JP2003512820A5

JP2003512820A5 - Ｓｙｋ−ｕｂｐタンパク質、組成物および使用法

Info

Publication number: JP2003512820A5
Application number: JP2001525227A
Authority: JP
Filing date: 2000-09-25
Publication date: 2007-11-15

Description

【特許請求の範囲】
【請求項１】図１または図３に記載した核酸配列と８０％より高い全体的配列同一性を有する核酸配列を含む、組換え核酸。
【請求項２】該核酸配列がＳＹＫキナーゼと結合する組換えタンパク質をコードする、請求項１に記載の組換え核酸。
【請求項３】図１または図３に記載した核酸配列を含む、請求項１に記載の組換え核酸。
【請求項４】核酸配列が、図１または図３に記載した核酸配列と８５％より高い全体的配列同一性を有する、請求項１に記載の組換え核酸。
【請求項５】核酸配列が、図１または図３に記載した核酸配列と９０％より高い全体的配列同一性を有する、請求項１に記載の組換え核酸。
【請求項６】核酸配列が、図１または図３に記載した核酸配列と９５％より高い全体的配列同一性を有する、請求項１に記載の組換え核酸。
【請求項７】図２または図４に記載したアミノ酸配列を含む組換えタンパク質をコードしている組換え核酸。
【請求項８】請求項１ないし請求項７に記載の組換え核酸のいずれかを含み、該核酸が、該核酸で形質転換した宿主細胞により認識される調節配列に作動可能なように連結している、発現ベクター。
【請求項９】請求項１ないし請求項７に記載の組換え核酸のいずれかを含む宿主細胞。
【請求項１０】請求項８に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１１】請求項８に記載の発現ベクターによりコードされる組換えタンパク質の製法であって、請求項９または請求項１０に記載の宿主細胞を、該組換えタンパク質の発現に適した条件下に培養することを含む方法。
【請求項１２】さらに該組換えタンパク質を回収することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】請求項１ないし請求項７のいずれかに記載の核酸によりコードされている、組換えタンパク質。
【請求項１４】図２または図４に記載したアミノ酸配列と少なくとも８０％の全体的配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換えポリペプチド。
【請求項１５】該ポリペプチドがＳＹＫキナーゼと結合する、請求項１４に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１６】該配列が図２または図４に記載したものである、請求項１４に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１７】アミノ酸配列が、図２または図４に記載したアミノ酸配列と８５％より高い全体的配列同一性を有する、請求項１４に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１８】アミノ酸配列が、図２または図４に記載したアミノ酸配列と９０％より高い全体的配列同一性を有する、請求項１４に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１９】アミノ酸配列が、図２または図４に記載したアミノ酸配列と９５％より高い全体的配列同一性を有する、請求項１４に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２０】請求項１５に記載の組換えタンパク質と特異的に結合する、単離されている抗体。
【請求項２１】該抗体がモノクローナル抗体である、請求項２０に記載の抗体。
【請求項２２】該抗体が、該組換えタンパク質の生物学的機能を低下または除去するものである、請求項２１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２３】該抗体が、該組換えタンパク質のＳＹＫ結合を低下または除去するものである、請求項２０に記載の抗体。
【請求項２４】請求項１４に記載した組換えタンパク質と結合する能力のあるバイオ活性物質をインビトロでスクリーニングする方法であって、
ａ）該組換えタンパク質と候補バイオ活性物質とを合わせること：および
ｂ）該候補バイオ活性物質と該組換えタンパク質との結合を測定すること
を含む、方法。
【請求項２５】請求項１４に記載した組換えタンパク質とＳＹＫキナーゼタンパク質との結合を妨害する能力のあるバイオ活性物質をインビトロでスクリーニングする方法であって、
ａ）該組換えタンパク質、候補バイオ活性物質およびＳＹＫキナーゼタンパク質を合わせること：および
ｂ）該組換えタンパク質と該ＳＹＫキナーゼタンパク質との結合を測定すること
を含む、方法。
【請求項２６】該組換えタンパク質と該ＳＹＫキナーゼタンパク質とを最初に合わせる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】請求項１４に記載した組換えタンパク質の活性を調節する能力のあるバイオ活性物質をインビトロでスクリーニングする方法であって、
ａ）該組換えタンパク質をコードしている組換え核酸を含む細胞に候補バイオ活性物質を加えること：および
ｂ）該候補バイオ活性物質が該細胞に与える効果を測定すること
を含む、方法。
【請求項２８】候補バイオ活性物質のライブラリーを、該組換えタンパク質をコードしている組換え核酸を含む複数の細胞に加える、請求項２７に記載の方法。

