CN1211652C - 一种富集微生物的电化学方法,用于分析有机物和生化需氧量的生物传感器 - Google Patents

一种富集微生物的电化学方法,用于分析有机物和生化需氧量的生物传感器 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种使用无传递器的生物燃料电池在厌氧条件下对样品的有机物浓度或生化需氧量进行电化学测定的生物传感器。该生物传感器利用存在于废水和污泥中并且在生物燃料电池的操作过程中浓密培养的电化学活性细菌作为生物传感器中使用的生物燃料电池的微生物催化剂，用于生化需氧量测定。因此，该生物传感器的操作不需要人工添加微生物，并能根据废水的性质使微生物保持合适的活性。另外，用于生物传感器中的生物燃料电池可以以稳定的方式运行6个月以上。

Description

一种富集微生物的电化学方法，用于分析有机物和 生化需氧量的生物传感器
技术领域
本发明涉及用于测定有机物浓度和生化需氧量的生物传感器。更具体地说，本发明涉及用于测定有机物浓度和生化需氧量的生物传感器，该生物传感器具有简单和快速测定的功能，并且其本身制造、使用、维护和修理所需成本相对较低。
背景技术
一般来说，生物传感器是指一种测量装置，其中有机体或源自有机体的物质用作与电装置结合的测量单元的至少一部分。由于生物传感器能够依靠生物反应的高度专一性对待测物质的浓度和性质进行精确测定的优点，因此从二十世纪六十年代以来人们一直在对其进行研究。并开发了多种生物传感器，其所测物质的范围也在不断地变化。例如，已经实际应用并且广泛使用由结合到氧电极上的葡糖氧化酶构成的葡萄糖浓度测定生物传感器，以及含有抗体的医用生物传感器(参见：Tuner等，1987，Biosensors，Fundamentalsand Applications，Oxford Science Publication)。
同时，工业废水或家庭污水的污染情况一般用化学需氧量(COD)或生化需氧量(BOD)来表示。其快速测定在环境治理和污染防治工业中具有十分重要的作用。但是，现有的体现可磁化微生物有机物的量的测定生化需氧量的方法存在的问题是耗时长，并且需要复杂的程序和装置。而且现有方法存在测定值随操作工人的熟练程度而变化的缺点。另外，这种方法难以用于污染状态需要快速确定时或者用于自动污水处理设施。
为了解决这些问题，提出了几种测定生化需氧量的生物传感器(参见：Hikuma等，1979，European Journal of Microbiology and Biotechnology，8，289；Riedel等，1990，Water Research，24，883；和Hyun等，1993，Biotechnologyand Bioengineering，41，1107)。一般来说，这些生化需氧量生物传感器的结构是在溶解氧测定电极上安装有膜，在该膜上固定有一定的微生物。这些生化需氧量生物传感器与待测样品反应，固定在膜上的微生物将样品中所含有机物磁化并消耗氧。将所得样品中溶解氧的值与对比样品中溶解氧的值进行对比并转化为生化需氧量。但是这些生物传感器存在下列问题：
首先，这些生物传感器使用一种微生物。因此，由于所用微生物的物种专一性，它们对存在于废水中的复杂营养物组分缺乏磁敏感性，从而不能指示生化需氧量的总值。
第二，微生物被固定在多孔膜上。因此膜需要频繁更换或修理以使所测生化需氧量具有高的再现性。但是可固定微生物的膜价格昂贵，因此这种生物传感器不经济，而且可维护性差。
第三，由于需要使用对比样品的溶解氧电极，设备复杂，价格昂贵且失效率高。
第四，这些测定生化需氧量的生物传感器中使用的微生物不能将电子直接传递出来。因此，这些生物传感器需要使用电转移传递器或独立的转换器。
同时，微生物在厌氧环境中的生长通常可以使用电子受体而不是氧。使用这些电子受体的新陈代谢称为微生物的厌氧呼吸。可以在有机物被厌氧呼吸的微生物氧化的氧化作用中使用的电子受体包括氧化铁，硝酸盐，六价锰，硫酸盐，碳酸盐等。如果电子供体相同，在由相应的电子受体和电子供体之间的氧化还原反应产生的能量中，与硝酸盐、硫酸盐和碳酸盐所产生的低的能量水平相比，氧化铁还原成氧化亚铁产生最大水平的能量。该能量水平与氧化还原势相关，氧化还原势是相应电子受体的固有特性(参见：Byoung-Hong，Kim，Microorganism Physiology，Academy Press Co.，Ltd.，Seoul，Korea，1995)。
在厌氧呼吸的金属盐还原的细菌所使用的这些电子受体中，氧化亚铁等在水中的溶解度很低。与需氧微生物所使用的一般电子受体——氧不同，这种难溶的电子受体在微生物细胞中不能吸附或还原。因此，为了还原存在于细胞外的电子受体，在金属盐还原的细菌中，存在特殊形式的电子转移系统。例如Geobacter sulfurreducens和Shewanella putrefaciens，在使用氧化铁作为电子受体的将金属盐还原的细菌中，存在细胞色素，一种电子转移蛋白质。通过该细胞色素，从微生物中的有机物的氧化产生的电子被转移至微生物细胞外面的电子受体。通过使用由该电子转移过程产生的能量，使微生物生长。[参见：Myers and Myers，Journal of Bacteriology，174，3429-3438，(1992)；和Seeliger等，Journal ofBacteriology，180，3686-3691，(1998)]。结果，具有类似特性的这些将金属盐还原的细菌将从有机物的分解代谢产生的电子转移至外部的难溶的电子受体，使改受体被还原。因此，有机物的量将与还原的电子受体的量成比例。而且，当使用适合于电子受体的合适的电极时，电极将用从细菌的内部产生的电子未被还原，直接转移至电极的电子将通过电路向外流动。利用微生物的这种生理学特征的生物燃料电池在韩国专利公开文本No.1998-16777(1998年6月5日)中进行了描述，该文献被结合进本发明作为参考。
在包括使用金属盐还原的细菌的生物燃料电池中，产生的电子的量与细菌的浓度、有机物的量等成比例。因此通过测定产生的电子的量，可以测定样品中存在的有机物的量。
因此，我们一直在研究这种生物燃料电池，以及可用于生物燃料电池中的微生物和有机物。结果完成了本发明。
发明内容
因此本发明的目的是提供一种用于测定生化需氧量的改进的生物传感器，以及使用该传感器测定生化需氧量的方法，且本文所述生物传感器不存在现有的测定生化需氧量的生物传感器的缺点。
本发明的第一方面是提供一种测定生化需氧量的生物传感器，该生物传感器包括测定单元，电流检测单元，和用于记录检测电流的变化的记录单元，测定单元由无传递器的生物燃料电池组成，生物燃料电池包括：分别含有导电介质的阴极隔室和阳极隔室；安置在阳极隔室中的阳极；安置在阴极隔室中的阴极；以及介于阴极隔室和阳极隔室之间用于分隔阳极隔室和阴极隔室的离子交换膜，其中的阳极隔室中加入了含有电化学活性细菌的样品。
本发明的第二方面是提供一种使用上述第一方面的测定生化需氧量的生物传感器测定样品的生化需氧量的方法，该方法包括：将阳极通过电阻电连接到阴极上；向阳极隔室中通入氮气使阳极隔室保持厌氧条件，同时向阴极隔室中通入氧气使阴极隔室保持需氧条件；浓密地培养存在于阳极隔室的样品中的电化学活性细菌；在使用浓密培养的电化学活性的细菌作为微生物催化剂时测定产生的电流。
