JP2003512026A - 神経変性疾患のためのトランスジェニック動物モデル - Google Patents
神経変性疾患のためのトランスジェニック動物モデルInfo
- Publication number
- JP2003512026A JP2003512026A JP2001520735A JP2001520735A JP2003512026A JP 2003512026 A JP2003512026 A JP 2003512026A JP 2001520735 A JP2001520735 A JP 2001520735A JP 2001520735 A JP2001520735 A JP 2001520735A JP 2003512026 A JP2003512026 A JP 2003512026A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- sequence number
- sequence
- parkin
- disease
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 title claims abstract description 26
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 title claims abstract description 25
- 238000011820 transgenic animal model Methods 0.000 title description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 89
- 102000045222 parkin Human genes 0.000 claims abstract description 73
- 108700007244 parkin Proteins 0.000 claims abstract description 53
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 38
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 38
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 36
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 35
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 33
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 claims abstract description 31
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 96
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 48
- 101000619542 Homo sapiens E3 ubiquitin-protein ligase parkin Proteins 0.000 claims description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 35
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 35
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 35
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 34
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 23
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 19
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 16
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 15
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 11
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 7
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 claims description 7
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 5
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 claims description 4
- 208000024777 Prion disease Diseases 0.000 claims description 4
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 201000011240 Frontotemporal dementia Diseases 0.000 claims description 3
- 208000002972 Hepatolenticular Degeneration Diseases 0.000 claims description 3
- 208000001089 Multiple system atrophy Diseases 0.000 claims description 3
- 208000000609 Pick Disease of the Brain Diseases 0.000 claims description 3
- 208000018839 Wilson disease Diseases 0.000 claims description 3
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 3
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 206010011953 Decreased activity Diseases 0.000 claims description 2
- 206010019196 Head injury Diseases 0.000 claims description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 2
- 206010034010 Parkinsonism Diseases 0.000 claims description 2
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 claims description 2
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 2
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 claims description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 claims description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 claims description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000006496 vascular abnormality Effects 0.000 claims 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 22
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 22
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 20
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 20
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 17
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 15
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 15
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 13
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 13
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 11
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 8
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 8
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 6
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 6
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 5
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- 208000027089 Parkinsonian disease Diseases 0.000 description 4
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 3
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 3
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 3
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 229960001760 dimethyl sulfoxide Drugs 0.000 description 3
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 3
- 210000005064 dopaminergic neuron Anatomy 0.000 description 3
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 3
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 210000003523 substantia nigra Anatomy 0.000 description 3
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 2
- 108020004491 Antisense DNA Proteins 0.000 description 2
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N L-DOPA Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N L-Dopa Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004058 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 2
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 2
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 2
- 229960004150 aciclovir Drugs 0.000 description 2
- MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N aciclovir Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1N(COCCO)C=N2 MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000185 alpha-Synuclein Proteins 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000003816 antisense DNA Substances 0.000 description 2
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 208000018620 early-onset Parkinson disease Diseases 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 description 2
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000626 neurodegenerative effect Effects 0.000 description 2
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- DIVDFFZHCJEHGG-UHFFFAOYSA-N oxidopamine Chemical compound NCCC1=CC(O)=C(O)C=C1O DIVDFFZHCJEHGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- PLRACCBDVIHHLZ-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine Chemical compound C1N(C)CCC(C=2C=CC=CC=2)=C1 PLRACCBDVIHHLZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDRNOBUWMVLVFH-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-n-(2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl)prop-2-enamide Chemical compound CC(=C)C(=O)NC1CC(C)(C)NC(C)(C)C1 KDRNOBUWMVLVFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 102100022900 Actin, cytoplasmic 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 206010003591 Ataxia Diseases 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 206010006100 Bradykinesia Diseases 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N Carbon monoxide Chemical compound [O+]#[C-] UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102100022207 E3 ubiquitin-protein ligase parkin Human genes 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 101100321669 Fagopyrum esculentum FA02 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100036738 Guanine nucleotide-binding protein subunit alpha-11 Human genes 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 101000834898 Homo sapiens Alpha-synuclein Proteins 0.000 description 1
- 101100283445 Homo sapiens GNA11 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000740112 Homo sapiens Membrane-associated transporter protein Proteins 0.000 description 1
- 101000835745 Homo sapiens Teratocarcinoma-derived growth factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 208000006083 Hypokinesia Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 102100037258 Membrane-associated transporter protein Human genes 0.000 description 1
- 208000016285 Movement disease Diseases 0.000 description 1
- 206010052904 Musculoskeletal stiffness Diseases 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 1
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 101001062854 Rattus norvegicus Fatty acid-binding protein 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 229920006328 Styrofoam Polymers 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 102000003802 alpha-Synuclein Human genes 0.000 description 1
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000001977 ataxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000009141 biological interaction Effects 0.000 description 1
- 210000004952 blastocoel Anatomy 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002026 chloroform extract Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000003136 dopamine receptor stimulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000006739 dopaminergic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000003291 dopaminomimetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 1
- 231100000118 genetic alteration Toxicity 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 238000010448 genetic screening Methods 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000014726 immortalization of host cell Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 210000004558 lewy body Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000000627 locus coeruleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- CAAULPUQFIIOTL-UHFFFAOYSA-N methyl dihydrogen phosphate Chemical group COP(O)(O)=O CAAULPUQFIIOTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 description 1
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 229940127073 nucleoside analogue Drugs 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003334 potential effect Effects 0.000 description 1
- 229940124606 potential therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000009117 preventive therapy Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- MEZLKOACVSPNER-GFCCVEGCSA-N selegiline Chemical compound C#CCN(C)[C@H](C)CC1=CC=CC=C1 MEZLKOACVSPNER-GFCCVEGCSA-N 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000008261 styrofoam Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000001608 teratocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/93—Ligases (6)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
- A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/15—Humanized animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
- A01K2267/0318—Animal model for neurodegenerative disease, e.g. non- Alzheimer's
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
本発明は、対応するヒト配列において生じると、ヒトにおいてパーキンソン病の原因となる変異又は欠失を含むマウスパーキン２ＤＮＡ−及びタンパク質配列、該変異ＤＮＡ配列を含み、かつ非パーキンタンパク質又は低活性若しく非活性のパーキンタンパク質を発現するランスジェニック非ヒト動物の構築、ならびに神経変性疾患のためのモデルとしての該トランスジェニック動物の使用に関する。
Description
【０００１】
本発明は、ヒト配列において生じるとヒトにおいてパーキンソン病の原因となる
天然由来の又は人工的に導入された変異又は欠失を含むマウスパーキン２ＤＮＡ
−及びタンパク質配列、非パーキンタンパク質、非活性又は切断型パーキンタン
パク質を発現する切断型パーキン遺伝子の構築、及び天然型パーキンタンパク質
又は非パーキンタンパク質の代わりにそのような低活性の又は非活性のパーキン
タンパク質を発現するトランスジェニック動物に関する。
天然由来の又は人工的に導入された変異又は欠失を含むマウスパーキン２ＤＮＡ
−及びタンパク質配列、非パーキンタンパク質、非活性又は切断型パーキンタン
パク質を発現する切断型パーキン遺伝子の構築、及び天然型パーキンタンパク質
又は非パーキンタンパク質の代わりにそのような低活性の又は非活性のパーキン
タンパク質を発現するトランスジェニック動物に関する。
【０００２】
神経変性疾患は社会において最も恐ろしい病気の幾つかである。過去１０年の間
、アルツハマイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症
、プリオン病、及び数種の失調性症候群のような主要な神経変性疾患の多くの遺
伝的原因のうちの幾つかが同定された。これらの発見は、それらの疾患によって
もたらされる結果のみならず発端となる引き金に関する知識に新たな衝撃を与え
た。これらの疾患が多くの病理学的機構を共通に有するという事実があるために
、神経細胞死に至る比較的少数の経路しかこれらの疾患に関わっていない可能性
があるように思われる。従って、特定の神経変性疾患のための治療戦略が他の関
連する障害においても意味をもつことが見出されるかもしれない。
、アルツハマイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症
、プリオン病、及び数種の失調性症候群のような主要な神経変性疾患の多くの遺
伝的原因のうちの幾つかが同定された。これらの発見は、それらの疾患によって
もたらされる結果のみならず発端となる引き金に関する知識に新たな衝撃を与え
た。これらの疾患が多くの病理学的機構を共通に有するという事実があるために
、神経細胞死に至る比較的少数の経路しかこれらの疾患に関わっていない可能性
があるように思われる。従って、特定の神経変性疾患のための治療戦略が他の関
連する障害においても意味をもつことが見出されるかもしれない。
【０００３】
パーキンソン病は、こわばり、運動緩徐、または震えのような重篤な症状を有す
る進行性の神経変性運動障害である。疾患の症状はドーパミン作用性ニューロン
の７０％から８０％以上の変性後に現れる。大まかに言うと、該疾患は二つのカ
テゴリー、即ち、晩期発症型と早期発症型に分類される。主に環境の影響の結果
として高齢（５５＋才）で起こる晩期発症型は、通常よりもより速い速度でかつ
より重篤な程度までドーパミン作用性ニューロン死の亢進を導く。早期発症型パ
ーキンソン病ははるかに頻繁に起こるが３５才から６０才の間で始まる。パーキ
ンソン病のこの早期型の３つの形態は家族の中に広がる傾向があり、それゆえ家
族性パーキンソン病として知られている。
る進行性の神経変性運動障害である。疾患の症状はドーパミン作用性ニューロン
の７０％から８０％以上の変性後に現れる。大まかに言うと、該疾患は二つのカ
テゴリー、即ち、晩期発症型と早期発症型に分類される。主に環境の影響の結果
として高齢（５５＋才）で起こる晩期発症型は、通常よりもより速い速度でかつ
より重篤な程度までドーパミン作用性ニューロン死の亢進を導く。早期発症型パ
ーキンソン病ははるかに頻繁に起こるが３５才から６０才の間で始まる。パーキ
ンソン病のこの早期型の３つの形態は家族の中に広がる傾向があり、それゆえ家
族性パーキンソン病として知られている。
【０００４】
パーキンソン病の早期発症型と晩期発症型では病態は同じであるが、その異常は
若年齢で始まる症例の方がより深刻で、かつ広範囲に及んでいる。該疾患は、ド
ーパミン作用性ニューロンの細胞体が主に黒質緻密層に位置する脳領域内の欠陥
を特徴とする。さらに、レヴィ小体として知られる細胞質内封入体が異なる脳領
域、特に黒質緻密層及び青斑において観察される。
若年齢で始まる症例の方がより深刻で、かつ広範囲に及んでいる。該疾患は、ド
ーパミン作用性ニューロンの細胞体が主に黒質緻密層に位置する脳領域内の欠陥
を特徴とする。さらに、レヴィ小体として知られる細胞質内封入体が異なる脳領
域、特に黒質緻密層及び青斑において観察される。
【０００５】
近年、２つの遺伝子座が早期発症型ＰＤに関連すると認識されているが、一つは
小型の多量に存在する脳分子（Polymeropoulos, M. et al., Science 1997;276:
2045-2047)であるα−シヌクレインタンパク質（又はparkin１）内のミスセンス
変異に起因する遺伝子欠陥を有するヒト染色体４ｑ２１−２３（“PARK 1”遺伝
子座）上にあり、もう一つは染色体２ｐ１３（“PARK 3”遺伝子座）（Gasser,
T. et al., Nat.Genet.1998；18:262-265)上にある。両形態とも常染色体優性様
式を受け継いでいる。
小型の多量に存在する脳分子（Polymeropoulos, M. et al., Science 1997;276:
2045-2047)であるα−シヌクレインタンパク質（又はparkin１）内のミスセンス
変異に起因する遺伝子欠陥を有するヒト染色体４ｑ２１−２３（“PARK 1”遺伝
子座）上にあり、もう一つは染色体２ｐ１３（“PARK 3”遺伝子座）（Gasser,
T. et al., Nat.Genet.1998；18:262-265)上にある。両形態とも常染色体優性様
式を受け継いでいる。
【０００６】
最近、家族性パーキンソン病の常染色体劣性型がヒト染色体６ｑ２５．２−２７
（“PARK 2”遺伝子座）（Matsumine, H. et al., Am J Hum Genet (1997);60:5
88-596)にリンクしていることが観察された。parkin(又は後にparkin２）と称さ
れるこの遺伝子は５００ｋｂ以上にのびる１２個のエキソンを含み、Ｎ−末端部
位にユビキチンに対して相同性を有し、Ｃ−末端部位にＲＩＮＧフィンガー様モ
チーフを有する、４６５個のアミノ酸からなるタンパク質（分子量５１，６５２
ダルトン）をコードする。
（“PARK 2”遺伝子座）（Matsumine, H. et al., Am J Hum Genet (1997);60:5
88-596)にリンクしていることが観察された。parkin(又は後にparkin２）と称さ
れるこの遺伝子は５００ｋｂ以上にのびる１２個のエキソンを含み、Ｎ−末端部
位にユビキチンに対して相同性を有し、Ｃ−末端部位にＲＩＮＧフィンガー様モ
チーフを有する、４６５個のアミノ酸からなるタンパク質（分子量５１，６５２
ダルトン）をコードする。
【０００７】
α−シヌクレイン遺伝子内の変異は常染色体劣性若年性パーキンソン症候群のみ
ならず常染色体優性パーキンソン病（Polymeropoulos, M. et al., Science 199
7;276;2045-2047)を誘導することが示されている（Kitada, T. et al., Nature
1998;392:605.608; Hattori, N. et al., Biochem Biophys Res Comm 1998;249:
754-458)。
ならず常染色体優性パーキンソン病（Polymeropoulos, M. et al., Science 199
7;276;2045-2047)を誘導することが示されている（Kitada, T. et al., Nature
1998;392:605.608; Hattori, N. et al., Biochem Biophys Res Comm 1998;249:
754-458)。
【０００８】
さらに、Hattori, N. et al.は、Ann Neurol 1998;44:935-941においてパーキン
遺伝子内の異なる欠失が常染色体劣性若年性パーキンソン症候群の原因となって
いる切断型パーキンタンパク質に対する理由であることを示した。特に、エキソ
ン３からエキソン７と同様、エキソン３から４、エキソン３、エキソン４、及び
エキソン５を含む遺伝子内欠失変異がその疾患に影響を与えると記載されている
。Lucking, C. et al.は、Lancet 1998;352:1355-1356においてパーキン遺伝子
のエキソン３の欠失はさらに常染色体劣性若年性パーキンソン症候群の原因とな
ることを記載している。Abbas, N. et al. Human Molecular Genetics 1999;8:5
67-574及びKitada T. et al., Nature 1998;392:805-808の研究は、ユビキチン
様のパーキン遺伝子のＮ−末端部分（エキソン２）における変異もまた異なるフ
レームシフト−又はミスセンス変異同様に常染色体劣性若年性パーキンソン症候
群の原因となりうることを示している。
遺伝子内の異なる欠失が常染色体劣性若年性パーキンソン症候群の原因となって
いる切断型パーキンタンパク質に対する理由であることを示した。特に、エキソ
ン３からエキソン７と同様、エキソン３から４、エキソン３、エキソン４、及び
エキソン５を含む遺伝子内欠失変異がその疾患に影響を与えると記載されている
。Lucking, C. et al.は、Lancet 1998;352:1355-1356においてパーキン遺伝子
のエキソン３の欠失はさらに常染色体劣性若年性パーキンソン症候群の原因とな
ることを記載している。Abbas, N. et al. Human Molecular Genetics 1999;8:5
67-574及びKitada T. et al., Nature 1998;392:805-808の研究は、ユビキチン
様のパーキン遺伝子のＮ−末端部分（エキソン２）における変異もまた異なるフ
レームシフト−又はミスセンス変異同様に常染色体劣性若年性パーキンソン症候
群の原因となりうることを示している。
【０００９】
Leroy, E. et al.は、Hum Genet 1988;103:424-427においてヒトパーキン遺伝子
のエキソン５、６、及び７の欠失が、早期発症型パーキンソン病を導くことを証
明した。
のエキソン５、６、及び７の欠失が、早期発症型パーキンソン病を導くことを証
明した。
【００１０】
現在、最も一般的な治療法は、ドーパミンの前駆体としてＬ−ドーパ、ドーパミ
ンアゴニスト又はMAO−B（Monoamino Oxidase B)阻害剤、例えばデプレニル(Dep
renyl)の適用を介してドーパミンの分解を遮断することによってＰＤ患者におけ
るドーパミン量の増加に対処している。晩期発症型ＰＤにおける症状が起こる前
に変性疾患の進行を止めるのに有効な予防的療法はない。これは、現在では最初
の症状が起こったときに診断ができるのみであるという事実によるものである。
これまでのところ、どの程度まで遺伝的要素がドーパミン性ニューロンの細胞死
の増加の原因を担っている環境的要素を亢進するのかが明確ではない。
ンアゴニスト又はMAO−B（Monoamino Oxidase B)阻害剤、例えばデプレニル(Dep
renyl)の適用を介してドーパミンの分解を遮断することによってＰＤ患者におけ
るドーパミン量の増加に対処している。晩期発症型ＰＤにおける症状が起こる前
に変性疾患の進行を止めるのに有効な予防的療法はない。これは、現在では最初
の症状が起こったときに診断ができるのみであるという事実によるものである。
これまでのところ、どの程度まで遺伝的要素がドーパミン性ニューロンの細胞死
の増加の原因を担っている環境的要素を亢進するのかが明確ではない。
【００１１】
アルツハイマー病のような神経変性疾患のための異なるトランスジェニック動物
モデルが作出されたが、パーキンソン病のためのトランスジェニック動物モデル
はまだ記載されていない。
モデルが作出されたが、パーキンソン病のためのトランスジェニック動物モデル
はまだ記載されていない。
【００１２】
相同組換えが部位特異的手法で遺伝子の不活性化又は変更に用いられる。ヒト細
胞を含む哺乳類細胞における相同組換えの使用は多くの論文に記載されている。
これらの論文の例としては、Kucherlpati et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 81:3153-3157；Kucherlpati et al. (1985) Mol. Cell. Bio. 5:714-720
；Smithies et al. (1985) Nature 317:230-234；Wake et al. (1985) Mol. Cel
l. Bio. 8:2080-2089；Ayares et al. (1985) Genetics 111:375-388；Ayares e
t al. (1986) Mol. Cell. Bio. 7:1656-1662；Song et al. (1987) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 84:6820-6824；Thomas et al. (1986) Cell 44:419-428；Thom
as and Capecchi (1987) Cell 51:503-512;Nandi et al. (1988) Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 85:3845-3849;及びMansour et al. (1988) Nature 336:348-352
がある。胚性幹細胞において特定の遺伝子変異を作りだすために、またこれらの
変異を生殖系列に移すために相同組換えを用いる種々の面が記載されている(Eva
ns and Kaufman (1981) Nature 294：154-156；Dotschman et al., (1987) Natu
re 330：576-578；Thomas and Capecchi (1987) Cell 51：503-512；Thompson e
t al. (1989) Cell 56：316-321)。ネオマイシン遺伝子を働かせるための変異ポ
リオーマエンハンサー及びチミジンキナーゼプロモーターの組み合わせは、Thom
as 及びCapecchi、同上、1987；Nicholas and Berg (1983) in Teratocarcinoma
Stem Cell, eds. Silver, martin and Strikland (Cold Spring Harbor Lab.,
Cold Spring Harbor, N.Y. (pp. 469-497)；及びLinney and Donerly, Cell 35
：693-699, 1983)によって胚性幹細胞とEC細胞の両方で活性であることが示され
た。
胞を含む哺乳類細胞における相同組換えの使用は多くの論文に記載されている。
これらの論文の例としては、Kucherlpati et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 81:3153-3157；Kucherlpati et al. (1985) Mol. Cell. Bio. 5:714-720
；Smithies et al. (1985) Nature 317:230-234；Wake et al. (1985) Mol. Cel
l. Bio. 8:2080-2089；Ayares et al. (1985) Genetics 111:375-388；Ayares e
t al. (1986) Mol. Cell. Bio. 7:1656-1662；Song et al. (1987) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 84:6820-6824；Thomas et al. (1986) Cell 44:419-428；Thom
as and Capecchi (1987) Cell 51:503-512;Nandi et al. (1988) Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 85:3845-3849;及びMansour et al. (1988) Nature 336:348-352
がある。胚性幹細胞において特定の遺伝子変異を作りだすために、またこれらの
変異を生殖系列に移すために相同組換えを用いる種々の面が記載されている(Eva
ns and Kaufman (1981) Nature 294：154-156；Dotschman et al., (1987) Natu
re 330：576-578；Thomas and Capecchi (1987) Cell 51：503-512；Thompson e
t al. (1989) Cell 56：316-321)。ネオマイシン遺伝子を働かせるための変異ポ
リオーマエンハンサー及びチミジンキナーゼプロモーターの組み合わせは、Thom
as 及びCapecchi、同上、1987；Nicholas and Berg (1983) in Teratocarcinoma
Stem Cell, eds. Silver, martin and Strikland (Cold Spring Harbor Lab.,
Cold Spring Harbor, N.Y. (pp. 469-497)；及びLinney and Donerly, Cell 35
：693-699, 1983)によって胚性幹細胞とEC細胞の両方で活性であることが示され
た。
【００１３】
本発明の課題は神経変性疾患、好ましくはパーキンソン病に対する試験モデルの
ための仮定、及びこれらの状態の診断及び治療において有用なツール、ならびに
パーキンソン病の発症に関与する可能性のある生化学的事象をさらに特定するた
めに用いることができるパーキンソン病の実験モデルの開発を提供することにあ
る。
ための仮定、及びこれらの状態の診断及び治療において有用なツール、ならびに
パーキンソン病の発症に関与する可能性のある生化学的事象をさらに特定するた
めに用いることができるパーキンソン病の実験モデルの開発を提供することにあ
る。
【００１４】
この課題は、対応するヒト配列において生じると、パーキンソン病の原因となる
ような天然由来の又は人工的に導入された変異又は欠失を含むマウスパーキン２
タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、該配列を含むベクター、及び該
ベクターを含む原核又は真核細胞、及びパーキン遺伝子をコードする遺伝子の一
方又は両方の対立遺伝子が、改変タンパク質、好ましくは低活性の又は非活性の
タンパク質が発現されるように方法で変異されているトランスジェニック非ヒト
動物によって解決される。
ような天然由来の又は人工的に導入された変異又は欠失を含むマウスパーキン２
タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、該配列を含むベクター、及び該
ベクターを含む原核又は真核細胞、及びパーキン遺伝子をコードする遺伝子の一
方又は両方の対立遺伝子が、改変タンパク質、好ましくは低活性の又は非活性の
タンパク質が発現されるように方法で変異されているトランスジェニック非ヒト
動物によって解決される。
【００１５】
本発明によるトランスジェニック非ヒト動物は神経変性疾患の症状を分析するた
めのモデルとして、又は神経変性疾患に対する治療有効性を試験するためのモデ
ル系として用いることができ、それによってヒト又は動物における上記疾患の一
つを治療するためのいずれかの方法を提供することは本発明の課題ではない。
めのモデルとして、又は神経変性疾患に対する治療有効性を試験するためのモデ
ル系として用いることができ、それによってヒト又は動物における上記疾患の一
つを治療するためのいずれかの方法を提供することは本発明の課題ではない。
【００１６】
そのようなモデルは一つの応用においてパーキンソン病の変性過程を変更する薬
物をスクリーニングすることに用いることができる可能性がある。例えば、パー
キンソン病のモデル系はその発症を誘導又は促進する環境因子をスクリーニング
するのに用いることができるだろう。さらに、実験モデルはパーキンソン病の進
行を抑制、阻害、又は逆行させる薬物をスクリーニングするのに用いることがで
きる。おそらく、そのようなモデルはパーキンソン病を予防し、進行を抑え、又
は逆行させるのに効果的な医薬品を開発することに用いることができる。さらに
そのようなモデルは神経変性疾患の進行中における行動に関する試験、疾患の生
理学的及び分子生物学的相互関係に関する試験、薬物効果に関する試験、及び効
果的な薬物投与量及び毒性の測定のために用いることができる。これらの応用は
例として考えるべきであり、いかなる点においてもそのモデルの応用を制限すべ
きではない。
物をスクリーニングすることに用いることができる可能性がある。例えば、パー
キンソン病のモデル系はその発症を誘導又は促進する環境因子をスクリーニング
するのに用いることができるだろう。さらに、実験モデルはパーキンソン病の進
行を抑制、阻害、又は逆行させる薬物をスクリーニングするのに用いることがで
きる。おそらく、そのようなモデルはパーキンソン病を予防し、進行を抑え、又
は逆行させるのに効果的な医薬品を開発することに用いることができる。さらに
そのようなモデルは神経変性疾患の進行中における行動に関する試験、疾患の生
理学的及び分子生物学的相互関係に関する試験、薬物効果に関する試験、及び効
果的な薬物投与量及び毒性の測定のために用いることができる。これらの応用は
例として考えるべきであり、いかなる点においてもそのモデルの応用を制限すべ
きではない。
【００１７】
本発明は神経変性疾患、好ましくはパーキンソン病のモデル系を提供するもので
あって、該モデル系はマウスパーキン２遺伝子（以降、ｍＰａｒｋ２と称する）
の変異アイソフォーム又は断片、すなわちヒト染色体遺伝領域６ｐ２５．２−２
７（“ＰＡＲＫ２”遺伝子座）によってコードされるヒトパーキンタンパク質に
対応するマウスパーキン２タンパク質をコードする配列番号１に由来するＤＮＡ
配列を含む。好ましいモデル系は変異ｍＰａｒｋ２配列、あるいは何らかの欠失
を含み、変異又は切断された低活性の又は非活性のパーキンタンパク質をコード
するｍＰａｒｋ２配列を含む。
あって、該モデル系はマウスパーキン２遺伝子（以降、ｍＰａｒｋ２と称する）
の変異アイソフォーム又は断片、すなわちヒト染色体遺伝領域６ｐ２５．２−２
７（“ＰＡＲＫ２”遺伝子座）によってコードされるヒトパーキンタンパク質に
対応するマウスパーキン２タンパク質をコードする配列番号１に由来するＤＮＡ
配列を含む。好ましいモデル系は変異ｍＰａｒｋ２配列、あるいは何らかの欠失
を含み、変異又は切断された低活性の又は非活性のパーキンタンパク質をコード
するｍＰａｒｋ２配列を含む。
【００１８】
ヒトα−シヌクレイン（ｐａｒｋｉｎ１）遺伝子、ならびにヒトパーキン（ｐａ
ｒｋｉｎ２）遺伝子は公知である。ヒトパーキン２遺伝子（以降、ｈＰａｒｋ２
と称する）は全長４６５個のアミノ酸を有し、かつ５１，６２５ダルトンの分子
量を有するタンパク質をコードする１２個のエキソンを含んでいる。
ｒｋｉｎ２）遺伝子は公知である。ヒトパーキン２遺伝子（以降、ｈＰａｒｋ２
と称する）は全長４６５個のアミノ酸を有し、かつ５１，６２５ダルトンの分子
量を有するタンパク質をコードする１２個のエキソンを含んでいる。
【００１９】
本願は配列番号１で表されるｍＰａｒｋ２の全長ｃＤＮＡを示すが、これは１２
個のエキソンから成り、コード領域が１３９５ｂｐから成るマウスパーキン２タ
ンパク質（配列番号４）に対する全長オープンリーディングフレームを含み、５
１６１５の計算分子量を有する４６４個のアミノ酸から成るタンパク質をコード
している。さらに、２６２個のアミノ酸（配列番号５）及び２５０個のアミノ酸
（配列番号６）から成るアミノ酸配列にそれぞれ対応する７８９ｂｐ（配列番号
２（特異的ＰＣＲによってマウス脳ｃＤＮＡから単離））及び７５３ｂｐ（配列
番号３（特異的ＰＣＲによってマウス腎ｃＤＮＡから単離）のコード領域にまた
がる２つのより短いｃＤＮＡが提供される。
個のエキソンから成り、コード領域が１３９５ｂｐから成るマウスパーキン２タ
ンパク質（配列番号４）に対する全長オープンリーディングフレームを含み、５
１６１５の計算分子量を有する４６４個のアミノ酸から成るタンパク質をコード
している。さらに、２６２個のアミノ酸（配列番号５）及び２５０個のアミノ酸
（配列番号６）から成るアミノ酸配列にそれぞれ対応する７８９ｂｐ（配列番号
２（特異的ＰＣＲによってマウス脳ｃＤＮＡから単離））及び７５３ｂｐ（配列
番号３（特異的ＰＣＲによってマウス腎ｃＤＮＡから単離）のコード領域にまた
がる２つのより短いｃＤＮＡが提供される。
【００２０】
本願において示される配列番号１から３の配列の単離及び配列決定の作業中、Sh
imizu, NらはＥＭＢＬ ＧｅｎＢａｎｋデータベースにマウスパーキンＤＮＡ配
列を提出し、受託番号ＡＢ０１９５５８で１９９９年７月に公表した。公表され
た配列によってコードされるマウスパーキンタンパク質のタンパク質配列は配列
番号４に一致する。
imizu, NらはＥＭＢＬ ＧｅｎＢａｎｋデータベースにマウスパーキンＤＮＡ配
列を提出し、受託番号ＡＢ０１９５５８で１９９９年７月に公表した。公表され
た配列によってコードされるマウスパーキンタンパク質のタンパク質配列は配列
番号４に一致する。
【００２１】
本発明は、対応するヒト配列において生じると、パーキンソン病の原因となるこ
とが知られている天然由来の又は人工的に導入された変異又は欠失を含む配列番
号１由来のポリ核酸について言及する。
とが知られている天然由来の又は人工的に導入された変異又は欠失を含む配列番
号１由来のポリ核酸について言及する。
【００２２】
本発明はさらにWobble原理によって天然由来の変異を含むポリヌクレオチド配列
を包含するが、それは本発明の変異又は切断型マウスパーキン２のいずれかと同
一又は相同なアミノ酸配列を有するいずれかのタンパク質をコードしている遺伝
暗号の多型ならびに遺伝暗号の縮退を表すものである。
を包含するが、それは本発明の変異又は切断型マウスパーキン２のいずれかと同
一又は相同なアミノ酸配列を有するいずれかのタンパク質をコードしている遺伝
暗号の多型ならびに遺伝暗号の縮退を表すものである。
【００２３】
本願においてマウスパーキン２タンパク質を満たしている“相同なアミノ酸配列
”とは、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％のアミノ
酸が本発明のタンパク質の一つと同一であるアミノ酸配列、置換されたアミノ酸
が好ましくは相同なアミノ酸によって置換されているアミノ酸配列を意味する。
親水性、荷電性、立体的特徴などに関して同様な特徴を有するアミノ酸を“相同
な”アミノ酸と称する。最も好ましくは図１のアラインメントに示されるヒトパ
ーキンタンパク質と比較してマウスアミノ酸配列の種依存的な違いを含むアミノ
酸配列である。エキソン境界を有する対応するポリヌクレオチド配列のアライン
メントが図２−１、図２−２に示される。
”とは、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％のアミノ
酸が本発明のタンパク質の一つと同一であるアミノ酸配列、置換されたアミノ酸
が好ましくは相同なアミノ酸によって置換されているアミノ酸配列を意味する。
親水性、荷電性、立体的特徴などに関して同様な特徴を有するアミノ酸を“相同
な”アミノ酸と称する。最も好ましくは図１のアラインメントに示されるヒトパ
ーキンタンパク質と比較してマウスアミノ酸配列の種依存的な違いを含むアミノ
酸配列である。エキソン境界を有する対応するポリヌクレオチド配列のアライン
メントが図２−１、図２−２に示される。
【００２４】
本願全体においてヌクレオチド及びアミノ酸については当業者に知られる通常の
表記（一文字または三文字コード）を用いる。
表記（一文字または三文字コード）を用いる。
【００２５】
配列番号１の全長ポリヌクレオチド配列又はその断片は、ｍＰａｒｋ２遺伝子の
エキソンとイントロンを含むゲノムＤＮＡの単離によって、ＤＮＡのＲＮＡ転写
物によって、又はｍＰａｒｋ２遺伝子のエキソンのみを含むｃＤＮＡの調製によ
って得ることができる。さらに、全長配列ならびにその断片はヌクレオチドの合
成重合によっても得ることができる。
エキソンとイントロンを含むゲノムＤＮＡの単離によって、ＤＮＡのＲＮＡ転写
物によって、又はｍＰａｒｋ２遺伝子のエキソンのみを含むｃＤＮＡの調製によ
って得ることができる。さらに、全長配列ならびにその断片はヌクレオチドの合
成重合によっても得ることができる。
【００２６】
本願の好ましいポリヌクレチド配列は、配列番号１由来のポリヌクレオチド配列
において変異されているかその配列の一部が欠失している配列である。変異、挿
入又は欠失はオープンリーディングフレームの５’上流（例えばプロモーター領
域内）に位置していてもよく、またはそれらはオープンリーディングフレームの
一以上のエキソンに関係することができる。より好ましくは、（例えば、停止コ
ドンに導く変異による）切断型パーキン２タンパク質又は、（例えば、変異や欠
失がエキソン１のプロモーター領域に位置しているならば）非タンパク質をコー
ドする、配列番号１の変異された全長配列又は断片のいずれかを含む配列である
。
において変異されているかその配列の一部が欠失している配列である。変異、挿
入又は欠失はオープンリーディングフレームの５’上流（例えばプロモーター領
域内）に位置していてもよく、またはそれらはオープンリーディングフレームの
一以上のエキソンに関係することができる。より好ましくは、（例えば、停止コ
ドンに導く変異による）切断型パーキン２タンパク質又は、（例えば、変異や欠
失がエキソン１のプロモーター領域に位置しているならば）非タンパク質をコー
ドする、配列番号１の変異された全長配列又は断片のいずれかを含む配列である
。
【００２７】
より好ましい変異又は欠失はプロモーター領域が含まれているエキソン１か、エ
キソン３及び／又はひとつ以上の他のエキソンに関係している。
キソン３及び／又はひとつ以上の他のエキソンに関係している。
【００２８】
本願の最も好ましいポリヌクレオチド配列は、配列番号２、配列番号３、配列番
号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、
配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配
列番号１８、配列番号１９、又は配列番号２０から選ばれる（表１および２も参
照）。
号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、
配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配
列番号１８、配列番号１９、又は配列番号２０から選ばれる（表１および２も参
照）。
【００２９】
配列番号１から３のポリヌクレオチド配列の一つを、ランダム又は部位特異的突
然変異によって、ランダム又は部位特異的消化によって、組換え又は融合又は当
業者に知られた他の方法によって、in vitro又はin vivoで処理し、低活性の又
は非活性のパーキンタンパク質を導く変異又は欠失を含む配列番号１由来の配列
を得ることができる。本発明がパーキン遺伝子をコードするポリヌクレオチド配
列の一部又は全部が欠失しているか他の配列によって（例えば抗生物質耐性をコ
ードする配列によって）置換されている任意のの構築物を同様に包含することを
当業者なら当然理解するだろう。
然変異によって、ランダム又は部位特異的消化によって、組換え又は融合又は当
業者に知られた他の方法によって、in vitro又はin vivoで処理し、低活性の又
は非活性のパーキンタンパク質を導く変異又は欠失を含む配列番号１由来の配列
を得ることができる。本発明がパーキン遺伝子をコードするポリヌクレオチド配
列の一部又は全部が欠失しているか他の配列によって（例えば抗生物質耐性をコ
ードする配列によって）置換されている任意のの構築物を同様に包含することを
当業者なら当然理解するだろう。
【００３０】
神経変性疾患のためのモデルとして少なくともトランスジェニック非ヒト動物を
得るために、この動物におけるパーキン遺伝子の天然由来の配列をその染色体の
一方又は両方の対立遺伝子上で、本発明の変異又は欠失を含むmPark２の配列に
よって置換すればよい。これらの動物は低活性の又は非パーキンタンパク質のい
ずれかを生産する。
得るために、この動物におけるパーキン遺伝子の天然由来の配列をその染色体の
一方又は両方の対立遺伝子上で、本発明の変異又は欠失を含むmPark２の配列に
よって置換すればよい。これらの動物は低活性の又は非パーキンタンパク質のい
ずれかを生産する。
【００３１】
本発明のトランスジェニック動物は、標的となる遺伝子置換、興味のある特定の
ＤＮＡ配列（標的ＤＮＡ)が代替えＤＮＡ（置換ＤＮＡ)によって置換された配列
を用いて作出される。胚性幹（ＥＳ)細胞のゲノムは相同組換えを用いて改変さ
れる(Capecchi, Science 1989;244:1288及びU.S.Pat.No.5,487,992)。胚性幹細
胞は成長胚の初期段階として胚盤胞にインジェクトされる。その後胚盤胞は偽妊
娠雌動物に移される。
ＤＮＡ配列（標的ＤＮＡ)が代替えＤＮＡ（置換ＤＮＡ)によって置換された配列
を用いて作出される。胚性幹（ＥＳ)細胞のゲノムは相同組換えを用いて改変さ
れる(Capecchi, Science 1989;244:1288及びU.S.Pat.No.5,487,992)。胚性幹細
胞は成長胚の初期段階として胚盤胞にインジェクトされる。その後胚盤胞は偽妊
娠雌動物に移される。