ある実施態様では、細胞周期核酸または細胞周期タンパク質は、本発明で提供される配列への核酸および／またはアミノ酸配列の実質的同一性または類似性により最初に同定される。好ましい実施態様では、細胞周期核酸または細胞周期タンパク質は、下記のように本発明で提供される配列に対して配列同一性または類似性を有し、１またはそれ以上のさらに後述するような細胞周期タンパク質バイオ活性を有する。そのような配列同一性または類似性は、全体的な核酸またはアミノ酸配列に基づくことができる。

もう１つのタイプの細胞周期タンパク質の共有結合的修飾は、米国特許第４６４０８３５号、第４４９６６８９号、第４３０１１４４号、第４６７０４１７号、第４７９１１９２号または第４１７９３３７号に示されている方法で、細胞周期ポリペプチドを種々の非タンパク質ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン、の１つに結合させることを含む。

外来性核酸を哺乳動物宿主およびその他の宿主中に導入する方法は技術上周知であり、用いる宿主細胞により異なるであろう。この技術としては、デキストラン仲介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン仲介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔法、ウイルス感染、ポリヌクレオチドのリポソームへの封入、およびＤＮＡの核内への直接マイクロインジェクションが挙げられる。

これらの細胞周期ポリペプチドをコードしている核酸類、アンタゴニストまたはアゴニストは、遺伝子治療にも使用できる。遺伝子治療への応用では、遺伝子を細胞内に導入し、例えば欠陥遺伝子置換のための、治療的に有効な遺伝子産物のインビボ合成を達成させる。「遺伝子治療」には、単回の処置により持続的効果を達成させる在来の遺伝子治療と、治療的に有効なＤＮＡまたはｍＲＮＡの単回または反復した投与を含む、遺伝子治療的物質の投与との両方が含まれる。アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ類を、インビボである種の遺伝子の発現を阻止する治療的物質として使用できる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチド類が細胞内に導入され、細胞膜による取り込みが制限されることにより細胞内濃度が低いにもかかわらず、そこで阻害物質として働き得ることが既に示されている(Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4143-4146 [1986])。これらのオリゴヌクレオチド類は、修飾、例えばそれらの負荷電ホスフォジエステル基を非荷電基と置換、してそれらの取り込みを増強することができる。

好ましい態様では、該候補バイオ活性物質はタンパク質である。本明細書において「タンパク質」とは共有結合した少なくとも２つのアミノ酸を意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドが含まれる。該タンパク質は、天然産生のアミノ酸およびペプチド結合または合成ペプチド模倣構造からなってもよい。従って本明細書において「アミノ酸」または「ペプチド残基」とは、天然産生のアミノ酸と合成アミノ酸の双方を意味する。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリンおよびノルロイシンは、本発明の目的のためのアミノ酸と考えられる。また「アミノ酸」には、プロリンおよびヒドロキシプロリンなどのイミノ酸残基が含まれる。その側鎖は（Ｒ）配置または（Ｓ）配置のいずれであってもよい。好ましい態様では、該アミノ酸は（Ｓ）またはＬ配置である。天然産生ではない側鎖を用いる場合は、例えばインビボ分解を妨げるか、または遅延させるために非アミノ酸置換基を用いてもよい。また、化学保護基またはその他の化学置換基を付加してもよい。

好ましい態様では、細胞の生存能力をアッセイし、細胞性変化のないことが実験的条件による（即ち、候補バイオ活性物質の導入）ものであり、細胞死によるものではないことを確認する。光散乱法、生存色素染色法、色素排除染色法を含む、がそれらに限定されない各種の適切な細胞生存能力アッセイを使用できる。

好ましい実施態様において、生存能力アッセイは生存能力判別色素(viability dye)を使用する。死細胞または瀕死細胞を染色するが、増殖中の細胞は染色しない、多くの既知の生存能力判別色素が存在する。例えば、アネキシンＶは２価イオンに依存した方法でリン脂質(ホスファチジルセリン)に特異的な結合を示すタンパクファミリーのメンバーである。このタンパク質は、ホスファチジルセリンの細胞表面への露出がこのプロセスの初期シグナルの特徴であるので、アポトーシス(プログラム細胞死)の測定に広く使用されている。適当な生存能力判別色素は、アネキシン、エチジウムホモダイマー−１、ＤＥＡＤＲｅｄ、ヨウ化プロピジウム、ＳＹＴＯＸＧｒｅｅｎなど、および当分野で既知の他の物質を含むが、これらに限定されない；the Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Haugland, Sixth Editionを参照。引用により本明細書に含める；特に２８５ページのApoptosis Assay、およびChapter 16を参照。

