JP2003504621A - 微生物の電気化学的濃化培養方法、並びに有機物質およびｂｏｄ分析用バイオセンサー - Google Patents

微生物の電気化学的濃化培養方法、並びに有機物質およびｂｏｄ分析用バイオセンサー

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Abstract

(57)【要約】 本発明では、嫌気的条件で媒介体のない生物燃料電池を使用して電気化学的な方法で試料中の有機物濃度またはＢＯＤを測定し得るバイオセンサーが提供される。ＢＯＤ測定用バイオセンサーに使用される生物燃料電池の電気化学的活性細菌としては、生物燃料電池の運転過程で濃化培養された廃水およびスラッジ中に含まれた活性細菌が使用される。したがって、本発明のＢＯＤバイオセンサーは、人為的な微生物の添加無しに運転することができ、廃水によって適切な細菌の活性が保持され得る。また、バイオセンサー用生物燃料電池は６ヶ月以上安定的に作動することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、有機物濃度およびＢＯＤ測定用バイオセンサーに関し、さらに詳細
には、測定が簡単且つ迅速であり、応用および製作並びにメンテナンスにかかる
コストの低い有機物濃度およびＢＯＤ測定用バイオセンサーに関する。
【０００２】 （背景技術） 一般に、バイオセンサーとは、測定部の一部または全部として生物体または生
物体から由来した物質が使用され、この測定部が電気的装置と結合された測定装
置を意味する。バイオセンサーは、生物反応における高度の特異性のため、測定
物質の濃度および性状が精度良く測定できるという点で、１９６０年代からそれ
に対する研究が持続的に行われてきた。その結果、様々なバイオセンサーが開発
され、その測定物質の範囲も多様化された。例えば、グルコースオキシダーゼと
酸素電極を結合して製作したグルコース濃度測定用バイオセンサーおよび抗体を
使用した医学用バイオセンサーが現在実用化されて広く使用されている［参照；
Ｔｕｎｅｒ等，１９８７：Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ， Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ
ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕ
ｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ］。
【０００３】 一方、工場稼動時に発生する廃水や家庭から発生する下水などの汚濁度は、通
常、化学的酸素要求量（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｏｘｙｇｅｎ Ｄｅｍａｎｄ：ＣＯ
Ｄ）または生化学的酸素要求量（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｏｘｙｇｅｎ Ｄｅ
ｍａｎｄ：ＢＯＤ）に換算して表示され、これらの迅速な測定は、環境および公
害防止関連産業において極めて重要な意味を有する。しかし、廃水中に存在する
微生物磁化性有機物質の量を意味するＢＯＤを測定する従来の方法では長時間か
かり、種々の複雑な過程と装置が必要とされる問題点がある。また、作業者の熟
練度によってその値に偏差が生じるだけでなく、水質の汚染状態を緊急確認した
い場合や、または廃水処理工程の自動化施設の設置において適用し難いという問
題点があった。
【０００４】 かかる問題点を解決するために、数種のＢＯＤ測定用バイオセンサーが開発さ
れた［参照；Ｈｉｋｕｍａ等，１９７９：Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８，
２８９：Ｒｉｅｄｅｌ等，１９９０：Ｗａｔｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２４，８
８３：Ｈｙｕｎ等，１９９３：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅ
ｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，４１，１１０７］。前記言及されたＢＯＤセンサーは、
通常、溶解酸素測定用電極に特定微生物を固定化させた膜を付着した形態であっ
て、この時、ＢＯＤセンサーを測定しようとする試料と反応させると、膜に固定
