JP2003505368A - 保護されたチオールを脱保護する方法 - Google Patents
保護されたチオールを脱保護する方法Info
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Abstract
Description
ベンジルおよびt−ブチル基(本明細書では以後、それぞれAcm、MBzlお
よびtBuと称する)により保護されたチオールであって、ジスルフィドを生成
する脱保護されたチオールの同時酸化を伴う脱保護のための新規な方法に関する
。そのような方法は、ペプチド合成において特に有用である。
官能基を保護することはまったく日常的なことである。例えば、反応性カルボニ
ル官能基はしばしばケタールとして保護され、反応性ヒドロキシル及びカルボキ
シル基はしばしばエステルとして保護される。
的に、ペプチド合成の間保護を必要とする。ベンジル、MBzl、4−メトキシ
ベンジル、トリチル、メトキシトリチル、tBu、t−ブチルチオール、アセチ
ル、3−ニトロ−2−ピリジンスルフェニルおよびAcmを含む広範なチオール
保護基が公知である。それら全ての基は、ペプチド合成において有効に用いられ
てきたし、「ザ・ペプチド」第2巻、グロスおよびマインホッファー編集、アカ
デミックプレス、233〜240ページ(1980年)においてバラニーとメリ
フィールドにより概説されている。
素、銀(I)またはタリウム(III)による処理により酸化開裂(oxida
tive cleavage)により取り除かれる。それは一般的に酸安定性と
みなされる。というのは、Acmの酸分解開裂は、無水または水性酸中で理論的
に可能であるけれども、そのような反応は、硫黄原子のプロトン付加における困
難さのために実際上不便なほど遅延性であるからである。
1030〜1034ページ(1993)においてフジイらは、Cys(Acm)
およびトリフルオロ酢酸(TFA)/10%ジメチルスルホキシド(DMSO)
を用いるオキシトシンの合成および酸化を記述する。その著者らは、Cys(A
cm)−オキシトシンが、上記TFA/DMSO混合物中の12時間処理後にほ
ぼ無傷に持ちこたえたと述べ、Acm保護がそのような酸条件の下で安定である
ことを示している。S−Acm基はまた、フッ化水素酸(HF)およびヒドラジ
ンのような強力な求核試薬に対して安定であるとして、J.Am.Chem.S
oc.94、5456〜5461ページ(1972)においてビーバーらによっ
ても報告されていた。
においてHF−アニソールによる4つのAcm基を含むペプチドの処理は、20
%の除去されたAcm基をもたらしたと報告した。より最近では、フィッシャー
らは、J.Pep.Res.49(4)、341〜346ページ(1997)に
おいて、Acmの酸分解開裂によるチロシン残基に対する修飾を記載し、シンら
は、テトラヘドロン・レターズ第37巻第24号4117〜4120ページ(1
996)においてC末端Cys(Acm)ペプチドからのAcmの部分的酸分解
開裂について報告する。それらの酸誘起脱保護反応は、ペプチド開裂の間の望ま
しからぬ副反応とみなされる。
強酸を用いて開裂される。テトラヘドロン・レターズ第32巻第9号1223〜
1226ページ(1991)においてオオタカらは、MBzl基はTFAに対し
て安定であり、MBzl保護化システインは室温でTFA/10%DMSOによ
る処理の際にシスチンに変換されないことを報告する。
またはトリフルオロメタンスルホン酸による酸分解により酸化開裂により取り除
かれる。その基は、TFAおよびヨウ素酸化に対して安定であると考えられる。
(1992)においてアカジらは、MBzl、tBuおよびAcmを含む様々の
システイン保護基の酸分解除去を報告するけれども、反応は、適切なシリルクロ
リドの存在に依存する。
ール保護基が酸化条件の下で酸に対して不安定であるという予想しなかった発見
に基づいている。したがって、tBuチオール保護基は、室温でこの方法で急速
に開裂し、高温でさらにより急速に開裂しうる。AcmおよびMBzlチオール
保護基は、数時間以下の反応時間で実質的に定量的な脱保護を達成することが可