細胞の生存能力判別のための生存色素染色(viability dye staining)のプロトコールは既知である。上記のMolecular Probesの目録を参照。本実施態様において、アネキシンのような生存能力判別色素を直接的または間接的に標識し、細胞集団と組み合わせる。アネキシンは商業的に、すなわちPharMingen, San Diego, CaliforniaまたはCaltag Laboratories, Millbrae, Californiaから入手可能である。好ましくは、生存能力判別色素は、色素の濃度が約１００ｎｇ／ｍｌ〜約５００ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約５００ｎｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌ、および最も好ましくは約１μｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌの溶液で提供される。好ましい実施態様において、生存能力判別色素は直接的に標識される；例えば、アネキシンはフルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)、Ａｌｅｘａ色素、ＴＲＩＴＣ、ＡＭＣＡ、ＡＰＣ、ｔｒｉ−ｃｏｌｏｒ、Ｃｙ−５のような蛍光色素、および当分野で既知または商業的に入手可能なものであり得る。別の好ましい実施態様において、生存能力判別色素はハプテン(例えばビオチン)のような第１の標識で標識され、第２の蛍光標識として、例えば蛍光ストレプトアビジンが使用される。当業者に分かるであろう他の第１および第２の標識の組合せが使用され得る。

添加後、生存能力判別色素は、ある時間、細胞とともにインキュベートされ、必要であれば洗浄される。次いで、以下に概説したように細胞をソートして非生存細胞を取り除く。

好ましい実施態様において、少なくとも１つの細胞生存能力アッセイが実施され、蛍光が互換可能な場合には２つの異なる細胞生存能力アッセイが好ましい。１つの生存能力アッセイのみを実施する場合、好ましい実施態様では光分散測定が利用される(前方および側方分散の両方)。２つの生存能力アッセイを実施する場合、好ましい実施態様では光分散と色素排除が利用され、光分散と生存可能な色素染色も利用可能であり、そして場合によっては３つすべてが利用され得る。したがって、生存能力アッセイにより非生存細胞または瀕死細胞から生存細胞を分離することが可能となる。

あるいは、抗細胞周期タンパク質抗体はモノクローナル抗体であってよい。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法を使用して調製し得る。その方法は、Kohler and Milstein, Nature, 256: 495(1975)に記載されている。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスターなどの適当な宿主動物を典型的には免疫化物質で免疫化する。そして、免疫化物質に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生し得るリンパ球を誘発する。あるいはリンパ球をインビトロで免疫化し得る。

好ましい不死化細胞系統は効率的に融合し、選択された抗体生産細胞による抗体の安定的高水準の発現を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に感受性である。さらに好ましい不死化細胞系統は、ネズミミエローマ系統であり、例えば、Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California and the American Type Culture Collection, Rockville, Marylandから得ることができる。ヒトミエローマおよびマウス−ヒトへテロミエローマ細胞系統は、ヒトモノクローナル抗体の生産に関して記載されている[Kozbor, J. Immunol., 133:3001(1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63]。

本発明の医薬組成物は、患者への投与に適した形態の細胞周期タンパク質、アゴニストまたはアンタゴニスト（本明細書に記載の抗体およびバイオ活性物質を含む）を含む。好ましい実施態様において、この医薬組成物は、水溶性形態、例えば、医薬的に許容し得る塩類として存在しており、これらは酸および塩基の両付加塩類を包含するものとする。「医薬的に許容し得る酸付加塩類」は、遊離塩基の生物学的有効性を保持し、かつ生物学上またはその他の点で許容できるものであり、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など、および有機酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、蓚酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などと形成する。「医薬的に許容し得る塩基付加塩類」は、無機塩基、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム塩類などから誘導されたものを含む。特に好ましいのは、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウムおよびマグネシウム塩類などである。医薬的に許容し得る有機非毒性塩基から誘導される塩類は、第１級、第２級および第３級アミン類、置換アミン類、例えば、天然産生の置換アミン類、環状アミン類および塩基性イオン交換樹脂、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミンおよびエタノールアミンの塩類がある。