JP2003512023A - 原発性胆汁性肝硬変および自己免疫障害に関連する新規レトロウイルスの同定 - Google Patents

原発性胆汁性肝硬変および自己免疫障害に関連する新規レトロウイルスの同定

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スー，リゼ
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Abstract

(57)【要約】 本発明はまず、PBCと関連する新規核酸分子の発見、同定および解析に関するものである。この本発明の新規ヌクレオチド配列は、レトロウイルスに由来するものであり、PBCと強い関連性のあるPBCレトロウイルスを示すものである。本発明は一部、PBC患者の組織に伝播性物質が存在するということを示唆する最初の証拠となる本出願人らによるデータに基づいている。レトロウイルス感染物質のPBCとの関連性が、移植の際に患者から得た門脈周囲のリンパ節と健全な胆管上皮細胞とのin vitroでの共存培養により本出願人らにより最初に示された。出願人らの発見から、本明細書に記載するとおり、電子顕微鏡観察およびイムノブロットにおける反応性により示されているように、レトロウイルスウイルスであるPBC関連感染物質の特性解析が報告される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】1. 緒言 本発明は第一に、原発性胆汁性肝硬変(PBC)およびシェーグレン症候群、強皮
症、全身性エリテマトーデス(SLE)、自己免疫甲状腺炎ならびにその他のさまざ
まな結合組織障害、さらにリンパ腫および乳癌などの他の免疫障害の存在に関連
する新規のヒトレトロウイルスおよびレトロウイルスの長い末端反復配列および
逆転写酵素のヌクレオチドをコードする新規のヌクレオチド配列の同定に関する
ものである。本発明はさらに、PBCレトロウイルスヌクレオチドを使用して、患
者サンプル中のPBC、シェーグレン症候群、強皮症、SLE、自己免疫甲状腺炎なら
びにその他のさまざまな結合組織障害を検出する方法に関する。本発明はまた、
PBC、シェーグレン症候群、強皮症、SLE、自己免疫甲状腺炎ならびにその他のさ
まざまな結合組織障害を治療するために、このような治療を必要とする患者にお
ける遺伝子治療の工程において、PBCレトロウイルスの長い末端反復配列および
逆転写酵素ヌクレオチドを利用し、かつこれらを標的とする方法にも関する。本
発明はまた、サイトカイン、逆転写酵素の阻害剤、ウイルスキャッピング阻害剤
、およびウイルス性プロテアーゼの阻害剤などの抗ウイルス剤を用いてPBCレト
ロウイルス感染を治療または抑制する方法にも関する。本発明はさらに、組織サ
ンプル中のPBC、シェーグレン症候群、強皮症、SLE、自己免疫甲状腺炎ならびに
その他のさまざまな結合組織障害を検出するための診断手法およびキットにも関
する。
【０００２】2. 発明の背景 原発性胆汁性肝硬変および自己免疫 原発性胆汁性肝硬変(PBC)は、肝臓、膵臓、唾液腺および涙腺に影響を及ぼす
進行性多腺性疾患である(Neubergerら、1997、Lancet 250: 875-79; Epsteinら
、1980、Lancet 1: 1166-68)。肝疾患は、リンパ球の浸潤、および間葉胆管の30
〜80μmの大きさの肉芽腫性の破壊を伴う鮮紅色の胆管病変を特徴とする(Rubin
ら、1965、Am. J. Pathol. 46: 387-407)。肝移植以外に効果的な治療がなく、
患者は通常肝硬変を起こす(Neubergerら、1997、Lancet 250: 875-８79)。ヨー
ロッパでは肝硬変で死亡する患者が約2％を占め、北米では同所性肝移植を必要
とする患者が10％を占めると推定されている(Neubergerら、1997、Lancet 250:
875-８79)。
【０００３】 PBCは、患者が抗ミトコンドリア抗体(AMA)を有し、かつシェーグレン症候群、
強皮症、全身性エリテマトーデス(SLE)、自己免疫甲状腺炎ならびにその他のさ
まざまな結合組織障害などの他の自己免疫障害も伴うこともあるので、典型的な
自己免疫障害であると考えられている(Neubergerら、1997、Lancet 250: 875-87
9)。乾燥眼および口内乾燥の検査ではPBC患者の70％〜100％で陽性であることか
ら、シェーグレン症候群との臨床所見の重複は極めて顕著である(Alarcon-Segov
iaら、1973、Ann. Intern. Med. 79:31)。さらに、PBC患者では、尿路感染の確
率が増加しており(Burroughsら、1984、Gut 25: 133-7)、また、乳癌の危険性が
4倍増加する(Wolkeら、1984、Am. J. Med. 76: 1075)。
【０００４】 PBCに関連する自己免疫症状は特徴がよく分析されている。PBC患者の95％を超
える患者が、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体(PDC)のE2サブユニットのジヒ
ドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼに結合してその酵素機能を阻害する
抗体を有する)(Gershwinら、1992、2-オキソ酸デヒドロゲナーゼ複合体および抗
細菌抗体の分子生物学、Philadelphia W. B. Saunders)。これらのAMAは無脊椎
動物の上記デヒドロゲナーゼE2酵素より哺乳動物の該E2酵素に高い親和性を有し
ており、オキソグルタレートデヒドロゲナーゼ複合体中の他の高度に保存されて
いるミトコンドリア内膜タンパク質のE2サブユニット、および分枝鎖2-オキソ酸
デヒドロゲナーゼ複合体に反応し、ならびにPBCのE1αおよびE1βサブユニット
にも反応する。肝疾患を有する患者では、E2ミトコンドリア酵素に対する反応性
はPBCに特異的であるが、このAMAはシェーグレン症候群およびSLEを患っている
個体でも観察されている(Van-de-Waterら、1989、New Eng. J. Med. 320: 1377-
80)。PBC患者が、抗原に起因するヒトPDC-E2に対する免疫応答を有する理由は、
免疫組織学的研究の知見により一部は説明される。モノクローナルおよびコンビ
ナトリアルAMAを用いて、PDC-E2またはPDC-E2に類似の抗原が、培養PBC胆管上皮
細胞の表面(Joplinら、1992、Lancet 339: 93-94)、PBC患者組織の胆管上皮およ
びリンパ節のマクロファージ(Joplinら、1991、Hepatology 14: 442-447、Van-d
e-Waterら、1993、J. Clin. Invest. 91: 2654-64)、ならびにPBCおよびシェー
グレン症候群の患者の唾液腺(Tsuneyamaら、1994、Hepatology 20: 893-898)に
観察されている。要約すると、この多腺性疾患の進行により影響を受ける組織は
、上皮細胞表面上のPDC-E2抗原の異常な分布を有する疾患と同じである。
【０００５】 この疾患は、全人種で見られ、多くは女性が羅患する(Neubergerら、1997、La
ncet 250: 875-８79)。現在のところ、PBCの素因となる非HLA遺伝因子は同定さ
れていないが、陽性家族歴が該疾患発症の最大の危険性を示す(Sherlockら、199
3、「原発性胆汁性肝硬変：定義および疫学的特徴(Primary biliary cirrhosis:
definition and epidemiological features)」Kluwer Academic Publishers, D
oredrecht/Boston/London, pp.341-49)。家系に集中する症例がよく実証されて
おり、ある報告では、家系の羅患率が2.4％であることが証明されている(Sherlo
ckら、1993、「原発性胆汁性肝硬変：定義および疫学的特徴(Primary biliary c
irrhosis: definition and epidemiological features)」Kluwer Academic Publ
ishers, Doredrecht/Boston/London, 341-49pp)。HLAクラスI対立遺伝子はPBCに
関連していないが、他の免疫原性因子は重要な役割を担っていると考えられる。
【０００６】 PBCの感染性病因を示唆するデータは限られている。疾患の伝染は、無関係な
ケア提供者（care provider）で示されており、特に、英国のシェフィールド(Sh
effield)では水道とも関連していたということが、その後10年の経過観察研究で
再確認された(Sherlockら、1993、「原発性胆汁性肝硬変：定義および疫学的特
徴(Primary biliary cirrhosis: definition and epidemiological features)」
Kluwer Academic Publishers, Doredrecht/Boston/London, pp.341-49、Trigger
1980、Br. Med. J. 281: 772-5)。そのデータは議論の的となったが、PBCと関
連する特定の抗ミトコンドリア抗体は関連家系構成員および関連のない家系構成
員で検出された(Sherlockら、1993、(原発性胆汁性肝硬変：定義および疫学的特
徴Sherlockら、1993、「原発性胆汁性肝硬変：定義および疫学的特徴(Primary b
iliary cirrhosis: definition and epidemiological features)」Kluwer Acade
mic Publishers, Doredrecht/Boston/London, pp.341-49)。PBCの感染性病因に
関する更なる証拠は、同所性肝移植を受けたPBC患者の約15％の肝同種移植片で
再発性疾患が観察されたことから示される。この証拠には、肝移植後に胆管の肉
芽腫破壊が見られること、ほとんどのPBC患者で血清AMAが引き続いて存在するこ
と(Trigger 1980、Br. Med. J. 281: 772-5)、および同種移植片の胆管上皮細胞
表面上にPDH-E2が存在することが免疫組織化学的に証明されていること(Neuberg
erら、1982、N. Eng. J. Med. 306: 1-4)が含まれる。
【０００７】 PBCの疫学調査は、単純な感染性疾患のパターンを提示しない。感染性病因を
考えるのであれば、感染により、遺伝的、ホルモン性または環境的要因の影響の
変化のために感染しやすくなった個体にのみPBCが見られるということが推測さ
れる。このことにより、PBC患者がAMAおよび肝疾患を発症するが、家系内の他の
者がPBCではないのに血清AMA反応性を起こすことはほとんど無いということの理
由を一部説明することができる。多くの研究者が、放線菌またはR型腸内細菌の
どちらかが病因としてPBCに関係していると推論している。その理由は、これら
の菌は高度に保存されたデヒドロゲナーゼ酵素を有しており、宿主のタンパク質
を微生物の分子が模倣するという機序により自己免疫を誘導すると考えられるか
らである（O'Donohueら、1994、J. Hepatol. 21: 887-889；Stemerowiczら、198
8、Lancet 1: 1166-170）。他の研究者らは、再発性の尿路の細菌感染はこのよ
うな抗原の曝露が原因となり得るが（Burroughsら、1984、Gut 25: 133-7）、こ
の仮説では、偏在的に存在する自己抗原に対する免疫応答を有する胆管上皮に限
られた限定的な疾患に対する解釈が示されないという主張をしている。従って、
感染物質のPBCとの関連は未だ解明されないままである。
【０００８】3. 発明の概要 本発明はまず、PBCと関連する新規核酸分子の発見、同定および解析に関する
ものである。本発明のこの新規ヌクレオチド配列は、レトロウイルスに由来する
ものであり、PBCに関連性の強いPBCレトロウイルスを示唆するものである。本発
明は一部、PBC患者の組織に伝染性物質が存在するということを示唆する最初の
証拠となる本出願人らによるデータに基づいている。レトロウイルス感染物質の
PBCとの関連性は、移植の際に患者から得た門脈周囲のリンパ節と健全な胆管上
皮細胞とのin vitroでの共存培養により本出願人らが最初に示した。出願人らの
発見から、本明細書に記載するとおり、電子顕微鏡観察およびイムノブロットに
おける反応性により示されるように、レトロウイルスウイルスであるPBC関連感
染物質の特性解析が報告される。加えて、本出願人はPBC関連レトロウイルスと
関連する新規ヌクレオチド配列を特定した。
【０００９】 本発明は、以下のヌクレオチド配列：(a) 本明細書中に開示するPBCレトロウ
イルス配列を含むヌクレオチド配列、および(b) PBC、シェーグレン症候群、強
皮症、SLE、自己免疫甲状腺炎、その他のさまざまな結合組織障害およびリンパ
腫の危険性のある個体またはこれらの障害を示す個体を特定および診断する本発
明の方法において、プローブまたはプライマーとして使用するPBCレトロウイル
スヌクレオチドの一部または断片を含有するヌクレオチド配列、を含む核酸分子
を包含する。
【００１０】 本発明はまた、上記の核酸分子の発現産物、即ち、上記のPBCレトロウイルス
核酸分子またはその縮重体(例えば、対立遺伝子変異体)によりコードされるタン
パク質および/またはポリペプチドを包含する。
【００１１】 本発明の構成要素にはさらに、低分子、高分子、抗体、およびPBCレトロウイ
ルス遺伝子の発現を阻害するために用いることができるヌクレオチド配列(例え
ば、アンチセンス、リボザイム分子および遺伝子または調節配列を置換した構築
物)を含むPBCレトロウイルス遺伝子産物のアンタゴニストも含まれる。
【００１２】 本発明は、PBCレトロウイルスヌクレオチドの存在に関連する疾患および障害
の治療または予防のための治療方法および医薬組成物に関する。係る疾患および
障害は、PBC、シェーグレン症候群、強皮症、SLE、自己免疫甲状腺炎およびその
他のさまざまな結合組織障害を含むが、これらに限定はしない。本発明の治療方
法および医薬組成物は、アンチセンス分子およびリボザイムなどのように、PBC
レトロウイルスヌクレオチドを標的とするように設計される。本発明の治療方法
および組成物はまた、低分子、高分子および抗体を含むPBCレトロウイルス遺伝
子産物を標的とするようにも設計される。本発明はさらに、PBCレトロウイルス
ヌクレオチドの存在と関連する障害を治療および/または予防するための、単離
したPBC関連ウイルス粒子の弱毒化型および/またはPBCレトロウイルス遺伝子産
物に基づくワクチン製剤に関する。
【００１３】 さらに、本発明は、PBCレトロウイルス感染ならびに/またはPBC、シェーグレ
ン症候群、強皮症、SLE、自己免疫甲状腺炎およびその他のさまざまな結合組織
障害を含む(これらに限定はしない)関連疾患の診断評価、遺伝子検査および予後
のための、本発明のヌクレオチド配列を用いる方法を提示する。例えば、一実施
形態では、本発明は、PBCレトロウイルス感染および/または関連障害を診断する
方法であって、係る障害を示す疑いがある患者のサンプルにおけるPBCレトロウ
イルス遺伝子発現を測定することを含む方法に関する。一実施形態では、本発明
の核酸分子は、PBCレトロウイルスの存在、ならびに/または関連疾患である、PB
C、シェーグレン症候群、強皮症、SLE、自己免疫甲状腺炎、その他のさまざまな
結合組織障害およびリンパ腫と関連するPBCレトロウイルスヌクレオチドを同定
するための診断的PCR分析におけるプライマーとして用いることができる。さら
に他の実施形態では、本発明の核酸分子を用いて、乳房組織以外の組織サンプル
(例えば、肝組織または血清サンプル)中でもPBC感染が見られる患者の乳癌を検
出することができる。他の実施形態では、抗体または血清学的アッセイを用いて
、乳房組織以外の組織サンプル(例えば、肝組織または血清)中でもPBCレトロウ
イルスの感染が見られる患者の乳癌を検出することができる。さらに他の実施形
態では、本発明の核酸分子を治療的PCR分析におけるプライマーとして用いて、
治療手法の効果を決定するためにPBCレトロウイルスの存在をモニターすること
ができる。
【００１４】 更に他の実施形態では、本発明はPBC特異的抗体に対する患者サンプルの免疫
反応性に基づく診断評価および予後の方法に関連する。この実施形態では、PBC
陽性患者から得た単離血清、PBC関連ウイルスに対して特異性を有するモノクロ
ーナル抗体またはポリクローナル抗体を、診断方法としてまたは治療手法の効果
を決定する方法としての患者サンプル中のPBC関連レトロウイルスの検出に用い
ることができる。
【００１５】 更に他の実施形態では、本発明はPBCレトロウイルスに感染した個体の治療方
法に関する。特に、本発明は、PBCレトロウイルスに感染した個体におけるウイ
ルス複製および疾患症状を制御するための抗ウイルス治療および免疫制御治療の
組合せに関する。本発明はさらに、遺伝的に蓋然性の高い個体に対して疾患を予
防するためのワクチンおよび他の予防処置に関する。
【００１６】3.1 定義 本明細書中で、オリゴヌクレオチドタグについて用いる用語「相補的」または
「タグ相補的」は、オリゴヌクレオチドタグが特異的にハイブリダイズして、好
ましくは二重鎖または三重鎖を形成するオリゴヌクレオチドをいう。特異的ハイ
ブリダイゼーションにより三重鎖となる実施形態では、オリゴヌクレオチドタグ
は二本鎖または一本鎖のどちらかになるように選択するとよい。従って、三重鎖
が形成される場合、「相補的」という用語は、一本鎖オリゴヌクレオチドタグに
相補的な二本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドタグに相補的な一本鎖のどちら
かを意味する。
【００１７】 本明細書中で用いる用語「オリゴヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオシ
ド、リボヌクレオシド、それらのアノマー型、ペプチド核酸(PNAs)などを含む、
天然のもしくは改変されたモノマーまたは結合物の直鎖状オリゴマーであって、
標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し得るものを含む。特定の結合は、ワトソ
ン-クリック型の塩基対形成、塩基スタッキング、フーグスティーン型または逆
フーグスティーン型塩基対形成などのようなモノマーとモノマーの相互作用の一
般的な様式により規定される。通常、モノマーがホスホジエステル結合またはそ
の類似物により結合して、サイズが数個(例えば、3〜4個)から数十個のモノマー
単位からなる範囲内にあるオリゴヌクレオチドを形成している。「ATGCCTG」の
ような文字列によりオリゴヌクレオチドを示す際は、他に注釈が無い限り常に、
ヌクレオチドは左から右に5'から3'への方向であり、「A」はデオキシアデノシ
ン、「C」はデオキシシチジン、「G」をデオキシグアノシン、および「T」はチ
ミジンを示すと解する。ホスホジエステル結合の類似物には、ホスホロチオエー
ト、ホスホロジチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホルアミデートなどを
含む。天然または非天然のヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドを用いる
場合が当業者には自明であり、例えば、いわゆる酵素によるプロセシングには一
般的に天然のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが要求される。二重鎖に
関して用いられる「完全にマッチする」という用語は、二重鎖を形成しているポ
リヌクレオチド鎖またはオリゴヌクレオチド鎖が、各々の鎖の各ヌクレオチドが
他方の鎖のヌクレオチドとワトソン-クリック型塩基対形成を起こすように一緒
に二本鎖構造を形成することを意味する。この用語はまた、デオキシイノシン、
2-アミノプリン塩基を有するヌクレオシドなどの利用可能なヌクレオシド類似体
の対形成も包含する。三重鎖について用いる場合は、この用語は、三重鎖が、完
全にマッチした二重鎖と、各ヌクレオチドが完全にマッチした二重鎖の塩基対と
フーグスティーン型または逆フーグスティーン型で対合する三本目の鎖からなる
ことを意味する。逆に、タグとオリゴヌクレオチドの二重鎖内の「ミスマッチ」
とは、二重鎖または三重鎖内の１対のヌクレオチドまたは1組の3個のヌクレオチ
ドがワトソン-クリック型および/またはフーグスティーン型および/または逆フ
ーグスティーン型で結合できないことをいう。例えば、当技術分野で公知の標識
、メチル化、「キャップ形成」、および1個以上の天然に存在するヌクレオチド
を類似体で置換するなどの公知のタイプの修飾、および電荷のない結合物(例え
ば、ホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート
など)、および電荷をもつ結合物(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオ
エートなど)、タンパク質(例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド
、ポリ-L-リジンなど)などの分枝部分、インターカレート剤(例えば、アクリジ
ン、プソラレンなど)、キレーター（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化
金属など）、アルキル化剤、改変型結合物（例えば、α-アノマー核酸など）な
どでのヌクレオチド内修飾されたものならびに非修飾のポリヌクレオチドもまた
これに包含される。
【００１８】 本明細書中で用いる用語「ヌクレオシド」は、2'-デオキシおよび2'-ヒドロキ
シル型を含む天然ヌクレオシドを含む（KorbergおよびBaker、DNA複製（DNA rep
lication）、第2版、Freeman, San Francisco, 1992などに記載されている通り