能であるほど、30℃を超える温度で、特に50℃以上の温度でそのような条件
の下で不安定さが増大するようになる。そのような酸誘起脱保護は、そのことが
Acm、MBzlおよびtBu基を除去するために現在用いられるより毒性の試
薬の使用の必要を回避するという点において特に有益である。酸化剤の存在下で
脱保護を行うことにより、遊離したチオール基は、直接分子間または分子内ジス
ルフィド基に変換される。本明細書で以下検討されるように、このことは、ジス
ルフィド結合を含む環状ペプチドの合成において特に有用な応用を有する。
またはtBu−保護化チオールの脱保護のための方法であって、脱保護およびジ
スルフィド結合の生成をもたらすのに十分な温度で酸化剤の存在下で前記保護化
チオールと酸を反応させることを含む方法を提供する。
、塩酸のような鉱酸のような水性無機酸および例えば、酢酸、またはより好まし
くはTFAのような強カルボン酸のようなカルボン酸、およびメタンスルホン酸
のようなスルホン酸のような水性または無水有機酸が有用であろう。
ンスルホキシドのような他のスルホキシドもまた有用であろう。しかしながら、
カリウムスーパーオキシドまたはニッケルペルオキシドのような金属スーパーオ
キシドおよびペルオキシド、ナトリウムトリチオカーボネートのようなチオカー
ボネートおよび炭酸トリフェニルビスマスのような有機金属炭酸塩もまた有用で
あろう。
l−および/またはtBu−保護化システイン残基を含むペプチドである。
わめて適している分子のクラスを表し、顕著な関心が、標的とされる画像化薬剤
(targeted imaging agent)の潜在成分としての合成ペ
プチドの調製に向けられている。
供する。というのは、そのペプチドは、還元されている状態かまたは酸化されて
いる状態かのいずれかで存在し得るからである。2以上のシステイン残基を含む
酸化されたペプチドは、ダイマー、トリマーもしくはマルチマー(multim
er)のような分子内ジスルフィドまたは分子間ジスルフィドを形成し得る。し
たがって、例えば、6個のシステイン残基を含むペプチドは、潜在的に15のジ
スルフィド異性体を形成することが可能であり、それゆえ、もし正確なジスルフ
ィド対形成がそのようなペプチドにおいて達成されるべきであるならば、注意深
い計画と適切な保護ストラテジーの選択が要求される。強い親和性の受容体との
結合が可能な生物学的に活性のコンフォメーションを与えるためには、正確な対
形成がペプチド主鎖(backbone)の正確な折りたたみおよび側鎖官能基
の付随する配向にとってしばしば重要であることが理解されるであろう。
は、トリチルとAcmまたはt−ブチルチオとAcmのような保護基の組み合わ
せを用い、第1ジスルフィド結合はトリチルまたはt−ブチルチオ基の除去の後
に生成し、第2の結合は、例えば、ヨウ素またはトリフルオロ酢酸タリウムを用
いてのAcm基の酸化開裂により生成する。多橋(multibridged)
ペプチドの合成の他の例には、Helv.Chim.Acta.57、2617
〜2621ページ(1974)において記載されているシーバーらによるインス
リンの溶液合成(solution synthesis)およびアサートンら
、J.Chem.Soc.Perkin Trans.1、2065ページ(1
985)およびアカジら、J.Am.Chem.Soc.115、11384ペ
ージ(1993)の手順が含まれる。
pot)」反応で生成しうるようにし、それにより部分的に酸化されたか部分的
に保護されたペプチドの中間精製の必要を回避し、そうして溶媒の使用および時
間の節約ならびに生成収率の改善を達成して、そのようなストラテジーの顕著な
単純化を可能とする。したがって、2つの酸不安定チオール保護基(例えばトリ
チル基)ならびに2以上のAcmおよび/またはMBzl基を含むペプチドを調
製することにより、第1のジスルフィド結合は比較的低温(例えば周囲温度)で
ペプチドの酸処理により生成しうるものであり、1以上の更なるジスルフィド結
合は、Acmおよび/またはMBzl基が開裂するように30℃を超える温度に
反応混合物の温度を高めることにより簡単に生成しうる。必要とされる酸化剤は
、所望により、低温処理の前後に加えられ得る。