【００３２】
簡単に言うと、置換ＤＮＡを担持するベクターが構築される。置換ＤＮＡの両末
端は標的ＤＮＡに隣接する配列に相同な長いＤＮＡ配列に隣接している。ベクタ
ーをＥＳ細胞に導入すると、相同配列並び換えと組換えが起こる場合がある。こ
の結果、標的ＤＮＡは置換ＤＮＡに置き換わることになる。ベクターは細胞内で
複製されず、失われるだろう。相同組換えの頻度は低い；従って、スクリーニン
グ系が用いられる。置換ＤＮＡはポジティブマーカー配列、通常はネオマイシン
耐性遺伝子を含むだろう。従って、相同組換えによって置換ＤＮＡを包含する任
意の細胞は何れもネオマイシン耐性となるだろう。薬物ネオマイシンを含む培地
で細胞を成長させることによって、置換ＤＮＡを含む細胞のみを選択できる。そ
の後、置換ＤＮＡを含むＥＳ細胞をレシピエントマウスの胚盤胞に挿入してキメ
ラマウスを作出する。置き換えられたＥＳ細胞に由来する生殖細胞を有するキメ
ラは改変されたゲノムをその子孫に伝え、標的ＤＮＡ（一つの標的ＤＮＡと一つ
の置換ＤＮＡを含む）に対してヘテロ接合性であるマウスを生み出す。その後、
置換ＤＮＡに対してホモ接合性であって標的ＤＮＡを欠くマウスを作出するため
に、又はホモ接合性マウスが生きてない場合にはトランスジェニックヘテロ接合
体を維持するためにヘテロ接合体を互いに交配させる。
端は標的ＤＮＡに隣接する配列に相同な長いＤＮＡ配列に隣接している。ベクタ
ーをＥＳ細胞に導入すると、相同配列並び換えと組換えが起こる場合がある。こ
の結果、標的ＤＮＡは置換ＤＮＡに置き換わることになる。ベクターは細胞内で
複製されず、失われるだろう。相同組換えの頻度は低い；従って、スクリーニン
グ系が用いられる。置換ＤＮＡはポジティブマーカー配列、通常はネオマイシン
耐性遺伝子を含むだろう。従って、相同組換えによって置換ＤＮＡを包含する任
意の細胞は何れもネオマイシン耐性となるだろう。薬物ネオマイシンを含む培地
で細胞を成長させることによって、置換ＤＮＡを含む細胞のみを選択できる。そ
の後、置換ＤＮＡを含むＥＳ細胞をレシピエントマウスの胚盤胞に挿入してキメ
ラマウスを作出する。置き換えられたＥＳ細胞に由来する生殖細胞を有するキメ
ラは改変されたゲノムをその子孫に伝え、標的ＤＮＡ（一つの標的ＤＮＡと一つ
の置換ＤＮＡを含む）に対してヘテロ接合性であるマウスを生み出す。その後、
置換ＤＮＡに対してホモ接合性であって標的ＤＮＡを欠くマウスを作出するため
に、又はホモ接合性マウスが生きてない場合にはトランスジェニックヘテロ接合
体を維持するためにヘテロ接合体を互いに交配させる。
【００３３】
ＤＮＡは、機能的タンパク質の発現を抑制するために、天然遺伝子の少なくとも
一つ、通常は両方のコピー中へ欠陥の導入とともに、特定の遺伝子座に該遺伝子
の少なくとも一部を含むだろう。この欠陥は挿入、欠失、置換、又はそれらの組
み合わせであってよい。欠陥を不活性化されている遺伝子のひとつのコピーにの
み導入する場合、標的遺伝子の単一の非変異コピーを有する（ヘテロ接合性）細
胞が増幅され、第二の形質転換に供することができる。そこでその欠陥は最初の
欠陥と同じであるか又は異なっており、通常は異なっており、そして欠失又は置
換が包含される場合はもともと導入した欠陥の少なくとも一部とオーバーラップ
していてもよい。得られた形質転換体は所望の機能性タンパク質の存在に対して
スクリーニングされ、細胞のＤＮＡはさらに野生型標的遺伝子の存在を確かめる
ためにさらにスクリーニングされる。あるいは、表現型についてホモ接合性は変
異に対してヘテロ接合性な宿主を繁殖させることによって達成することができる
。
一つ、通常は両方のコピー中へ欠陥の導入とともに、特定の遺伝子座に該遺伝子
の少なくとも一部を含むだろう。この欠陥は挿入、欠失、置換、又はそれらの組
み合わせであってよい。欠陥を不活性化されている遺伝子のひとつのコピーにの
み導入する場合、標的遺伝子の単一の非変異コピーを有する（ヘテロ接合性）細
胞が増幅され、第二の形質転換に供することができる。そこでその欠陥は最初の
欠陥と同じであるか又は異なっており、通常は異なっており、そして欠失又は置
換が包含される場合はもともと導入した欠陥の少なくとも一部とオーバーラップ
していてもよい。得られた形質転換体は所望の機能性タンパク質の存在に対して
スクリーニングされ、細胞のＤＮＡはさらに野生型標的遺伝子の存在を確かめる
ためにさらにスクリーニングされる。あるいは、表現型についてホモ接合性は変
異に対してヘテロ接合性な宿主を繁殖させることによって達成することができる
。
【００３４】
本願によるトランスジェニック動物モデルの構築のためには、任意の適切な動物
を用いることができるが、哺乳類が好ましい。より好ましくは齧歯動物であり、
最も好ましくはラット及びマウスである。
を用いることができるが、哺乳類が好ましい。より好ましくは齧歯動物であり、
最も好ましくはラット及びマウスである。
【００３５】
以下に前記動物モデルを作出する一つの工程を詳細に述べる。
【００３６】
まず、パーキン遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列から、好ましくはｍＰ
ａｒｋ２遺伝子をコードする配列から、より好ましくは配列番号１から３のいず
れかに記載の配列から、最も好ましくは所望の変異、挿入、又は欠失をその配列
に導入した配列番号１に記載の配列から始める。ランダム又は部位特異的突然変
異によって変異をつくるための、あるいはランダム又は部位特異的消化及び／又
は置換によって所望の挿入又は欠失をつくるための方法は、当業者に一般的に知
られており、文献に広く記載されている。変異、挿入又は置換を配列に導入する
ための方法は関係はないが、後述するヌクレオチド、アミノ酸又は配列が包含さ
れる限り、本発明の範囲内にある。
ａｒｋ２遺伝子をコードする配列から、より好ましくは配列番号１から３のいず
れかに記載の配列から、最も好ましくは所望の変異、挿入、又は欠失をその配列
に導入した配列番号１に記載の配列から始める。ランダム又は部位特異的突然変
異によって変異をつくるための、あるいはランダム又は部位特異的消化及び／又
は置換によって所望の挿入又は欠失をつくるための方法は、当業者に一般的に知
られており、文献に広く記載されている。変異、挿入又は置換を配列に導入する
ための方法は関係はないが、後述するヌクレオチド、アミノ酸又は配列が包含さ
れる限り、本発明の範囲内にある。
【００３７】
前記構築物の調製、増幅、宿主細胞の形質転換、及び該構築物の宿主細胞への組
み込みに用途を見出しうる変異配列以外の機能的エンティティ（entity)を含む
ように該構築物を改変してもよい。
み込みに用途を見出しうる変異配列以外の機能的エンティティ（entity)を含む
ように該構築物を改変してもよい。
【００３８】
前記構築物をターゲッティングするための相同配列は一又はそれ以上の欠失、挿
入、置換またはそれらの組み合わせを有してもよい。例えば、ｍＰａｒｋ２遺伝
子は、一つの部位に欠失、そして別の部位に選択に用いることのできる遺伝子を
含む挿入を含んでもよく、その挿入遺伝子の存在は結果的に欠陥のある不活性な
タンパク質産物をもたらすだろう。好ましくは、置換が用いられる。特に望まし
い挿入遺伝子としては、マーカー、例えばＧ４１８耐性を含むネオマイシン耐性
のような抗生物質耐性を付与する遺伝子である。
入、置換またはそれらの組み合わせを有してもよい。例えば、ｍＰａｒｋ２遺伝
子は、一つの部位に欠失、そして別の部位に選択に用いることのできる遺伝子を
含む挿入を含んでもよく、その挿入遺伝子の存在は結果的に欠陥のある不活性な
タンパク質産物をもたらすだろう。好ましくは、置換が用いられる。特に望まし
い挿入遺伝子としては、マーカー、例えばＧ４１８耐性を含むネオマイシン耐性
のような抗生物質耐性を付与する遺伝子である。
【００３９】
欠失は少なくとも約５０ｂｐ、より通常は少なくとも約１００ｂｐであって、一
般的には２０ｋｂｓを超えず、その欠失は、通常は少なくとも一又はそれ以上の
エキソン部分を含むコード領域の部分、一又はそれ以上のイントロン部分を含み
、そして隣接する非コード領域の部分、特には５’−非コード領域（転写制御領
域）は含んでいても含んでいなくてもよい。従って、相同領域は５’−非コード
領域又は代りに３’−非−コード領域へコード領域を越えて伸びてもよい。挿入
は一般的には１０ｋｂｐを超えず、通常は５ｋｂｐを超えず、一般的には少なく
とも５０ｂｐであり、より通常は少なくとも２００ｂｐである。
般的には２０ｋｂｓを超えず、その欠失は、通常は少なくとも一又はそれ以上の
エキソン部分を含むコード領域の部分、一又はそれ以上のイントロン部分を含み
、そして隣接する非コード領域の部分、特には５’−非コード領域（転写制御領
域）は含んでいても含んでいなくてもよい。従って、相同領域は５’−非コード
領域又は代りに３’−非−コード領域へコード領域を越えて伸びてもよい。挿入
は一般的には１０ｋｂｐを超えず、通常は５ｋｂｐを超えず、一般的には少なく
とも５０ｂｐであり、より通常は少なくとも２００ｂｐである。
【００４０】
相同配列は標的配列の少なくとも約１００ｂｐ、好ましくは少なくとも約１５０
ｂｐ、より好ましくは少なくとも約３００ｂｐを含むべきであり、そして一般的
には２０ｋｂｓを超えず、通常は１０ｋｂｓを超えず、好ましくは全部で約５ｋ
ｂｓ以下であって、通常は二重クロスオーバー組換えに供するために挿入及び／
又は欠失の反対の部位に少なくとも約５０ｂｐを有する。
ｂｐ、より好ましくは少なくとも約３００ｂｐを含むべきであり、そして一般的
には２０ｋｂｓを超えず、通常は１０ｋｂｓを超えず、好ましくは全部で約５ｋ
ｂｓ以下であって、通常は二重クロスオーバー組換えに供するために挿入及び／
又は欠失の反対の部位に少なくとも約５０ｂｐを有する。
【００４１】
標的遺伝子構築物から上流及び／又は下流にゲノム中の構築物の初代ランダム組
み込みを選択するためのツールを提供する遺伝子が存在してもよい。この目的の
ために、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子を用いることができる。
その理由はチミジンキナーゼ遺伝子の存在がガンシクロビル又はアシクロビルの
ようなヌクレオシドアナログの使用によって機能的ＨＳＶ−ｔ遺伝子を含む細胞
に対するそれらの細胞毒性効果を検出することができるからである。これらのヌ
クレオシドアナログに対して感受性が存在しないことは相同組換えが起こったこ
とを示す。
み込みを選択するためのツールを提供する遺伝子が存在してもよい。この目的の
ために、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子を用いることができる。
その理由はチミジンキナーゼ遺伝子の存在がガンシクロビル又はアシクロビルの
ようなヌクレオシドアナログの使用によって機能的ＨＳＶ−ｔ遺伝子を含む細胞
に対するそれらの細胞毒性効果を検出することができるからである。これらのヌ
クレオシドアナログに対して感受性が存在しないことは相同組換えが起こったこ
とを示す。
【００４２】
所望の遺伝子に挿入されるマーカー遺伝子の存在により宿主ゲノムへの標的構築
物の組み込みが確立する。
物の組み込みが確立する。
【００４３】
しかしながら、ＤＮＡ分析が相同組換え又は非相同組換えが起こったかどうかを
確立するために必要である。これは、挿入物に対するプローブを用い、構築物の
隣接領域を越えて伸びる所望の遺伝子の存在のために挿入物に隣接する５’及び
３’領域を配列決定することによって、又はそのような欠失が導入されたとき欠
失の存在を確認することによって決定することができる。
確立するために必要である。これは、挿入物に対するプローブを用い、構築物の
隣接領域を越えて伸びる所望の遺伝子の存在のために挿入物に隣接する５’及び
３’領域を配列決定することによって、又はそのような欠失が導入されたとき欠
失の存在を確認することによって決定することができる。
【００４４】
相同組換えの存在を検出することにおける利点を有するポリメラーゼ連鎖反応（
ＰＣＲ)を行うことができる（Kim and Smithies, (1988) Nucleic Acids Res. 1
6:8887-8903;及びJoyer et al (1989) Nature 338:153-156)。構築物内にある配
列に相補的な、通常は選択マーカー遺伝子に相補的であって、かつ標的遺伝子座
にある構築物の外側の配列に相補的なプライマーを用いることができる。これに
より、相同組換えが起こった相補鎖に存在するプライマーの両方を有するＤＮＡ
二重らせんのみを得ることができる。プライマー配列または予想されるサイズの
配列の存在を確認することによって、相同組換えが起こったことが裏付けられる
。適切なＰＣＲプライマー及び条件を決定する方法は当業者に公知である。
ＰＣＲ)を行うことができる（Kim and Smithies, (1988) Nucleic Acids Res. 1
6:8887-8903;及びJoyer et al (1989) Nature 338:153-156)。構築物内にある配
列に相補的な、通常は選択マーカー遺伝子に相補的であって、かつ標的遺伝子座
にある構築物の外側の配列に相補的なプライマーを用いることができる。これに
より、相同組換えが起こった相補鎖に存在するプライマーの両方を有するＤＮＡ
二重らせんのみを得ることができる。プライマー配列または予想されるサイズの
配列の存在を確認することによって、相同組換えが起こったことが裏付けられる
。適切なＰＣＲプライマー及び条件を決定する方法は当業者に公知である。
【００４５】
前記構築物はさらに哺乳類宿主細胞において機能的である複製系を含んでいても
よい。ほとんどの場合、これらの複製系はシミアンウイルス４0（Simian Virus
40）、エプスタイン−バーウイルス（Epstein−Barr virus）、パピローマウイ
ルス、アデノウイルスなどのような細菌性複製系を含むだろう。
よい。ほとんどの場合、これらの複製系はシミアンウイルス４0（Simian Virus
40）、エプスタイン−バーウイルス（Epstein−Barr virus）、パピローマウイ
ルス、アデノウイルスなどのような細菌性複製系を含むだろう。
【００４６】
マーカー遺伝子が挿入物として、及び／又は隣接する遺伝子として遺伝子の本質
に応じて包含される場合、それは野生型の転写制御領域、特には転写開始制御領
域又は異なる転写開始領域を有してもよい。転写開始領域が哺乳類宿主細胞の転
写機構によって認識されない宿主由来の遺伝子である場合に、異なる転写開始領
域が必要となるであろう。この領域は構築性であっても誘導性であってもよく、
好ましくは誘導性である。種々の転写開始領域が単離され、異なる遺伝子ととも
に用いられている。プロモーターとして特に興味のあるものは、哺乳類宿主のメ
タロチオネイン−Ｉ及び−ＩＩのプロモーター、チミジンキナーゼ、ベータ−ア
クチン、免疫グロブリンプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター
、及びＳＶ４０プロモーターである。プロモーターに加え、野生型エンハンサー
が存在してもよく、異なる遺伝子由来のエンハンサーがプロモーター領域に結合
していてもよい。
に応じて包含される場合、それは野生型の転写制御領域、特には転写開始制御領
域又は異なる転写開始領域を有してもよい。転写開始領域が哺乳類宿主細胞の転
写機構によって認識されない宿主由来の遺伝子である場合に、異なる転写開始領
域が必要となるであろう。この領域は構築性であっても誘導性であってもよく、
好ましくは誘導性である。種々の転写開始領域が単離され、異なる遺伝子ととも
に用いられている。プロモーターとして特に興味のあるものは、哺乳類宿主のメ
タロチオネイン−Ｉ及び−ＩＩのプロモーター、チミジンキナーゼ、ベータ−ア
クチン、免疫グロブリンプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター
、及びＳＶ４０プロモーターである。プロモーターに加え、野生型エンハンサー
が存在してもよく、異なる遺伝子由来のエンハンサーがプロモーター領域に結合
していてもよい。
【００４７】
前記構築物を調製し、各操作後にクローニングし、制限マッピング又は配列決定
のような分析をすることに使用するため、該構築物は原核細胞、特には大腸菌の
ための複製系をさらに含んでもよく、続いてクローンの増幅と次の操作のために
プラスミドの分離を行う。必要ならば、異なるマーカーを細菌性形質転換体を検
出するために用いてもよい。
のような分析をすることに使用するため、該構築物は原核細胞、特には大腸菌の
ための複製系をさらに含んでもよく、続いてクローンの増幅と次の操作のために
プラスミドの分離を行う。必要ならば、異なるマーカーを細菌性形質転換体を検
出するために用いてもよい。
【００４８】
ベクターを一度調製したら、さらに細菌性配列の欠失ならびに直線化によって操
作してもよい。その場合、一般的には約５００ｂｐを超えない、一般的には５０
ｂｐから３００ｂｐの短い欠失を相同配列内に提供してもよい。小さい欠失は一
般的には標的構造遺伝子の一方又は他方の末端近くに存在するだろう。
作してもよい。その場合、一般的には約５００ｂｐを超えない、一般的には５０
ｂｐから３００ｂｐの短い欠失を相同配列内に提供してもよい。小さい欠失は一
般的には標的構造遺伝子の一方又は他方の末端近くに存在するだろう。
【００４９】
所望のポリヌクレオチド配列の構築はクローニングベクター内で行い、ＥＳ細胞
の形質移入の前に直線化すればよい。広範囲のクローニングベクターならびに相
同組換えのためのベクターが市販されており、所望の構築にしたがって選択する
ことができる。
の形質移入の前に直線化すればよい。広範囲のクローニングベクターならびに相
同組換えのためのベクターが市販されており、所望の構築にしたがって選択する
ことができる。
【００５０】
クローニングベクターは通常は原核細胞内で複製され、それにより所望の構築物
の選択と増殖が可能になる。どの原核細胞を用いるかは重要ではないが、通常は
大腸菌又は酵母株が好ましい。
の選択と増殖が可能になる。どの原核細胞を用いるかは重要ではないが、通常は
大腸菌又は酵母株が好ましい。
【００５１】
大腸菌は本発明のＤＮＡ配列をクローニングするために特に有用な一つの原核細
胞宿主である。使用に適した他の微生物宿主はバチルス サブティルス（Bacill
us subtilus）のようなバチルス菌、サルモネラ、セラチアのようなエンテロバ
クター菌、及び種々のシュードモナス種が含まれる。これらの原核細胞宿主にお
いては、発現ベクターを作成することもでき、それは典型的には宿主細胞に適合
した発現制御配列（例えば複製起点）を含むだろう。さらに、ラクトースプロモ
ーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモ
ーター系、又はファージラムダ由来のプロモーター系などの周知の種々のプロモ
ーターが存在するだろう。プロモーターは場合によってはオペレーター配列と一
緒に典型的には発現を制御し、転写開始及び終結ならびに翻訳のためにリボソー
ム結合部位などを有するだろう。
胞宿主である。使用に適した他の微生物宿主はバチルス サブティルス（Bacill
us subtilus）のようなバチルス菌、サルモネラ、セラチアのようなエンテロバ
クター菌、及び種々のシュードモナス種が含まれる。これらの原核細胞宿主にお
いては、発現ベクターを作成することもでき、それは典型的には宿主細胞に適合
した発現制御配列（例えば複製起点）を含むだろう。さらに、ラクトースプロモ
ーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモ
ーター系、又はファージラムダ由来のプロモーター系などの周知の種々のプロモ
ーターが存在するだろう。プロモーターは場合によってはオペレーター配列と一
緒に典型的には発現を制御し、転写開始及び終結ならびに翻訳のためにリボソー
ム結合部位などを有するだろう。
【００５２】
酵母のような他の微生物もまた発現のために用いることができる。サッカロマイ
セスは３−ホスホグリセレートキナーゼ又は他の解糖酵素を含むプロモーターの
ような発現制御配列、複製起点、所望により終結配列などを有する好適なベクタ
ーを備えた好ましい宿主である。
セスは３−ホスホグリセレートキナーゼ又は他の解糖酵素を含むプロモーターの
ような発現制御配列、複製起点、所望により終結配列などを有する好適なベクタ
ーを備えた好ましい宿主である。
【００５３】
相同組換えを用いて変異配列を特定部位、例えば宿主パーキン遺伝子座において
宿主ゲノムへ挿入することができる。あるタイプの相同組換えでは、一又はそれ
以上の宿主配列が置換される；たとえば、宿主パーキン対立遺伝子（又はその部
分）が変異パーキン対立遺伝子（又はその部分）で置換される。そのような遺伝
子置換方法の他にも、相同組換えを用いて変異パーキン対立遺伝子を宿主パーキ
ン遺伝子座以外の特定の部位に標的化させることができる。相同組換えを用いて
、変異パーキン対立遺伝子を含有するトランスジェニック非ヒト動物及び／又は
細胞を生産することができる。
宿主ゲノムへ挿入することができる。あるタイプの相同組換えでは、一又はそれ
以上の宿主配列が置換される；たとえば、宿主パーキン対立遺伝子（又はその部
分）が変異パーキン対立遺伝子（又はその部分）で置換される。そのような遺伝
子置換方法の他にも、相同組換えを用いて変異パーキン対立遺伝子を宿主パーキ
ン遺伝子座以外の特定の部位に標的化させることができる。相同組換えを用いて
、変異パーキン対立遺伝子を含有するトランスジェニック非ヒト動物及び／又は
細胞を生産することができる。
【００５４】
上記技術に加え、処理された配列を発現する工程を最後に挿入することができる
。そのためには、該構築物を任意の発現ベクターに（サブ）クローニングし、こ
れを適当な真核細胞に導入すればよい。これらの発現ベクターは典型的にはエピ
ソームとして又は宿主染色体ＤＮＡの組み込み部分として宿主生物において複製
可能である。一般的に、発現ベクターは選択マーカー、例えば所望のＤＮＡ配列
で形質転換された細胞の検出及び／又は選択を可能にするテトラサイクリン耐性
又はハイグロマシン耐性のような選択マーカーを含む。変異パーキン２ポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドはコードされたポリペプチド産物を生産する
ように該コーディング配列の転写（発現配列）および翻訳を容易にする配列を含
んでもよい。そのようなポリヌクレオチドの構築は当分野において周知であり、
Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. (1989),
Cold Spring Harbor, N.Y.に記述されている。例えば、そのようなポリペプチ
ドはプロモーター、転写終結部位（真核生物発現宿主におけるポリアデニ化部位
）、リボソーム結合部位、及び所望により真核生物発現宿主で使用するためのエ
ンハンサー、及び所望によりベクターの複製のために必要な配列を含むことがで
きるが、これらに限定はされない。
。そのためには、該構築物を任意の発現ベクターに（サブ）クローニングし、こ
れを適当な真核細胞に導入すればよい。これらの発現ベクターは典型的にはエピ
ソームとして又は宿主染色体ＤＮＡの組み込み部分として宿主生物において複製
可能である。一般的に、発現ベクターは選択マーカー、例えば所望のＤＮＡ配列
で形質転換された細胞の検出及び／又は選択を可能にするテトラサイクリン耐性
又はハイグロマシン耐性のような選択マーカーを含む。変異パーキン２ポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドはコードされたポリペプチド産物を生産する
ように該コーディング配列の転写（発現配列）および翻訳を容易にする配列を含
んでもよい。そのようなポリヌクレオチドの構築は当分野において周知であり、
Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. (1989),
Cold Spring Harbor, N.Y.に記述されている。例えば、そのようなポリペプチ
ドはプロモーター、転写終結部位（真核生物発現宿主におけるポリアデニ化部位
）、リボソーム結合部位、及び所望により真核生物発現宿主で使用するためのエ
ンハンサー、及び所望によりベクターの複製のために必要な配列を含むことがで
きるが、これらに限定はされない。
【００５５】
適当な真核細胞を用いることができるが、初代細胞又は不死化細胞系として昆虫
細胞又は哺乳類細胞が好ましい。
細胞又は哺乳類細胞が好ましい。
【００５６】
完全なヒトタンパク質を分泌できる多くの適当な宿主細胞系が当分野で開発され
ており、ＣＨＯ細胞系、種々のＣＯＳ細胞系、ＨｅＬａ細胞、ミエローマ細胞系
、Jurkat細胞等が挙げられる。バキュロウイルス発現系は真核細胞における異種
遺伝子の高レベル発現のために有用である（Knops et al. (1991) J, Biol. Che
m. 266(11): 7285）。これらの細胞のための発現ベクターは複製起点、プロモー
ター、エンハンサーなどの発現制御配列を含むことができ（Queen et al. (1986
) Immunol. Rev. 89:49）、そして必要によりリボソーム結合部位、ＲＮＡスプ
ライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列などのプロセシング情報部
位を含むことができる。好ましい発現制御配列は免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４
０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスなどに由来するプロモーターであ
る。所望のＤＮＡセグメントを含むベクターを宿主細胞のタイプに応じて異なる
周知の方法によって宿主に導入することができる。例えば、塩化カルシウム法は
一般に原核細胞に用いられるのに対し、リン酸カルシウム法、核へのＤＮＡのマ
イクロインジェクション、又はエレクトロポレーションは他の細胞宿主に用いら
れる（一般的にはManiatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
2nd Ed. Cold Spring Harbor Press. (1989)を参照)。ＤＮＡは一本鎖又は二本
鎖、直鎖状又は環状、弛緩又は超らせんＤＮＡの何れでもよい。哺乳類細胞を形
質転換するための種々の技術については、Methods in Enzymology (1990) 185:5
27-537を参照。
ており、ＣＨＯ細胞系、種々のＣＯＳ細胞系、ＨｅＬａ細胞、ミエローマ細胞系
、Jurkat細胞等が挙げられる。バキュロウイルス発現系は真核細胞における異種
遺伝子の高レベル発現のために有用である（Knops et al. (1991) J, Biol. Che
m. 266(11): 7285）。これらの細胞のための発現ベクターは複製起点、プロモー
ター、エンハンサーなどの発現制御配列を含むことができ（Queen et al. (1986
) Immunol. Rev. 89:49）、そして必要によりリボソーム結合部位、ＲＮＡスプ
ライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列などのプロセシング情報部
位を含むことができる。好ましい発現制御配列は免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４
０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスなどに由来するプロモーターであ
る。所望のＤＮＡセグメントを含むベクターを宿主細胞のタイプに応じて異なる
周知の方法によって宿主に導入することができる。例えば、塩化カルシウム法は
一般に原核細胞に用いられるのに対し、リン酸カルシウム法、核へのＤＮＡのマ
イクロインジェクション、又はエレクトロポレーションは他の細胞宿主に用いら
れる（一般的にはManiatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
2nd Ed. Cold Spring Harbor Press. (1989)を参照)。ＤＮＡは一本鎖又は二本
鎖、直鎖状又は環状、弛緩又は超らせんＤＮＡの何れでもよい。哺乳類細胞を形
質転換するための種々の技術については、Methods in Enzymology (1990) 185:5
27-537を参照。
【００５７】
本発明の動物モデル作出のためには、対応するヒト配列に生じるとき、ヒトにお
いてパーキンソン病の原因となることが知られている変異、挿入又は欠失を含む
各ポリヌクレオチド配列を用いることができる。本発明の動物モデル作出のため
の好ましいポリヌクレチド配列はその変異が表２に示される配列である。より好
ましくは表１に示される変異又は欠失を含むポリヌクレオチド配列である。本発
明のトランスジェニック動物の構築のために最も好ましいポリヌクレオチド配列
は配列番号７である。さらに、パーキン配列が他の哺乳類の対応する配列によっ
て（例えば、本願に記載される変異、挿入、又は欠失のうちの一つを含むヒト配
列によって）、又はマーカー、例えば抗生物質をコードする配列によって置換さ
れている動物モデルも本発明に包含される。
いてパーキンソン病の原因となることが知られている変異、挿入又は欠失を含む
各ポリヌクレオチド配列を用いることができる。本発明の動物モデル作出のため
の好ましいポリヌクレチド配列はその変異が表２に示される配列である。より好
ましくは表１に示される変異又は欠失を含むポリヌクレオチド配列である。本発
明のトランスジェニック動物の構築のために最も好ましいポリヌクレオチド配列
は配列番号７である。さらに、パーキン配列が他の哺乳類の対応する配列によっ
て（例えば、本願に記載される変異、挿入、又は欠失のうちの一つを含むヒト配
列によって）、又はマーカー、例えば抗生物質をコードする配列によって置換さ
れている動物モデルも本発明に包含される。
【００５８】
【表１】
【００５９】
【表２】
【００６０】
構築物を一度調製し、操作したら、ＤＮＡを当分野で公知の任意の方法によって
原核生物宿主から単離する。ＤＮＡ構築物を相同組換えのために標的細胞に導入
する前に、所望しない配列、例えば所望しない細菌性配列をベクターから除去し
てもよい。標的細胞として胚性幹（ＥＳ）細胞系を用いてもよい。発現系につい
て既に示したように、ＤＮＡを標的細胞に導入するための任意の簡便な技法が用
いることができる。標的細胞の形質転換後、多くの標的細胞が既に示したように
陽性及び／又は陰性マーカー、ネオマイシン耐性及びアシクロビル又はガンシク
ロビル耐性によって選択される。所望の表現型を示す細胞を制限酵素分析、電気
泳動、サザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応などによってさらに分析することがで
きる。標的遺伝子部位に欠陥の存在を示す断片を同定することによって、相同組
換えが起こった細胞を同定し、標的遺伝子を不活性化することができる。
原核生物宿主から単離する。ＤＮＡ構築物を相同組換えのために標的細胞に導入
する前に、所望しない配列、例えば所望しない細菌性配列をベクターから除去し
てもよい。標的細胞として胚性幹（ＥＳ）細胞系を用いてもよい。発現系につい
て既に示したように、ＤＮＡを標的細胞に導入するための任意の簡便な技法が用
いることができる。標的細胞の形質転換後、多くの標的細胞が既に示したように
陽性及び／又は陰性マーカー、ネオマイシン耐性及びアシクロビル又はガンシク
ロビル耐性によって選択される。所望の表現型を示す細胞を制限酵素分析、電気
泳動、サザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応などによってさらに分析することがで
きる。標的遺伝子部位に欠陥の存在を示す断片を同定することによって、相同組
換えが起こった細胞を同定し、標的遺伝子を不活性化することができる。
【００６１】
変異後、胚性幹細胞については、該細胞を適当な培地、例えば胎児ウシ血清を補
充したＤＥＭＥ中フィーダー層に植え付ける。構築物を含む細胞は選択培地を用
いて検出することができ、コロニーが成長するまで十分な時間後にコロニーを拾
い、相同組換えの発生を分析することができる。上述したように、標的遺伝子座
であるが、構築物の範囲内又は範囲外にあるプライマーでポリメラーゼ連鎖反応
を用いることができる。相同組換えを示すそれらのコロニーは胚盤胞インジェク
ションによる胚操作のために用いることができる。胚盤胞は４から６週齢の過排
卵した雌から排卵３．５日後に子宮を洗い流すことによって得ることができる。
胚性幹細胞はその後トリプシン化され、改変された細胞は胚盤胞を含む液滴に添
加する。少なくとも１個、通常は少なくとも約１０個、そして約１５個までの改
変された胚性幹細胞を胚盤胞の胞胚腔にインジェクトすればよい。インジェクシ
ョン後、少なくとも約１個の、そして約１５個は超えない胚盤胞が偽妊娠メスの
子宮角に戻される。あるいは、例えば変異遺伝子又はその断片の１−細胞胚への
マイクロインジェクション、その後継母内でのインキュベーションというような
一般的な技法のいずれかを用いることができる。
充したＤＥＭＥ中フィーダー層に植え付ける。構築物を含む細胞は選択培地を用
いて検出することができ、コロニーが成長するまで十分な時間後にコロニーを拾
い、相同組換えの発生を分析することができる。上述したように、標的遺伝子座
であるが、構築物の範囲内又は範囲外にあるプライマーでポリメラーゼ連鎖反応
を用いることができる。相同組換えを示すそれらのコロニーは胚盤胞インジェク
ションによる胚操作のために用いることができる。胚盤胞は４から６週齢の過排
卵した雌から排卵３．５日後に子宮を洗い流すことによって得ることができる。
胚性幹細胞はその後トリプシン化され、改変された細胞は胚盤胞を含む液滴に添
加する。少なくとも１個、通常は少なくとも約１０個、そして約１５個までの改
変された胚性幹細胞を胚盤胞の胞胚腔にインジェクトすればよい。インジェクシ
ョン後、少なくとも約１個の、そして約１５個は超えない胚盤胞が偽妊娠メスの
子宮角に戻される。あるいは、例えば変異遺伝子又はその断片の１−細胞胚への
マイクロインジェクション、その後継母内でのインキュベーションというような
一般的な技法のいずれかを用いることができる。
【００６２】
子は通常胚盤胞の継母への導入後16-18日で生まれるだろう。キメラ動物はヘテ
ロ接合性トランスジーンを作るために野生型（wt）マウスと交配するだろう。
ロ接合性トランスジーンを作るために野生型（wt）マウスと交配するだろう。
【００６３】
これらの方法を用いて、改変された活性、好ましくは低活性のパーキンタンパク
質、又は非活性のパーキンタンパク質が発現されるようにパーキン遺伝子をコー
ドする遺伝子の一方又は両方の対立遺伝子が変異されているトランスジェニック
非ヒト動物を得ることが可能である、
質、又は非活性のパーキンタンパク質が発現されるようにパーキン遺伝子をコー
ドする遺伝子の一方又は両方の対立遺伝子が変異されているトランスジェニック
非ヒト動物を得ることが可能である、
【００６４】
本明細書において“変異された”とはヌクレオチド又はポリヌクレオチド配列の
置換、挿入又は欠失を意味する。
置換、挿入又は欠失を意味する。
【００６５】
変異されたパーキン遺伝子の結果、これらの動物は変異された又は切断されたパ
ーキンタンパク質又は非パーキンタンパク質を生産する。好ましくは、−パーキ
ンタンパク質が発現される場合−トランスジェニック動物によって発現されるパ
ーキンタンパク質は、配列番号５、配列番号６、配列番号２１、配列番号２２、
配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配
列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列
番号３３、配列番号３４のアミノ酸配列を有するタンパク質のいずれかによって
表される表１及び表２に示される変異又は欠失のいずれか、又はそれらと相同な
タンパク質又は断片を有する天然由来の若しくは人工的に導入された変異のいず
れかを含んでおり、特に好ましくは配列番号２１の配列を有するパーキンタンパ
ク質が発現される。
ーキンタンパク質又は非パーキンタンパク質を生産する。好ましくは、−パーキ
ンタンパク質が発現される場合−トランスジェニック動物によって発現されるパ
ーキンタンパク質は、配列番号５、配列番号６、配列番号２１、配列番号２２、
配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配
列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列
番号３３、配列番号３４のアミノ酸配列を有するタンパク質のいずれかによって
表される表１及び表２に示される変異又は欠失のいずれか、又はそれらと相同な
タンパク質又は断片を有する天然由来の若しくは人工的に導入された変異のいず
れかを含んでおり、特に好ましくは配列番号２１の配列を有するパーキンタンパ
ク質が発現される。
【００６６】
トランスジェニック非ヒト動物においてこれらのタンパク質の一つ又は非タンパ
ク質を発現させると、これらの動物は神経変性疾患の特徴を示すようになる。こ
れらの特徴は、生理学的、生物化学的又は分子生物学的改変を、例えば、細胞、
組織、器官又は神経構造において発生させることによって現れうる。
ク質を発現させると、これらの動物は神経変性疾患の特徴を示すようになる。こ
れらの特徴は、生理学的、生物化学的又は分子生物学的改変を、例えば、細胞、
組織、器官又は神経構造において発生させることによって現れうる。
【００６７】
標準的なプロトコルに従い、初代培養か不死化細胞系の任意の培養真核細胞は、
培養された真核細胞が変異パーキン２ポリペプチドを発現するように変異又は断
片化したmPark2遺伝子座で一時的にまたは安定的に形質移入されることができる
。
培養された真核細胞が変異パーキン２ポリペプチドを発現するように変異又は断
片化したmPark2遺伝子座で一時的にまたは安定的に形質移入されることができる
。
【００６８】
本発明はさらに本発明のＤＮＡ配列のいずれかで形質転換又は形質移入された細
胞、典型的には哺乳類細胞、及び好ましくは哺乳類の神経細胞、膠細胞、又はア
ストロサイト系列細胞、ならびにトランスジェニック非ヒト動物由来の任意の細
胞に関するものである。それらの細胞は本発明の変異パーキン２タンパク質のい
ずれか、好ましくは表１又は２に示されるアイソフォーム又はそれらの断片を発
現するか、パーキンタンパク質を発現しないように変異されたパーキン配列を含
む。トランスジェニック動物由来の細胞は細胞系列として又は初代培養物として
培養することができる。
胞、典型的には哺乳類細胞、及び好ましくは哺乳類の神経細胞、膠細胞、又はア
ストロサイト系列細胞、ならびにトランスジェニック非ヒト動物由来の任意の細
