JP2003325189A - ヒト腸Ｎｐｔ２Ｂ - Google Patents

ヒト腸Ｎｐｔ２Ｂ

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JP2003325189A
JP2003325189A JP2003083145A JP2003083145A JP2003325189A JP 2003325189 A JP2003325189 A JP 2003325189A JP 2003083145 A JP2003083145 A JP 2003083145A JP 2003083145 A JP2003083145 A JP 2003083145A JP 2003325189 A JP2003325189 A JP 2003325189A
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protein
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Paul David Cannon
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Suryanarayana Sankurati
サンクラティ サリアナラヤナ
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F Hoffmann La Roche AG
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、新規なイオン輸送体、特にリン酸
ナトリウム共輸送体を提供することを課題とする。 【解決手段】 腸上皮細胞の先端表面で発現される新し
いヒトリン酸ナトリウム共輸送体（huNpt2B）とそれに
関係するポリペプチド、ならびにこれをコードする核酸
組成物を提供する。本ポリペプチドおよび核酸組成物
は、研究、診断、および治療薬スクリーニングへの施用
を含む様々な異なる施用例において使用できる。また、
宿主におけるNpt2B活性阻害法、およびNpt2B活性に関連
する疾患状態の治療法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明の分野はイオン輸送
体、特にリン酸ナトリウム共輸送体である。
【０００２】
【従来の技術】リンは膜構造、輸送およびエネルギー貯
蔵において重要な役割を果たしている。正常な生理学的
pH（例えばpH7.4）では、血漿中の無機リン（Pi）はHPO
4 2-とH 2PO4 -の4：1の混合物で構成されている。体内に
存在する700gのリンのうち、0.1%は細胞外液中で自由に
拡散できる形で存在している。Piの血漿濃度は、ビタミ
ンDの影響による小腸でのPi吸収の制御と、副甲状腺ホ
ルモンの影響による腎臓でのPi排出の制御によって維持
される。
【０００３】Piの吸収には経上皮輸送が必要である。Pi
の経上皮輸送の重要な段階はPiの上皮細胞への取り込み
である。Piの取り込みは、適当な上皮細胞、例えば腸お
よび腎上皮細胞の先端表面に存在するリン酸ナトリウム
共輸送体により達成される。様々なリン酸ナトリウム共
輸送体が今日までに同定されており、NaPi-1（ウサ
ギ）、NPT1（ヒト）、Npt1（マウス）、NaPi-2（ラッ
ト）、NaPi-3（ヒト）、NaPi-4（オポッサム）、NaPi-5
（フラウンダー）、NaPi-6（ウサギ）、NaPi-7（マウ
ス）、およびNBL-1細胞のNaPi（ウシ）が含まれる。
【０００４】様々な疾患の状態がPi代謝障害に関連して
おり、このような疾患の状態には、例えば骨軟化症、低
カルシウム尿症およびくる病といった低リン酸血症を特
徴とするもの、例えば上皮小体機能亢進症、低カルシウ
ム血症、ビタミンD欠乏症、軟部組織または転移性石灰
化等といった高リン酸血症を特徴とするものが含まれ
る。特に、高リン酸血症は腎臓病および腎不全に特徴的
で、このような腎臓合併症で観察される有害な症状の多
くの基礎的原因である。
【０００５】Pi代謝の異常を治療する方法は多様であ
る。例えば、低リン酸血症に関連する疾患状態に対して
は、治療法として、リンが豊富な食品を含む食事への変
更、リン塩の補給、治療薬、例えばジピリダモールの使
用等が含まれる。高リン酸血症に関連する疾患状態に対
し、腎不全が認められない場合の治療には、水分補給お
よび／または腸管腔でリンと結合するアルミニウムを主
薬とする制酸剤の使用が含まれる。腎不全が認められる
場合は、リン酸塩結合剤および／またはリンの摂取を制
限するための食事変更が有用となる可能性があるが、一
般的には透析が用いられる。
【０００６】Pi代謝異常を特徴とする疾患の状態は多様
性が高いため、Pi代謝を担う分子成分の同定に継続的に
興味が寄せられている。特に興味が持たれるのは、腸に
おけるPiの吸収および取り込みを担う腸輸送体の同定で
ある。
【０００７】関連する文献として次のものが挙げられ
る。Hilfikerら、Proc. Nat'l Acad.Sci. USA (1988) 9
5:14564〜14569はマウスNpt2B核酸配列を開示してい
る。同様に興味深いものに、Smithkline Beecham Pharm
aceuticals, 709 Swedeland Road, King of Prussia, P
A 19406が1998年12月7日に提出し、GenBank登録番号407
1357で1998年12月24日に発行された、Feildら、「ヒト
小腸および肺で発現されるナトリウム依存性リン酸塩輸
送体イソフォームのクローニングと特性分析(Cloning a
nd Characterization of a Sodium Dependent Phosphat
e Transporter Isoform Expressed in Human Small Int
estine and Lung)」がある。リン酸ナトリウム共輸送体
について開示している文献には、Wernerら、Proc. Nat'
l Acad. Sci.USA (1991) 88:9608〜9612、Chongら、Gen
omics (1993) 18:355〜359、Chongら、Am. J. Physiol.
(1995) 268: F1038〜F1045、Magagninら、Proc. Nat'l
Acad. Sci. USA (1993) 90:5979〜5983、Sorribasら、
J. Biol. Chem. (1994) 269:6615〜6621、Wernerら、A
m. J. Physiol. (1995) 267: F311〜F317、Verriら、A
m. J. Physiol. (1995) 268: F626〜F633、Collinsら、
FASEB J. (1994) 8:862〜868、およびHelpsら、Eur. J.
