen que codifica la proteina sintaxina interactuanteInfo
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Abstract
La presente invención se refiere a genes novedosos y polipéptidos derivados de los mismos que codifican a la proteína sintaxina interactuante. La invención también describe vectores y células huéspedes que comprenden al gen novedoso. La invención además describe métodos para usar el gen novedoso, polipéptidos y anticuerpos específicamente polipéptidos blancos derivados de los genes novedosos, en la detención de supresiones genéticas del gen, la localización subcelular del polipéptido, el aislamiento de clases discretas de ARN, aplicaciones de terapia genética, el diagnostico de los síndromes que involucran la resistencia a la insulina, el desarrollo de estrategias adecuadas de escrutinio de los inhibidores de la proteína sintaxina interactuante.
Description
GEN QUE CODIFICA LA PROTEINA SINTAXINA INTERACTUANTE
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN • La presente invención se refiere a genes y polipéptidos novedosos derivados de los mismos que codifican una proteína sintaxina interactuante. La invención también describe vectores y células huésped que comprenden el gen novedoso. La invención también describe adicionalmente métodos para utilizar el gen novedoso, polipéptidos, y anticuerpos que seleccionan específicamente los polipéptidos, en la detección de supresiones
• genéticas del gen, localización subceiular del polipéptido, aislamiento de clases discretas de ARN, aplicaciones de terapia de gen, diagnósticos de síndromes que involucran niveles anormales de glucosa o translocación anormal de GLUT4,
desarrollo de estrategias de selección patentadas para inhibidores de proteína sintaxina interactuante.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA La estimulación por insulina del transporte de glucosa 20 en los tipos principales de células que responden a insulina de músculo, de esqueleto y grasa ocurre por la constricción de transportadores de glucosa, en particular GLUT4, desde el compartimento microsomal de baja densidad intracelular a la superficie de las células. Se ha implicado una cierta clase de 25 proteína en las translocación inducida por insulina de GLUT4 a la membrana plasmática. Está clase de proteína se ha referido como proteínas SNARE. Las proteínas SNARE son receptores de proteína en
• uniones del factor sensitivo con membrana de vesícula y membrana objetivo soluble en N-etilmaleiduro. Las proteínas SNARE identificadas en la membrana de vesícula o las v-SNAREs, son sinaptobrevina o VAMP. Las proteínas SNARE identificadas en la membrana objetivo, o t--SNAREs, son sintaxina y SNAP-25. Estudios recientes han demostrado que isoformas de sintaxina, especialmente sintaxina-4, y VAMP, especialmente VAMP2 y VAMP3/celubrevina, son las t-SNAREs y las v-SNAREs funcionales requeridas para la traslocación de GLUT4 estimulada por insulina hacia la membrana plasmática. La translocación de GLUT4 juega un papel importante en la toma de glucosa por las
células, la cual a su vez juega un papel importante en los estados afectivos caracterizados por la toma de glucosa anormal. Al ganar un entendimiento del mecanismo bioquímico detrás de estás v- y t- SNAREs requeridas y su efecto en la translocación de GLUT4 estimulada por insulina, nuevas oportunidades para tratar y
diagnosticar afecciones relacionadas con el almacenamiento anormal (alto o bajo) y/o utilización de glucosa, puede lograrse. Expresado de otra manera, un mejor entendimiento de los mecanismos moleculares de transporte de glucosa permitirá el diseño mejorado de fármacos terapéuticos que tratan afecciones
relacionadas con el almacenamiento anormal y/o utilización de glucosa. Tales estados afectivos incluyen diabetes, afecciones de almacenamiento de glicógeno, obesidad, síndrome de ovario poliquístico, hipertensión, arteriosclerosis y otras afecciones de resistencia a la insulina.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere al descubrimiento y purificación de una novedosa proteína objetivo de membrana (SNARE) la proteína sintaxina-4 interactuante ("SYNIP") y el aislamiento de secuencias de polinucleótido que codifican las proteínas. Las SYNIPs son de interés debido a que juegan un papel importante en la translocación de GLUT4 desde el compartimento intracelular hasta la superficie de la célula en respuesta a la presencia de insulina. Las SYNIPs se enlazan competitivamente a la sintaxina-4 y evitan al ligando de interactuar con su receptor intracelular consanguíneo. Está propiedad de las SYNIPs tiene efectos fisiológicos profundos. Así, al regular los niveles intracelulares de las SYNIPs expuestas, pueden obtenerse efectos fisiológicos deseables. Tales efectos pueden utilizarse para tratar una diversidad de afecciones que involucran niveles anormales de glucosa o la translocación anormal de GLUT4 (es decir estados afectivos que incluyen, pero no se limitan a diabetes, afecciones del almacenamiento de glicógeno, obesidad, síndrome de ovario poliquístico, hipertensión, arteriosclerosis y otras enfermedades de resistencia a la insulina).
La razón fundamental para el uso terapéutico de SYNIP para diseñar o descubrir el tratamiento para estas afecciones se basa en el desajuste general del transporte de glucosa en tales estados. Numerosos estudios han mostrado que la estimulación del transporte de glucosa por insulina se reduce significativamente en la diabetes Tipo II y otros estados de resistencia a la insulina. Así, las propuestas farmacológicas o genéticas para aliviar esta deficiencia tendrán un impacto principal en las afecciones descritas anteriormente. Un aspecto de la invención es proporcionar las SYNIPs purificadas. Las proteínas purificadas pueden obtenerse de células recombinantes o células que ocurren naturalmente. Las SYNIPs purificadas de la invención pueden ser de origen mamífero, las de primate, que incluyen las SYNIPs derivadas de humano son ejemplos de las diversas SYNIP específicamente proporcionadas. La invención también proporciona variantes alélicas y derivados biológicamente activos de las SYNIPs que ocurran naturalmente. Otro aspecto de la invención es proporcionar polinucleótidos que codifican las SYNIPs de la invención y proporcionar polinucleótidos complementarios a la cepa que codifica polinucleótidos. Los polinucleótidos de la invención pueden utilizarse para proporcionar la expresión recombinante de las SYNIPs. Los polinucleótidos de la invención también pueden utilizarse para propósitos de terapia genética a manera de tratar afecciones relacionadas con los receptores intracelulares que enlazan ligandos que se enlazan a las SYNIPs, usadas en la detección de supresiones genéticas del polinucleótido, localización subcelular del polipéptido, y aislamiento de clases discretas de ARN. La invención también proporciona polinucleótidos para uso como sonda de hibridización y cebadores de amplificación para la detección de polinucleótidos que codifican las SYNIPs que ocurre naturalmente. Otro aspecto de la invención es proporcionar anticuerpos capaces de enlazarse a las SYNIPs de la invención. Los anticuerpos puede ser policlonales o monoclonales. La é° invención también proporciona métodos para utilizar los anticuerpos objetivo para detectar y medir la expresión de las SYNIPs ya sea in vitro o in vivo o para detecta proteínas que interactúan con las SYNIPs, o moléculas que regulan cualesquiera
de las actividades de las SYNIPs. Otro aspecto de la invención es proporcionar pruebas para la detección o selección de compuestos terapéuticos que interfieren con la interacción entre las SYNIPs y la sintaxina-4 (u
• otros ligando que se enlazan a las SYNIP). Las pruebas de la
invención comprenden la etapa de medir el efecto de un compuesto de interés en el enlace entre las SYNIPs y la sintaxina- 4 (u otros ligandos que se enlazan a las SYNIP). El enlace puede medirse en una diversidad de formas, que incluyen el uso de SYNIP marcadas o ligandos marcados.
Otro aspecto de la invención es proporcionar pruebas para el descubrimiento de proteínas que interactúan directamente o indirectamente con las SYNIPs. Las pruebas de la invención
# comprenden un método para detectar tales interacciones en células, o en pruebas bioquímicas. Estás interacciones pueden detectarse en una diversidad de formas, que incluyen el uso de ADNc que codifica las SYNIPs, o las SYNIPs en sí mismas, o fragmentos o modificaciones de las mismas. Lo anterior no intenta y no debe interpretarse como que i' limita la invención en cualquier forma. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tiene el mismo significado como se entiende comúnmente por alguien con experiencia en la técnica a la cual ésta invención pertenece. Todas las patentes Norteamericanas y todas las
publicaciones mencionadas en la presente se incorporan en su totalidad por referencia a la misma.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1. Clonación, caracterización de la expresión de 20 SYNIP y especificidad de enlace. A) Secuencias de aminoácidos deducidas de la estructura de lectura abierta sencilla de SYNIP ADNc aislado. B) Organización estructural predicha de los dominios funcionales de SYNIP. Los números en lo alto indican los residuos de aminoácidos que definen las fronteras de estos 25 dominios. C) Análisis de tinción Northern de la expresión SYNIP ARNm en tejidos de ratón. La tinción múltiple de ARNm de tejido de ratón se probó con las secuencias de codificación de SYNIP ADNc. H, corazón; Br, cerebro; Sp, bazo; Lu, pulmón; Li, hígado;
# Sk, músculo esquelético; K, riñon; Te, testículo; D) Especificidad del enlace SYNIP/WT y SYNIP/CT a Sintaxina 4. Lisados celulares de células 293T SYNIP tipo silvestre marcado con señalizador (SYNIP/WT) o la SYNIP carboxilo terminal (SYNIP/CT) se incubaron con cantidades iguales de proteínas GST (senda 1), GST-Syn1A (senda 2), GST-Syn1B (senda 3), GST-Syn2 (senda 4), É0 GST-Syn3 (senda 5) y GST-Syn4 (senda 6) inmovilizadas en cuentas de glutatión-agarosa. Las proteínas retenidas se inmunotiñeron con anticuerpo antiSeñalizador. La secuencia de SYNIP y ADNc se ha depositado en el Banco de Genes. Número de acceso XXXXXX. 15 FIGURA 1A: A - SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS SYNIP; FIGURA 1B: B - ESTRUCTURA DE DOMINIO SYNIP FIGURA 1C: A - TINCIÓN NORTHERN FIGURA 1D: A - ESPECIFICACIÓN DE ENLACE; B - IB: SEÑALIZADOR 20 Figura 2. La estimulación con insulina induce una disociación de SYNIP desde la sintaxina-4 in vivo. Las células CHO/IR se transfectaron con la SYNIP de longitud completa (SYNIP/WT), el dominio SYNIP amino terminal (SYNIP/NT) o el dominio SYNIP carboxilo terminal (SYNIP/CT) y estimulado con y
sin insulina. A) los lisados celulares se prepararon e inmunotiñeron con el anticuerpo Señalizador. B) Los lisados celulares se inmunoprecipitaron con un anticuerpo sintaxina-4 e inmunotiñeron con el anticuerpo Señalizador. C). Los inmunoprecipitados en (B) se inmunotiñeron con el anticuerpo sintaxina-4. FIGURA 2A: A - LISADO; B- IB:SEÑALIZADOR; C- INSULINA FIGURA 2B: A- IB: SEÑALIZADOR; B- INSULINA. FIGURA 2C: A- IP-SYN4; B- IB:SEÑALIZADOR; C- INSULINA. Figura 3. La estimulación con insulina resulta en una afinidad por la sintaxina-4. Las células CHO/IR se transfectaron con la SYNIP de longitud completa (SYNIP/WT), el dominio SYNIP amino terminal (SYNIP/NT) o el dominio SYNIP carboxilo terminal (SYNIP/CT) y se estimularon con y sin insulina. A) los lisados celulares se prepararon e inmunotiñeron con el anticuerpo Señalizador. B) Los lisados celulares se incubaron con la proteína de fusión GST-Syn4 y los precipitados resultantes se inmunotiñeron con el anticuerpo señalizador. C) Los lisados celulares se incubaron con la proteína fusionada GST-SYNIP y los precipitados resultantes se inmunotiñeron con el anticuerpo sintaxina-4. D) Los lisados celulares se incubaron con diversas cantidades de la proteína fusionada GST-Syn4 y los precipitados resultantes se inmunotiñeron con el anticuerpo Señalizador. FIGURA 3A: A - LISADO; B- IB- SEÑALIZADOR; C- INSULINA. FIGURA 3B: A - IB- SEÑALIZADOR; B- INSULINA. FIGURA 3C: A - IB: SYN4; B- LISADO; C- INSULINA.