化された微生物が試料内の有機物を磁化しながら酸素を消費するようになり、し
たがって、この時の溶解酸素値を対照試料の溶解酸素値と比較し、これをＢＯＤ
に換算する。しかし、このようなＢＯＤ測定用バイオセンサーは下記のような問
題点を抱えている。
【０００５】 第一に、１種の微生物を使用し、使用した微生物の基質特性によって廃水中の
複合栄養成分に対する磁化性が足りないため、ＢＯＤの全体値が表せない。
【０００６】 第二に、多孔性膜に微生物を固定させたため、再現性の高いＢＯＤ測定値を得
るためには随時に膜を交換、修理しなくてはならないが、使用される微生物固定
膜が高価なので非経済的であり、整備もしにくい。
【０００７】 第三に、対照試料用溶解酸素電極を使用しなくてはならず、装置が複雑となり
、装備コストおよび故障率も高くなる。
【０００８】 第四に、従来ＢＯＤ測定用バイオセンサーに使用される微生物は、微生物の外
部から電気化学的活性を直接測定できないため、電子伝達媒介体（ｅｌｅｃｔｒ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｄｉａｔｏｒ）や別途の変換機（ｔｒａｎｓｄｕｃｅ
ｒ）を取り付けなくてはならない。
【０００９】 一方、一般的に嫌気的環境で生長する微生物は、酸素以外に他の電子受容体を
使用することができ、こうした電子受容体を使用して代謝する過程を微生物の嫌
気的呼吸と呼ぶ。嫌気的に呼吸する微生物が有機物を酸化する際に利用し得る電
子受容体には、酸化第二鉄、硝酸塩、六価マンガン、硫酸塩、炭酸塩などがある
。電子供与体が同じの場合、微生物電子伝達系内の酸化還元反応から発生するエ
ネルギーは、酸化第二鉄が酸化第一鉄に還元される時が最も大きく、硝酸塩、硫
酸塩、炭酸塩の順に低くなるが、これは、各々の電子受容体の固有特性である酸
化還元電位と関係がある［参照；キムビョンホム、１９９５：微生物生理学、ア
カデミー書籍］。
【００１０】 こうした嫌気的呼吸を行う微生物の金属塩還元細菌が利用する電子受容体のう
ち酸化第二鉄などは、水に対する溶解度が極めて低いため、好気性微生物の一般
の電子受容体である酸素とは違って、不溶性電子受容体を細胞内に吸収して還元
することができない。したがって、金属塩還元細菌の場合、外部に存在する電子
受容体を還元するために特殊な形態の電子伝達システムが存在する。例えば、酸
化第二鉄を電子受容体として利用する金属塩還元細菌の一種であるジオバクター
サルファーリデュセンス（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ
）とシーワネラピュートリファシエンス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆ
ａｃｉｅｎｓ）の場合、電子伝達タンパク質のシトクロムが存在し、このシトク
ロムを通して微生物内部で酸化された有機物から発生した電子が外部の電子受容
体に伝達され、こうした一連の電子伝達過程を通じて発生したエネルギーを利用
して生長するようになる［参照：Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｙｅｒｓ，１９９２，
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７４，３４２９−３４３
８；Ｓｅｅｌｉｇｅｒ等，１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌｏｇｙ，１８０，３６８６−３６９１］。したがって、類似した性質をもつこ
れらの金属塩還元細菌は、有機物の代謝時に発生する電子を外部の不溶性電子受
容体に伝達して電子受容体を還元させるため、有機物の量は外部の電子受容体の
還元量と比例するようになり、この電子受容体に代替できる適当な電極を利用す
ると、微生物内部から発生する電子が電極を還元させ、電極に直接伝達された電
子は回路を通じて外部へ流れるようになる。こうした微生物の生理学的特性を利
用する生物燃料電池などが大韓民国特許公開公報第１９９８−１６７７７号（１
９９８年６月５日）に開示されており、本願に参考として導入される。
【００１１】 ところで、前記金属塩還元細菌を利用した生物燃料電池において電子の量は微
生物の濃度、有機物の量などに比例するため、発生された電子の量を測定するこ
とによって試料中に存在する有機物の量を測定することが可能になる。
【００１２】 したがって、本発明者らは、このような生物燃料電池および使用された微生物