Biochem. (1995) 228:927〜930が含まれる。
【０００８】同様に興味深いものに国際公開公報第98/3
7198号がある。
【０００９】リン代謝におけるリン酸ナトリウム共輸送
体の役割に関する基礎情報を提供する文献には、Tenenh
ouse、J. Bone Min. Res. (1997) 12: 159、およびハリ
ソン内科学の原理(Harrison's Principle of Internal
Medicine)、第14版（1998）pp2259〜2363がある。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、新規なイオ
ン輸送体、特にリン酸ナトリウム共輸送体を提供するこ
とを課題とする。
【００１１】新規なヒト腸リン酸ナトリウム共輸送体
（すなわちNpt2B）とそれに関係するポリペプチド、な
らびにこれをコードする核酸組成物が提供される。本ポ
リペプチドおよび／または核酸組成物は、研究、診断、
および治療薬スクリーニング／発見／調製への施用を含
む様々な異なる施用例において使用できる。また、腸Np
t2Bの機能に関連する疾患の状態、例えば低リン酸血症
および高リン酸血症などの血清リン酸塩濃度の異常を来
す状態の治療法も提供される。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明を詳細に述べる前
に、発明の特定の態様は変更することが可能で、変更し
た方法も請求の範囲内であるため、本発明が以下に述べ
る特定の態様に制限されるものではないことを理解され
たい。また、用いる用語は特定の態様を説明するための
もので、これらを制限するものではないことも理解され
たい。代わりに、本発明の範囲を請求の範囲で設定す
る。
【００１３】本明細書および請求の範囲において、単数
形の語は文脈から明らかにそうではないことが示されな
い限り複数のものも含む。別に規定されない限り、本明
細書で用いるすべての専門用語および科学用語は、本発
明が属する技術分野の当業者に一般に理解されているも
のと同じ意味を有する。
【００１４】本発明に係るポリペプチドにおいては、
（１）配列番号:1と実質的に同一のアミノ酸配列を有す
るNpt2Bポリペプチドであることを特徴とする。
【００１５】また、本発明に係るポリペプチドにおいて
は、（２）上記(1)記載のポリペプチドと少なくとも90%
同一のNpt2Bポリペプチドであることを特徴とする。
【００１６】また、本発明に係るポリペプチドにおいて
は、（３）配列番号:1のアミノ酸配列を含む、上記(1)
または(2)のいずれか一項記載のNpt2Bポリペプチドであ
ることを特徴とする。
【００１７】また、本発明に係るポリペプチドにおいて
は、（４）リン酸ナトリウム共輸送活性を有する、上記
(1)から(3)のいずれか一項記載の蛋白質またはポリペプ
チドであることを特徴とする。
【００１８】また、本発明に係るポリペプチド断片にお
いては、（５）上記(1)から(4)のいずれか一項記載のNp
t2Bポリペプチドの断片であることを特徴とする。
【００１９】また、本発明に係る核酸においては、
（６）上記(1)から(5)のいずれか一項記載の蛋白質また
はポリペプチドをコードする核酸であることを特徴とす
る。
【００２０】また、本発明に係る核酸においては、
（７）配列番号:2の核酸配列と実質的に同一の核酸配列
を有する、上記(6)記載の核酸であることを特徴とす
る。
【００２１】また、本発明に係る核酸断片においては、
（８）上記(6)または(7)記載の核酸の断片であることを
特徴とする。
【００２２】また、本発明に係る核酸においては、
（９）ストリンジェントな条件下で上記(6)から(8)のい
ずれか一項記載の核酸またはその相補配列にハイブリダ
イズする、単離された核酸またはその擬似体であること
を特徴とする。
【００２３】また、本発明に係る発現カセットにおいて
は、（１０）発現宿主中で機能する転写開始領域と、該
転写開始領域の転写調節下で上記(6)から(9)のいずれか
一項記載の核酸に認められるヌクレオチド配列を有する
核酸と、該発現宿主中で機能する転写終結領域とを含む
発現カセットであることを特徴とする。
【００２４】また、本発明に係る細胞においては、（１
１）宿主細胞中に導入した結果、染色体外要素の一部と
しての、または該宿主細胞のゲノム中に取り込まれた、
上記(10)記載の発現カセットを含む細胞であることを特
徴とする。
【００２５】また、本発明に係る細胞においては、（１
２）上記(10)または(11)記載の宿主細胞の後代細胞であ
ることを特徴とする。
【００２６】また、本発明に係る方法においては、（１
３）Npt2Bの製造方法であって、該Npt2Bを発現する上記
(11)または(12)記載の細胞を増殖させることと、他の蛋
白質を実質的に含まない該Npt2Bを単離することとを含
む方法であることを特徴とする。
【００２７】また、本発明に係る抗体においては、（１
４）Npt2Bに特異的に結合するモノクローナル抗体であ
ることを特徴とする。
【００２８】また、本発明に係る抗体においては、（１
５）Npt2Bの機能を阻害する上記(14)記載の抗体である
ことを特徴とする。
【００２９】また、本発明に係る抗体においては、（１
６）ヒト化抗体である上記(14)または(15)記載のモノク
ローナル抗体であることを特徴とする。
【００３０】また、本発明に係る方法においては、（１
７）宿主中でNpt2Bを調節する方法であって、該宿主にN
pt2B調節物質の有効量を投与することを含む方法である
ことを特徴とする。
【００３１】また、本発明に係る使用においては、（１
８）宿主中でNpt2Bを調節するための医薬品の製造を目
的とするNpt2B調節物質の使用であることを特徴とす
る。
【００３２】また、本発明に係る方法においては、（１
９）Npt2B調節物質を同定するためのスクリーニング法
であって、リンアニオン存在下、細胞表面で機能性Npt2
Bを発現する細胞を候補物質と接触させることと、該細
胞によるリンアニオンの取り込み量を定量することとを
含む方法であることを特徴とする。
【００３３】また、本発明に係る方法においては、（２
０）リンアニオンが検出可能なラベルで標識されてい
る、上記(19)記載の方法であることを特徴とする。
【００３４】また、本発明に係る方法においては、（２
１）ラベルが同位体である、上記(19)または(20)記載の
方法であることを特徴とする。
【００３５】また、本発明に係る動物モデルにおいて
は、（２２）Npt2Bを発現可能なヒト以外のトランスジ
ェニック動物モデルであることを特徴とする。
【００３６】また、本発明に係る使用においては、（２
３）Npt2B調節物質をスクリーニングするための上記(1)
から(5)のいずれか一項記載の蛋白質またはポリペプチ
ドの使用であることを特徴とする。