m−保護化および/またはMBzl−保護化チオール基が残りのジスルフィド結
合の正確な生成を容易にする方式で近接するように、分子を折りたたまれたコン
フォメーションにもたらすようにすることが有利である。
易に開裂するので、tBuとAcmおよび/またはMBzl保護の組み合わせが
用いられ得、その場合、tBu基は室温で開裂し、Acmおよび/またはMBz
l基は続いて30℃を超える温度に加熱することにより除去される。それゆえ、
多数のジスルフィドの特異的生成が、クロマトグラフィーによる中間体の単離の
必要無しに「ワンポット」ストラテジーを用いて高収率でもたらされ得る。
2〜10%のDMSO含有量のTFA/DMSO混合物の使用は、本発明のその
ような態様において特に好ましい。というのは、S−保護化出発物質とジスルフ
ィド結合した中間体と最終生成物の全ては、典型的には、そのような混合物に溶
解性であるからである。TFAとDMSOの両方は、更なる使用のために容易に
リサイクルされ得る。
性であり、一方、tBuチオール保護基は酸化条件の下でのみ酸不安定性である
という事実は、位置選択的「ワンポット」酸化プロセスによる3つのジスルフィ
ド結合を含むペプチドの合成において利用され得る。したがって、トリチル、メ
トキシトリチルまたは他の酸不安定性基で、tBu基で、ならびにAcmおよび
/またはMBzl基でそれぞれ保護されたシステイン残基の適切に位置した対を
含む、樹脂で支持された合成ペプチドは、最初は、樹脂からの開裂およびトリチ
ル、メトキシトリチルまたは他の酸不安定性保護基の開裂をもたらすために酸で
処理され得る。チオール基のこのようにして発生した対は、最初の所望のジスル
フィド結合を生成するように塩基性pHの水溶液中で、または水性DMSO中で
酸化され得るものであり、その後、溶媒は、真空中でまたは凍結乾燥により蒸発
させることができる。次いで、上記の生成物の連続低温(例えば室温)および高
温(すなわち>30℃)酸性および酸化処理は、チオール基のtBu−保護化お
よびAcm−および/またはMBzl−保護化対の連続反応により所望の第2お
よび第3のジスルフィド結合の生成をもたらす。
化することを可能とし、それにより、典型的には、0.1mg/ml台のペプチ
ド濃度を用い、それで最終精製の前に例えばイオン交換クロマトグラフィーによ
り生成物が濃縮されることを必要とする、Acmのヨウ素開裂および空気酸化の
ような現存のプロトコールと比較して溶媒体積要求を実質的に減少させる。他方
、本発明の手順によれば、生成物濃縮は、真空中での溶媒蒸発により簡単に行う
ことができる。
3を結合するジスルフィド結合を有するIle−Cys−Cys−Asn−Pr
o−Ala−Cys−Gly−Pro−Lys−Tyr−Ser−Cys−NH 2 ]の「ワンポット」合成
mmol規模のリンク(Rink)アミド樹脂(ノババイオケム)で出発するA
BI433A自動ペプチドシンセサイザーで組み立てられた(assemble
d)。システイン残基2および7をトリチル基で保護し、一方、残基3および1
3をアセトアミドメチル基で保護した。全てのアミノ酸を、O−ベンゾトリアゾ
ール−1−イル−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロ
ホスフェート(HBTU)を用いて予備活性化させた(pre−activat
ed)。
時除去は、5%トリイソプロピルシランおよび5%の水を含むトリフルオロ酢酸
(TFA)による2時間の処理により行い、130gの粗生成物を得た。粗生成
物のHPLC分析(バイダック218TP54カラム)を、1ml/分の流量で
20分にわたって5から30%Bの勾配(A=0.1%TFA/水およびB=0
.1%TFA/アセトニトリル)を用いて実施した。生成物は、>90%純粋で
あることが見出された。更なる生成物特性測定をMALDI質量スペクトロメト
リーを用いて実施した。Acm保護化生成物についてのM+Hは、1496と予
測され、1502であることが見出された。
O)(0.1ml)を加えた。混合物を氷上で攪拌し、酸化の経路(courc
e)をHPLCで追跡した。出発生成物、滞留時間16.2分(20分にわたっ