胞に関するものである。それらの細胞は本発明の変異パーキン２タンパク質のい
ずれか、好ましくは表１又は２に示されるアイソフォーム又はそれらの断片を発
現するか、パーキンタンパク質を発現しないように変異されたパーキン配列を含
む。トランスジェニック動物由来の細胞は細胞系列として又は初代培養物として
培養することができる。
【００６９】
いったん確立されると、全てのそのような細胞系は培養液内で継続して成長する
ことができ、パーキン発現及びプロセシングを研究するために種々のin vitro実
験のために用いることができる。
ことができ、パーキン発現及びプロセシングを研究するために種々のin vitro実
験のために用いることができる。
【００７０】
本発明はさらに、好ましくは表１又は表２に示されるような本発明の任意の変異
マウスパーキン２タンパク質アイソフォームのいずれか、又はそれらの天然由来
の若しくは人工的に誘導された変異体又はそれらの断片をコードする任意のポリ
ヌクレオチド配列を含むトランスジェニック非ヒト動物又は形質転換細胞を生産
する方法に関する。
マウスパーキン２タンパク質アイソフォームのいずれか、又はそれらの天然由来
の若しくは人工的に誘導された変異体又はそれらの断片をコードする任意のポリ
ヌクレオチド配列を含むトランスジェニック非ヒト動物又は形質転換細胞を生産
する方法に関する。
【００７１】
好ましい上記のポリヌクレオチド配列、そのタンパク質及びアミノ酸配列ならび
にトランスジェニック動物モデルおよび細胞系は神経変性疾患の症状を分析する
ための任意の方法に用いることができる。
にトランスジェニック動物モデルおよび細胞系は神経変性疾患の症状を分析する
ための任意の方法に用いることができる。
【００７２】
そのような神経変性疾患にはとりわけパーキンソン病、アルツハイマー病、ハン
チントン病、筋萎縮性側索硬化症、多系統萎縮症、ウィルソン病、ピック病、プ
リオン病、又は毒素（例えばマンガン、鉄、６−ヒドロキシドーパミン、ＭＰＴ
Ｐ（１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン）、一
酸化炭素、薬物、脳腫瘍、頭部外傷、発作、血管異常、代謝異常のようなパーキ
ンソン症候群を誘発する二次性病因を包含する。
チントン病、筋萎縮性側索硬化症、多系統萎縮症、ウィルソン病、ピック病、プ
リオン病、又は毒素（例えばマンガン、鉄、６−ヒドロキシドーパミン、ＭＰＴ
Ｐ（１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン）、一
酸化炭素、薬物、脳腫瘍、頭部外傷、発作、血管異常、代謝異常のようなパーキ
ンソン症候群を誘発する二次性病因を包含する。
【００７３】
これらの方法には生体外の方法が含まれ、それらはＰＣＲ、サザン及びノーザン
ブロット分析、ＤＮＡ又はＲＮＡプローブ、ならびにウェスタンブロット分析、
本願で述べられたタンパク又はアミノ酸配列由来のエピトープの調製、モノクロ
ーナル及びポリクローナル抗体の生産の方法である。これらの方法は試料、好ま
しくは生体液のパーキンタンパク質の存在を検出するための方法として該タンパ
ク質の発現か、あるいはパーキンをコードする遺伝子配列における遺伝子的変化
を同定することを含む対象から採取した核酸試料または他の試料中のパーキンソ
ン病に対する遺伝子の存在のいずれかをスクリーニングするのに用いることがで
きる。さらに、動物を犠牲にした後、神経変性疾患、特にパーキンソン病の生体
に対する影響を検討するために実施される病理生物化学的、免疫生物学的、神経
学的、ならびに組織化学的方法が含まれる。パーキンソン病と関連する遺伝的変
異の存在を位置付けるためのさらなる方法が提供される。これらの方法は発症前
にその疾患の進行を予想するため、又は遺伝子スクリーニングのために生体外で
用いることができる。
ブロット分析、ＤＮＡ又はＲＮＡプローブ、ならびにウェスタンブロット分析、
本願で述べられたタンパク又はアミノ酸配列由来のエピトープの調製、モノクロ
ーナル及びポリクローナル抗体の生産の方法である。これらの方法は試料、好ま
しくは生体液のパーキンタンパク質の存在を検出するための方法として該タンパ
ク質の発現か、あるいはパーキンをコードする遺伝子配列における遺伝子的変化
を同定することを含む対象から採取した核酸試料または他の試料中のパーキンソ
ン病に対する遺伝子の存在のいずれかをスクリーニングするのに用いることがで
きる。さらに、動物を犠牲にした後、神経変性疾患、特にパーキンソン病の生体
に対する影響を検討するために実施される病理生物化学的、免疫生物学的、神経
学的、ならびに組織化学的方法が含まれる。パーキンソン病と関連する遺伝的変
異の存在を位置付けるためのさらなる方法が提供される。これらの方法は発症前
にその疾患の進行を予想するため、又は遺伝子スクリーニングのために生体外で
用いることができる。
【００７４】
しかしながら、特に好ましくは、モデルとして作出したトランスジェニック動物
のいずれかを仮想的な治療に供し、該治療有効性を測定することを含む、低活性
の又は非活性のパーキンタンパク質に関連する神経変性疾患のための治療有効性
を試験する方法である。
のいずれかを仮想的な治療に供し、該治療有効性を測定することを含む、低活性
の又は非活性のパーキンタンパク質に関連する神経変性疾患のための治療有効性
を試験する方法である。
【００７５】
これらの試験方法は、好ましくはその効果が上記方法のいずれかによって決定で
きるような活性物質を本発明のトランスジェニック動物に投与することを含む。
きるような活性物質を本発明のトランスジェニック動物に投与することを含む。
【００７６】
本願で記載したトランスジェニック動物の使用によって、ある活性物質が非活性
パーキンタンパク質に関連する状態を治療し、そして該疾患を治療することにお
いて効果をもたらす該活性物質のレベルを測定するのに有用であるかどうかをモ
デル系で試験することが初めて可能である。
パーキンタンパク質に関連する状態を治療し、そして該疾患を治療することにお
いて効果をもたらす該活性物質のレベルを測定するのに有用であるかどうかをモ
デル系で試験することが初めて可能である。
【００７７】
治療は単回投与で行うことができるが、複数回投与で長期間の実験にそのトラン
スジェニック動物を使用することが好ましい。
スジェニック動物を使用することが好ましい。
【００７８】
本発明のトランスジェニック動物は特に薬物のスクリーニングと薬物の効果を評
価するためのモデル系として使用することができる。さらに、そのようなモデル
系は神経変性疾患の基礎をなす生化学を定義づけるためのツールを提供し、それ
によって合理的な薬物デザインのための基礎を提供する。該モデルはさらに行動
の研究、生理学的及び分子生物学的実験、薬理学的及び毒物学的研究及び幾つか
の他の用途に用いることができる。
価するためのモデル系として使用することができる。さらに、そのようなモデル
系は神経変性疾患の基礎をなす生化学を定義づけるためのツールを提供し、それ
によって合理的な薬物デザインのための基礎を提供する。該モデルはさらに行動
の研究、生理学的及び分子生物学的実験、薬理学的及び毒物学的研究及び幾つか
の他の用途に用いることができる。
【００７９】
本発明の方法のいずれかを用いてパーキンソン病の明白な兆候をまだ示さない個
体内でパーキンタンパク質をコードする遺伝子配列において遺伝的変異を検出し
たとすると、該疾患の発症を抑制するために遺伝子移入の形態で遺伝子治療を用
いることが可能であるかもしれない。
体内でパーキンタンパク質をコードする遺伝子配列において遺伝的変異を検出し
たとすると、該疾患の発症を抑制するために遺伝子移入の形態で遺伝子治療を用
いることが可能であるかもしれない。
【００８０】
変異パーキンタンパク質の変調に向けられたさらなる態様は本願において記述し
た変異パーキン配列の全部又は一部に相補的な特定のアンチセンスポリヌクレオ
チド、あるいは幾つかの態様では野生型パーキン配列を用いる方法を含む。その
ような相補的なアンチセンスポリヌクレオチドは関連の標的配列に対する特異的
なハイブリダイゼーションがそのポリヌクレオチドの性質として保持される限り
、ヌクレオチド置換、付加、欠失、又はトランスポジションを含むことができる
。従って、アンチセンスポリヌクレオチドは優先的に野生型パーキンに比較して
変異パーキン配列に結合しなければならない。アンチセンスポリヌクレオチドは
縮重配列ではなく変異対立遺伝子（又は所望する場合は野生型対立遺伝子）の正
確なヌクレオチド配列を反映することが最も好ましい。
た変異パーキン配列の全部又は一部に相補的な特定のアンチセンスポリヌクレオ
チド、あるいは幾つかの態様では野生型パーキン配列を用いる方法を含む。その
ような相補的なアンチセンスポリヌクレオチドは関連の標的配列に対する特異的
なハイブリダイゼーションがそのポリヌクレオチドの性質として保持される限り
、ヌクレオチド置換、付加、欠失、又はトランスポジションを含むことができる
。従って、アンチセンスポリヌクレオチドは優先的に野生型パーキンに比較して
変異パーキン配列に結合しなければならない。アンチセンスポリヌクレオチドは
縮重配列ではなく変異対立遺伝子（又は所望する場合は野生型対立遺伝子）の正
確なヌクレオチド配列を反映することが最も好ましい。
【００８１】
相補的なアンチセンスポリヌクレオチドは変異パーキンｍＲＮＡ種に特異的にハ
イブリダイズでき、ｍＲＮＡ種の転写及び／又はコードされるポリペプチドの転
写を抑制することのできる可溶性アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡオリゴヌクレオ
チドを含む(参照することによって記載に代えるChing et al. (1989) Proc. Nat
l. Acad. Sci. U.S.A. 86:10006: Broder et al. (1990) Ann. Int. Med. 113:6
04: Loreau et al. (1990) FEBS Letters 274:53-56) ; Holcenberg et al. WO9
1/11535; U.S.Pat. No. 7,530,165 ("New human CRIPTO gene"・・Derwent Publ
icaions Ltd., Rochdale House, 128 Theobalds Road, London, UKを通して公的
に入手可能）; WO91/09865; WO91/04753; WO90/13641; 及びEP386563）。それゆ
えアンチセンスポリヌクレオチドは変異パーキンポリペプチドの生産を阻害する
。
イブリダイズでき、ｍＲＮＡ種の転写及び／又はコードされるポリペプチドの転
写を抑制することのできる可溶性アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡオリゴヌクレオ
チドを含む(参照することによって記載に代えるChing et al. (1989) Proc. Nat
l. Acad. Sci. U.S.A. 86:10006: Broder et al. (1990) Ann. Int. Med. 113:6
04: Loreau et al. (1990) FEBS Letters 274:53-56) ; Holcenberg et al. WO9
1/11535; U.S.Pat. No. 7,530,165 ("New human CRIPTO gene"・・Derwent Publ
icaions Ltd., Rochdale House, 128 Theobalds Road, London, UKを通して公的
に入手可能）; WO91/09865; WO91/04753; WO90/13641; 及びEP386563）。それゆ
えアンチセンスポリヌクレオチドは変異パーキンポリペプチドの生産を阻害する
。
【００８２】
アンチセンスポリヌクレオチドは、形質転換細胞又はトランスジェニック神経細
胞、膠細胞又はアストロサイト細胞のようなトランスジェニック細胞若しくは動
物内で異種発現カセットから生産することができ、好ましくはその発現カセット
は細胞型特異的発現を促進する配列を含んでいる（Wirak et al., loc. cit.)。
あるいは、アンチセンスポリヌクレオチドはin vitroで培養培地内またはin viv
oで循環系内若しくは間質液内に、外部環境に投与される可溶性オリゴヌクレオ
チドを含むことができる。外部環境内に存在する可溶性アンチセンスポリヌクレ
オチドは原形質に到達し、特異的ｍＲＮＡ種の翻訳を阻害することが示されてい
る。幾つかの態様では、アンチセンスポリヌクレオチドはメチルリン酸塩部分を
含む。アンチセンスポリヌクレオチドに関する一般的な方法については、Antise
nse RNA and DNA, (1988). D.A. Melton, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory
, Cold Spring Harbor, N.Yを参照。
胞、膠細胞又はアストロサイト細胞のようなトランスジェニック細胞若しくは動
物内で異種発現カセットから生産することができ、好ましくはその発現カセット
は細胞型特異的発現を促進する配列を含んでいる（Wirak et al., loc. cit.)。
あるいは、アンチセンスポリヌクレオチドはin vitroで培養培地内またはin viv
oで循環系内若しくは間質液内に、外部環境に投与される可溶性オリゴヌクレオ
チドを含むことができる。外部環境内に存在する可溶性アンチセンスポリヌクレ
オチドは原形質に到達し、特異的ｍＲＮＡ種の翻訳を阻害することが示されてい
る。幾つかの態様では、アンチセンスポリヌクレオチドはメチルリン酸塩部分を
含む。アンチセンスポリヌクレオチドに関する一般的な方法については、Antise
nse RNA and DNA, (1988). D.A. Melton, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory
, Cold Spring Harbor, N.Yを参照。
【００８３】
以下の実施例は説明のために提示されるものであって、提示された特定の実施例
に本発明を限定することを意図したものではない。
に本発明を限定することを意図したものではない。
【００８４】
実施例１
マウスパーキン２ｃＤＮＡクローン：
アレイされたマウス脳及びマウス腎ｃＤＮＡライブラリー(Biofrontera Pharmac
eticals/Bio Systems)をプライマーＥｘ２ｓ：tcaggttcaactccagctatggc及びＥ
ｘ２ａｓ：tgcctgcgaaatcacacgcagcを用いて標準条件のＰＣＲによってスクリー
ニングした。サイクル条件は以下の通りであった：３分，９５℃、（３０秒，９
５℃、３０秒，５６℃、１分，７２℃）×３５サイクル。
eticals/Bio Systems)をプライマーＥｘ２ｓ：tcaggttcaactccagctatggc及びＥ
ｘ２ａｓ：tgcctgcgaaatcacacgcagcを用いて標準条件のＰＣＲによってスクリー
ニングした。サイクル条件は以下の通りであった：３分，９５℃、（３０秒，９
５℃、３０秒，５６℃、１分，７２℃）×３５サイクル。
【００８５】
ｍＰａｒｋ２遺伝子を含む単一コロニーをManiatis et al. 1989（上記参照）に
記載されるプロトコルに従ってコロニーハイブリダイゼーションによって確認し
た。
記載されるプロトコルに従ってコロニーハイブリダイゼーションによって確認し
た。
【００８６】
Del Exon 3パーキン遺伝子（配列番号７）の構築
以下に述べる全てのクローニング工程を図３に示す。パーキン遺伝子のエキソン
３を含むゲノムラムダZIPクローン（ゲノムマウスλ−Fixライブラリー、Strata
gene社）をmPark2遺伝子のエキソン３特異的プライマーを用いてＰＣＲによって
単離した。mPark2のエキソン３にゲノムＤＮＡ３’末端を含むラムダＺＩＰクロ
ーンの3.1kbのBamHI／HindIII断片をクローニングベクターpBluescriptKS（Stra
tagene社）にクローニングし、プラスミドpmPark2−BHを得た。第２に、5kbのHi
ndIII／EcoRIゲノムＤＮＡ断片をpmPark2−BH−クローンのHindIIIに挿入した。
EcoRI及びHindIII部位をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理によって破壊した。その結
果、エキソン３の３’末端に8.1kbの長いゲノム領域を有するプラスミドpmPark2
−BE−が得られた。
３を含むゲノムラムダZIPクローン（ゲノムマウスλ−Fixライブラリー、Strata
gene社）をmPark2遺伝子のエキソン３特異的プライマーを用いてＰＣＲによって
単離した。mPark2のエキソン３にゲノムＤＮＡ３’末端を含むラムダＺＩＰクロ
ーンの3.1kbのBamHI／HindIII断片をクローニングベクターpBluescriptKS（Stra
tagene社）にクローニングし、プラスミドpmPark2−BHを得た。第２に、5kbのHi
ndIII／EcoRIゲノムＤＮＡ断片をpmPark2−BH−クローンのHindIIIに挿入した。
EcoRI及びHindIII部位をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理によって破壊した。その結
果、エキソン３の３’末端に8.1kbの長いゲノム領域を有するプラスミドpmPark2
−BE−が得られた。
【００８７】
エキソン３に対して５’側にゲノム領域を含む2.0kbのXbaI/XhoI(XbaI制限酵素
部位はLamda Fixのマルチクローニングサイト（mcs）に位置する）ゲノムＤＮＡ
断片を、pNeoloxp−ベクター（Giese et al. Science, 1998, 279:870-3)のEcoR
Iに、T4DNAポリメラーゼ処理によって平滑末端を作成した後クローニングした。
このベクターのBamHI−部位（EcoRI部位に対して５’側）を続いて2.5kbHSV-tk
−マーカー遺伝子の挿入のために用いた。用いたクローニング部位を除去するた
めに再びT4DNAポリメラーゼを用いてライゲーション前に平滑末端を作った。得
られたベクターを制限酵素NotI及びXhoIにて消化し、HSV−tk、エキソン３の５
’末端側に2kbのXhoI/XbaIゲノム領域、及びネオマーカーを含む6.5kbの断片を
得た。ベクターpmPark2-BEをXhoIで消化し、プラスミドを直線化した。単離され
た6.5kbの断片ならびに直線化したベクターの両方をライゲーション前にT4DNAポ
リメラーゼで処理し、用いた制限酵素部位を除去した。
部位はLamda Fixのマルチクローニングサイト（mcs）に位置する）ゲノムＤＮＡ
断片を、pNeoloxp−ベクター（Giese et al. Science, 1998, 279:870-3)のEcoR
Iに、T4DNAポリメラーゼ処理によって平滑末端を作成した後クローニングした。
このベクターのBamHI−部位（EcoRI部位に対して５’側）を続いて2.5kbHSV-tk
−マーカー遺伝子の挿入のために用いた。用いたクローニング部位を除去するた
めに再びT4DNAポリメラーゼを用いてライゲーション前に平滑末端を作った。得
られたベクターを制限酵素NotI及びXhoIにて消化し、HSV−tk、エキソン３の５
’末端側に2kbのXhoI/XbaIゲノム領域、及びネオマーカーを含む6.5kbの断片を
得た。ベクターpmPark2-BEをXhoIで消化し、プラスミドを直線化した。単離され