【００３７】
【発明の実施の形態】ポリペプチド組成物 腸上皮細胞で発現される新規のヒトリン酸ナトリウム共
輸送体（すなわちNpt2B）、ならびにそれに関係するポ
リペプチド組成物が提供される。ポリペプチド組成物と
いう用語は本明細書では、ヒト蛋白質全長ならびにその
一部または断片の両方を意味する。また、この用語には
天然ヒト蛋白質の変種も含まれ、以下に詳細に記載する
とおり、このような変種は天然蛋白質と相同または実質
的に類似である。本発明の下記の説明中、Npt2Bという
用語は本発明の野生型ヒト腸リン酸ナトリウム共輸送体
分子を指して用いる。
【００３８】本発明のNpt2B蛋白質は、多くの経膜領域
を有する膜蛋白質で、アミノ酸配列に基づく経膜領域の
推定数は10である（TMbase（膜上蛋白質セグメントのTm
base-Adatabase。Biol. Chem. Hoppe-Seyler 347, 16
6）に基づくTMpred（www.Ch.embnet.org）を用いて予
測）。Npt2BはII型リン酸ナトリウム共輸送体である。
天然の環境では、Npt2Bはナトリウムカチオンとリン酸
アニオンの共輸送体である。Npt2Bは、数ある部位の中
でも腸上皮細胞の表面、すなわち上皮細胞の先端つまり
腸管腔側に発現され、それにより腸管腔から腸上皮細胞
へナトリウムおよびリン酸イオンを輸送する。Npt2bは
また、肺II型肺胞細胞でも発現され、そこでムチン糖蛋
白質合成の需要増大に応ずるためのリン酸塩の細胞への
輸送に関わると考えられる。Npt2Bは、Chongら、「ヒト
腎リン酸ナトリウム輸送蛋白質をコードするcDNAの分子
クローニングと染色体6p21.3-p23への割当てMolecular
cloning of the cDNA encoding a human renal sodium
phosphate transport proteinand its assignment to c
hromosome 6p21.3-p23」、Genomics (1993) 18: 355〜3
59に記載のヒトNPT1と23%のアミノ酸配列同一性を示
し、Maganinら、「ヒトおよびラット腎皮質Na／Pi共輸
送の発現クローニングExpression Cloning of Human an
d Rat Renal Cortex Na/Pi co-transport」、Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA(1993) 90: 5979〜5983に記載のヒト
Npt2aと52.5%の同一性を示す（D. G. HigginsおよびP.
M. Sharp.マイクロコンピューターによる高速で感度の
高い複数配列決定Fast and Sensitive multiple Sequen
ce Alignments on a Microcomputer.(1989) CABIOS, 5:
151〜153に記載のクラスターアルゴリズムを用いてMeg
Align、DNAstar（1998）により測定。用いたパラメータ
ーは、ktuple 1、gpaペナルティ3、ウィンドウ5、およ
び保存対角線5）。Npt2Bの他の特徴には、細胞外ループ
上の潜在的グリコシレーション部位がある。
【００３９】Npt2Bは図1に示すアミノ酸配列を有してお
り、配列番号:1とされている。Npt2Bはそのアミノ酸配
列から分子量約75kDaで、もっと厳密に言えば75598.52
ダルトンである（H. Nakashimaら、p蛋白質の折りたた
み型はアミノ酸組成に関係しているThe Folding Type o
f a pProtein is Related to the Amino Acid Composit
ion. J. Biochem (Tokyo) 99: 153〜162に従い、Protea
n/DNAstar（1997）を用いて測定した）。Npt2Bの真の分
子量はグリコシレーションおよび／または蛋白質の翻訳
後修飾によって異なることがある。このように、Npt2B
の実際上の分子量は約70から130kDaの範囲内と考えられ
る。
【００４０】本発明の野生型配列と配列が異なるNpt2B
相同体または蛋白質（もしくはその断片）も提供され
る。相同体という用語により、本発明のNpt2B蛋白質と
少なくとも約35%、一般的には少なくとも約40%、そして
より一般的には少なくとも約60%のアミノ酸配列同一性
を有する蛋白質を意味する（D. G. HigginsおよびP. M.
Sharp.マイクロコンピューターによる高速で感度の高い
複数配列決定Fast and Sensitive multiple Sequence A
lignments on a Microcomputer. (1989) CABIOS,5: 151
〜153に記載のクラスターアルゴリズムを用いたMegAlig
n、DNAstar（1998）による。用いたパラメーターは、kt
uple 1、gpaペナルティ3、ウィンドウ5、および保存対
角線5）。
【００４１】また、ヒトNpt2Bと実質的に同一のNpt2B蛋
白質も提供され、ただし、実質的に同一という表現によ
り、蛋白質がNpt2Bの配列と少なくとも約60%、一般的に
は少なくとも約65%、そしてより一般的には少なくとも
約70%のアミノ酸配列同一性を有することを意味する。
【００４２】本発明の蛋白質は非天然環境に存在してお
り、例えば天然環境から分離されている。特定の態様に
おいて、本蛋白質は天然環境に比べて本蛋白質が濃縮さ
れた組成物として存在する。例えば、精製したNpt2Bが
提供され、ただし、精製したという表現により、Npt2B
が実質的にNpt2B以外の蛋白質を含まない組成物として
存在することを意味し、実質的に含まないという表現に
より、組成物の90%未満、一般的には60%未満、そしてよ
り一般的には50%未満がNpt2B以外の蛋白質からなること
を意味する。また、本発明の蛋白質は単離物として存在
してもよく、単離物は蛋白質が実質的に他の蛋白質なら
びにオリゴ糖、ポリヌクレオチド、およびその断片など
の他の天然生体分子を含まない蛋白質を意味し、ただし
この場合の「実質的に含まない」という用語は、単離蛋
白質を含む組成物の70%未満、一般的には60%未満、そし
てより一般的には50%未満が蛋白質の天然生体分子であ
ることを意味する。特定の態様において、蛋白質は実質
的に純粋な形で存在し、ただし「実質的に純粋な形」は
少なくとも95%、一般的には少なくとも97%、そしてより
一般的には少なくとも99%の純度であることを意味す
る。
【００４３】天然蛋白質に加えて、天然蛋白質と異なる
ポリペプチド、例えばNpt2Bポリペプチドも提供され
る。Npt2Bポリペプチドは、以下に詳細に記載するNpt2B
をコードする遺伝子のオープンリーディングフレーム
（ORF）によりコードされるアミノ酸配列を意味し、Npt