FIGURA 3D: A - IB- SEÑALIZADOR; B- LISADO; C- INSULINA.. Figura 4. La insulina induce la disociación del complejo SYNIP: sintaxina-4 en adipocitos 3T3L1 diferenciados. Los
# adipocitos 3T3L1 diferenciados se transfectaron con las SYNIPs de longitud completa (SYNIP/WT) o el dominio SYNIP carboxilo terminal (SYNIP/CT) y se estimularon con y sin insulina. A) Los lisados celulares se prepararon e inmunotiñeron con el anticuerpo Señalizador. B) Los lisados celulares se incubaron con la proteína fusionada GST-Syn4 y los precipitados resultantes se inmunotiñeron con el anticuerpo Señalizador. # FIGURA 4A: A - LISADO; B- IB:SEÑALIZADOR; C- INSULINA. FIGURA 4B: A - IB- SEÑALIZADOR; B- INSULINA. Figura 5. La expresión de un mutante interferente dominante del SYNIP inhibe el transporte de glucosa estimulado
por insulina. A) Adipocitos 3T3L1 diferenciados se pasaron por electroforesis con diversas cantidades de pcDNA3.1-LacZ y eficiencia de transfección/expresión valorada por la mancha X-Gal para expresión de ß-galatoxidasa. Para cada condición de
• electroforesis la cantidad total de plásmido de ADN fue de 600µg
mantenida por la visión del vector vacío pcADN 3.1. B) adipocitos 3T3L1 diferenciados se pasaron por electroforesis con ya sea el vector vacío o diversas construcciones de SYNIP ADNc y se determinó la velocidad de transporte de 2-desoxiglucosa basal (barras abiertas) y estimulada por insulina (barras sólidas). 25 FIGURA 5A: A - EXPESION DE B-GALACTOSIDAZA.
FIGURA 5B: A - TRANSPORTE DE GLUCOSA; B- INSULINA; C-ESTIMULACION RELATIVA DE INSULINA. Figura 6. La expresión de un mutante interferente dominante de SYNIP inhibe GLUT4 estimulada por insulina pero no la traslocación de GLUT1. A) Adipocitos 3T3L1 diferenciados se co-trasfectaron con GLUT4-eGFP y diversas SYNIP ADNc. B) Adipocitos 3T3L1 diferenciados se co-transfectaron con eGFP-GLUT4 y diversas SYNIP ADNc. La localización subcelular de GLUT4-eGFP y eGFP-GLUT1 se determinó en las células control y estimuladas con insulina por microscopía fluorescente con focal. FIGURA 6A: A - CONTROL; B- INSULINA.. FIGURA 6B: A - CONTROL; B- INSULINA. Figura 7. Modelo hipotético para la regulación independiente de insulina de la función SYNIP y translocación GLUT4. FIGURA 7: A - DINAMINA; B- LISOSOMA; C- SEPARACIÓN DE INDOSAMA.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Dentro de está solicitud, a menos que se diga lo contrario, las técnicas utilizadas pueden encontrarse en cualquiera de diversas referencias bien conocidas tales como: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Gene Expression Technology (Methods in Enzymology, Vol. 185, editado por D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, CA), "Guide to Protein Purification" in Methods in Enzymology (M.P. Deutshcer, ed., (1990) Academic Press, Inc); PCR Protocols: A Guide to Methods and Aplications (Innis et al., 1990, Academic Press, San Diego, CA), Culture of Animal Cell: A Manual of Baste Technique, 2nd ed. (R.l. Freshney, 1987, Liss, Inc. New York, NY), and Gene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, ed. E.J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, NJ). En un aspecto, la presente invención proporciona polinucleótidos purificados y aislados novedosos, más adelante
•10 referidos como genes de proteína de sintaxina-4 interactuante ("SYNIP") que codifican las SYNIPs. El término "sintaxina-4" se usa ampliamente en la presente. A menos que se señale lo contrario, el término "sintaxina-4" ¡ncluye, pero no se limita a, cualquier forma de sintaxina-4 derivada de mamífero natural y
similares. Se prefiere que el término sintaxina-4 incluya primates y humanos. También, el término "interactuante se usa ampliamente en la presente. A menos que se señale lo contrario, el termino "interactuante", incluye, pero no se limita a, efecto y regulación. Los polinucleótidos provistos pueden codificar las
SYNIPs completas o porciones de las mismas. Los polinucleótidos de la invención pueden producirse por una diversidad de métodos que incluyen síntesis química in vitro utilizando la técnica de síntesis de fase sólida bien conocida, por clonación o combinaciones de los mismos. El polinucleótido de la invención
puede derivarse de bibliotecas ADNc o genómicas. Personas con experiencia común en la técnica están familiarizadas con la degeneración del código genético y pueden fácilmente diseñar polinucleótidos que codifican ias SYNIPs que tengan homología en la secuencia de polinucleótido o parcial a secuencias de polinucleótido que ocurren naturalmente que codifican las SYNIPs. Los polinucleótidos de la invención pueden ser de hebras sencillas o de doble hebra. También se proporcionan poliriucleótidos complementarios a los polinucleótidos que codifican las SYNIPs. El polinucleótido que codifica una SYNIP puede obtenerse de bibliotecas de ADNc preparadas de tejido que se
# cree que posen SYNIP ARNm y la expresan a un nivel detectable. Por ejemplo, la biblioteca ADNc puede construirse al obtener ARNm poliadenilado de una línea de células conocidas por expresar SYNIP y utilizar el ARNm como una plantilla para
sintetizar el ADNc de doble hebra. Las bibliotecas, ya sea de ADNc o genómica, se seleccionan con sondas diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína codificada por él. Para la expresión de
^"P bibliotecas de ADNc, sondas adecuadas que incluyen anticuerpos
monoclonales y policlonales que reconocen y que se enlazan específicamente a una SYNIP. Para bibliotecas ADNc las sondas adecuadas incluyen sondas de oligonucleótido seleccionadas cuidadosamente (usualmente de aproximadamente 20-80 bases en longitud) que codifican porciones conocidas fechadas de una
SYN1P de la misma o diferente especie, y/o ADNc complementario u homólogo o fragmentos del mismo que codifican el mismo o un gen o uno similar, y/o ADN homólogo o genómico o fragmentos del mismo. La sección del ADNc o biblioteca genómica con las sondas seleccionadas puede conducirse usando procedimientos estándar como se describe en los capítulos 10-12 de Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un método preferido para practicar está invención es utilizar secuencias de oligonucleótido cuidadosamente seleccionadas para seleccionar bibliotecas de ADNc de diversos
• tejidos. Las secuencias oligonucleótidas seleccionadas como sondas deben ser suficientes en longitud y suficientemente sin ambigüedad para que los falsos positivos se minimicen. La o las secuencias de nucleótidos actual es/son usualmente diseñadas
basadas en regiones de una SYNIP que tiene al menos redundancia de codón. Los oligonucleótidos pueden degenerarse en una o más posiciones. El uso de oligonucleótidos generados es de particular importancia en donde una biblioteca se selecciona de
• una especie en la cual no se conoce el uso de codón preferencial.
El oligonucleótido debe marcarse de tal manera que pueda detectarse en la hibridización de ADN en la biblioteca que se está seleccionando. El método preferido para marcar es utilizar ATP (por ejemplo, T32P) y polinucleótido quinasa para radio marcar el extremo 5' del oligonucleótido. Sin embargo, otros métodos pueden utilizarse para marcar el oliginucleótido, que ¡ncluye, pero no se limita a, biodimilación o marcado de enzima. También pueden identificarse ADNc que codifica SYNIP y aislarse por otras técnicas conocidas de la tecnología ADN recombinante, tal como clonación de expresión directa o usando la reacción en cadena de polimerasa (PCR) como se describió en la Patente Norteamericana Número 4,683,195, en la Sección 14 de Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 1989 Chapter 15 de Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et
• al., eds., Green Publishing Associates and Wiley-lnterscience, 1991. Esté método requiere el uso de sondas de oligonucleótido que se hibridizarán al ADN que codifica una SYNIP. En una modalidad preferida, la invención comprende
secuencias de ADN sustancialmente similares a aquellas mostradas en SEC. DE IDENT. 1 ó 6 (polinucleótidos SYNIP humanos). Como se define en la presente, "sustancialmente similar," incluye secuencias idénticas, así como supresiones,
• sustituciones aún de ADN, ARN o secuencia de proteína que
mantiene la función del producto de proteína y posee motivos de enlace similares al zinc. De preferencia, las secuencias de ADN de acuerdo con la invención consisten esencialmente de la secuencia de ADN de la SEC. DE IDENT. 3, 4 ó 6. Estas secuencias de ADN aisladas y purificadas novedosas puede utilizarse para dirigir la expresión de SYNIP y para el análisis mutacional de la función SYNIP. Las secuencias mutadas de acuerdo con la invención
• pueden identificarse en una forma rutinaria por aquellos expertos en la técnica usando las enseñanzas proporcionadas en la presente, y las técnicas bien conocidas en el arte. En una modalidad preferida, la presente invención comprende una secuencia del nucleótido que se hibridiza a la secuencia de nucieótido mostrada en la SEC. DE IDENT. 1, 3, 4 ó 6 bajo condiciones de hibridización de alto rigor. Como se usa en
• la presente, el término "condiciones de hibridación de alto rigor se refiere a la hibridización a 65°C" en un amortiguador de hibridización de baja salinidad a la sonda de interés de 2 x 108 cpm/µg por entre aproximadamente 8 horas a 24 horas, seguida
por lavado en 1% SDS, 20 mM de amortiguador de fosfatos y 1 mM de EDTA a 65°C, por entre aproximadamente 30 minutos a 4 horas. En una modalidad preferida, el amortiguador de hibridización de baja salinidad comprende de entre aproximadamente 0.5-10% SDS, y 0.05 m y 0.5m de fosfato de sodio. En una modalidad más
preferida, el amortiguador de hibridización de baja salinidad comprende, 7% SDS, y 0.125 M de fosfato de sodio. Los polinucleótidos de la invención tiene una diversidad de usos, algunos de los cuales han indicados o se tomaran en gran detalle, infra. Los usos particulares para un polinucleótido
dado dependen, en parte, en la modalidad de polinucleótidos especifica de interés. Los polinucleótidos de la invención pueden utilizarse como sondas de hibridización para recuperar polinucleótidos que codifican SYNIP o una porción de los mismos de bibliotecas genéticas. Los polinucleótidos de la invención también pueden utilizarse como cebadores para la amplificación de polinucleótidos que codifican SYNIP o una porción de los mismos a través de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y otros procedimientos de amplificación similares. Los polinucleótidos de la invención también pueden utilizarse como sondas y cebadores de amplificación para detectar mutaciones en polinucleótidos que codifican SYNIP o una porción del mismo que ha sido correlacionada con afecciones, particularmente afecciones relacionadas con la sobre expresión o subexpresión de ligandos para SYNIP. La invención también proporciona una diversidad de vectores de expresión de polinucleótido, que comprenden polinucleótidos que codifican SYNIP o una porción del mismo o una secuencia sustancialmente similar a ella subclonada dentro de un vector extra cromosómico. Este aspecto de la invención permite la presión in vitro de polinucleótidos que codifican SYNIP, permitiendo así un análisis de regulación de polinucleótidos que codifican SYNIP y función de estructura SYNIP. Como se usa en la presente, el término "vector extracromosómico" incluye, pero no se limita a, plásmidos, bacteriófagos, cósmidos, retrovirus y cromosomas artificiales. En una modalidad preferida, el vector extracromosómico comprende un vector de expresión que permite la producción de SYNIP cuando la molécula de ADN recombinante se inserta dentro de una célula huésped. Tales vectores son bien
• conocidos en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a, aquellos con los productores de polimerasa T3 o T7, el promotor SV40, el promotor CMV, o cualquier promotor que pueda dirigir la expresión del gen, o aquel que desee probar la capacidad para dirigir la expresión del gen. En una modalidad preferida, los vectores de expresión objetivo comprenden una secuencia de polinucleótido que codifica
• una SYNIP en combinación funcional con una o más secuencias de promotor para proporcionar la expresión de la SYNIP (o una copia antisentido de la secuencia adecuada para la inhibición de la expresión de un gen endógeno). Los vectores pueden comprender
secuencias adicionales de polinucleótido para la expresión del gen, regulación, o la manipulación conveniente del vector, tales secuencias adicionales incluyen terminadores, mejoradores, marcadores selectivos, sitios de empaque y similares. La descripción detallada de los vectores de expresión de
polinucleótido y su uso puede encontrarse en, entre otros lugares Gene Expressión Technology: Methods in Enzymology, Volume 185, Goeddel, ed., Academic Press Inc., San Diego, CA (1991), Protein Expression in Animal Cell, Roth, ed., Academic Press, San Diego, CA (1994).
Los vectores de expresión de polinucleótidos de la invención tienen una diversidad de usos. Tales usos incluyen la ingeniería genética de células huésped para expresar las SYNIPs. En una aspecto adicional, la presente invención proporciona células huésped recombinantes que se transfectan establemente con una molécula de ADN recombinante que comprende polinucleótidos que codifican SYNIP subclonado dentro de un vector extra-cromosómico. Las células huésped de la presente invención pueden ser de cualquier tipo, incluyendo, pero no limitándose a, bacterias, levaduras, y células de mamífero. La transfección de células huésped con moléculas de ADN recombinante es bien conocida en la técnica (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ed., Cold Spring Harbor Press, 1989) y, como se usa en la presente, incluye pero no se limita a transfección de fosfato de calcio, transfección de sulfato de dextrano, electroporación, lipofección e infección viral. Este aspecto de la invención permite la expresión in vitro e in vivo de SYNIP y su producto gen, o una porción de SYNIP y su producto gen, permitiendo así la expresión de alto nivel de SYNIP o una porción del mismo. Otros usos de los vectores de expresión de polinucleótidos, discutidos en gran detalle, infra, incluye, su uso para terapia genética para afecciones y condiciones en las cuales puede ser deseable su uso para expresar SYNIP a niveles mayores que los niveles de expresión que ocurre naturalmente.
Alternativamente, puede ser deseable utilizar los vectores objetivo para la expresión antisentido para reducir los niveles que ocurren naturalmente de SYNIP. • En otro aspecto, la presente invención proporciona una proteína recombinante sustancialmente purificada que comprende un polipéptido sustancialmente similar a la SYNIP mostrada en la SEC. DE IDENT. 2 ó 5. Además, este aspecto de la invención permite el uso de la SYNIP en diversos ensayos in vitro descritos anteriormente. Como se emplea en la presente, el término "sustancialmente similar" incluye eliminaciones, sustituciones y
« adiciones a las SEC. DE IDENT. 2 ó 5. Introducidas por cualquier medio in vitro. Como se usa en la presente, el término "sustancialmente purificado" significa que la proteína debe estar libre de proteína contaminante detectable, pero la SYNIP puede
co-purificarse con una proteína interactuante, o como un oligómero. En una modalidad más preferida, la secuencia de proteína de acuerdo con la invención comprende una secuencia de aminoácido de SEC. DE IDENT. 2 ó 5. Las secuencias mutadas de
• acuerdo con la invención pueden identificarse en una forma
rutinaria por aquellos expertos en la técnica usando las enseñanzas provistas en la presente y las técnicas bien conocidas en la técnica. Este aspecto de la invención proporciona una proteína purificada novedosa que puede utilizarse para pruebas in vitro y como un componente de una composición farmacéutica para
la modificación de la translocación de GLUT4, descrita infra.
Las SYNIPs pueden utilizarse para descubrir moléculas que interfieren con sus actividades. Por ejemplo, las moléculas que previenen el enlace de SYNIP a las sintaxina-4 en tejidos que responde s a insulina, incrementando así el transporte de glucosa. Adicionalmente, las SYNIPs pueden utilizarse para encontrar otras proteínas que puedan interactuar directamente con ellas, representando amortiguadores importantes adicionales del transporte de glucosa. Las SYNIPs de la presente invención tienen la actividad biológica de enlazarse a la sintaxina-4. La SYNIP de la invención puede aislarse de un diversidad de especies de animales mamíferos. Las especies de mamíferos preferidas para aislamientos son los primates y los humanos. La invención también contempla variantes alélicas de SYNIP. Las SYNIPs pueden prepararse de una diversidad de tejidos de mamífero, sin embargo líneas de células establecidas de tejido que responde s a insulina son fuentes no recombinantes preferidas de SYNIP. De preferencia las SYNIPs se obtienen de células huésped recombinantes diseñadas genéticamente para expresar cantidades significativas de SYNIP. Las SYNIPs pueden aislarse de células recombinantes o no recombinantes en una diversidad de formas bien conocidas para una persona con experiencia común en la técnica. El término "SYNIP" como se usa en la presente se refiere no solamente a las proteínas que tiene la secuencia de residuo de aminoácido de las SYNIPs que ocurren naturalmente, sino también se refiere a los derivados funcionales y variantes de las SYNIPs que ocurre naturalmente. Un "derivado funcional" de un polipéptido nativo es un compuesto que tiene una actividad biológica cualitativa en común con la SYNIP nativa. Así, un derivado funcional de una SYNIP nativa es un compuesto que tiene una actividad biológica cualitativa en común con una SYNIP nativa, por ejemplo enlazarse a sintaxina-4 y otros ligandos consanguíneos. "Derivados funcionales" incluyen, pero no se limitan a, fragmentos de polipéptidos nativos de cualquier especie animal, (incluyendo al ser humano), y derivados de polipéptidos nativos (humanos y no humanos) y sus fragmentos, con la condición de que tengan una actividad biológica en común con un polipéptido nativo respectivo. "Fragmentos" comprende regiones dentro de las secuencia de un polipéptido nativo maduro. El término "derivado" se usa para definir variantes de glicosilación y secuencias de aminoácidos dentro de su definición. De preferencia, los derivados funcionales son polipéptidos que tienen al menos aproximadamente 65% de identidad de secuencia de aminoácidos, de mayor preferencia aproximadamente 75% de identidad de secuencia de aminoácidos, aún de mayor preferencia al menos 85% de identidad de secuencia de aminoácidos, de mayor preferencia al menos 95% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de un polipéptido nativo correspondiente. De mayor preferencia, los derivados funcionales de una SYNIP nativa retienen o imitan la región o regiones dentro de las secuencias del polipéptido nativo que participa directamente en el enlace de ligando. La frase "derivado funcional" incluye específicamente péptidos y moléculas orgánicas pequeñas
• que tiene una actividad biológica cualitativa en común con una SYNIP nativa. "Identidad" o "humologías" con respecto a un polipéptido nativo y su derivado funcional se define en la presente como el porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia candidato que son idénticos a los residuos de un polipéptidos
^0 nativo correspondiente, después de alinear las secuencias e introducir intervalos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de homología, y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la secuencia de identidad. Ni las extensiones ni las inserciones N- o C-terminales deben tomarse
como identidad reductora u homología. Métodos y programas de computación para la alineación son bien conocidos en la técnica. Variantes de la secuencia de aminoácidos de las SYNIPs nativas y los fragmentos SYNIP se preparan por métodos conocidos en la técnica introduciendo cambios nucleótidos
apropiados dentro de una SYNIP nativa o variante que codifica ADN, o por síntesis in vitro del polipéptido deseado. Existen dos variables principales en la construcción de las variantes de las secuencias de aminoácidos: la ubicación del sitio de mutación y la naturaleza de la mutación. Con la excepción de los alelos que
ocurren naturalmente, que no requieren la manipulación de la secuencia de ADN que codifica a la SYNIP, las variantes de secuencia de aminoácidos de SYNIP se construyen de preferencia al mutar el ADN, ya sea para llegar a un alelo o a una variante de la secuencia de aminoácidos que no ocurre en la naturaleza. Alternativamente o en adición, las alteraciones de aminoácidos pueden hacerse en sitios que difieren en las SYNIPs de diversas especies, o en regiones altamente conservadas, dependiendo de la meta a lograrse. Los sitios en tales ubicaciones se modificarán típicamente en series, por ejemplo, por (1) sustituir primero con selecciones conservadoras y después con selecciones más radicales dependiendo de los resultados logrados, (2) suprimir el residuo o los residuos objetivo, o (3) insertar residuos de la misma o diferente clase adyacente al sitio ubicado, o combinaciones de las opciones 1-3. Una técnica útil se llama "selección de alanina" Cunningham and Wells, Science, 1989; 244:1081-1085. Aquí, un residuo o grupos objetivo que residen, se identifican y sustituyen por alanina o polialanina. Aquellos dominios que demuestran sensitividad funcional a la sustituciones de alanina se refinan entonces introduciendo adicionalmente otros sustituyentes en o para los sitios de sustitución de alanina. Después de identificar las mutaciones deseadas, el gen que codifica una variante SYNIP puede, por ejemplo, obtenerse por síntesis química.
De mayor preferencia, el ADN que codifica una variante de la secuencia de aminoácido de SYNIP se prepara por mutagénesis dirigida al sitio del ADN que codifica una versión variante o no variante preparada antes de SYNIP. La mutagénesis dirigida al sitio (sitio-específico) permite la producción de variantes SYNIP a través del uso de secuencias de oligonucleótidos especificas que codifican la secuencia de ADN de la mutación deseada, al igual que un número suficiente de nucleótidos adyacentes, para proporcionar una secuencia de
,.«10 cebador de tamaño y complejidad de secuencia suficiente para
• formar un dúplex estable en ambos lados de la unión de supresión que es atravesada. Típicamente, un cebador de aproximadamente 20 a 25 nucleótidos de largo se prefiere, con aproximadamente 5 a 10 residuos en ambos lados de la unión de la secuencia que se
altera. En general, las técnicas de mutagénesis en sitios específicos son bien conocidos en la técnica, como se ejemplifica por publicaciones tales como Edelman et al., DNA, 1983;2:183. Como se apreciará, la técnica de mutagénesis en sitios específicos emplea típicamente un factor fago que existe en una
forma de hebra sencilla y de doble hebra. Los vectores típicos útiles en la mutagénesis dirigida al sitio incluyen vectores tales como el fago M13. Este y otros vectores fago están comercialmente disponibles, y su uso es bien conocido por aquellos expertos en la técnica. Un procedimiento versátil y
eficiente para la construcción de mutaciones dirigidas al sitio específico de oligodesoxiribonucleótido en fragmentos de ADN usando vectores derivados M13 se publicó por Zoller M.J. and Smith M., Nucleic Acids Res., 1982; 10:6487-6500). También,
• vectores plásmidos que contiene un origen de replicación de fago de hebra sencilla, Veira et al., Meth. Enzymol., 1987; 153:3 puede emplearse para obtener ADN de hebra sencilla. Alternativamente, se introducen sustituciones de nucleótidos al sintetizar el fragmento apropiado de ADN in vitro y amplificarlo por procedimientos de PCR conocidos en la técnica. En general, la mutagénesis de sitio específico puede
• realizarse obteniendo un vector de hebra sencilla que incluye dentro de su secuencia una secuencia de ADN que codifica la proteína relevante. Se prepara un cebador oligonucleótido que lleva la deseada secuencia mutada generalmente, sintéticamente,
por ejemplo, Crea et al., Proc Nati. Acad. Sci., USA, 1978; 75:5765. Este cebador se templa después con el vector que contiene las secuencias de proteína de hebra sencilla, y se somete a las enzimas polimerizantes de ADN tales como el fragmento de polimerasa I de Klenow de E. Coli para completar la síntesis de la
hebra que lleva la mutación. Así, se forma un heterodúplex en donde una hebra codifica la secuencia original no mutada y la segunda hebra lleva la mutación que se desea. Este vector heteroduplex se usa entonces para transformar las células huésped apropiadas tales como las células HB101, que
seleccionan los clones que incluyen vectores recombinantes que llevan el arreglo de la secuencia mutada. Después, la región mutada puede eliminarse y colocarse en un vector de expresión apropiado para la producción de proteína. La técnica PCR también puede utilizarse para crear variantes de la secuencia de aminoácidos de una SYNIP. Cuando pequeñas cantidades de plantilla de ADN se usan como material inicial en una PCR, los cebadores que difieren ligeramente en la secuencia de la región correspondiente en una plantilla de ADN pueden utilizarse para generar cantidades relativamente grandes de un fragmento específico de ADN que difiere de la plantilla solamente en las posiciones en donde los cebadores difieren de la plantilla. Para la introducción de una mutación dentro de un plásmido de ADN, uno de los cebadores se diseña para traslapar la posición de la mutación y contener la mutación; la secuencia del
