JP2003505108A - 転写フリーｓｅｌｅｘ - Google Patents

転写フリーｓｅｌｅｘ

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JP2003505108A
JP2003505108A JP2001513635A JP2001513635A JP2003505108A JP 2003505108 A JP2003505108 A JP 2003505108A JP 2001513635 A JP2001513635 A JP 2001513635A JP 2001513635 A JP2001513635 A JP 2001513635A JP 2003505108 A JP2003505108 A JP 2003505108A
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JP2001513635A
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スミス，ジョナサン・ドリュー
ゴールド，ラリー
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ギリード・サイエンシズ・インコーポレーテッド
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
    • C12Q2537/155—Cyclic reactions

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Abstract

(57)【要約】 転写フリー指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化（転写フリーＳＥＬＥＸ）として知られている方法により、標的分子に対する核酸リガンドを製造する方法を提供する。前記転写フリーＳＥＬＥＸ法とは、相補的なテンプレートに断片をアニ-リングし、次にそれらの断片を互いに連結するすることによって合成核酸の断片から核酸リガンドを調製するというものである。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野 本発明は、ＳＥＬＥＸ工程を用いて標的分子に対し特異的に作用する核酸リガ
ンドを産出する方法に関する。本発明は、転写を用いずにＲＮＡ核酸リガンドの
候補混合物を作り出す方法を提供する。本方法により、ＳＥＬＥＸがＲＮＡポリ
メラーゼの有効な基質として機能しない修飾されたリボヌクレオチドを使って実
施されることが可能となる。
【０００２】背景技術 長年にわたり定説となっていたのは、核酸は主として情報を与える役割を担っ
ているというものであった。ＳＥＬＥＸ法と名付けられている、指数関数的濃縮
によるリガンドの系統的進化として知られている方法により、核酸がタンパク質
のような三次元的な構造的多様性をもつことが明らかになってきた。このＳＥＬ
ＥＸ法は標的分子に対する極めて特異的に結合する核酸分子をｉｎ ｖｉｔｒｏ
で進化させるための方法であり、１９９０年６月１１日に提出され現在放棄され
た、米国特許第０７／５３６，４２８号「指数関数的濃縮によるリガンドの系統
的進化」、米国特許第５，４７５，０９６号「核酸リガンド」および米国特許第
５，２７０，１６３号（ＷＯ９１／１９８１３号も参照のこと）「核酸リガンド
の同定法」に記載されており、これらはそれぞれを参照として特に援用する。こ
れらの出願、まとめてＳＥＬＥＸ特許出願と呼ぶ、は所望の標的分子に対する核
酸リガンドを作成する根本的に新しい方法をそれぞれ記載している。このＳＥＬ
ＥＸ法はそれぞれ非反復配列を持ち、所望の標的化合物または分子に特異的に結
合する性質を持つ核酸リガンド（あるいはアプタマー）と呼ばれる１クラスの生
成物を提供する。各ＳＥＬＥＸ同定核酸リガンドは、ある標的化合物または分子
に対する特異的リガンドである。このＳＥＬＥＸ法は、核酸は様々な二次元およ
び三次元構造を形成することができ、それ自身のモノマー中に、モノマーであろ
うとポリマーであろうと、実質的にいかなる化学的化合物ともリガンドとして作
用する（特異的な結合ペアを形成する）に充分な化学的融通性を持っているとい
う独特の洞察に基づいている。このＳＥＬＥＸ法においてはいかなる大きさ、い
かなる組成の分子でも標的とすることができる。高親和性結合の用途に用いるＳ
ＥＬＥＸ法においては、候補オリゴヌクレオチドの混合物からの選択と、同じ一
般的選択スキームを用いて、結合、分配、および増幅を段階的に反復し、実質的
にどのような基準の結合親和性と選択性を所望したとしても、それを達成するこ
とができる。ＳＥＬＥＸ法は、好ましくはランダム化した配列のセグメントを含
有する、核酸混合物を原料にし、結合、標的分子に特異的に結合した核酸から非
結合核酸を分配し、核酸-標的複合体を解離し、この核酸-標的複合体から解離し
た核酸を増幅してリガンドに富む核酸混合物を得るのに有利な条件のもとでこの
混合物を標的と接触する工程を含有し、それから結合、分配、解離および増幅工
程を所望回数反復して標的分子に対し極めて特異性の高い高親和性核酸リガンド
を得るものである。
【０００３】 本発明者らは化学化合物としての核酸に広範囲にわたる一連の形状、大きさお
よび構造の形成能があり、生物学的システム中で核酸が示しているよりもはるか
に幅広い結合並びにその他の機能の能力があることをこのＳＥＬＥＸ法が示して
いるという認識を得た。
【０００４】 基本となるＳＥＬＥＸ法は多数の特定対象物を得るために修正されている。例
えば１９９２年１０月１４日に申請され、現在放棄された米国特許第０７／９６
０，０９３号、および米国特許第５，７０７，７９６号は共に「構造に基づく核
酸選択法」という標題であるが、ベントＤＮＡなどの特定の構造的特徴を持つ核
酸分子を選択するためにゲル電気泳動と組みあわせたＳＥＬＥＸ法の使用が記載
されている。１９９３年９月１７日に申請され現在放棄された、米国特許第０８
／１２３，９３５号「核酸リガンドの光選択」、米国特許第５，７６３，１７７
号および米国特許第６，００１，５７７号は共に「指数関数的濃縮による核酸リ
ガンドの系統的進化：核酸リガンドの光選択と溶液ＳＥＬＥＸ」においては標的
分子に対する結合、および／または光架橋、および／または標的分子の光不活性
化をおこなうことができる光反応性基を含有する核酸リガンドを選択するＳＥＬ
ＥＸ法に基づいた方法が記載されている。米国特許第５，５８０，７３７号「テ
オフィリンとカフェインとを識別する高親和性核酸リガンド」は密接に関連した
分子同士、これはペプチド性でなくてもよい、を見分けることのできる高特異性
核酸リガンドを同定する方法、カウンターＳＥＬＥＸ法と呼ばれている、が記載
されている。米国特許第５，５６７，５８８号「指数関数的濃縮によるリガンド
の系統的進化：溶液ＳＥＬＥＸ」は標的分子に高い親和性を持つオリゴヌクレオ
チドと低い親和性を持つオリゴヌクレオチドを効率的に分配するＳＥＬＥＸベー
スの方法を記載している。
【０００５】 ＳＥＬＥＸ法は、改善された生体内安定性、または改善されたデリバリ特性な
どの改善された特性をリガンドに与える修飾ヌクレオチドを持つ高親和性核酸リ
ガンドの同定を行う。このような修飾の例としてはリボース位置および／または
ホスフェート位置および／または塩基位置における化学的置換があげられる。修
飾ヌクレオチドを含有するＳＥＬＥＸ法同定核酸リガンドは米国特許第５，６６
０，９８５号「修飾ヌクレオチドを含有する高親和性核酸リガンド」に記載され
ているが、ここにはピリミジンの５-および２’-位で化学修飾されたヌクレオチ
ド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドが記載されている。上記米国特許第５，
５８０，７３７号では２’-アミノ（２’-ＮＨ2）、２’-フルオロ（２’-Ｆ）
、および／または２’-Ｏ-メチル（２’-ＯＭｅ）で修飾された一つ以上のヌク
レオチドを含有する高度に特異的な核酸リガンドが記載されている。１９９４年
６月２２日に申請された、米国特許出願第０８／２６４，０２９号「分子間求核
置換による既知および新規の２’-修飾ヌクレオシドの新規調製法」では様々な
２’-修飾ピリミジンを含有するオリゴヌクレオチドが記載されている。
【０００６】 ＳＥＬＥＸ法は、米国特許第５，６３７，４５９号「指数関数的濃縮によるリ
ガンドの系統的進化：キメラＳＥＬＥＸ」、米国特許第５，６８３，８６７号「
指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化：ブレンドＳＥＬＥＸ」にそれぞれ
記載されているように、選択されたオリゴヌクレオチドと他の選択されたオリゴ
ヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチド官能性単位とを組みあわせることを包
含する。これらの応用例によりオリゴヌクレオチドの広範囲に渡る形およびその
他の性質、ならびに効率的な増幅や再現性とその他の分子の所望の性質とを組み
あわせることができる。
【０００７】 ＳＥＬＥＸ法はさらに米国特許第６，００１，０２０号「核酸リガンド複合体
」中に記載されているように、選択された核酸リガンドと親油性化合物または非
免疫原性高分子量化合物とを結合し、診断または治療用複合体とすることも包含
する。基本的ＳＥＬＥＸプロセスの修正例を記載している上記の特許出願それぞ
れはここにその全体を参照として特に援用する。
【０００８】 標的に対する核酸リガンドを同定するための中心となる方法はＳＥＬＥＸ法と
よばれるもので、Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａ
ｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（指数関数的濃
縮によるリガンドの系統的進化）の頭文字を取ったものであり、（ａ）核酸の候
補混合物を標的と接触させ、（ｂ）前記候補混合物のメンバーを標的に対する親
和力に基づき分配し、そして（ｃ）選択された分子を増幅して標的に対する結合
に対し比較的高い親和力を持つ核酸配列に富む核酸混合物を得ることを包含する
。
【０００９】 ＳＥＬＥＸ工程の典型的な様態では、核酸リガンドの候補混合物はＲＮＡ分子
を含む。前述の分配工程（ｂ）に続き、標的に対して高い親和性を有するＲＮＡ
分子が逆転写されてＤＮＡテンプレートを形成する。このＤＮＡテンプレートが
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅され、増幅されたＤＮＡ分子がＳ
ＥＬＥＸ工程の次の回での新しいＲＮＡ候補混合物を提供するために転写される
。
【００１０】 ＲＮＡ核酸リガンド候補混合物を形成するＳＥＬＥＸ工程においてＤＮＡテン
プレートの転写は一般的に効果的であるが、修飾されたリボヌクレオチドを転写
時にＲＮＡ分子中に組み入れようとする場合に問題が発生する。そのような修飾
されたリボヌクレオチドは候補核酸リガンドの機能性および安定性を増加させる
が、多くの場合ＲＮＡポリメラーゼの基質とはなりにくい。結果として、そのよ
うな修飾されたリボヌクレオチドの存在下の転写は多くの場合非効果的であり、
低収量を招く、あるいは全く転写されない。例えば、２’-ＯＭｅ(２’酸素のメ
チル基)のように、２’-Ｏアルキル-リボヌクレオチド(２’酸素にアルキル基を
有するリボヌクレオチド)を候補ＲＮＡ核酸リガンドに組み入れることがたいて
いの場合望ましい。なぜならそのようなリボヌクレオチドはＲＮＡにすばらしい
安定性を与えるからである。しかしながら、それらの修飾されたリボヌクレオチ
ドはＲＮＡポリメラーゼの基質ではないので、２’-ＯＭｅリボヌクレオチドの
存在下では全く転写は起こらない。
【００１１】 典型的なＳＥＬＥＸ工程は、最高５つの異なる部分修飾されたヌクレオチドを
候補混合物(転写の延長フェーズ中で組み込まれる４ＮＴＰのそれぞれの一つ、
および、転写の開始で５’末端に組み込まれるＮＭＰあるいはＮＤＰの一つのヌ
クレオシド)に組み込むことを可能にする。５’修飾の例外をのぞいて、これら
の修飾は数と位置の双方に関し、転写物のランダム部分の至る所でランダムに分
配される。このランダム分配は不利益となり得、特に化学反応的修飾あるいは転
写物の溶解性あるいは安定性が低下させる修飾を導入する場合においては不都合
である。
【００１２】 本発明の目的は、２’-ＯＭｅリボヌクレオチドのように修飾されたリボヌク
レオチドが有効にＲＮＡ候補混合物に組み込まれるＳＥＬＥＸ工程を実施する方
法を提供する。本発明のさらなる目的は、修飾されたリボヌクレオチドが特異的
な位置に組み込まれるＳＥＬＥＸ工程を実施する方法を提供する。
【００１３】発明の概要 本発明は、標的化合物に対する核酸リガンドを得るためのＳＥＬＥＸ工程を実
施する新しい方法を提供する。特に、転写を必要とせずにＲＮＡからなる核酸リ
ガンドの候補混合物を得るための方法を提供する。転写のかわりに、候補ＲＮＡ
核酸リガンドを、少なくとも部分的にランダムなＤＮＡテンプレートに少なくと
も部分的にランダムなＲＮＡ断片をアニーリングすることによって調製する。ア
ニーリングされたＲＮＡ断片は、次に候補核酸リガンドを形成するために連結す
る。ＲＮＡ断片は完全に合成されたものでよく、そして、転写時にＲＮＡポリメ
ラーゼによってＲＮＡに組み込まれない修飾リボヌクレオチドサブユニットを含
み得る。その結果、本発明は、以前可能であったものより多くの異なる核酸化合
物でＳＥＬＥＸ工程を実施することを可能にする。
【００１４】発明の詳細な説明 定義 本発明の態様を述べるためにここでは様々な用語が使用されている。本発明の
構成要素の記載をより明確にするために、下記の定義を設ける。
【００１５】 ここで用いる「核酸リガンド」とは標的に対し所望の作用を行う天然には産出
しない核酸である。核酸リガンドはしばしば「アプタマー」と呼ばれている。望
ましい作用としては、これに限るわけではないが、標的の結合、標的を触媒的に
変化させること、標的、または標的の官能性を修飾／変更するようなやり方で標
的と反応すること、自己不活性化阻害剤で行われるように、標的に共有結合的に
結合すること、標的とその他の分子の間の反応を促進することなどがある。好ま
しい態様において、この作用は標的分子に対する特異的結合親和力であり、この
ような標的分子は、ワトソン／クリックの塩基対合または三重らせん結合に支配
されている機構を通じて核酸リガンドへ結合するポリヌクレオチド以外の三次元
化学構造を持つものであり、ここで核酸リガンドは標的分子によって結合される
既知の生理学的機能を持つ核酸ではない。核酸リガンドは核酸の候補混合物から
同定される核酸を含むが、かかる核酸リガンドは、ａ）候補混合物に較べ標的に
対して高い親和力を持つ核酸を候補混合物の残りから分配できるように候補混合
物を標的と接触させ、ｂ）候補混合物の残りから親和力の高い核酸を分配し、そ
してｃ）親和力の高い核酸を増幅し、リガンドに富む核酸混合物を得る、ことを
含有する方法によるある特定の標的のリガンドなのである。
【００１６】 ここで使用する「候補混合物」とは異なる配列を持つ核酸の混合物であり、そ
の中から所望のリガンドを選択するものである。候補混合物の原料は天然産出の
核酸であっても、またその断片であっても、あるいは化学的に合成された核酸で
あっても、酵素により合成された核酸であっても、また前述の技法を組みあわせ
て生産された核酸であってもよい。好ましい様態において、各核酸は増幅プロセ
スを容易にするためにランダム化した領域を取り囲む固定配列を持つ。本発明の
好ましい態様において、候補混合物はより小さなＲＮＡ断片から得られる合成Ｒ
ＮＡからなる。
【００１７】 「ＳＥＬＥＸ標的」または「標的」とはそのためにリガンドが必要である、対
象化合物または分子を指す。標的はタンパク質、ペプチド、炭水化物、多糖類、
グリコプロテイン、ホルモン、レセプター、抗原、抗体、ウイルス、基質、代謝
産物、遷移状態類似体、補助因子、阻害剤、薬物、染料、栄養素、成長因子など
であってよく、限定されない。
【００１８】 ここで使用する「核酸」とはＤＮＡでも、ＲＮＡでも、一本鎖でも、二本鎖
であってもよく、またはその化学的修飾物であってもよい。修飾としては、これ
に限るわけではないが、電荷、分極性、水素結合性、静電的相互作用、および流
動性を核酸リガンド塩基へまたは核酸リガンド全体に与える、別の化学基を提供
するものがあげられる。このような修飾には、これに限るわけではないが、２’
-位糖修飾、５-位ピリミジン修飾、８-位プリン修飾、環外アミン修飾、４-チオ
ウリジンの置換、５-ブロモまたは５-ヨード-ウラシルの置換、主鎖修飾、メチ
ル化、イソシチジン、イソグアニジンなどのイソ塩基など珍しい塩基対合の組み
合わせなどが含まれる。修飾にはキャッピングなどの３’および５’修飾もまた
含まれる。本発明において一つの好ましい態様は、リボヌクレオチドの２’酸素
のメチル基のポジショニング（ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ）である。
【００１９】 「ＳＥＬＥＸ」法には所望のやり方で標的と相互作用をする、例えばタンパク
に結合する、核酸リガンドの選択とこれらの選択した核酸の増幅とが組みあわさ
れて含有される。この選択／増幅工程は反復サイクリングを行ってもよく、きわ
めて多数の核酸を含有するプールから標的と最も強力に相互作用する一つまたは
小数の核酸を選択することができる。選択／増幅工程の循環は選択されたゴール
が達成されるまで続けられる。ＳＥＬＥＸ法は現在放棄された、米国特許第０７
／５３６，４２８号「指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化」、米国特許
第５，４７５，０９６号「核酸リガンド」、および米国特許第５，２７０，１６
３号（Ｗ０９１／１９８１３も参照のこと）「核酸リガンド同定法」に記載され
ている。これらの特許および特許出願は、それぞれここに参照として援用してい
るが、まとめてＳＥＬＥＸ特許出願と呼ぶ。
【００２０】 もっとも基本的な形のＳＥＬＥＸは下記の一連のステップにより定義すること
ができる。 １）さまざまな配列をもつ核酸の候補混合物を調製する。候補混合物には一般に
固定配列（つまり候補混合物のメンバーそれぞれは同じ位置に同じ配列を含有す
る）とランダム化した配列の領域が含まれる。固定配列の領域は（ａ）下記に記
載の増幅工程において役立つ、（ｂ）標的に結合することがわかっている配列を
模倣する、あるいは（ｃ）候補混合物の核酸中のある構造配列の濃度を高めるた
めに、選択される。ランダム化配列は全面的にランダム化（例えばある塩基をあ
る位置に見いだす確立は四分の一である）または部分的にランダム化（例えばあ
る塩基をある位置に見いだす確立は０パーセントから１００パーセントまでの間
のいずれかである）することができる。 ２）候補混合物は標的と候補混合物のメンバー間の結合に好ましい条件の下で選
択された標的と接触させる。これらの状況のもとでは標的と候補混合物の核酸の
間の相互作用により、標的に対して最も親和力の強い核酸と標的との間に核酸-
標的ペアが形成されると考えられる。 ３）標的に対して最も親和力の高い核酸と標的に対する親和力がより低い核酸と
を分配する。この候補混合物中に存在するうちで最も親和力の高い核酸に相当す
るのはきわめて少数の配列のみ（そしておそらく核酸一分子のみ）であるので、
分配を通じて維持される、候補混合物中の核酸量がかなりの量（約５-５０％）
となるように、分配基準を設定することが一般的に望ましい。 ４）標的に対する親和力が比較的高いとして分配で選択された核酸をついで増幅
し、標的に対する親和力が相対的により高められた核酸に富む新しい候補混合物
を作り出す。 ５）上記の分配および増幅工程を繰り返すことにより、新しく形成された候補混
合物は、より少ない非反復配列を含有し、標的に対する核酸の平均親和度は一般
に増加する。極端な場合、ＳＥＬＥＸ法は当初の候補混合物から標的分子に対し
最も高い親和力を持つ核酸を表す、一つまたは小数の非反復配列を含有する候補
混合物を作り出すであろう。
【００２１】 この基本的ＳＥＬＥＸ法は多数の特定の目的物を作り出すために修正されてき
た。例えば１９９２年、１０月１４日に出願され、現在放棄された米国特許第０
７／９６０，０９３号、米国特許第５，７０７，７９６号、これらは共に「構造
に基づき核酸を選択する方法」と言う標題を持つが、においてはベントＤＮＡな
ど、特定の構造的特徴を持つ核酸分子を選択するために、ゲル電気泳動法を組み
あわせたＳＥＬＥＸ法の使用について記載している。１９９３年９月１７日に出
願され、現在放棄された米国特許第０８／１２３，９３５号「核酸リガンドの光
選択」、米国特許第５，７６３，１７７号および米国特許第６，００１，５５７
号、共に「指数関数的濃縮による核酸リガンドの系統的進化：核酸リガンドの光
選択と溶液ＳＥＬＥＸ」という標題であるが、これらは標的分子に結合および／
または光架橋および／または光不活性化する能力のある光反応性基を含有する核
酸リガンド選択のためのＳＥＬＥＸに基づく方法を記載している。米国特許第５
，５８０，７３７号「テオリフィンおよびカフェインを見分ける高親和性核酸リ
ガンド」は密接に関連している分子間を見分けることのできる高度に特異的な核
酸リガンドを同定するための方法、カウンターＳＥＬＥＸと呼ばれる、を記載し
ている。米国特許第５，５６７，５８８号「指数関数的濃縮によるリガンドの系
統的進化：溶液ＳＥＬＥＸ」は、標的分子に対し親和性の高いオリゴヌクレオチ
ドと親和性の低いオリゴヌクレオチドとを効率的に分配することができるＳＥＬ
ＥＸ法に基づく方法を記載している。米国特許第５，４９６，９３８号「ＨＩＶ
-ＲＴおよびＨＩＶ-１ ｒｅｖに対する核酸リガンド」はＳＥＬＥＸ法を行った
後で改良核酸リガンドを得る方法を記載している。米国特許第５，７０５，３３
７号「指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化：Ｃｈｅｍｉ-ＳＥＬＥＸ」
はリガンドをその標的へ共有結合で結びつける方法を記載している。
【００２２】 ＳＥＬＥＸ法はリガンドに、改善された生体内安定性、または改善されたデリ
バリ特性などの改善された特性を与える修飾ヌクレオチドを持つ高親和性核酸リ
ガンドの同定を行う。このような修飾の例としてはリボースおよび／またはリン
酸基および／または塩基における化学的置換があげられる。修飾ヌクレオチドを
含有するＳＥＬＥＸ法同定核酸リガンドは米国特許第５，６６０，９８５号「修
飾ヌクレオチドを含有する高親和性核酸リガンド」に記載されているが、ここに
はピリミジンの５-および２’-位で化学修飾されたヌクレオチド誘導体を含有す
るオリゴヌクレオチドが記載されている。上記米国特許第５，６３７，４５９号
では２’-アミノ（２’-ＮＨ2）、２’-フルオロ（２’-Ｆ）、および／または
２’-Ｏ-メチル（２’-ＯＭｅ）で修飾された一つ以上のヌクレオチドを含有す
る高度に特異的な核酸リガンドが記載されている。１９９４年６月２２日に出願
された米国特許第０８／２６４，０２９号「分子間求核置換による既知および新
規の２’修飾ヌクレオシドの新規調製法」では様々な２’-修飾ピリミジンを含
有するオリゴヌクレオチドが記載されている。
【００２３】 ＳＥＬＥＸ法は、米国特許第５，６３７，４５９号「指数関数的濃縮によるリ
ガンドの系統的進化：キメラＳＥＬＥＸ」、米国特許第５，６８３，８６７号「
指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化：ブレンドＳＥＬＥＸ」にそれぞれ
記載されているように、選択されたオリゴヌクレオチドと他の選択されたオリゴ
ヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチド官能性単位とを組みあわせることを含
有する。これら応用例によりオリゴヌクレオチドの広範囲に渡る形およびその他
の性質、ならびに効率的な増幅および再現性とその他の分子の持つ所望の性質と
を組みあわせることができる。
【００２４】 米国特許第５，４９６，９３８号はＳＥＬＥＸ法を行った後に改良核酸リガン
ドを得る方法を記載している。この「ＨＩＶ-ＲＴおよびＨＩＶ-１ ｒｅｖに対
する核酸リガンド」という標題の特許は、ここに参照として特に援用する。
【００２５】 ＳＥＬＥＸ法はそれぞれ非反復配列を持ち、所望の標的化合物または分子に特
異的に結合する性質を持つ核酸分子である１クラスの生成物を提供する。標的分
子は好ましくはタンパク質であるが、その他にも炭水化物、ペプチドグリカン類
、およびさまざまな小分子であってもよい。ＳＥＬＥＸ法はまた細胞表面やウイ
ルスなどの標的となる生物学的構造体に対して、その生物学的構造体と一体とな
っている分子との特異的相互作用を通じて用いることもできる。
【００２６】 核酸を診断に使用する上で直面する潜在的な問題として、所望の効果が発現す
るまえに、ホスホジエステル形のオリゴヌクレオチドが体液中ではエンドヌクレ
アーゼやエキソヌクレアーゼなどの細胞内、細胞外の酵素により、速やかに分解
されてしまう恐れのあることである。この核酸リガンドの生体内安定性を増加す
るため、あるいは核酸リガンドのデリバリを強化、または媒介するために核酸リ
ガンドのある種の化学修飾を行うことができる。例えば１９９３年９月９日に申
請され、現在放棄された米国特許第０８／１１７，９９１号、および米国特許第
５，６６０，９８５号、標題はともに「修飾されたヌクレオチドを含有する高親
和性核酸リガンド」であり、ここに参照として特に援用する、を参照されたい。
本発明において考えられている核酸リガンドの修飾は、これに限るわけではない
が、核酸リガンド塩基あるいは核酸リガンド全体にさらに電荷、分極性、疎水性
、水素結合、静電的相互作用、および流動性を与える他の化学基を提供するもの
が含まれる。このような修飾には、これに限るわけではないが、２’-位糖修飾
、５-位ピリミジン修飾、８-位プリン修飾、環外アミン修飾、４-チオウリジン
の置換、５-ブロモまたは５-ヨード-ウラシルの置換、主鎖修飾、ホスホロチオ
エートまたはアルキルホスフェート修飾、メチル化、ホスホン酸メチル（methyl
phosphonates）、ホスホン酸（H phosphonates）、ペプチド修飾、イソシチジ
ンとイソグアニジンなどのような異常な塩基対の組み合わせを含む。修飾は、キ
ャッピング、３’または５’硫黄、３’または５’アミンのような３’および５
’修飾をも含む。修飾された核酸が相補的な配列と二重らせんを形成できるいず
れの核酸が、本発明で考慮される。
【００２７】 修飾はＳＥＬＥＸプロセス前の修飾であってもＳＥＬＥＸプロセス後の修飾で
あってもよい。ＳＥＬＥＸプロセス前の修飾はＳＥＬＥＸ標的に対する特異性と
生体内安定性の改善の両方を核酸リガンドに対して行う。２’-ＯＨ核酸リガン
ドに対してＳＥＬＥＸプロセス後の修飾を行うと核酸リガンドの結合能力に悪影
響を及ぼすことなく生体内安定性が向上する。本発明は、候補混合物中で修飾さ
れた核酸を使用したＳＥＬＥＸ法を行う方法を提供する。