2B蛋白質全長とその断片、特に生物活性のある断片およ
び／または機能領域、例えば経膜領域などに対応する断
片を含み、他の蛋白質またはその一部と本ポリペプチド
の融合物を含む。関心対象となる断片は、典型的には少
なくとも約10aaの長さで、一般的には少なくとも約50aa
の長さ、そして300aa以上の長さであることもあるが、
一般的には約1000aaの長さを超えることはなく、この断
片は少なくとも約10aa、そして一般的には少なくとも約
15aa、また多くの態様では少なくとも約50aaの長さの本
蛋白質と同一のアミノ酸伸長部を有する。
【００４４】本蛋白質およびポリペプチドは天然原料か
ら得る、または合成的に産生することができる。例え
ば、Npt2Bは一般に腸の上皮細胞由来であるが、Npt2Bの
発現が認められる他の細胞型または組織、例えば肺など
に由来することもある。本蛋白質は合成的手段、例え
ば、以下に詳細に記載するとおり、適当な宿主中で関心
対象蛋白質をコードする組換え遺伝子を発現させること
により得ることもできる。いかなる簡便な蛋白質精製法
を用いることもできるが、ただし適当な蛋白質精製法が
蛋白質精製の手引き（Guide to Protein Purificatio
n）（Deuthser編）（Academic Press, 1990）に記載さ
れている。例えば、溶解産物を原料、例えば腸上皮細胞
または発現宿主から調製した後、HPLC、排除クロマトグ
ラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフ
ィー等を用いて精製することができる。
【００４５】核酸組成物 Npt2B蛋白質をコードする核酸組成物、またはその断
片、ならびに本発明のNpt2B相同体も提供される。Npt2B
核酸組成物は、Npt2Bをコードするオープンリーディン
グフレームを有するDNA配列、すなわちNpt2B遺伝子を含
む組成物を意味し、適当な条件下でNpt2Bとして発現可
能である。またこの用語には、Npt2B蛋白質をコードす
る核酸と相同または実質的に類似もしくは同一の核酸も
含まれる。したがって、本発明は、本発明のヒトNpt2B
をコードする遺伝子およびその相同体を提供する。ヒト
Npt2B遺伝子は図2および3に示す該核酸配列を有してお
り、下記の配列番号:2とされている。
【００４６】相同遺伝子の起源はいかなる種でもよく、
例えば霊長類、特にヒト、ラットやマウスなどの齧歯
類、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、酵母、線虫など
でもよい。哺乳類の間、例えばヒトとマウスの間では、
相同体には核酸配列に実質的な配列の類似性があり、例
えば少なくとも75%のヌクレオチド配列同一性、一般的
には少なくとも90%、より一般的には少なくとも95%の同
一性がある。配列の類似性は基準配列に基づいて計算さ
れ、この基準配列は保存モティーフ、コード領域、隣接
領域などのより大きな配列のサブセットであってもよ
い。基準配列は一般的には少なくとも約18ntの長さ、よ
り一般的には少なくとも約30ntの長さで、比較しようと
する全配列まで拡大してもよい。配列分析のアルゴリズ
ムは、Altschulら(1990), J. Mol. Biol. 215:403〜10
に記載のBLAST（既定値使用）など、当技術分野では周
知である。本明細書で提示する配列は、Npt2B関連およ
び相同蛋白質、ならびにこれらをコードする核酸をデー
タベース検索で認識するために必要不可欠である。
【００４７】本発明のNpt2B蛋白質およびNpt2Bポリペプ
チドをコードする核酸は、cDNAもしくはゲノムDNAまた
はその断片であってもよい。「Npt2B遺伝子」という用
語は、特定のNpt2B蛋白質およびポリペプチドをコード
するオープンリーディングフレームと、Npt2Bイントロ
ン、ならびにコード領域の外側でこれに隣接する約20kb
までの発現調節に関与する5'および3'非コード核酸配列
であるが、いずれかの方向にさらに長い可能性もある配
列を意味すると企図される。この遺伝子は染色体外維持
のため、または宿主ゲノムへの挿入のために、適当なベ
クターに導入してもよい。
【００４８】「cDNA」という用語は本明細書では、天然
の成熟mRNA種で認められる配列要素の並び方が同じすべ
ての核酸を含むと企図され、ただし配列要素はエキソン
と5'および3'非コード領域である。通常は、mRNA種は隣
接するエキソンを有し、介在イントロンを有する場合も
あるが、これはNpt2B蛋白質をコードする連続的なオー
プンリーディングフレームを作るために核RNAスプライ
シングにより除去される。
【００４９】関心対象となるゲノム配列は、列挙した配
列中で定義されている開始コドンと停止コドンとの間に
ある核酸を含み、本来の染色体に通常存在するすべての
イントロンを含む。これはさらに、成熟mRNA中に認めら
れる5'および3'未翻訳領域も含んでいてもよい。またさ
らに、プロモーター、エンハンサーなどの特定の転写お
よび翻訳調節配列も含んでいてもよく、転写された領域
の5'または3'いずれかの末端の、約1kbまたはそれより
長いこともありうる、隣接するゲノムDNAを含む。ゲノ
ムDNAは100kbp以下で、隣接する染色体配列を実質的に
含まない断片として単離され得る。3'または5'いずれか
のコード領域に隣接するゲノムDNA、またはイントロン
中に認められることがある内部調節配列は、適当な組織
および段階特異的発現に必要な配列を含む。
【００５０】本発明の核酸組成物は本Npt2B蛋白質のす
べて、または一部をコードすることができる。通常の方
法によるオリゴヌクレオチドの化学的合成、制限酵素で
の消化、PCR増幅などにより、DNA配列から二本鎖または
一本鎖断片を得ることができる。たいてい、DNA断片は
少なくとも15nt、一般的には少なくとも18ntまたは25nt
となり、また少なくとも約50ntでもよい。
【００５１】Npt2B遺伝子はかなりの純度で、一般には
完全な染色体以外のものとして単離し、得ることができ
る。通常、DNAはNpt2B配列またはその断片を含まない蛋
白質の核酸配列を実質的に含まない状態で得られ、一般
には少なくとも約50%、一般的には少なくとも約90%の純
度で、典型的には「組換え体」である、すなわち通常は
天然の染色体上では結合することのない1つまたは複数
のヌクレオチドが隣接している。
【００５２】本発明の好ましい態様は、配列番号:1の配
列と実質的に同一、特に少なくとも90%同一のアミノ酸
配列を有するNpt2Bポリペプチドである。
【００５３】さらに、同様に好ましい態様は、配列番
号:1のアミノ酸配列を含む前述のNpt2Bポリペプチドで
ある。
【００５４】本発明の他の好ましい局面は、リン酸ナト
リウム共輸送活性を有する前述の蛋白質またはポリペプ