otro cebador debe ser idéntica a un intervalo de secuencia de la hebra puesta del plásmido, pero esta secuencia puede ubicarse en cualquier lugar a lo largo del plásmido del ADN. Se prefiere sin embargo, que la secuencia del segundo cebador se ubique dentro de los 200 nucleótidos de aquel del primero, para que en el
extremo la región completa amplificada de ADN unida por los cebadores pueda estar fácilmente en secuencia. La amplificación de PCR que utiliza un par de cebadores similar a aquel descrito que resulta en una población de fragmentos de ADN que difieren en la posición de la mutación especificada por el cebador, y posiblemente en otras posiciones, como la copia de la plantilla que es un tanto propensa al error. Detalles adicionales de lo anterior y técnicas de
• mutagénesis similares se encuentran el libros de texto generales, tales como, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: H Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor (1989), y Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley and Son (1995). Los aminoácidos que ocurren naturalmente se dividen en grupos basados en propiedades de cadena lateral comunes: • (1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrofóbicos neutros: cys, ser, tier; (3) ácidos; asp, glu; (4) básicos: asn, gin, his, lys, erg; 15 (5) residuos que influencian la orientación de la cadena: gly, pro; y (6) aromáticos: trp, tyr, pine. Las sustituciones conservadoras involucran el intercambio de un miembro dentro de un grupo por otro miembro
dentro del mismo grupo, mientras que las sustituciones no conservadoras vinculan el intercambio de un miembro de una de estas clases por otro. Se espera que las variantes obtenidas por sustituciones no conservadoras resulten en cambio significativos en las propiedades/función biológica de la variante obtenida, y
pueden resultar en variantes SYNIP que bloqueen las actividades biológicas de SYNIP, es decir, el enlace de ligando, Las posiciones de aminoácidos que se conservan entre diversas especies sustituyen generalmente en una forma relativamente conservadora si la meta es retener la función biológica. Las supresiones de la secuencia de aminoácidos generalmente varían de aproximadamente 1 a 30 residuos, de mayor preferencia de aproximadamente 1 a 10 residuos y típicamente son contiguas. Las supresiones pueden introducirse dentro de regiones no directamente involucradas en la unión de ligandos. Las inserciones de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carboxilo terminales que varían en longitud de un residuo hasta polipéptidos que contiene un ciento o más de residuos, al igual que inserciones intrasecuencia de residuos de aminoácidos sencillos o múltiples. Las inserciones intrasecuencia (es decir inserciones dentro de las secuencia de aminoácido de SYNIP) puede variar generalmente de aproximadamente 1 a 10 residuos, de mayor preferencia de aproximadamente 1 a 5 residuos, de mayor preferencia de 1 a 3 residuos. Ejemplos de inserciones terminales incluyen las SYNIPs con un residuo metionilo N-terminal, un artefacto de expresión directa en cultivo de células recombinantes bacterianas, y fusión de una secuencia de señal N-terminal, hetérologa al N-terminal de la SYNIP para facilitar la secreción de la SYNIP madura a partir de células huésped recombinantes. Tales secuencias de señal se obtendrán generalmente de, y por lo tanto homologa a, las especies de células huésped pretendidas. Las secuencias adecuadas incluyen STII o Ipp para E. Coli, factor alfa para levadura, y señales virales tales como herpes gD para células de mamífero. Otras variantes de inserción de las moléculas SYNIP nativas incluyen la fusión del N- o C-terminal de una SYNIP a polipéptidos inmunogénicos, por ejemplo, polipéptidos bacterianos tales como betalactamasa o una enzima codificada por el locus trp de E. Coli, o proteína de levadura, y fusiones C-terminales con proteínas que tienen una larga vida media tales como regiones de inmunoglobulina (de preferencia regiones constantes de inmunoglobulina), albúmina, o ferritina, como se describe en las solicitudes publicadas de PCT WO 89/02922. Puesto que es frecuentemente difícil predecir por anticipado las características de una variante SYNIP, se apreciará que la selección será necesaria para seleccionar la variante óptima. Para este propósito pruebas de selección bioquímica, tales como aquellas descritas en la presente a continuación, serán fácilmente disponibles. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona anticuerpos y métodos para detectar anticuerpos que enlazan polipéptidos selectivamente con una secuencia de aminoácidos sustancialmente similar a la secuencia de los aminoácidos de la SEC. DE IDENT. 2 ó 5. Como se discute en más detalle, infra el anticuerpo de la presente invención puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal, preparado utilizando toda o parte de la secuencia de la SEC. DE IDENT. 2 ó 5, o porciones modificadas del misma, para producir una respuesta inmune en un animal huésped de acuerdo con las técnicas estándar (Harlow and Lañe (1988), eds., Antibody: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press). En una modalidad preferida, la secuencia completa del polipéptido de SEC. DE IDENT. 2 se usa para producir la producción de anticuerpos policlonales en un huésped animal. El método para detectar anticuerpos SYNIP comprende poner en contacto células con un anticuerpo que reconoce SYNIP
• e incubar las células en una forma que permita la detección del complejo anticuerpo SYNIP. Las condiciones estándar para la detección por anticuerpo del antígeno pueden utilizarse para lograr este aspecto de la invención (Harlow and Lañe 1988). Este
aspecto de la invención permite la detección de la proteína SYNIP tanto in vitro como in vivo. El objeto de la invención proporciona métodos para el tratamiento de una diversidad de afecciones caracterizadas por
• niveles anormales indeseables de glucosa o translocación anormal
de GLUT4. Las afecciones pueden tratarse a través de terapia genética ya sea in vitro e in vivo. Los protocolos para la terapia genética a través del uso de vectores virales puede encontrase, entre otros lugares, en Viral Vector Gene Therapy and Neuroscience Aplications, Kaplir and Lowry, Academic Press, San
Diego (1995). Los métodos de terapia genética de la invención comprenden la etapa de introducir un vector para la expresión de SYNIP (o ARN de anti-sentido inhibitorio) dentro de una célula del paciente. La célula del paciente puede estar en el paciente, es decir, terapia genética in vivo o externa al paciente y reintroducirse subsecuentemente dentro del paciente, es decir terapia genética in vitro Las afecciones que pueden tratarse por los métodos de terapia genética objetivo incluyen, pero no se limitan a diabetes, afecciones de almacenamiento de glicógeno, obesidad, síndrome de ovario poliquístico, arteriosclerosis y otras afecciones de resistencia a la insulina. En un aspecto preferido de la invención se proporciona un método para proteger células de mamífero de niveles anormales de glucosa o translocación anormal de GLUT4 , que comprende introducir dentro de las células del mamífero un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN sustancialmente similar a la secuencia de ADN mostrada en la SEC. DE IDENT. 1 ó 4, que está unida operativamente a una secuencia de ADN que promueve la expresión de la secuencia de ADN e incubando las células bajo condiciones en donde la secuencia de ADN SEC. DE IDENT. 1 ó 4 se expresará a niveles elevados en las células de mamíferos. Los vectores de expresión adecuados son como se describe anteriormente. En una modalidad preferida, la región de codificación del gen humano SYNIP (SEC. DE IDENT.4) se subclona dentro de un vector de expresión bajo el control transcripcional del promotor de citomegalovirus (CMV) para permitir el gen de expresión SYNIP constituyente. En otro aspecto preferido de la presente invención, se
• proporciona un método para tratar o prevenir niveles anormales de glucosa o translocación anormal de GLUT4, que comprende introducir dentro de las células tumorales de mamífero en un vector de expresión que comprende un ADN antisentido a una secuencia sustancialmente similar a la secuencia de ADN mostrada en la SEC. DE IDENT. 1 ó 4 que está operativamente enlazada a una secuencia de ADN que promueve la expresión de
• ADN antisentido. Las células entonces se cultivan bajo condiciones en donde la secuencia de ADN antisentido de SEC. DE IDENT. 1 ó 4 se expresará a niveles elevados en las células de mamífero. 15 En una modalidad más preferida, la secuencia de ADN consiste esencialmente de SEC. DE IDENT. 1 ó 4. En una modalidad preferida adicional, el vector de expresión comprende un vector de adenovirus donde SYNIP ADNc está unida operativamente en una orientación antisentido a un promotor de
citomelagalovirus (CMV) para permitir la expresión constituyente del SYNIP ADNc antisentido en una célula huésped. En una modalidad preferida, el vector de expresión de adenovirus SYNIP se introduce dentro de las células sensitivas a insulina de mamífero por inyección dentro de un mamífero.
Otro aspecto de la invención es proporcionar pruebas útiles para determinar si un compuesto de interés puede enlazarse a la SYNIP como para interferir en el enlace de la sintaxina-4 (u otros ligandos) a la v- y t-SNAREs. La prueba comprende las etapas de medir el enlace de un compuesto de interés a una SYNIP. La SYNIP o el compuesto de interés que se va a probar puede marcarse con un marcador detectable, por ejemplo un marcador fluorescente o radiactivo, a fin de proporcionar la detección de la formación del complejo entre el compuesto de interés y la SYNIP. En otra modalidad de las pruebas expuestas, las pruebas involucran medir la interferencia, es decir el enlace competitivo, de un compuesto de interés con la interacción de enlace entre una SYNIP y sintaxina-4 (u otro ligando ya conocido por enlazarse a SYNIP) por ejemplo, el efecto de cantidades crecientes de un compuesto de interés en la formación de complejos entre la radioactividad de sintaxina-4 marcada y una SYNIP pueden medirse cuantificando la formación de la formación de complejo SYNIP de ligando marcado. Los anticuerpos policlonales para las SYNIPs generalmente se elevan en los animales por inyecciones múltiples subcutáneas (se) o intraperitoneales (¡p) de una SYNIP y un adyuvante. Puede ser útil conjugar la SYNIP o un fragmento que contenga la secuencia de aminoácido objetivo a una proteína que es inmunogénica en las especies que van a se inmunizadas, por ejemplo hemocianina de lapa en U, albúmina de suero, tiroglobulina bovina, o inhibidor de tripcina de soya usando un agente bifunsional o derivador, por ejemplo, ester maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCI2, o R1~N = C = NR, en donde R y Ri son grupos alquilo diferentes. Los animales se inmunizan contra los conjugados o derivados inmunogénicos combinando 1 mg o un 1 cifra de conjugado (para conejos o ratones respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvantes completos, de Freund e inyectando la solución intradérmicamente en sitios múltiples. Un mes después los animales se refuerzan con 1/5 a 1/10 de la cantidad original del conjugado en adyuvante completo de Freund por inyección subcutánea en sitios múltiples. De 7 a 14 días después los animales se sangran y el suero se prueba por concentración de anticuerpo anti-SYNIPs. Los animales se refuerzan hasta la concentración del segmento plano elevado de un registro gráfico. De preferencia, el animal reforzado con el conjugado de la misma SYNIP, pero conjugado a una proteína diferente y/o a través de un reactivo de reticulación diferente. Los conjugados también pueden hacerse en cultivos de células recombinantes como proteínas fusionadas. También, se usan agentes de degradación como un alumbre para mejorar la respuesta inmune. Los anticuerpos monoclonales se obtiene de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que ocurren naturalmente que pueden estar presentes en cantidades menores.
• Así, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como no siendo una mezcla de anticuerpos discretos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales anti-SYNIP de la invención pueden hacerse usando el primer método de hibridoma descrito por Kohler & Milstein, Nature, 1975;256:495, o puede hacerse por métodos de ADN recombinantes [Cabilly et al, Patente Norteamericana No.4,816,567]. • En el método de hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster se inmuniza como se describió anteriormente en la presente para producir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se enlazaran
específicamente a la proteína usada para inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Los linfocitos se fusionan después con células de mieloma usando un agente fusionante adecuado, tal como un polietilenglicol, para formar una célula hibridoma [Coding, Monoclonal Antibodies:
Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]. Los anticuerpos específicos anti-SYNIP de la invención tienen un número de usos. Los anticuerpos pueden utilizarse para purificar las SYNIPs a partir de células recombinantes o no recombinantes. Los anticuerpos objetivo pueden utilizarse para
detectar y/o cuantificar la presencia de las SYNIPs en muestras de tejido, por ejemplo, de sangre, piel, y similares. La cuantificación de las SYNIPs puede utilizarse diagnósticamente para aquellas afecciones y condiciones fisiológicas o genéticas que se han correlacionado con niveles particulares de niveles de expresión SYNIP. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una prueba de diagnóstico para detectar células que contienen supresiones de polinucleótido de SYNIP, que comprenden aislar el ADN genómico total de la célula y someter el ADN genómico a amplificación PCR usando cebadores derivados de la secuencia ADN de la SEC. DE IDENT. 1 ó 4. Este aspecto de la invención permite la detección de supresiones de polinucleótido de SYNIP en cualquier tipo de célula, y puede utilizarse en prueba genética o como una herramienta de laboratorio. Los cebadores ARN puede escogerse de cualquier forma que permita la amplificación de un fragmento de polinucleótido lo suficientemente grande para detectarse por electroforesis en gel. La detección puede ser por cualquier método, que incluye, pero no se limita a tinción con bromuro de etidio de geles de agarosa o poliacrilamida, detección autoradiográfica de fragmentos gen de SYNIP radiomarcados, hibridización de tinción Southern, y el análisis de secuencia de ADN. En una modalidad preferida, la detección se logra por electroforesis en gel de poliacrilamida, seguido por la secuencia de ADN para verificar la identidad de las supresiones. Las condiciones de PCR se determinan rutinariamente basadas en la longitud y contenido de base de los cebadores seleccionados de acuerdo con las técnicas bien conocidas en el arte (Sambrook et al., 1989). Un aspecto adicional de la presente invención proporciona una prueba de diagnóstico para detectar células que contiene supresiones de polinucleótido de SYNIP, que comprende aislar el ARN total de la célula y someter el ARN a amplificación PCR por transcripción inversa usando cebadores derivados de la secuencia de ADN de la SEC. DE IDENT. 1 ó 4. Este aspecto de la invención permite la detección de supresiones SYNIP en cualquier tipo de célula, y puede utilizarse en pruebas genéticas o como una herramienta de laboratorio. La transcripción inversa se logra rutinariamente por medio de técnicas estándar (Ausubel et al., en Current Protocols in Molecular Biology, ed John Wiley and Sons., Inc. 1994) y PCR se logra como se describió anteriormente. En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para aislar ARN que contiene intervalos de residuos de poliA (adenina), poliC (citosina) o poliU (uridina), que comprende poner en contacto una muestra de ARN con SYNIP, incubando la mezcla ARN-SYNIP con un anticuerpo que reconoce el poiipéptido SYNIP, aislando los complejos anticuerpo-SYNIP-ARN, y purificando el ARN lejos del complejo anticuerpo-SYNIP. Este aspecto de la invención proporciona un método in vitro novedoso para aislar una clase discreta de ARN. En una modalidad preferida, la muestra de ARN se pone en contacto con SYNIP en la presencia (para el aislamiento preferencial de los ARNs que
• contienen poliA y poliC), o ausencia (para el aislamiento preferencial de los ARNs que contiene poliU) o un agente reductor. Los agentes reductores preferidos para uso en este aspecto de la invención incluyen, pero no se limitan a DTT y ß-mercaptoetano. Los agentes reductores se usan de preferencia a una concentración de entre aproximadamente 50 nM y 1M. El aislamientos de los complejos anticuerpos-SYNIP-ARN pueden
• lograrse por medio de técnicas estándar en el arte, que incluyen, pero no se limitan al uso de Proteína-A conjugada con cuentas de agarosa o celulosa. La presente invención puede entenderse mejor con
referencia a los ejemplos acompañantes que se pretenden solamente para propósitos de ilustración y no deben interpretarse para limitar el alcance de la invención, como se define por las reivindicaciones anexas en la presente.
EJEMPLOS EJEMPLOS 1 Sumario El transporte de glucosa estimulada por insulina y la translocación de GLUT4 requieren interacciones específicas entre
la sintaxina-4, v-SNARE, VAMP2, y t-SNARE. Sin embargo, la insulina no afecta directamente estas o cualquier otra SNARE, similares a las moléculas identificadas hasta la fecha. Como se muestra en el siguiente ejemplo, se aisló una novedosa proteína que enlaza sintaxina-4 SYNIP, la cual interactúa específicamente con sintaxina-4 y que se expresó solamente en células que exhibieron el transporte de glucosa que responde a la insulina y translocación de GLUT4. La insulina indujo a una disociación del complejo SYNIP sintaxina-4 debido a una afinidad de enlace disminuida de SYNIP por sintaxina-4. En contraste, el enlace del dominio SYNIP carboxilo terminal fue refractivo a la estimulación con insulina pero inhibió el transporte de glucosa y la translocación de GLUT-4. Estos datos identifican a SYNIP como la primera proteína parecida a SNARE regulada por insulina, involucrada directamente en la regulación del transporte de glucosa y translocación en vesícula de GLUT4.
Procedimientos Experimentales Materiales El anticuerpo monoclonal señalizador M2 se obtuvo de Kodak y el anticuerpo policlonal sintaxina-4 de oveja se aisló como se describe previamente (Olson A. L., Knight J. B., and Pessin J. E., "Syntaxin 4, VAMP2, and/or VAMP3/cellubrevine are functional target membrane and the cycle SNAP receptors for insulin-stimulated GLUT4 translocation in adipocytes." Mol Cell Biol, 1997; 17: 2425-2435). El plásmido de expresión ß-galotoxidasa (pcDNA3.1/his/LacZ) se adquirió de Invitrogen. Los reactivos SuperSigal ULTRA Enhanced Chemiluminescent (ECL), y el antioveja secundario, y el anti-conejo IgG-HRP fueron de Pierce. Los reactivos de tinción western ECL y [a-32 P]dCTP se adquirieron de Amersham Life Science. Todas las enzimas de restricción, medios de cultivo celular, y los reactivos fueron de GIBCO BRL. Todos los otros reactivos se obtuvieron de Sigma Chemical Co a menos que se señale específicamente .
Aislamiento de SYNIP ADNc por selección híbrida de dos levaduras La región que codifica del dominio citoplasmático de sintaxina-4 (residuo 2-274) se amplificó por PCR desde el plásmido que lleva la sintaxina-4 ADNc usando los cebadores 5'CGGGATCCTGCGCGACAGGACCCATG 3' y
'GGTCGACCTTTTTCTTCCTCGC 3'. El producto PCR se subclonó después dentro del sitio BamHI-Sa1l del vector cebo pGBT9 (Clontech), en la estructura con el dominio que enlaza GAL4 ADN. Para seleccionar la proteína que enlaza la sintaxina-4, la cepa de levadura Y 190 se transformó secuencialmente con el ADN cebo y después la biblioteca ADNc híbrida de dos levaduras construida de adipocito 3T3L1 ARNm como se describió previamente (Printen J. A., Brady M. J., and Saltiel A. R., "PTG, a protein phosphatase 1-binding protein with a role in glycogen metabolism". Science, 1997; 275:1475-1478). La transformación se plantó sobre un medio sintético carente de triptofano, leucina e histidina conteniendo 25 mM 3-aminotriazol (Sigma) e incubado a 30° C. Las colonias que aparecieron después de 5-7 días de incubación se analizaron por actividad de ß-Galatoxidasa sembrando en el medio que contiene X-Gal. Los ADNcs presa se recuperaron de los aciertos más fuertes y se sometieron a secuenciación de ADN. Todas las secuencias se analizaron con programas búsqueda BLAST, herramienta de Proteína y COIL 2.2 .
Análisis de Tinción Orden Los 1.67 kb de las secuencias que codifican SYNIP ADNc se radiomarcaron con [a-32 P] dCTP usando un equipo de marcado hexámero al azar, y la sonda se purificó con un QIAquick Nucleotide Removal Kit (QIAGEN). La sonda se hibridizó con una tinción Northern que contiene 2 mg de poli A+ ARN purificado aislado de diversos tejidos de ratón en una solución de hibridización ExpressHyb (Clontech) durante 16 horas a 65° C. La tinción se lavó extensamente después siguiendo la recomendación del fabricante y se sometió a autoradiografía. Construcciones de Expresión La región que codifica de SYNIP ADNc fue PCR amplificada desde un plásmido que contiene 2.6 kb SYNIP ADNc con un par de oligos: 5'GTACTGACCCGGGAATTCGAAAGCATGAGTGATGGTA CAGC3' y 5'GTCGACGCGGCCGCTCGAGCTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAG TCGCTTTTCGGGTCTGTTAGCTCTCTG3'. El extremo 3' de la secuencias incorporadas al cebador que codifican un epítope
• señalizador de ocho aminoácidos. El producto PCR se clonó dentro de un vector pCR2.1 (Invitrogen). Para construir el plásmido de expresión de mamífero SYNIP/WT se subclonó el SYNIP marcado con señalizador carboxilo terminal de longitud completa dentro de los sitios EcoR1/Xho1 del vector pcDNA3 (Invitrogen). Para construir el mutante de supresión (residuo 1-301) de SYNIP/NT, el inserto se generó primero por PCR con cebadores
• 5?CTGAATTCATGAGTGATGGTACTGCTTCTGC3' y
'ATCCTCGAGCACTTCATCTGCTTCTAGAG 3' y se clonó dentro de los sitios EcoRI/Xhol de un vector pcDNA3 que contiene una marca señalizadora inmediatamente corriente abajo del sitio Xhol.
La construcción SYNIP/NT se obtuvo cambiando un fragmento interno de EcoRI/Xbal con el mismo fragmento del plásmido SYNIP/WT de manera que contiene las secuencias Kozak de tipo silvestre. Para construir el mutante SYNIP/CT, el ADNc de dos
• híbridos originales se subclonó dentro de los sitios EcoRI/Sa1l del
vector pFlag-CMV2 (Kodak). La construcción de fusión de GLUT4-eGFP se preparó subclonando el GLUT4 ADNc de rata dentro del vector pEGFP (Clontech) en los sitios 5'BamHI y 3'Hindlll. El GLUT4 ADNc se puso en la estructura con el EGFP ADNc cortando el fragmento de
200 bp Bg1ll-Agel y reemplazándolo con el fragmento PCR digerido Bg1 ll-Agel generado por la amplificación del GLUT4 ADNc de rata usando cebadores 5'CTTCATCTTCACCTTCCTAA3' y 5'GGTGGCGACCGGTACGTCATTCTCATCTGG3'. La proteína de fusión es la secuencia contigua de GLUT4 con 5 aminoácidos adicionales (Val-Pro-Val-Ala-Thr) que lo conectan a EGFP. El GLUT4-eGFP resultante se subclonó dentro del vector pcDNA3 usando los sitios 5'Hindlll y 3'Xbal. La construcción eGFP-GLUT1 se preparó subclonando el GLUT1 ADNc de rata dentro del plásmido pEGFP-C3 (Clontech) usando sitios de restricción 5'Xhol y 3'EcoRI. La construcción resultante contiene 9 aminoácidos adicionales entre la eGFP y GLUT1 (Tyr-Ser-Asp-Asp-Leu-Glu-Arg-Ser-Ala-Ala).
Cultivo de células Células 293T de riñon de embrión humano se obtuvieron de la American Type Culture Collection y se mantuvieron en un medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contiene 10% de suero bovino fetal a 37°C en una atmósfera al 5% C02. Células de ovarios de hámster chino que expresan el receptor de insulina humano (CHO/IR) se obtuvieron como se describió anteriormente (Waters S. B., Yamauchi K., and Pessin J. E., "Insulin-stimulated disassociation of the SOS-Grb2 complex" Mol Cell Biol, 1995;15:2791-2799). Estás células se mantuvieron en un medio de Eagle mínimo que contiene nucleótidos además de 10% de suero de bovino fetal a 37°C en una atmósfera al 5% de C02. Se obtuvieron preadipocitos 3T3L1 del depósito de American Type Tissue Culture y se cultivaron en DMEM conteniendo 25 mM de glucosa, 10% de suero de ternero a 37° C en una atmósfera al 8%
• de C02 los cultivos confluentes se indujeron para diferenciarse por incubación de las células con DMEM conteniendo 25 mM de glucosa, 10% de suero bovino fetal, un mg/mL de insulina, un mM dexametasona, y 0.5 mM isobutil-1-metilxantina. Después de 4 días, el medio se cambió a DMEM, 25 mM glucosa, 10% de suero fetal de bovino y un mg/mL de insulina durante 4 días adicionales. El medio se cambio después a DMEM conteniendo 25mM de
• glucosa y 10% de suero de bovino fetal. Bajo estás condiciones más del 95% de la publicación de las células se diferenció morfológicamente en adipocitos. Los adipocitos se mantuvieron durante 4 a 8 días adicionales antes de su uso. 15 Purificación de Proteínas de Fusión de GST Se subclonaron porciones citoplasmáticas de sintaxina- 1A (aminoácidos 4-264), sintaxina-1B (aminoácidos 3-263), sintaxina-2 (aminoácidos 1-265), sintaxina-3 (aminoácidos 1-262),
y sintaxina-4 (aminoácidos 2-274) dentro del vector de expresión pGEX-4T-1 (Pharmacia). Las proteínas recombinantes de GST se sobreexpresaron en BL21 (DE3) (Stratagene) y las células de bacterias se usaron usando B-PER-Bacterial Protein Extraction Reagent (Pierce). Las proteínas de fusión de GST se unieron entonces a cuentas de Glutationa-agarosa al 50% se lavaron extensamente y se almacenaron hasta por 2 semanas a 4o C.