本发明的第三方面是提供一种用于测定有机物浓度的无传递器的生物燃料电池型生物传感器，该生物传感器包括测定单元，电流检测单元，和用于记录检测电流的变化的记录单元，测定单元由无传递器的生物燃料电池组成，生物燃料电池包括：分别含有导电介质的阴极隔室和阳极隔室；安置在阳极隔室中的阳极；安置在阴极隔室中的阴极；以及介于阴极隔室和阳极隔室之间用于分隔阳极隔室和阴极隔室的离子交换膜，其中阳极隔室含有用于使有机物发生分解的单种类的电化学活性细菌。
本发明的第四方面是提供一种使用上述第三方面的生物传感器测定有机物浓度的方法，该方法包括：向阳极隔室中加入待测样品，同时连续向阴极隔室中通入空气，以使阴极隔室与阳极隔室保持一个电位差；测定由于样品中所含有机物被电化学活性的细菌所消耗而产生的电流，从而测定有机物的浓度。
本发明的第五方面是提供一种使用上述第三方面的生物传感器中所包括的无传递器的生物燃料电池浓密地培养存在于活性污泥和废水中的电化学活性细菌的方法，该方法包括：向阳极隔室中加入活性污泥和废水；将阳极通过电阻电连接到阴极上；向阳极隔室中通入氮气使阳极隔室保持厌氧条件，同时向阴极隔室中通入空气使阴极隔室保持需氧条件；从而不需独立的电子受体而浓密地培养存在于活性污泥和废水中的细菌。
附图说明
通过下列参照附图的具体实施方式的描述，将使本发明的上述的和其它的目的和方面更加清楚，其中：
图1为按照本发明的测定生化需氧量的生物传感器中所使用的生物燃料电池的透视图；
图2为按照本发明实施例1的表示电流与加入到生物燃料电池中的样品的化学需氧量之间相互关系的图；
图3为按照本发明实施例1的表示电量与加入到生物燃料电池中的样品的化学需氧量之间相互关系的图；
图4为按照本发明实施例2的测定生化需氧量的生物传感器的简图，该生物传感器包括使用带有稳压器的微生物浓密培养装置；
图5为按照本发明实施例2的表示电流与加入到生物燃料电池型生物传感器中的样品的化学需氧量之间相互关系的图，所述生物传感器中使用稳压器浓密培养电化学活性细菌；
图6a为按照本发明实施例2的生物燃料电池型生物传感器的工作电极表面的扫描电子显微照片，该显微照片摄于使用生物传感器浓密培养微生物之前；
图6b为按照本发明实施例2的生物燃料电池型生物传感器的工作电极表面的扫描电子显微照片，该显微照片摄于使用生物传感器浓密培养微生物之后；
图7为按照本发明实施例4的用于测定乳酸浓度的生物燃料电池型生物传感器的简图；
图8表示测定乳酸浓度过程中产生的电流的典型增加；
图9为按照实施例4得到的显示乳酸浓度与产生的电流的起始斜率之间相互关系的图；
图10为表示根据样品的化学需氧量的电量的图，其中使用本发明实施例1的测定生化需氧量的生物传感器测定6个月的电量。
实施本发明的最佳方式
本发明涉及能够测定存在于废水中的可磁化微生物组分(BOD)或有机物(如乳酸)的生物传感器。为了实现这种测定，本发明的生物传感器利用有机物磁化力和电化学活性微生物的电子转移能力，而不是利用电子转移传递器或转换器。
在本发明的一种具体实施方式中，测定生化需氧量的生物传感器包括测定单元，电流检测单元，和用于记录检测电流的变化的记录单元。测定单元由无传递器的生物燃料电池组成。这种生物燃料电池包括分别含有导电介质的阴极隔室和阳极隔室。而且该生物燃料电池还包括安置在阳极隔室中的阳极；安置在阴极隔室中的阴极；以及介于阴极隔室和阳极隔室之间用于分隔阳极隔室和阴极隔室的离子交换膜。在阳极隔室中包括了含有电化学活性细菌的样品。
更具体地说，在阳极隔室中，电化学活性细菌通过使用存在于一定样品中的有机物和活性污泥作为菌种(seed sample)而被电化学浓密培养。浓密培养的电化学活性细菌被用作微生物催化剂以产生电力。产生的电力与各种有机物的浓度成比例，所述有机物可被加入到作为测定单元的生物燃料电池中的微生物磁化。因此通过检测和记录产生的电力就可测定样品的生化需氧量。