と有機物に対する研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【００１３】 （発明の開示） 本発明の目的は、前述した従来のＢＯＤ測定用バイオセンサーの問題点を解消
し、改善されたＢＯＤ測定用バイオセンサーおよびそれを使用したＢＯＤ測定方
法を提供することにある。
【００１４】
【発明の構成および作用】
前記目的を達成するために、本発明の一観点によれば、測定部、電流検出部お
よび検出された電流変化を記録する記録部を含み、前記測定部は、陽極および陰
極、これら陽極および陰極の伝導媒体、並びにこれら両極間のイオン交換膜を含
む無媒介体生物燃料電池からなり、前記陰極部には電気化学的活性細菌を含有す
る試料が添加されることを特徴とするＢＯＤ測定用バイオセンサーが提供される
。
【００１５】 また、前記ＢＯＤ測定用バイオセンサーにおいて、陰極と陽極を抵抗を介して
連結した後、陰極部には窒素を供給して嫌気性条件にし、陽極部には空気を供給
して好気性条件を作って試料中に存在する電気化学的活性細菌を前記陰極部に濃
化培養し、前記濃化培養された電気化学的活性細菌を微生物触媒として利用する
ことから発生した電流を測定することを特徴とする試料中のＢＯＤ測定方法が提
供される。
【００１６】 本発明の他の観点によれば、測定部、電流検出部および検出された電流変化を
記録する記録部を含み、前記測定部は、陽極および陰極、これら陽極および陰極
の伝導媒体、並びにこれら両極間のイオン交換膜を含む無媒介体生物燃料電池か
らなり、前記陰極部に所定の有機物を代謝する単一種の電気化学的活性細菌が含
まれていることを特徴とする無媒介体生物燃料電池型有機物濃度測定用バイオセ
ンサーが提供される。
【００１７】 また、前記有機物濃度測定用バイオセンサーにおいて、陽極部には空気を継続
的に供給して陰極部との電圧差を保持させながら、測定したい試料を陰極部に添
加して陰極部に含まれた細菌が有機物を消費する上で生産される電子の流れを測
定することによって該当有機物の濃度を測定することを特徴とする有機物濃度測
定方法が提供される。
【００１８】 本発明のさらに他の観点によれば、陽極および陰極、これら陽極および陰極の
伝導媒体、並びにこれら両極間のイオン交換膜からなる無媒介体生物燃料電池に
おいて、陰極部には活性スラッジと廃水を添加し、陰極と陽極を抵抗を介して連
結した後、陰極部には窒素を供給して嫌気性条件にし、陽極部には空気を供給し
て好気性条件に作って別途の電子受容体無しに活性スラッジと廃水中に存在する
電気化学的活性細菌を濃化培養する方法が提供される。
【００１９】 本発明は、電気化学的に活性をもつ微生物を使用し、電子伝達媒介体や変換機
（ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）無しに微生物自体の有機物磁化力および電子伝達能力
を利用して廃水中の微生物磁化性成分（ＢＯＤ）や乳酸などの有機物濃度を測定
し得るバイオセンサーに関するものである。
【００２０】 本発明の一観点において、ＢＯＤ測定用バイオセンサーは、測定部、電流検出
部および検出された電流変化を記録する記録部を含み、前記測定部は、陽極およ
び陰極、これら陽極および陰極の伝導媒体、並びにこれら両極間のイオン交換膜
を含む無媒介体生物燃料電池からなり、前記陰極部には電気化学的活性細菌を含
有する試料が添加される。
【００２１】 即ち、特定試料内の有機物と活性スラッジを種菌試料とし、電気化学的に活性
のある電気化学的活性細菌を電気化学的な方法で電極および電極を含む電極部に
濃化培養し、前記濃化培養された電気化学的活性細菌を微生物触媒として利用す
ることによって電力を生産させると、生産された電力は測定部として使用された
生物燃料電池に添加された微生物磁化性成分である各種有機物濃度に比例するよ
うになり、これを検出、記録することによって試料中のＢＯＤを測定することが
可能になる。
【００２２】 また、好ましくは、前記測定部の陰極部に電気化学的活性細菌の濃化培養を促
すために、静電位電解装置を使用することができる。
【００２３】 本発明の目的上、電気化学的活性細菌とは、廃水中の有機物を酸化する過程で
発生する電子を細胞外部へ放出し電極に直接伝達することから電流を発生させ得
る細菌のことをいい、代表的なものには金属塩還元細菌がある。
【００２４】 本発明の他の観点において、有機物濃度測定用バイオセンサーは、前記生物燃
料電池の電極自体または電極部に特定有機物質を基質とする電気化学的に活性で