である）。ヌクレオシドについて用いられる「類似体」とは、修飾された塩基部
分および/または修飾された糖部分を有する合成ヌクレオシド（Scheit、Nucleot
ide Analogs (John Wiley, New York, 1980、UhlmanおよびPeyman, Chemical Re
view, 90: 543-584, 1990などに記載されている)であって、ハイブリダイズ可能
であるとの但し書のあるものを含む。このような類似体は、設計によって、結合
特性の増大した、縮重の低減された、特異性を増大または低減された合成ヌクレ
オシド等を含む。
【００１９】 本明細書中で用いる場合、指定の配列に「由来する」ポリヌクレオチドとは、
指定の配列の少なくとも約６ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８ヌクレオ
チド、より好ましくは少なくとも約10〜12ヌクレオチド、および一層好ましくは
少なくとも約15〜20ヌクレオチド程度の一部分を指す。「相当する」という語は
、指定の配列に対して相同または相補的であることを意味する。好ましくは、該
ポリヌクレオチドが由来する領域の配列はPBC関連ウイルスのゲノムに特有の配
列に対して相同または相補的である。より好ましくは、由来する配列は、PBC関
連ウイルスの単離株の全てまたはその大部分に特有の配列に対して相同または相
補的である。配列がPBC関連ウイルスゲノムに特有なものであるか否かは、当業
者に公知の技法によって決定できる。例えば、感染していない宿主または他の生
物に存在するか否かを調べるために配列をデータバンク（例えば、Genebank）に
ある配列と比較することができる。配列を他のウイルス性物質（レトロウイルス
を含む）の公知の配列と比較することもできる。由来する配列が他の配列に相当
するものであるか否かは、適当なストリンジェントの条件下でハイブリダイゼー
ションによっても調べることができる。核酸配列の相補性を調べるためのハイブ
リダイゼーション技術は当技術分野に公知であり、本明細書中で後述する。また
、例えばManiatisら（1982）の記載を参照のこと。さらに、ハイブリダイゼーシ
ョンにより形成された二重鎖ポリヌクレオチドのミスマッチを公知の技法で調べ
ることができる。この技法には、例えば、二重鎖ポリヌクレオチド内の一本鎖部
分を特異的に消化するS1ヌクレアーゼなどのヌクレアーゼによる消化などが含ま
れる。典型的なDNA配列が「由来する」領域には、限定する意味ではないが、例
えば、特異的エピトープ、ならびに、非転写および/または非翻訳領域をコード
する領域などが含まれる。
【００２０】 由来するポリヌクレオチドは、必ずしも示したヌクレオチド配列に物理的に由
来するものである必要はなく、化学合成、DNA複製または逆転写もしくは転写を
含むあらゆる方法で作製され得る。さらに、指定の配列の領域に相当する領域の
組合せは、意図された用途に合うように当技術分野に公知の方法で改変すること
ができる。
【００２１】 本明細書中で用いる用語「組換えポリヌクレオチド」は、起源がゲノム、cDNA
、半合成物または合成物であるポリヌクレオチドをさす。該用語はさらに、（1
）天然では対合するポリヌクレオチドの全部分または一部分と対合しないポリヌ
クレオチド；（2）天然では結合しているポリヌクレオチド以外のポリヌクレオ
チドと結合しているポリヌクレオチド；または（3）天然には存在しないポリヌ
クレオチドも包含する。
【００２２】 本明細書中で用いる場合、核酸の「センス鎖」はｍRNAの配列に配列相同性を
有する配列を含有する。「アンチセンス鎖」は、「センス鎖」に相補的な配列を
含有する。
【００２３】 本明細書中で用いる用語「プライマー」は、適切な条件下で起こるポリヌクレ
オチド鎖の合成開始点として作用し得るオリゴマーをいう。プライマーは、ポリ
ヌクレオチド鎖のコピーされる領域に対して完全にまたは実質的に相補的である
。従って、ハイブリダイゼーションを誘導する条件下では、プライマーは分析対
象の鎖の相補的領域にアニールする。適切な反応試薬（例えば、ポリメラーゼ、
ヌクレオチド三リン酸類など）を添加することにより、プライマーはポリマー化
試薬により伸長されて分析対象の鎖のコピーを生成する。プライマーは一本鎖ま
たは一部もしくは全部が二本鎖であってよい。
【００２４】 用語「分析対象のポリヌクレオチド」および「分析対象の鎖」は、標的配列を
含有していると考えられ、かつ生物学的サンプル中に存在し得る一本鎖または二
本鎖の核酸分子をいう。本明細書中で用いる用語「オリゴマー」はプライマーお
よびプローブをさす。オリゴマーという語は、分子のサイズを示唆する意味はな
い。
【００２５】 本明細書中で用いる用語「プローブ」は、プローブ中の少なくとも1つの配列
が標的領域の配列に対して相補的であることにより標的配列とハイブリッド構造
を形成するポリヌクレオチドの構造をさす。プローブのポリヌクレオチド領域は
、DNAおよび/もしくはRNAならびに/または合成ヌクレオチド類似体から構成され
得る。プローブには、「補択プローブ」および「標識プローブ」が含まれる。好
ましくは、プローブは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を開始するために用いる
配列に相補的な配列を含有しない。
【００２６】 本明細書中で用いる用語「標的領域」は増幅および/または検出される核酸の
領域をいう。用語「標的配列」は、所望の条件下でプローブまたはプライマーと
安定なハイブリッドを形成する配列をいう。
【００２７】 本明細書中で用いる用語「ウイルスRNA」は、PBC関連RNAを含み、ウイルスゲ
ノム、その断片、その転写物、およびそれから誘導される変異配列に由来するRN
Aをいう。
【００２８】 本明細書中で用いる用語「生物学的サンプル」は、個体から単離された組織ま
たは体液のサンプルをいう。従って、「生物学的サンプル」には、例えば、血漿
、血清、髄液、リンパ液、皮膚の外部部位、気道、腸管および尿生殖路、涙、唾
液、乳、血液細胞、腫瘍、器官、ならびにin vitro細胞培養構成成分のサンプル
（限定はしないが、細胞培養培地中で細胞を増殖させることにより得られるなら
し培地、ウイルス感染が推測される細胞、組換え細胞および細胞構成成分を含む
）が含まれるが、これらに限定はしない。
【００２９】4. 図面の簡単な説明 図面の簡単な説明については後述する。
【００３０】5. 詳細な説明 本発明は、PBC患者の組織サンプルから単離したPBCレトロウイルスの発見、同
定および特性解析に基づいている。単離されたウイルス調製物はPBC患者の肝お
よび皮膚組織から得た。ウイルスを単離して、総RNAを抽出し、ランダムプライ
マーおよび逆転写酵素を用いてcDNAに変換した。今まで同定されていなかった新
規の外因性ヒトレトロウイルス配列が患者組織サンプルから増幅された。
【００３１】 本発明は、新規のPBC関連ヒトレトロウイルス（本明細書では「PBCレトロウイ
ルス」と呼ぶ）の単離調製物に関する。本発明は、新規のヒトレトロウイルスの
単離ゲノムならびに該ゲノムをコードするヌクレオチドおよび核酸分子に関する
。本発明は、PBC、シェーグレン症候群、強皮症、SLE、自己免疫甲状腺炎および
その他のさまざまな結合組織障害を示すまたはこれらの危険性を有する個体を特
定および診断するためみ、本発明の方法においてプローブまたはプライマーとし
て利用できるPBCレトロウイルスヌクレオチドの一部分または断片を包括するヌ
クレオチド配列に関する。
【００３２】 本発明は、PBCレトロウイルス感染およびPBC、シェーグレン症候群、強皮症、
SLE、自己免疫甲状腺炎およびその他のさまざまな結合組織障害を含む関連疾患
の診断評価および予後評価の方法を包含する。一実施形態では、これらの方法は
、本発明の核酸分子を利用してPBCレトロウイルスヌクレオチド配列のレベルを
測定することを含む。他の実施形態では、これらの方法は、PBCレトロウイルス
に特異的な血清、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いて、患者サン
プル中のPBCウイルスおよび/またはウイルスタンパク質のレベルを測定すること
を含む。
【００３３】 本発明はさらに、係る方法を実践するための診断キットを提供する。
【００３４】 本発明は、PBCレトロウイルスの感染および/またはPBCレトロウイルスヌクレ
オチド配列の存在に関連する疾患および障害（PBC、シェーグレン症候群、強皮
症、SLE、自己免疫甲状腺炎およびその他のさまざまな結合組織障害を含むが、
これらに限定はしない）の治療および予防のための治療方法および医薬組成物に
関する。該治療方法および組成物では、アンチセンス分子およびリボザイムなど
のように、PBCレトロウイルスヌクレオチドを標的とするように設計される。本
発明の治療方法および組成物では、低分子、高分子および抗体を含むPBCレトロ
ウイルス遺伝子産物を標的とするようにも設計される。特に、本発明は診断手法
での組織サンプル中のPBCレトロウイルス検出用の、ならびに/またはPBCレトロ
ウイルス感染および関連障害（PBC、シェーグレン症候群、強皮症、SLE、自己免
疫甲状腺炎、その他のさまざまな結合組織障害、リンパ腫および乳癌）の治療お
よび/もしくは予防のためのワクチン調製物製剤用の抗体を産生するために、単
離PBCレトロウイルスおよびレトロウイルス遺伝子産物の使用を包含する。
【００３５】5.1 PBCレトロウイルスヌクレオチド 本発明のレトロウイルスヌクレオチドは本明細書中に記載する。注釈が無い限
り、用語「レトロウイルスまたはウイルスのヌクレオチドまたは核酸分子」は、
本明細書に記載の配列を集合的に指すこととする。本発明の新規のヒトレトロウ
イルスヌクレオチドは、PBC患者由来のサンプル内で同定された新規クローンを
含むが、限定はしない。
【００３６】 下記のクローンは、PBC患者3人から得たBEC cDNAライブラリーから単離された
。
【００３７】
【００３８】 下記のクローンは、MMTV LTR およびMMTV pol 配列中の保存されているヌクレ
オチドに相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、PBC患者から得たBEC cDNAライブラリーから単離された。
【００３９】
【００４０】 以下のクローンは、異なるPBC患者の胆汁サンプルから得られた。
【００４１】
【００４２】 以下のクローンは、少なくとも8人のPBC患者のBEC cDNAライブラリーおよび胆
汁サンプルから得られた。
【００４３】
【００４４】 本発明のPBC関連ヒトレトロウイルスヌクレオチド配列には、（a）本発明のPB
Cレトロウイルスゲノムの一部をコードするヌクレオチド配列またはその断片（
例えば配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、11、12、13、14また
は15等）、（b）PBCレトロウイルスゲノム、またはその一部、突然変異体もしく
は対立遺伝子変異体をコードする配列番号１、２，３、４、５、６、７、８、９
、10、11、12、13、14または15を含むヌクレオチド配列、（c）レトロウイルス
遺伝子産物をコードする本明細書中に開示される新規ヒトレトロウイルス配列を
含むヌクレオチド配列、およびその断片、ならびに（d）配列番号１、２、３、
４、５、６、７、８、９、10、11、12、13、14もしくは15の中のヌクレオチド配
列（例えばプライマー）、またはその一部であって、PBC、シェーグレン症候群
、強皮症、SLE、自己免疫性甲状腺炎、および他の様々な結合組織障害を示す危
険性のある個体を特定および診断するための本発明の方法の一部として使用する
ことができるものが含まれる。
【００４５】 本発明のPBCレトロウイルスヌクレオチド配列はさらに、（a）高ストリンジェ
ント条件下（例えば、65℃の0.5M NaHPO4、7％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）
、1mM EDTAにおけるフィルタ結合DNAへのハイブリダイゼーション、および68℃
の0.1×SSC/0.1％ SDS中での洗浄など（Ausubel F.M.ら編, 1989, Current Prot
ocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc.,
およびJohn Wiley & sons, Inc., New York, at p.2.10.3））で、PBCレトロウ
イルス遺伝子産物をコードする核酸分子の相補体にハイブリダイズする任意のヌ
クレオチド配列を含む。好適な実施形態において、このような核酸分子は、PBC
レトロウイルス遺伝子産物に機能的に同等な遺伝子産物をコードする。また、本
発明のPBCレトロウイルスヌクレオチド配列はさらに、（b）中程度のストリンジ
ェント条件下などのストリンジェンシーがより低い条件下（例えば、42℃の0.2
×SSC/0.1％ SDS中での洗浄など（Ausubelら, 1989（前掲））で、PBCレトロウ
イルス遺伝子産物をコードする核酸分子の相補体にハイブリダイズする任意のヌ
クレオチド配列であって、機能的に同等なPBCレトロウイルス遺伝子産物をコー
ドするものを含む。本発明は、ヒトから得た単離ヌクレオチド配列（ヒトゲノム
の内因性または外因性のもの）に関する。
【００４６】 本発明の核酸分子の中には、高ストリンジェント条件下又は中程度のストリン
ジェント条件下で上記PBCレトロウイルス核酸分子にハイブリダイズするデオキ
シオリゴヌクレオチド（「オリゴ」）がある。高ストリンジェント条件の例につ
いては、例えば（14塩基オリゴの場合）37℃、（17塩基オリゴの場合）48℃、（
20塩基オリゴの場合）55℃、（23塩基オリゴの場合）60℃の6×SSC/0.05％ピロ
リン酸ナトリウム中での洗浄を参照されたい。これらの核酸分子は、例えばPBC
レトロウイルス遺伝子調節において有用なアンチセンス分子をコードするまたは
このようなアンチセンス分子として機能し、および/またはPBCレトロウイルス遺
伝子核酸配列の増幅反応におけるアンチセンスプライマーとして機能することが
できる。さらに、このような配列は、リボザイムおよび/または３重らせん配列
の一部として使用することができ、また、PBCレトロウイルス遺伝子の調節に有
用であり得る。さらに、このような分子は、例えばPBC、シェーグレン症候群、
強皮症、SLE、自己免疫性甲状腺炎、および他の様々な結合組織障害等の障害に
関与する特定のPBCレトロウイルス核酸分子の存在を検出することができる診断
方法の成分として使用することができる。
【００４７】 PBCレトロウイルス核酸分子の断片は、少なくとも10ヌクレオチド長であり得
る。他の実施形態において、該断片は、約20、30、40、50、60、70、80、90、10
0、200、300、400、500、1000ヌクレオチド長、またはそれ以上のヌクレオチド
長であってもよい。あるいは、該断片は、PBCレトロウイルス遺伝子産物の少な
くとも10、20、30、40、50、100、またはそれ以上の連続するアミノ酸残基をコ
ードする配列を含むことができる。
【００４８】 本発明のPBCレトロウイルスヌクレオチド配列は、例えば標準的な配列決定法
によって簡単に得ることができ、その配列は本明細書中に記載されている。
【００４９】 PBCレトロウイルスゲノム遺伝子の他の対立遺伝子変異体および他の種（例え
ばマウス）に由来する相同体のクローニングに関して、本明細書中に開示された
単離PBCレトロウイルス遺伝子配列を標識し、目的とする生物（例えばモルモッ
ト、ウシ、およびマウス）に由来する適当な細胞または組織（例えば脳および網
膜組織）から得たmRNAから構築したcDNAライブラリーをスクリーニングするため
に使用することができる。そのcDNAライブラリーが標識した配列が由来する生物
とは異なるタイプの生物に由来する場合、使用するハイブリダイゼーション条件
は、一般には低いストリンジェンシーでなければならない。
【００５０】 あるいは、標識した断片を用い、適当なストリンジェント条件を用いて、再度
目的の生物に由来するゲノムライブラリーをスクリーニングすることもできる。
低ストリンジェンシー条件は当業者に周知であり、そのライブラリーおよび標識
配列が由来する特定の生物によって予測可能に変更することができる。このよう
な条件に関するガイダンスとして、例えばSambrookら, 1989, Molecular Clonin
g, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, N.Y.;
およびAusubelら, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Pub
lishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.を参照されたい。
【００５１】 さらに、PBCレトロウイルスゲノム対立遺伝子変異体は、例えば、本明細書中
に開示したヌクレオチド配列に基づいて設計された２つの縮重オリゴヌクレオチ
ドプライマーのプールを用いてPCRを行うことにより、ヒト核酸から単離するこ
とができる。この反応に使用される鋳型は、例えば、レトロウイルスゲノム対立
遺伝子を発現することが分かっているまたは疑われるヒトもしくは非ヒト細胞系
または組織（例えばPBCを保有する個体に由来する肝組織など）から調製したmRN
Aの逆転写により得たcDNAであってもよい。
【００５２】 PCR産物をサブクローニングし、配列決定して、増幅配列がPBCレトロウイルス
ゲノム核酸配列の配列であることを確認することができる。次に、PCR断片を用
いて様々な方法により全長cDNAクローンを単離することができる。例えば、増幅
断片を標識し、これを用いてバクテリオファージcDNAライブラリーをスクリーニ
ングすることができる。あるいは、標識断片を用いてゲノムライブラリーのスク
リーニングによりゲノムクローンを単離することができる。
【００５３】 また、PCR技法およびcDNA末端の高速増幅（RACE）を用いて、全長cDNA配列を
単離することもできる。特に、本発明の核酸を用いて、患者のサンプル、感染性
胆管上皮細胞から、またはPBC肝臓cDNAライブラリーの完全表示（full represen
tation）をスクリーニングすることにより、PBC関連ウイルスゲノムを単離する
ことができる。
【００５４】 本発明に従って、レトロウイルスのゲノム核酸分子の同定について、レトロウ
イルス粒子の存在を、当業者に公知である常套的なプロトコール（例えば、培養
細胞、肝臓内胆管上皮細胞、培養胆管上皮細胞、リンパ系細胞（lymphonoid cel
l）、HepG2、HCCおよびRH9乳突リンパ節 （lympholoastoid）細胞系とPBC患者に
由来する肝組織またはリンパ節組織との共存培養サンプル等）を用いて検出する
ことができる。レトロウイルス感染の証拠は、RT-PCR、細胞形態学、電子顕微鏡
法、およびvirla抽出物のウェスタンブロットにより検出することができる。濾
過により得たRNAを用いてウイルスゲノムを単離することもできる。
【００５５】 さらに本発明によれば、標準的な手法に従って、適当な細胞起源または組織起
源（すなわち、PBCレトロウイルスゲノムを発現することが分かっているまたは
疑われる細胞起源または組織起源、例えばPBC患者から生体組織検査（肝生検等
）により得た肝組織サンプルまたは肝切除試料または死後検体等）からRNAを単
離することができる。第１鎖合成のプライミングのために増幅断片の最も5’側
の端部に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、該RNAに対して逆転
写反応を行うことができる。次に、得られたRNA/DNAハイブリッドに標準的な末
端トランスフェラーゼ反応を用いてグアニンで「テイルを付け」、このハイブリ
ッドをリボヌクレアーゼHで消化した後、ポリCプライマーで第２鎖合成をプライ
ミングすることができる。このように、増幅断片の上流のcDNA配列は簡単に単離
することができる。使用することができるクローニング法の概説については、例
えばSambrookら, 1989(前掲)を参照されたい。
【００５６】 例えば当業者に周知の技法であるPCRによって、PBCレトロウイルスゲノムの突
然変異対立遺伝子変異体のcDNAを単離することができる。この場合、第１のcDNA
鎖は、突然変異PBCレトロウイルス対立遺伝子を保有すると推定される個体にお
いて発現されることが分かっているまたは疑われる、組織から単離したmRNAに、
オリゴ-dTオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、逆転写酵素を用いて新し
い鎖を伸長させることによって、合成することができる。次に、正常な遺伝子の
5’側末端に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを用いてcDNAの第
２の鎖を合成する。次に、これら２つのプライマーを用いて、該産物をPCRによ
り増幅し、適切なベクター中にクローニングし、当業者に周知である方法によっ
てDNA配列分析にかける。突然変異PBCレトロウイルス対立遺伝子のDNA配列を正
常なPBCレトロウイルス対立遺伝子のDNA配列と比較することにより、突然変異PB
Cレトロウイルス遺伝子産物の機能の低下または変化の原因となる突然変異を確
認することができる。
【００５７】 あるいは、突然変異PBCレトロウイルス対立遺伝子を保有することが分かって
いるまたは疑われる個体から得たDNAを用いてゲノムライブラリーを構築するこ
とができる。または、突然変異PBCレトロウイルス対立遺伝子を発現することが
分かっているまたは疑われる組織に由来するRNAを用いてcDNAライブラリーを構
築することができる。次に、非損傷PBCレトロウイルスゲノムまたはその任意の
適当な断片を標識し、このようなライブラリーの中の対応する突然変異PBCレト
ロウイルス対立遺伝子を同定するためのプローブとして使用することができる。