て0から30%BでA=0.1%TFA/水およびB=0.1%TFA/アセト
ニトリル)を16.4分の滞留時間の新たな生成物とゆっくりと置換し、2時間
後、出発生成物は完全に消失した。ついで、0.05mlのアニソールをペプチ
ド溶液に加え、混合物をさらに2時間60℃に暖め、その後TFAを真空中で除
去し、ペプチドをジエチルエーテルの添加により沈殿させた。完全に酸化された
粗生成物(1.4mg)は、それぞれ16.9および17.8分のHPLC滞留
時間で1:5の比で2つの主生成物を含んでいた。ほぼ80%の生成物を含む1
7.8分生成物は、α−コノトキシンの信頼しうるサンプル(バッケム,H−1
112)と共溶出することが見出された。
TFA/水およびB=0.1%TFA/アセトニトリル)を用いてのバイダック
218TP152010半分取カラム上での精製と続く凍結乾燥は、>90%純
粋であることが見出されたコノトキシン(0.7mg、35%収率)を与えた。
更なる特性測定をMALDI質量スペクトロメトリーを用いて実施した。生成物
についてのM+Hは1354と予測され、1356であると見出された。
、一方、残基3および13を4−メチルベンジル基で保護することを除いて例1
において記載されているように組み立てた。全てのアミノ酸を、HBTUを用い
て予備活性化した。
ンジルを除く)側鎖保護基の同時除去を、5%トリイソプロピルシランおよび5
%水を含むTFAによる2時間の処理により行い、125mgの粗生成物を得た
。粗生成物のHPLC分析(バイダック218TP54カラム)を1ml/分の
流量で20分にわたり20から60%Bの勾配(A=0.1%TFA/水および
B=0.1%TFA/アセトニトリル)を用いて実施した。生成物は、15.7
分の滞留時間および>90%の純度を有することが見出された。更なる生成物の
特性測定をMALDI質量スペクトロメトリーを用いて実施した。部分的に保護
された生成物についてのM+Hは1680と予測され、1685であることが見
出された。
ml)、DMSO(2.0ml)およびアニソール(0.1mL)を加えた。混
合物を室温で40分間攪拌し、反応混合物の試料をMALDI質量スペクトロメ
ーターに掛けた。確認された新たな生成物が現れ、これは、単一のジスルフィド
であり、4−メチルベンジル保護基が残っていることを確認した。この部分的に
保護された生成物についてのM+Hは1565と予測され、1568であること
が見出された。
空中で除去し、ペプチドをジエチルエーテルの添加により沈殿させた。沈殿をエ
ーテルとともに粉砕し、空気乾燥してほとんど定量的収率で完全に酸化された粗
生成物(45mg)を得、>90%のHPLC純度であった。
0分にわたって0から30%Bの勾配(A=0.1%TFA/水およびB=0.
1%TFA/アセトニトリル)を用いてバイダック218TP1022 C18
分取カラム上の分取HPLCにより精製した。純粋な生成物を含む画分を集め、
凍結乾燥した(10mg、50%収率)。生成物は、分析用HPLCにより>9
9%純粋であることが見出された。更なる特性測定をMALDIマススペクトロ
メトリーを用いて実施した。生成物についてのM+Hは1354と予測され、1
356であることが見出された。
)と共溶出することを示した。
−Tyr−Ile−Gln−Asn−Cys(Acm)−Pro−Leu−Gl
y−NH2
模でリンクアミドAM樹脂で出発してABI433A自動ペプチドシンセサイザ
ーで合成した。アミノ酸を、カップリングの前にHBTUを用いて予備活性化し
た。樹脂からのペプチドのおよびペプチドからの(Acmを除く)側鎖保護基の
同時除去を、5%トリイソプロピルシランおよび5%水を含むTFAによる1時
間の処理により行った。
から30%Bの勾配(A=0.1%TFA/水およびB=0.1%TFA/アセ
トニトリル)を用いて分取HPLC(バイダックC18 218TP1022カ
ラム)により精製した。凍結乾燥の後、166mgの純粋な生成物を得た。この
精製された生成物のHPLC分析(バイダックC18 218TP54カラム)
を、214nmのUVによる生成物検出により5から50%Bの勾配(A=0.