ある特定な細菌を含ませ、これをそのままバイオセンサーの測定部として利用す
る。即ち、特定な有機物を代謝する電気化学的活性細菌を陰極部に含ませるため
、生物燃料電池によって発生した電力は試料中に存在する特定有機物の代謝によ
るものとなり、これを測定することによって試料中の有機物濃度を測定すること
が可能になる。
【００２５】 以下、前述のようなＢＯＤおよび有機物濃度を測定する方法について具体的に
説明する。 （１）電気化学的活性細菌の濃化培養およびこれを利用したＢＯＤ測定用バイオ
センサー 廃水から発生する活性スラッジおよび嫌気性スラッジには多量の鉄還元細菌を
含んだ種々の金属塩還元細菌が高い濃度で存在するものと最近の研究から確認さ
れた［参照：Ｎｉｅｌｓｅｎなど、１９９７，Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０，６４５−６５１；Ｎｉｅｌ
ｓｅｎなど、１９９６，Ｗａｔｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ，３４，１２９−１３６；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎｓなど、１９９４，Ｗａｔ
ｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２８，４１７−４２５］。
【００２６】 したがって、活性スラッジや廃水などの種々の微生物が混合されている試料を
種菌とし、電極の含まれた培養槽で適当な培地とともに嫌気的に培養すると、電
極を電子受容体として使用し得る微生物だけが最終的に生存することになり、こ
れら微生物種はシトクロムのような電子伝達体をもっているため、電気化学的活
性をもつ。したがって、このような方法で廃水や活性スラッジなどに存在する種
々の微生物のうち電気化学的活性をもつ菌を選択的に濃化培養することができる
。
【００２７】 一方、廃水や汚染された下水には多様な類型の有機物が含まれており、これら
廃水や下水のＢＯＤを一律的な方法、即ち１種類の微生物だけで測定するという
のは極めて難しいことであり、測定誤差もまた大きい。したがって、相異なる有
機廃水および活性スラッジ中の多様な電気化学的活性細菌を前述のように濃化培
養し、濃化培養されたこれらの活性細菌を測定部の生物燃料電池の微生物触媒と
して利用する過程で生産された電力量を測定することによって、試料中のＢＯＤ
を測定することができる。
【００２８】 （２）生物燃料電池型バイオセンサーを使用した有機物濃度測定 前記ＢＯＤ測定用バイオセンサーで説明したような生物燃料電池において、陰
極部には測定したい基質に適する電気化学的に活性である単一種の微生物を含ま
せる。陽極部には空気を供給し続けて陰極部との電圧差を保持させ、測定したい
試料を陰極部に添加すると、陰極部に含まれた微生物が該当基質を消費する上で
生産される電子が直接陰極を通じて外部の回路に流れ出るようになり、これを測
定することによって該当基質の濃度を測定することができる。したがって、この
ような原理に基づき多様な基質を消費する電気化学的に活性をもつ細菌を使用す
ると、多様な基質、即ち相応する該当有機物の濃度を測定することができる。
【００２９】 以下、添付した図面を参照しつつ本発明をさらに詳細に説明する。 図１は、生物燃料電池形態の濃化培養装置を利用したＢＯＤセンサーの模式図
である。陽極部５に酸素を供給して陽極２と陰極１に電位差を付与し、陰極部４
に試料（例えば、廃水およびスラッジ）を添加し、陽極部にリン酸緩衝溶液また
は水道水を添加する。陰極部には嫌気的状態を保持させるために窒素を供給し、
陽極部には空気を供給して単位電池の電圧差を保持させることができる。一定期
間経過した後（通常、３週）、陰極には特定廃水を基質として濃化された電気化
学的活性をもつ微生物が付着されるが、ここで、付着された微生物が基質を酸化
して発生する電気を適宜測定すると、廃水中のＢＯＤ増減を測定することができ
る。本発明では前記陽極と陰極は両方とも炭素不織布から構成したが、状況に応
じてこれ以外の各種材料の電極を使用してもよい。
【００３０】 図４は、本発明の好ましい具現例であって、電気化学的濃化培養法を利用した
ＢＯＤセンサーの構成図である。この場合、電極の電圧を一定に保持するために
静電位電解装置（ｐｏｔｅｎｔｉｏｓｔａｔ）を使用する。ここで、作業電極１
０１は電子受容体として作用し、電極に対する適用電圧を変化させることによっ
て微生物に対する電気化学的作用が異なることもある。作業電極の材質は炭素不