チドである。
【００５５】同様に好ましい局面は、前述のNpt2Bポリ
ペプチドの断片である。
【００５６】本発明のさらに好ましい局面は、特に核酸
が配列番号:2の核酸配列と実質的に同一の核酸配列を有
する、前述の蛋白質またはポリペプチドをコードする核
酸である。同様に好ましい局面は該核酸の断片である。
【００５７】さらに、他の好ましい局面は、ストリンジ
ェントな条件下で前述の核酸またはその相補配列にハイ
ブリダイズする単離された核酸またはその擬似体であ
る。
【００５８】他の好ましい局面は、発現宿主中で機能す
る転写開始領域、該転写開始領域の転写調節下で前述の
核酸に認められるヌクレオチド配列を有する核酸、およ
び該発現宿主中で機能する転写終結領域を含む発現カセ
ットである。特に好ましい局面は、染色体外要素の一部
としての、または発現カセットを宿主細胞中に導入した
結果、該宿主細胞のゲノム中に取り込まれた、該発現カ
セットを含む細胞である。特に好ましい局面は、前述の
宿主細胞の後代細胞である。
【００５９】本発明のさらに好ましい態様は、Npt2Bを
産生する方法であって、該Npt2Bを発現する前述の細胞
を増殖させること、および他の蛋白質を実質的に含まな
い該Npt2Bを単離することを含む方法である。
【００６０】同様に好ましい態様は、Npt2Bに特異的に
結合するモノクローナル抗体であって、特に該抗体がNp
t2Bの機能を阻害する抗体であり、特に好ましいのは該
抗体がヒト化抗体である該モノクローナル抗体である。
【００６１】本発明の他の好ましい態様は、宿主中でNp
t2Bを調節する方法であって、好ましくは該調節物質が
小分子であり、特に該調節物質が抗体である、該宿主に
Npt2B調節物質の有効量を投与することを含む方法であ
る。
【００６２】同様に好ましい態様は、宿主中でNpt2Bを
調節するための薬剤産生のためのNpt2B調節物質の使用
法である。
【００６３】さらに好ましい局面は、Npt2B調節物質を
同定するためのスクリーニング法であって、リンアニオ
ン存在下、細胞表面で機能性Npt2Bを発現する細胞を候
補物質と接触させることと、該細胞によるリンアニオン
の取り込み量を定量することとを含む方法である。特に
好ましい局面は、該リンアニオンが検出可能なラベルで
標識されており、特に該ラベルが同位体である、この方
法である。
【００６４】本発明の他の好ましい態様は、Npt2Bを発
現可能なヒト以外のトランスジェニック動物モデルであ
る。
【００６５】さらに好ましい態様は、Npt2B調節物質を
スクリーニングするための前述の蛋白質またはポリペプ
チドの使用法である。
【００６６】本発明の他の好ましい局面は、Npt2Bの機
能に関連する疾患状態を患う宿主を治療するための薬剤
産生のためのNpt2B調節物質の使用法である。
【００６７】同様に好ましい局面は、Npt2Bの機能に関
連する疾患状態を患う宿主を治療する方法であって、好
ましくはNpt2B調節物質がNpt2Bアゴニストであり、特に
好ましくは該Npt2B調節物質がNpt2Bアンタゴニストであ
る、該宿主に該Npt2B調節物質を投与することを含む方
法である。非常に好ましい局面は、該疾患状態が高リン
酸血症を特徴とする、前述の方法である。
【００６８】Npt2Bポリペプチドの調製 以下の項でより詳細に述べる多くの使用法に加えて、本
核酸組成物は前述のNpt2Bポリペプチドの全体または一
部の調整において使用できる。発現には発現カセットを
用いることができる。発現ベクターは、誘導性または構
成性でもよく、転写開始領域の転写制御下でコード領域
が結合する転写および翻訳開始領域と、転写および翻訳
停止領域を提供する。これらの制御領域はNpt2B遺伝子
が本来備えているものでもよく、または外来起源から誘
導することもできる。
【００６９】発現ベクターは一般に、異種蛋白質をコー
ドする核酸配列を挿入するために都合のよい、プロモー
ター配列に隣接する制限酵素切断部位を有する。発現宿
主中で操作できる選択可能なマーカーが存在してもよ
い。発現ベクターは融合蛋白質の産生に用いることもで
き、そこで外来融合蛋白質はさらなる機能性、すなわち
蛋白質合成の増加、安定性、規定された抗血清との反応
性、または、例えばβ-ガラクトシダーゼなどの酵素マ
ーカーを提供する。
【００７０】発現カセットは、転写開始領域、遺伝子ま
たはその断片、および転写終結領域を備えて調製するこ
とができる。特に興味が持たれるのは、一般的には少な
くともアミノ酸約8個の長さ、より一般的には少なくと
もアミノ酸約15個から約25個まで、そして遺伝子のオー
プンリーディングフレーム全長までの機能性エピトープ
または領域を発現させる配列の使用法である。DNA導入
後、構成物を含む細胞を選択可能マーカーを用いて選択
し、細胞を膨張させ、次いで発現に用いることができ
る。
【００７１】Npt2B蛋白質およびポリペプチドは、発現
の目的に応じて、通常の方法に従い、原核生物または真
核生物中で発現させることができる。蛋白質の大量生産
のためには、大腸菌、枯草菌、S.セレビジエなどの単細
胞生物、バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫
細胞、または脊椎動物、特に哺乳動物などの高等生物の
細胞、例えばCOS 7細胞、HEK 293、CHO、アフリカツメ
ガエル卵母細胞などを発現宿主細胞として用いることが
できる。状況によっては、Npt2B遺伝子を真核細胞で発
現させることが望ましいこともあり、この細胞中でNpt2
B蛋白質は本来の折りたたみ構造および翻訳後修飾によ
り利益を受けることになる。小さいペプチドは研究室で
合成することもできる。全Npt2B配列のサブセットであ
るポリペプチドを用いて、蛋白質の機能上重要な部分を
同定し、研究することができる。
【００７２】本Npt2Bポリペプチドおよび核酸組成物の
使用 本Npt2Bポリペプチドおよび核酸組成物は、研究、診
断、および治療薬のスクリーニング／発見／調製への施
用を含む様々な異なる施用例、ならびに治療用組成物お
よびこれを用いる方法において使用できる。
【００７３】研究上の施用 本核酸組成物は様々な研究上の施用において使用でき
る。関心対象となる研究上の施用例には、Npt2B相同体
の同定、新規プロモーター要素の原料として、Npt2B発
現調節因子の同定、例えばPCRなどハイブリダイゼーシ
ョンにおけるプローブおよびプライマーとしての施用
例、生体試料における発現パターンの同定、Npt2B機能
の細胞または動物モデル調製、Npt2B機能のインビトロ
モデル調製などが含まれる。
【００７４】Npt2Bの相同体は多くの方法のいずれかに
より同定される。提供されたcDNA断片を、ストリンジェ
ンシーの低い条件を用い、関心対象となる標的生物から
のcDNAライブラリーに対するハイブリダイゼーション・
