ES2267551T3 - Procedimiento de desproteccion de compuestos tiolicos protegidos. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para la preparación de un compuesto que contiene dos o más enlaces disulfuro a par- tir de un precursor que tiene dos o más pares de grupos tiol, estando protegido cada par de grupos tiol con dife- rentes grupos protectores de tiol, seleccionados entre acetamidometilo (Acm), 4-metilbencilo (MBzl) y t-butilo (tBu), cuyo procedimiento consiste en: (i) reacción del precursor con un ácido en presencia de un agente oxidante a una primera temperatura suficiente para efectuar la des- protección de los tioles protegidos con tBu y la formación de enlaces disulfuro por un pri- mer par de grupos tiol protegidos y (ii) elevación de la temperatura de la mezcla de reacción de la etapa (i) a una segunda temperatura suficiente para efectuar la des- protección y la formación de enlaces disulfu- ro para un segundo par de grupos tiol prote- gidos.
Description
Procedimiento de desprotección de compuestos
tiólicos protegidos.
Esta invención se relaciona con un nuevo
procedimiento para la desprotección de compuestos tiólicos
protegidos, más particularmente tioles protegidos por grupos
acetamidometilo, 4-metilbencilo y
t-butilo(a los que en adelante se hará
referencia como Acm, MBzl y tBu, respectivamente), con oxidación
concomitante de los tioles desprotegidos para formar disulfuros.
Dichos procedimientos son particularmente útiles en la síntesis de
péptidos.
Durante las síntesis orgánicas, es bastante
rutinario proteger determinadas funcionalidades reactivas para
evitar su participación en reacciones colaterales no deseadas. Por
ejemplo, las funcionalidades carbonilo reactivas son frecuentemente
protegidas como cetales y los grupos reactivos hidroxilo y carboxilo
son frecuentemente protegidos como ésteres.
El grupo tiol neutro y fuertemente nucleofílico
presente en la cisteína requiere, en general, protección durante
las síntesis de péptidos. Se conoce una amplia variedad de grupos
protectores de tiol, incluyendo bencilo, MBzl,
4-metoxibencilo, tritilo, metoxitritilo, tBu,
t-butiltiol, acetilo,
3-nitro-2-piridinasulfenilo
y Acm. Todos estos grupos han sido utilizados con éxito en la
síntesis de péptidos y están revisados por Barany y Merrifield en
"The Peptides", Vol. 2, Ed. Gross y Minehoffer, Academic Press,
pp. 233-240 (1980).
El Acm es un grupo protector de tiol que
normalmente se elimina por escisión oxidativa, por ejemplo por
tratamiento con mercurio (II), yodo, plata (I) o talio (III).
Generalmente se le considera como estable a ácidos, ya que, aunque
la escisión acidolítica del Acm es teóricamente posible en ácidos
anhidros o acuosos, dichas reacciones son inconvenientemente lentas
en la práctica debido a dificultades en la protonación del átomo de
azufre.
En este contexto, Fujii y col., en Chem. Pharm.
Bull. 41(6), pp. 1030-1034 (1993), describen
la síntesis y la oxidación de oxitocina usando Cys(Acm) y
ácido trifluoroacético (TFA)/sulfóxido de dimetilo (DMSO) al 10%.
Los autores dicen que la Cys(Acm)-oxitocina
sobrevivía casi intacta después de un tratamiento de 12 horas en la
anterior mezcla de TFA/DMSO, mostrando que la protección con Acm es
estable en tales condiciones ácidas. El grupo S-Acm
fue también descrito como estable por Veber y col., en J. Am. Chem.
Soc. 94, pp. 5456-5461 (1972) al ácido
fluorhídrico (HF) y a nucleófilos fuertes, tales como la
hidrazina.
Van Rietschoten y col. describieron en Peptides
(1977), pp. 522-524, que el tratamiento de un
péptido que contiene cuatro grupos Acm con
HF-anisol daba lugar a la eliminación de un 20% de
los grupos Acm. Más recientemente, Fisher y col., en J. Pep. Res.
49(4), pp. 341-346 (1997), han
descrito una modificación de un residuo de tirosina debida a
escisión acidolítica de Acm y Singh y col., en Tetrahedron Letters,
Vol. 37, Nº 24, pp. 4117-4120 (1996), describen la
escisión acidolítica parcial de Acm de péptidos con Cys(Acm)
terminal. Estas reacciones de desprotección inducida por ácido son
consideradas como reacciones colaterales no deseadas durante la
escisión peptídica.
El grupo protector de tiol MBzl es
tradicionalmente escindido usando ácidos fuertes, tales como HF, a
una temperatura de -5ºC a 0ºC. Otaka y col., en Tetrahedron Letters,
Vol. 32, Nº 9, pp. 1223-1226 (1991), describen que
el grupo MBzl es estable al TFA y que la cisteína protegida con MBzl
no se convierte en cistina mediante tratamiento con TFA/DMSO al 10%
a temperatura ambiente.
El grupo protector de tiol tBu es típicamente
eliminado por escisión oxidativa, v.g., por tratamiento con
mercurio (II), o por acidolisis con ácido trifluorometanosulfónico.
El grupo es considerado estable al TFA y a la oxidación con
yodo.
B. Hargittai y G. Barany describieron en
"Controlled synthesis of natural and
disulfide-mispaired regioisomers of
alpha-concotoxin SI", Journal of Peptide
Research, Vol. 54, Nº 6, Junio de 1999, páginas
468-479, un método para la síntesis ortogonal de un
péptido sintético con múltiples enlaces disulfuro.
En "Investigation of the dimethyl
sulfoxide-trifluoroacetic acid oxidation system for
the synthesis of cystine-containing peptides",
Chemical and Pharmaceutical Bulletin, Vol. 41, Nº 6, 1993, páginas
1030-1034, Koide y col. describe la desprotección
de tiol usando TFA/DMSO junto con una variedad de grupos
protectores. Sin embargo, Koide y col. describen en la Tabla 1 que
falló la desprotección de Acm-tiol usando
DMSO/TFA.
J.P. Tam y col., "Disulphide Bond Formation in
Peptides by Dimethyl Sulphoxide. Scope and Application", J. Am.
Chem. Soc., 1991, Nº 113, páginas 6657-6662,
describen un método en el que se usa DMSO como agente oxidante para
la formación de enlaces disulfuro en péptidos sintéticos que
contienen Cys.
Aunque Akaji y col., en J. Am. Chem. Soc., Vol.
114, Nº 11, pp. 4137-4143 (1992), describen la
eliminación acidolítica de una variedad de grupos protectores de
cisteína, incluyendo MBzl, tBu y Acm, la reacción es dependiente de
la presencia de un cloruro de sililo adecuado.
La presente invención se basa en el hallazgo
inesperado de que los grupos protectores de tiol Acm, MBzl y tBu
son lábiles a ácidos en condiciones oxidantes, particularmente al
aumentar la temperatura de la reacción. Así, los grupos protectores
de tiol tBu pueden escindirse rápidamente de esta forma a
temperatura ambiente e incluso más rápidamente a elevadas
temperaturas. Los grupos protectores de tiol Acm y MBzl se vuelven
cada vez más lábiles en dichas condiciones a temperaturas por encima
de 30ºC, particularmente a temperaturas de 50ºC y superiores, de
tal forma que es posible conseguir una desprotección
substancialmente cuantitativa con tiempos de reacción de unas
cuantas horas o menos. Dicha desprotección inducida por ácido es
particularmente ventajosa en el sentido de que evita la necesidad
de usar los reactivos más tóxicos actualmente empleados para
eliminar grupos Acm, MBzl y tBu. Realizando la desprotección en
presencia de un agente oxidante, los grupos tiol liberados se
convierten directamente en grupos disulfuro intermoleculares o
intramoleculares; como se discute aquí a continuación, esto tiene
aplicaciones particularmente valiosas en la síntesis de péptidos
cíclicos que contienen uniones disulfuro.
Así, según un aspecto, la invención proporciona
un procedimiento para la preparación de un compuesto que contiene
dos o más enlaces disulfuro a partir de un precursor que tiene dos o
más pares de grupos tiol, estando protegido cada par de grupos tiol
con diferentes grupos protectores de tiol, seleccionados entre
acetamidometilo (Acm), 4-metilbencilo (MBzl) y
t-butilo (tBu), cuyo procedimiento consiste en:
- (i)
- reacción del precursor con un ácido en presencia de un agente oxidante a una primera temperatura suficiente para efectuar la desprotección de los tioles protegidos con tBu y la formación de enlaces disulfuro por un primer par de grupos tiol protegidos y
- (ii)
- elevación de la temperatura de la mezcla de reacción de la etapa (i) a una segunda temperatura suficiente para efectuar la desprotección y la formación de enlaces disulfuro para un segundo par de grupos tiol protegidos.