織布であり、基準電極１１３としては銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）が、補助電
極１０２としては白金が使用される。基準電極は作業電極の作用電圧を保持、補
正し、補助電極は作業電極と電気回路を構成する。この装置は、作業電極に一定
な電位を加え（塩化銀基準電極に対して通常＋０．９８Ｖ）、試料（廃水および
スラッジ）を供給して特定廃水中の電気化学的活性細菌を一定期間（通常、２週
）濃化培養し、これにより、電極に付着（濃化）された微生物および装置をその
ままＢＯＤ測定用バイオセンサーとして使用することができる。
【００３１】 本発明の利点および目的は、下記に説明される実施例によってより容易に理解
されるものの、これに限定されるのではない。
【００３２】 ［実施例１］ 生物燃料電池を利用した電気化学活性をもつ微生物濃化とＣＯＤ濃度による生
物燃料電池の電流変化 特定廃水中の有機物を電子供与体として利用する、電気化学的に活性をもつ微
生物を濃化培養するために図１のような装置を製作した。
【００３３】 本実験では、澱粉加工廃水（出所：三養ゼネックス、大韓民国仁川市所在）を
利用し、同工場の廃水処理から発生した活性スラッジを接種源として使用した。
生物燃料電池の基本形態はベネットなどの文献［参照：Ｂｅｎｎｅｔｔｏなど、
１９８５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，７，６９９−７０４
］を参照した。電極は、陽極２および陰極１とも炭素不織布（寸法：５×７．５
×０．６ｃｍ）とし、電極の配線は白金線を使用した［本発明では、微生物（ま
たは、微生物の電子伝達物質）が電極によって酸化される場所を陰極部４とし、
外部回路を通じて移動された電子が再び電極で酸化剤を還元させる部分を陽極部
５とする］。陰極部と陽極部はイオン交換膜３を介在して分離され、陰極１と陽
極２は外部の回路を通じて連結される。この時、外部の回路に適当な抵抗を連結
すると、陰極と陽極間の電流を制御することができる。陽極部（作業容量：３０
ｍｌ）には空気を供給し、陰極部（作業容量：３０ｍｌ）には廃水とスラッジな
どの試料を添加した。陰極部に廃水およびスラッジを添加し、陰極と陽極を抵抗
を介して連結した後、陰極部には窒素を供給して嫌気的条件にし、陽極部に空気
を供給して好気的条件を作って濃化培養を開始した。約３週間の濃化培養の後、
背景電流が一定に保持されたとき一定な濃度のＢＯＤをもつ廃水を添加して発生
される電流の総量を積算した。
【００３４】 電流が基本値を表すとき、異なる濃度のＣＯＤをもつ廃水（出所：三養ゼネッ
クス、大韓民国仁川市所在）を添加した。図２に示すように、発生される電流量
は添加された廃水のＣＯＤに比例して増加した。また、図３に示すように、積算
電流値は添加された試料のＣＯＤが増加するにつれて比例的に増加した。
【００３５】 一方、前記製作されたＢＯＤセンサーを６ヶ月間作動させながら、１ヶ月毎に
ＣＯＤ５０ｐｐｍと１００ｐｐｍを各々添加して発生される電流量を測定した。
図１０に示すように、発生される電流量は殆ど変化することなく一定に保持され
た。したがって、発生される電流量は、ＢＯＤセンサーの作動期間にかかわらず
、添加されたＣＯＤの量に従って一定な値を保持しながら作動されることがわか
った。
【００３６】 ［実施例２］ 静電位電解装置が装着された生物燃料電池を利用した電気化学的活性微生物の
濃化とＣＯＤ濃度による電流変化 電気化学的に活性をもつ微生物を有効に濃化培養するために図４のような装置
を製作した。電気化学セル（Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｅｌｌ）の材
質はパイレックス（登録商標）ガラスを使用し、容量を５００ｍｌとした。微生 物が濃化される部分には、作業電極（炭素不織布）１０１が静電位電解装置と連 結されて付着されており、電気回路を構成するために補助電極（白金線）１０２ を取り付け、これを静電位電解装置と連結した。微生物が濃化される作業電極部 と補助電極部は透析膜で分離されている。作業電極部１０４および補助電極部１ ０５には同じ濃度の廃水を添加した。作業電極を一定の静電位に保持するために 基準電極１１３を付着し、作業電極の電位は静電位電解装置によって調節される 。試料の投入および採取口１０９を形成し、必要に応じて嫌気的条件を保持する ために窒素ガスを供給した。これら窒素注入口および排出口１１０，１１１は連 続的な試料の供給が必要な場合、窒素に代わって試料の供給および排出口として も使用することができる。作業電極と補助電極間の電圧および電流の変化は、静 電位電解装置を通じて増幅され、これをコンピュータを利用した記録装置や記録 紙を利用するレコーダーで記録した。濃化培養は、作業電極部に菌源試料として 活性スラッジを添加した後、静電位電解装置を作動させて作業電極が固定された 電位を保持された状態で開始した。本実験で廃水および活性スラッジは澱粉加工 廃水（出所：三養ゼネックス、大韓民国仁川市所在）を利用した。