プローブとして用いることができる。このプローブは大
きい断片でもよく、または1本もしくは複数の短い変性
プライマーでもよい。配列類似性を有する核酸は、低ス
トリンジェンシー条件下、例えば50℃、6XSSC（0.9M塩
化ナトリウム／0.09Mクエン酸ナトリウム）でのハイブ
リダイゼーションにより検出され、1XSSC（0.15M塩化ナ
トリウム／0.015Mクエン酸ナトリウム）中55℃での洗浄
時にも結合したままである。配列の同一性は、ストリン
ジェントな条件下、例えば50℃以上、0.1XSSC（15mM塩
化ナトリウム／1.5mMクエン酸ナトリウム）でのハイブ
リダイゼーションにより調べることができる。提供され
たNpt2B配列と実質的に同一の領域を有する核酸、例え
ば対立変異体、遺伝的に変更された遺伝子などが、スト
リンジェントなハイブリダイゼーション条件下で提供さ
れたNpt2B配列と結合する。プローブ、特にDNA配列の標
識プローブを用いることにより、相同な関係する遺伝子
を単離することができる。
【００７５】5'隣接領域の配列を、Npt2Bが発現される
組織で発生調節を行う、エンハンサー結合部位を含むプ
ロモーター要素として用いることができる。組織特異的
発現は発現パターンを調べ、本来の発現パターンを模擬
するプロモーターを提供するために有用である。プロモ
ーター領域の自然に生じる多形性は、発現における自然
変異、特に疾患に関連する可能性のある変異を調べる際
に有用である。
【００７６】または、プロモーター領域に突然変異を導
入して、実験的に規定した系で発現変更の影響を調べる
こともできる。転写因子の結合に関与する特定のDNAモ
ティーフを同定する方法は当技術分野では周知で、例え
ば既知の結合モティーフに対する配列類似性、ゲル遅延
試験などがある。例えば、Blackwellら(1995), Mol.Me
d. 1:194〜205、Mortlockら(1996), Genome Res. 6:327
〜33、ならびにJoulinおよびRichard-Foy (1995), Eur.
J. Biochem. 232:620〜626を参照されたい。
【００７７】調節配列を用いて、特に異なる組織または
発生段階におけるNpt2B遺伝子発現の転写および翻訳調
節に必要なシス作用性配列を同定し、Npt2B遺伝子発現
を調節または仲介するシス作用性配列およびトランス作
用性因子を同定することができる。培養細胞において、
または肺、胎児もしくは成人組織において、野生型もし
くは変更Npt2Bまたは関心対象となる他の蛋白質の発現
を促進するため、そして遺伝子治療のために、このよう
な転写または翻訳制御領域を操作してNpt2B遺伝子に結
合させることができる。
【００７８】小さいDNA断片は、PCR用のプライマー、ハ
イブリダイゼーション・スクリーニング用プローブなど
として有用である。より大きいDNA断片、すなわち100nt
以上の断片は、前項で述べたコードされたポリペプチド
の産生に有用である。幾何学的PCRなどの幾何学的増幅
反応で用いるためには、一対のプライマーを用いること
になる。プライマー配列の正確な組成は本発明にとって
重要ではないが、ほとんどの施用例でプライマーは当技
術分野では周知のストリンジェンシー条件下で本配列に
ハイブリダイズする。少なくとも約50nt、好ましくは少
なくとも約100ntの増幅産物を生成するプライマー対を
選ぶことが好ましい。プライマー配列選択のためのアル
ゴリズムは一般に周知で、ソフトウェアパッケージで市
販されている。増幅プライマーはDNAの相補鎖にハイブ
リダイズし、お互いの方向に鎖の伸長を開始する。
【００７９】このDNAはまた、生体試料における遺伝子
の発現を同定する際にも用いることができる。ゲノムDN
AまたはRNAとしての特定のヌクレオチド配列の有無につ
いて細胞を調べる方法は、文献でしっかりと確立されて
いる。簡単に言うと、DNAまたはmRNAを細胞サンプルか
ら単離する。このmRNAを逆転写酵素を用いてRT-PCRで増
幅して相補的DNA鎖を形成し、続いて本DNA配列に特異的
なプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応による増幅
を行うことができる。または、mRNAサンプルをゲル電気
泳動で分離し、適当な支持体、例えばニトロセルロー
ス、ナイロンなどに移し、次いで本DNAの断片をプロー
ブとして用いて調べる。オリゴヌクレオチド・ライゲー
ション分析、インサイチューハイブリダイゼーション、
および固体チップに並べたDNAプローブへのハイブリダ
イゼーションなどの他の方法も用いることができる。本
配列にハイブリダイズしたmRNAが検出されれば、サンプ
ル中のNpt2B遺伝子発現が示される。
【００８０】隣接するプロモーター領域およびコード領
域を含む、Npt2B遺伝子の配列を当技術分野では周知の
様々な方法により突然変異させて、プロモーターの強
さ、コードされた蛋白質の配列などにおける目標とする
変化を生じさせるこができる。このような突然変異体の
DNA配列または蛋白質生成物は、通常は本明細書で提供
される配列と実質的に類似、すなわちそれぞれ少なくと
も1個のヌクレオチドまたはアミノ酸が異なり、少なく
とも2個、しかし約10個以下のヌクレオチドまたはアミ
ノ酸が異なることがある。配列の変化は、置換、挿入、
欠失、またはそれらの組み合わせであり得る。欠失はさ
らに、領域またはエキソンの欠失など、より大きい変化
を含むこともある。関心対象となる他の変更には、例え
ばFLAGシステム、HAなどによるエピトープの標識が含ま
れる。細胞内局在研究には、緑色蛍光蛋白質（GFP）と
の融合蛋白質を用いることができる。
【００８１】クローン化遺伝子のインビトロ突然変異誘
発法が知られている。部位特異的突然変異誘発のプロト
コルの例を、Gustinら(1993), Biotechniques 14:22、B
arany (1985), Gene 37:111〜23、Colicelliら(1985),
Mol. Gen. Genet. 199:537〜9、およびPrentkiら(198
4), Gene 29:303〜13に見ることができる。部位特異的
突然変異誘発法は、Sambrookら、分子クローニング：実
験の手引きMolecular Cloning: A Laboratory Mannual,
CSH Press 1989, pp.15.3〜15.108、Weinerら(1993),
Gene 126:35〜41、Sayersら(1992), Biotechniques 13:
592〜6、JonesおよびWinistorfer (1992), Biotechniqu
es 12:528〜30、Bartonら(1990), Nucleic Acids Res 1
8:7349〜55、MarottiおよびTomich (1989), Gene Anal.