1%TFA/水およびB=0.1%TFA/アセトニトリル)を用いて実施した
。生成物の滞留時間は14.30分であった。更なる生成物の特性測定をMAL
DIマススペクトロメトリーを用いて実施した。生成物についてのM+Hは、1
151.0と予測され、1551.5であることが見出された。
NH2 −Cys−Tyr−Ile−Gln−Asn−Cys−Pro−Leu−
Gly−NH2 ]を生成するための脱保護と酸化
させ、次いで、60℃に予備加熱されたアニソール(40μl)、DMSO(1
ml)およびTFA(18ml)の混合物に加えた。この温度で5時間後、オキ
シトシンへの定量的変換が生じたことを、214nmのUVによる生成物検出に
よる5から50%Bの勾配(A=0.1%TFA/水およびB=0.1%TFA
/アセトニトリル)を用いての分析用HPLC(バイダック C18 218T
P54カラム)により確認した。生成物の滞留時間は12.98分であった。更
なる生成物の特性測定をMALDIマススペクトロメトリーを用いて実施した。
生成物についてのM+Hは1007と予測され、1011であることが見出され
た。生成物は、ノババイオケムから購入されたオキシトシンの信頼し得る試料と
ともに共溶出することが見出された。
よび酸化速度の比較研究 例3(a)の手順を、オキシトシンのCys(tBu)−保護化およびCys
(MBzl)−保護化類似体を調製するために反復した。それらの類似体および
Cys(Acm)−保護化オキシトシンの脱保護および酸化を、室温および60
℃で例3(b)において記載されたように実施した。以下の表は、分析用HPL
Cにより定量されたオキシトシンへの変換の程度を要約する。60℃で定量的変
換が生じたことをMALDI質量スペクトロメトリーにより確認した。
2とCys10およびCys5とCys13を結合させるジスルフィド結合を有
するNH2 −Cys−Cys−Glu−Leu−Cys−Cys−Asn−Pr
o−Ala−Cys−Ala−Gly−Cys−Tyr−OH]の「ワンポット
」合成
てた。システイン残基1および6をトリチル基で保護し、残基2および10をt
−ブチル基で保護し、残基5および13を4−メチルベンジル基で保護した。ペ
プチドを例1において記載された固相支持体から開裂させ、190mgの粗収率
を得た(システイン残基1および6はチオール形態にあり、残りのシステインは
いまだ保護されたままである)。50mgの部分的に保護された粗ペプチドを4
00mlの水/アセトニトリル(60:40)中に溶解し、pHを希釈水酸化ア
ンモニウムの添加により8に調節した。DMSO(10ml)を加え、続く酸化
の経路を分析用HPLCおよびMALDI−TOFにより追跡した。Cys1と
Cys6を結合させるジスルフィド結合を有する新たな生成物が1時間以内に生
成することが見出され、その後、溶媒を真空中で除去した。
アニソール(0.1ml)を加え、混合物を1時間攪拌した。MALDI−TO
F分析は、t−ブチル基が除去され、Cys2とCys10を結合させる第2の
ジスルフィド結合が形成されたことを示した。次いで、フラスコを凝縮器に取り
付け、温度を1時間70℃に上昇させた。MALDI−TOF分析は、4−メチ
ルベンジル基の完全な開裂が起こったことを明らかにした。TFAを除去し、生
成物をジエチルエーテルの添加により沈殿させた。ジエチルエーテルによる粉砕
と空気乾燥に続いて粗生成物を回収した。HPLCによる精製は、30%収率で
純粋な生成物を産生させた。
ロのスクリーニングアッセイで活性(Ki=3nM)であることを確認した。
Claims (9)
- 【請求項1】 Acm−、MBzl−および/またはtBu−保護化チオー
ルの脱保護のための方法であって、脱保護およびジスルフィド結合の生成をもた
らすのに十分な温度で酸化剤の存在下で、前記保護化チオールと酸を反応させる
ことを含む方法。 - 【請求項2】 前記酸がトリフルオロ酢酸である請求項1記載の方法。
- 【請求項3】 前記酸化剤がDMSOである請求項1または2記載の方法。
- 【請求項4】 脱保護を1から20%のDMSOを含むTFA/DMSO混
合物を用いて行う請求項1ないし3のいずれか1項記載の方法。 - 【請求項5】 前記保護されたチオールがペプチド中に存在する請求項1な
いし4のいずれか1項記載の方法。 - 【請求項6】 前記ペプチドが少なくとも2つのtBu保護化チオールおよ
び/または少なくとも2つのAcmもしくはMBzl保護化チオールを含む請求
項5記載の方法。 - 【請求項7】 tBu保護化チオールが室温で脱保護される請求項1ないし
6のいずれか1項記載の方法。 - 【請求項8】 AcmまたはMBzl保護化チオールが30℃以上の温度で
脱保護される請求項1ないし7のいずれか1項記載の方法。 - 【請求項9】 AcmまたはMBzl保護化チオールが50℃以上の温度で
脱保護される請求項8記載の方法。
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