【００３７】 濃化培養は、廃水および活性スラッジを作業電極部に添加した後、作業電極を
＋０．９８Ｖに固定した状態で開始した。実験開始から１４日間稼動したとき、
作業電極と補助電極間の電流は約５０μＡから最大３２２μＡまで増加し、作業
開始１８日経過の後、約１５３μＡで電流が安定化した。電流が安定化したとき
濃度の異なる廃水を試料投入口を通じて投入した結果、電流の値が図２に似た形
に増加した。試料投入口１０９と窒素排出口１１０を通じて廃水を連続的に投入
・放出し、作業電極と補助電極間の電流を確認した結果、投入された廃水の濃度
による電流の変化が確認できた（図５参照）。したがって、この装置を使用して
ＢＯＤを連続的に測定することが可能ということが分かり、装置を分解して電極
を走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した結果、多量の微生物が電極に付着されて
いることが確認できた（図６参照）。電極から分離した微生物を培養し、循環電
流法で調査した結果、電気化学的に活性であると確認された。
【００３８】 ［実施例３］ 生物燃料電池型ＢＯＤセンサーの陰極および陰極部内の金属塩還元細菌数の変
化 実施例２で使用された生物燃料電池形態のＢＯＤセンサーの濃化培養過程およ
び作動中、陰極部から陰極を試料として採取し鉄還元細菌の菌体数を調査した。
培地は、リン酸塩緩衝液基本培地（ＰＢＢＭ）を使用し、培地成分は、酵母抽出
物１ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム１ｇ／Ｌ、Ｍａｃｒｏ−ｍｉｎｅｒａｌ（ＩＩ）
２５ｍｌ／Ｌ（リットル当り６ｇ ＫＨ２ＰＯ４、１２ｇ ＮａＣｌ、２．４ｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏおよび１．６ｇ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ包含）、微量元
素２ｍｌ／Ｌ（リットル当り１２．８ｇニトロ酢酸、０．１ｇ ＦｅＳＯ４・７
Ｈ２Ｏ、０．１ｇ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．１７ｇ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ
、０．１ｇ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．１ｇ ＺｎＣｌ２、０．０２ｇ Ｃｕ
Ｃｌ２・Ｈ２Ｏ、０．１ｇ Ｈ３ＢＯ３、０．０１ｇモリブデン塩、１．０ｇ
ＮａＣｌ、０．０１７ｇ Ｎａ２ＳｅＯ３、０．０２６ｇ ＮｉＳＯ４・６Ｈ２ Ｏ包含）、ビタミン液０．１ｍｌ／Ｌ（０．００２ｇビオチン、０．００２ｇ
葉酸、０．０１０ｇ Ｂ６（ピリドクシン）ＨＣｌ、０．００５ｇ Ｂ１（チア
ミン）ＨＣｌ、 ０．００５ｇ Ｂ２（リボフラビン）、０．００５ｇ ニコチ
ン酸（ニアシン）、０．００５ｇ パントテン酸、０．０００１ｇ Ｂ１２（シ
アノコバラミン）結晶、０．００５ｇ ＰＡＢＡ、０．００５ｇリボ酸（チオク
ト酸）、レザズリン（Ｒｅｓａｚｕｒｉｎ）（０．２％）１ｍｌ／Ｌ と寒天（
ａｇａｒ）１．８％を添加して平板培地を製造した。この時、電子供与体として
酢酸２０ｍＭ、乳酸３０ｍＭ、ブドウ糖２０ｍＭを各々使用し、電子受容体とし
て水溶性鉄のピロリン酸第二鉄（Ｆｅｒｒｉｃ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）
２０ｍＭを使用した。１次段階は、反応初期燃料電池の好気性スラッジと嫌気性
スラッジの試料を生理食塩水（０．８５％塩水）で希釈しＣＦＵ（Ｃｏｌｏｎｙ
Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｕｎｉｔ ／ｍｌ）に測定し、２次と３次段階は、反応後各
々１ヶ月経過したのち同一培地と方法で測定した。その結果を下記表１に表す。