【００２８】 その他の修飾は当業者に公知である。このような修飾はＳＥＬＥＸプロセス後
に行ってもよく（予め同定された未修飾リガンドの修飾）あるいはＳＥＬＥＸ法
中に含めて行っても良い。
【００２９】 幾つかの実施様態において、核酸リガンドを選択された波長を持つ光で照射す
ると核酸リガンドはその標的に共有結合で結合する。このような核酸リガンドを
得る方法は、１９９３年９月１７日に申請され、現在放棄された米国特許第０８
／１２３，９３５号「核酸リガンドの光選択」、および米国特許第５，７６３，
１７７号および米国特許第６，００１，５５７号、共に「指数関数的濃縮による
リガンドの系統的進化：核酸リガンドの光選択と溶液ＳＥＬＥＸ」という標題で
あるが、に記載されており、これらはそれぞれここにその全体を参照として特に
援用する。
【００３０】 ここで使用している"合成ＲＮＡ"とは、インビトロで酵素の使用なしに作られ
たリボヌクレオチドポリマーを意味する。リボヌクレオチドポリマー合成に関す
る先行技術として知られたあらゆる化学的システムは、固相および液相の化学反
応を含め考慮される。
【００３１】 ここで使用している"ライブラリー"とは、あらかじめ決められた位置で互いに
配列の異なる集団の個々のメンバーが一定の長さを有する核酸分子の集団を意味
する。個々のライブラリーは、ライブラリーのすべてのメンバーが特定の位置で
同じ塩基を有する一つあるいはそれ以上の固定配列領域およびランダム領域を有
する。ランダム領域は部分的あるいは完全にランダムでありうる。本発明の好ま
しい態様は３つのライブラリーを用いる：個々の核酸分子が３’固定領域に隣接
する５’ランダム領域を有する最初のライブラリー：個々の核酸分子が３’ラン
ダム領域に隣接する５’固定領域を有する２番目のライブラリー;および個々の
核酸分子がそれらの長さを通してランダムである３つめのライブラリー。
【００３２】 ここで使われる“断片”とは、ライブラリーから得られた個々の核酸分子を意
味する。断片は個々の核酸リガンドよりも典型的に短い。
【００３３】転写フリーＳＥＬＥＸ ＳＥＬＥＸ工程のある態様では、核酸リガンドの候補混合物はＲＮＡ分子を含
む。そのような態様においてＳＥＬＥＸ工程は以下の工程： （ａ）固定３’および５’配列およびランダム内部配列を含むＤＮＡテンプレー
トライブラリーを提供する工程； （ｂ）前記固定配列の一つから前記ＤＮＡテンプレートライブラリーを転写し、
ＲＮＡ核酸リガンドの候補混合物を形成させる工程； （ｃ）ＲＮＡ核酸リガンドの前記候補混合物を前記ＤＮＡテンプレートライブラ
リーから精製し、ＲＮＡ核酸リガンドの前記候補混合物を標的と接触させる工程
； （ｄ）望ましい様式で標的と作用するＲＮＡ核酸リガンドを、作用しないものか
ら分配する工程； （ｅ）望ましい様式で標的と相互作用するそれらのＲＮＡ核酸リガンド逆転写し
てＤＮＡテンプレートを形成する工程； （ｆ）前記固定３’および５’配列とハイブリダイズするプライマー存在下ポリ
メラーゼ連鎖反応を使用して前記ＤＮＡテンプレートを増幅させる工程；および
必要により； （ｇ）所望の回数（ｂ）〜（ｆ）工程を繰り返す を含む。
【００３４】 本発明は、工程（ｂ）で転写が起こること、および選択的に工程（ｅ）で逆転
写が起こることを必要としない上述のＳＥＬＥＸ工程を完成した。本発明は工程
（ｂ）のＤＮＡテンプレート上で相補的ＲＮＡ分子を直接的に調製するため、代
わりに、合成ＲＮＡ分子の一つあるいはそれ以上のランダムライブラリーを使用
する。工程（ｂ）のＤＮＡテンプレートと接触させ、ランダム合成ＲＮＡ分子を
テンプレートにアニーリングする。個々のＲＮＡ断片は互いに連結することがで
き、得られたＲＮＡ分子を前述したように、核酸リガンドの候補混合物として使
用するために精製する。次に、核酸リガンドの候補混合物は、ＲＮＡ分子にアニ
ーリングし、互いに連結させるＤＮＡ断片を用いてＤＮＡを構築するためのテン
プレートとなる。得られたＤＮＡはＰＣＲにより増幅でき、ＳＥＬＥＸ法の次の
ラウンドのＤＮＡテンプレートとなる。このように転写を必要とせずにＤＮＡテ
ンプレートからＲＮＡ核酸リガンドの候補混合物を生成することが可能であり、
選択的に逆転写を必要とせずにＲＮＡ核酸リガンドからＤＮＡテンプレートを生
成することが可能である。この方法を転写フリーＳＥＬＥＸと呼ぶ。
【００３５】 転写フリーＳＥＬＥＸ法の一つの態様においては、以下の工程を行う（図１）
: （ａ）固定３’および５’配列領域およびランダム内部配列を含むＤＮＡライブ
ラリーを提供する工程； （ｂ）前記ＤＮＡライブラリーをランダムＲＮＡ断片を含む一つまたはそれ以上
の合成ライブラリーと接触させる工程、ここで前記断片は前記ＤＮＡライブラリ
ーにアニーリングされ、前記ＤＮＡライブラリーの個々のメンバーに相補的で本
質的に連続したＲＮＡ分子を形成し； （ｃ）前記ＲＮＡ断片を一緒に連結しＲＮＡ核酸リガンドの候補混合物を形成さ
せる工程； （ｄ）ＲＮＡ核酸リガンドの前記候補混合物を前記ＤＮＡライブラリーから精製
し、ＲＮＡ核酸リガンドの前記候補混合物を標的と接触させる工程； （ｅ）望ましい様式で標的と作用するＲＮＡ核酸リガンドを、作用しないものか
ら分配する工程； （ｆ）望ましい様式で標的と相互作用するそれらのＲＮＡ核酸リガンド逆転写し
てＤＮＡテンプレートを形成する工程； （ｇ）前記固定３’および５’配列領域とハイブリダイズするプライマー存在下
でのポリメラーゼ連鎖反応を使用してそれらＤＮＡテンプレートを増幅させる工
程；および必要により （ｈ）所望の回数（ｂ）〜（ｇ）工程を繰り返す。 工程を含む、前記方法。
【００３６】 ＲＮＡ核酸リガンドの候補混合物を集めるのに転写よりも合成ＲＮＡ断片を使
うことの主な利点は、修飾されたリボヌクレオチドがより容易に核酸リガンドに
組み込まれうることである。そのような修飾されたリボヌクレオチドはしばしば
ＲＮＡポリメラーゼの基質とはなりにくく、転写物が殆どあるいは全く得られな
い。例えば、ある態様においては２’-ＯＭｅであるＲＮＡ核酸リガンドを使う
ことが望ましい。２’-ＯＭｅリボヌクレオチドはＲＮＡ核酸リガンドにリボヌ
クレアーゼに対する安定性を付与する。しかしながら、ＲＮＡポリメラーゼは２
’-ＯＭｅリボヌクレオチドをＲＮＡに組み入れず、ＲＮＡは生成されない。対
照的に、転写フリーＳＥＬＥＸ法では、ＲＮＡ断片は先行技術で知られたあらゆ
る技術によって２’-ＯＭｅリボヌクレオチドとともに化学的に合成されたもの
であってもよい。２’-ＯＭｅＲＮＡ断片を互いに連結することにより、ＲＮＡ
核酸リガンドの２’-ＯＭｅ候補混合物は転写によらず効果的に生成される。転
写フリーＳＥＬＥＸ法は、求核試薬、ＲＧＤペプチド、ケージ、およびＰＥＧ基
(以下を参照せよ)を非制限的に含む限定された部位で機能的な活性を含むことを
可能にするであろう。
【００３７】 本発明の好ましい様態は、ランダム化および部分ランダム合成ＲＮＡ断片のラ
イブラリーを使用する。部分ランダムＲＮＡ断片はランダム配列領域および固定
配列領域を含み、固定配列領域はＤＮＡテンプレートの固定配列領域に相補的な
配列である。そうして、部分ランダム断片はＤＮＡテンプレートの固定領域、お
よびＤＮＡテンプレートに隣接するランダム配列領域にアニーリングされる。固
定配列領域は迅速にアニーリングされ、（各ランダム配列に対して高濃度である
ので）完全にランダムなＲＮＡ分子をアニーリングするための“レジスター”（
ｒｅｇｉｓｔｅｒ）がなされる。これは正確なサイズの生成物を与え、位置特異
的にとっては必要である(以下参照)。ＤＮＡテンプレートの長さに沿ってアニー
リングした個々のランダムおよび部分ランダムＲＮＡ分子は、互いに連結されて
ＤＮＡテンプレートの配列と相補的な連続したＲＮＡ鎖を形成する。
【００３８】 本発明の好ましい態様において、少なくとも３つの別のＲＮＡライブラリーを
用いる。それらのライブラリーの概念図を図２に示す。第１のライブラリーはラ
ンダム配列である３’領域のＹヌクレオチドの長さ、およびＤＮＡテンプレート
の３’固定配列領域に相補的な固定配列である５’領域のＸヌクレオチドの長さ
を有し、；第２のライブラリーはランダム配列である５’領域のＡヌクレオチド
の長さ、およびＤＮＡテンプレートの固定５’領域に相補的な固定配列である３
’領域のＢヌクレオチドの長さを有し；第３のライブラリーはランダム配列のＺ
ヌクレオチドである。３つのライブラリーのランダム部分の合計の長さはＤＮＡ
テンプレートのランダム部分の長さに等しい（Ｙ＋Ａ＋Ｚ＝ＤＮＡテンプレート
ランダム領域）。第１および第２のライブラリーのそれぞれのＲＮＡ分子の合計
の長さは、第３のライブラリーにおけるそれぞれの分子の長さよりも長い（Ｘ＋
Ｙ＞Ｚ；Ａ＋Ｂ＞Ｚ）;第１および第２のライブラリーのランダム部分は、第３
の集団の完全にランダムな分子よりも短い（Ｙ＜Ｚ；Ａ＜Ｚ）。好ましくは、Ｙ
＞ＸおよびＡ＞Ｂ。図２に示すようにそれらの配列はＤＮＡテンプレートにアニ
ーリングされる。
【００３９】 ＤＮＡテンプレートと同じ大きさのランダムなＲＮＡ分子を使うのではなく、
複数のランダムなＲＮＡ断片を使うことによって、ＤＮＡテンプレートの全体の