Precipitación de Proteína de Fusión de GST Se incubaron lisados de células de adipocitos HEK293T, CHO/IR o 3T3L1 con GST sola o con proteínas de fusión de GST inmobilizadas en las cuentas de glutationa-agarosa durante 1 hora a 4°C. Las cuentas se lavaron extensamente tres veces con un mL de HNTG (50mM HEPES, pH 7.4, 150mM de cloruro de sodio, 1% Tritón X-100, 10% glicerol, y 1mM EDTA) amortiguador y después dos veces con un mL de agua destilada. Las proteínas retenidas se eluyeron después con 50µL 2X de amortiguador de muestra Laemmli, se calentaron a 100°C durante 5 minutos y se separaron por SDS-PAGE, y después se inmutiñeron con el anticuerpo monoclonal señalizador M2 o un anticuerpo SYNIP policlonal de oveja.
Inmunoprecipitación e Inmutinción. Extractos detergentes de células completas se prepararon por solubilización por detergente en un amortiguador de lisis NP-40 (25mM Tris Ph 7.4, 1% de NP-40, 10% glicerol, 50mM de fluoruro de sodio, 10 mM de pirofosfato de sodio, 137 mM de NaCI, 1mM de Na3 VO4, 1mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 10 µg/mL de aprotinina, 1 µg/mL de pepstatina, 5 µg/mL de leupeptina) durante 10 minutos a 4°C. Las inmunoprecipitaciones se realizaron usando 4.0 mg de los extractos celulares incubados con 8 µg de un anticuerpo de oveja policlonal de polisintaxina-4 durante 2 horas a 4o C. El anticuerpo sintaxina-4 se preparó en oveja usando una proteína fusionada GST que expresa el dominio citoplásmatico de sintaxina-4 (Olson A. L., Knight J. B., y Pessin J. E., "Syntaxin 4, VAMP2, and/or VAMP3/cellubrevin are funcional target membrane and vesicle SNAP receptors for insulin-stimulated GLUT4 translocation ¡n adipocytes" Mol Cell Biol, 1997;17:2425-2435). La muestras se incubaron con proteína A-Sefarosa durante 2 horas a 4o C. Los inmunoprecipitados resultantes se sometieron después a electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y tinción western usando el anticuerpo policlonal sintaxina-4 y el anticuerpo monoclonal señalizador M2 .
Transfección de Células de HEK293T, Células CHO/IR y adipocitos 3T3L1 Las células HEK293T se tranfectaron con un equipo de transfección CaP04 de mamíferos (Stratagene). Las células CHO/IR se transfectaron cuantitativamente por electroporación como se describe previamente (Yamauchi K., Ribon V., Saltiel A. R., and Pessin J. E., " Identifaication of the major SHPTP2-binding protein that is tyrosine- phosphorylated in response to insulin" J. Biol. Chem., 1995; 270;17716-17722). Brevemente, estás células se mezclaron con un total de 40µg de plásmido ADN y se electroporaron a 340 V y 960 µF. Bajo estás condiciones más del 95% de la población celular sobreviviente expresan el ADNc de interés. Adipocitos 3T3L1 diferenciados se electroporaron usando una modificación de este protocolo. Los adipocitos se pusieron en suspensión por tripsinización ligera y se electroporaron con un total de 600µg de plásmido bajo condiciones de bajo voltaje (160 V 960 µF). Se les dejó adherir a las células después a cajas de cultivos de tejido recubiertas con colágeno durante 30-48 y los adipocitos se pusieron en inanición de suero durante 2 horas antes de la incubación en la ausencia o presencia de 100 mM de insulina durante 15 minutos a 37° C. Bajo estás condiciones, aproximadamente 15% de los adipocitos electroporados sobrevivieron pero de estás células la eficiencia de tranfección/expresión fue mayor del 70%.
Tinción de ß-galactoxidasa in situ Se electroporaron adipocitos 3T3L1 diferenciados con diversas cantidades de plásmido ADN que contiene el gen LacZ (pcDNA3.1/his/LacZ) como se describió anteriormente, se lavaron con solución salina regulada con fosfato (137 mM de NaCI, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HP04, 2.6 mM de KH2P04, pH 7.4), y se fijó con 2% de formaldehído, 0.2% de glutaraldehído en PBS, pH 7.4 durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células se enjuagaron después y se incubaron con 0.2% del reactivo 5-bromo-4-cloro-3-indolil ß,D-galactosido (X-Gal) en 10 mM Na2HP04, pH 7.4, 1mM MgCI2, 150mM NaCI, 3.3 mM K3 Fe(CN)6, 3.3 mM K4Fe(CN) durante 2 horas a 37° C. Las células se almacenaron después bajo 70% de glicerol y se fotografiaron a una amplificación de 100x.
• Transporte de 2-desoxiglucosa Los adipocitos 3T3L1 electroporados se colocaron en DMEM teniendo 25mM de glucosa además de 0.5% de albúmina de suero de bovino durante 2 horas a 37° C. Las células se lavaron después con amortiguador KRPH (5mM de Na2HP04 de 20 mM HEPES, pH 7.4 1mM MgS04, 1mM CaCI2, 136 mM NaCI, 4.7 mM KCl, y 1% de albúmina de suero de bovino) y ya sea sin tratar o
• estimuladas con 100nM de insulina durante 15 minutos a 37° C. El transporte de glucosa se determinó por incubación con 50µM de 2- desoxiglucosa conteniendo 0.5mC¡ de [3H]2-desoxiglucosa en la ausencia o presencia de 10µM de citocalasina B. La reacción se
detuvo después de 10 minutos al lavar las células 3 veces con PBS frío de hielo. Las células se solubilizaron después en 1% de Tritón X-100 a 37°C durante 30 minutos y las alícuotas se sometieron a conteo por centelleo. La concentración de proteínas se determinó por el método de Brandford. 20 Microscopía Confocal de Fluorescencia Se electroporaron adipocitos de 3T3L1 diferenciados como se describió anteriormente con 50µg de pcDNA3-GLUT4- eGFP y 200 µg de ya sea pcDNA3, SYNIP/WT, SYNIP/NT, o
SYNIP/CT. Cuarenta y ocho horas después de la electroporación, las células se pusieron en inanición de suero en un medio de DMEM durante 3 horas y se incubaron con o sin 100nM de insulina durante 30 minutos. La insulina se eliminó por dos lavados con
• PBS frío de hielo, se fijo con 2% de paraformaldehído (en PBS) durante 15 minutos a temperatura ambiente, y se detuvo con 100 mM de glicina durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las células fluorescentes se visualizaron con microscopía confocal de barrido en la University of lowa Microscope Facility.
Resultados • Identificación de SYNIP, una Proteína de interacción de
Sintaxina-4 de multidominio Para aislar la o las proteínas de enlace que puedan interactuar con y regular la fusión de sintaxina-4 en tejidos que
responden a la insulina, se selecciona una biblioteca de ADNc de adipocito 3T3L1 híbrida de dos levaduras fusionada al dominio de activación de transcripción de GAL4 (Printen J. A., Brady M. J., y Saltiel A.R. "PTG, a protein phosphatasa 1-binding protein with a role in glycogen metabolism". Science, 1997, 275:1475-1478) con
la porción citoplasmática de sintaxina-4 fusionada al dominio de enlace de ADN de GAL4 como cebo (GAL4-Syn4). De entre un millón de transformantes seleccionados, 200 colonias crecieron en este medio sintético de His-Trp-Leu, del cual 102 fueron positivas para actividad de ß-galactosidasa cuando se sembraron en un
medio que contiene X-Gal. Se recuperaron plásmidos derivados de la biblioteca para secuencias de ADN y se dio enfoque a una clase de ADNcs que inducía actividad ß-galactosidasa solamente cuando se co-expresa con GAL4-Syn4, pero no con una proteína de fusión que contiene el dominio citoplásmico de sintaxina-3. Las secuencias de ADN de las uniones de fusión de GAL4 de los insertos plásmidos codificados para diferentes dominios de fragmentos de proteínas que se traslapan en el carboxilo terminal. Para obtener el extremo 5' corriente arriba del ADNc, se llevó a cabo 5'RACE y se clonó 1.2 kb adicionales. El ADNc de 2.6 kb más largo se obtuvo ligando el clon de dos híbridos de 1.4 kb original con el clon 5'-RACE de 1.2 kb. La secuencia de nucleótido del gen SYNIP se establece en la Figura 8. El análisis de secuencia reveló que este ADNc tenía una estructura de lectura abierta sencilla la cual codificaba para una proteína de 557 aminoácidos con un peso molecular predicho de 61 kDa (Figura 1A). Esta proteína se designó SYNIP para la proteína sintaxina-4 interactuante. Una búsqueda de las bases de datos reveló dos clones EST de ratón (AA756269 y AA919678) eludiendo el sitio de inicio de traducción de SYNIP. El análisis de secuencia de proteína indicó que SYNIP tiene tres dominios de interacción de proteína-proteína específicos: un dominio PDZ sencillo en el amino terminal, un par de dominios doblemente enrollados uno tras del otro y un dominio WW en el carboxilo terminal (Figura 1B). Además, SYNIP contiene un enlace potencial de calcio EF-motivo manual carboxilo terminal al domino PDZ predicho y el amino terminal de los dominios doblemente enrollados. Todos estos motivos se subrayan en las secuencias de aminoácidos primarios en la Figura 1A. La distribución de tejido de SYNIP ARNm se determinó usando tinción Northern de tejido múltiple de ratón hibridizado con una sonda radiomarcada que contiene 1.67 kb de la secuencia que codifica SYNIP (Figura 1C). Se encontró predominantemente una transcripción de 7.5 kb en músculo del esqueleto y corazón, con expresión sustancialmente menor en testículos. Dos transcripciones adicionales de tamaño menor se detectaron
#C también, pero no exhibieron un patrón de distribución de tejido restringido similar. No hubo transcripciones SYNIP específicas en tejido de cerebro, hígado, bazo, pulmón o riñon. Además, también se detectó SYNIP ARNm en adipocitos blancos y cafés de rata por
tinción Northern (no se muestran datos). Para determinar la especificidad del enlace SYNIP, se prepararon construcciones SYNIP completa marcada con epítope señalizador para la longitud total de SYNIP (SYNIP/WT) y el dominio de la SYNIP carboxilo terminal (SYNIP/CT) que codifica
los dominios doblemente enrollados uno tras del otro y WW. Estas construcciones se transfectaron después dentro de células HEK293T y se incubaron con GST sola o proteína de fusión GST que contienen los dominios cítoplasmáticos de sintaxina-1 A, sintaxina-1 B, sintaxina-2, sintaxina-3 y sintaxina-4. El análisis de
enlace in vitro demostró que ambos SYNIP/WT y SYNIP/CT se enlazan específicamente a sintaxina-4 (Figura 1D, senda 6) pero no a las otras proteínas sintaxina 1A, 1B, 2 y 3 (Figura 1D, sendas 2-5). Así, la expresión específica de SYNIP en tejidos que están enriquecidos en sintaxina-4 y que exhiben exclusivamente transporte de glucosa sensible a la insulina (músculo y grasa), es consistente con un papel potencial para esta proteína como un amortiguador fisiológicamente relevante de la traslocación GLUT4.