【００３９】
【表１】 生物燃料電池陰極部内の特定微生物の菌体数変化
【００４０】 前記表１において、好気性スラッジ試料は燃料電池の陰極部位を嫌気状態に作
るため、通性嫌気性菌株以外には選別されながら減少し続け、電気化学的活性を
もつ微生物だけが濃化培養されるものと判断され、嫌気性スラッジ試料は、２次
段階で嫌気性細菌が増加してから３次段階には減少して電気化学的活性をもつ特
定生物だけが濃化培養された。
【００４１】 ［実施例４］ シーワネラピュートリファシエンスを利用する燃料電池型バイオセンサーによ
る乳酸濃度の測定 乳酸の濃度を測定するために鉄還元細菌の一種のシーワネラピュートリファシ
エンス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）ＩＲ−１（受託番
号 ＫＣＴＣ ８７５３Ｐ、韓国科学技術研究院敷設生命工学研究所遺伝子銀行
）を使用してバイオセンサーを製作した（図７参照）。
【００４２】 この細菌は、乳酸を酢酸に酸化して発生する還元力で酸化第二鉄を還元する性
質をもつ。陽極部２０５の容量は約２０ｍｌであり、０．１Ｍの塩化ナトリウム
を含む０．０５Ｍのリン酸塩緩衝溶液を添加し、陰極部２０４にはシーワネラピ
ュートリファシエンス ＩＲ−１（乾燥重量：５ｍｇ）と０．１Ｍの塩化ナトリ
ウムを含む１９ｍｌの０．０５Ｍリン酸塩緩衝溶液を添加した。陰極２０１は０
．８×４×０．３ｃｍ寸法の炭素不織布を使用し、陽極２０２は多孔性光沢炭素
（Ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅｄ Ｖｉｔｒｅｏｕｓ Ｃａｒｂｏｎ； 寸法：３×３
×０．３ｃｍ）を使用した。陽極と陰極は抵抗（５００Ω）を介して連結され、
この時の電圧の変化を測定して電極間の電流を計算した。電流は電圧計を経て記
録計を作動させ得るように増幅され、電流（電圧）の変化を記録計を用いて記録
した。作業温度を２５℃に保ち、測定は、背景電流が安定化した後、各々異なる
濃度の乳酸が含まれた１ｍｌの試料を投入口２０９を通じて添加し、時間の経過
による電流変化を記録し初期勾配を求めた。
【００４３】 一定濃度の乳酸をバイオセンサー内に投入した時に発生する電流の初期勾配は
、乳酸の濃度に比例したが、これは微生物によって乳酸が酸化されて発生した電
子が電極を通じて移動するのを意味し、乳酸の濃度は微生物の濃度が一定の時に
発生される電子の量に比例することを表している。代表的な電流の増加例を図８
に示し、乳酸の濃度変化による電流発生時の初期勾配を図９に示した。乳酸濃度
による電流初期勾配の相関係数は０．８４であり、これは微生物の種類、濃度、
電極の材質および寸法を変化させたり、抵抗を変化させるなどバイオセンサーの
構成を変化させることによって改善された。
【００４４】 本発明のバイオセンサーに使用される燃料電池である微生物触媒の電気化学的
活性細菌として、ＢＯＤ測定のための生物燃料電池の運転過程で濃化培養された
廃水およびスラッジ中に含まれた活性細菌が使用される。したがって、本ＢＯＤ
バイオセンサーは、人為的な微生物の添加無しに運転され、廃水によって適切な
細菌の活性が保持されることができ、廃水のＢＯＤ値を連続的に測定することが
できる。また、本発明のＢＯＤ測定用バイオセンサーに使用される生物燃料電池
は６ヶ月以上安定的に作動することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、生物燃料電池形態の特定微生物濃化装置を利用したＢＯＤ測定用バイ
オセンサーの模式図である。
【図２】 図２は、本発明による生物燃料電池型バイオセンサーに添加された試料のＣＯ
Ｄと電流の関係を表すグラフである。
【図３】 図３は、生物燃料電池のバイオセンサーに添加された試料のＣＯＤおよび発生
した積算電流量との相関関係を表すグラフである。
【図４】 図４は、静電位電解装置（ｐｏｔｅｎｔｉｏｓｔａｔ）を利用した特定微生物
の濃化培養用装置と、これを利用したＢＯＤ測定用バイオセンサーの模式図であ
る。
【図５】 図５は、実施例２による静電位電解装置を使用して電気化学的活性細菌が濃化
培養された生物燃料電池型バイオセンサーに添加された試料のＣＯＤと電流との
関係を表すグラフである。
【図６】 図６ａは、本発明による生物燃料電池型バイオセンサーの作業電極の使用前の
電極表面の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真であり、図６ｂは、作業電極表面に濃