た6.5kbの断片ならびに直線化したベクターの両方をライゲーション前にT4DNAポ
リメラーゼで処理し、用いた制限酵素部位を除去した。
【００８８】
このプラスミドpmPark2del-ex3はＥＳ細胞に形質導入する前に制限酵素NotIで直
線化した。
線化した。
【００８９】
（実施例２） ＥＳ細胞の形質導入
ＥＳ細胞の単離と凍結：
１４週齢の胚を単離し、頭部及び器官を胚より除去し、残りの組織を細かく刻み
、１×ＰＢＳで洗浄した。37℃で５分間それをインキュベートすることによって
その組織を溶解させるために１×トリプシン（0.5g/l）/EDTA（0.2g/l）を用い
た。反応は１容量のＥＦ培地（Embryonic Feeder medium:１×DMEM, 10%ＦＣＳ
血清、2mMグルタミン、すべてLIFE Technologiesから入手）を添加することによ
って停止させ、細胞を数回上下させてピペッティングすることによって溶解した
。上清を1000rpmで５分間遠心した。一つの胚からの胚盤胞を30mlの培地を入れ
た175cm2フラスコに撒いた。培地を24時間後に換えた。胚盤胞がコンフルエント
な単層を形成したとき、それらを１：３に分割し、その後細胞が再びコンフルエ
ントになるまで凍結した。175cm2フラスコからの細胞を一つのチューブ内で凍結
した。そのため、まず空のチューブを氷上に置き、凍結培地を添加し（ＥＦ培地
＋20% DMSO（Dimethylsulfoxid)）、0.5mlのＦＦ培地と共に細胞を添加、混合し
、発泡スチロール製ボックスに入れ、それを−80℃のフリーザー内で冷却し、翌
日そのチューブを液体Ｎ2（ｌ）タンクに移した。
、１×ＰＢＳで洗浄した。37℃で５分間それをインキュベートすることによって
その組織を溶解させるために１×トリプシン（0.5g/l）/EDTA（0.2g/l）を用い
た。反応は１容量のＥＦ培地（Embryonic Feeder medium:１×DMEM, 10%ＦＣＳ
血清、2mMグルタミン、すべてLIFE Technologiesから入手）を添加することによ
って停止させ、細胞を数回上下させてピペッティングすることによって溶解した
。上清を1000rpmで５分間遠心した。一つの胚からの胚盤胞を30mlの培地を入れ
た175cm2フラスコに撒いた。培地を24時間後に換えた。胚盤胞がコンフルエント
な単層を形成したとき、それらを１：３に分割し、その後細胞が再びコンフルエ
ントになるまで凍結した。175cm2フラスコからの細胞を一つのチューブ内で凍結
した。そのため、まず空のチューブを氷上に置き、凍結培地を添加し（ＥＦ培地
＋20% DMSO（Dimethylsulfoxid)）、0.5mlのＦＦ培地と共に細胞を添加、混合し
、発泡スチロール製ボックスに入れ、それを−80℃のフリーザー内で冷却し、翌
日そのチューブを液体Ｎ2（ｌ）タンクに移した。
【００９０】
サブカルチャー、不活性化及びフィーダー層：
胚盤胞はゼラチン−被覆プラスチック容器上で培養することができる。その細胞
を３日後に注意深く１：３に分割した。フィーダー層はＥＳ細胞培養に必要であ
り、胚盤胞はマイトマインＣによって分割−不活性されるべきである。２ｍｇの
マイトマイシンＣは10mlのＰＢＳに溶解し、−20℃で保存することができる。こ
のストック液を不活化のためにＥＦ培地にて１：２０に希釈する；175ｃｍ2フラ
スコ内でほとんどコンフルエントになった胚盤胞をマイトマイシンＣを添加した
20〜30mlの培地中で37℃で２時間インキュベートする。マイトマイシンＣをＰＢ
Ｓで２回洗浄することによって除去し、不活化した胚盤胞をそれらが凍結する前
に24時間ＥＦ培地で回収するか、数日後にＥＳ細胞培養のために用いる。細胞は
使用するまで(最長10日間）37℃で保存するか、凍結する。フィーダー層につい
ては、細胞を同じ領域に撒き、プラスチック容器をゼラチンによって被覆しなけ
ればならない。
を３日後に注意深く１：３に分割した。フィーダー層はＥＳ細胞培養に必要であ
り、胚盤胞はマイトマインＣによって分割−不活性されるべきである。２ｍｇの
マイトマイシンＣは10mlのＰＢＳに溶解し、−20℃で保存することができる。こ
のストック液を不活化のためにＥＦ培地にて１：２０に希釈する；175ｃｍ2フラ
スコ内でほとんどコンフルエントになった胚盤胞をマイトマイシンＣを添加した
20〜30mlの培地中で37℃で２時間インキュベートする。マイトマイシンＣをＰＢ
Ｓで２回洗浄することによって除去し、不活化した胚盤胞をそれらが凍結する前
に24時間ＥＦ培地で回収するか、数日後にＥＳ細胞培養のために用いる。細胞は
使用するまで(最長10日間）37℃で保存するか、凍結する。フィーダー層につい
ては、細胞を同じ領域に撒き、プラスチック容器をゼラチンによって被覆しなけ
ればならない。
【００９１】
ＥＳ細胞のサブカルチャー：
ＥＳ細胞を培養液中で２〜４回の継代の間、保持した。培地はＥＳ培地（１×Ｄ
ＭＥＭ、15％ＦＣＳ血清、２ｍＭグルタミン、１×非必須アミノ酸、７μｌβメ
ルカプトエタノール、ＬＩＦ(Leukemia Inhibitory Factor）2．5×105から106
Ｕ／ｌを含む補助成分を添加、全てLIFE Technologiesから入手可能）であり、
細胞は２日毎に１：６に分割する。細胞を継代する前に２時間再フィードした。
ＭＥＭ、15％ＦＣＳ血清、２ｍＭグルタミン、１×非必須アミノ酸、７μｌβメ
ルカプトエタノール、ＬＩＦ(Leukemia Inhibitory Factor）2．5×105から106
Ｕ／ｌを含む補助成分を添加、全てLIFE Technologiesから入手可能）であり、
細胞は２日毎に１：６に分割する。細胞を継代する前に２時間再フィードした。
【００９２】
ＥＳ細胞の安定なトランスフェクション
遺伝子ターゲッティング構築物の消化後、ＤＮＡをフェノール／ＣＨＣｌ3
（24／23）で抽出し、エタノール（75％エタノールで２回洗浄）で沈殿させる：
エタノールの残りを注意深く除去し、約15分間滅菌条件下（層流）空乾させる。
ＤＮＡを水（最終濃度：3mg/ml）に懸濁させる。単層の5×107細胞を１×トリプ
シンで処理し、それらをフラスコの底から剥がし、0.8mlの培地に懸濁させ、そ
してＤＮＡを用いてエレクトロポレートする（30μｇ線状ＤＮＡ、800V、3μＦ
、BioRad Gene Pulser)。４℃にて20分後、細胞を9.5ml培地に希釈し、ディッシ
ュ（９ｃｍ直径）に撒く。24時間のエレクトロポレーション後、G418（150−175
mg/ml)を加えて選択を開始する。培地を１日ごとに交換し、選択の７〜９日後、
コロニーを拾い取ることができる。
（24／23）で抽出し、エタノール（75％エタノールで２回洗浄）で沈殿させる：
エタノールの残りを注意深く除去し、約15分間滅菌条件下（層流）空乾させる。
ＤＮＡを水（最終濃度：3mg/ml）に懸濁させる。単層の5×107細胞を１×トリプ
シンで処理し、それらをフラスコの底から剥がし、0.8mlの培地に懸濁させ、そ
してＤＮＡを用いてエレクトロポレートする（30μｇ線状ＤＮＡ、800V、3μＦ
、BioRad Gene Pulser)。４℃にて20分後、細胞を9.5ml培地に希釈し、ディッシ
ュ（９ｃｍ直径）に撒く。24時間のエレクトロポレーション後、G418（150−175
mg/ml)を加えて選択を開始する。培地を１日ごとに交換し、選択の７〜９日後、
コロニーを拾い取ることができる。
【００９３】
コロニーの拾い取り及び拾い取ったコロニーの培養：
24個のコロニーをエッペンドルフチップを用いて倒立顕微鏡下で拾い取った。コ
ロニーを96ウェルプレート（丸底）のウェルに移した。30μlの１×トリプシン
／ＥＤＴＡを加え、プレートを10分間37℃でインキュベートする。その後、100
μlのＥＳ−培地を加え、細胞をマルチチャンネルピペットを用いて12回ピペッ
ティングアップ及びダウンすることによって懸濁させる。トリプシン化した細胞
だけを24ウェルプレートに撒く。培地を24時間ごとに交換する。拾い取って３〜
４日後、細胞をプレートの底から剥がす。そのために、培地を除去し、60μｌ×
トリプシン／ＥＤＴＡを加えプレートを７分間37℃にて培養する。処理を200μl
の培地を加えることによって停止させ、細胞を再懸濁させる。200μlの細胞懸濁
液を200mlの培地に20％ DMSOとともに加え、そして細胞を上述したように凍結さ
せる。
ロニーを96ウェルプレート（丸底）のウェルに移した。30μlの１×トリプシン
／ＥＤＴＡを加え、プレートを10分間37℃でインキュベートする。その後、100
μlのＥＳ−培地を加え、細胞をマルチチャンネルピペットを用いて12回ピペッ
ティングアップ及びダウンすることによって懸濁させる。トリプシン化した細胞
だけを24ウェルプレートに撒く。培地を24時間ごとに交換する。拾い取って３〜
４日後、細胞をプレートの底から剥がす。そのために、培地を除去し、60μｌ×
トリプシン／ＥＤＴＡを加えプレートを７分間37℃にて培養する。処理を200μl
の培地を加えることによって停止させ、細胞を再懸濁させる。200μlの細胞懸濁
液を200mlの培地に20％ DMSOとともに加え、そして細胞を上述したように凍結さ
せる。
【００９４】
（実施例３） 拾い取ったコロニーＤＮＡ単離、対照に対するサザンブロット及
び同定 実施例２で拾い取ったコロニーを特徴づけるためにＤＮＡをその細胞から単離し
、調べる。そのために、60μlの細胞懸濁液（実施例２参照）を依然として含ん
でいるはずの拾い取ったコロニーの任意のウェルに500μlの培地を添加する。細
胞をＤＮＡ単離のためにコンフルエントになるまで３〜４日間続けて培養する。
500μlの溶菌バッファー（12ml 1M Tris-HCl(pH8.3)；1.2ml 0.5M EDTA；2.4ml
10% SDS；4.8ml 5M NaCl；1.2 ml 10mg/mlプロテナーゼＫ；98.4ml H2O）を加え
、55℃で終夜インキュベートする。ＤＮＡを１容量の２−プロパノールを添加す
ることによって沈殿させ、少なくとも15分間室温で振とうさせ、エッペンドルフ
チップを用いて１ｍｌの70%エタノールといっしょに1.5mlチューブ中へ移した。
チューブを10分間室温にて遠心し、ＤＮＡを回転により沈降させる。エタノール
を除去し、ペレットを少なくとも１時間空気乾燥させる。その後、ＤＮＡを55℃
で一晩、100μlのＴＥに溶解する。
び同定 実施例２で拾い取ったコロニーを特徴づけるためにＤＮＡをその細胞から単離し
、調べる。そのために、60μlの細胞懸濁液（実施例２参照）を依然として含ん
でいるはずの拾い取ったコロニーの任意のウェルに500μlの培地を添加する。細
胞をＤＮＡ単離のためにコンフルエントになるまで３〜４日間続けて培養する。
500μlの溶菌バッファー（12ml 1M Tris-HCl(pH8.3)；1.2ml 0.5M EDTA；2.4ml
10% SDS；4.8ml 5M NaCl；1.2 ml 10mg/mlプロテナーゼＫ；98.4ml H2O）を加え
、55℃で終夜インキュベートする。ＤＮＡを１容量の２−プロパノールを添加す
ることによって沈殿させ、少なくとも15分間室温で振とうさせ、エッペンドルフ
チップを用いて１ｍｌの70%エタノールといっしょに1.5mlチューブ中へ移した。
チューブを10分間室温にて遠心し、ＤＮＡを回転により沈降させる。エタノール
を除去し、ペレットを少なくとも１時間空気乾燥させる。その後、ＤＮＡを55℃
で一晩、100μlのＴＥに溶解する。
【００９５】
サザンブロット分析：
単離したＤＮＡの３分の１を一回の消化に用いた。消化は37℃で一晩行った。Lo
ading buffer を加え、ＤＮＡをアガロース内で少なくとも６時間分離した。ゲ
ルを0.2N HCl中15分間室温にてインキュベートした：15分後HCl溶液を0.4N NaOH
で交換し、ゲルをその中で15分間室温でインキュベートした。ＤＮＡを真空ブロ
ット機（Stratagene社)を用いてtransfer bufferとして０．4N NaOHを用いて終
夜かけてナイロン膜（Amersham社）に移した。膜を２×ＳＳＣ内で１時間中和し
、少なくとも１時間空乾した。ＵＶ−架橋後、膜上のＤＮＡとＤＮＡプローブ（
図３に示したプローブ）とのハイブリダイゼーションを標準条件下（Clontech社
のQuickHyb、65℃、2×SSC、0.1% SDS、65℃で2回洗浄）で実施した。
ading buffer を加え、ＤＮＡをアガロース内で少なくとも６時間分離した。ゲ
ルを0.2N HCl中15分間室温にてインキュベートした：15分後HCl溶液を0.4N NaOH
で交換し、ゲルをその中で15分間室温でインキュベートした。ＤＮＡを真空ブロ
ット機（Stratagene社)を用いてtransfer bufferとして０．4N NaOHを用いて終
夜かけてナイロン膜（Amersham社）に移した。膜を２×ＳＳＣ内で１時間中和し
、少なくとも１時間空乾した。ＵＶ−架橋後、膜上のＤＮＡとＤＮＡプローブ（
図３に示したプローブ）とのハイブリダイゼーションを標準条件下（Clontech社
のQuickHyb、65℃、2×SSC、0.1% SDS、65℃で2回洗浄）で実施した。
【００９６】
変異パーキン対立遺伝子を有するトランスジェニック動物の作出
10−15の組換えＥＳ細胞を胚盤胞にインジェクトする。胚盤胞を擬妊娠マウスに
移植する。キメラ子孫を野生型マウスと交配させてヘテロ接合性組換えＦ１マウ
スを得る。これらのマウスを上述したようにサザンブロットによって分析する。
トランスジェニックマウスを互いに交配させ、両方の対立遺伝子が修飾されたマ
ウス（ホモ接合性動物）を得る。
移植する。キメラ子孫を野生型マウスと交配させてヘテロ接合性組換えＦ１マウ
スを得る。これらのマウスを上述したようにサザンブロットによって分析する。
トランスジェニックマウスを互いに交配させ、両方の対立遺伝子が修飾されたマ
ウス（ホモ接合性動物）を得る。
【００９７】
トランスジェニック動物の子孫は同じ又は何らかの他の遺伝子型を表現するマウ
ス株、好ましくは神経学的異常を示す株、より好ましくは神経変性異常を示すマ
ウス株との繁殖に用いることができる。これらの他のマウス株は野生型マウス、
ノック−イン又はノック−アウトを含むマウス、遺伝子の変異を含むマウスまた
はいずれかの遺伝子産物を過剰発現するマウスから選択することができる。最も
好ましい繁殖の相手はアルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症
、多系統萎縮症、ウィルソン病、ピック病、又はプリオン病のためのモデルを表
現するマウスである。
ス株、好ましくは神経学的異常を示す株、より好ましくは神経変性異常を示すマ
ウス株との繁殖に用いることができる。これらの他のマウス株は野生型マウス、
ノック−イン又はノック−アウトを含むマウス、遺伝子の変異を含むマウスまた
はいずれかの遺伝子産物を過剰発現するマウスから選択することができる。最も
好ましい繁殖の相手はアルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症
、多系統萎縮症、ウィルソン病、ピック病、又はプリオン病のためのモデルを表
現するマウスである。
【００９８】
トランスジェニックマウスの使用：
前記動物は潜在的な治療剤を試験するのに用いることができる。マウスの試験群
を適当な様式で所定の期間試験化合物で処理する。試験期間の終了において、該
動物を行動学的に、生物化学的に、そして組織学的にその試験化合物の潜在的な
効果に対して評価する。正確なプロトコルは該試験化合物の予想される作用機構
による。パーキンソン病を治療することにおいて有用性を有する可能性のある化
合物はこのアプローチを用いて同定することができる。
を適当な様式で所定の期間試験化合物で処理する。試験期間の終了において、該
動物を行動学的に、生物化学的に、そして組織学的にその試験化合物の潜在的な
効果に対して評価する。正確なプロトコルは該試験化合物の予想される作用機構
による。パーキンソン病を治療することにおいて有用性を有する可能性のある化
合物はこのアプローチを用いて同定することができる。
【００９９】
そのような分析は動物で、発現している細胞の初代組織培養液で、又はそれらの
動物由来の不死化細胞で行うことができる。
動物由来の不死化細胞で行うことができる。
【０１００】
上述の切断型パーキン２タンパク質遺伝子又はその変異体を発現するマウスは、
その動物の加齢中パーキンソン病の発症を試験するのに用いることができる。黒
質における細胞死の亢進のほか、MATP又は６−ヒドロキシドーパミンのような選
択的神経毒に対する選択性の増加及びL-ドーパのようなドーパミン性前駆体への
応答の亢進を試験することができる。
その動物の加齢中パーキンソン病の発症を試験するのに用いることができる。黒
質における細胞死の亢進のほか、MATP又は６−ヒドロキシドーパミンのような選
択的神経毒に対する選択性の増加及びL-ドーパのようなドーパミン性前駆体への
応答の亢進を試験することができる。
【０１０１】
【配列表】
【図１】 図１はヒト及びマウスパーキン２タンパク質の推定アミノ酸配列
（配列番号４）のアランインメントを示す。下線部は両タンパク質の保存された
ユビキチン様（Ｎ−末端部位）及びＲｉｎｇフィンガー様（Ｃ−末端部位）領域
である。
（配列番号４）のアランインメントを示す。下線部は両タンパク質の保存された
ユビキチン様（Ｎ−末端部位）及びＲｉｎｇフィンガー様（Ｃ−末端部位）領域
である。
【図２】 図２−１はヒト及びマウスパーキン遺伝子のヌクレオチド配列の
アランインメントを示す。太字はヒト及びマウスに対して同定されたエキソン境
界を示す。
アランインメントを示す。太字はヒト及びマウスに対して同定されたエキソン境
界を示す。
【図３】 図２−２はヒト及びマウスパーキン遺伝子のヌクレオチド配列の
アランインメントを示す。太字はヒト及びマウスに対して同定されたエキソン境
界を示す。
アランインメントを示す。太字はヒト及びマウスに対して同定されたエキソン境
界を示す。
【図４】 図３はマウスパーキン２遺伝子−エキソン３ノックアウト構築物
のクローニング手順のフローチャートを示す。 ａ）制限エンドヌクレアーゼ： N＝NotI、E＝EcoRI、H＝HindIII、X＝XbaI ｂ）改変：（ ）＝生じたプラスミドにおける制限酵素を除去するために
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理 ｃ）◆◆◆◆◆＝pBluescript KSII (Stratagene)ベクター配列 ＊＊＊＝λ−Fixベクター配列 ｄ）HSV−tk＝単純ヘルペスプロモーター及びチミジンキナーゼ遺伝子 ｅ）ｋｂ＝キロベース
のクローニング手順のフローチャートを示す。 ａ）制限エンドヌクレアーゼ： N＝NotI、E＝EcoRI、H＝HindIII、X＝XbaI ｂ）改変：（ ）＝生じたプラスミドにおける制限酵素を除去するために
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理 ｃ）◆◆◆◆◆＝pBluescript KSII (Stratagene)ベクター配列 ＊＊＊＝λ−Fixベクター配列 ｄ）HSV−tk＝単純ヘルペスプロモーター及びチミジンキナーゼ遺伝子 ｅ）ｋｂ＝キロベース
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ
5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Ｃ１２Ｑ 1/68 5/00 Ｂ
Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA80 CA04 DA02 DA05
DA11 EA02 EA03 EA04 FA02
GA11 HA01 HA11
4B063 QA01 QA08 QA18 QQ01 QQ42
QQ52 QR33 QR55 QR59 QR82
QS05 QS25 QS34 QS36 QX02
4B065 AA01X AA57X AA90X AA91Y
AB01 BA02 BA21 CA46
Claims (22)
- 【請求項１】 対応するヒト配列において生じると、ヒトにおいてパーキン
ソン病の原因となる天然由来の又は人工的に導入された変異又は欠失を含む、マ
ウスパーキン２タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。 - 【請求項２】 前記配列が全長のパーキン遺伝子若しくはその断片をコード
するゲノムＤＮＡ、又は全長のパーキン遺伝子若しくはその断片のｃＤＮＡ、又
は全長のパーキン遺伝子若しくはその断片のＲＮＡである、請求項１に記載の配
列。 - 【請求項３】 前記配列が配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号
８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、
配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配
列番号１９、配列番号２０、又はそれらの天然由来の若しくは人工的に導入され
た変異体、又はそれらの断片から選択される、請求項１又は２に記載の配列。 - 【請求項４】 請求項１から３のいずれかに記載のいずれかの配列を含むベ
クター。 - 【請求項５】 請求項４に記載のベクターを含む原核又は真核細胞。
- 【請求項６】 前記細胞が、細菌又は酵母細胞、初代細胞又は不死化細胞系
として昆虫細胞又は哺乳類細胞から選ばれることを特徴とする請求項５に記載の
細胞。 - 【請求項７】 配列番号５、配列番号６、配列番号２１、配列番号２２、配
列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列
番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番
号３３、配列番号３４、又はそれらの相同タンパク質配列を有する天然由来の若
しくは人工的に導入された変異体、又はそれらの断片のアミノ酸配列を有するマ
ウスパーキンタンパク質。 - 【請求項８】 改変された活性、好ましくは低活性のタンパク質、又は非活
性のタンパク質を発現するようにパーキン遺伝子をコードする遺伝子の一方又は
両方の対立遺伝子が変異又は切断されている、トランスジェニック非ヒト動物。 - 【請求項９】 前記パーキン遺伝子が、対応するヒト配列において生じると
、パーキンソン病の原因となることが知られているいずれかの変異又は欠失を有
している、請求項８に記載のトランスジェニック動物。 - 【請求項１０】 パーキンタンパク質をコードする遺伝子の一方又は両方の
対立遺伝子に変異又は欠失を持っている請求項８又は９に記載のトランスジェニ
ック非ヒト動物であって、該パーキン遺伝子の発現が、該動物に神経変性疾患の
生理学的、生物化学的、分子生物学的特徴のいずれかを呈示させる原因となる変
異若しくは切断タンパク質又は非タンパク質を生産する、前記トランスジェニッ
ク非ヒト動物。 - 【請求項１１】 前記パーキンタンパク質をコードする遺伝子のいずれかの
エキソンの一方又は両方の対立遺伝子において欠失を有している、請求項１０に
記載のトランスジェニック非ヒト動物。 - 【請求項１２】 配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列
番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号
１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１
９、又は配列番号２０の配列のいずれかのＤＮＡ配列を有する請求項８から１１
のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。 - 【請求項１３】 請求項１から３のいずれの配列又は請求項４に記載のベク
ター又は請求項８から１２のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物由
来の細胞系若しくは初代培養物で形質転換又は形質移入された哺乳類細胞系。 - 【請求項１４】 請求項８から１２のいずれかに記載のトランスジェニック
動物又は請求項１３に記載の細胞系を製造する方法。 - 【請求項１５】 請求項８から１２のいずれかに記載のトランスジェニック
非ヒト動物又は請求項１３に記載の細胞系の、神経変性疾患に対するモデルとし
ての使用。 - 【請求項１６】 請求項１から４のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列
のいずれか、請求項７に記載のタンパク質配列のいずれかを用いて生体外で、又
は請求項１５に記載のいずれかのモデルを用いて神経変性疾患の症状を分析する
方法。 - 【請求項１７】 請求項１５のいずれかのモデルを仮想的な治療に供し、該
治療の有効性を測定することを含む、低活性の又は非活性のパーキンタンパク質
に関連する神経変性疾患の治療有効性の試験方法。 - 【請求項１８】 前記神経変性疾患がパーキンソン病、アルツハイマー病、
ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、多系統萎縮症、ウィルソン病、ピック病
、プリオン病、あるいは毒素、薬物、脳腫瘍、頭部外傷、発作、血管異常、又は
代謝異常のようなパーキンソン症候群を誘発する二次性病因から選択される、請
求項１６又は請求項１７に記載の方法。 - 【請求項１９】 前記治療が活性物質を前記モデルに投与することを含む請
求項１７から１９のいずれかの方法。 - 【請求項２０】 請求項８から１２のいずれかに記載のトランスジェニック
動物又は請求項１３の細胞系に活性物質を投与し、前記疾患を治療することにお
いて効果をもたらす該活性物質の量を測定することを含む、活性物質が非活性パ
ーキンタンパク質に関連する状態を治療するために有用であるかどうかを試験す
るための、請求項１５に記載のいずれかのモデルの使用。 - 【請求項２１】 神経変性疾患の進行中の行動に関する試験のためのモデル
として、あるいは神経変性疾患、該疾患の生理学的及び分子生物学的相互関係に
関する病理生化学的、免疫生物学的、神経学的、ならびに組織化学的影響の試験
のための、薬物の効果に関する研究のための、及び効果的な薬物投与量及び毒性
を測定するための請求項１５に記載のいずれかのモデルとしての、請求項８から
１２のいずれかに記載の動物の使用。 - 【請求項２２】 同一の又は任意の他の遺伝形質と交配することによって得
られる、請求項８から１２のいずれかに記載の動物の子孫。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP99116766A EP1081225A1 (en) | 1999-08-30 | 1999-08-30 | Transgenic animal model for neurodegenerative diseases |
| EP99116766.9 | 1999-08-30 | ||
| PCT/EP2000/008071 WO2001016176A2 (en) | 1999-08-30 | 2000-08-18 | Transgenic animal model for neurodegenerative diseases |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003512026A true JP2003512026A (ja) | 2003-04-02 |
Family
ID=8238860
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001520735A Pending JP2003512026A (ja) | 1999-08-30 | 2000-08-18 | 神経変性疾患のためのトランスジェニック動物モデル |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP1081225A1 (ja) |
| JP (1) | JP2003512026A (ja) |
| AT (1) | ATE396263T1 (ja) |
| CA (1) | CA2383564A1 (ja) |
| DE (1) | DE60038966D1 (ja) |
| ES (1) | ES2304973T3 (ja) |
| WO (1) | WO2001016176A2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2020034500A (ja) * | 2018-08-31 | 2020-03-05 | 株式会社 大昌電子 | 変位検出センサ組み込みプリント配線板装置およびその製造方法 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2845245A1 (fr) * | 2002-10-07 | 2004-04-09 | Aventis Pharma Sa | Modele animal de la maladie de parkinson |
| US6943278B2 (en) * | 2002-10-15 | 2005-09-13 | Genexel, Inc. | Transgenic Drosophila having a disrupted Parkin gene and exhibits reduced climbing ability |
| CN113373150B (zh) * | 2021-06-18 | 2022-11-22 | 南方科技大学 | 一种靶向dat基因的sgRNA及其应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU8163798A (en) * | 1997-06-25 | 1999-01-04 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | Cloning of a gene mutation for parkinson's disease |
| EP1063294B1 (en) * | 1998-02-09 | 2006-01-11 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Dnas or genes participating in parkinson's disease |
| ES2330281T3 (es) * | 1998-11-19 | 2009-12-07 | Aventis Pharma S.A. | Mutaciones del gen de la parquina, composiciones, metodos y usos. |
-
1999
- 1999-08-30 EP EP99116766A patent/EP1081225A1/en not_active Withdrawn
-
2000
- 2000-08-18 AT AT00956461T patent/ATE396263T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-08-18 ES ES00956461T patent/ES2304973T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-08-18 JP JP2001520735A patent/JP2003512026A/ja active Pending
- 2000-08-18 WO PCT/EP2000/008071 patent/WO2001016176A2/en active IP Right Grant
- 2000-08-18 CA CA002383564A patent/CA2383564A1/en not_active Abandoned
- 2000-08-18 EP EP00956461A patent/EP1208200B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-08-18 DE DE60038966T patent/DE60038966D1/de not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| JPN5002014213, Ｎａｔｕｒｅ, 1998, Ｖｏｌ．３９２， Ｎｏ．６６７６, ｐｐ．６０５−６０８ * |
| JPN6010006692, "ＤＥＦＩＮＩＴＩＯＮ Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ｍＲＮＡ ｆｏｒ ｐａｒｋｉｎ， ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ．", ［ｏｎｌｉｎｅ］, 19990713, ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＡＢ０１９５５８ * |
| JPN6010006696, Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ．, 199904, Ｖｏｌ．８， Ｎｏ．４, ｐｐ．５６７−５７４ * |
| JPN6010006698, Ｌａｎｃ．, 1998, Ｖｏｌ．３５２, ｐｐ．１３５５−１３５６ * |
| JPN6010006701, Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．, 1998, Ｖｏｌ．１０３, ｐｐ．４２４−４２７ * |
| JPN6010006704, Ａｎｎ． Ｎｅｕｒｏｌ．, 1998, Ｖｏｌ．４４, ｐｐ．９３５−９４１ * |
| JPN6010006707, Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｌｅｔｔ．, 1998, Ｖｏｌ．２５４, ｐｐ．１８０−１８２ * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2020034500A (ja) * | 2018-08-31 | 2020-03-05 | 株式会社 大昌電子 | 変位検出センサ組み込みプリント配線板装置およびその製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2383564A1 (en) | 2001-03-08 |
| ES2304973T3 (es) | 2008-11-01 |
| WO2001016176A2 (en) | 2001-03-08 |
| WO2001016176A3 (en) | 2001-09-27 |
| ATE396263T1 (de) | 2008-06-15 |
| DE60038966D1 (de) | 2008-07-03 |
| EP1208200A2 (en) | 2002-05-29 |
| EP1208200B1 (en) | 2008-05-21 |
| EP1081225A1 (en) | 2001-03-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8148599B2 (en) | Transgenic non-human animals for pharmacological and toxicological studies | |
| AU2002248977A1 (en) | Transgenic non-human animals for pharmacological and toxicological studies | |
| WO2000072670A1 (fr) | Animaux rompant le gene lkb1 | |
| US5545563A (en) | Human C/EBP gene and vectors for its expression | |
| JP2003512026A (ja) | 神経変性疾患のためのトランスジェニック動物モデル | |
| WO1997035967A2 (en) | Transgenic organisms with altered telomerase activity | |
| US20220217956A1 (en) | Rodent Model Of Increased Bone Mineral Density | |
| US5850002A (en) | Animal models for loss and gain of Hox11 function | |
| US20090007283A1 (en) | Transgenic Rodents Selectively Expressing Human B1 Bradykinin Receptor Protein | |
| JP2004267002A (ja) | セネッセンスマーカープロテイン３０欠損動物、抗体およびその作製方法 | |
| WO1998045464A1 (en) | Transgenic, non-human animal with protein deficiency, cells derived therefrom, use of said animal and cells, and method of producing said transgenic animal | |
| JPH1033087A (ja) | グルタミン酸トランスポーター遺伝子機能欠損非ヒト動物 | |
| JP2002517202A5 (ja) | ||
| JP2005510220A (ja) | プロスタグランジンｅ合成酵素２遺伝子の破壊 | |
| WO1998045465A1 (en) | Transgenic, non-human animal with protein deficiency, cells derived therefrom, use of said animal and cells, and method of producing said transgenic animal | |
| JP2004298180A (ja) | ゲノムが改変されたマウス | |
| JP2010220615A (ja) | ゲノムが改変されたマウス | |
| JPH06245670A (ja) | トランスジェニック動物 | |
| JP2002065281A (ja) | ビクニン遺伝子のターゲッティング用ｄｎａ | |
| JP2003116407A (ja) | ラディキシンノックアウト動物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070320 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100216 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20100817 |