La insulina rompe la interacción entre SYNIP y sintaxina-4 Estudios previos han demostrado que VAMP2 funciona como una vesícula GLUT4 v-SNARE y que la alteración de VAMP2 con sintaxina-4 es necesaria para la traslocación de GLUT4 estimulada por insulina hacia la membrana del plasma (Cain C. C, Trimble W. S., and Lienhard G. E., "Members of the VAMP family of synaptic vesicle proteins are components of giucose transporter-containing vesicles from rat adipocytes." J Biol Chem, 1992;267:11681-11684; Cheatham B., Volchuk A., Kahn C.R., Wang L., Rhodes C.J., and Kllp A., "Insulin-stimulated translocation of GLUT4 glucose transporters requires SNARE-complex proteins." Proc Nati Acad Sci USA, 1996;93:15169-15173; Jagadish M.N., Fernandez C.S., Hewish D.R., Macaulay S.L., Gough K.H., Grusovin J., Verkuylen A., Cosgrove L., Alafaci A., Frenkel M.J., and Ward C.W., "Insulin-responsive tissues contain the core complex protein SNAP-25 (synaptosomal-associated protein 25) A and B isoforms in addition to syntaxin-4 and synaptobrevins 1 and 2." Biochem J. 1996;317:945-954; Martin L.B., Shewan A., Millar C.A., Gould G.W., and James D.E., "Vesicle-associated membrane protein 2 plays a specific role in the
• insulin-dependent trafficking of the facilitative glucose transporter GLUT4 in 3T3-L1 adipocytes." J Biol Chem, 1998;273:1444-1452; Olson A.L., Knigth J.B., and Pessin J.E., Syntaxin-4, VAMP2, and/or VAMP3/ceIlubrevin are functional target membrane and vesicle SNAP receptors for insulin-stimulated GLUT4 translocation in adipocytes" Mol Cell Biol, 1997:17:2425-2435; Tomari Y., Hashiramoto M., Araki S., Kamata Y., Takahashi M., Kozaki S.,
# and Kasuga M., "Cleavage of vesicle-associated membrane protein (VAMP)-2 and cellubrevin on GLUT4-containing vesicles inhibits the translocation of GLUT4 in 3T3-L-1 adipocytes". Biochem Biophys Res Commun, 1996; 220:740-745; Volchuk A., Sargeant
R., Sumitani S., Liu Z., He L., and Klip A., "Cellubrevin is a resident protein of insulin-sensitive GLUT4 glucose transporter vesicles in 3T3-L1 adipocytes" J Biol Chem, 1995;270:8233-8240). Para explorar el potencial de regulación de la SYNIP: la
• interacción sintaxina-4 por insulina, se evaluó la asociación de
estas dos proteínas por co-inmunoprecipitación en células de ovario de hámster chino y que expresan el receptor de insulina humana (CHO/IR). Las células se transfectaron con ADNcs que codifica la SYNIP (SYNIP/WT) de longitud completa marcada con epítope señalizador, el dominio SYNIP amino terminal (SYNIP/NT),
y el dominio SYNIP carboxilo terminal (SYNIP/CT). la inmunotinción de extractos detergentes de células completas demostró que la expresión similar de SYNIP/WT y SYNIP/NT, con una expresión ligeramente mayor de SYNIP/CT en este experimento particular (Figura 2A, sendas 1, 3, 5). La estimulación sobre insulina no tuvo efecto significativo en la expresión de estas proteínas (Figura 2A; sendas 2, 4, 6). Como se esperaba, la inmunoprecipitación de sintaxina-4 endógena resulto en la co-inmunoprecipitación de SYNIP/WT (Figura 2B, senda 1). Sin embargo, después del tratamiento con insulina hubo una reducción marcada en la cantidad de SYNIP/WT que se co-inmunoprecipitó con sintaxina-4 (Figura 2B, senda 2). En contraste, la estimulación con insulina no tuvo efecto significativo en la capacidad de la sintaxina-4 para co-inmunoprecipitar las proteínas SYNIP/NT o SYNIP/CT (Figura 2B, sendas 3-6). Interesantemente, la interacción de SYNIP/NT con sintaxina-4 in vivo fue significativamente menor que la vista con SYNIP/WT o SYNIP/CT (Figura 2B), sugiriendo que la región carboxilo terminal de SYNIP contiene el dominio de enlaces de sintaxina-4 principal. En cualquier caso, la cantidad de sintaxina-4 inmunoprecipitada no puede explicar estas diferencias puesto que fueron esencialmente idéntica bajo todas estas condiciones (Figura 2C). Existen diversos mecanismos posibles que pueden explicar la disociación estimulada con insulina de SYNIP de sintaxina-4. Puesto que no hubo cambio aparente en la expresión de SYNIP o sintaxina-4, parece muy probablemente que la insulina pudiera inducir una alteración funcional en la SYNIP o la sintaxina-4. Para explorar estas posibilidades, se examinó la capacidad de las proteínas de fusión GST- sintaxina-4 (GST-Syn4) y GST-SYNIP (GST-SYNIP) para precipitar su asociado de enlace correspondiente. (Figura 3). Como se observó previamente, la transfección de células CHO/IR con las SYNIP/WT, SYNIP/NT y SYNIP/CT ADNcs resultó en niveles similares de expresión de proteína (Figura 3A). La incubación de células con insulina produjo una reducción marcada en la cantidad de SYNIP/WT precipitada con GST-Syn4 en extractos de células (Figura 3B, sendas 1 y 2). Sin embargo, no hubo diferencia significativa en la precipitación con GST-Syn-4 de SYNIP/NT o SYNIP/CT en extractos derivados de células estimuladas con insulina (Figura 3B, sendas 3-6). En contraste, la incubación de extractos de células control y estimuladas con insulina con GST-SYNIP resultó en idéntica cantidad de precipitación de sintaxina-4 (Figura 3C, sendas 1-4). Para confirmar que la insulina reduce la afinidad de enlace de SYNIP por sintaxina-4, se examinó el enlace como una función de la concentración de GST-Syn4 (Figura 3D). Las inmunotinciones de extractos detergentes de células completas demostraron cantidades iguales de proteína SYNIP expresada en los extractos de células control y estimuladas con insulina (Figura 3D, sendas 1 y 2). La estimulación con insulina resultó en una reducción marcada en la cantidad de SYNIP/WT que se precipitó con 10 y 20 µg de GST-Syn4 comparada con los extractos control (Figura 3D, compare sendas 3 con 4 y sendas 5 con 6). Sin embargo, la diferencia entre los extractos de células control y estimuladas con insulina se disminuyó con el incremento de las
• cantidades de GST-Syn4(40 µg), y no se observó diferencia significativa en 80 mg (Figura 3D, comparar sendas 7 con 8 y sendas 9 con 10). La saturación del enlace SYNIP/WT también fue específico a estas concentraciones de GST-Syn4 puesto que no hubo precipitación detectable de SYNIP/WT por GST sola (no se muestran datos). Así, estos datos demuestran que la estimulación de insulina resulta en una modificación específica de SYNIP que
• reduce su capacidad para asociarse con sintaxina-4. Además, el enlace disminuido entre SYNIP y sintaxina-4 resulta de un cambio en la afinidad de enlaces SYNIP sin alteración significativa en el número de sitios de enlace de SYNIP o sintaxina-4. 15 La insulina regula la interacción de SYNIP con sintaxina-4 en adipocitos 3T3L1. En contraste con las células CHO/IR, los adipocitos 3T3L1 responden a insulina con respecto al transporte de glucosa
y la traslocación de GLUT4. Por lo tanto se determinó si la interacción entre SYNIP y sintaxina-4 también era sensible a la insulina en estas células. Los adipocitos 3T3L1 diferenciados se transfectaron por electroporación con los ADNcs que codifican SYNIP/WT y SYNIP/CT (ver Figura 5). La inmunotinción de lisados
de células completas demostró la expresión de SYNIP/WT y SYNIP/CT que no fue afectada por el tratamiento con insulina (Figura 4A, sendas 1-4). Similar a lo observado en células CHO/IR, la incubación de extractos de células estimuladas con insulina con GST-Syn4 resultó en una disminución marcada en la precipitación de SYNIP/WT pero no de SYNIP/CT comparada con los extractos de células control (Figura 4B, sendas 1-4). Estos datos recapitulan los descubrimientos en las células CHO/IR y demuestran que la insulina regula la interacción entre SYNIP y sintaxina-4 en un tipo metabólico de células que responde a insulina.
SYNIP juega un papel crucial en el transporte de glucosa estimulada con insulina y la traslocación de GLUT4 Diversos estudios también han sugerido que la función sintaxina-4 es necesaria para la traslocación en vesícula de GLUT4 estimulada con insulina pero no en el tráfico de GLUT1 en vesícula (Cheatham B., Volchuk A., Kand C. R., Wang., Rhodes C. J., and Klip A., "Insulin-stimulated translocation of GLUT4 glucose transporters requires SNARE-complex proteins". Proc Nati Acad Sci USA, 1996; 93:15169-15173; Olson A. L., Knigth J. B., and Pessin J. E., Syntaxin-4, VAMP2, and/or VAMP3/cellubrevin are funtional target membrane and vesicle SNAP receptors for insulin-stimulated GLUT4 translocation in adipocytes" Mol Cell Biol, 1997;17:2425-2435; Tamori Y., Hashiramoto M., Araki S., Kamata Y., Takahashi M., Kozaki S., and Kasuga M., "Cleavage of vesicle- associated membrane protein (VAMP)-2 and cellubrevin on GLUT4-containing vesicles inhibits the translocation of GLUT4 in 3T3-L-1 adipocytes". Biochem Biophys Res Commun, 1996; 220:740-745; Volchuk A., Wang Q., Ewart H. S., Liu Z., He L., Bennett M. K., and Klip A., "Syntaxin 4 in 3T3-L1 adipocytes: regulation by insulin and participation in insulin-dependent glucose transport". Mol Biol Cell, 1996; 7:1075-1082). Sin embargo, el análisis bioquímico de estas interacciones ha sido inadecuado, puesto que la eficiente transfección/expresión de ADNcs en adipocitos 3T3L1 diferenciados es notoriamente difícil. Para rodear este asunto, se estableció un método de electroporación de bajo voltaje para adipocitos completamente diferenciados lo cual proporcionó expresión eficiente usando altas concentraciones de plásmido ADN (Figura 5A). Como un marcador para la eficiencia de transfección/expresión, adipocitos 3T3L1 diferenciados se electroporaron (160 V, 960 µF) con diversas cantidades de un ADNc que codifica ß-galactosidasa (LacZ). La electroporación con el vector vacío no resultó en ninguna tinción X-Gal detectable (Figura 5A, panel 1). En contraste, la electroporación con el plásmido LacZ resultó en un incremento dependiente de la concentración de adipocitos que tienen positivo para actividad de ß-galactosidasa (Figura 5A, paneles 2-5). Electroporación con 600 µg del plásmido de expresión LacZ resulta rutinariamente en una eficiencia de transfección mayor del 70% cuya expresión no es detectable de fibroblastos contaminados.
Habiendo establecido un protocolo de transfección razonable para adipocitos 3T3L1 diferenciados, se examinó después el efecto de la expresión de SYNIP en el transporte de glucosa estimulado con insulina (Figura 5B). Células electroporadas con el vector vacío (pcDNA3) permanecieron sensibles a la insulina con una estimulación de 4 veces de la toma de 2-desoxiglucosa en estas células. Aunque la expresión de SYNIP/WT y SYNIP/NT tendió a aumentar la toma basal de 2-desoxiglucosa, la expresión de estas células a la insulina resultó en una activación del transporte de glucosa similar al observado en las células transfectadas con el vector vacío. En contraste, la expresión de SYNIP/CT inhibió ligeramente la velocidad basal del transporte de glucosa, pero trunco significativamente el incremento estimulado de insulina. Los adipocitos 3T3L1 expresan las isoformas transportadoras de glucosa GLUT1 y GLUT4 (Calderhead D. M., Kitagawa K., Lienhard G. E., and Gould G. W., "Translocation of the brain-type glucose transporter largely accounts for insulin stimulation of glucose transport in BC3H-1 myocytes". Biochem J. 1990; 269:597-601; Yang J. and Holman G. D., "Comparison of GLUT4 and GLUT1 subcellular trafficking in basal and insulin-stimulated 3T3-L1 cells". J Biol Chem, 1993;268:4600-4603). Aunque GLUT1 reside principalmente en la superficie de la célula en el estado basal, también puede sufrir traslocaciones estimuladas con insulina a la membrana del plasma (Holman G. D., Kozka I. J., Clark A. E., Flower C. J., Saltis J., Habberfield A. D., Simpson I. A., and Cushman S. W., "Cell surface labeling of glucose transporter isoform GLUT4 by bis-mannose photolabel.
• Correlation with stimulation of glucose transport in rat adipose cell by insulin and phorbol ester". J Biol Chem, 1990; 265:18172- 18179; Piper R. C, Hess L. J., and James D. E., "Differential sorting of two glucose transporters expressed in insulin-sensitive cells". Am J Physiol, 1991 ;20-C570-580; Robinson L. J., Pang S., Harris D. S., Heuser J., and James D. E., "Translocation of the glucose transporter (GLUT4) to the cell surface in permeabilized
« 3T3-L1 adipocytes: effects of ATP insulin, and GTP gamma S and localization of GLUT4 to clathrin lattices". J Cell Biol. 1992;117:1181-1196). Así, para distinguir el efecto de la expresión SYNIP en la traslocación de GLUT1 y GLUT4, los adipocitos 3T3L1
se transfectaron con ADNcs GLUT4 (GLUT4-eGFP) y GLUT1 (eGFP-GLUT1) marcadas de Green Fluorescent Protein mejorada (Figura 6). En las células control, GLUT4-eGFP se localizó en una región perinuclear y en vesículas intracelulares discretas a través
• del interior de la célula, pero no en la superficie de la célula
(Figura 6A, panel 1). Este patrón de expresión de proteína GLUT4- eGFP es idéntico a aquel observado para GLUT4 endógena y colocaliza con otra proteína marcador para las vesículas GLUT4 del tipo que responde con insulina, vp165/IRAP (datos no mostrados). La estimulación con insulina resultó en una redistribución de la
GLUT4-eGFP localizada intracelular a la membrana del plasma (Figura 6A, panel 2). Estos datos demuestran que la GLUT4-eGFP expresada en adipocitos 3T3L1 sufre la traslocación estimulada con insulina característica a la membrana del plasma, reminiscente de GLUT4 endógena. Consistente con los datos de transporte de glucosa, la expresión de SYNIP/WT y SYNIP/NT no tuvo efecto en la traslocación estimulada con insulina de GLUT4- eGFP(Figura 6A, paneles 2-6). Aunque la expresión de SYNIP/CT no alteró la distribución basal de GLUT4-eGFP, hubo una casi completa inhibición en la fluorescencia de borde de membrana del plasma (Figura 6A, paneles 7 y 8). • En contraste con GLUT4, una gran proporción de GLUT1 se encontró localizada en la membrana del plasma en el estado basal (Rea S. and James D. E., "Moving GLUT4: the biogénesis and trafficking of GLUT4 storage vesicles". Diabetes, 1997;
46:1667-1677; Yang J. and Holman G. D., "Comparison of GLUT4 and GLUT1 subcellular trafficking in basal and insulin-stimulated 3T3-L1 cells". J Biol Chem, 1993; 268:4600-4603). En forma similar, la expresión de eGFP-GLUT1 también resultó en
• localización en la membrana del plasma e intracelular en el estado
basal (Figura 6B, panel 1): Como se esperaba, la sección con el vector vacío no tuvo efecto significativo en la distribución de eGFP-GLUT1 (Figura 6B, panel 2). Además, la expresión de SYNIP/WT y SYNIP/NT o SYNIP/CT no afectó la localización basal o la estimulada con insulina de eGFP-GLUT1 (Figura 6B, paneles
2-8). Así, la inhibición de la actividad del transporte de glucosa estimulada con insulina por SYNIP/CT fue específica para la traslocación de GLUT4, sin ningún efecto significativo en la distribución subcelular de GLUT1. •
EJEMPLO 2 Clonación de un ADNc que Codifica SYNIP Humana Para, identificar SYNlPh, se consultó una base de datos de secuencia humana con la secuencia de nucleótido que codifica SYNIP de ratón. Se identificó un clon (EST) de secuencia marcada de expresión humana AA652491. Este EST exhibió 86% de
• homología a la secuencia SYNIP de ratón. Para obtener un clon humano de longitud completa, se usó la secuencia de información de la EST para diseñar una estrategia de reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando
Amplificación Rápida de Extremos de ADNc (RACE). Dos cebadores PCR hacia adelante,
?GCCCACAAAGGAACAACACCAAGCC-3' y 5'- GCTCAAGTGTGAAGAGATGATGCC-3' para 3' anidados PCR RACE
• y dos cebadores inversos, 5'-GGCATCATCTCTTTCACACTTGAGC- 20 3' y 5'-GCAAGCAAAACAAGTTTCTGGCAACC-3' se diseñaron para 5' anidado RACE. Las reacciones se llevaron a cabo usando una biblioteca Clontech de grasa humana RACE. Después de completar las reacciones 5' y 3' RACE, las secuencias resultantes se combinaron para obtener la secuencia
de longitud completa. Para confirmar que la secuencias 5'RACE y 3'RACE eran del mismo gen, se diseñó un cebador hacia adelante 5' que rodea el codón de inicio ATG. Usando este oligonucleótido, junto con un cebador inverso 3' que rodea el codón de detención, se realizó otra reacción PCR y se amplificó una banda sencilla, confirmando la identidad del ADNc. El clon resultante se sometió a un análisis de secuencia final, formando la completa secuencia humana SYNIP ADNc. Debe entenderse que la invención no se limita a los detalles exactos de operación, o a ios compuestos exactos, composiciones, métodos, procedimientos o modalidades mostradas
• y descritas, puesto que modificaciones y equivalentes obvios serán aparentes para un experto en la técnica, y la invención se limita por lo tanto solamente por el alcance total de las reivindicaciones anexas. 15
•
Claims (20)
- REIVINDICACIONES 1. Una secuencia de ADN aislada y purificada sustancialmente similar a la secuencia de ADN mostrada en la
- • SEC. DE IDENT. 1 ó 4. 2. Una secuencia de ADN aislada y purificada que está caracterizada porque hibridiza a la secuencia de ADN mostrada en la SEC. DE IDENT. 1 ó 4 bajo condiciones de hibridización de alta astringencia. 3. Una secuencia de ADN aislada y purificada
- F caracterizada porque consiste esencialmente de la secuencia de ADN mostrada en la SEC. DE IDENT. 1 ó 4.
- 4. La molécula de ADN recombinante está caracterizada porque comprende la secuencia de ADN aislada y purificada de conformidad con la reivindicación 1, 2 ó 3 subclonada dentro de un 15 vector extracromosómico.
- 5. La célula huésped recombinante caracterizada porque comprende una célula huésped transfectada con la molécula de • ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 4.
- 6. Un polipéptido recombinante sustancial purificado, 20 caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del polipéptido recombinante sustancialmente purificado es sustancialmente similar a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. DE IDENT. 2 ó 5.
- 7. Un polipéptido recombinante sustancialmente purificado, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del polipéptido recombinante sustancialmente purificado consiste • esencialmente de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. DE IDENT. 2 ó 5.
- 8. El anticuerpo está caracterizado porque enlaza » polipéptidos selectivamente con una secuencia de aminoácidos sustancialmente similar a la secuencia de aminoácidos de conformidad con la reivindicación 6. •
- 9. El método para detectar una SYNIP en células, caracterizado porque comprende poner en contacto las células con el anticuerpo de conformidad con reivindicación 8 e incubar las células en una forma que permita la detección del complejo SYNIP-anticuerpo. 15
- 10. La prueba de diagnóstico para detectar células que contienen mutaciones SYNIP, que comprenden el aislamiento total de ADN genómico de la célula y someter el ADN genómico a amplificación PCR usando cebadores derivados de la secuencia de ADN aislada y purificada de conformidad con la reivindicación 1, 2 20 ó 3 y determinar si el producto PCR resultante contiene una mutación.
- 11. La prueba de diagnóstico para detectar células que contienen mutaciones SYNIP, caracterizada porque comprende el aislamiento total del ARN de la célula, sometiendo el ARN a transcripción inversa-amplificación PCR usando cebadores derivados de la secuencia de ADN aislada y purificada de conformidad con la reivindicación 1, 2 ó 3 y determinar si el producto PCR resultante contiene una mutación.
- 12. Una prueba de diagnóstico para detectar o seleccionar compuestos terapéuticos que interfieran con la interacción entre SYNIP y sintaxina-4 u otros ligandos que enlazan a SYNIP, caracterizada porque comprende la etapa de medir la interacción entre SYNIP y sintaxina-4 u otros ligandos que enlazan • a SYNIP mientras están en la presencia de al menos otro compuesto terapéutico.
- 13. Una prueba de diagnóstico para el descubrimiento de proteínas que interactúan directamente o indirectamente con SYNIP, caracterizada porque comprende la etapa de detectar la 15 interacción de SYNIP o ADNc que codifica SYNIP como proteínas en células de mamífero.
- 14. El método para aislar ARN que contiene intervalos • de residuos de poliA o poliC caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto una muestra de ARN con SYNIP 20 en amortiguador de enlace de ARN en la presencia de un agente reductor; (b) incubar la mezcla ARN-SYNIP con el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 8; (c) aislar los complejos del anticuerpo-SYNIP-ARN, y (d) purificar el ARN lejos del complejo del anticuerpo- SYNIP.
- 15. El método para aislar ARN que contiene intervalos • de residuos poliU caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto una muestra de RNA con SYNIP en amortiguador de enlace de ARN en la ausencia de agentes reductores; (b) incubar la mezcla ARN-SYNIP con el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 8; # (c) aislar los complejos del anticuerpo-SYNIP-ARN; y (d) purificar el ARN lejos del complejo del anticuerpo- SYNIP.
- 16. El método para purificar SYNIP de células bacterianas caracterizado porque comprende: 15 (a) transfectar una célula huésped bacteriana con un vector que comprende la secuencia de ADN aislada y purificada de conformidad con la reivindicación 1, 2 ó 3 enlazada operativamente a un promotor capaz de dirigir la expresión del gen en una célula huésped bacteriana; 20 (b) inducir la expresión de la secuencia de ADN aislada y purificada en las células bacterianas; (c) lisar las células bacterianas; (d) aislar los cuerpos de inclusión bacteriana; (e) purificar la proteína SYNIP de los cuerpos de inclusión aislados.
- 17. El método para aislar ARN que contiene intervalos de residuos poliU, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto una muestra de ARN con SYNIP en amortiguador de enlace de ARN en la ausencia de agentes reductores; (b) incubar la mezcla ARN-SYNIP con el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 8; (c) aislar los complejos de anticuerpo-SYNIP-ARN; y (d) purificar el ARN lejos del complejo de anticuerpo-SYNIP.
- 18. El método para proteger células de mamífero de trastornos de la utilización o almacenamiento de glucosa, caracterizado porque comprende introducir dentro de las células del mamífero un vector de expresión que comprende la secuencia de ADN aislada y purificada de conformidad con la reivindicación 1, 2 ó 3, la cual se une operativamente a una secuencia de ADN que promueve el alto nivel de expresión de la secuencia de ADN aislada y purificada en células de mamífero.
- 19. El método para tratar o prevenir la resistencia a la insulina, caracterizado porque comprende introducir dentro de un mamífero un vector de expresión que comprende la secuencia de ADN aislada y purificada de conformidad con la reivindicación 1, 2 ó 3, la cual se enlaza operativamente a una secuencia de ADN que promueve el alto nivel de expresión de la cepa antisentido de la secuencia de ADN aislada y purificada en las células de mamífero.
- 20. El método para purificar SYNIP de células bacterianas caracterizado porque comprende: (a) transfectar una célula huésped bacteriana con un vector que comprende la secuencia de ADN aislada y purificada de conformidad con la reivindicación 1, 2 ó 3 enlazada operativamente a un promotor capaz de dirigir la expresión del gen en una célula huésped bacteriana; (b) inducir la expresión de la secuencia de ADN aislada y purificada en las células bacterianas; (c) lisar las células bacterianas; (d) aislar los cuerpos de inclusión bacteriana; (e) purificar la proteína SYNIP de los cuerpos de inclusión aislados. RESUM EN La presente invención se refiere a genes novedosos y polipéptidos derivados de los mismos que codifican a la proteína sintaxina interactuante. La invención también describe vectores y células huéspedes que comprenden al gen novedoso. La invención además describe métodos para usar el gen novedoso, polipéptidos y anticuerpos específicamente polipéptidos blancos derivados de los genes novedosos, en la detección de supresiones genéticas del gen, la localización subcelular del polipéptido, el aislamiento de clases discretas de ARN, aplicaciones de terapia genética, el diagnostico de los síndromes que involucran la resistencia a la insulina, el desarrollo de estrategias adecuadas de escrutinio de los inhibidores de la proteína sintaxina interactuante.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US60/082,454 | 1998-04-20 |
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MXPA00009332A true MXPA00009332A (es) | 2001-07-09 |
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