FR2599038A1 - Procede de preparation de nonacosapeptides et peptides intermediaires - Google Patents

Procede de preparation de nonacosapeptides et peptides intermediaires Download PDF

Info

Publication number
FR2599038A1
FR2599038A1 FR8607480A FR8607480A FR2599038A1 FR 2599038 A1 FR2599038 A1 FR 2599038A1 FR 8607480 A FR8607480 A FR 8607480A FR 8607480 A FR8607480 A FR 8607480A FR 2599038 A1 FR2599038 A1 FR 2599038A1
Authority
FR
France
Prior art keywords
sep
leu
arg
ser
ile
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
FR8607480A
Other languages
English (en)
Other versions
FR2599038B1 (fr
Inventor
Joseph Diaz
Yvette Muneaux
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanofi SA
Original Assignee
Sanofi SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sanofi SA filed Critical Sanofi SA
Priority to FR8607480A priority Critical patent/FR2599038B1/fr
Publication of FR2599038A1 publication Critical patent/FR2599038A1/fr
Application granted granted Critical
Publication of FR2599038B1 publication Critical patent/FR2599038B1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/60—Growth hormone-releasing factor [GH-RF], i.e. somatoliberin
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

L'INVENTION CONCERNE UN PROCEDE POUR L'OBTENTION DE NONACOSAPEPTIDES DE FORMULE I: H-TYR-ALA-ASP-ALA-ILE-PHE-THR-ASN-SER-TYR-ARG-LYS-VAL-LEU-GLY-GLN-LEU-SER-ALA-ARG-LYS-LEU-LEU-GLN-ASP-ILE-(A)-SER-ARG-NH (I)DANS LAQUELLE A EST MET, ILE OU NLE QUI, CONSISTE A COUPLER DANS UN SOLVANT POLAIRE APROTIQUE EN PRESENCE D'UN AGENT DE COUPLAGE, SUCCESSIVEMENT LES PEPTIDES PROTEGES II III ET V, VII DERIVES DES PEPTIDES II, III, V ET VII DE FORMULES CI-APRES: X-ARG-LYS-LEU-NH-NH (II) H-LEU-GLN-ASP-ILE-(A)-SER-ARG-NH (III) X-ILE-PHE-THR-ASN-SER-TYR-ARG-LYS-VAL-LEU-GLY-GLN-LEU-SER-ALA-OH (V) X-TYR-ALA-ASP-ALA-OH (VII)DANS LESQUELS X ET X SONT DES GROUPES N- PROTECTEURS, LES FONCTIONS LATERALES DES DIFFERENTS ACIDES AMINES ETANT CONVENABLEMENT PROTEGEES, A DEPROTEGER LE PRODUIT OBTENU ET A ISOLER LE PEPTIDE DE FORMULEI.

Description

La présente invention concerne un procédé de préparation en phase liquide de nonacosapeptides ayant une activité GRF et des peptides intermédiaires pour la ise en oeuvre dudit procédé.
Le GRF ou hGRF ou hpGRF (human pancreatic Growthhormone Releasing Factor) ou somatocrinine est un peptide constitue par l'enchainement de 44 amino acides. Sa séquence est la suivante
1 5 10 15
H-Tyr-Ala-Asp-Ala- I le-Phe-Thr-AsnSer-Tyr-Arg-Lys-Va1-Leu-Gly
20 25 30
Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln
35 40 44
Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2
Il a été découvert par A.GUILLEMIN et Coll., Scien ce, 1982, 218, 585-587, à partir d'extraits d'une tumeur pancréatique humaine.Ce peptide est particulidrement actif sur la stimulation de la libération de l'hormone de croissance (GH) aussi bien in vitro qu'in vivo. In vitro, en particulier, son efficacité se manifeste à des doses de quelques femto moles/ml (ED50 = 15 femto moles/ml).
L'intérAt thérapeutique en médecine humaine de cette substance va donc se situer au niveau du traitement du nanisme et des retards à la croissance en pédiatrie. D'autres applications sont possibles dans les cas de déficience anabolique proteique, par exemple ulcÚre de stress, réparation de fractures ou d'atteintes du cartilage, brulûres étendues (pendant la phase anabolique), réparations cutanées, ostéoporoses.
Par la suite, il a été montré que des peptides plus courts maintenaient l'activité biologique de base. Tout particuliÚrement, la séquence des 29 premiers acides aminés avec la terminaison amide, hGRF(1-29)-NH2, présente une activité trÚs proche du hGRF (1-44)-NH2 (Rivier et ai.,
Nature, 1982, 300, 276-278).
I1 est Ă©galement connu que la Met-27 du hGRF (1-29)-NH2 peut ĂȘtre avantageusement remplace par-Nle ou
Ile pour obtenir des produits ayant une stabilité chimique (oxydation par l'oxygÚne) et une résistance à la dégradation enzymatique supérieures à celles de la séquence naturelle, tout en possédant une activité intrinsÚque équivalente.
Selon ce qui est indiqué dans la littérature, le GRF(1-29)-NH2 et ses analogues Nie-27 et Ile-27 ont été synthétisés en phase solide mais cette technique n'est pas souhaitable pour une production des produits ci-dessus en quantités importantes.
Des synthÚses en phase liquide desdits produit t n'ont pas été décrites en littérature. Par ailleurs, l'enchaß- nement de 29 acides aminés par voie séquentielle en phase liquide présente des difficultés
On a maintenant trouvĂ© que le hGRF(1-29)-NH2 et ses analogues Nle-27 et Ile-27 peuvent ĂȘtre prĂ©parĂ©s par une synthĂšse par fragments en phase liquide qui peut ĂȘtre transposĂ©e Ă  l'Ă©chelle industrielle et qui permet d'obte- nir les produits souhaitĂ©s avec des rendements et puretĂ©s excellents.
Les acides alpha-aminés sont représentés ci-aprÚs par les symboles recommandés par la commission de nomenclature de l'IUPAC-IUB section biochimie.
Ala : Alanine
Arg : Arginine
Asn : Asparagine
Asp : Acide aspartique
Gln : Glutamine
Gly : Glycine
Ile : Isoleucine
Leu : Leucine
Lys : Lysine
Met : Methionine
Phe : Phenylalanine
Ser : Serine
Thr : Thréonine
Tyr : Tyrosine
Val : Valine
Nle : Norleucine
A l'exception de la glycine, ils sont tous de configuration L.
On utilisera également, ci-aprÚs, les abréviations suivantes:
THF : TĂ©trahydrofuranne
AcOH : Acide acétique
HBr : Acide bromhydrique
CCM : Chromatographie sur couche mince
OBzl : Ester benzylique
Z : Benzyl-oxycarbonyle (carbamate)
Boc : Tertiobutoxy-carbonyle(carbamate)
DMF : Diméthyl-formamide
NEM : N-Ă©thyl-morpholine
TFA : Acide trifluoroacétique
AcOEt : Acétate d'éthyle
2-Br-Z : Bromo-2 benzyloxycarbonyle
2-Cl-Z : Chloro-benzyloxycarbonyle
AAA : Analyse d t acides aminés
Cha : Cyclohexylamine
DCCI : Dicyclohexylcarbodiimide
DCU : Dicyclohexylurée
ONSu : Ester activé avec le N-Hydroxy-succinimide
ONp 6 Ester activé avec le para nitro-phénol
OTcp : Ester activé avec le2,3,5-trichloro-phénol
Mts : MesitylĂšne-sulfonyle
OHBT :N-hydroxy-benzotriazole
ONb Ester activé avec le N-hydroxy-norbornÚne-5 dicarboximide-2, 3
BOP : Hexafluorophosphate de benzc-triazolyloxy-
tris (diméthylamino) phosphonium
T.A. : Température ambiante
EPP : Pureté polypeptidique
DIPEA : Diisopropyl-Ă©thyl-amine
TFMSA : Acide trifluorométhane sulfonique
Les dénominations Sephadex et Biogel des résines échangeuses d'ions sont des marques.
Ainsi, la présente invention a pour objet un procédé pour la préparation d'un nonacosapeptide de formule H-Tyr-Ala-Asp-Ala-I le-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-
Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln Asp-Ile- (A) -Ser-Arg-NH-2 (I) dans laquelle (A) représente Met, Nle ou Ile, et de ses sels pharmaceutiquement acceptables, dans lequel on couple un tripeptide protégé II' dérivé du tripeptide II de formule
X-Arg-Lys-Leu-NH-Nh2 (II) dans laquelle X représente un groupe N-protecteur la fonction guanidine de l'arginine et la fonction amine latérale de la lysine dudit tripeptide II' etant protégées par protonation ou par un groupement stable dans les condi- tions de déprotection du groupement X, avec un heptapeptide protégé de formule III' dérivé de l'heptapeptide de formule III
H-Leu-Gln-Asp-Ile-(A)-Ser-Arg-NH2 (III) dans laquelle (A) est tel que défini cimdessus @ les fonc- tions laterales de l'acide aspartique et de l'arginine de l'heptapeptide protégé III', étant protégées par un groupement stable dans les conditions de déprotection du groupe X, ou, dans le cas de l'arginine, par protonation.
AprÚs clivage du groupe protectauxX, on couple le décapeptide protégé IV' ainsi obtenu dérivé du décapaptide de formule IV :
H-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-(A)-Ser-Arg-NH2 (IV dans laquelle (A) est tel que défini ci-dessus, dont les fonctions latérales de l'acide aspartique, de la lyeine et de l'arginine restent protégées comme défini ci-dessus, avec un pentadécapeptide protégé V' dérivé du pentadécapeptide de formule V
X-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly
Gln-Leu-Ser-Ala-OH (V) dans laquelle X est un groupe Nwprotecteur, les fonctions latérales de la lysine et de l'argßnine dudit pentadecapeptide étant protégées par protonation ou par un groupement stable dans les conditions de déprotection du groupement X.Ensuite, aprÚs clivage du groupe protecteur X, on couple le pentacosapeptide protégé VII ainsi obtenu dérivé du pentacosapeptide de formule VI
H-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln
Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-(A)
Ser-Arg-NH2 (VI) dans laquelle (A) est tel que défini ci-dessus, dont les fonctions latérales de l'acide aspartique, de l'arginine et de la lysine restent protégées comme défini ci-dessus, avec un tétrapeptide protégé VII', dérivé du tétrapeptide de formule VII
X'-Tyr-Ala-Asp-Ala-OH (VII) dans laquelle X' représente un groupe N-protecteur et la fonction acide latérale de l'acide aspartique du tétrapeptide VII' étant protégée.Lesdits couplaques sont effectuée dans un solvant polaire aprotique en présence d'un agent de couplage.
Enfin on soumet le nonacosapeptide ainsi obtenu, dans lequel toutes les fonctions latérales sont protégées a une déprotection, on isole le produit de formule I ainsi obtenu et on le transforme éventuellement en l'un de ses sels pharmaceutiquement acceptables.
Le groupe X peut etre un groupe protecteur quelconque utilisé dans la chimie des peptides dans l'opération d'élongation des chaßnes, le groupe Boc étant particuliÚrement préféré
Le groupe X' peut ĂȘtre le mĂȘme groupe X, mais il est prĂ©fĂ©rable qu'il soit diffĂ©rent, de façon Ă  ouvoir ĂȘtre clivĂ© en mĂȘme temps que les groupes protecteurs de acide aspartique, de la lysine et de l'arginine dĂ©jĂ  prĂ©sents dans les composĂ©s VI' et VII'
Au niveau de la déprotection terminale en fin de séquence, tous les groupes protecteurs sont éliminés, de préférence par hydrolyse à l'aide d'une solution 0,1 à 1 M d'acide méthanesulfonique ou trifluorométhanesulfonique dans l'acide trifluoroacétique.
Comme groupement protecteur de la fonction latĂ©rale de l'arginine, on utilise de prĂ©fĂ©rence le Mts, mais on peut Ă©galement protĂ©ger ladite fonction par simple protonation ou par un groupement nitro qui doit cependant ĂȘtre clivĂ© le plus t8t possible.
Les fonctions acides carboxyliques des chaßnes latérales de l'acide aspartique sont protégées par des groupements clivables par hydrogénation catalytique par exemple par H2/Pd/charbon ou bien en milieu acide fort comme les mélanges acide méthanesulfonique (0,5 M) - acide trifluoroacétique, ou acide trifluorométhanesulfonique (0,5 M) - acide trifluoroacétique. Les groupes protecteurs préférentiels sont l'ester benzylique (OB21) ou l'ester 2,6 di chlorobenzylique. Ces groupements protecteurs sont stables dans. les conditions de déprotections intermittentes des amines en alpha comme par exemple dans le cas de l'élimination des groupements Boc par l'acide trifluoracétique.
Les fonctions amines des chaines latĂ©rales des lysines sont protĂ©gĂ©es par des groupements clivables dans les mĂȘmes conditions que prĂ©cĂ©demment. Les groupements benzyloxycarbonyle (Z), 2-chloro-ou 2-bromo benzyloxycarbonyL (2 - Cl-Z ou 2 - Br-Z), stables dans les conditions de dĂ©protection intermittente par l'acide trifluoroacĂ©tique, sont particuliĂšrement prĂ©fĂ©rĂ©s.
Les fonctions hydroxyles présentes dans la thréonine, la sérine et la tyrosine, ne sont pas protégées.
L'ensemble du procédé de la présente invention est représenté par le schéma suivant utilisant des groupes protecteurs préférentiels.
Boc-Arg(Mtz)-Lys(Z)-Leu-NH-NH2 (II")
H-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-(A)-Ser-Arg(E+)-NH2 Boc-Arg(Mts)-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-(A)-Ser
Figure img00080001

(III")
-Arg(H+)-NH2
H-Arg(Mts)-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-(A)-Ser
-Arg(H+)-NH2 (IV")
Figure img00080002

puis
H+
Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg(H+)-Lys(Z)-Val -Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-OH (V").
Figure img00080003
BOP puis
H-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg(H+)-Lys(Z)-Val-Leu
Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg(Mts)-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln -Asp(OBzl)-Ile-(A)-Ser-Arg(H+)-NH2 (VI")
+
Z-Tyr-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH (VII")
hGRF (1-29)-NHo
Figure img00080004
BOP puis
H+ fort
Arg(H+) représente le radical dérivé de l'amino acide arginine dans lequel le groupe guanidino de la channe latérale est protégé par protonation.
Dans le procédé de synthÚse de la présente invention on applique le principe de la protection minimale au niveau des channes latérales fonctionnalisées.
L'élongation du peptide à partir des fragments synthétisés est réalisée en utilisant un agent de couplage comme l'hexafluorophosphate de benzotriazolyloxy tris (diméthylamino) phosphonium (BOP), la dicyclohexylcarbodiimide en présence d'hydroxy-1 benzotriazole, ou la méthode aux carboxyazides (Curtius) dans un solvant approprié comme le diméthylformamide ou le diméthylsulfoxyde. L'isolement du produit du milieu réactionnel est effectué par introduction d'un tie ant insolubilisant tel que éther ou l'acétate d'éthyle, qui précipite le peptide.
On se limite pendant les étapes de couplage A des purifications sommaires du type lavages en phase solide à a l'aide de solvants appropriés afin d'éliminer de légers excÚs du dernier fragment couplé, ainsi que les impuretés apportées par les agents de couplage.
Chaque opération de couplage daun fragment est suivie d'une phase de déprotection du groupement protecteur1 le groupe
Boc de prĂ©fĂ©rence, au niveau de l'amine sur laquelle va ĂȘtre effectue le couplage suivant. La dĂ©protection au niveau du groupement X est effectuĂ©e selon des mĂ©thodes connues.Le Boc est clivĂ© par l'acide trifluoroacĂ©tique dans le chlorure de mĂ©thylĂšne (50/50 en volume)
Les dĂ©protections des channes latĂ©rales en fin d'Ă©longation du peptide peuvent ĂȘtre effectuĂ©es par hydrogĂ©nation catalytique, en utilisant par exemple Pd/C, Ă  l'aide d'hydrogĂšne gazeur sous lĂ©gĂšre pression (1 Ă  5 kg) ou bien avec un gĂ©nĂ©rateur d'hydrogĂšne comme l'acide formique ou le formiate d'ammonium Il est Ă©galement pos- sible d'Ă©liminer ce type de groupements protecteurs par un acide fort comme les mĂ©langes d'acide mĂ©thanesulfonique dans l'acide trifluoroacĂ©tique (0,5 M) ou bien d'acide trifluoromĂ©thanesulfonique dans l'acide trifluoroacĂ©tique (0,5 M).
Le produit de formule I, , aprÚs les déprotections ter minales, est purifié par filtration sur gel Sephadex G 50 à l'aide de l'acide acétique à 30 %. Les fractions @@@@- chies en produit de formule I sont réunies et soumises@@ une chromatographie sur échangeurs d ions (cations) du type carboxy et à l'aide d'un gradient à force ionique croissante adaptée au type de résine échangeuse d'ions utilisée. Les fractions de plus haute pûreté sont réunies et purifiées, soit par chromatographie de partition sur un support approprié du type Séphadex G 50 ou Biogel P 10, soit par la distribution à contre-courant.Les fractions dont le titre de pureté est jué satisfaisant par EPLC analytique sont réunies Les autres sont recyclées
Une variante au procédé consiste à remplacer la chromatographie de partition ou la distribution à contre courant par la HPLC préparative sur un support et avec un tampon appropriés.
Les différents fragments de formules IV' et VI' et sous-fragments de formules II' et III' intervenant dans le procédé de la présente invention du GRF sont synthétisés selon une stratégie adaptés à chaque ces
Les stratégies utilisées pour la synthÚse des sous- fragments II' et III' sont celles reportées dans les tableaux I, II ci-aprÚs.
Les fragments V' et VII' sont decrits dans la demande de brevet européen publiée sous le numéro 171 315.
Le fragment de formule VI' et les sous fragments de formules II', III' et IV' sont nouveaux et représentent des intermédiaires utiles dans la préparation du hGRF(1-29)-NH2 et de ses analogues Nle-27 et Ile-27. Ils rentrent dans le cadre de la présente invention.
Ainsi, selon un autre de ses aspects, la présente invention concerne un peptide protégé II' dérivé du peptide de formule
X-Arg-Lys-Leu-NH-NH2 (il) dans lequel X est un groupe protecteur et la fonction guanidine de l'arginine et la fonction amine latérale de la lysine sont protégées par protonation ou par groupement stable dans les conditions de déprotection du groupement
X.
et un peptide de formule
X"-Q-'R-Leu-Gln-Asp-Ile-(A)-Ser-Arg-NH2 (VIII) dans laquelle - R représente une liaison directe ou Arg-Lys-Leu-, - O représente une liaison directe ou
Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu
Ser-Ala - (A) représente Met, Nie ou lie - X" représente l'hydrogÚne ou le groupe N-protecteuz X,
Q étant obligatoirement une liaison directe lorsque R est une liaison directe, ainsi que ses dérivés protégés dans iesquels les fonctions latérales de Asp, Arg et Lys éventuellement présentes dans ledit peptide sont protégées par des groupes protecteurs stables dans les conditions de clivage du groupe N-protecteur X.
Les sels du peptide de formule VIII oĂč X" reprĂ©sente l'hydrogĂšne rentrent Ă©galement dans le cadre de la prĂ©sente invention.
Le groupe protecteur représenté par X est de préférence le groupe Boc.
Les groupes protecteurs des acides aminés Asp, Lys et
Arg sont de préférence ceux qui sont indiqués ci-dessus.
Des peptides particuliÚrement préférés sont représentés par les formules suivantes:
Boc-Arg (Mts) -Lys (Z) -Leu-NH-NH2
H-Leu-Gln-Asp (OBzl) -Ile-(A) -Ser-Arg (H+) -NH2
H-Arg(Mts)-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-(A)-Ser
-Arg(H+)-NH2
H-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg(H+)-Lys(Z)-Val-Leu-Gly
-Gln-Leu-Ser-Ala- rg(Mts)-Lys(Z)-Leu Leu-Gln-Asp(OBzl) -Ile-(A)-Ser-Arg(H+)-NH2 dans lesquelles (A) est Met, Ile ou Nie, de préférence
Met ou Nle.
TABLEAU I: SOUS FRAGMENT III'
Figure img00140001
<SEP> Leu <SEP> Gln <SEP> Asp <SEP> Ile <SEP> Met <SEP> Ser <SEP> Arg
<tb> <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> NO2
<tb> <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> Z <SEP> | <SEP> OH
<tb> <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> |# <SEP> NO2
<tb> <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> |
<tb> <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> Z <SEP> | <SEP> NH2
<tb> <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> HBr/AcOH <SEP> |#
<tb> <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> NO2
<tb> <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> Doc-SeR-ONb <SEP> H <SEP> | <SEP> NH2, <SEP> HBr
<tb> <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> # <SEP> | <SEP> NO2
<tb> <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> Boc <SEP> | <SEP> | <SEP> NH2
<tb> <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> # <SEP> TFA <SEP> | <SEP> NO2
<tb> <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> Doc-Met-ONp <SEP> + <SEP> H <SEP> | <SEP> | <SEP> NH2, <SEP> TFA
<tb> <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> # <SEP> | <SEP> | <SEP> NO2
<tb> <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> Doc <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> NH2
<tb> <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> TFA <SEP> # <SEP> | <SEP> | <SEP> NO2
<tb> <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> Doc-Ile-ONsu <SEP> + <SEP> H <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> NH2, <SEP> TFA
<tb> <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> # <SEP> | <SEP> | <SEP> NO2
<tb> <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> Doc <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> NH2
<tb> <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> # <SEP> TFA <SEP> | <SEP> | <SEP> NO2
<tb> <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> H <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> NH2, <SEP> TFA
<tb> <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> OBzl <SEP> | <SEP> | <SEP> # <SEP> H2/Pd <SEP> | <SEP> | <SEP> H+
<tb> <SEP> | <SEP> | <SEP> Boc-Asp-ONsy <SEP> + <SEP> H <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> NH2
<tb> <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> OBzl <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> H+
<tb> <SEP> | <SEP> | <SEP> Boc <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> NH2
<tb> <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> OBzl <SEP> | <SEP> # <SEP> TFA <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> H+
<tb> <SEP> | <SEP> Boc-Gln-ONp <SEP> + <SEP> H <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> NH2, <SEP> TFA
<tb> <SEP> | <SEP> | <SEP> # <SEP> | <SEP> OBzl <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> H+
<tb> <SEP> | <SEP> Boc <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> NH2
<tb> <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> OBzl <SEP> # <SEP> TFA <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> H+
<tb> <SEP> Buc-Leu-ONSu <SEP> + <SEP> H <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> NH2, <SEP> TFA
<tb> <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> OBzl <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> H+
<tb> <SEP> Boc <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> NH2
<tb> <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> OBzlTIA <SEP> # <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> H+
<tb> <SEP> H <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> NH2
<tb>
TABLEAU il :SOUS FRAGMENT Il'
Figure img00150001
<tb> <SEP> Arg <SEP> Lys <SEP> Leu
<tb> <SEP> Z
<tb> <SEP> Boc0Tcp <SEP> H <SEP> ~ <SEP> OMe, <SEP> HC1
<tb> <SEP> z
<tb> Boc <SEP> OH <SEP> Boc <SEP> g <SEP> OMe
<tb> <SEP> : <SEP> : <SEP> :
<tb> <SEP> ; <SEP> 'SFA
<tb> <SEP> Mts <SEP> z <SEP> > <SEP> Z <SEP> TFA
<tb> BOY <SEP> /OH <SEP> H <SEP> / <SEP> OMe, <SEP> TFA
<tb> <SEP> : <SEP> DCC/NSuQH:
<tb> <SEP> ts <SEP> DCC/NSuOH:
<tb> <SEP> M <SEP> Z
<tb> Boc <SEP> / <SEP> / <SEP> r <SEP> OMe
<tb> <SEP> t <SEP> NH2NH2 <SEP> t
<tb> <SEP> Mts <SEP> : <SEP> Z <SEP> 4 <SEP> O
<tb> Boc <SEP> NH-NH2
<tb> <SEP> 2
<tb>
Le procédé de la présente invention étant basé sur le principe d'une synthÚse par fragments en phase liquide, présente l'avantage de permettre la synthÚse en parallÚle de ces fragments, ce qui se traduit par un gain notable de temps et une transposition aisée à grande échelle.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter.
Les chromatographies sur couche mince (CCM) sont effectuées sur des plaques de silice Merck 60F 254 (5 x 7,5 cm).
EXEMPLE I : SYNTHESE DU PEPTIDE III"
H-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg(H+)-NH2 1 ) Z-Arg(NO2)-NH2
On dissout 30 g de Z-Arg(NO2)-OH dans 200 ml de THF contenant 23 ml de n tributylamine. On ajoute 9,8 ml de chloroformiate d'éthyle puis, aprÚs agitation pendant 10 min et refroidissement à + 50C, on ajoute 19 ml d'ammoniaque à 28%. On maintient l'agitation et la température pendant 2 h, puis le solide est essore, lavé à l'éther, séché.
Rendement : 25,2 g t 80 %
CCM : chloroforme-MeOH-AcOH (60/20/15) ; Rf : 0,25 2 ) H-Arg(NO2)-NH2, HBr
On dissout 25,2 g de Z-Arg(N02)-NH2 dans 260 ml d'AcOH à 33 % HBr On agite 30min, puis on précipite le produit par addition d'éther. I1 est essoré, lavé à l'éther et séché.
Rendement : 22,8 g ; (97 %)
CCM : BuOH-2/AcOH/H2O (72/7/21) ; Rf = 0,16 3 ) Boc-Ser-Arg(NO2)-NH2
On dissout 20 g de H-Arg(NO2)-NH2, HBr et 22,9 g de
Boc-Ser-ONb dans 250 ml de DMF. On maintient le pH à 6,5 par addition de NEM à T.A. On contrÎle la fin de la réaction par CCM aprÚs 3 h.Le milieu est évaporé à sec et repris dans le chlorure de méthylÚne. Un solide précipite.
Il est décanté, repris dans l'éther, essoré, lavé à l'éther et séché.
Rendement : 22,8 g t (84 %)
CCM : BuOH-2/AcOH/H2O (72/7/21) ; Rf : 0,60 4 ) H-Ser-Arg(NO2)-NH2, TFA
On dissout 10,5 g de Boc-Ser-Arg(NO2)-NH2 dans 130 ml solution 50/50 chlorure de méthylÚne - TFA, refroidie à + 100C. On agite 60 min à T.A.. On évapore sous vide et le produit est précipité par addition d'éther, essoré, lavé à l'éther et snché.
Rendement : 9,46 g ; (86 %) CCM : :-BuOH-2/AcOH/H2O (72/7/21) ; Rf -= 0,14 5 ) Boc-Met-Ser-Arg(NO2)-NH2
On dissout 43 g de H-Ser-Arg(N02)-NH2, TFA et 38,1 g
Boc-Met-ONp dans 450 ml DMF. On ajoute 1,14g d'OHBT et on agite 18 h à T.A. en maintenant le pH à 6,5 par NEM.AprÚs contrale CCM, le milieu est évaporé à sec, repris par .1'AcOEt. Un produit précipite, l'-AcOEt est décanté, remplacé par de l'éther, puis le solide est essoré, lavé avec AcOEt, à l'éther et séché.
Rendement : 38,5 g ; (70 %)
CCM : BuOH-2/AcOH/H2O (72/7/21) ; Rf : 0,62 6 ) H-Met-Ser-Arg(NO2)-NH2, TFA
On dissout 38 g de Boc-Met-Ser-Arg(NO2)-NH2 dans 400 ml d'un mélange 50/50 de chlorure de méthylÚne/TFA contenant 10 % d'éthane dithiol, refroidi à + 100C. On agite 45 min ?
T.A., puis on évapore et on précipite le produit par addi- tion d'éther. Il est essoré, lavé à à l'éther, séché.
Rendement : 38.4 g ; (98 %)
CCM : BuOH-2/AcOH/H2O (72/7/21) ; Rf : : 0,07 7o) Boc-Ile-Met-Ser-Arg(NO2)-NH)
On dissout 4,5 g H-Met-Ser-Arg(N02)-NH2, TFA et 3,03 g
Boc-Ile-ONSu dans 50 l de DMF . On maintient le pH à 6,5 par NEM.18 h. AprÚs contrÎle de la fin de réaction, on évapore à sec et on précipite le produit par addition d'AcOEt. il est essoré, lavé avec AcOEt, à l'éther et seche.
Rendement : 4,1 g ; (77 %)
CCM : BuOH-2/AcOH/H2O (72/7/21) t Rf : 0,62 80) H-Ile-Met-Ser-Arg(NO2)-NH2, TFA
On dissout 13,7 g de Boc-Ile-Met-Ser-Arg(No2)-Leu-NH2 dans 150 ml d'un mélange 50/50 chlorure de méthylÚne/TFA à 10 % d'éthane dithiol, refroidi à + 10 C.
Le milieu est agité 45 min à T.A., , évaporé à sec, précipité par addition d'éther. Le produit est essoré, lavé à l'éther, séché;
Rendement : 14 g ; (100 %)
CCM : BuOH-2/AcOH/H20 (72/7/21) ; Rf : 0,14 9 ) H-Ile-Met-Ser-Arg(H+)-NH2, TFA
On dissout 19,7 g de H-Ile-Met-Ser-Arg (N02)-NH2, TFA dans 200 ml d'eau, on ajoute 60 ml de HClIN et 40 g de Pd/C a 10 % (50 % humide). On hydrogĂšne 48 h (100 mm Hg).
On essore et on lave le catalyseur à l'eau. On ajoute de la résine IR 45 OH jusqu'à amener le pH à 8,5. On essore et on lave la resine. On dégaze le milieu. On vérifie l'absence de NH4+ et on lyophilise.
RENDEMENT : 11,5 g ; (77 %)
CCM : nBuOH/pyridine/AcOH/H2O (60/12/12/48)-;- Rf 0,50
AAA : Ser ; 0,93 - Met : 1,01 - ile : 1,00 - Arg : 1,07 10 ) Boc-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg(H+)-NH2
On dissout 7 g de H-Ile-Met-Ser-Arg(H+)-NH2, TFA dans 80 ml de DMF, et on ajoute goutte Ă  goutte 6 g de
Boc-Asp(OBzl)-ONSu dans 30 ml de DMF en maintenant le pH à 6,5 par addition de NEM. Le milieu est agité à T.A. en maintenant le pH à 6,5 par NEM durant 18 h. AprÚs contrale
CCM, le milieu est évaporé à sec et le produit précipité par addition d'AcOEt. I1 est essoré, lavé AcOEt, éther, séché.
CCM : BuOH--2/AcOH/H20 (72/7/21) ; Rf- : 0,56 110) H-Asp(OBzl) -Ile-Met-Ser-Arg (H+)-NH2, TFA
On dissout Ă  +10 C, 8,75 g de
Boc-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg(H+)-NH2 dans 90 ml d'un mélange 50/50 chlorure de méthylÚne/TFA à 10 % d'éthane dithiol. On agite 45 min à T.A. On évapore à sec et précipite le produit par addition d'éther. On essore, lave et sÚche le produit obtenu.
Rendement : 8,9 g ; (100 %)
CCM : BuOH-2/AcOH/H20 (71/7/21) ; Rf : 0,28 12 ) Boc-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg(H+)-NH2
On dissout 8,9 g de H-Asp(OBzl) Iie-Met-Ser-Arg(H+)-NH2, TFA et 4,3 g de Boc-Gln-ONp dans 100 ml de DMP. On ajoute 0,2 g d'OHBt et on agite Ă  T.A.
18 h en maintenant le pH à 6,5 par NEM. AprÚs évaporation à sec, le produit est précipité par addition d'AcOEt, essore', lavé avec AcOEt et l'éther, puis séché.
CCM : BuOH-2/AcOH/H O (71/7/21) ; Rf : 0,43
2 130) H-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg(H+)-NH2, TFA.
On dissout Ă  + 100C, 8,33 g de Boc-Gln-Asp(OBzl)
Ile-Met-Ser-Arg(H+)-NH2 dans 90 mi d'un mélange 50/50 chlorure de méthylÚne/TFA à 10 % d'éthane dithiol. On agite 45 min à T.A., puis on évapore le milieu. Le produit est précipité par addition d'éther, essoré, lavé à l'éther et séché.
Rendement : 8,8 g ; (100 %)
CCM : n BuOH/pyridine/AcOH/H2o (60/12/12/48) t
Rf : 0,3 14 ) Boc-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg(H+)-NH2
On dissout 5,5 g de H-Gln-Asp(OBzl) Ile-Met-Ser-Arg(H+) -NH 2, TFA, 2,3 g de Boc-Leu-ONSu dans 50 ml DMF. On maintient le pH Ă  6,5 18 h par addition de
NEM. AprÚs contrÎle de fin de réaction, on évapore. Le produit est précipité par addition d'AcOEt, essoré, lavé avec AcOEt, à l'éther, et séché.
Rendement @ 3,1 g , (84 %)
CCM : n BuOH/pyridine/AcOH/H2O (60/12/12/48) t
Rf = 0t77 15 ) H-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg(H+)-NH2, TFA
On dissout 5 g de Boc-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met Ser-Arg(H+)-NH9 à + 100C dans 60 ml d'un mélange 50-/50 de chlorure de méthylÚne/TFA à 10% d'éthane dithiol. Le milieu est agité à T.A., 45 min, puis évaporé. Le produit est précipité par adition d'éther, essoré, lavé à l'éther, séché.
RENDEMENT : 5 g ; (98 %)
CCM : n BuOH/pyridine/AcOH/H20 (60/12/12/48)
Rf : 0,37
EXEMPLE II : SYNTHESE DU PEPTIDE II"
Boc-Arg(Mts)-Lys(Z)-Leu-NH-NH2 (II") 1 ) Boc-Arg(Mts)-OH, Cha
50 g de Boc-Arg-OH, HC1, H2O (0,152 M) sont dissous dans 190 ml de soude 4 N (pH 13-14). On ajoute 1.200 ml d'acétone et refroidit l'ensemble à -50C, dans un mélange glace + sel.A la solution précédente, on ajoute sous bonne agitation en 1 h, 66 g de chlorure de mésitylÚne sulfonyle
soit 0,3 M, en solution dans 300 ml d'acétone; En fin d'addition, on agite encore 1 h à -50C, puis on amÚne le pH de 8 à 11-12 par addition de soude 4N. On supprime le bain réfrigérant et laisse revenir progressivement à T.A.
On poursuit l'agitation pendant 2 h 30 et rajoute 200 ml d'eau, pour dissoudre le précipité de chlorure de sodium, formé en cours de réaction. Un contrÎle en CCM chloroforme/méthanol/acide acétique 87/7/3 indique que la réaction est terminée.
On évapore l'acétone au maximum sous vide (25 mm Hg) à 30 C. Le résidu est dilué dans 500 ml d'eau, et on extraitl'ensemble par de l'acétate d'éthyle (2 x 400 ml), pour éliminer l'excÚs de chlorure de mésitylÚne sulfonyle. La solution aqueuse est traitée, en présence de 1000 m d'acétate d'éthyle, par une solution saturée de KHSO4, le pH passe de 9 à 3. L'acétate d'éthyle est décanté, et on extrait la phase aqueuse par 3 x 500 ml d'acétate d'éthyle. Les phases acétate d'éthyle sont réunies, lavées par des solutions aqueuses de KHSO4-K2S04 à 5 % (2 x 300 ml), H2O (3 x 300 ml), puis séchées sur sulfate de magnésium.La solution ( 2.500 ml d'acétate d'éthyle) est filtrée et conservée au réfrigérateur jusau'au lendemain.
On reprend la solution précédente et on la concentre -sous vide (25 mm Hg) jusqu'd 500 ml. On rajoute à froid 18 ml de cyclohexylamine : le produit précipite sous forme d'une gomme blanche. On rajoute quelques gouttes de cyclohexylamine pour que le pH passe de 6 à 8. On évapore l'acétate d'éthyle sous vide, et obtient une gomme; les derniÚre s traces de solvant sont éliminées sous videpoussé.
Le solide s'organise ; on le reprend dans 500 ml d'éther éthylique et triture l'ensemble : on obtient ainsi un solide blanc qui est essoré et séché.
CCM : chloroforme/méthanol/acide acétique 87/7/3
Tache unique
RENDEMENT : 71 % ; Poids : 60 g 20) Boc- rg(Mts)-OH
300 g de Boc-Arg(Mts)-OH, Cha (0,54 M) sont dissous dans 3000 ml d'acétate d'éthyle. On y rajoute 1000 ml d'eau et acidifie au pH-mFtre jusqu'd pH 2, par addition d'une solution saturée de KHSO4. On décante l'acétate d'éthyle, et on extrait la phase aaueuse avec de l'acétate d'éthyle (2 x 500 ml). On réunit les phases d'acétate d'éthyle, lave à l'eau (2 x 300 ml), sÚche la phase organique sur sulfate de magnésium. On évapore au rotavapor sous vide de 25 mm de Hg à 300C. On obtient une gomme semi-cristallisée qui est triturée dans le pentane (2000 ml), au mixeur jusqu'à l'obtention d'une poudre, qui est isolée par essorage.
Rendement : 73 % ; Poids : 180 g ;
CCM : chloroforme/méthanol/acide acétique (87/7/3)
1H RMN conforme.
3 ) Boc-Lys(Z)-Leu-OCH3
Dans 1600 ml d'acétate d'éthyle refroidis à + 100C, on dissout
- 54,5 gde H-Leu-OCH3, HCl (soit 0,3 M)
- 42,2 ml de N-Ă©thyl morpholine (0,33 M)
- 50,5 g de 1-Hydroxybenzotriazole, hydrate.
A cette solution, on ajoute alors 167,9 g de
Boc-Lys(Z)-OTcp (0,3 M). On ajuste le pH- à 6-7 si nécessaire par addition de NEM. On agite le milieu réactionnel une heure à + 100C, puis une nuit à T.A.
Le lendemain, on contrÎle par CCM [chloroforme/méthanol/acide acétique (95/5/3], s'il n'y a plus de Boc-Lys(Z)-OTcp ; on essore un léger insoluble. La phase acétate d'éthyle est lavée par les solutions aqueuses suivantes
- 2 x 300 ml HKSO4-K2SO4 Ă  5 %
- 2 x 300 mi solution saturée de chlorure de sodium
- 2 x 300 ml solution saturée de bicarbonate de
sodium
- 300 ml eau
On sÚche la solution d'acétate d'éthyle sur sulfate de magnésium, filtre, et évapore le solvant sous vide de 25 mm de Hg à 300C ; on obtient une huile visqueuse qui estchromatographiée sur une colonne de gel de silice Merck 60 (200-400 mesh) diamÚtre 7 cm - -hauteur de lit : 210 cm
Eluant de départ : chloroforme.
AprĂšs passage des impuretĂ©s de tĂȘte, on rajoute 2 % de mĂ©thanol au chloroforme. On suit le dĂ©roulement de la chromatographie par CCM (chloroforme/mĂ©thanol/acide acĂ©tique 95/5/3). Les fractions intĂ©ressantes sont rĂ©unies, le solvant est.Ă©vaporĂ© sous vide (25 mm de Hg) Ă  300C, et le rĂ©sidu est recristallisĂ© dans un mĂ©lange pentane-Ether Ă©thylique 50/SOn On obtient des cristaux blancs.
Rendement : 79 % ; Poids : 119 g
1 H RMN - Conforme.
40) H-Lys(Z)-Leu-OCH3 , TFA
37,8 g de Boc-Lys(Z)-Leu-OCH3 sont dissous dans 190 ml de chlorure de méthylÚne, refroidis au bain de glace. On ajoute en 5min, 190 ml d'acide trifluoracétique et agite une heure à T.A. On évapore le mélange réactionnel sous vide (25 mm de Hg) et à 300 C, jusqu'à obtention d'une huile de poids constant, utilisée telle quelle pour l'opération suivante.
5 ) Boc-Arg(Mts)-Lys(Z)-Leu-OCH3
34 g de Boc-Arg-(Mts)-OH (0,075 M) sont dissous dans 560 ml de tétrahydrofuranne, refroidis dans un bain de glace. On y ajouté 10,5 g de N-hydroxy-succinimide (0,07-5 Mx 1,2, soit 20 % d'excÚs), et 18,6 g de DCCI (0,075 Mx 1,2), soit 20 % d'excÚs.
Au bout d'une heure, apparat un précipité important (18 g) de DCU, qui est séparé par essorage. A cette solution de Boc-Arg(Mts)-ONSu préparé in situ, est ajouté à froid (bain de glace), 0,075 M de TFA, H-Lys(Z)-Leu-OMe dans 150 ml de tétrahydrofuranne. Le pH du milieu réactionnel est amené et maintenu à 7 par addition de NEM.
On agite une nuit à T.A. et on vérifie en CCM (chloroforme/méthanol/acide acétique (95/5/3) que la réaction est terminée. Le milieu réactionnel est évaporé à sec sous pression réduite (25 mm de Hg) à 300C. Le résidu huileux obtenu est repris dans 1000 ml d'acétate d'éthyle et lavé successivement avec - 2 x 300 ml solution aqueuse saturée de bicarbonate de
sodium - 2 x 300 ml solution aqueuse de HKSO4-K2SO4 à 5 % - 300 ml solution aqueuse saturée de chlorure de sodium
La solution d'acétate d'éthyle est séchée sur sulfate de magnésium, puis évaporée à sec sous vide (25 mm de Hg) à 300C. On obtient une gomme (80 g) qui est purifiée par chromatographie, sur une colonne de gel de silice (Merck 60 A 200-400 mesh), de 7 cm de diamÚtre, par 210 cm de hauteur.
Le produit est introduit dans le mélange d'élution (chloroforme/méthanol 100/1,5 v/v). La chromatographie est suivie par CCM ou par détection UV. Les fractions intéressantes sont réunies, les solvants évaporés et le résidu obtenu recristallisé dans un mélange pentane/éther éthylique (50/50 v/v). On obtient 40 g d'une poudre blanche.
Rendement : 63 %
CCM : chloroforme/méthanol/acide acétique 90/10/1
Rf : 0,59
1H RMN - Conforme.
6 ) Bpc-Arg(Mts)-Lys(Z)-Leu-NH-NH2
10 g de Boc-Arg(Mts)-Lys(Z)-Leu-OCH3 (0,0118 M) sont dissous dans 16.0 ml de méthanol. On agite en refroidissant dans un bain de glace et ajoute 28,2 ml d'hydrate d'hydrazine (0,0118 x 50 équiv.) CCM dans chloroforme/méthanol 90/10 + 3 gouttes d'eau : la réaction est terminée au bout de 4 h.
On concentre la solution méthanoliaue à moitié et on la verse sur de la glace.- On abandonne quelques heures : le produit précipite sur la glace. AprÚs fusion on filtre sous vide, lave abondamment à l'eau, sÚche.
CCM : chloroforme/méthanol , 90/10 + 3 gouttes d'eau
Rf : 0,40
On obtient 7,6 g ; Rendement : 76 %
1 H RMN - Conforme.
EXEMPLE III: SynthĂšse du peptide IV"
H-Arg(Mts)-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(OBzl) Ile-Met-Ser-Arg (H+) -NH 2 1 ) Boc-Arg(Mts)-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser
Arg(H+)-NH2
On dissout 12,7 g de Boc-Arg(Mts)-Lys(Z)-Leu-NH-NH2 dans 280 ml DMF. On refroidit entre -15 et -20 C sous azote. On ajoute 7,3 ml d'HCl/dioxanne 6,75 N puis 2,1 ml nitrite de t -butyle.
On maintient la solution 1 h Ă  -15 C. On amĂšne le pH Ă  6,3 avec DIPEA.
On dissout le H-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser Arg(H+)-NH2, TFA dans 200 ml DMF. On refroidit à -100C et on amÚne le pH à 6,6-6,9 par DIPEA. On ajoute en 30min à -15 , -20 C cette solution à la solution précédente. On ajuste le pH à 7 par DIPEA et on conserve le milieu à -150C pendant 72 h
AprÚs contrÎle de fin de réaction, on évapore le milieu, on précipite le produit par addition AcOEt. I1 est essoré, lavé avec AcOEt, à l'éther, puis séché.
Rendement : 13,1 g ; (61 %)
BuOH-2/AcOH/H20 (72/7/21) ; Rf : 0,41 20) H-Arg(Mts)-Lys(Z)-Leu-Leu Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-
Arg(H+)-NH2, TFA
On dissout 12 g de Boc-Arg(Mts)-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln
Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg(H+)-NH2 à +'00C dans un mélange 50/50 chlorure de méthylÚne/TFA à 10 % d-'éthane dithiol.
On agite 45 min à T.A., puis le milieu est évaporé et le produit précipité par addition d'éther, essoré, lavé à éther, séché.
Rendement : 10,2 g ; (84 %)
CCM : BuOH-2/AcOH/H2O (72/7/21) ; Rf : 0,31
EXEMPLE IV : SynthÚse de GRF (1-29)-NH2 protégé
Boc-Tyr-Ala-Asp(OBzl)-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr
Arg(H+)-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg(Mts)
Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg(H+)-NH2 1 ) Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg(H+)-Lys(Z)-Val
Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg(Mts)-Lys(Z)-Leu-Leu
Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg(H+)-NH2
On dissout 5 g de H-Arg(Mts)-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-
Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg(H+)-NH2, TFA et 5,2 g de
Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg(H+)-Lys(Z)-Val-Leu
Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-OH dans un mélange de 100 ml DMF et 50 ml DMSO. On ajoute 1,8 g de BOP et on maintient le pH à- 6,5 avec NEM.AprÚs 4 h à T.A. et contrÎle de fin de réaction, le milieu est concentré, le produit précipité par addition d'AcOEt. il est essoré, lavé avecAcOEt, à l'éther, puis séché.
Rendement : 8 g ; (81 %)
CCM : BuOH-2/AcOH/H2O (72/7/21) ;Rf 0,42 2 ) H-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg(H+)-Lys(Z)-Val-Leu
Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg(Mts)-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln
Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg(H+)-NH2,TFA
On dissout 8 g de Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr
Arg(H+)-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala
Arg (Mtx)-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met
Ser-Arg(H+)-NH2 à +100C dans un mélange 50/50 de chlorure de méthylÚne/TFA à 10 % d'éthane dithiol, le milieu est agité 45min à T.A., évaporé à sec. Le produit est précipité par addition d'éther, essoré, lavé à l'éther, puis séché.
Rendement : 8,3 g ; (100 %)
CCM : BuOH-2/AcOH/H2O (72/7/21) t Rf : 0,33 30) GRF(1-29)-NH2 protégé
On dissout 8 g de H-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg(H+)-
Lys(Z)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg(Mts)-Lys(Z)
Leu-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg(H+)-NH2, TFA et 1,4 g de Boc-Tyr-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH dans 70 ml DMF et 30 ml de DMSO. On ajoute 1,4 g de BOP et on maintient le pH Ă  7 par NEM pendant 4 h.
AprÚs contrÎle de fin de réaction, le milieu est concentré, et le produit précipité par addition d'AcOEt.
I1 est essoré, lavé, AcOEt-, éther, séché.
Rendement : 8 g ; (87 %)
CCM : n-BuOH/pyridine/AcOH/H20 (60/12/12/48)
EXEMPLE V : DĂ©protection et purification du GRF(1-29)NH2 10) DĂ©protection du GRF(1-29)-NH2
On agite à OOC, 60 min, 4,5 g de GRF(1-29)-NH2 protégé dans un mélange de 180 ml de TFA, 19,8 ml TFMSA, 27 mi thioanisole et 11 ml metacrésol. On précipite le produit par addition d'l 1 d'éther, il est essoré, lavé à l'éther, séché sous vide en présence de potasse. Le produit est dissout dans 200 ml d'eau, amené à pH 4,5 par de la résine
IR45, forme acétate. AprÚs 30min d'agitation, la résine est filtrée, lavée à l'eau et les filtrats réunis sont lyophilisés.
Rendement : 3,80 g
-CCM : nBuOH/pyridine/AcOH/H2O (60/12/12/48) 2 ) Purification
AprĂšs passage sur-colonne de SĂ©phadex G 50 F (Ă©lution
AcOH 30 % avec 0,1 e béta mercapto éthanol), puis cange d'ions sur CM trisaoryle (élution par gradient acétate ammonium 0,1 à 0,4 M avec 0,1 % béta mercapto éthanol), le produit subit une chromatographie de partition sur
SĂ©phadex G 50 F dans n-BuOH/pyridine/EtOH/AcOH 0,2 N (4/1/1/7) sous saturation d'argon.
Les fractions dont 1'EPP est sunérieure ou égale à 95 % sont réunies et lyophilisées. Le produit est contrÎlé par
HPLC par rapport à un standard de référence et AAA -Tyr : 1,90 (2) - Ala : 2,82 (3) - Asn, Asp : 2,85 (3) -Ile . 1,95 (2) - Phe : 0,92 (1) - Thr : 1,01 (1) -Ser : 2,78 (3) - Arg : 2,98 (3) - Lys : 1,98 (2) -Val : 1,01 (1) - Leu : 4,05 (4) - Gly : 0,97 (1) -Gln : 1,89 (2) - Met : 0,91 (1)
EXEMPLE VI : SynthĂšse de
H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg
Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu
Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH
On opÚre selon le mode opératoire décrit dans les
exemples I Ă  V, Ă  partir de H-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Nle-
Ser-Arg(H+)-NH2 obtenu' selon exemple I en utilisant
la Boc-Nle-ONSu Ă  la place de la Boc-Met-ONp
EXEMPLE VII : SynthĂšse de
H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg
Lys-Val-Leu-Gly-Gly-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu
Leu-Gln-Asp-Ile-Ile-Ser-Arg-NH2
On opÚre selon le mode opératoire décrit dans les
exemples I Ă  V, Ă  partir de n-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-aae-
Ser-Arg(H+)-NH2 obtenu selon l'exemple I en utilisant
la Boc-Ile-ONSu Ă  la place de la Boc-Met-ONp.

Claims (11)

  1. REVENDICATIONS
    X'-Tyr-Ala-Asp-Ala-OH (VII) dans laquelle X' représentÚ un groupe N-protecteur et la fonction acide latérale de l'acide aspartique étant protégée ; lesdits couplages étant effectués dans un solvant polaire aprotique en présence d'un agent de couplage ; enfin on soumet le nonacosapeptide ainsi obtenu, dans lequel toutes les fonctions latérales sont protégées, à une déprotectiong on isole le produit de formule I ainsi obtenu et on le transforme éventuellement en l'un de ses sels pharmaceutiquement acceptables.
    (A) -Ser-Arg-NH 2 (VI) dans laquelle (A) est tel que défini ci-dessus, dont les fonctions latérales de l'acide aspartique, de 1' arginine et de la lysine restent protégées comme défini ci-dessus, avec un tétrapeptide protégé VII' dérivé du tétrapeptide de formule VII
    Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile
    Gln-Leu-Ser-Ala-OH (V) dans laquelle X est un groupe N-protecteur, les fonctions latérales de la lysine et de l'arginine dudit pentadecapeptide étant protégées par protonation ou par un groupement stable dans les conditions de déprotection du groupement X ; ensuite, aprÚs clivage du groupe protecteur X, on couple le pentacosapeptide VI' protégé ainsi obtenu dérivé du pentacosapeptide de formule VI H-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly
    H-Arg-Lys-Leu-Leu-Gin-Asp-Ile- (A) -Ser-Arg-NH2 (IV) dans laquelle (A) est tel que défini ci-dessus, dont les fonctions latérales de l'acide aspartique, de la lysine et de l'arginrne restent protégées comme défini ci-dessus, avec un pentadécapeptide protégé V' dérivé du pentadécapeptide de formule V X-I le-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys -Val-Leu-Gly=
    IV' ainsi obtenu dérivé du decapeptide de formule IV
    groupe protecteur X, on couple le décapeptide protégé
    l'arginine, par protonation ; puis, aprĂšs clivage du
    déprotection du groupe X, ou, dans le cas de
    un groupement stable dans les conditions de
    l'arginine dudit heptapeptide III' étant protégées par
    fonctions latérales de l'acide aspartique et de
    dans laquelle (A) est tel que défini ci-dessus, les
    2
    H-Leu-Gln-Asp-Ile- (A) -Ses-Arg-NH (III)
    formule III :
    heptapeptide protégé III' dérivé de l'heptapeptide de
    conditions de dé protection du groupement X, avec un
    par protonation ou par un groupement stable dans les
    la lysine dudit tripeptide II' étant protégées
    guanidine de l'arginine et la fonction amine latérale de
    oĂč X reprĂ©sente un groupe N-protecteur, la fonction
    X-Arg-Lys-Leu-NH-NH2 -( il)
    tripeptide de formule II ::
    qu'on couple un tripeptide protégé II' dérivé du
    sels pharmaceutiquement acceptables, caractérisé en ce
    dans laquelle (A) représente Met, Nle ou Ile, et de ses
    (A)-Ser-Arg-NH2 (I)
    Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-
    H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-val-
    formule
    1. Procédé pour la préparation d'un nonacosapeptide de
  2. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que
    dans les différents fragments à coupler X est un groupe
    Boc et en ce que les fonctions latérales des acides ami nés Asp, Lys et Arg sont protégées de façon stable dans les conditions d'élimination du groupe Boc
  3. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caracteri
    sé en ce que dans les différents fragments à coupler
    - la fonction latérale de l'acide aspartique est protégée sous forme de OBzl - la fonction latérale de l'arginine est protégée par protonation ou par un groupe Mts - la fonction latérale de la lysine est protégée par un groupe Z.
  4. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à
    3,caractérisé en ce que la déprotection finale est
    effectuée par hydrolyse à l'aide d'une solution 0,1 à 1
    M d'acide méthanesulfonique ou trifluorométhane-
    sulfonique dans l'acide trifluoroacétique
  5. 5.Peptide de formule
    "-Q-R-Leu-Gln-Asp-Ile-(A)-Ser-Arg-NH2 (VIII)
    dans laquelle
    - R représente une liaison directe ou Arg-Lys-Leu,
    - Q représente une liaison directe ou
    Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln Leu-Ser-Ala-
    - (A) représente Met, Nle ou ßle
    - X" représente l'hydrogÚne ou le groupe N-protecteur
    X,
    Q Ă©tant obligatoirement une liaison directe lorsque R
    est une liaison directe, ainsi que ses dérivés protégés
    dans lesquels les fonctions latérales de Asp, Arg et
    Lys éventuellement présentes dans ledit peptide son
    protégées par des groupes protecteurs stables dan le'
    conditions de clivage du groupe N-protecteur X.
  6. 6. Peptide selon la revendication 5, caractérise en ce
    que Q et R ne sont pas une liaison directe.
  7. 7. Tripeptide protégé dérivé du peptide de formule :
    X-Arg-Lys-Leu-NH-NH2 (II)
    dans laquelle X est un groupe protecteur, la fonction
    guanidine de l'arginine et la fonction amine latérale
    de la lysine dudit tripeptide étant protégées par
    protonation ou par un groupement stable dans les condi
    tions de déprotection du groupement X.
  8. 8. Tripeptide protégé selon la revendicaeion i, caractérisé
    en ce qu'il répond à la formule i Boc-Arg(Mts)-Lys(Z)-Leu-NH-NH
  9. 9. Peptide de formule
    H-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg(H+)-Lys(Z)-Val-Leu
    Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg(Mts)-Lys(Z)-Leu-Leu
    Gln-Asp(OBzl)-Ile-(A)-Ser-Arg(H+)-NH2
    dans laquelle (A) est Met, Nle ou Ile
  10. 10.Peptide de formule
    H-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-(A)-Ser-Arg(H+)-NH2
    dans laquelle (A) est Met, Nle ou Ile.
  11. 11. Peptide de formule
    H-Arg(Mts)-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile
    (A)-Ser-Arg(H+)-NH2
    dans laquelle (A) est Met, Nle ou Ile.
FR8607480A 1986-05-26 1986-05-26 Procede de preparation de nonacosapeptides et peptides intermediaires Expired - Fee Related FR2599038B1 (fr)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR8607480A FR2599038B1 (fr) 1986-05-26 1986-05-26 Procede de preparation de nonacosapeptides et peptides intermediaires

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR8607480A FR2599038B1 (fr) 1986-05-26 1986-05-26 Procede de preparation de nonacosapeptides et peptides intermediaires

Publications (2)

Publication Number Publication Date
FR2599038A1 true FR2599038A1 (fr) 1987-11-27
FR2599038B1 FR2599038B1 (fr) 1990-06-29

Family

ID=9335615

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FR8607480A Expired - Fee Related FR2599038B1 (fr) 1986-05-26 1986-05-26 Procede de preparation de nonacosapeptides et peptides intermediaires

Country Status (1)

Country Link
FR (1) FR2599038B1 (fr)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997017367A1 (fr) * 1995-11-03 1997-05-15 Theratechnologies Inc. Technique de synthese de peptides grf

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR67425E (fr) * 1955-01-14 1958-03-07 Brevets Pour Les Applic De L E Perfectionnements Ă  tous raccordements Ă©lectriques obtenus par sertissage
EP0105759A2 (fr) * 1982-10-04 1984-04-18 The Salk Institute For Biological Studies GRF pancréatique humain
EP0107890A1 (fr) * 1982-06-16 1984-05-09 The Salk Institute For Biological Studies PGRF de mammifĂšres
EP0117034A2 (fr) * 1983-01-13 1984-08-29 The Salk Institute For Biological Studies Analogues du facteur GRF
EP0122818A1 (fr) * 1983-02-21 1984-10-24 Sanofi S.A. SynthÚse du hpGRF (Somatocrinine) en phase liquide et peptides intermédiaires
EP0136475A2 (fr) * 1983-08-10 1985-04-10 The Administrators of The Tulane University Educational Fund Peptides libérant de l'hormone de croissance et méthode pour le traitement de mammifÚres
EP0138416A2 (fr) * 1983-09-21 1985-04-24 Eli Lilly And Company Analogues du facteur de libération de l'hormone de croissance
EP0161852A2 (fr) * 1984-05-18 1985-11-21 The Salk Institute For Biological Studies Analogues GRF IV
EP0193910A2 (fr) * 1985-03-06 1986-09-10 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited SynthÚse d'un dérivé du "GRF" et peptides intermédiaires

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR67425E (fr) * 1955-01-14 1958-03-07 Brevets Pour Les Applic De L E Perfectionnements Ă  tous raccordements Ă©lectriques obtenus par sertissage
EP0107890A1 (fr) * 1982-06-16 1984-05-09 The Salk Institute For Biological Studies PGRF de mammifĂšres
EP0105759A2 (fr) * 1982-10-04 1984-04-18 The Salk Institute For Biological Studies GRF pancréatique humain
EP0117034A2 (fr) * 1983-01-13 1984-08-29 The Salk Institute For Biological Studies Analogues du facteur GRF
EP0122818A1 (fr) * 1983-02-21 1984-10-24 Sanofi S.A. SynthÚse du hpGRF (Somatocrinine) en phase liquide et peptides intermédiaires
EP0136475A2 (fr) * 1983-08-10 1985-04-10 The Administrators of The Tulane University Educational Fund Peptides libérant de l'hormone de croissance et méthode pour le traitement de mammifÚres
EP0138416A2 (fr) * 1983-09-21 1985-04-24 Eli Lilly And Company Analogues du facteur de libération de l'hormone de croissance
EP0161852A2 (fr) * 1984-05-18 1985-11-21 The Salk Institute For Biological Studies Analogues GRF IV
EP0193910A2 (fr) * 1985-03-06 1986-09-10 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited SynthÚse d'un dérivé du "GRF" et peptides intermédiaires

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997017367A1 (fr) * 1995-11-03 1997-05-15 Theratechnologies Inc. Technique de synthese de peptides grf

Also Published As

Publication number Publication date
FR2599038B1 (fr) 1990-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Bodanszky et al. Cholecystokinin (pancreozymin). 3. Synthesis and properties of an analog of the C-terminal heptapeptide with serine sulfate replacing tyrosine sulfate
BG60740B2 (bg) ĐŸĐŸĐ»ĐžĐżĐ”ĐżŃ‚ĐžĐŽ
US5977302A (en) Liquid phase process for the preparation of GnRH peptides
EP0122818B1 (fr) SynthÚse du hpGRF (Somatocrinine) en phase liquide et peptides intermédiaires
US4638046A (en) Retro-inverso C-terminal hexapeptide analogues of substance P
EP0171315B1 (fr) Procédé de synthÚse du hGRF (Somatocrinine) en phase liquide et peptides intermédiaires
CH635571A5 (fr) Tetrapeptides et composition therapeutique les contenant.
US5095004A (en) Fluorine containing atrial natriuretic peptides
CA1249100A (fr) Derives peptidiques, leur procede de preparation et les compositions les contenant
FR2557114A1 (fr) Nouveaux derives de la gonadoliberine, procede pour leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant
US3862927A (en) Process for preparation of vasoactive intestinal peptide
US4758552A (en) Gonadoliberin derivatives containing an aromatic aminocarboxylic acid in the 6-position, pharmaceutical and veterinary compositions containing them and process for preparing same
JPH09503200A (ja) ïŒŁććżœæ€§ă‚żăƒłăƒ‘ă‚ŻèłȘæ–­ç‰‡ă‹ă‚‰èȘ˜ć°Žă•ă‚ŒăŸă‚ȘăƒȘギペプチド
EP0185320B1 (fr) Analogues rétro-inverses de neurotensines partiellement modifiés
BE1005720A3 (fr) Procede de synthese peptidique et nouveaux intermediaires de synthese.
FR2599038A1 (fr) Procede de preparation de nonacosapeptides et peptides intermediaires
US5376635A (en) Fluorine containing atrial natriuretic peptides
Campiglia et al. Novel route in the synthesis of ψ [CH2NH] amide bond surrogate
Lavielle et al. Binding affinities to rat brain synaptosomes–synthesis of biotinylated analogues of Substance P
HU187503B (en) Process for preparing gonadoliberine derivatives containing beta-aspartyl group
FR2524878A1 (fr) Peptides a activite biologique et medicament les contenant
KR100272310B1 (ko) ì•Ąìƒ 1-ë°ì•„ëŻžë…ž-8-d-ì•„ë„Žêž°ë‹Œ 바소프레신 아섞테읎튞 합성ëȕ
FR2555588A1 (fr) Procede de synthese en phase liquide de la somatocrinine et peptides intermediaires
FR2541271A1 (fr) Nouvelle synthese du hpgrf en phase liquide
KR840000054B1 (ko) 티ëȘšì‹  α₁의 ì œìĄ°ë°©ëȕ

Legal Events

Date Code Title Description
ST Notification of lapse