Tech. 6:67〜70、ならびにZhu (1989), Anal. Biochem
177:120〜4に見ることができる。このような突然変異
遺伝子を用いて、Npt2Bの構造−機能相関を研究する、
またはその機能もしくは調節に影響をおよぼす蛋白質の
特性を変えることができる。
【００８２】本核酸を用いてヒト以外のトランスジェニ
ック動物を作る、または細胞系統における部位特異的な
遺伝子修飾を行うことができる。トランスジェニック動
物は、内因性Npt2B遺伝子座を変える同種組換えにより
作ることができる。または、核酸構成物をゲノム中に無
作為に取り込ませる。安定な取り込みのためのベクター
には、プラスミド、レトロウイルスおよび他の動物ウイ
ルス、YACs等が含まれる。
【００８３】修飾された細胞または動物は、Npt2Bの機
能および調節の研究において有用である。興味が持たれ
るのは、Npt2Bに関係する疾患状態、例えば高または低
リン酸血症のトランスジェニック動物モデルを作成する
ためのNpt2B遺伝子の使用法である。したがって、本発
明のトランスジェニック動物モデルは、内因性Npt2Bの
発現がなくなっていないとしても少なくとも低減されて
いる、内因性Npt2Bノックアウト動物を含み、このよう
な動物はまた概して本発明のNpt2Bペプチド、例えば本
発明のNpt2B蛋白質またはその断片を発現する。ヒトNpt
2B遺伝子に見いだされる配列を有する核酸を導入する場
合、導入核酸はNpt2B遺伝子の完全配列または部分配列
のいずれかであってもよい。lacZなどの検出可能なマー
カーをNpt2B遺伝子座に導入してもよく、Npt2B発現のア
ップレギュレーションによる表現型の変化が容易に検出
されるようになる。また、Npt2B遺伝子またはその変異
体を、通常はこれらを発現しない細胞または組織におい
て、このような細胞または組織に通常存在しないレベル
で発現させることもできる。
【００８４】同種組換えのためのDNA構成物は、遺伝子
が望まれる遺伝学的修飾を施され、標的遺伝子座と相同
の領域を含む、本発明のNpt2B遺伝子の少なくとも一部
を含む。無作為取り込みのためのDNA構成物は、組換え
を仲介するために相同領域を含む必要はない。簡便に
は、ポジティブおよびネガティブ選択用のマーカーが含
まれる。同種組換えにより標的とする遺伝子修飾を施さ
れた細胞の生成法は、当技術分野では周知である。哺乳
動物細胞のトランスフェクションに関する様々な方法に
ついては、Keownら(1990), Neth. Enzymol. 185:527〜5
37を参照されたい。
【００８５】胚性幹（ES）細胞については、ES細胞系統
を用いることができ、または胚細胞を宿主、例えばマウ
ス、ラット、モルモットなどから新しく採取してもよ
い。このような細胞を適当な線維芽細胞フィーダー層上
で増殖させるか、または白血病阻害因子（LIF）存在下
で増殖させる。ESまたは胚細胞を形質転換させた場合、
これらをトランスジェニック動物を作り出すために用い
ることができる。形質転換後、細胞を適当な培地中、フ
ィーダー層上で平板培養する。構成物を含む細胞を、選
択培地を用いて検出することができる。コロニーを十分
な時間増殖させた後に取り出し、同種組換えまたは構成
物の取り込みの発生について分析する。次いで、発生を
認めたコロニーを胚操作および胚盤胞注入に用いること
ができる。胚盤胞は4〜6週齡の過剰排卵した雌から得
る。ES細胞をトリプシン処理し、修飾細胞を胚盤胞の胞
胚腔に注入する。注入後、胚盤胞をそれぞれの偽妊娠雌
子宮角に戻す。次いで雌を満期産させ、得られた仔を構
成物についてスクリーニングする。胚盤胞の異なる表現
型および遺伝子修飾した細胞により、キメラ子孫を容易
に検出することができる。
【００８６】キメラ動物を修飾遺伝子の有無についてス
クリーニングし、修飾遺伝子を持つ雄と雌を交配して同
型接合子孫を産出する。遺伝子の変更により発生中のど
こかの時点で致死的となる場合は、組織または臓器を同
種もしくはコンジェニックな移植片もしくは移植臓器と
して、またはインビトロ培養で維持することができる。
トランスジェニック動物は、実験動物、家畜など、ヒト
以外のいかなる哺乳動物でもよい。トランスジェニック
動物は、機能研究、薬剤スクリーニング等、例えばNpt2
Bの機能に対する候補薬の効果を調べるために使用する
ことができる。
【００８７】診断上の施用例 同様に、関心対象となる生体サンプルのNpt2Bレベルま
たはNpt2B遺伝子発現レベルを観察することにより、疾
患状態を診断する方法も提供される。サンプルには本明
細書では、血液、脳脊髄液、涙、唾液、リンパ液、透析
液、精液などの体液、臓器または組織培養由来の液体、
および生理組織から抽出した液体が含まれる。同様に、
この用語にはこのような液体の派生物および画分も含ま
れる。固形組織の場合、細胞を解離するか、または組織
切片を分析してもよい。または、細胞溶解産物を調製し
てもよい。
【００８８】特定のサンプルにおける遺伝子または蛋白
質の発現レベルを調べるために、多くの方法が使用でき
る。患者サンプル中の正常または異常Npt2Bの有無また
は変化した量を調べるために、多くの方法による診断を
実施することができる。例えば、検出には通常の方法に
したがって実施した細胞染色または標識抗体を用いた組
織切片を使用してもよい。細胞質分子を染色するために
細胞を透過可能にする。関心対象となる抗体を細胞サン
プルに加え、十分な時間、通常は少なくとも10分間イン
キュベートしてエピトープに結合させる。直接検出する
ために、抗体を放射性同位体、酵素、蛍光、化学発光物
質、または他のラベルで標識してもよい。または、第2