化された微生物の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真である。
【図７】 図７は、本発明による燃料電池型乳酸濃度測定バイオセンサーの模式図である
。
【図８】 図８は、乳酸濃度測定の時に発生する電流記録の一般的な形態である。
【図９】 図９は、乳酸濃度および電流発生時の初期勾配間の相関関係を表すグラフであ
る。
【図１０】 図１０は、本発明によるＢＯＤ測定用バイオセンサーを使用した場合、６ヶ月
間添加されたＣＯＤ濃度による電流量を表すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/18 １０５ Ｇ０１Ｎ 27/327 Ｈ０１Ｍ 8/16 33/18 １０５ Ｃ０２Ｆ 3/00 Ｇ Ｈ０１Ｍ 8/16 Ｃ１２Ｒ 1:01 // Ｃ０２Ｆ 3/00 Ｇ０１Ｎ 27/46 ３０１Ｎ (Ｃ１２Ｍ 1/34 27/30 ３５５ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 ヒュン，モンシク 大韓民国 138−747，ソウル，ソンパ− ク，ガラク２−ドン，ガラク サンギョン アパートメント 303−2403 (72)発明者 キム，ヒュンジョ 大韓民国 135−260，ソウル，カンナム− ク，ポイ−ドン，242−２，ヒュンデタッ プ ヴィラ 103 (72)発明者 パク，ヒュンソ 大韓民国 139−754，ソウル，ノウォン− ク，サンケェ７−ドン，ジュコン アパー トメント 407−1502 Ｆターム(参考） 4B029 AA07 BB02 CC01 DA08 FA12 4B063 QA01 QQ18 QQ61 QR75 QR82 QX04 4B065 AA01X AC20 BB08 BB40 BC50 CA46 CA54

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 測定部、電流検出部および検出された電流変化を記録する記
    録部を含み、前記測定部は、陽極および陰極、前記陽極および陰極の伝導媒体、
    並びに前記両極間のイオン交換膜を含む無媒介体生物燃料電池からなり、前記陰
    極部には電気化学的活性細菌を含有する試料が添加されることを特徴とするＢＯ
    Ｄ測定用バイオセンサー。
  2. 【請求項２】 前記測定部に陰極部の電位を調節する静電位電解装置をさら
    に含むことを特徴とする請求項１記載のＢＯＤ測定用バイオセンサー。
  3. 【請求項３】 陰極と陽極を抵抗を介して連結した後、陰極部には窒素を供
    給して嫌気性条件にし、陽極部には空気を供給して好気性条件に作って、試料中
    に存在する電気化学的活性細菌を前記陰極部に濃化培養し、前記濃化培養された
    電気化学的活性細菌を微生物触媒として利用することによって発生された電流を
    測定することを特徴とする、請求項１または２に記載のＢＯＤ測定用バイオセン
    サーを用いて試料中のＢＯＤを測定する方法。
  4. 【請求項４】 測定部、電流検出部、および検出された電流変化を記録する
    記録部を含み、前記測定部は、陽極および陰極、これら陽極および陰極の伝導媒
    体、並びにこれら両極間のイオン交換膜を含む無媒介体生物燃料電池からなり、
    前記陰極部に所定の有機物を代謝する単一種の電気化学的活性細菌が含まれてい
    ることを特徴とする無媒介体生物燃料電池型有機物濃度測定用バイオセンサー。
  5. 【請求項５】 陽極部には空気を継続して供給して陰極部との電圧差を保持
    させながら、測定したい試料を陰極部に添加し、陰極部に含まれた細菌が試料に
    含まれた有機物を消費する上で生産される電子の流れを測定することによって該
    当有機物の濃度を測定することを特徴とする、請求項４記載のバイオセンサーに
    よる有機物濃度測定方法。
  6. 【請求項６】 陽極および陰極、前記陽極および陰極の伝導媒体、並びに前
    記両極間のイオン交換膜からなる無媒介体生物燃料電池において、陰極部には活
    性スラッジと廃水を添加し、陰極と陽極を抵抗を介して連結した後、陰極部には
    窒素を供給して嫌気性条件にし、陽極部には空気を供給して好気性条件に作って
    、別途の電子受容体無しに活性スラッジと廃水中に存在する電気化学的活性細菌
    を濃化培養する方法。
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