長さでのハイブリダイゼーションに要する時間は劇的に短くなる。例えば、３０
ｍｅｒＲＮＡ分子のランダムライブラリーが３０ｍｅｒのＤＮＡテンプレートに
アニーリングするには、およそ１０4年を要するが、短いＲＮＡ断片の３つのラ
ンダムライブラリーを用いると完了までに１〜２時間しか要しない。さらに、Ｄ
ＮＡテンプレートの固定配列に相補的な領域を第１および第２集団に付与するこ
とにより、それらのＲＮＡ断片は適切な位置に保たれる。第１および第２ライブ
ラリーのランダム部分は第三ライブラリーよりも短いので（Ｙ＜Ｚ；Ａ＜Ｚ）、
ＤＮＡテンプレートに第三ライブラリーをアニーリングするにおいて、固定領域
をもアニーリングすることなしにＤＮＡテンプレートのランダム領域に第１およ
び第２ライブラリーがアニーリングするはないであろう。同様に、第１および第
２ライブラリーＲＮＡ断片は、第３集団ＲＮＡ断片より長いので、正しくアニー
リングされた第１および第２ライブラリーＲＮＡ断片が、同じ配列に偶然ハイブ
リダイズする第３ライブラリー分子によって置き換わることはないであろう。こ
のように、３つのライブラリーのランダムおよび固定配列領域の相対的な長さは
、図２に示すＤＮＡテンプレートへの３つのＲＮＡ断片のアニーリングは、最も
熱力学的に安定な配列で起こることを確かにする。
【００４０】 上述した態様は３つの集団を使用するが、あらゆる数のＲＮＡ断片を使用しう
る。確かに、ある応用例ではかなりの数を使うことが望ましい。例えば、あるＳ
ＥＬＥＸ反応では一つの優位な配列がライブラリーの１０％まで含んでもよいこ
とが知られている。仮に第３の集団のＲＮＡ断片(完全にランダム)が、例えば１
１ヌクレオチドの長さであり、ＤＮＡテンプレートに対しそれらのＲＮＡ断片の
５倍過剰に存在すると、ＲＮＡ断片の１／４11＝１／（４×１０6）のみが優位
な配列にアニーリングする正確な配列を有する。これは優位な配列が後のＳＥＬ
ＥＸラウンドであまり増幅されないことを意味する。５倍よりもかなり多く存在
し、１１ヌクレオチドより短いＲＮＡ断片を用いると、優位な配列のより効果的
な増幅が可能となる。
【００４１】 特定の転写フリーＳＥＬＥＸの応用例において、最大限の効果を得るために容
易に調整されうる多くの変化があるということは、前述の記載から理解できるで
あろう。そのような変化を利用できることは転写フリーＳＥＬＥＸ法に高度な柔
軟性を与える。利用可能な変化は非制限的に：ランダムおよび部分ランダムＲＮ
Ａ断片の集団の数;それぞれの集団の個々のＲＮＡ分子の長さ;それぞれの集団に
おけるＲＮＡ分子の濃度;部分ランダムＲＮＡ断片集団における固定配列領域の
長さ;およびハイブリダイゼーションを行う時間と温度を含む。それらの変化を
決めるには、当業者のルーチン実験のみが要求される。
【００４２】 転写フリーＳＥＬＥＸ法は核酸リガンドの候補混合物に組み込まれる修飾ヌク
レオチドの数および位置を調整する方法を提供する。図２に示す例に従い構築さ
れたＲＮＡ核酸リガンドについて考える。ライブラリーＲＮＡ断片のそれぞれは
別に合成された生成物であり、ＤＮＡテンプレート上の特定の位置を占める。例
えば、ＤＮＡテンプレートの５’末端にアニーリングするＲＮＡ断片におけるす
べてのウリジンは第一の様式で修飾され（例えば、２’ＯＭｅ）、中央のＲＮＡ
断片のすべてのウリジンは第二の様式で修飾され(例えば、ＢｒｄＵ)、およびＤ
ＮＡテンプレートの３’末端にアニーリングするＲＮＤ断片のすべてのウリジン
は第三の様式で修飾される(例えば、５-アミノ-ベンゾイル)と指定することが可
能である。この方法は、ＲＮＡ断片のそれぞれのライブラリーにおけるすべての
４つのヌクレオチドに用いることができる。
【００４３】 この概念は個々のヌクレオチドのレベルに拡張することができ、シンセサイザ
ーの利用可能なポートの数によってのみ実施が制限される。つまり、あるＲＮＡ
断片の位置１のウリジンが修飾１、位置２のウリジンが修飾２などと指定するこ
とができる。それゆえライブラリーに組み込まれる異なる修飾の数は、オリゴラ
イブラリーを合成する能力によってのみ制限される。本発明は、修飾された核酸
が相補的核酸配列と二重らせんを形成できる、あらゆる核酸化合物の使用を意図
したものである。
【００４４】 本発明の好ましい態様において、アニーリングした後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを
反応混合物に加えることによって個々のＲＮＡ断片を連結する。アニーリング工
程の最終段階でリガーゼを加えることが好ましく、さもなくば動力学的中間生成
物(不完全に、および不適切にアニーリングしたＲＮＡ断片)が互いに連結されて
しまう。
【００４５】 意図した修飾リボヌクレオチドのいくつかはリガーゼの基質になりにくく；そ
のような修飾リボヌクレオチドを含むＲＮＡ断片は、それゆえ低効率でしか連結
されないであろう。そういった場合においては、その特定のリボヌクレオチド修
飾が、ＲＮＡリガーゼ作用を必要とするＲＮＡ断片の重要な部分には存在しない
ように合成ＲＮＡ分子をデザインすることができる。別の様態においては、ライ
ゲーションはリガーゼを使用しなくても化学的に行える。化学的ライゲーション
の多様性は化学文献に記述されており、Dolinnaya, N. G., N. I. Sokolova et
al. (1988) Nucleic Acids Research 16(9):3721-38に記載されているカルボ
ジイミド縮合；Dolinnaya, N. G., N. I. Sokolova et al (1991) Nucleic Acid
s Research 19(1l):3067-72に記載されている臭化シアン縮合、およびXu and Ko
ol (1999) Nucleic Acids Research 27(3):875-81.に記載されているハロゲン化
硫黄求核置換を含む。前述した参考文献のそれぞれをそのまま参照としてここに
援用する。反応の正確さ、および得られる生成物の活性は、Housby and Souther
n(1998)NAR 26:4259-4266；James, K. D., A. R. Boles et al.(1998) Nucleic
Acids Research 26(22):5203-5211；James and Ellington(1997)Chem. Biol. 4( 8) :595-605;および Shabarova, Z. A., 1. N. Merenkova et al.(1991) Nucleic
Acids Research 19（15）4247-51に示されており、これらのそれぞれをそのま
ま参照としてここに援用する。
【００４６】 上述した態様において、ライゲーションにより構築した合成ＲＮＡ候補混合物
は、逆転写のためのテンプレートとして提供することが可能なはずである。２’
-ＯＭｅのように、ある修飾リボヌクレオチドは、逆転写酵素のテンプレートと
なるが、別の有益な修飾リボヌクレオチドはテンプレートとならない。これは、
候補ＲＮＡ混合物に組み込まれることができる修飾リボヌクレオチドのアイデン
ティティー(identity)をある程度制限するかもしれない。しかしながら、本発明
は逆転写がＰＣＲに必要なＤＮＡテンプレートを提供するために使用されない態
様も意図している。これらの態様において、ＰＣＲのためのＤＮＡテンプレート
は、分配されたＲＮＡ候補混合物分子（望ましい様式で標的と作用したそれらの
ＲＮＡ分子）上に、ＲＮＡ候補混合物分子それ自体が構築されるのと同じ方法で
構築される。つまり、分配されたＲＮＡ候補混合物をランダムおよび部分ランダ
ムＤＮＡ断片を含むライブラリーと接触させ、それらのＤＮＡ断片をＲＮＡテン
プレートにアニーリングし、次にＤＮＡ断片を連結し、連結断片をＰＣＲ増幅さ
せることによって構築される。上述したように、ＤＮＡ断片のライゲーションは
ＤＮＡリガーゼを用いずに化学的に実施することができる。ＤＮＡテンプレート
を逆転写酵素を用いず構築することによって、ＳＥＬＥＸで使用できる修飾塩基
の種類をさらに広げることが可能である。ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素
では反応しない修飾塩基もこの方法を用いて候補混合物に組み込むことができる
。この方法は、候補混合物を構成する核酸の構造、化学的性質、機能の多様性を
さらに増加させることによりＳＥＬＥＸ技術の有用性を非常に高めるであろう。
【００４７】 上記で説明した態様は、一本鎖ＲＮＡ分子を含む核酸リガンドの候補混合物の
利用を意図している。しかしながら、ここで述べた方法が二本鎖ＲＮＡ、一本鎖
ＮＤＡおよび二本鎖ＤＮＡを含む候補混合物に容易に応用できることは当業者に
は明確であろう。
【００４８】 転写フリーＳＥＬＥＸ法は典型的なＳＥＬＥＸ法に勝る多くの利点を有する。
例えば、転写フリーＳＥＬＥＸは典型的なＳＥＬＥＸ法よりも小さな核酸リガン
ドを生成することができる。これは２つの要因：（１）基本のヌクレオチドと比
較して修飾されたヌクレオチドの増加した化学的活性;および（２）骨格のチャ
ージ斥力の減少にかかわらず、より小さい構造モチーフの安定性の増加、による
。これらについては順に論議していく。
【００４９】 現在の典型的なヌクレオチドは、強い求核的あるいは求電子中心を提供せず、
中性のｐＨ環境下において酸-塩基遷移も与えない。この反応性の欠如は、サイ
ズによっていくらか補うことができる：多くの弱い相互作用が総和して一つの強
い相互作用に置き換わることが可能となる。具体的に述べたそれらの多くの弱い
相互作用を特定する配列はまれにしか選択されず、かつ選択されにくく、それら
が選択されても結果として大きな、合成しにくい配列になるので、核酸リガンド
にとっては不都合である。反応性に富んだしたヌクレオチドを含む修飾断片ライ
ブラリーは、多くの弱い相互作用を一つの強い相互作用に置換することによって
、より小さい核酸リガンドを獲得する。例えば、正電荷は一つの修飾ヌクレオチ
ドによって提供されうる；これは同等のチャージを与える金属結合ポケットを形
成するはずの典型的な核酸リガンドとして、幾つかの典型的なヌクレオチドを置
き換えることができる。
【００５０】 核酸リガンドの長さを短くできる、化学的に合成された断片ライブラリーを使
った転写フリーＳＥＬＥＸによる二番目の方法は、静電的斥力の減少によるもの
である。通常のホスホジエステル核酸は、１残基当たり１つの正味負荷電を含む
。リン酸塩基間の斥力は、通常の二重らせんにおいてさえ相当なものであり、そ
れを補うためには多くの水素結合およびスタッキング相互作用を必要とし、そし
て安定した構造を形成することができる。この負荷電を排除する骨格の修飾によ
り、より安定なへリックスを形成する。例えば、ＤＮＡ-ＰＮＡ（ペプチド核酸
）へリックスは相当するＤＮＡ-ＤＮＡへリックスよりも３０％以上安定である
、というGiesenおよびKleider(1998)Nucleic Acids Research 26:5004を参照と
してそのままここに援用する。それゆえ荷電されていない残基を組み込んだ修飾
断片ライブラリーは、通常の核酸ライブラリー構造よりもより安定なへリックス
および他の構造的モチーフを有すると期待できる。この増加した安定性により、
より小さな構造的モチーフ、および通常のＳＥＬＥＸ法から得られる相当する物
質より小さい核酸リガンドが得られる。
【００５１】 核酸リガンド、および実際はすべてのオリゴヌクレオチド剤を商品化する際の
制限要因の一つは価格である。価格を最小限度に抑えるために候補オリゴヌクレ
オチド剤のサイズを最小にすることに相当の努力が注がれる。転写フリーＳＥＬ
ＥＸ法は従来のＳＥＬＥＸ法に比べより小さな核酸リガンドを生成することがで
きるので、本発明の方法は、より価格競争力のある核酸リガンドの開発を顕著に
促進するはずである。
【００５２】実施例 以下の実施例は単に本発明の様々な態様を示す目的で述べたものである。これ
らの実施例はいかなる意味においても発明の範囲を制限するものと解釈すべきで
はない。
【００５３】実施例１． ＤＮＡテンプレートへのランダム１１-ｍｅｒＲＮＡのアニーリン
グ 図３は、５’および３’固定配列領域、および内部に２９ヌクレオチドランダ
ム配列領域を含む典型的なＳＥＬＥＸ ＤＮＡテンプレートライブラリーを示す
。それから、ＲＮＡの３つのライブラリーが合成される：
【００５４】 １.（５＋９）ｎｔ：このライブラリーにあるそれぞれのＲＮＡ分子は、ＤＮ
Ａテンプレートの３’固定配列領域に相補的な５’５ヌクレオチド固定配列を含
む；５ヌクレオチド固定領域の３’側に接して、それぞれの分子は９ヌクレオチ
ドランダム配列を有する。（５＋９）ｎｔ ＲＮＡライブラリーにおける個々の
分子の５’末端は水酸基（ＯＨ）を持つ。
【００５５】 ２．（９＋５）ｎｔ：このライブラリーにあるそれぞれのＲＮＡ分子は、ＤＮ
Ａテンプレートの５’固定配列領域に相補的な３’５ヌクレオチド固定配列を含
む; ５ヌクレオチド固定領域の５’側に接して、それぞれの分子は９ヌクレオチ
ドランダム配列を有する。（９＋５）ｎｔ ＲＮＡライブラリーにおける個々の
分子の５’末端はリン酸基（Ｐ）を持つ。
【００５６】 ３．１１ｎｔ：これはランダム１１ヌクレオチドＲＮＡ配列を含む；１１ｎｔ
ＲＮＡライブラリーの個々の分子の５’末端はリン酸基（Ｐ）を持つ。
【００５７】 こうして、平衡状態で、１１ｎｔライブラリーからの１１ｎｔＲＮＡ分子およ
び、（５＋９）および（９＋５）ｎｔライブラリーからの９ｎｔ配列は、それぞ
れのＤＮＡテンプレート分子の２９ｎｔ領域を完全にカバーするだろう。
【００５８】実施例２. ＲＮＡ候補混合物を集めるためのＲＮＡライブラリーの使用
【００５９】 実施例１のライブラリーでのアニーリング比率は次のように計算され： ランダム１１-ｍｅｒにおける配列の数:４11＝４×１０6 アニーリング比率：１×１０7Ｍ-1ｓ-1(０.１ｍＭ ＣＴＡＢ、６５℃にて) ＤＮＡテンプレートの濃度：１ｎｍｏｌnmol/５０μＬ＝２×１０-5Ｍ １１ｍｅｒライブラリーの濃度：５ｎｍｏｌ/５０μＬ＝１×１０-4Ｍ ランダム１１ｍｅｒバイブリダイズでの比率：１×１０7Ｍ1ｓ-1×１×１０-4Ｍ
/４×１０6＝３×１０-4ｓ-1。この比率において、アニーリング反応は１〜２時
間で完了する。
【００６０】 ＲＮＡライブラリーは過剰量であるので、それらの濃度では反応を推し進める
。問題となる数は、総濃度をその配列多様性で割ったそれぞれの配列の濃度であ
る。９ｍｅｒは１６倍の高濃縮で存在し、より迅速にアニーリングする。これは
１１ｍｅｒを適切な位置に配置させる。不適切なアニーリングは起こりうるが（
適切なアニーリングよりも不適切なアニーリングを起こす場合が多い）、適切な
位置でのアニーリングは塩基対の数および断片を最大にし、最も好ましい配列に
なる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は転写フリーＳＥＬＥＸ工程の一つの態様の概念図を示す。 ラ
ンダム（Ｒ）および固定（Ｆ）配列領域を含むＤＮＡテンプレートライブラリー
を、ランダム領域およびＤＮＡテンプレートの固定領域に相補的な固定領域を含
むＲＮＡ断片の３つのライブラリーと接触させる。正確なアニーリング後、ＲＮ
Ａ断片を連結し、ＲＮＡを核酸リガンドの候補混合物を提供するためにＤＮＡテ
ンプレートから分配する。核酸リガンドの候補混合物を興味のある標的分子と接
触させる；望ましい様式で標的と相互に作用する核酸リガンドを作用しない核酸
リガンドから分配する。望ましい様式で標的と作用する核酸リガンドを、相補的
ＤＮＡテンプレートを得るために逆転写する。一方、核酸リガンドが逆転写酵素
の作用しないリボヌクレオチドを含む場合は、ＤＮＡ断片を核酸リガンドにアニ
ーリングし、それらのＤＮＡ断片を一緒に連結することによってＤＮＡテンプレ
ートを調製する。どちらの場合も、これらのＤＮＡテンプレートは転写フリーＳ
ＥＬＥＸ方法のさらなる選択的サイクルにおけるＲＮＡ断片アニーリングのテン
プレートとして提供しうる。
【図２】 図２は、典型的なＳＥＬＥＸ ＤＮＡテンプレートにアニーリングさ
れた３つのランダム、および部分ランダムＲＮＡライブラリーの概念図を示す。
ＲＮＡライブラリーの固定およびランダム配列領域の相対的な大きさは、平衡状
態で、個々のライブラリー断片の最も安定した配置が図示されたものであること
を保証する。
【図３】 図３は、２９ｎｔランダム領域を有するＤＮＡテンプレートを用いた
転写フリーＳＥＬＥＸ工程で使用されうる３つの可能なＲＮＡライブラリーの概
念図を示す。個々のＲＮＡ断片は、熱力学的に最も好ましい配置にてＤＮＡテン
プレートにアニーリングされることを示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 CA01 CA11 HA11 HA12 HA20 4B063 QA20 QQ42 QQ52 QR08 QR32 QR42 QR55 QR82 QS25 QS34 QX01

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 標的化合物の核酸リガンドを同定する方法であって、前記方
    法が、 ａ）リボ核酸の候補混合物を調製する工程； ｂ）核酸の候補混合物を前記標的と接触させる工程、ここで候補混合物と比較し
    、前記標的に対する親和力が高い核酸を残りの候補混合物から分配（partition
    ）することができ； ｃ）親和力の高い核酸を残りの候補混合物から分配する工程；および ｄ）親和力の高い核酸を増幅し、前記標的との結合親和性および結合特異性が比
    較的高い核酸に富む核酸混合物を得る工程； を含み、ここでリボ核酸の前記候補混合物がランダム配列を含むＲＮＡ断片から
    集められる、前記方法。
  2. 【請求項２】 前記ＲＮＡ断片が合成ＲＮＡ分子を含む、請求項１記の方法
    。
  3. 【請求項３】 前記合成ＲＮＡ分子が少なくとも一つの非天然リボヌクレオ
    チドを含む、請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記非天然リボヌクレオチドが２’-ＯＭｅリボヌクレオチ
    ドである、請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】 請求項１記載の方法であって、相補的ＤＮＡテンプレートに
    前記ＲＮＡ断片をアニーリングし、次に前記アニーリングされたＲＮＡ断片を連
    結することによって、前記核酸混合物がＲＮＡ断片から調製される、前記方法。
  6. 【請求項６】 標的に対する核酸リガンドを調製する方法であって、 （ａ）固定３’および５’配列領域およびランダム内部配列を含むＤＮＡテンプ
    レートライブラリーを提供する工程； （ｂ）前記ＤＮＡテンプレートライブラリーを、各ライブラリーが合成ランダム
    ＲＮＡ断片を含む一つまたはそれ以上のＲＮＡライブラリーと接触させる工程、
    ここで前記ＲＮＡ断片は前記ＤＮＡテンプレートにアニーリングされ、各ＲＮＡ
    断片が前記ＤＮＡテンプレートより短い； （ｃ）前記ＲＮＡ断片を一緒に連結しＲＮＡ核酸リガンドの候補混合物を形成さ
    せる工程； （ｄ）ＲＮＡ核酸リガンドの前記候補混合物を前記ＤＮＡテンプレートライブラ
    リーから精製し、ＲＮＡ核酸リガンドの前記候補混合物を標的と接触させる工程
    ； （ｅ）前記候補混合物中で望ましい様式で標的と作用するＲＮＡ核酸リガンドを
    、作用しないものから分配する工程； （ｆ）望ましい様式で標的と相互作用する、それらのＲＮＡ核酸リガンドを逆転
    写してＤＮＡテンプレートを形成する工程； （ｇ）前記固定５’および３’配列領域とハイブリダイズするプライマー存在下
    でのポリメラーゼ連鎖反応を使用して、それらＤＮＡテンプレートを増幅させて
    、新たなＤＮＡテンプレートライブラリーを形成させる工程；および （ｈ）必要により所望の回数（ｂ）〜（ｇ）工程を繰り返す 工程を含む前記方法。
  7. 【請求項７】 請求項６の方法であって、ここで合成ランダムＲＮＡ断片を
    含む第一、第２及び第３ライブラリーが工程（ｂ）で用いられ、ここで、前記第
    １ライブラリーが更に前記ＤＮＡテンプレートの固定５’領域と相補的な固定Ｒ
    ＮＡ配列を含み、第２ライブラリーが更に前記ＤＮＡテンプレートの固定３’領
    域と相補的な固定ＲＮＡ配列を含む、前記方法。
  8. 【請求項８】 請求項７の方法であって、ここで前記第1ライブラリーが固
    定配列のＸリボヌクレオチドおよびランダム配列のＹリボヌクレオチドを含み；
    前記第２ライブラリーが固定配列のＡリボヌクレオチドおよびランダム配列のＢ
    リボヌクレオチドを含み；前記第３ライブラリーがランダム配列のＺリボヌクレ
    オチドを含み；Ｘ＋Ｙ＞Ｚ、Ａ＋Ｂ＞Ｚ、Ｙ＞Ｘ、Ｂ＞Ａ、Ｚ＞Ｙ、およびＺ＞
    Ｂである、前記方法。
  9. 【請求項９】 標的に対するＲＮＡ核酸リガンドの調製方法であって、 （ａ）固定３’および５’配列領域およびランダム内部配列を含むＤＮＡテンプ
    レートライブラリーを提供する工程； （ｂ）前記ＤＮＡテンプレートライブラリーを、各ライブラリーが合成ランダム
    ＲＮＡ断片を含む一つまたはそれ以上のＲＮＡライブラリーと接触させる工程、
    ここで前記ＲＮＡ断片は前記ＤＮＡテンプレートにアニーリングされ、各前記Ｒ
    ＮＡ断片が前記ＤＮＡテンプレートより短い； （ｃ）前記ＲＮＡ断片を一緒に連結しＲＮＡ核酸リガンドの候補混合物を形成さ
    せる工程； （ｄ）ＲＮＡ核酸リガンドの前記候補混合物を前記ＤＮＡテンプレートライブラ
    リーから精製し、ＲＮＡ核酸リガンドの前記候補混合物を標的と接触させる工程
    ； （ｅ）前記候補混合物中で望ましい様式で前記標的と作用するＲＮＡ核酸リガン
    ドを、作用しないものから分配する工程； （ｆ）前記標的と望ましい様式で作用するそれらのＲＮＡ核酸リガンドを, 各ライブラリーが合成ランダムＤＮＡ断片を含む一つまたはそれ以上のＤＮＡラ
    イブラリーと接触させる工程、ここで前記ＤＮＡ断片は前記ＲＮＡ核酸リガンド
    にアニーリングされ、各前記ＤＮＡ断片が前記ＲＮＡ核酸リガンドより短い； （ｇ）前記ＤＮＡ断片を一緒に連結し新たなＤＮＡテンプレートを形成させる工
    程； （ｈ）前記固定５’および３’配列領域とハイブリダイズするプライマー存在下
    ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、それら新たなＤＮＡテンプレートを増幅させ
    ることにより、新たなＤＮＡテンプレートライブラリーを形成させる工程；およ
    び （ｉ）必要により所望の回数（ｂ）〜（ｈ）工程を繰り返す 工程を含む、前記方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013027796A1 (ja) * 2011-08-24 2013-02-28 大塚化学株式会社 IgG結合性ペプチド及びそれによるIgGの検出および精製方法

Families Citing this family (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6716580B2 (en) * 1990-06-11 2004-04-06 Somalogic, Inc. Method for the automated generation of nucleic acid ligands
US6951719B1 (en) * 1999-08-11 2005-10-04 Proteus S.A. Process for obtaining recombined nucleotide sequences in vitro, libraries of sequences and sequences thus obtained
US20030104417A1 (en) * 1998-08-12 2003-06-05 Proteus S.A. Template-mediated, ligation-oriented method of nonrandomly shuffling polynucleotides
US6387620B1 (en) * 1999-07-28 2002-05-14 Gilead Sciences, Inc. Transcription-free selex
CA2328356A1 (en) * 1999-12-22 2001-06-22 Itty Atcravi Recreational vehicles
US7645743B2 (en) * 1999-12-22 2010-01-12 Altermune, Llc Chemically programmable immunity
US7300922B2 (en) 2001-05-25 2007-11-27 Duke University Modulators of pharmacological agents
US8030465B2 (en) 2001-06-29 2011-10-04 Medimolecular Pty Ltd Nucleic acid ligands to complex targets
WO2003093504A1 (de) * 2002-05-06 2003-11-13 Noxxon Pharma Ag Verfahren zur amplifikation von nukleinsäuren
US7727969B2 (en) * 2003-06-06 2010-06-01 Massachusetts Institute Of Technology Controlled release nanoparticle having bound oligonucleotide for targeted delivery
US20110182904A1 (en) 2006-09-05 2011-07-28 Deborah Zimmerman Antibodies to bone morphogenic proteins and receptors therefor and methods for their use
PL2066351T3 (pl) 2006-10-02 2016-02-29 Squibb & Sons Llc Przeciwciała ludzkie wiążące CXCR4 i ich wykorzystanie
SG177168A1 (en) 2006-12-01 2012-01-30 Medarex Inc Human antibodies that bind cd22 and uses thereof
CL2007003622A1 (es) 2006-12-13 2009-08-07 Medarex Inc Anticuerpo monoclonal humano anti-cd19; composicion que lo comprende; y metodo de inhibicion del crecimiento de celulas tumorales.
NZ578354A (en) 2006-12-14 2012-01-12 Medarex Inc Antibody-partner molecule conjugates that bind cd70 and uses thereof
MX2009013269A (es) 2007-06-05 2010-04-21 Univ Yale Inhibidores de receptor de cinasas de tirosina y metodos de uso de los mismos.
PT2403878T (pt) 2009-03-05 2017-09-01 Squibb & Sons Llc Anticorpos completamente humanos específicos a cadm1
SG175734A1 (en) 2009-04-20 2011-12-29 Oxford Biotherapeutics Ltd Antibodies specific to cadherin-17
CA2760774A1 (en) * 2009-05-05 2010-11-11 Altermune Technologies, Llc Chemically programmable immunity
US20120231004A1 (en) 2009-10-13 2012-09-13 Oxford Biotherapeutic Ltd. Antibodies
US8841429B2 (en) 2009-11-03 2014-09-23 Vivonics, Inc. Nucleic acid ligands against infectious prions
US8236570B2 (en) 2009-11-03 2012-08-07 Infoscitex Methods for identifying nucleic acid ligands
WO2011072266A2 (en) 2009-12-11 2011-06-16 Atyr Pharma, Inc. Aminoacyl trna synthetases for modulating hematopoiesis
EP2534489A1 (en) 2010-02-10 2012-12-19 Novartis AG Methods and compounds for muscle growth
EP2563380B1 (en) 2010-04-26 2018-05-30 aTyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of cysteinyl-trna synthetase
EP2563381B1 (en) 2010-04-27 2017-08-09 aTyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of isoleucyl trna synthetases
WO2011139853A2 (en) 2010-04-28 2011-11-10 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of alanyl trna synthetases
CA2797393C (en) 2010-04-29 2020-03-10 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of valyl trna synthetases
CA2797374C (en) 2010-04-29 2021-02-16 Pangu Biopharma Limited Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of asparaginyl trna synthetases
JP5976638B2 (ja) 2010-05-03 2016-08-23 エータイアー ファーマ， インコーポレイテッド アルギニルｔＲＮＡ合成酵素のタンパク質フラグメントに関連した治療用、診断用および抗体組成物の革新的発見
US9034321B2 (en) 2010-05-03 2015-05-19 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of phenylalanyl-alpha-tRNA synthetases
EP2566496B1 (en) 2010-05-03 2018-02-28 aTyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of methionyl-trna synthetases
EP2566499B1 (en) 2010-05-04 2017-01-25 aTyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of p38 multi-trna synthetase complex
WO2011143608A1 (en) 2010-05-13 2011-11-17 Avi Biopharma, Inc. Antisense modulation of interleukins 17 and 23 signaling
US8945541B2 (en) 2010-05-14 2015-02-03 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of phenylalanyl-beta-tRNA synthetases
EP2575856B1 (en) 2010-05-27 2017-08-16 aTyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of glutaminyl-trna synthetases
WO2012021247A2 (en) 2010-07-12 2012-02-16 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of glycyl-trna synthetases
AU2011293294B2 (en) 2010-08-25 2016-03-24 Pangu Biopharma Limited Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of Tyrosyl-tRNA synthetases
MY160826A (en) 2011-06-28 2017-03-31 Berlin-Chemie Ag Antibodies to bone marrow stromal antigen 1
GB201114662D0 (en) 2011-08-24 2011-10-12 Altermune Technologies Llc Chemically programmable immunity
NZ628126A (en) 2012-02-16 2016-10-28 Atyr Pharma Inc Histidyl-trna synthetases for treating autoimmune and inflammatory diseases
ES2912033T3 (es) 2012-10-23 2022-05-24 Caris Science Inc Aptámeros y usos de los mismos
US10942184B2 (en) 2012-10-23 2021-03-09 Caris Science, Inc. Aptamers and uses thereof
AU2013361323B2 (en) 2012-12-19 2018-09-06 Caris Science, Inc. Compositions and methods for aptamer screening
CN110478481A (zh) 2013-03-13 2019-11-22 比奥阿赛斯技术有限公司 p97片段及其应用
WO2014144744A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Aptamer methods and compositions
CN113683695A (zh) 2013-08-02 2021-11-23 辉瑞公司 抗cxcr4抗体及抗体-药物缀合物
EP3626822A1 (en) 2014-08-15 2020-03-25 Adynxx, Inc. Oligonucleotide decoys for the treatment of pain
CN110392697A (zh) 2017-03-02 2019-10-29 国家医疗保健研究所 对nectin-4具有特异性的抗体及其用途
CA3107332A1 (en) 2018-07-22 2020-01-30 Bioasis Technologies Inc. Treatment of lymphatic metastases
US20230040928A1 (en) 2019-12-09 2023-02-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antibodies having specificity to her4 and uses thereof
EP4149558A1 (en) 2020-05-12 2023-03-22 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) New method to treat cutaneous t-cell lymphomas and tfh derived lymphomas
US20210355468A1 (en) 2020-05-18 2021-11-18 Bioasis Technologies, Inc. Compositions and methods for treating lewy body dementia
US20210393787A1 (en) 2020-06-17 2021-12-23 Bioasis Technologies, Inc. Compositions and methods for treating frontotemporal dementia
WO2023170296A1 (en) 2022-03-11 2023-09-14 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Nucleic acid system to specifically reprogram b and t cells and uses thereof
WO2023183873A1 (en) 2022-03-24 2023-09-28 Mensura Health Inc. Aptamers and uses thereof
WO2024044770A1 (en) 2022-08-26 2024-02-29 Core Biotherapeutics, Inc. Oligonucleotides for the treatment of breast cancer
WO2024052503A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Antibodies having specificity to ltbp2 and uses thereof

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3546806C2 (ja) 1985-03-30 1991-03-28 Marc Genf/Geneve Ch Ballivet
WO1989006694A1 (en) 1988-01-15 1989-07-27 Trustees Of The University Of Pennsylvania Process for selection of proteinaceous substances which mimic growth-inducing molecules
US5637459A (en) * 1990-06-11 1997-06-10 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chimeric selex
US5496938A (en) * 1990-06-11 1996-03-05 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligands to HIV-RT and HIV-1 rev
US5660985A (en) * 1990-06-11 1997-08-26 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands containing modified nucleotides
WO1991019813A1 (en) 1990-06-11 1991-12-26 The University Of Colorado Foundation, Inc. Nucleic acid ligands
US5707796A (en) * 1990-06-11 1998-01-13 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Method for selecting nucleic acids on the basis of structure
AU1435492A (en) 1991-02-21 1992-09-15 Gilead Sciences, Inc. Aptamer specific for biomolecules and method of making
US5582981A (en) * 1991-08-14 1996-12-10 Gilead Sciences, Inc. Method for identifying an oligonucleotide aptamer specific for a target
US5698391A (en) 1991-08-23 1997-12-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for synthetic unrandomization of oligomer fragments
US5605793A (en) * 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5706796A (en) * 1996-08-16 1998-01-13 Genero; Nivardo Blasoni Heat diffusion ovens
US6387620B1 (en) * 1999-07-28 2002-05-14 Gilead Sciences, Inc. Transcription-free selex

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013027796A1 (ja) * 2011-08-24 2013-02-28 大塚化学株式会社 IgG結合性ペプチド及びそれによるIgGの検出および精製方法
JPWO2013027796A1 (ja) * 2011-08-24 2015-03-19 大塚化学株式会社 ＩｇＧ結合性ペプチド及びそれによるＩｇＧの検出および精製方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2001009380A1 (en) 2001-02-08
EP1206575A1 (en) 2002-05-22
AU6113300A (en) 2001-02-19
US6387620B1 (en) 2002-05-14
ATE435922T1 (de) 2009-07-15
EP1206575A4 (en) 2004-12-01
DE60042526D1 (de) 2009-08-20
CA2391351A1 (en) 2001-02-08
US20020102599A1 (en) 2002-08-01
AU782673B2 (en) 2005-08-18
EP1206575B1 (en) 2009-07-08

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Sabat et al. Template-dependent DNA ligation for the synthesis of modified oligonucleotides
WO2003014369A1 (en) Nucleic acid ligands with intramolecular duplexes
Barciszewski et al. Why RNA?
Green An in vitro genetic analysis of the group I self-splicing intron
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