次に、突然変異PBCレトロウイルス配列を含むクローンを精製し、当業者に周知
の方法に従って配列分析にかける。
【００５８】 さらに、例えばこのような突然変異対立遺伝子を保有することが分かっている
または疑われる個体において、突然変異PBCレトロウイルス対立遺伝子を発現す
ることが分かっているまたは疑われる組織から単離したRNAから合成したcDNAを
用いて発現ライブラリーを構築することができる。このように、推定突然変異組
織により産生された遺伝子産物は、以下の第5.3節に記載するように、正常なPBC
レトロウイルス遺伝子産物に対する抗体と一緒に標準的な抗体スクリーニング技
法を用いて、発現およびスクリーニングすることができる（スクリーニング技法
については、例えばHarlowおよびLane編, 1988, “Antibodies: A Laboratory M
anual”, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harborを参照されたい）。
【００５９】 また本発明は、前の段落のヌクレオチド配列の相補体である核酸分子、好まし
くはDNA分子も含む。
【００６０】5.2. PBCレトロウイルスゲノムのタンパク質産物 PBCレトロウイルス遺伝子産物、またはそのペプチド断片は、様々な用途のた
めに調製することができる。例えば、このような遺伝子産物またはそのペプチド
断片は、診断アッセイ用の抗体の生成のため、またはPBC、シェーグレン症候群
、強皮症、SLE、自己免疫性甲状腺炎、および様々な結合組織障害等の障害の制
御に関与する他の細胞内もしくは細胞外遺伝子産物の同定のために使用すること
ができる。
【００６１】 さらに、PBCレトロウイルスのゲノム産物は、機能的に同等な遺伝子産物であ
るタンパク質を含み得る。機能的に同等な遺伝子産物には、例えば上記第5.1節
で記載したPBCレトロウイルス核酸分子のうちのいずれかによりコードされる遺
伝子産物が含まれ得る。好適な実施形態において、このような機能的に同等なPB
Cレトロウイルス遺伝子産物は天然に生じる遺伝子産物である。このような同等
なPBCレトロウイルス遺伝子産物は、欠失（中間部欠失を含む）、付加（融合タ
ンパク質を生成する付加を含む）、または上記5.1節に記載したPBCレトロウイル
ス遺伝子配列によりコードされるアミノ酸配列の中のおよび/またはそれに隣接
するアミノ酸残基の置換であって、同じ活性を有するPBCレトロウイルス遺伝子
産物を産生する変化のうち、「サイレント」変化をもたらすようなものを含み得
る。
【００６２】 アミノ酸置換は、関係する残基の極性、電荷、可溶度、疎水性、親水性、およ
び/または両親媒性特性における類似性に基づいて行うことができる。例えば、
非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、
プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれ、極性
中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、ア
スパラギン、およびグルタミンが含まれ、正電荷（塩基性）アミノ酸にはアルギ
ニン、リジンおよびヒスチジンが含まれ、そして負電荷（酸性）アミノ酸にはア
スパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。
【００６３】5.3. PBCレトロウイルス遺伝子産物に対する抗体 本明細書中には、PBCレトロウイルス遺伝子産物の保存的変異体またはペプチ
ド断片の１以上のPBCレトロウイルス遺伝子産物エピトープを特異的に認識する
ことができる抗体の産生方法が記載される。さらに、PBCレトロウイルスの突然
変異形態を特異的に認識する抗体は、本発明によって包含される。
【００６４】 このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（mAbs）、ヒ
ト化もしくはキメラ抗体、一本鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメン
ト、Fab発現ライブラリーにより産生されるフラグメント、抗イデオタイプ（抗-
Id）抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメント（ポリクローナ
ル抗体およびモノクローナル抗体を含む）が含まれるがこれらに限定されない。
このような抗体は、例えば生物学的サンプル中のPBCレトロウイルス遺伝子産物
の検出に使用することができ、よって、患者のPBCレトロウイルス遺伝子産物の
異常レベルについて、および/またはこのような遺伝子産物の異常形態の存在に
ついてテストすることができる、診断もしくは予後技法の一部として用いること
ができる。このような抗体を例えば化合物のスクリーニングスキームと一緒に用
いて、PBCレトロウイルス遺伝子産物のレベルおよび/または活性に及ぼすテスト
化合物の影響を評価することもできる。さらに、このような抗体は、以下に記載
する遺伝子療法技術と一緒に用いて正常なおよび/または遺伝子操作したPBCレト
ロウイルスゲノム発現細胞を患者に導入する前に評価することができる。
【００６５】 抗PBCレトロウイルス遺伝子産物抗体はさらに、医薬製剤に用いることができ
、またPBCレトロウイルス感染、ならびにシェーグレン症候群、強皮症、SLE、自
己免疫性甲状腺炎、様々な結合組織障害、乳癌およびリンパ腫等の関連障害の治
療および/または予防方法に使用することができる。
【００６６】 PBCレトロウイルスの遺伝子産物またはPBCレトロウイルスに対する抗体を産生
するために、PBCレトロウイルス遺伝子産物またはPBCレトロウイルス粒子を注射
して様々な宿主動物を免疫することができる。このような宿主動物にはウサギ、
マウス、およびラット（ほんの一例に過ぎない）が含まれるがこれらに限定され
ない。宿主種に応じて様々なアジュバントを用い、免疫学的応答を増大させるこ
とができる。このようなアジュバントには、フロイントの（完全および不完全）
アジュバント、水酸化アルミニウム等のミネラルゲル（mineral gel）、リゾレ
シチン等の界面活性剤、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油
エマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およ
びBCG（カルメット-ゲラン杆菌）やコリネバクテリウム・パルヴム等の潜在的に
有用なヒトアジュバントが含まれるが、これらに限定されない。
【００６７】 ポリクローナル抗体は、抗原またはその抗原性機能を持つ誘導体で免疫した動
物の血清に由来する抗体分子の不均一集団である。ポリクローナル抗体を産生す
るためには、PBCレトロウイルス遺伝子産物またはウイルス粒子に上記のような
アジュバントを加えたものを注射することにより、上記のような宿主動物を免疫
することができる。
【００６８】 特定の抗原に対する抗体の均一集団であるモノクローナル抗体は、細胞系の連
続培養により抗体分子を産生する任意の技法によって得ることができる。これら
には、KohlerおよびMilsteinのハイブリドーマ技法(1975, Nature 256:495-497;
および米国特許第4,376,110号)、ヒトB細胞ハイブリドーマ技法（Kosborら, 198
3, Immunology Today 4:72; Coleら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:20
26-2030）およびEBV-ハイブリドーマ技法（Coleら, 1985, Monoclonal Antibodi
es And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96）が含まれるが、これ
らに限定されない。このような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgAおよびIgDを含むあ
らゆるイムノグロブリンクラスならびにそのあらゆるサブクラスのものであって
もよい。この発明のmAbを産生するハイブリドーマは、in vitroまたはin vivoで
培養することができる。高力価のmAbsのin vivo産生により、現在のところこれ
が好適な産生方法となっている。
【００６９】 さらに、適当な抗原特異性を有するマウス抗体分子からの遺伝子を適当な生物
学的活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子と一緒にスプライシングすることに
より「キメラ抗体」を産生するために開発された技法（Morrisonら, 1984, Proc
. Natl. Acad. Sci., 81:6851-6855; Neubergerら, 1984, Nature 312:604-608;
Takedaら, 1985, Nature, 314:452-454）を用いることができる。キメラ抗体は
、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、例えばマウスmAbに由来す
る可変領域とヒトイムノグロブリンの定常領域とを有する分子等がそうである。
（例えばCabillyらの米国特許第4,816,567号；およびBossらの米国特許第4,816,
397号（本明細書中に参考として全て組みこまれる）を参照されたい）。
【００７０】 さらに、ヒト化抗体を産生するための技法も既に開発されている（例えば本明
細書中に参考として全て組みこまれるQueenの米国特許第5,585,089号を参照され
たい）。イムノグロブリンの軽鎖または重鎖可変領域は、相補性決定領域（CDR
）と呼ばれる３つの超可変領域によって割り込まれた「フレームワーク」からな
る。フレームワーク領域およびCDRの範囲は正確に定義されている（”Sequences
of Proteins of Immunological Interest”, Kabat, E.ら, U.S. Department o
f Health and Human Services (1983)を参照されたい）。簡単に述べると、ヒト
化抗体は、非ヒト種に由来する１以上のCDRとヒトイムノグロブリン分子に由来
するフレーム領域とを有する非ヒト種由来抗体分子である。
【００７１】 あるいは、一本鎖抗体を産生するために記載された技法（米国特許第4,946,77
8号; Bird, 1988, Science 242:423-426; Hustonら, 1988, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 85:5879-5883;およびWardら, 1989, Nature 334:544-546）を、PBCレ
トロウイルス粒子およびPBCレトロウイルス遺伝子産物に対する一本鎖抗体を産
生するために応用することができる。一本鎖抗体は、アミノ酸架橋によりFv領域
の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントを結合して一本鎖ポリペプチドを生
成することにより形成される。
【００７２】 特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは公知技法により作製すること
ができる。例えば、このようなフラグメントには、該抗体分子のペプシン消化に
より生成することができるF(ab’)2フラグメント、および該F(ab’)2フラグメン
トのジスルフィド架橋を減少させることにより生成することができるFabフラグ
メントが含まれるが、これらに限定されない。あるいは、所望の特異性を有する
モノクローナルFabフラグメントの迅速且つ簡単な同定を可能とするFab発現ライ
ブラリーを構築することができる（Huseら, 1989, Science 246:1275-1281）。
【００７３】5.4. PBCレトロウイルス遺伝子配列、遺伝子産物、および抗体の利用 本明細書中には、単離したPBCレトロウイルス粒子、遺伝子配列、PBCレトロウ
イルス遺伝子産物（そのペプチド断片および融合タンパク質を含む）、ならびに
PBCレトロウイルス遺伝子産物およびそのペプチド断片に対する抗体の様々な用
途が記載される。このような用途としては、例えばPBCレトロウイルスの完全ゲ
ノムの特徴付け、新規レトロウイルスの同定および特徴付け、PBCレトロウイル
スによる感染またはその関連疾患（例えばシェーグレン症候群、強皮症、SLE、
自己免疫性甲状腺炎、様々な結合組織障害、乳癌およびリンパ種等）の予後およ
び診断評価、ならびにこのような障害に対する疾病素質を有する対象の同定が挙
げられる。
【００７４】 さらにこのような用途には、以下に記載するようなPBCレトロウイルスによる
感染またはその関連疾患（例えばシェーグレン症候群、強皮症、SLE、自己免疫
性甲状腺炎、様々な結合組織障害、乳癌およびリンパ種等）の治療方法、ならび
にPBCレトロウイルス遺伝子の発現および/またはPBCレトロウイルス遺伝子産物
の合成または活性を調節する化合物の同定方法が含まれる。
【００７５】5.5. PBC関連レトロウイルスおよび関連障害の診断 PBCレトロウイルス感染および関連障害PBCの診断および予後評価、ならびにこ
のような障害に対する疾病素質を有する対象の同定のために、様々な方法を用い
ることができる。
【００７６】 このような方法は、例えば第5.1節に記載したPBCレトロウイルス遺伝子ヌクレ
オチド配列や、上記第5.3節に記載したようなPBCレトロウイルス遺伝子産物に対
する抗体（そのペプチドフラグメントを含む）等の試薬を利用することができる
。特に、このような試薬は例えば、 （1）PBCレトロウイルスヌクレオチド配列の存在の検出、 （2）PBCレトロウイルス遺伝子産物の存在の検出 に使用することができる。
【００７７】 本発明の検出方法は、治療薬による治療をモニターし、最適化する薬理遺伝学
的方法において利用することができる。
【００７８】 本明細書中に記載される方法は、例えば、臨床的設定等においてPBCを示す患
者およびPBCレトロウイルスによる感染を診断するために使用するのに便利な、
本明細書中に記載される少なくとも１種の特異的PBCレトロウイルス核酸または
抗PBCレトロウイルス遺伝子産物抗体試薬を含む、予めパッケージングされた診
断キットを利用して行うことができる。
【００７９】 さらに、PBC関連ウイルスに特異的な抗体または血清に対するテストサンプル
の免疫反応性を測定する方法は、PBCレトロウイルス感染および関連障害PBCの診
断および予後評価のために、ならびにこのような障害に対する疾病素質を有する
対象の同定のために用いることができる。
【００８０】5.6. PBCレトロウイルス核酸分子の検出 PBCレトロウイルス核酸配列のレベルを検出および/またはアッセイするために
、様々な方法を用いてPBCレトロウイルスの存在をスクリーニングすることがで
きる。
【００８１】 PBCレトロウイルス核酸配列は、PBCレトロウイルスのゲノム構造に関与するレ
ベルおよび異常（点突然変異、挿入、欠失、逆位、転座および染色体再配列を含
む）を検出するための生物学的サンプルのハイブリダイゼーションまたは増幅ア
ッセイに使用することができる。このようなアッセイには、サザン分析、一本鎖
コンフォメーション多型分析（SSCP）、およびPCR分析が含まれるが、これらに
限定されない。
【００８２】 PBCレトロウイルス遺伝子特異的突然変異の検出のための診断方法は、例えば
、サンプルから得た核酸（患者サンプルまたは他の適当な細胞起源から得たもの
等）を、１以上の標識した核酸試薬（上記第5.1節で記載したような組換えDNA分
子、クローン化遺伝子またはその縮重変異体を含む）に、これらの試薬がPBCレ
トロウイルスゲノムの中のまたはこれをフランキングするその相補配列に特異的
にアニーリングするのに好適な条件下で接触させ、一緒にインキュベートする工
程を含むものであってもよい。本発明の診断方法はさらに、PBCレトロウイルス
ゲノムの単一のヌクレオチド突然変異もしくは多型を検出するために核酸を接触
およびインキュベートすることを包含する。
【００８３】 インキュベーション後、全てのアニーリングされなかった核酸を、核酸/PBCレ
トロウイルス分子ハイブリッドから除去する。ハイブリダイズした核酸が存在す
る場合にはその存在を検出する。このような検出スキームを用いて、目的の細胞
の種類または組織から得た核酸を、例えば膜等の固相支持体またはマイクロタイ
タープレートやポリスチレンビーズ上等のプラスチック表面に固定することがで
きる。この場合、インキュベーション後に、アニーリングされなかった第5.1に
記載したタイプの標識核酸試薬は簡単に除去される。残っているアニーリングさ
れた標識PBCレトロウイルス核酸試薬の検出は、当業者に周知である標準的な技
法を用いて行われる。PBCレトロウイルス遺伝子の突然変異が存在するか否かを
検出するために、該核酸試薬がアニーリングしたPBCレトロウイルス遺伝子配列
を、正常なPBCレトロウイルス遺伝子配列から期待されるアニーリングパターン
と比較することができる。
【００８４】 好適な実施形態において、PBCレトロウイルスの突然変異もしくは多型は、基
質または「遺伝子チップ」に固定されたPBCレトロウイルス核酸配列のマイクロ
アッセイを用いて検出することができる（例えばCroninら, 1996, Human Mutati
on 7:244-255を参照されたい）。
【００８５】 患者サンプルまたは他の適当な細胞起源の中のPBCレトロウイルス遺伝子特異
的核酸分子を検出するための他の診断方法は、例えばPCRによるこれらの増幅（M
ullis, 1987,米国特許第4,683,202号に記載された実験的実施形態）後に、当業
者に周知である技法（例えば上記に記載したもの等）を用いて増幅した分子の分
析を行うものであってもよい。
【００８６】 このような増幅が関連する診断スクリーニング分析に好適なこれらのPBCレト
ロウイルス核酸配列は、本明細書中の実施例に記載されたオリゴヌクレオチドプ
ライマーである。
【００８７】 このような増幅が関連する分析に好適な他のPBCレトロウイルス核酸配列は、P
BCレトロウイルス多型の存在を検出する配列である。このような多型には、PBC
レトロウイルスにより媒介される障害に関連する突然変異を表すものが含まれる
。
【００８８】 さらに、周知の遺伝子タイピング技法を行って、PBCレトロウイルス遺伝子の
突然変異を保有する個体を特定することができる。このような技法には、例えば
、使用する特定の制限酵素の認識部位の中の１つにおける配列変異を含む制限断
片長多型（RFLP）の使用が含まれる。
【００８９】 さらに、制限酵素部位間にある様々な数の縦に連結して反復された短いDNA配
列の存在を利用する、PBCレトロウイルス遺伝子特異的突然変異の特定に使用す
ることができる改良されたDNA多型分析方法が、既に記載されている。例えば、W
eber（米国特許第5,075,217号）は、（dC-dA）n-（dG-dT）nの短い縦列反復配列
のブロックにおける長さの多型に基づくDNAマーカーについて記載している。（d
C-dA）n-（dG-dT）nブロックの平均距離は、30,000〜60,000bpであると推定され
る。非常に短い間隔で離間されているマーカーは、高頻度の同時遺伝性（co-inh
eritance）を示し、遺伝子の突然変異（例えばPBCレトロウイルス遺伝子の中の
突然変異等）の同定、ならびにPBCレトロウイルス突然変異に関連する疾患およ
び障害の診断において非常に有用である。
【００９０】 また、Caskeyら（米国特許第5,364,759号）は、短い３回-および４回-ヌクレ
オチド反復配列のためのDNAプロファイリングアッセイについて記載している。
この方法は、PBCレトロウイルス遺伝子等の目的DNAの抽出、抽出したDNAの増幅
、および反復配列の標識を行って、個体のDNAの遺伝子マップを作製するもので
ある。
【００９１】 当業者に周知である他の方法を用いて、一塩基多型（SNP）を同定することが
でき、これには、２つの対立遺伝子（両方とも、１つの集団の中において非常に
高い頻度で存在する）を有する双対立遺伝子型SNP（biallelic SNP）または双対
立遺伝子型マーカー（biallelic marker）が含まれる。SNPを検出するための従
来技法としては、例えば従来型ドットブロット分析、一本鎖コンフォメーション
高次構造多型（SSCP）分析（例えばOritaら, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 86:2766-2770を参照されたい）、変性勾配ゲル電気泳動（DGGE）、ヘテロデュ
レックス（heterodulex）分析、ミスマッチ開裂検出、および当分野で周知であ
る他の常套的な技法（例えばSheffieldら, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. 86:5
855-5892; Grompe, 1993, Nature Genetics 5:111-117を参照されたい）が挙げ
られる。あるいは、SNPを検出およびマッピングする好適な方法は、単一ヌクレ
オチドプライマー伸長反応によって標的DNA中のSNP部位を検出するミクロシーク
エンシング技法（例えばGoeletらの国際特許出願公開番号WO92/15712；Mundyの
米国特許第4,656,127号；VaryおよびDiamondの米国特許第4,851,331号；Cohenら
の国際特許出願公開番号WO91/02087号；Cheeらの国際特許出願公開番号WO95/119
95号；Landegrenら,1998, Science 241:1077-1080；Nicersonら, 1990, Proc. N
atl. Acad. Sci. U.S.A. 87:8923-8927；Pastinenら, 1997, Genome Res. 7:606
-614；Pastinenら, 1996, Clin. Chem. 42:1391-1397；Jalankoら, 1992, Clin.