Se pueden usar ácidos tanto acuosos como
anhidros en el proceso. Así, por ejemplo, pueden ser útiles ácidos
inorgánicos acuosos, v.g., ácidos minerales, tales como ácido
clorhídrico, y ácidos orgánicos acuosos o anhidros, v.g., ácidos
carboxílicos, tales como ácido acético o, más preferiblemente,
ácidos carboxílicos fuertes, tales como TFA, y ácidos sulfónicos,
tales como ácido metanosulfónico.
El DMSO es un ejemplo preferido de agente
oxidante útil en el procedimiento. También pueden resultar útiles
otros sulfóxidos, tales como sulfóxido de tetrametileno, al igual
que superóxidos y peróxidos de metales, tales como superóxido de
potasio o peróxido de níquel, tiocarbonatos, tales como
tritiocarbonato de sodio, y carbonatos organometálicos, tales como
carbonato de trifenilbismuto.
En una realización preferida, el tiol que se ha
de desproteger es un péptido que contiene uno o más residuos de
cisteína protegidos con Acm, MBzl y/o tBu.
Los péptidos representan una clase de moléculas
que resultan extremadamente bien adecuadas para dirigir marcadores
específicos de enfermedad in vivo y se está prestando una
considerable atención a la preparación de péptidos sintéticos como
componentes potenciales de agentes de imagen dirigidos.
La síntesis de péptidos que contienen cisteína
presenta desafíos especiales a un químico de péptidos, ya que el
péptido puede existir en un estado reducido u oxidado. Los péptidos
oxidados que contienen más de un residuo de cisteína pueden formar
disulfuros intramoleculares o disulfuros intermoleculares, tales
como dímeros, trímeros o multímeros. Así, por ejemplo, un péptido
que contenga seis residuos de cisteína es potencialmente capaz de
formar 15 isómeros de disulfuro y se requiere, por lo tanto una
cuidadosa planificación y selección de una estrategia de protección
adecuada si se han de conseguir emparejamientos disulfuro correctos
en dichos péptidos. Se apreciará que un emparejamiento correcto es
frecuentemente crítico para corregir el plegamiento del esqueleto
peptídico y la orientación concomitante de las funcionalidades de
las cadenas laterales para obtener una conformación biológicamente
activa capaz de una unión a receptores de alta afinidad.
Las estrategias típicas existentes para la
formación selectiva de dos o más enlaces disulfuro usan
combinaciones de grupos protectores, tales como tritilo y Acm o
t-butiltío y Acm, formándose el primer enlace
disulfuro tras la eliminación de los grupos tritilo o
t-butiltío y formándose el segundo por escisión
oxidativa del grupo Acm usando, por ejemplo, yodo o
trifluoroacetato de talio. Otros ejemplos de la síntesis de péptidos
con múltiples puentes incluyen la síntesis en solución de insulina
por Sieber y col. descrita en Helv. Chim. Acta, 57, pp.
2617-2621 (1974), y los procedimientos de Atherton y
col., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, p. 2065 (1985), y Akaji y
col., J. Am. Chem. Soc. 115, p. 11384 (1993).
La desprotección según la presente invención
permite una considerable simplificación de dichas estrategias, de
tal forma que se pueden generar dos o más enlaces disulfuro en una
reacción de "un recipiente", evitando así la necesidad de
purificación intermedia de los péptidos parcialmente oxidados o
parcialmente protegidos y consiguiendo así ahorros en el uso de
solventes y en el tiempo y mejoras en el rendimiento de producto.
De este modo, preparando un péptido que contiene dos grupos
protectores de tiol lábiles a ácidos (v.g., grupos tritilo), así
como dos o más grupos Acm y/o MBzl, se puede formar un primer enlace
disulfuro por tratamiento ácido del péptido a una temperatura
relativamente baja (v.g., ambiente) y se pueden formar uno o más
enlaces disulfuro adicionales simplemente aumentando la temperatura
de la mezcla de reacción a una temperatura por encima de 30ºC, de
tal forma que se escindan los grupos Acm y/o MBzl. Se puede añadir
el agente oxidante requerido antes o después del tratamiento a baja
temperatura, según se desee.
Las posiciones de los grupos protectores lábiles
a ácidos son ventajosamente tales que el enlace disulfuro
primeramente formado lleve la molécula a una conformación plegada,
de tal forma que el resto de los grupos tiol protegidos con Acm y/o
protegidos con MBzl se yuxtapongan de un modo que facilite la
correcta formación del enlace o enlaces disulfuro restantes.
Dado que, como se ha indicado antes, los grupos
protectores de tiol tBu se escinden fácilmente a temperatura
ambiente por tratamiento ácido y oxidativo, se puede usar una
combinación de tBu con protección Acm y/o MBzl, escindiéndose los
grupos tBu a temperatura ambiente y eliminándose a continuación los
grupos Acm y/o MBzl por calentamiento a una temperatura superior a
30ºC. Se puede efectuar, por lo tanto, la formación específica de
múltiples disulfuros con un alto rendimiento usando una estrategia
de "un recipiente" sin necesidad de aislar intermediarios por
cromatografía.
El uso de mezclas TFA/DMSO, v.g., con un
contenido en DMSO del 1 al 20%, v.g., 2-10%, para
promover la desprotección y la formación de enlaces disulfuro es
particularmente preferido en dichas realizaciones de la invención,
ya que tanto los materiales de partida S-protegidos,
como los intermediarios unidos a disulfuro, como los productos
finales, serán típicamente solubles en tales mezclas. Se pueden
reciclar fácilmente tanto el TFA como el DMSO para uso
ulterior.
El hecho de que los grupos protectores de tiol,
tales como tritilo y metoxitritilo, sean generalmente lábiles a
ácidos, mientras que los grupos protectores de tiol tBu son sólo
lábiles a ácidos en condiciones oxidantes puede ser explotado en la
síntesis de péptidos que contienen tres enlaces disulfuro por un
procedimiento de oxidación de "un recipiente" regioselectivo.
Así, se puede tratar inicialmente un péptido sintético soportado en
resina que contenga pares de residuos de cisteína apropiadamente
situados protegidos con grupos titilo, metoxitritilo u otros grupos
lábiles a ácidos, con grupos tBu y con grupos Acm y/o MBzl,
respectivamente, con ácido para efectuar la escisión de la resina y
la escisión de los grupos protectores tritilo, metoxitritilo u
otros grupos protectores lábiles. El par así generado de grupos tiol
puede oxidarse en solución acuosa a pH básico o en DMSO acuoso para
formar el primer enlace disulfuro deseado, tras de lo cual se puede
evaporar el solvente a vacío o por liofilización. El tratamiento
sucesivo ácido y oxidativo del producto a baja temperatura (v.g.,
ambiente) y a alta temperatura (es decir, >30ºC) como se ha
descrito antes conduce a la formación del segundo y tercer enlaces
disulfuro deseados por reacción sucesiva de los pares de grupos tiol
protegidos con tBu y protegidos con Acm y/o MBzl.
El presente procedimiento permite oxidar
péptidos que contienen cisteína a concentraciones por encima de 1
mg/ml, reduciendo así substancialmente los requerimientos de volumen
de solvente en comparación con los protocolos existentes, tales
como la escisión con yodo de Acm y la oxidación con aire, que
típicamente emplean concentraciones de péptido del orden de 0,1
mg/ml y por lo tanto requieren que el producto esté concentrado,
v.g., por cromatografía de intercambio iónico, antes de la
purificación final. Según el presente procedimiento, por otra
parte, se puede efectuar la concentración del producto simplemente
por evaporación del solvente a vacío.
Los siguientes Ejemplos sirven para ilustrar la
invención.
Se montó la secuencia peptídica en un
sintetizador de péptidos automático ABI 433A partiendo de resina de
amida Rink (Novabiochem) a una escala de 0,12 mmoles usando 1 mmol
de cartuchos de aminoácidos. Se protegieron los residuos de cisteína
2 y 7 con grupos tritilo, mientras que se protegieron los residuos 3
y 13 con grupos acetamidometilo. Todos los aminoácidos fueron
preactivados usando hexafluorofosfato de
O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametiluronio
(HBTU).
Se efectuó la eliminación simultánea del péptido
de la resina y de los grupos protectores de cadena lateral (excepto
Acm) del péptido por tratamiento con ácido trifluoroacético (TFA)
que contenía un 5% de tri-isopropilsilano y un 5%
de agua durante 2 horas, obteniéndose un rendimiento de producto
bruto de 130 mg. Se llevó a cabo el análisis por HPLC del producto
bruto (columna Vydac 218TP54) usando un gradiente de un 5 a un 30%
de B a lo largo de 20 minutos (A = 0,1% de TFA/agua y B = 0,1% de
TFA/acetonitrilo) a una velocidad de flujo de 1 ml/minuto; se vio
que el producto era >90% puro. Se llevo a cabo una mayor
caracterización del producto usando espectrometría de masas MALDI:
M+H para el producto protegido con Acm esperado a 1496, encontrado a
1502.
A 2 mg del producto bruto se añadieron TFA (10
ml) y sulfóxido de dimetilo (DMSO) (0,1 ml). Se agitó la mezcla
sobre hielo y se siguió el curso de la oxidación por HPLC. El
producto de partida, tiempo de retención 16,2 minutos (0 a 30% de B
a lo largo de 20 minutos, donde A = 0,1% de TFA/agua y B = 0,1% de
TFA/acetonitri-lo) fue substituido lentamente por un
nuevo producto con un tiempo de retención de 16,4 minutos y después
de 2 horas el producto de partida había desaparecido por completo.
Se añadieron entonces 0,05 ml de anisol a la solución peptídica y
se calentó la mezcla a 60ºC durante 2 horas más, después de lo cual
se eliminó el TFA a vacío y se precipitó el péptido por adición de
éter dietílico. El material totalmente oxidado bruto (1,4 mg)
consistía en 2 productos principales, razón 1:5, con tiempos de
retención de HPLC de 16,9 y 17,8 minutos, respectivamente. El
producto de 17,8 minutos, que constituía aproximadamente el 80% del
material, resultó co-eluir con una muestra
auténtica de \alpha-conotoxina
(Bachem, H-1112).
(Bachem, H-1112).
La purificación en una columna semipreparatoria
Vydac 218TP152010 usando un gradiente de un 0 a un 30% de B a lo
largo de 30 minutos (A = 0,1% de TFA/agua y B = 0,1% de
TFA/acetonitrilo) a una velocidad de flujo de 5 ml/minuto, seguida
de liofilización, dio conotoxina (0,7 mg, rendimiento del 35%), que
resultó ser >90% pura. Se llevó a cabo una mayor caracterización
usando espectrometría de masas MALDI: M+H para el producto esperado
a 1354, encontrado a 1356.
Se montó la secuencia peptídica como se ha
descrito en el Ejemplo 1, excepto por proteger los residuos de
cisteína 2 y 7 con grupos t-butilo, mientras que los
residuos 3 y 13 fueron protegidos con grupos
4-metil-bencilo. Todos los
aminoácidos fueron preactivados usando HBTU.
La separación simultánea del péptido de la
resina y de los grupos protectores de cadenas laterales (excepto
t-butilo y 4-metilbencilo) del
péptido fue efectuada por tratamiento con TFA que contenía un 5% de
tri-isopropilsilano y un 5% de agua durante 2 horas,
obteniéndose un rendimiento de producto bruto de 125 mg. El
análisis por HPLC del producto bruto (columna Vydac 218TP54) fue
llevado a cabo usando un gradiente de un 20 a un 60% de B a lo
largo de 20 minutos (A = 0,1% de TFA/agua y B = 0,1% de
TFA/acetonitrilo) a una velocidad de flujo de 1 ml/minuto; se vio
que el producto tenía un tiempo de retención de 15,7 minutos y una
pureza >90%. Se llevó a cabo una mayor caracterización del
producto usando espectrometría de masas MALDI: M+H para el producto
parcialmente protegido esperado a 1680, encontrado a 1685.
A 50 mg del producto bruto parcialmente
protegido en un matraz limpio se añadieron TFA (98 ml), DMSO (2,0
ml) y anisol (0,1 ml). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente
durante 40 minutos y se llevó una muestra de la mezcla de reacción
a un espectrómetro de masas MALDI. Apareció un nuevo producto, que
se confirmó que era el disulfuro simple con permanencia de los
grupos protectores 4-metilbencilo: M+H para el
producto parcialmente protegido esperado a 1565, encontrado a
1568.