而且，为了促进测定单元的阳极隔室中的电化学活性细菌的浓密培养，优选使用稳压器。
此处所用的术语“电化学活性细菌”是指可以将由存在于废水中的有机物的氧化而产生的电子放电至其细胞外面，将该电子转移至电极，从而产生电流的细菌。电化学活性细菌的典型例子包括把金属盐还原的细菌。
在本发明的另一种具体实施方式中，用于测定有机物浓度的生物传感器在其本身电极上或电极隔室中含有电化学活性细菌。这种细菌利用一定的有机物作为培养基。含有这种细菌的生物传感器用其本身作为测定单元。这就是说，由于阳极隔室含有使一定的有机物发生分解代谢的电化学活性细菌，由生物燃料电池产生的电力对应于由存在于样品中的一定有机物的分解代谢产生的电力。因此测定产生的电力就可以测定存在于样品中的有机物的浓度。
下面详细描述上述用于测定生化需氧量和有机物浓度的方法。
(1)电化学活性细菌的浓密培养，和用该培养的细菌测定生化需氧量的生物传感器
最近的研究表明，废水中的活性的和厌氧性的污泥含有多种盐还原的细菌，包括大量高浓度的铁还原细菌[参见：Nielsen等，Systematic and AppliedMicrobiology，20，645-651，(1997)；Nielsen等，Water Science and Technology，34，129-136，(1996)；和Rasmussens等，Water Research，28，417-425，(1994)]。
因此，如果其中各种微生物彼此混合的菌种(seed sample)同合适的培养物一起在含有电极的发酵器中厌氧培养，则只有能够使用电极作为电子受体的微生物最终有活力。这些微生物种类具有电子载体如细胞色素，因此具有电化学活性。因此，按照这种方式，有可能在存在于废水和活性污泥中的各种微生物中对具有电化学活性的微生物进行选择性的浓密培养。
同时，由于废水和污水含有各种有机物，因此很难按照统一的方式，即只使用一种微生物，测定废水或污水的生化需氧量。另外，这种测定误差很高。因此在本发明中，将存在于有机废水和活性污泥中的各种电化学活性细菌如上所述进行浓密培养，将浓密培养的活性细菌用作测定单元的生物燃料电池的微生物催化剂，从而产生电力。从产生的电力的量测定样品的生化需氧量。
(2)用生物燃料电池型生物传感器测定有机物浓度
在上述测定生化需氧量的生物传感器的生物燃料电池的阳极隔室中加入一定类型的电化学活性微生物，该电化学活性微生物根据待测培养基的性质来选择。连续向阴极隔室通入空气使其与阳极隔室保持电位差。向阳极隔室中加入待测样品。然后阳极隔室中所含的微生物消耗相应的培养基，同时产生的电子通过阴极隔室流出外电路。测定产生的电流从而测定相应培养基的浓度。按照这种方式，通过使用电化学活性细菌消耗各种培养基，从而测定相应有机物的浓度。
下面参照附图对本发明进行详细说明。
图1为本发明的生化传感器中作为微生物浓密培养装置的生物燃料电池的透视图。参照图1，该装置包括阳极隔室4和阴极隔室5。在这些电极隔室4和5中，分别有阳极1和阴极2。而且在阴极隔室5和阳极隔室4之间插入了一种离子交换膜3用于使这些隔室彼此隔开。
阴极隔室5提供有氧气，以使阴极2与阳极1保持电位差。阳极隔室4通过端口9加入样品(如废水和污泥)，同时阴极隔室5通过端口11加入磷酸盐缓冲溶液或自来水。阳极隔室4也通过端口9提供有氮气以使其保持厌氧条件。阴极隔室通过端口11提供有空气以使电极4和5彼此能够保持电位差。在一定时间后(一般为三星期)，在电极1上粘有用废水作为培养基浓密培养的电化学活性微生物。通过测定由该底物被该微生物氧化所产生的电流，可以测定废水的生化需氧量的增加和降低。在本发明中，电极2和电极1优选由炭毡制造，但这些电极有时也可以由其它材料制造。另外，图1中的标记数字6表示防泄漏硅橡胶膜，标记数字7和8为连接阳极和阴极的接线，标记数字10为样品和氮气的排出口，标记数字12为空气和磷酸盐缓冲溶液的排出口，标记数字13为防护元件，标记数字14为固定螺钉。