Chem. 38:39-43; Shumakerら, 1996, Hum. Mutation 7:346-354；Caskeyらの国
際特許出願公開番号WO95/00669号を参照されたい）を含む。
【００９２】 PBCレトロウイルス遺伝子の発現レベルをアッセイすることもできる。例えば
、PBCレトロウイルス遺伝子を発現することが分かっているまたは疑われる細胞
の種類または組織（胆管または肝組織等）に由来するRNAは、上記のようなハイ
ブリダイゼーションまたはPCR技法を用いて単離およびテストすることができる
。単離細胞は、細胞培養物または患者に由来するものであってもよい。培養物か
ら得た細胞の分析は、細胞ベースの遺伝子療法技術の一部として使用される、あ
るいはPBCレトロウイルス遺伝子の発現に及ぼす化合物の影響をテストするため
の、細胞の評価において必要な工程である。このような分析により、PBCレトロ
ウイルス遺伝子の発現パターンの定量的態様および定性的態様（PBCレトロウイ
ルス遺伝子発現の活性化および不活化を含む）の両方が明らかとなる。
【００９３】 このような検出スキームの１つの実施形態において、cDNA分子は目的のRNA分
子から（例えばRNA分子からcDNAへの逆転写により）合成される。次に、cDNAの
中の配列を、PCR増幅反応等の核酸増幅反応等の鋳型として使用する。この方法
の逆転写および核酸増幅工程において合成開始試薬（例えばプライマー等）とし
て使用される核酸試薬は、第5.1節に記載されたPBCレトロウイルス遺伝子核酸試
薬の中から選択される。このような核酸試薬の好適な長さは少なくとも9〜30ヌ
クレオチドである。増幅された産物を検出するために、放射性標識または非放射
性標識したヌクレオチドを用いて核酸増幅を行うことができる。あるいは、標準
的な臭化エチジウム染色により、または任意の他の適当な核酸染色方法を用いる
ことにより増幅産物を可視化することができるように、十分な増幅産物を作成す
ることができる。
【００９４】 さらに、核酸精製の必要をなくすために、「in situ」で、すなわち生検また
は切除により得た患者の組織の組織切片（固定切片および/または凍結切片）に
対して直接、このようなPBCレトロウイルス遺伝子発現アッセイを行うことが可
能である。第5.1節で記載したもの等の核酸試薬は、このようなin situ手法のた
めのプローブおよび/またはプライマーとして使用することができる（例えばNuo
vo, G.J., 1992, “PCR In Situ Hybridization: Protocols And Applications
”, Raven Press, NYを参照されたい）。
【００９５】 あるいは、十分な量の適当な細胞が得られる場合、標準的なノーザン分析を行
って、PBCレトロウイルス遺伝子のmRNA発現レベルを測定することができる。
【００９６】5.7 抑制的アンチセンス、リボザイムおよび三重らせん手法 別の実施形態において、PBCレトロウイルス媒介性障害の症状は、PBCレトロウ
イルス遺伝子配列を公知のアンチセンス法、遺伝子「ノックアウト」法、リボザ
イム法および／または三重らせん法と組み合せて用いてPBCレトロウイルス遺伝
子の発現レベルを低下させることにより、PBCレトロウイルス遺伝子の発現およ
び／またはPBCレトロウイルス遺伝子産物の活性のレベルを低下させることによ
って改善することができる。PBCレトロウイルス媒介性障害の症状を改善する能
力を含む、PBCレトロウイルス遺伝子の活性、発現または合成を調節する能力を
示し得る化合物としては、アンチセンス分子、リボザイム分子および三重らせん
分子が挙げられる。そのような分子は、損なわれていないか、あるいは（それが
適切である場合には）突然変異している標的遺伝子の活性を低下または抑制する
ように設計すればよい。そのような分子の作製や使用の技法は当業者には公知で
ある。
【００９７】 アンチセンスRNAおよびDNA分子は、標的とするmRNAにハイブリダイズしてタン
パク質翻訳を妨げることによりmRNAの翻訳を直接ブロックするように作用する。
アンチセンス手法は、標的遺伝子mRNAに相補的であるオリゴヌクレオチドの設計
を含むものである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的な標的遺伝子mR
NA転写産物に結合し、翻訳を妨げる。完全な相補性は、好ましいが、必須ではな
い。
【００９８】 RNAの一部に「相補的」である配列とは、本明細書で言及する場合、RNAとハイ
ブリダイズして安定な二重鎖を形成することができるように十分な相補性を持つ
配列を意味する。したがって、二本鎖アンチセンス核酸の場合には、その二本鎖
DNAの一方の鎖を試験してもよいし、または三重鎖形成をアッセイしてもよい。
ハイブリダイズする能力は、そのアンチセンス核酸の相補性の程度および長さの
両者に応じて異なる。一般には、ハイブリダイズする核酸が長くなるほど、RNA
との塩基ミスマッチを多く含む可能性があり、それでも依然として該RNAと安定
な二本鎖（または場合によっては三重鎖）を形成できることもある。当業者であ
れば、ハイブリダイズした複合体の融解点を求める標準的手順を用いることによ
り、ミスマッチの寛容可能な程度を確認することができる。
【００９９】 １つの実施形態においては、PBCレトロウイルス遺伝子の非コード領域に相補
的なオリゴヌクレオチドをアンチセンス手法において用いることにより、内在性
PBCレトロウイルスmRNAの翻訳を抑制することが可能である。アンチセンス核酸
は、少なくとも6ヌクレオチド長である必要があり、好ましくは6〜約50ヌクレオ
チド長の範囲のオリゴヌクレオチドである。特定の態様においては、このオリゴ
ヌクレオチドは少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なく
とも25ヌクレオチドまたは少なくとも50ヌクレオチドである。
【０１００】 標的配列を選択に関わりなく、まずin vitro試験を行って、アンチセンスオリ
ゴヌクレオチドの遺伝子発現抑制能力を定量化することが好ましい。これらの試
験は、オリゴヌクレオチドのアンチセンス遺伝子抑制と非特異的生物学的作用と
を区別するために対照を用いることが好ましい。また、これらの試験で、標的RN
Aまたタンパク質のレベルを内部対照RNAまたはタンパク質のレベルと比較するこ
とも好ましい。加えて、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて得られた結果
を対照オリゴヌクレオチドを用いて得られた結果と比較することも考えられる。
この対照オリゴヌクレオチドが試験オリゴヌクレオチドとほぼ同じ長さのもので
あり、かつオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列がアンチセンス配列と、標的
配列への特異的ハイブリダイゼーションを阻止するのに必要な程度に相違してい
ることが好ましい。
【０１０１】 上記オリゴヌクレオチドは、DNAもしくはRNA、またはキメラ混合物であっても
よいし、あるいはそれらの誘導体または修飾体であってもよく、一本鎖であって
もよいし二本鎖であってもよい。このオリゴヌクレオチドは、例えばその分子の
安定性やハイブリダイゼーション等を改善するために、塩基部分、糖部分または
リン酸骨格が修飾されていてもよい。上記オリゴヌクレオチドは、他の付加基、
例えばペプチド（例えば、in vivoで宿主細胞受容体をターゲティングするため
のもの）、または細胞膜（例えば、Letsingerら、1989, Proc. Natl. Acad. Sci
. U.S.A. 86:6553-6556；Lemaitreら、1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 8
4:648-652；1988年12月15日公開のPCT公報WO88／09810を参照）もしくは血液−
脳関門（例えば、1988年4月25日公開のPCT公報WO89／10134を参照）を通過する
輸送を容易にする物質、ハイブリダイゼーション誘発開裂剤（例えば、Krolら、
1988, BioTechniques 6:958-976を参照）または挿入剤（例えば、Zon, 1988, Ph
arm. Res. 5:539-549を参照）を含んでいてもよい。この目的のためには、オリ
ゴヌクレオチドは、他の分子（例えばペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架
橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発開裂剤）に結合させてもよい。
【０１０２】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの修飾塩基部分を含んで
いてもよく、かかる修飾塩基部分としては、限定されるものではないが、5-フル
オロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポ
キサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシメチ
ル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシ
メチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルクエオシ
ン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノ
シン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチル
シトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミ
ノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシル
クエオシン、5’-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-
メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸（v）、ワイブ
トキソシン、プソイドウラシル、クエオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チ
オウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5
-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸（v）、5-メチル-2-チオウ
ラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w、および2,
6-ジアミノプリンを含む群より選択されるものが挙げられる。
【０１０３】 アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、限定されるものではないが、アラビ
ノース、2-フルオロアラビノース、キシルロースおよびヘキソースを含む群より
選択される少なくとも1つの修飾糖部分を含んでいてもよい。
【０１０４】 さらに別の実施形態においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホ
ロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホロア
ミデート、ホスホロジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエ
ステルおよびホルムアセタール、またはそれらの類似体からなる群より選択され
る少なくとも1つの修飾リン酸骨格を含むものである。
【０１０５】 さらに別の実施形態においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドはα-アノ
マー型オリゴヌクレオチドである。α-アノマー型オリゴヌクレオチドは、相補
的RNAと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成するものであり、このハイブリッド
においては、通常のβ-ユニットとは違って、鎖が互いに平行に伸びている（Gau
tierら、1987, Nucl. Acids Res. 15:6625-6641）。このオリゴヌクレオチドは2
’-O-メチルリボヌクレオチド（Inoueら、1987, Nucl. Acids Res. 15:6131-614
8）またはキメラRNA−DNA類似体（Inoueら、1987, FEBS Lett. 215:327-330）で
ある。
【０１０６】 本発明のオリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知の標準的な方法、例えば、
自動DNA合成装置（例えば、Biosearch、Applied Biosystems等から市販されてい
るもの）を用いることによって合成することができる。例としては、ホスホロチ
オエートオリゴヌクレオチドはSteinらの方法（1988, Nucl. Acids Res. 16:320
9）によって合成することができること、およびメチルホスホネートオリゴヌク
レオチドは制御化多孔質ガラスポリマー支持体（Sarinら、1988, Proc. Natl. A
cad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451）を用いて調製することができることなどが挙
げられる。
【０１０７】 標的遺伝子コード領域配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドが使用可能で
あるが、転写された未翻訳の領域に相補的なものが最も好ましい。
【０１０８】 アンチセンス分子は、in vivoで標的遺伝子を発現する細胞に送達される必要
がある。アンチセンスDNAまたはRNAを細胞に送達するための方法が多数開発され
ており、例えば、アンチセンス分子は、組織部位に直接注入してもよいし、ある
いは、所望の細胞を標的とするように設計された改変アンチセンス分子（例えば
、標的細胞の表面に発現されている受容体または抗原に特異的に結合するペプチ
ドまたは抗体に連結させたアンチセンス）を全身投与してもよい。
【０１０９】 しかし、内在性mRNAの翻訳を抑制するのに十分なアンチセンスの細胞内濃度を
達成することが困難な場合が多い。したがって、１つの好ましい手法は、アンチ
センスオリゴヌクレオチドが強力なpol IIIまたはpol IIプロモーターの制御下
に置かれている組換えDNA構築物を利用するものである。そのような構築物を使
用して患者内の標的細胞をトランスフェクトすれば、内因性標的遺伝子転写産物
と相補的塩基対を形成する一本鎖RNAの十分な量の転写が起こって、標的遺伝子m
RNAの翻訳を阻止する。例えば、ベクターを導入し、例えばそれが細胞に取り込
まれてアンチセンスRNAの転写を指令するようにすることができる。そのような
ベクターは、それが転写されて目的のアンチセンスRNAを産生できるならば、エ
ピソームのままであってもよいし、染色体に組み込まれてもよい。そのようなベ
クターは、当技術分野で標準的な組換えDNAテクノロジー法により構築できる。
ベクターは、哺乳動物細胞内での複製および発現に用いられるプラスミド、ウイ
ルス性のもの、または当技術分野で公知の他のものとすることができる。アンチ
センスRNAをコードする配列の発現は、哺乳動物（好ましくはヒト細胞）におい
て作用することが当技術分野で知られているどのようなプロモーターによるもの
であってもよい。そのようなプロモーターは、誘導性であっても恒常性であって
もよい。そのようなプロモーターとしては、限定されるものではないが、SV40初
期プロモーター領域（BernoistおよびChambon, 1981, Nature 290:304-310）、
ラウス肉腫ウイルスの3’側の長い末端反復配列中に含まれるプロモーター（Yam
amotoら, 1980, Cell 22:787-797）、ヘルペス・チミジンキナーゼプロモーター
（Wagnerら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445）、メタロチ
オネイン遺伝子の調節配列（Brinsterら, 1982, Nature 296:39-42）などが挙げ
られる。プラスミド、コスミド、YACまたはウイルスベクターの任意のタイプの
ものも、組織部位に直接導入可能な組換えDNA構築物の調製に使用できる。ある
いはまた、所望の組織を選択的に感染させるウイルスベクターを使用してもよく
、その場合、投与は別の経路（例えば全身的）により達成できる。
【０１１０】 触媒作用により標的遺伝子mRNA転写産物を開裂するように設計されたリボザイ
ム分子もまた、標的遺伝子mRNAの翻訳を阻止し、ひいては標的遺伝子産物の発現
を阻止するのに使用可能である。（例えば、1990年10月４日に公表されたPCT国
際公報WO90/11364；Sarverら, 1990, Science 247, 1222-1225を参照のこと。） リボザイムは、RNAの特異的開裂を触媒できる酵素活性を持つRNA分子である。
（概説については、Rossi, 1994, Current Biology 4:469-471を参照されたい。
）リボザイムの作用機序は、リボザイム分子の相補的な標的RNAへの配列特異的
ハイブリダイゼーション、それに続くヌクレオチド内開裂性（endonucleolytic
）事象を含む。リボザイム分子の構成要素は、標的遺伝子mRNAに相補的な１つ以
上の配列を含んでいなければならず、且つ、mRNAの開裂に関与する公知の触媒活
性を持つ配列を含んでいなければばならない。この配列については、例えば米国
特許第5,093,246号（参照によりその全体を本明細書に組み入れる）を参照され
たい。
【０１１１】 標的遺伝子mRNAを破壊するために、mRNAを部位特異的認識配列において分解す
るリボザイムを使用できるが、ハンマーヘッド型リボザイムの使用が好ましい。
ハンマーヘッド型リボザイムは、mRNAを、標的mRNAと相補的塩基対を形成する隣
接領域により指定される位置で分解する。ただ１つの要件は、標的mRNAが5’-UG
-3’２の塩基からなる配列を含むことである。ハンマーヘッド型リボザイムの構
築および作製は当技術分野で公知であり、Myers, 1995, Molecular Biology and
Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, New York
（特に833頁の図４を参照のこと）ならびにHaseloffおよびGerlach, 1988, Natu
re, 334:585-591（引用によりその全体を本明細書に組み入れる）にさらに十分
に記載されている。
【０１１２】 好ましくは、リボザイムは、分解認識部位が標的遺伝子mRNAの5’末端の近傍
に位置するように、つまり、効率を増大させ且つ機能性でないmRNA転写産物の細
胞内蓄積を最小限に抑えるように作製される。
【０１１３】 また、本発明のリボザイムとしては、テトラヒメナ（Tetrahymena thermophil
a）内に天然に存在するもの（IVSまたはL-19 IVS RNAとして知られている）、お
よびThomas Cechおよび共同研究者により広範に記載されているもの（Zaugら, 1
984, Science, 224:574-578；ZaugおよびCech, 1986, Science, 231:470-475；Z
augら, 1986, Nature, 324:429-433；University Patents Inc.による国際特許
公報WO88/04300；BeenおよびCech, 1986, Cell, 47:207-216）などのRNAエンド
リボヌクレアーゼも挙げられる（以下、「Cech型リボザイム」と呼ぶ）。Cech型
リボザイムは、標的RNA配列にハイブリダイズする８塩基対からなる活性部位を
含み、そのハイブリダイゼーションの後で該標的RNAの開裂を起こす。本発明は
、標的遺伝子中に存在する８塩基対からなる活性部位配列を標的とするCech型リ
ボザイムを包含する。
【０１１４】 アンチセンス手法の場合と同様に、リボザイムは、（例えば安定性やターゲッ
ティングなどを向上させるための）修飾オリゴヌクレオチドから構成されてもよ
く、in vivoで標的遺伝子を発現する細胞に送達される必要がある。好ましい送
達方法は、強力な恒常的pol IIIもしくはpol IIプロモーターの制御下でリボザ
イムを「コードする」DNA構築物を用い、トランスフェクトした細胞が十分な量
の該リボザイムを産生して内因性の標的遺伝子メッセージを破壊し且つ翻訳を阻
止するようにすることを含む。リボザイムは、アンチセンス分子とは違って触媒
活性を持つので、効率にとっては必要とする細胞内濃度はより低いものとなる。
【０１１５】 内因性標的遺伝子の発現は、標的化相同組換え（targeted homologous recomb
ination）を用いて該標的遺伝子またはそのプロモーターを不活性化または「ノ
ックアウト」することによっても低減できる（例えば、Smithiesら, 1985, Natu
re, 317:230-234；ThomasおよびCapecchi, 1987, Cell 51:503-512；Thompsonら
, 1989, Cell 5:313-321を参照；それらの各々は参照によりその全体を本明細書
に組み入れる）。例えば、内因性の標的遺伝子に相同なDNA（該標的遺伝子のコ
ード領域か調節領域のいずれか）が隣接している突然変異型の非機能性標的遺伝
子（または完全に無関係なDNA配列）を選択マーカーおよび／もしくはネガティ
ブ選択マーカーと共にまたはそれらなしで用いて、該標的遺伝子をin vivoで発
現する細胞をトランスフェクトすることができる。このDNA構築物を標的相同組
換えにより挿入することにより、標的遺伝子が不活性化される。そのような方法
は特に農業分野において適し、その場合、ES（胚性幹）細胞への改変を用いて、
不活性な標的遺伝子を含む子孫動物が作製できる（例えば、ThomasおよびCapecc
hi, 1987およびThompson, 1989,前掲を参照のこと）。しかし、この方法はヒト
での使用に適合させることができ、但しその場合、組換えDNA構築物は直接投与
されるか、適当なウイルスベクターを用いてin vivoで必要とされる部位にター
ゲッティングされる。
【０１１６】 あるいはまた、内因性標的遺伝子の発現は、該標的遺伝子の調節領域（すなわ
ち、標的遺伝子のプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なデオキ
シリボヌクレオチド配列を標的として、体内の標的細胞における標的遺伝子の転
写を抑制する三重らせん構造を形成することにより低減してもよい（概略的には
、Helene. 1991, Anticancer Drug Des., 6(6):569-584；Heleneら, 1992, Ann.
N.Y. Acad. Sci., 660:27-36；ならびにMaher, 1992, Bioassays 14(12):807-8
15を参照されたい）。
【０１１７】 転写抑制のための三重らせん形成において用いられる核酸分子は、一本鎖であ
り、且つデオキシヌクレオチドから構成されるものでなければならない。これら
のオリゴヌクレオチドの塩基組成は、フーグスティーン型塩基対合の法則による
三重らせん形成を促進するように設計されなければならず、このためには、通常
、二重らせんの一方の鎖にプリンまたはピリミジンのかなり大きなストレッチが
存在することが必要である。ヌクレオチド配列は、ピリミジン系のものであって
もよく、この場合、得られる三重らせんの３本の結合鎖を横切ってTATおよびCGC ＋ トリプレットが形成される。ピリミジンに富む分子には、その鎖と平行に並ん
でいる二重らせんの一方の鎖のプリンに富む領域に対する塩基相補性が備わって
いる。さらに、プリンに富んでいる（例えばＧ残基のストレッチを含んでいる）
核酸分子を選んでもよい。これらの分子は、ＧＣ対に富むDNA二重らせんと三重
らせんを形成し、該らせん内で、プリン残基の大部分は、標的とする二重らせん
の一方の鎖に位置して、三重らせんの３本の鎖を横切ってＧＧＣトリプレットと
なる。
【０１１８】 あるいはまた、三重らせん形成の標的とされ得る可能性のある配列は、いわゆ
る「スイッチバック（折り返し）」型核酸分子を作製することにより増やすこと
ができる。スイッチバック型分子は、それらがまず二重らせんの一方の鎖と塩基
対合し次にもう一方の鎖と塩基対合するように、5’−3’と3’−5’が交互にな
る様に合成して、プリンもしくはピリミジンのかなり大きなストレッチが二重ら
せんの一方の鎖に存在しなくてもよいようになっている。
【０１１９】 本明細書で記載するアンチセンス、リボザイムおよび／または三重鎖分子を利
用して突然変異型遺伝子発現を抑制する場合、おそらく、この方法は、正常な標
的遺伝子の対立遺伝子により生じるmRNAの転写（三重らせんの場合）および／ま
たは翻訳（アンチセンス、リボザイムの場合）をとても効率的に低減または抑制
でき、存在する正常な標的遺伝子産物の濃度は正常な表現型の場合に必要な濃度
よりも低い可能性がある。したがって、そうした場合、実質的に正常な標的遺伝
子活性レベルが確実に維持されるようにするためには、正常な標的遺伝子の活性
を示す標的遺伝子ポリペプチドをコードし発現する核酸分子を、例えば後記のセ
クション5.4.2に記載されているような遺伝子治療方法により、利用するアンチ
センス、リボザイムまたは三重らせん処理に影響される配列を含んでいない細胞
に導入すればよい。あるいはまた、標的遺伝子が細胞外タンパク質をコードする
場合、必要な標的遺伝子の活性レベルを維持するために、正常な標的遺伝子タン
パク質を同時投与することが好ましいこともある。
【０１２０】 本発明のアンチセンスRNAおよびDNA、リボザイムならびに三重らせん分子は、
上記で述べたように、DNAおよびRNA分子の合成用として当技術分野で公知のいず
れの方法によっても調製できる。これらの方法としては、当技術分野で公知のオ
リゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドを化学的に合成す
るための技法、例えば固相ホスホルアミド化学合成が挙げられる。あるいはまた
、RNA分子は、アンチセンスRNA分子をコードするDNA配列のin vitroおよびin vi
vo転写により作製することが可能である。そのようなDNA配列は、T7またはSP6ポ
リメラーゼプロモーターなどの適切なRNAポリメラーゼプロモーターを組み込む
多種多様なベクターに組み込まれ得る。あるいはまた、使用するプロモーターよ
っては、アンチセンスRNAを恒常性または誘導性になるように合成するアンチセ
ンスcDNA構築物を細胞系に安定に導入してもよい。
【０１２１】5.8 医薬調製剤および投与方法 本発明は、PBCレトロウイルスに感染した個体の治療方法に関する。特に、本
発明は、PBCレトロウイルスに感染した個体におけるウイルスの複製および疾患
の症状を調節するための抗ウイルス療法と免疫調節療法との組合せに関する。本
発明は、サイトカイン、逆転写酵素の阻害剤、ウイルスキャッピングの阻害剤お
よびウイルスプロテアーゼの阻害剤などの抗ウイルス剤によるPBCレトロウイル
ス感染の治療または抑制の方法に関する。本発明はさらに、遺伝的に罹患しやす
い個体において疾患を予防するためのワクチンおよび他の予防的治療に関する。
【０１２２】 本明細書で述べるように、抗ウイルス剤は、組織学的分析により測定した場合
に、PBC感染患者においてPBCウイルスの負荷および／または感染を軽減または抑
制することが実証されている。本発明によれば、PBCウイルスの負荷(coad)およ
び／または感染を低減するために使用できる抗ウイルス剤としては、限定される
ものではないが、逆転写酵素阻害剤、ウイルスプロテアーゼ阻害剤、グリコシル
化阻害剤；ウイルスの伝染に関与する異なる標的分子に作用するもの；同一分子
の異なる座に作用するもの；およびウイルス耐性の発生を抑制または低減するも
のが挙げられる。当業者ならば、上記の形態の活性を示す非常に様々な抗ウイル
ス療法を知っており、例えば次のものが挙げられる：ヌクレオシド誘導体は、RN
AおよびDNAの結合ブロックであるプリンおよびピリミジンヌクレオシドの修飾形
態であり、限定されるものではないが、例えば2’,3’-ジデオキシアデノシン（
ddA）、2’,3’-ジデオキシグアノシン（ddG）、2’,3’-ジデオキシイノシン（
ddI）、2’,3’-ジデオキシシチジン（ddC）、2’,3’-ジデオキシチミジン（dd
T）、2’,3’-ジデオキシ-ジデオキシチミジン（d4T）および3’-アジド-2’,3
’-ジデオキシチミジン（AZT）が挙げられる。あるいはまた、ハロゲン化ヌクレ
オシド誘導体も使用可能であり、好ましくは、（限定されるものではないが）例
えば2’,3’-ジデオキシ-2’-フルオロアデノシン、2’,3’-ジデオキシ-2’-フ
ルオロイノシン、2’,3’-ジデオキシ-2’-フルオロチミジン、2’,3’-ジデオ
キシ-2’-フルオロシトシンなどの2’,3’-ジデオキシ-2’-フルオロヌクレオシ
ド、ならびに（限定されるものではないが）例えば2’,3’-ジデオキシ-2’,3’
-ジデヒドロ-2’-フルオロチミジン(Fd4T)などの2’,3’-ジデオキシ-2’,3’-
ジデオキシ-2’-フルオロヌクレオシドである。好ましくは、本発明の2’,3’-
ジデオキシ-2’-フルオロヌクレオシドは、フッ素結合がβ構造のものであり、
限定されるものではないが、例えば2’,3’-ジデオキシ-2’-β-フルオロアデノ
シン（F-ddA）、2’,3’-ジデオキシ-2’-β-フルオロイノシン（F-ddI）および
2’,3’-ジデオキシ-2’-β-フルオロシトシン（F-ddC）が挙げられる。
【０１２３】 ウイルスプロテアーゼ阻害剤としては、限定されるものではないが、インビラ
ーゼ（Invirase）（サキナビル, Roche）、ABT-538（Abbott, CAS登録番号No.15
5213-67-5）、AG1343（Burroughs Wellcome/Glaxo, CAS登録番号No.161814-49-9
）が挙げられる。プロテアーゼ阻害剤は一般に、主にアセンブリの間またはその
後で（すなわちウイルスの出芽により）、ビリオンの成熟感染状態への成熟を抑
制するように作用すると考えられている。例えば、ABT-538は、in vitroでは潜
在的な抗ウイルス活性を持ち、in vivoでは好ましい薬物動態学および安全なプ
ロフィールを持つことが示されている（Hoら, 1995, Nature 373:123-126）。
【０１２４】 PBCレトロウイルス遺伝子の発現または遺伝子産物の活性に影響を及ぼすこと
が確定した化合物は、PBCレトロウイルス媒介性障害を治療または改善するため
に、患者に治療上有効な用量で投与できる。治療上有効な用量とは、そのような
障害の症状の改善をもたらすのに十分な該化合物の量をいう。
【０１２５】5.8.1 有効な用量 そのような化合物の毒性および治療有効性は、例えばLD50（集団の50％に対す
る致死用量）およびED50（集団の50％において治療上有効な用量）を測定するた
めの細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順により測定できる。
有害作用と治療作用との用量比が治療指数であり、それはLD50／ED50比として表
わすことができる。本明細書で記載するように、本発明はまた、PBCの細胞培養
物モデルも包含するものであり、例えばPBCに感染した肝組織と不死化細胞系と
の共存培養物が挙げられ、これらは、PBCの治療に用いようとする化合物のLD50
／ED50比を確立するのに使用できる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。
有害な副作用を示す化合物を用いることも可能であるが、未感染細胞に対する潜
在的損傷を最低限に抑えることにより副作用を低減するために、かかる化合物を
罹患組織の部位にターゲッティングする送達系を設計するよう注意を払わねばな
らない。
【０１２６】 細胞培養物アッセイおよび動物試験から得られるデータは、ヒトにおける使用
のためのある範囲の投与量を処方するのに用いることができる。かかる化合物の
投与量は、好ましくは、毒性が殆どまたは全くない、ED50を含むある循環濃度範
囲内である。投与量は、この範囲内で、用いる剤形や利用する投与経路に応じて
様々に変えることができる。本発明の方法において用いられるいずれの化合物に
ついても、治療上有効な用量は、まず細胞培養物アッセイから見積もることがで
きる。用量は、動物モデルにおいて、細胞培養において測定したIC50（すなわち
、症状の最大抑制の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲
を達成するように処方されればよい。そのような情報は、ヒトにおける有用な用
量をより正確に決定するのに用いることができる。血漿中レベルは、例えば高速
液体クロマトグラフィーにより測定できる。
【０１２７】5.8.2 製剤および使用 本発明に従って使用するための医薬組成物は、１種以上の生理学上許容される
担体または賦形剤を用いて慣用の方法で製剤化できる。
【０１２８】 したがって、上記化合物ならびにそれらの生理学上許容される塩および溶媒和
化合物は、吸入もしくはガス注入（insufflation）（口または鼻のいずれかを経
由する）による投与用、または経口、口腔内（buccal）、非経口もしくは直腸投
与用に製剤化できる。
【０１２９】 経口投与の場合、上記医薬組成物は、例えば、慣用の手段により、結合剤（例
えば、アルファー化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロ
キシプロピルメチルセルロース）、充填剤（例えば、乳糖、微結晶セルロースま
たはリン酸水素カルシウム）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タ
ルクまたはシリカ）、崩壊剤（例えば、馬鈴薯デンプンまたはデンプングリコー
ル酸ナトリウム）、または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの製
薬上許容される賦形剤を用いて調製される錠剤またはカプセル剤の形態を取り得
る。錠剤は、当技術分野で公知の方法によりコーティングされていてもよい。経
口投与用の液体調製剤は、例えば液剤、シロップ剤または懸濁剤の形態を取って
もよいし、使用前に水または他の適切な溶媒で構成するための乾燥製品としても
よい。そのような液体調製剤は、慣用の手段により、懸濁化剤（例えば、ソルビ
トールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂肪）、乳化剤（例えば、
レシチンまたはアラビアゴム）、非水性溶媒（例えばアーモンド油、油性エステ
ル、エチルアルコールまたは分留植物性油）および保存剤（例えば、p-ヒドロキ
シ安息香酸メチルもしくはp-ヒドロキシ安息香酸プロピルまたはソルビン酸）な
どの製薬上許容される添加剤を用いて調製できる。これらの調製剤はまた、適宜
に、緩衝塩、矯味矯臭剤、着色剤および甘味剤を含んでもよい。
【０１３０】 経口投与用の調製剤は、活性化合物の制御放出をもたらすのに適するように処
方してもよい。
【０１３１】 口腔内投与の場合、上記組成物は、慣用の方法で製剤化された錠剤またはロゼ
ンジの形態を取ることができる。
【０１３２】 吸入による投与の場合、本発明に従って使用するための化合物は、加圧パック
または噴霧器からのエアゾールスプレー提示の形態で簡便に送達され、この場合
、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテト
ラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガスなどの適切な噴射剤を用い
る。加圧エアゾールの場合、投与単位は、ある一定量を送達するためのバルブを
備えることにより決定できる。吸入またはガス注入において使用するための、該
化合物と適切な粉末基剤（例えば乳糖またはデンプン）との粉末混合物を含むカ
プセルおよびカートリッジ（例えばゼラチン製のもの）を製剤化してもよい。
【０１３３】 上記化合物は、注射による（例えば、ボーラス注射や連続輸液による）非経口
投与用に製剤化できる。注射用の製剤は、例えばアンプルやマルチドース容器に
入れた単位剤形としてもよく、この場合、保存剤が添加される。この組成物は、
油性または水性溶媒中で調製した懸濁剤、液剤または乳濁剤の形態を取ってもよ
いし、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの配合剤（formulatory agen
ts）を含んでもよい。あるいはまた、活性成分は、使用前に、例えば無菌の発熱
物質不含水などの適切な溶媒で構成するための粉末形態としてもよい。
【０１３４】 また、上記化合物は、例えばココア脂や他のグリセライドなどの慣用の坐剤用
基剤を含む、坐剤や停留性浣腸剤などの直腸用組成物に製剤化してもよい。
【０１３５】 これまで記載した製剤以外にも、上記化合物は、デポー調製剤としても製剤化
できる。そのような長期作用性の製剤は、（例えば皮下または筋肉内の）埋め込
みにより、あるいは筋肉内注射により投与可能である。したがって、例えば、上
記化合物は、適切なポリマー性もしくは疎水性の物質と共に（例えば、許容され
る油中での乳濁液として）、またはイオン交換樹脂と共に、あるいは僅かに可溶
性の誘導体（例えば僅かに可溶性の塩）として製剤化できる。
【０１３６】 上記組成物は、所望であれば、活性成分を含む１以上の単位剤形を含み得るパ
ック内またはディスペンサー装置に入れて提供してもよい。このパックは、金属
箔もしくはプラスチック箔を含んでなる、例えば、ブリスターパックなどであっ
てよい。このパックまたはディスペンサー装置には、投与のついての説明書が同
封されていてもよい。
【０１３７】5.9 ワクチン製剤および投与方法 弱毒化形態のPBC関連ウイルスおよびPBC関連ウイルス遺伝子産物は、ワクチン
調製剤、ならびに例えばワクチン接種した被験体の体液サンプルにおいて抗原に
対する抗体の存在を検出もしくは測定して、感染症を診断し、且つ／またはワク
チン接種後の該被験体の免疫応答をモニターするためのイムノアッセイに用いら
れる。
【０１３８】 活性成分として免疫原性ポリペプチドを含有するワクチンの調製は、当業者に
は公知である。
【０１３９】5.9.1 ワクチンの有効性の測定 弱毒化形態のPBC関連ウイルスおよびPBC関連ウイルス遺伝子産物の免疫効力（
immunopotency）は、被験動物を該抗原で免疫した後に免疫応答をモニターする
ことにより、または当技術分野で公知のイムノアッセイを用いて測定できる。体
液性（抗体）応答および／または細胞媒介免疫性の出現が、免疫応答の指標とし
て採用できる。被験動物としては、マウス、ハムスター、イヌ、ネコ、サル、ウ
サギ、チンパンジーなどを挙げることができ、最終的にはヒト被験者とし得る。
【０１４０】 ワクチンの導入方法としては、経口、脳内、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、
皮下、鼻腔内、または任意の他の標準的な免疫化経路が挙げられる。被験体の免
疫応答は、例えば免疫吸着アッセイ（ELISA）、イムノブロット、放射性免疫沈
降法などの公知の技法によりアッセイした、抗原に対する生じた免疫血清の反応
性などの種々の手法により、あるいは抗原が抗原性または免疫原性を提示する場
合には、PBC関連レトロウイルスによる感染からの免疫化宿主の保護および／ま
たは免疫化宿主における感染による症状の緩和により分析できる。
【０１４１】 好適なワクチンの動物試験の一例として、本発明のワクチンは、ウサギにおい
て、抗原に対する抗体応答を誘導する能力について試験できる。雄性で特定病原
体除去済み（SPF）の若い成体ニュージランドホワイト種ウサギを用いることが
できる。試験群に、それぞれ固定濃度のワクチンを投与する。対照群には、抗原
を含まない１mM Tris-HCl（pH 9.0）を投与する。
【０１４２】 １または２週間毎にそのウサギから血液サンプルを採血し、血清をウイルスタ
ンパク質に対する抗体について分析すればよい。その抗原に対する抗体の存在に
ついては、例えばELISAを用いてアッセイできる。
【０１４３】5.9.2 ワクチン製剤 そのようなワクチンの好適な調製剤としては、注射剤（液状溶剤または懸濁剤
のいずれか）が挙げられ、注射の前に溶液、懸濁液または液体にするための固形
形態も調製可能である。調製物は乳化してもよく、ポリペプチドをリポソームに
封入してもよい。活性免疫原性成分は、製薬上許容され、且つ該活性成分と適合
性である賦形剤と混合されることが多い。適切な賦形剤は、例えば、食塩水、デ
キストロース、グリセロール、エタノールなど、またはそれらの組合せである。
さらに、所望であれば、ワクチン調製剤は、湿潤剤や乳化剤、pH緩衝化剤、およ
び／またはワクチンの有効性を増大させるアジュバントなどの補助物質も少量含
み得る。
【０１４４】 本発明の別の実施形態では、本発明のPBCレトロウイルス核酸分子を発現する
組換えワクチンが処方できる。さらに別の実施形態では、単離したPBC関連レト
ロウイルスを含むワクチンが処方でき、これは、慣用の技法を用いて該ウイルス
を「死滅」または弱毒化するように処方されているものである。そのような技法
としては、熱による不活性化、またはホルマリン、ホルムアルデヒドもしくはβ
-プロピオラクトンによる処理が挙げられる。
【０１４５】 有効と考えられるアジュバントの例としては、限定されるものではないが、水
酸化アルミニウム、N-アセチル-ムラミル-L-スレオニル-D-イソグルタミン（thr
-MDP）、N-アセチル-nor-ムラミル-Lアラニル-D-イソグルタミン、N-アセチルム
ラミル-L-アラニル-D-イソグルタミニル-L-アラニン-2-(1’-2’-ジパルミトイ
ル-sn-グリセロ-3-ヒドロキシホスホリルオキシ)-エチルアミンが挙げられる。
【０１４６】 アジュバントの有効性は、ウイルスポリペプチドエピトープを含む免疫原性ポ
リペプチドに対する抗体の誘導を測定することにより判定でき、この抗体は、種
々のアジュバントから構成されるワクチン中のこのポリペプチドの投与により生
じる。
【０１４７】 このポリペプチドは、そのまま、または塩の形態でワクチンに製剤化すること
ができる。製薬上許容される塩としては、例えば塩酸やリン酸などの無機酸、ま
たは酢酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸などの有機酸を用いて形成される酸付
加塩（該ペプチドの遊離アミノ基により形成されるもの）が挙げられる。遊離カ
ルボキシル基により形成される塩もまた、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリ
ウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄などの無機塩
基、ならびにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノー
ル、ヒスチジンおよびプロカインなどの有機塩基から誘導できる。
【０１４８】 本発明のワクチンは、多価であっても１価であってもよい。多価ワクチンは、
２種以上の抗原の発現を指令する組換えウイルスから作製される。
【０１４９】 本発明のワクチン製剤の導入には、多くの方法が使用できる。これらの方法と
しては、限定されるものではないが、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮
下、鼻腔内の経路、ならびに乱切（例えば二又の針を用いて皮膚の表層を引っ掻
く）によるものが挙げられる。
【０１５０】 ワクチンを投与する患者は、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒト
であるが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽（例えばニワトリ）、ヤギ、ネコ、
イヌ、ハムスター、マウスおよびラットなど（しかしそれらに限定されない）の
ヒト以外の動物でもよい。
【０１５１】 本発明のワクチン製剤は、有効免疫量のウイルスタンパク質と薬学的に許容さ
れる担体もしくは賦形剤とを含む。ワクチン調製剤は、有効免疫量の１種以上の
抗原と製薬上許容される担体もしくは賦形剤とを含む。製薬上許容される担体は
当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、食塩水、緩衝化食塩水、
デキストロース、水、グリセロール、無菌等張水系緩衝液、およびそれらの組合
せが挙げられる。そのような許容される担体の一例は、例えば安定化し加水分解
したタンパク質や乳糖などの１種以上の安定化剤を含有する生理学的にバランス
された培地である。担体は、好ましくは無菌である。製剤は、投与形態に適する
ものとすべきである。
【０１５２】 上記組成物は、所望であれば、少量の湿潤剤、乳化剤またはpH緩衝化剤を含む
ことができる。該組成物は、液状溶剤、懸濁剤、乳濁剤、錠剤、丸剤、カプセル
剤、持続放出製剤、または粉剤であってもよい。経口用製剤は、製薬等級のマン
ニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム
、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含み得る。
【０１５３】 一般に、上記成分は、個々に、または一緒に混合して、単回剤形として、例え
ば活性成分の量を明示したアンプルもしくは小袋（sachette）などの容器に入れ
て密封した乾燥した凍結乾燥供粉末もしくは水不含濃縮物として供給される。そ
の組成物が注射により投与される場合、無菌希釈剤のアンプルを提供して、投与
前に成分を混合できるようにしてもよい。
【０１５４】 製剤化において採用されるワクチン調製剤の正確な用量も、投与経路や患者の
性質に応じて異なり、標準的な臨床技法に従って医師の判断や各患者の状況によ
り決定すべきである。有効免疫量とは、ワクチン調製剤を投与した宿主において
抗原に対する免疫応答を引き起こすのに十分な量である。
【０１５５】 精製抗原のワクチン調製物としての使用は、標準的な方法により実施できる。
例えば、精製したタンパク質は、適当な濃度に調整し、任意の適切なワクチン用
アジュバントと共に配合し、使用のためにパッケージングしなければならない。
適切なアジュバントとしては、限定されるものではないが、水酸化アルミニウム
などの鉱物ゲル；リゾレシチンやプロピニックポリオールなどの表面活性物質；
ポリアニオン；ペプチド；油性乳濁物；アルミニウムならびにMDPを挙げること
ができる。また、免疫原は、リポソームに取り込ませてもよいし、多糖および／
またはワクチン製剤において使用するための他のポリマーと組み合せてもよい。
組換え抗原がハプテン（すなわち、コグネート抗体と選択的に反応できる点で抗
原性であるが、免疫応答を誘発できない点で免疫原性ではない分子）である場合
、そのハプテンは、担体もしくは免疫原性分子と共有結合していてもよい。例え
ば、血清アルブミンなどの巨大タンパク質は、それに結合したハプテンに免疫原
性を付与する。このハプテン−担体は、ワクチンとしての使用のために製剤化で
きる。
【０１５６】 本発明のワクチンの有効用量（免疫量）は、動物モデル試験系から誘導した用
量−応答曲線からも推定できる。
【０１５７】 また本発明は、本発明のワクチン製剤の成分の１種以上を含んだ１つ以上の容
器を備える医薬品パックまたはキットを提供する。そのような容器には、医薬品
の製造、使用または販売を統制している米国政府機関により規定された形態の注
意書きを添えることができ、その注意書は、ヒト投与のための製造、使用または
販売に関する機関による承認を反映するものである。
【０１５８】 したがって、本発明は、本発明のワクチンの有効免疫用量を動物に投与するこ
とを含む、動物の免疫方法または動物における種々の疾患もしくは障害の治療も
しくは予防方法を提供する。
【０１５９】6. 実施例 以下の実施例では、新規PBCレトロウイルスヌクレオチドの単離および特徴決
定を説明する。
【０１６０】6.1 PBC胆管上皮および同時培養調査の電子顕微鏡検査 肝臓移植レシピエントから抽出した胆管上皮細胞(BEC)、ならびにリンパ節の
同時培養調査から得たBECおよび上清に対して電子顕微鏡(EM)調査を行った。異
なる調査において見とめられた粒子は、大きさおよび形が類似しており、Ｂ型お
よびＤ型レトロウイルス形態と合致していた。同時培養調査の間に１つのBECに
おいて槽内Ａ型粒子が見とめられたが、これは、出芽レトロウイルスの未成熟形
態を示しているのかもしれない。
【０１６１】 肝臓移植レシピエントから新しく単離されたBECの初期EM調査では、患者１人
当たり約200〜400の細胞の切片を盲検様式で調査した。比較グループの４人の患
者のうちの１人において単一のウイルス様粒子が検出されたのに対して、５人の
PBC患者のうちの３人が、１細胞当たりいくつかのウイルス様粒子の形跡を有し
ていた。個々の大きさは、約100〜120nMで、限定可能な(definable)エンベロー
プおよび高密度の楕円形の核を有しており、Ｂ型およびＤ型レトロウイルス形態
と合致した。シェーグレン症候群を患う患者から得たHRV 5と同様、PBCウイルス
は、存在度が非常に低いと思われ、100〜300のBEC当たりに１つしか見とめられ
なかった。細胞内粒子および細胞外粒子の両方を見とめた。
【０１６２】 同時培養調査においてインキュベート1週間後に、BECに対してEM調査を行い、
盲検様式で評価した。PBCリンパ節ホモジェネートを用いたある実験では、直径
が約80〜90 nmの大きさのＡ型粒子が小胞中で見つかった。同時培養調査からは
１週間後に上清も得て、超遠心分離器で処理し、陰性染色し、盲検様式で評価し
た。ウイルス様粒子は、ほとんど見とめられず、PBC同時培養上清においてのみ
見とめられた。これらは球形で、陰性染色によりウイルスエンベロープが白く抜
き出された１つの粒子では、核が中央にありかつ楕円形でＢ型レトロウイルス形
態と合致していた。
【０１６３】 上記調査は、PBCリンパ節ホモジェネートにより正常胆管上皮においてAMA反応
性を特定の様式で誘導できるという根拠のある証拠を提供する。さらに、正常BE
Cの形質転換によりPBCの表現型発現をもたらす伝染性物質(transmissible agent
)は、外因性Ｂ型およびＤ型レトロウイルスのゲノム特性、形態学的特性および
流体力学的特性を有する。
【０１６４】6.2 レトロウイルスクローニング調査 発現差(representational difference)分析により得られたレトロウイルス配列 発現差分析(RDA)をまず用いて、感染性物質がPBCの病因に病因学的に関与する
か否かを決定した。この技術は、「増幅材料(driver)」DNAには存在しない、「検査
材料(tester)」物(この場合肝臓サンプル)中の少量の細菌DNAを同定する力がある
(Lisitsynら, 1993. Science. 259:946-951)。このサブトラクションハイブリダ
イゼーションおよびPCR増幅法はまた、体細胞突然変異ならびにゲノム欠失およ
び挿入を検出する力がある(Lisitsynら, 1993. Science. 259:946-951)。これら
の調査において、Lisitsynおよび共同調査者らが記載するRDAプロトコールを用
いて、PBC患者および原発性硬化性胆管炎(PSC)を患う対照患者の肝臓および皮膚
から抽出されたDNAを、それぞれ検査材料および増幅材料として用いた(Lisitsyn
ら, 1993. Science. 259:946-951)。全てのRDA産物をクローニングし、配列決定
し、NCBIデータベースのblast検索によりアッセイした。一部のPBC RDA産物は、
未成熟形態のＢ型およびＤ型レトロウイルスなどのレトロウイルス様配列と最高
点の相同性を有することが見とめられた。ある産物は、内因性レトロウイルスER
V-9と91％のヌクレオチド相同性を有しており、他の３つの産物はそれぞれHTLV-
1エンベロープ遺伝子、ネコ免疫不全ウイルスenvタンパク質および地上リス(gro
und squirrel)ヘパドナウイルスpolタンパク質と部分的なヌクレオチド相同性ま
たはタンパク質配列相同性のいずれかを有していた。対照的に、PSC RDA産物で
はウイルスまたはレトロウイルス様配列は同定されなかった。以下は、同定され
たRDA産物の配列である。以下の配列は、患者の血清または組織サンプルをレト
ロウイルス感染の存在についてスクリーニングするための遺伝子マーカーとして
特に有用であり得る。
【０１６５】
【０１６６】 肝臓疾患患者および対照由来の肝臓の全DNAを用いたサザンブロット調査を、P
BC RDA産物をプローブとして用いて行った。さらに、レトロウイルス様PBC RDA
産物と相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、終末期肝臓疾患を患う
患者に由来する肝臓DNA、肝臓cDNAおよび血清cDNAに対してPCR調査を行った。サ
ザンブロットおよびPCR調査により、全てのPBC RDA産物がヒトゲノムにおいてコ
ードされていることを確認した。興味深いことに、RDA産物の１つ(S86)は、PBC
患者において有意に高いハイブリダイゼーションシグナルを有することが分かっ
た。これは、PBC患者における新規多ファミリーHERV様配列のコピー数がより高
いことを示唆する。
【０１６７】PBC患者由来の外因性レトロウイルスのクローニング レトロウイルスcDNAを単離およびクローニングする可能性を最大化するために
、同所肝臓移植された３人のPBC患者の全肝臓および２つの正常肝臓に由来する
胆管上皮細胞(BEC)から２つのライブラリーを作製した。BECを単離し、PBC患者
由来の細胞において最大細胞表面AMA反応性が見とめられる10日間、肝臓成長因
子と共に培養した(Joplin, R., T. Hishida, H. Tsubouchi, Y. Diakuhara, R.
Ayres, J.M. NeubergerおよびA.J. Strain. 1992. J Clin Invest. 90:1284-128
9)。凍結BECから合成されたcDNAを、λUni-zap XRTM cDNAライブラリー(Stratag
ene)にクローニングした。ex-assistヘルパーファージを用いて、PBCおよび正常
BECライブラリーを、線維状バクテリオファージベクターから、各ライブラリー
のcDNAを含むプラスミドベクターへと大量に切り出した。単離したウイルスも、
本発明者らのクローニング調査に使用した。肝臓サンプルからウイルス調製を行
い、Griffithsら(Griffithsら, 1997 J Virol. 71:2866-2872)に記載の可溶性タ
ンパク質複合体、またはGarryおよび共同調査者ら(Garry, R.F., C.D. Fermin,
P.F. Kohler, M.L.MarketおよびH.Luo. 1996. Aids Research and Human Retrov
iruses. 12:931-940)に記載のミクロソーム画分のいずれかを得た。さらに、胆
汁サンプル上でのウイルス調製は、細胞屑を除去し、超遠心分離器中で100,000g
にて上清からウイルスペレットを濃縮することにより行った。cDNA合成の前に、
DNAアーゼにより全てのウイルス調製物から残存ゲノムDNAを除去した。
【０１６８】 大量に切出したBECライブラリーを鋳型として用いた初期の実験においては、P
BC cDNAから得たエチジウムブロミド染色アガロースゲル上で予想された125塩基
対のPCR産物が見とめられたが、正常BEC cDNA鋳型では見とめられなかった。PBC
PCR産物の15の別個のクローンを配列決定したところ、それらは全て互いに対し
て97％の同一性を有していた。ヒト末梢血単核細胞をスクリーニングした際に検
出された配列の１つとしてShihおよび共同調査者らにより1989年に寄託された「
ヒト逆転写酵素遺伝子」(受託番号#M25768号)として定義されたHUMREVTRAC（Shih
ら, 1989, J.Virol. 63: 64-75)に対して最も高い相同性を有することがblastn
検索により分かった。blastnおよびblastx検索により、マウス乳腺癌ウイルス(M
MTV)ヌクレオチドおよびタンパク質配列と90％を越える相同性が明らかになった
。配列は、保存性LPQGXXXSP........YMDDレトロウイルス逆転写酵素モチーフを
コードし、全てのレトロウイルスおよびヘパドナウイルス逆転写酵素タンパク質
においてセリン-プロリンモチーフが保存されていることから、この遺伝子は元
々レトロウイルスである可能性が高い。ClustalW分析(MacVector 6.5)により他
の公知のヒトレトロウイルスヌクレオチド配列と比較した場合、PBC関連レトロ
ウイルスは、HERV-KおよびHRV-5、Ｂ型およびＤ型レトロウイルスと最も近似し
た配列相同性を有していた(図３)。
【０１６９】 異なる鋳型を用いて上記結果を確認するため、同じ縮重オリゴヌクレオチドプ
ライマーを、胆汁および肝臓組織のウイルス調製物由来のcDNAに対するRT-PCR実
験において用いた。これらの調査において、各サンプルから、RT-PCR産物の約6
〜10のクローンを配列決定した。PBC関連レトロウイルス配列を、７人の調査対
象PBC患者全員の胆汁cDNA(ｎ＝５)および肝臓cDNA(ｎ＝２)において検出したが
、胆汁に由来するクローンの約50％〜60％、および肝臓クローンの80％〜90％は
内因性レトロウイルスから誘導されていた。PBCを患っていない患者からなる比
較グループでは、PBC関連ウイルスについてのRT-PCRによれば単一の胆汁サンプ
ル(ｎ＝２)において１つの胆汁サンプルのみが陽性であり、同様の様式で処理し
た肝臓サンプル(ｎ＝２)では陽性はなかった。後者の調査では、エンベロープ化
レトロウイルスが同時沈降する1.13〜1.17の密度画分でRT-PCR反応性が見とめら
れた。これらの調査から、PBC関連レトロウイルスは、PBC患者の胆管上皮におい
て最も頻繁に見とめられ、次いで胆汁において見とめられたが、肝臓組織全体に
おいてはそれ程見とめられなかった。重要なことにライブラリー構築およびその
後クローニング調査を行うヒトまたは動物レトロウイルスについての調査はこれ
まで実験されたことはない。実際、様々なクローン間での配列の違いから、これ
らの配列が「PCR汚染」の結果により生じ得たものであるという懸念はほぼ無くす
ことができる。
【０１７０】 PBC関連レトロウイルスの罹患率を評価するために、肝臓の全DNA、肝臓cDNAお
よび血清cDNAを用いてPCR調査を行った。これらの調査のために、PCRオリゴヌク
レオチドプライマーおよびPBC関連レトロウイルスに相補的なプローブを合成し
、PBC患者、他の病因による肝臓疾患を患う患者、実質性肝臓疾患を患っていな
い患者、および血液ドナー由来のサンプルを回収した。PCR産物を、エチジウム
ブロミドで染色したアガロースゲル上で処理し、その後PBC関連ウイルス内在(in
ternal)オリゴプローブに対するサザンブロットハイブリダイゼーションを用い
て検出した。ウイルス配列は、PBCを患っている患者の肝臓および血清cDNAにお
いて主に検出された(表１)。肝臓DNAのPCRは、PBC患者および比較グループにお
いて陰性であり、この配列が内因的にコードされていないという見解と一致して
いた。PBC関連ウイルスcDNAは、対照よりもPBC肝臓サンプルにおいて有意に高い
頻度で検出された。
【０１７１】 これらのPCR結果はまた、この物質のコピー数が非常に低いか、またはPBC関連
ウイルスを検出するために採用したアッセイがあまり感受性が高くないことを明
らかにする。実際、両方の仮説に信頼を置ける証拠がある。弱いが目に見えるPC
R産物は、PBC BEC cDNAライブラリー由来のエチジウムブロミド染色されたアガ
ロースゲル上でのみ見とめられが、いずれの患者サンプルからは、見とめられな
かった。この調査結果は、肝臓中の細胞当たりのウイルスのコピー数が１を大幅
に下回ることを示唆する。また、縮重逆転写酵素プライマーを鋳型であるPBC BE
C cDNAライブラリーと共に用いたところ、PBC関連レトロウイルスプライマーと
比べて、相当に多い数のPCR産物が見とめられた。PBC BEC cDNAライブラリーの
縮重PCR調査で得た配列決定された全てのクローンがPBC関連ウイルス配列であっ
たことから、これらのプライマーを用いて検出されるシグナルが大きいのは、PB
C関連ウイルスよりもウイルス検出に対する感受性が高いことを反映しているた
めと考える。PBC関連ウイルスの正確な数を十分に評価し、物質の罹患率を十分
に評価するためには、ネスト化(nested)RT-PCR法またはリアルタイムPCR法での
さらなる調査が必要となる。
【０１７２】
【表１】
【０１７３】 さらに、PBC関連レトロウイルスが、肝臓に感染する他の公知のウイルスと比
べてはるかに豊富とはいえないことを示唆するのに良い証拠がある。電子顕微鏡
調査では、ウイルス粒子はPBC患者の胆管上皮細胞で1:100〜300の割合でしか見
とめられず、低い感染量を裏付ける。また、縮重PCRクローニング調査では、PBC
関連ウイルス対内因性レトロウイルスの検出は、PBC患者由来の肝臓ウイルス調
製物よりも胆管上皮の全cDNAにおいてはるかに高かった。従って、胆管上皮より
も肝細胞において物質の存在量が高いと考える根拠はない。これらの調査結果は
、1,000細胞につき推定コピー数が１ウイルスである、存在量が極めて低いウイ
ルスであるHRV-5感染で観察されるものと類似しうる(Griffithsら, 1997. J Vir
ol. 71:2866-2872)。
【０１７４】 PBC関連レトロウイルスゲノムのためのゲノム材料をさらにクローニングする
ために、PBC胆汁およびPBC BEC cDNAライブラリーの両方が最良の由来源である
と思われた。なぜなら、これらの画分(compartment)におけるウイルスの存在量
が高いからである。より多くのウイルスゲノムを単離するために、MMTV LTRおよ
びMMTV pol配列中の保存されたヌクレオチド配列と相補的なネスト化PCRオリゴ
ヌクレオチドプライマーを合成し、PBC BEC cDNAライブラリーおよびランダムな
(random)感作胆汁cDNAについてのPCRに使用した。これらの調査において、エチ
ジウムブロミド染色アガロースゲル上のPBC BEC cDNAライブラリーおよび７つの
PBC胆汁サンプルのうちの２つにおいて正確な大きさの産物が見とめられた。PCR
産物は過度に豊富ではなかったが、その後のネスト化PCRにより正しい分子量の
産物の存在を確認した。ネスト化産物をクローニングし、配列決定し、blastn検
索では全てのクローンがMMTV LTRと最高点の相同性を有していた。また、MMTV p
olの保存的ヌクレオチド配列と相補的な保存的オリゴヌクレオチドプライマーを
、blastn検索によりMMTV polとより高い得点の相同性を有する産物をクローニン
グおよび配列決定するために使用した。
【０１７５】7. レトロウイルスイムノブロット調査 PBC患者はHIVおよびHIAPタンパク質に対して血清反応性を有する クローニング実験と並行して、PBCの病因論においてレトロウイルスを示唆す
る他の証明も探した。PBC患者がレトロウイルスタンパク質に対する抗体反応性
の証拠も有するか否かを評価するために、HIVおよびHIAPイムノブロットを用い
たウェスタンブロット調査を、レトロウイルス感染の証明についての代理テスト
として行った(Masonら, 1998 Lancet. 351:1620-24)。これらの調査において、
ウェスタンブロットを、77人のPBC患者、125人の肝臓疾患対照、48人のSLE患者
、および25人の健康な被験者に由来する血清サンプルを使用して行った(Masonら
, 1998. Lancet. 351:1620-24)。いずれの患者にもHIV感染について確立された
基準は見とめられず、HIV gagおよびエンベロープタンパク質の両方に対して反
応性を有する者はいなかった。ウイルス肝炎、特発性胆管疾患およびSLEを患う
患者の一部において単一HIV p24反応性を見とめたが、健康な被験者対照、およ
び遺伝性またはアルコール誘導型肝臓疾患を患う患者では反応性はほとんど見と
められなかった(表２)。HIV p24 gag反応性における有意な差は、PBC患者と、AL
Dまたはα-1ATを患う対照グループおよび健康なボランティア(ｐ＝0.003)との間
で見とめられた。
【０１７６】
【表２】
【０１７７】PBC患者は、レトロウイルスの流体力学的特性をもつ肝臓核酸/タンパク質複合体 を有する PBC患者が特徴決定されていないレトロウイルスで肝臓感染されているという
仮説に取り組むために、PBC患者および正常肝臓由来のウイルス抽出物を使用し
、33％〜68％のショ糖勾配で分離して、これを用いてウェスタンブロットを行っ
た。イムノブロットを、PBC血清で展開し、全てのPBCおよび正常肝臓勾配のサン
プルにおいて75 kDaおよび50 kDAタンパク質に対する反応性を観察した。これは
混在するPDC-E2および他のミトコンドリアE2タンパク質に対する自己反応性を示
唆していた。しかし、正常肝臓勾配においては見とめられなかったPBCミクロソ
ーム抽出物のウェスタンブロットで約40 kDaの特異的なバンドを見とめた。免疫
反応性は、エンベロープ化レトロウイルスが同時沈降する1.14〜1.17 g/mlの密
度にわたる勾配にのみ見とめられた。さらに、PBC関連レトロウイルスプライマ
ーを用いたRT-PCR調査により、PBC患者が、1.14〜1.17 g/ml抽出物中に、対照肝
臓勾配では見とめられなかった検出可能なウイルスRNAを有することが分かった
。従って、PBC患者の肝臓ミクロソーム抽出物のみが、PBC患者の血清に対する実
証可能な抗原反応性、およびPBC関連レトロウイルスの検出可能なゲノム配列の
両方をもち、エンベロープ化レトロウイルスの流体力学特性を有する特定のタン
パク質/核酸複合体を含んでいた。
【０１７８】 PBC BECライブラリー由来のクローンが全て、公知のMMTV配列と近い同一性を
有するため、推定PBCウイルスがMMTVと相当な抗原類似性を有しうると考えられ
た。従って、マウスMM5MT細胞(NCI受託機関(NCI repository))、MMTV産生乳癌細
胞系を用いてウェスタンブロット調査を行い、PBC患者がマウスウイルスに対し
て血清学的反応性を有するか否かを決定した。これらの調査のため、MM5MT細胞
の粗細胞溶解物をSDS-PAGEゲル上で分離し、MMTV gagタンパク質およびMMTV pol
に対するポリクローナル抗体を陽性対照として用いた(Quality Biotec, NCI受託
機関)。PBC患者において、対照では見とめられなかった複数のタンパク質に対す
る血清学的反応性が見とめられた(図４)。具体的にいうと、77 kDaの前駆体未切
断gagタンパク質が、大半のPBC患者において見られ(図４中、矢印)、これは、他
の肝臓疾患患者及び血液ドナーと比べて統計的に有意な調査結果であった(83％
対13％；表３)。さらに、ほとんどのPBC患者は、陽性対照抗体、ならびにÅ70 k
Da、Å50 kDaおよびÅ40 kDaのタンパク質と相関する他のタンパク質に対して血
清学的反応性を有していたが、これが、ミトコンドリアタンパク質またはウイル
スタンパク質のいずれに対しての抗体反応性を反映するか否かを識別するのは難
しかった。
【０１７９】 HIAP感染型RH9リンパ芽球様(lymphoblastoid)細胞由来のミクロソーム抽出物
を用いた調査では、PDC-E2自己抗原に反応する特異的なマウスモノクローナル抗
体を用いては、ミトコンドリアタンパク質に対する反応は見つからなかった。ミ
トコンドリアタンパク質の抽出を最小限にするため、MMTV槽内Ａ型粒子の未成熟
核コアが集合したMM5MTミクロソーム抽出物を用いてイムノブロットを行った。
ミクロソーム抽出物の陰性対照として、Tatトランスジェニックマウス由来の非M
MTV産生乳癌細胞系をイムノブロット調査に用いて、ミトコンドリアタンパク質
が同時精製されているか否かを評価した。ミクロソーム抽出物に加えて、精製ウ
イルス抽出物を、モノクローナルMMTV p27 gag抗体を陽性対照として用いるウェ
スタンブロット調査の基質として用いた。離乳体C3Hマウスの胃の中の凝乳からM
MTVを単離し、乳タンパク質をこれらの調査の陰性対照として用いた。
【０１８０】 ウイルス調製物は、イムノブロットの感受性および特異性を改善した(図５)。
全てのPBC患者が精製MMTVに対して血清学的反応性を有しており、PBC患者の75％
がミクロソーム抽出物に対して免疫反応性を有していた(表３)。約70 kDa、50 k
Da、および40 kDaにあるタンパク質において優勢な反応性が同じく見とめられた
が(図４中、ミクロソーム抽出物ブロットにおける矢印)、特異的なタンパク質反
応性を決定する必要がまだある。離乳体の胃由来の精製抽出物において、前駆体
110 gagタンパク質に対する弱い血清学的反応性が見とめられた(図４中、精製MM
TVブロットにおける矢印)。その一方、調査された全てのPBC患者において70 kDa
タンパク質に対する著しい反応性が見とめられ、調査グループのおよそ半分が50 kDaタンパク質に対する血清学的反応性を有していた。
【０１８１】 どのような抽出方法を用いても、MMTVタンパク質に対する反応性の頻度は、慢
性肝炎または血液ドナーの比較グループよりもPBCグループにおいて有意に高か
った(表３)。重要なことに、Tatトランスジェニックマウス乳癌細胞系由来のミ
クロソーム抽出物または乳タンパク質のブロットのいずれに対しても、PBC血清
を用いた際に陰性対照ブロットは免疫反応性を示さなかった。これらのイムノブ
ロット調査から得た最も目立った調査結果は、大半のPBC患者がマウスウイルス
と血清学的反応性を有することであり、これはPBCを患う患者におけるPBC pol配
列のRT-PCR検出を補足するものである。このことは、大半のPBC患者が、MMTVに
抗原的に関連する物質に曝されたことを示唆する。
【０１８２】 PBC患者に見られる血清学的反応性を提供する抗原タンパク質の性質は、これ
までに部分的にしか特徴決定されていない(図６)。非常に興味深いことに、精製
ウシPDC-E2(Sigma)のアフィニティーカラムでの溶出によりPBC患者の血清から抽
出されたAMAも、ミクロソーム抽出物および精製ウイルスから誘導したウェスタ
ンブロットにおいて50 kDaおよび70 kDaタンパク質に対して反応した(図６)。対
照的に、ウシPDC-E2に対して生じさせたマウスモノクローナル抗体は、ミクロソ
ーム抽出物または精製ウイルスのいずれとも反応しなかった。70 kDaタンパク質
に対するAMAイムノブロット反応性は、5 mgのウシPDC-E2(それ自体で約70 kDaの
分子量を有する)との予備インキュベーションによりブロックされ得る。一方、5
0 kDaタンパク質およびp110 gag前駆体に対する溶出されたヒトAMAの血清学的反
応性は、ウシPDC-E2で血清を溶出することにより大幅に変化することはなかった
。さらに、３人のPBCを患っている患者から得た血清の予備インキュベーション
もまた、精製ウイルスに対する免疫反応性を低下させる効果がほとんどなかった
(図６)。これらの調査は、これらのブロットにおいてPBC血清反応性を促す50 kD
aおよび70 kDaタンパク質が、それぞれ50 kDaおよび70 kDaの分子量を有するミ
トコンドリア自己抗原PDC-XおよびPDC-E2を単に示すだけとは思われないことを
示唆する。この場合、マウスAMAとの免疫反応性、および精製MMTVに対するPBC血
清反応性のいくらかの実証可能な阻害が見られることが予想される(図６)。
【０１８３】 HIAP感染型リンパ芽球様細胞のミクロソーム抽出物を用いたこれまでのウェス
タンブロット調査では、AMA反応性は見とめられず、この抽出方法がミトコンド
リアタンパク質を同時精製しないことを示唆する。AMAは乳タンパク質のウェス
タンブロットとも反応しなかったため、離乳体凝乳由来の精製MMTVは、乳中のミ
トコンドリアタンパク質を混在していなかったと思われる。現在まで、精製MMTV
が、PDC-E2に対するPBC患者の血清反応性をブロックできるか否かは評価されて
いない。現時点では、これが交差反応性ウイルスタンパク質に結合したAMAとの「
分子擬態」を表すのか否か、またはPDC-E2もしくは関連宿主タンパク質が実際にM
MTV粒子と共に同時パッケージングされて(例えばHIVにおいて見とめられるよう
に)いわゆる「バイスタンダー(bystander)効果」を促すのか否かは知られていない
。上記調査は、PBCを患う患者が、MMTVと抗原決定基を共有するウイルスに対す
る血清学的反応性を有するのみでなく、MMTVタンパク質複合体が、主要PBC自己
抗原であるPDC-E2と血清学的に交差反応する抗原を含むことを示唆する良い証明
を提供する。
【０１８４】
【表３】
【０１８５】8. 胆管上皮同時培養および電子顕微鏡調査 PBC患者はリンパ節に伝染性物質を有する PBCの発生に影響を及ぼす遺伝的要因および環境的要因が決定されていないた
め、PBC関連レトロウイルスが感染症についてのコッホ仮説を満たすかどうかは
未知である。さらに、コッホの仮説は慢性障害について確立するのは難しい。し
かし、PBCが感染性障害であるという仮説は、胆管上皮におけるAMA反応性を疾患
の表現型マーカーとして用いてin vitroで試験されている(Sadamotoら, 1988, L
ancet 352:1595-1596)。非肝臓疾患患者から抽出した正常BEC、ならびにPBC患者
および肝臓疾患対照から肝臓移植時に得た門脈周囲リンパ節を用いて同時培養調
査を行った。PBC門脈周囲リンパ節は、該組織中の約25％のマクロファージがAMA
反応性を有するため「感染された」材料として選択した(Sadamotoら, 1988, Lance
t 352:1595-1596)。この調査において、リンパ節をホモジェネートし、培養培地
中で希釈し、正常BECと18時間インキュベートした。その後、培養培地を置き換
え、細胞を処理する前に７日間維持した(Sadamotoら, 1988, Lancet 352:1595-1
596)。
【０１８６】 抗原精製AMAを用いたウェスタンブロットおよび免疫組織化学によりBECタンパ
ク質発現を調査した。ウェスタンブロットにより、他の肝臓疾患患者由来の比較
グループのホモジェネートと比べて、PBCリンパ節とインキュベートされたBECに