Se puso entonces el matraz en un baño de aceite
y se calentó a 70ºC durante 3 horas, después de lo cual se eliminó
el TFA a vacío y se precipitó el péptido por adición de éter
dietílico. Se trituró el precipitado con éter y se secó al aire
para obtener producto bruto totalmente oxidado (45 mg) en un
rendimiento casi cuantitativo y con una pureza por HPLC
>90%.
Se purificó una alícuota de 20 mg del producto
bruto totalmente oxidado por HPLC preparatoria en una columna
preparatoria Vydac 218TP1022 C18 usando un gradiente de un 0 a un
30% de B a lo largo de 40 minutos (A = 0,1% de TFA/agua y B = 0,1%
TFA/acetonitrilo) a una velocidad de flujo de 9 ml/minuto. Se
recogieron las fracciones que contenían producto puro y se
liofilizaron (10 mg, rendimiento del 50%). Se vio que el producto
era >99% puro por HPLC analítica. Se llevó a cabo una mayor
caracterización usando espectrometría de masas MALDI: M+H para el
producto esperado a 1354, encontrado a 1356.
Se vio que el material co-eluía
con una muestra auténtica de \alpha-conotoxina
(Bachem, H-1112).
Se sintetizó el péptido en un sintetizador de
péptidos automático ABI 433A partiendo de resina AM de amida de
Rink a una escala de 0,25 mmoles usando 1 mmol de cartuchos de
aminoácidos. Se preactivaron los aminoácidos usando HBTU antes de
la copulación. Se efectuó la separación simultánea del péptido de la
resina y de los grupos protectores de cadenas laterales (excepto
Acm) del péptido por tratamiento con TFA que contenía un 5% de
triisopropilsilano y un 5% de agua durante una hora.
Se purificó el material bruto resultante (300
mg) por HPLC preparatoria (columna Vydac C18 218TP1022) usando un
gradiente del 5 al 30% de B a lo largo de 40 minutos (A = 0,1% de
TFA/agua y B = 0,1% de TFA/acetonitrilo) a una velocidad de flujo
de 9 ml/minuto. Después de la liofilización, se obtuvieron 166 mg de
material puro. El análisis por HPLC de este producto purificado
(columna Vydac C18 218TP54) fue llevado a cabo usando un gradiente
del 5 al 50% de B (A = 0,1% de TFA/agua y B = 0,1% de
TFA/acetonitrilo) con detección del producto por UV a 214 nm; el
tiempo de retención del producto era de 14,30 minutos. Se realizó
una mayor caracterización del producto usando espectrometría de
masas MALDI: M+H para el producto esperado a 1151,0, encontrado a
1551,5.
Se disolvieron 5 mg de oxitocina protegida con
Cys(Acm) en TFA (2 ml) y se añadieron luego a una mezcla de
anisol (40 \mul), DMSO (1 ml) y TFA (18 ml) precalentada a 60ºC.
Después de 5 horas a esta temperatura, se confirmó la producción de
conversión cuantitativa a oxitocina por HPLC analítica (columna
Vydac C18 218TP54) usando un gradiente del 5 al 50% de B (A = 0,1%
de TFA/agua y B = 0,1% de TFA/acetonitrilo) con detección del
producto por UV a 214 nm; el tiempo de retención del producto era de
12,98 minutos. Se llevó a cabo una mayor caracterización del
producto usando espectrometría de masas MALDI: M+H para el producto
esperado a 1007, encontrado a 1011. Se vio que el producto
co-eluía con una muestra auténtica de oxitocina
comprada a Novabiochem.