图4为用于按照本发明的一种优选的具体实施方式进行微生物的电化学浓密培养的生化需氧量传感器的结构简图。参照图4，生化需氧量传感器包括稳压器，以使生化需氧量传感器的电极保持在恒定电位上。而且，在生化需氧量传感器中，工作电极101作为电子受体，并根据对工作电极101所施电压的变化而改变对微生物的电化学作用。工作电极101由炭毡制成，参比电极113由银/氯化银(Ag/AgCl)制成，辅助电极102由铂制成。参比电极113用于保持和补偿对工作电极101所施用的电压。辅助电极102用于与工作电极101一起构成电路。工作电极101施用恒定电压(一般相对于氯化银参比电极113为+0.98V)，并且工作电极隔室104提供有样品(废水和污泥)。然后电化学活性微生物被浓密培养一定时间(一般为2星期)。结果，图4所示在工作电极101上粘(浓密培养)有微生物的装置本身可用作测定生化需氧量的生物传感器。同时，图4中的标记数字114和112分别表示磁搅拌器和单向阀。图4中未进行描述的其它标记数字将在下面的实施例2中描述。
下面的实施例仅用于描述本发明，而不是对其范围的限定。
                          实施例1
用生物燃料电池浓密培养电化学活性微生物，以及生物燃料电池中的电流随化学需氧量的改变而产生的变化
为了利用存在于一定废水中的有机物作为培养基进行电化学微生物的浓密培养，制造如图1所示的生物燃料电池。
在本实施例中，使用取自淀粉加工厂的废水(从韩国Inchon的SamyangGenex收集)，并用同一工厂中废水处理产生的活性污泥作为接种体。本实施例中使用的生物燃料电池的基本结构参照Bennetto等的文献[参见：Bennetto等，Biotechnology Letters，7，699-704，(1985)]。参照图1，阳极1和阴极2都由炭毡制成并且分别具有5×7.5×0.6cm大小。而且电极1和2用铂导线作为电线。此处所用的由标记数字4标记的术语“阳极隔室”是指其中微生物或微生物的电子载体被阳极1氧化的区域。由标记数字5标记的术语“阴极隔室”是指其中通过外部电路迁移的电子将阴极2中的氧化剂还原的区域。阳极隔室4和阴极隔室5被离子交换膜3彼此隔开，并通过外部电路进行电连接。在此情况下，在外部电路连接合适的电阻可以控制阴极2与阳极1之间的电流的流动。阴极隔室5(工作容积：30毫升)提供有空气，同时阳极隔室4(工作容积：30毫升)中加入有由废水和污泥组成的样品。当样品加入到阳极隔室4中后，阴极2和阳极1通过电阻进行电连接。然后阳极隔室4中通入氮气使其保持厌氧条件，同时阴极隔室中通入空气使其保持需氧条件。在这些电极保持在相应条件的情况下，开始微生物的浓密培养。在浓密培养大约3星期后，保持背景电流为恒定水平。此时向阳极隔室4中加入具有一定生化需氧量值的废水，并对产生的电流的总量求积分。当产生的电流显示为基准值时，向生物燃料电池中加入另一种待测化学需氧量的废水。如图2所示，箭头指示样品的化学需氧量值，产生的电量的增加与加入的废水的化学需氧量成比例。而且，如图3所示，产生的电量的增加与加入的样品的化学需氧量的增加成比例。
同时，在制造的测定生化需氧量的传感器操作6个月时，每个月向生化需氧量传感器中分别加入具有50ppm化学需氧量的样品和具有100ppm化学需氧量的样品，并测定产生的电量。如图10所示，产生的电量保持在恒定水平，很少或者没有变化。结果证明，不管传感器的操作周期如何，产生的电量根据加入样品的化学需氧量值而保持在一个恒定的水平。