おいてPDC-E2発現が２〜３倍増加していることが明らかになった(Sadamotoら, 1
988, Lancet 352:1595-1596)。さらに、PBCリンパ節と同時培養したBECは、比較
グループでは見とめられなかったAMAに対する実証可能な免疫組織化学反応性を
有していた(Sadamotoら, 1988, Lancet 352:1595-1596)。次に、これらの調査か
ら得た上清を、新しいBECを用いたさらに別の実験セットのために用いたところ
、またPBC由来上清とインキュベートされた際に新しいBEC培養中でAMA反応性が
生じた。換言すると、PBCリンパ節由来の伝染性因子が正常BECを形質転換させ、
その後３回の培養培地交換の後、これらの細胞に由来する上清が二番目のBECバ
ッチを形質転換させた。従って、PBCリンパ節に由来する可溶性因子またはIgA/P
DH-E2免疫複合体が二番目のBECセットを形質転換したとは思われない。なぜなら
、これらはこの処理により相当に希釈されているはずだからである。
【０１８７】 電磁ビーズに結合したAMAに予め固定したBECを用いた同時培養の１週間後にEM
調査を行った(図７ａにAMA反応性の大まかな様子(bulky appearance)を示す)。A
MAは、細胞表面、および成熟レトロウイルスで見とめられる典型的な核高密度コ
アを持たない直径100〜150 nmの大きさのくぼんだ構造に結合した(図７ａ)。こ
れらの円形構造は、微絨毛としては大き過ぎ、成熟ウイルスの外観を有しておら
ず、これらが欠損ウイルス粒子であるか否かを決定するにはさらなる調査が必要
である。しかし、小胞内に軸(stalk)を有する80〜90 nmの核高密度構造を有する
細胞膜付近のAMA陽性BECにおいて、槽内Ａ型粒子に似た構造が見とめられた(図
７ｂにおいて矢印で示す)。
【０１８８】 １週間目の同時培養調査から得た使用済み(spent)上清を、超遠心分離器で処
理し、陰性染色し、電子顕微鏡法により盲検様式で評価した。ウイルス様粒子は
ほとんど見とめられず、PBC同時培養調査でしか見とめられなかった。粒子は110
〜120 nmの大きさを有しており、球状で、典型的なエンベロープ糖タンパク質ス
パイクを有しており、これは、PBC患者由来のBECにおいてin vivoで見とめられ
るスパイクに匹敵した。陰性染色によりウイルスエンベロープが白く抜き出たあ
る粒子においては、コアが偏心配置された正二十面体の核を有しており、in viv
oで検出された粒子の外観に類似しており、MMTVの典型的なＢ型粒子形態学的特
徴と合致していた。
【０１８９】 PBCリンパ節ホモジェネートと同時培養された正常胆管上皮細胞の表現型の変
化は、伝染性物質での感染に派生するものと考えられた。推定PBCウイルスから
誘導された配列が胆管上皮細胞において検出されうるか否かを確立するために、
推定PBCウイルスLTR配列と相補的なネスト化オリゴプライマーを用いたRT-PCR調
査を盲検様式で行った。５人のPBCを患っている患者、他の肝臓障害を患ってい
る８人の患者、および２人の健康な個体から得たリンパ節同時培養調査の20のコ
ード標本(デュプリケート（duplicates)を含む)から合計RNAを抽出した。各サン
プルは約70,000〜280,000の細胞を含み、これらをRT-PCR調査に使用した。エチ
ジウムブロミド染色アガロースゲル上の正確な分子量バンドを可視化することに
より判断したところ、合計で、５人のPBC患者のうちの４人、および10人の対照
のうちの原因不明の肝臓疾患を患う１人が、PBCウイルス配列について陽性であ
った(ｐ＝0.017、フィッシャーの正確検定)。重要なのは、１ラウンド目のPCRで
はバンドは見とめられず、これは配列が高度に発現されていないことを示唆する
。これらの調査結果は、正常胆管上皮細胞中のPDC-E2様分子に対するAMA反応性
の発生が、元々PBC患者の胆管上皮細胞からクローニングされた物質での感染に
部分的に関連するという仮説を裏付ける。
【０１９０】
【表４】
【０１９１】 約５mlのPBCおよび対照リンパ節同時培養調査の上清から抽出されたRNAに対す
る初期RT-PCR実験において、クローニングされたPBC関連外因性レトロウイルス
に相補的なプライマーを用いて産物は見とめられなかった。ウイルス様粒子がほ
とんど見とめられないことが電子顕微鏡調査(下文参照)から明らかになった後、
PBCリンパ節同時培養から得た56 mlのプールされた上清を用いて、ウイルス様粒
子の性質を調査した。プールされた上清を、60％ショ糖クッション(cushion)を
介して濃縮し、20％〜60％の勾配を介して分離した。500μlの画分を回収し、各
画分の密度を屈折計で決定した。「銀アッセイ(Silver assay)」(Grossら, 1998,
Science 281:703-706)により各画分における逆転写酵素反応性を決定し、抽出RN
Aに対してRT-PCRを行ってPBC関連ウイルスを検出した。1.147〜1.169 g/mの密度
にわたる８つの勾配において逆転写酵素反応を検出した。これらの勾配のうちの
３つは、PBC関連レトロウイルスに相補的なプライマーでのRT-PCRで陽性であっ
た(詳細については表４を参照のこと)。同様の実験を、また対照グループのプー
ルされた上清サンプルに対して行う必要がある。
【０１９２】 SV40不死化BEC系統を用いて、PBC患者(ｎ＝２)および肝臓疾患対照(ｎ＝２)由
来の肝臓生検材料で同時培養調査を行った。RT-PCRで感染が証明されなかったPB
C肝臓で、リンパ芽球様RH9細胞系を感染させるよう試みた。さらに、肝臓移植レ
シピエントの肝切除標本に由来するウイルス調製物を用いて、上清in vitroショ
糖勾配調査を完了した。PBC由来肝臓ウイルス抽出物の1.14〜1.17 g/ml画分にお
いて、PBC pol配列をRT-PCRにより検出したが、肝臓疾患対照患者では検出され
なかった。従って、PBC患者の肝臓ウイルス調製物は、エンベロープ化レトロウ
イルスの流体力学特性と合わせて特異的なPBC pol配列を含んでいた。
【０１９３】「PBC特徴」の誘導は馴らし培地によっても誘導できる ： また「PBC特徴」を誘導できる馴らし培地に因子があるか否かを決定するために
、PBC LNまたは非PBC LN(「PBC/非PBC馴らし培地」)のいずれかと予備インキュベ
ートされたBECから得た５日間培養培地を、正常被験者由来BECの新鮮な培養物に
播種した。PBC馴らし培地(ｎ＝４)は、組織培養培地単独の場合と比較して中央
値誘導指数が2.19(1.07〜3.14の範囲)(p<0.04)であった。ここでも、抗PDC染色
パターンはPBC肝臓から単離されたBECに典型的なものであった。対照的に、非PB
C馴らし培地(ｎ＝４)は、誘導指数が1.06(0.93〜1.211の範囲)であった。７日間
にわたる毎日の細胞サンプリングにより、PBCリンパ節とのインキュベーション
から４日目に初めて異常型E2発現が検出されることが示された。
【０１９４】γ放射は馴らし培地の効果を壊滅する ： ３つの標準実験ウイルスを対照として使用した。単純ヘルペスウイルスＩ型(H
SV1)およびアデノウイルス２型(AV2)は、二本鎖DNAを含む(HSV1はエンベロープ
化されており、AV2はネイキッドである)。コクサッキーB4ウイルス(CB4)は、一
本鎖RNAを含む非エンベロープ化ウイルスである。それぞれのウイルスの力価は
、各ウイルスの適切な細胞系における終点希釈(end-point dilution)により確定
した(HSV1はBHK 21細胞において、AV2は293細胞において、およびCB4はVero細胞
において)。各ウイルスストックに30KGyで18時間にわたり照射し、ウイルス力価
を再度確定した。このレベルの照射処理により、ウイルスの複製の可能性がほぼ
壊滅することがわかった。PBC馴らし培地(ｎ＝７)に同じレベルの照射を行った
ところ、非照射馴らし培地のアリコートにより誘導されるPDC-E2の量の３分の１
に減少した。E2の膜染色は、BECが照射PBC馴らし培地とインキュベートされた場
合には見とめられなかった。照射が他のタンパク質を変性するという仮説を試験
するために、TNF-αおよびIL-1の機能的影響に対するγ照射の影響を試験した。
これらの培地の照射アリコートおよび非照射アリコートを用いて、肝臓洞様毛細
血管内皮細胞(hepatic sinusoidal endothelial cells：HSEC)の培養物を処理し
た。IL-1およびTNF-αは、HSECによるIL-1の放出を生じる。これを、特異的ELIS
AによりHSEC上清中で測定した。照射後のIL-1産生には違いが見られず、照射後
のE2誘導の欠失が、核酸に対する影響によるものであることを示唆した。しかし
、他の可溶性分子がPDC-E2誘導を生じ得る可能性も残っている。
【０１９５】「PBC表現型」を誘導する原因となる因子は粒子であり得る ： 可溶性非粒子物質を排除するさらなる試みにおいて、PBCを患う患者由来のリ
ンパ節ホモジェネート(ｎ＝５)を80分間遠心分離し、これらの粒子を含まない上
清を上述のように伝染性実験において接種材料として用いた。上清は新しい細胞
においてPBC「表現型」の発現を生じなかった。
【０１９６】IgA取込みはこれらの影響に無関係である ： BECはIgAを取込むことおよび分泌することができるために、IgAはPBCの病因に
関係があるとされてきた。これらの実験において見られる調査結果はIgAの取り
込みによるものであるという可能性は低い。なぜなら、IgAはPBC「表現型」を誘導
した上清中で検出されなかったからである(検出限界が0.3 ng/mlと低いELISAを
使用)。
【０１９７】ウイルスであるかもしれない粒子は「PBC表現型」を誘導できる細胞およびその上
清において検出可能である ： ウイルス物質の関与について裏付ける証明を電子顕微鏡検査により得た(図２)
。予備実験において、PBC患者由来の単離BECにおいてウイルス様粒子を見とめた
。さらなる調査において、PBCおよび非PBC患者由来のBECを培養し、細胞ペレッ
トから得た薄い切片を試験した。高密度の(おそらく核酸であろう)コアを有する
100〜120nmのウイルス様粒子を見とめた。これらの粒子は、PBCに由来するBECの
３つの調製物の全て、および非PBCに由来する６つのBEC調製物のうちの１つのみ
に見とめられた。さらに別の２つの実験セットにおいて、BECをPBCまたは非PBC
LNのいずれかに曝し、細胞切片により細胞ペレットを試験し、一方で上清を陰性
染色により試験した。ここでも、ウイルス様粒子は、非PBC標本(1/9)よりも、PB
C誘導型接種材料(LNまたはBECのいずれにせよ)(5/9)と関連性を有することが示
された。
【０１９８】 全体的に、同時培養調査から、PBCリンパ節および肝臓ホモジェネートにより
正常胆管上皮においてAMA反応性が特異的な様式で誘導され得るという根拠のあ
る証明を得た。さらに、正常BECをPBCの表現型発現へ形質転換させることに関連
する伝染性物質は、外因性Ｂ型レトロウイルスのゲノム特性、形態学的特性、お
よび流体力学的特性を有する。
【０１９９】9.原発性胆汁性肝硬変を患う患者に対するラミブジン療法 PBC患者における逆転写酵素阻害剤の効力および生物学的応答を評価するため
に、１日につき150mgのラミブジンを１年間用いて調査を行った。治療を受けた1
0人の患者のうち誰も治療に対して完全な生化学的応答は示さなかったが、８人
の患者において血清AMAレベルが減少し、２人には変化が見られなかった。これ
が胆管自己抗原レベルの減少を反映するAMAに当てはまるか否かを、治療後の肝
臓生検材料に対するAMA免疫組織化学反応性を分析することで評価する必要がま
だある。７人の患者が、組織学的比較のために十分な治療前肝臓生検材料および
治療後肝臓生検材料を有していた：４人の患者において治療後に肝炎指数が減少
し、１人は変化がなく、２人の疾患が組織学的に進行していた。２人の患者にお
いて、自発的事象として報告されることはまれであるルートヴィッヒ段階(stage
)の減少を伴う劇的な(HAIスコアで>5の減少)組織学的改善が見とめられた。
【０２００】 この抗ウイルス調査は、初期段階の疾患を患っている患者における肝臓障害が
抗ウイルス療法のみで著しく減少できるのと同等の自己免疫疾患プロセスの誘導
について重要な結果を有する。従って、自己免疫現象が、PBCの段階Ｉおよび段
階IIにおける疾患プロセスを仲介するのに主要な役割を果たす可能性は低い。ま
た、AMAにおける減少は、簡単には説明できない興味深い観察である。ウルソデ
オキシコール酸に対して部分的な肝臓生化学応答を有する患者に見とめられるよ
うに、疾患プロセスが解明(resolve)されれば、AMAの産生レベルを減少させるこ
とができる可能性がある。また、抗ウイルス治療がウイルスタンパク質/自己抗
原発現を減少させて、体液性免疫応答およびAMA産生を低下させることも可能で
ある。
【０２０１】 ラミブジン療法が、PBC患者の胆管上皮細胞上で見とめられるPDC-E2様分子の
異常型発現になんらかの強い影響を及ぼすか否かを評価するために、免疫組織化
学調査を行った。PDC-E2に対するマウスモノクローナル抗原を用いた免疫組織化
学調査を、治療前および治療後組織サンプルを十分に有する７人の患者から得た
肝臓生検サンプルに対して行い、結果を盲検様式で評価した。ラミブジン療法の
１年後に３人の患者が検出可能なAMA染色を有していたのに対して、４人の患者
からPDC-E2様分子の形跡が消えた。この調査の結果は、ラミブジン療法が組織学
的改善、および自己抗体レベルの低下を伴う自己抗原提示の減少に関係するらし
いことを示す。
【０２０２】均等論 本発明の方法および組成物は、様々な実施形態に採用されることができ、上記
例示および説明はそのうちのほんの一部でしかないことが理解されるであろう。
具体的な実施例を記載したが、上記記載は例示であり限定するものではない。本
発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で
具現化され得る。上記実施形態は、あらゆる点で例示のものであり限定するもの
ではないとみなされるべきである。従って、本発明の範囲は、上記記載ではなく
添付の請求の範囲により示される。請求項と等価の意味および範囲内にある変化
は本発明の範囲に含まれるものである。
【０２０３】 本出願に引用した全ての刊行物および特許文書は、個々の刊行物または特許文
書が個別に示されるがごとく、あらゆる点において参照によりそれらの全体にお
いて組み入れられるものとする。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図1は、PBC患者から得た胆管上皮細胞の電子顕微鏡写真であり、色濃い卵形の
核中心を持つウイルス様粒子が観察される（aおよびｂ：白い棒は1μｍを示し、
差込図は5倍拡大写真である）。
【図２】 図２は、MMTVに類似の形態を有する粒子の電子顕微鏡写真である。図（a）お
よび(b)はPBC共存培養実験の上清から得た非染色ウイルス様粒子を示す。図(a)
は、外被糖タンパク質である「スパイク」を有する球状粒子を提示している。図
(b)は、非染色粒子が外被を突き刺して、異様な位置にある正十二面体であるこ
とを示す。(a)および(b)は双方とも、図１aの粒子を拡大したものである(c)およ
びMMTVの原型のB型粒子である(d)と比較できる。
【図３】 図３は、BおよびD型レトロウイルスに関連するHERV-K10およびHRV-5とPBC関連
レトロウイルスに最も近系の相同性を示すヒトレトロウイルス逆転写酵素pol遺
伝子配列のクラスターWアラインメイトの系統樹を表している。PBC-RV PBCレト
ロウイルス関連HERV-K10ヒト内因性レトロウイルスK10；HRV-5ヒトレトロウイル
ス５、HIVヒト免疫不全ウイルス、MSRV多発性硬化症レトロウイルス、HTLV1ヒト
T細胞白血病ウイルス-1、HFVヒト泡状ウイルス、HBV B型肝炎ウイルスを示して
いる。
【図４】 図４は、PBC患者および血液提供者から得た血清で増殖させたMM5MT細胞系由来
の細胞溶解液で実施したMMTVタンパク質ウエスタンブロット実験の結果を示す。
MMTVgagおよびpol（NCI）に対するポリクローナル抗体の陽性対照を示している
。
【図５】 図５は、MM5MTまたは精製ウイルスから得たミクロソーム抽出物のMMTVウエス
タンブロット実験の結果を示す。モノクローナル抗MMTVp27gag抗体での図４と同
様の陽性対照を示している。
【図６】 図６は、PBCおよび肝疾患患者から得た血清で増殖させて精製したMMTVおよびM
M5MTのミクロソーム抽出物、ならびにPBC患者から得て抽出したヒトAMAおよびマ
ウスモノクローナルAMAで実施したMMTVタンパク質ウエスタンブロット実験の結
果を示す。50kDaまたは70ｋDaでの反応はマウスAMAでは見られなかった。PDC-E2
とプレインキュベーションすることでヒトAMA反応性は低減したが、PBC患者血清
の反応性ではほとんど影響がなかった。
【図７】 図7は、7日間PBCリンパ節とインキュベートした正常BECのAMA免疫組織化学実
験の結果を示す。細胞表面のくぼんだ構造に対するAMA反応性を示す電子顕微鏡
写真である。矢印は、曹内のA型粒子に典型的な小胞内の粒子を指す（白い棒は
、500nm；拡大率はｂよりaの方が大きい）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 5/14 Ａ６１Ｐ 17/00 17/00 29/00 29/00 31/12 31/12 37/02 37/02 37/06 37/06 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｈ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｅ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 スー，リゼ アメリカ合衆国 70001 ルイジアナ州， メタイリエ，サウス アイ−10 サービス ロード 3736 (72)発明者 ニューバーガー，ジェームス イギリス国 ビー48 ７エスティー ウォ ーセスター，ラドフォード ロード，モー ト ハウス Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA32 CA04 DA02 EA04 GA11 HA11 4B063 QA01 QQ43 QR32 QR55 QR62 QS33 QS34 4C084 AA13 AA17 ZA75 ZA89 ZB02 ZB05 ZB33 ZC06 4C086 AA01 EA16 NA14 ZA75 ZA89 ZB02 ZB05 ZB33 ZC06

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 PBCを有する個体を特定する方法であって、PBCレトロウイル
    ス核酸分子が存在するか否かを検出する工程を含み、該核酸分子の存在により、
    その個体が上記障害を有していることが示される上記方法。
  2. 【請求項２】 核酸分子が配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、
    １０、１１、１２、１３、１４または１５に示すヌクレオチド配列を有する、請
    求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 単離されたPBCレトロウイルスを含む組成物。
  4. 【請求項４】 PBCレトロウイルスに感染した個体を特定する方法であって
    、PBCレトロウイルス核酸分子が存在するか否かを検出する工程を含み、該核酸
    分子の存在により、その個体が該ウイルスに感染していることが示される上記方
    法。
  5. 【請求項５】 PBC pol配列を標的とする成分を治療に有効な量で投与する
    ことにより、ウイルスに感染した個体内のPBCレトロウイルスの複製を抑制する
    方法。
  6. 【請求項６】 上記成分がアンチセンス分子である、請求項５記載の方法。
  7. 【請求項７】 上記成分が逆転写酵素阻害剤またはプロテアーゼ阻害剤であ
    る、請求項５記載の方法。
  8. 【請求項８】 組織サンプル中のPBCレトロウイルスの存在を特定する方法
    であって、サンプルとPBCに特異的な血清との免疫反応性が存在するか否かを検
    出する工程を含み、該免疫反応性の存在により、その組織が該ウイルスに感染し
    ていることが示される上記方法。
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