Se repitió el procedimiento del Ejemplo
3(a) para preparar análogos de oxitocina protegidos con
Cys(tBu) y protegidos con Cys(MBzl). Se llevaron a
cabo la desprotección y la oxidación de estos análogos y de la
oxitocina protegida con Cys(Acm) como se describe en el
Ejemplo 3(b) a temperatura ambiente y a 60ºC. La siguiente
tabla resume el grado de conversión en oxitocina determinado por
HPLC analítica: se confirmó la producción de conversión
cuantitativa a 60ºC por espectrometría de masas MALDI.
| Grupo protector | % Oxitocina formada a | % Oxitocina formada a 60ºC |
| temperatura ambiente | ||
| tBu | 100% después de 40 minutos | 100% después de 10 minutos |
| Acm | 45% después de 72 horas | 100% después de 5 horas |
| MBzl | 30% después de 72 horas | 100% después de 6 horas |
Se montó la secuencia peptídica de un modo
similar al descrito en el Ejemplo 1; se protegieron los residuos de
cisteína 1 y 6 con grupos tritilo, los residuos 2 y 10 con grupos
t-butilo y los residuos 5 y 13 con grupos
4-metilbencilo. Se escindió el péptido del soporte
sólido como se describe en el Ejemplo 1, con un rendimiento bruto
de 190 mg (residuos de cisteína 1 y 6 en forma de tiol y el resto de
las cisteínas aún protegidas). Se disolvieron 50 mg del péptido
bruto parcialmente protegido en 400 ml de agua/acetonitrilo (60:40)
y se ajustó el pH a 8 por adición de hidróxido de amonio diluido. Se
añadió DMSO (10 ml) y se siguió el curso de la oxidación
subsiguiente por HPLC analítica y MALDI-TOF. Se vio
que se formaba un nuevo producto con un enlace disulfuro que
conectaba Cys 1 con Cys 6 en 1 hora, después de lo cual se eliminó
el solvente a vacío.
Se añadieron al residuo resultante que contenía
DMSO en el mismo matraz TFA (75 ml) y anisol (0,1 ml) y se agitó la
mezcla durante 1 hora. El análisis MALDI-TOF mostró
que los grupos t-butilo habían sido eliminados y
que se había formado un segundo enlace disulfuro que conectaba Cys 2
con Cys 10. Se equipó entonces el matraz con un condensador y se
elevó la temperatura a 70ºC durante 1 hora. El análisis
MALDI-TOF reveló que había tenido lugar la escisión
completa de los grupos 4-metilbencilo. Se eliminó el
TFA y se precipitó el producto por adición de éter dietílico. Se
recuperó producto bruto después de triturar con éter dietílico y de
secar al aire. La purificación por HPLC dio producto puro con un
rendimiento del 30%.
Se vio que el producto co-eluía
con una muestra auténtica de péptido ST y se confirmó que era activo
(Ki = 3 nM) en un ensayo de rastreo in vitro.
Claims (9)
1. Un procedimiento para la preparación de un
compuesto que contiene dos o más enlaces disulfuro a partir de un
precursor que tiene dos o más pares de grupos tiol, estando
protegido cada par de grupos tiol con diferentes grupos protectores
de tiol, seleccionados entre acetamidometilo (Acm),
4-metilbencilo (MBzl) y t-butilo
(tBu), cuyo procedimiento consiste en:
- (i)
- reacción del precursor con un ácido en presencia de un agente oxidante a una primera temperatura suficiente para efectuar la desprotección de los tioles protegidos con tBu y la formación de enlaces disulfuro por un primer par de grupos tiol protegidos y
- (ii)
- elevación de la temperatura de la mezcla de reacción de la etapa (i) a una segunda temperatura suficiente para efectuar la desprotección y la formación de enlaces disulfuro para un segundo par de grupos tiol protegidos.
2. Un procedimiento según se reivindica en la
reivindicación 1, donde dicho ácido es ácido trifluoroacético
(TFA).
3. Un procedimiento según se reivindica en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, donde dicho agente
oxidante es sulfóxido de dimetilo (DMSO).
4. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, donde se efectúa la desprotección usando una
mezcla de TFA/DMSO que contiene de un 1 a un 20% de DMSO.
5. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, donde dichos grupos tiol protegidos están
presentes en un péptido.
6. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, donde dicho compuesto contiene al menos dos
tioles protegidos con t-butilo (tBu) y al menos dos
tioles protegidos con acetamidometilo (Acm) o
4-metilbencilo (MBzl).
7. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, donde los tioles protegidos con tBu son
desprotegidos a temperatura ambiente en la etapa (i).
8. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, donde los tioles protegidos con Acm o MBzl
son desprotegidos a temperaturas de 30ºC o más en la etapa (ii).
9. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, donde los tioles protegidos con Acm o MBzl
son desprotegidos a temperaturas de 50ºC o más en la etapa (ii).
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