实施例2
用包括稳压器的生物燃料电池浓密培养电化学活性微生物，以及电流随化学需氧量的变化
为了对电化学活性微生物进行有效的浓密培养，制造如图4所示的生物传感器。参照图4，该生物传感器包括由耐热玻璃制成并具有500毫升容积的电化学池100。在其中微生物将被浓密培养的一部分电化学池100上，安装连接有稳压器的由炭毡制成的工作电极101。而电化学池的另一部分安装有由铂导线制成的辅助电极102以形成电路。具有工作电极101的工作电极部分104与具有辅助电极102的辅助电极部分彼此由透析横隔膜隔开。工作电极部分104和辅助电极部分105加入具有相同化学需氧量值的废水。为了使工作电极保持恒定电位，在电化学池100中还安装有参比电极113。工作电极101的电位通过稳压器调节。在电化学池100的边上有用于加入和排出样品的端口109。向电化学池100中提供氮气使其保持厌氧条件。为此，当需要连续加入样品时，氮气加入口110和氮气排出口111的安装也可以用作样品的输入和排出口。工作电极101和辅助电极102之间的电位和电流的变化通过稳压器放大并用使用计算机的记录单元和使用记录纸的记录仪进行记录。为了微生物的浓密培养，工作电极部分104加入有活性污泥作为接种体，然后操作稳压器使得工作电极101保持在一个固定的电位。从而开始微生物的浓密培养。在本实施例中，使用淀粉加工厂的废水(从韩国Inchon的Samyang Genex收集)作为废水和活性污泥。当废水和活性污泥加入到工作电极部分104并且工作电极101固定在+0.98V以后开始浓密培养。在试验开始后运行14天时，工作电极101与辅助电极102之间的电流从大约50微安增加至最大的322微安。在操作开始后18天时，电流稳定在大约154微安。当电流稳定时，通过样品加入口109加入另一种具有不同化学需氧量值的废水导致电流值的增加，类似于图2。当通过样品加入口109和氮气排出口110连续加入和排出废水时，监测工作电极101与辅助电极102之间的电流。由此可证明电流随废水的化学需氧量的改变而变化，如图5所示。因此可以发现，使用图4所示生物传感器可以连续测定生化需氧量。而且，在生物传感器变质以后对电极进行了扫描电子显微镜观察。通过该观察可以证明，大量的微生物粘附在电极上，图6a和图6b分别为使用前后拍摄的电极表面的显微照片。另外，对从该电极上分离出的微生物进行培养后通过循环伏安法进行检测。发现该微生物是电化学活性的。
                          实施例3
存在于生物燃料电池型生化需氧量传感器的阳极和阴极隔室中的金属还原细菌数量的变化
在实施例2中使用的生物燃料电池型生化需氧量传感器的浓密培养和操作期间从阳极和阴极隔室收集样品，并进行铁还原细菌的菌落数检测。在本实施例中，使用基于磷酸盐缓冲溶液的介质(PBBM)作为介质。将下列组分加入到该介质中制备板极介质：1g/L的酵母浸出物，1g/L的氯化铵，25ml/L的宏矿质(macromineral)(II)(每1L包括：6克KH2PO4，12克NaCl，2.4克MgSO4·7H2O和1.6克CaCl2·2H2O)，2ml/L的微量元素(microelements)(包括：12.8克硝基乙酸，0.1克FeSO4·7H2O，0.1克MnCl2·4H2O，0.17克CoCl2·6H2O，0.1克CaCl2·2H2O，0.1克ZnCl2，0.02克CuCl2·H2O，0.1克H3BO3，0.01克钼酸盐，1.0克NaCl，0.017克Na2SeO3和0.026克NiSO4·6H2O)，0.1ml/L的维他命溶液(包括：0.002克维生素H，0.002克叶酸，0.010克B6(吡哆辛)HCl，0.005克B1(硫胺)HCl，0.005克B2(核黄素)HCl，0.005克烟酸，0.005克panthothenic酸，0.0001克B12(氰钴胺)结晶，0.005克PABA，和0.005克硫辛酸)，1ml/L的刃天青(0.2％)，和1.8％的琼脂。
分别使用20mM乙酸，30mM乳酸和20mM葡萄糖作为电子供体，并用20mM的焦磷酸铁(一种水溶性铁)作为电子受体。在第一次测定中，在反应的早期阶段就生物燃料电池的需氧污泥和厌氧污泥的相应样品用生理盐水溶液(0.85％)稀释，然后测定每毫升溶液的菌落形成单位。使用第一次测定中的相同介质和方法分别在反应后的一个月和二个月进行第二次和第三次测定。结果列于下面的表1中。
                    表1：生物燃料电池的阳极隔室中菌落数的变化
样品      电子供体      电子受体    第一次       第二次        第三次
          (mM)          (mM)
需氧污泥  乙酸(20)      FP(20)      2.8×107    0.9×104    5.1×103
          葡萄糖(20)    FP(20)      8.0×107    1.3×105    4.2×104
          乳酸(30)      FP(30)      6.4×107    1.1×105    4.1×104
厌氧污泥  乙酸(20)      FP(20)      3.6×105    5.4×106    1.5×105
          葡萄糖(20)    FP(20)      2.1×105    8.4×106    1.4×106
          乳酸(30)      FP(20)      1.7×105    1.5×106    2.3×105
FP：焦磷酸铁
上述表1证明，在需氧污泥样品的情况下，可以相信，由于生物燃料电池的阳极隔室保持在厌氧条件下，兼性厌氧菌株以外的菌株应当被掩蔽时持续还原，使得只有电化学活性的微生物被浓密培养。在厌氧污泥样品的情况下，在第二次测定时厌氧细菌增加，而在第三次测定时减少，因此只有电化学活性的微生物被浓密培养。
                            实施例4
使用Shewanella putrefaciens的燃料电池型生物传感器测定乳酸浓度
为了测定乳酸浓度，使用Shewanella putrefaciens IR-1(一种铁还原细菌)制造如图7所示生物传感器。这种菌株可以从Korean Collection for TypeCultures，Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology获得，登记号为KCTC 8753P。这种细菌具有通过使用在乳酸氧化成乙酸的氧化过程中产生的还原力将氧化亚铁还原的能力。
参照图7，生物传感器包括池200，其中包括阳极隔室204和阴极隔室205。阳极隔室204和阴极隔室205被阳离子交换膜203隔开，并分别包括阳极201和阴极202。具有20毫升容积的阴极隔室205中加入含有0.1M氯化钠的0.05M磷酸盐缓冲溶液。阳极隔室204通过氮气加入口211通入氮气。标记数字210表示氮气排出口。阳极隔室204中还加入Shewanellaputrefaciens IR-1(干基重：5mg)和19毫升含有0.01M氯化钠的0.05M磷酸盐缓冲溶液。阳极201由具有0.8cm×4cm×0.3cm大小的炭毡制成，阴极202由具有3cm×3cm×0.3cm大小的网状玻璃碳制成。阳极201和阴极202通过一个电阻器(500Ω)彼此电连接。在此情况下，用电压测定仪测定穿过电阻器的电压的变化，并转换为二个电极之间的电流，电流通过扫描器放大以使记录单元能够操作。记录单元记录电流(电压)的变化。工作温度保持在25℃。当背景电流稳定后，通过样品加入口209向生物燃料电池中加入1毫升含有不同浓度乳酸的相应样品。记录电流随时间的变化而变化，并得到电流的起始斜率。图7中的标记数字214表示磁搅拌器。
当向生物传感器中加入合适浓度的乳酸时产生的电流的起始斜率与乳酸的浓度成比例。这表明，由于乳酸被微生物氧化而产生的电子向电极移动，并且在恒定的微生物浓度下乳酸浓度与产生的电子的量成比例。图8描述了电流随着乳酸的加入的典型增加，图9描述了随着乳酸浓度的变化的电流起始斜率。起始电流斜率与乳酸浓度的关联系数为0.84。通过改变生物传感器的构造例如微生物的性质和浓度、电极的材料和大小、电阻等，可以改善该关联系数。
工业实用性
从前面的描述可以看出，本发明的生物传感器利用存在于废水和污泥中并且在生物燃料电池的操作过程中浓密培养的电化学活性细菌作为生物传感器中使用的生物燃料电池的微生物催化剂，用于生化需氧量测定。因此，本发明的生物传感器的操作不需要人工添加微生物，并能根据废水的性质使微生物的活性保持在一个合适的水平。而且，它能连续进行废水的生化需氧量的测定。另外，用于本发明的测定生化需氧量的生物传感器中的生物燃料电池可以以稳定的方式运行6个月以上。
虽然为了描述本发明而公开了本发明的优选的具体实施方式，但是本领域技术人员可以理解，在不背离权利要求书所公开的范围和精神的前提下可以对其进行各种改进、添加和替换。

Claims (5)

1、一种测定生化需氧量的生物传感器，该生物传感器包括测定单元，电流检测单元，和用于记录检测电流的变化的记录单元，测定单元由无传递器的生物燃料电池组成，生物燃料电池包括：
分别含有导电介质的阴极隔室和阳极隔室；
安置在阳极隔室中的阳极；
安置在阴极隔室中的阴极；和
介于阴极隔室和阳极隔室之间用于分隔阳极隔室和阴极隔室的离子交换膜，其中的阳极隔室中加入了含有电化学活性细菌的样品。
2、如权利要求1所述的测定生化需氧量的生物传感器，其中所述测定单元进一步包括一种用于控制阳极隔室的电位的稳压器。
3、一种用于测定有机物浓度的无传递器的生物燃料电池型生物传感器，该生物传感器包括测定单元，电流检测单元，和用于记录检测电流的变化的记录单元，测定单元包括：
分别含有导电介质的阴极隔室和阳极隔室；
安置在阳极隔室中的阳极；
安置在阴极隔室中的阴极；
介于阴极隔室和阳极隔室之间用于分隔阳极隔室和阴极隔室的离子交换膜，其中阳极隔室包括含有单种类的用于使有机物发生分解的电化学活性细菌的样品。
4、一种使用如权利要求3所述的生物传感器测定有机物浓度的方法，该方法包括：
向阳极隔室中加入待测样品，同时连续向阴极隔室中通入空气，以使阴极隔室与阳极隔室保持一个电位差；和
测定由于样品中所含有机物被电化学活性细菌所消耗而产生的电流，从而测定有机物的浓度。
5、一种使用如权利要求3所述的生物传感器中所包括的无传递器的生物燃料电池浓密地培养存在于活性污泥和废水中的电化学活性细菌的方法，该方法包括：
向阳极隔室中加入活性污泥和废水；
将阳极通过电阻电连接到阴极上；
向阳极隔室中通入氮气使阳极隔室保持厌氧条件，同时向阴极隔室中通入空气使阴极隔室保持需氧条件；从而不需独立的电子受体而浓密地培养存在于活性污泥和废水中的细菌。
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