期抗体または試薬を用いてシグナルを増幅する。このよ
うな試薬は当技術分野ではよく知られている。例えば、
西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したアビジンを第2
期試薬として加えることにより、1次抗体をビオチンと
結合させることができる。または、2次抗体を蛍光化合
物、例えばフルオレセイン、ローダミン、テキサスレッ
ド等に結合させる。最終検出はペルオキシダーゼ存在下
で色が変化する基質を用いる。抗体結合の有無は、解離
細胞のフローサイトメトリー、顕微鏡、ラジオグラフィ
ー、シンチレーション計数等を含む様々な方法により調
べることができる。
【００８９】または、Npt2Bの発現に焦点を当てること
もできる。生化学的試験を実施して、Npt2Bコード領域
または制御領域における配列多形性が疾患と関連してい
るかどうかを調べることができる。疾患関連の多形性に
は、遺伝子の欠失または欠損、発現レベルを変える突然
変異、蛋白質の活性に影響をおよぼす突然変異等が含ま
れる。
【００９０】Npt2Bの発現レベルに影響をおよぼす可能
性があるプロモーターまたはエンハンサー配列の変異
を、当技術分野で周知の様々な方法により正常な対立遺
伝子の発現レベルと比較することができる。プロモータ
ーまたはエンハンサーの強度を調べる方法には、発現し
た天然蛋白質の定量、変異体制御因子をβ−ガラクトシ
ダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコール・アセ
チルトランスフェラーゼなどの、定量を容易にするレポ
ーター遺伝子と共にベクターに挿入することなどが含ま
れる。
【００９１】特定の配列、例えば疾患関連の多形性の有
無について核酸を分析するために、多くの方法が使用で
きる。大量のDNAが得られる場合には、ゲノムDNAを直接
用いる。または、関心対象領域を適当なベクター中にク
ローン化し、分析するのに十分な量まで増殖させる。Np
t2Bを発現する細胞を用いてmRNAを得、これを直接分析
するか、またはcDNAに逆転写して分析することもでき
る。核酸は、分析するのに十分な量を得るために、ポリ
メラーゼ連鎖反応（PCR）などの通常の方法で増殖させ
ることができる。ポリメラーゼ連鎖反応の使用法はSaik
iら(1985), Science 239:487に記載されており、技術的
総説はSambrookら、分子クローニング：実験の手引きMo
lecular Cloning: A Laboratory Mannual, CSH Press 1
989, pp.14.2〜14.33に記載されている。または、多形
性を検出する手段としてオリゴヌクレオチド・ライゲー
ションを用いる様々な方法が当技術分野では知られてお
り、例えばRileyら(1990), Nucl. Acids Res. 18:2887
〜2890、およびDelahuntyら(1996), Am. J. Hum. Gene
t. 58:1239〜1246を参照されたい。
【００９２】検出可能なラベルが増幅反応に含まれても
よい。適当なラベルには蛍光色素、例えば、フルオレセ
インイソチオシアネート（FITC）、ローダミン、テキサ
スレッド、フィコエリトリン、アロフィコシアニン、6-
カルボキシフルオレセイン（6-FAM）、2',7'-ジメトキ
シ-4',5'-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン（JO
E）、6-カルボキシ-X-ローダミン（ROX）、6-カルボキ
シ2',4',7',4,7-ヘキサクロロフルオレセイン（HEX）、
5-カルボキシフルオレセイン（5-FAM）またはN,N,N',
N',-テトラメチル-6-カルボキシローダミン（TAMRA）、
放射性ラベル、例えば、32P、35S、3H等が含まれる。ラ
ベルは、増幅DNAを、例えばアビジン、特異抗体等の高
親和性の結合相手を有するビオチン、ハプテン等に結合
させ、この結合相手を検出可能ラベルに結合させる、2
段階システムでもよい。ラベルはプライマーの一方また
は両方に結合させることができる。または、増幅産物中
にラベルが取り込まれるよう、増幅に用いるヌクレオチ
ドの貯留液を標識する。
【００９３】サンプルとなる核酸、例えば増幅またはク
ローン化断片を、当技術分野では周知の多くの方法のひ
とつにより分析する。核酸をジデオキシ法または他の方
法で配列決定し、塩基配列を野生型Npt2B遺伝子の配列
と比較することができる。変異体配列の有無を調べるた
めに、サザンブロット、ドットブロット等によるこの配
列とのハイブリダイゼーションも用いることができる。
米国特許第5445934号または国際公開公報第95/35505号
に記載されているとおり、固相担体に固定したオリゴヌ
クレオチドプローブ配列への対照および変異体配列のハ
イブリダイゼーションパターンも、変異体配列の有無を
検出する手段として用いることができる。一本鎖配座多
形性（SSCP）分析、変性勾配ゲル電気泳動（DGGE）、お
よびゲル基質におけるヘテロ二本鎖分析を用いて、DNA
配列の変異により電気泳動上の易動度変化として現れる
配座の変化を検出する。または、多形性により制限エン
ドヌクレアーゼの認識部位が作られるか、または破壊さ
れる場合、サンプルをそのエンドヌクレアーゼで消化
し、生成物をサイズ分別して、断片が消化されたかどう
かを調べる。分別はゲルまたは毛細管電気泳動、特にア
クリルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳動により
実施する。
【００９４】Npt2Bにおける突然変異のスクリーニング
は、蛋白質の機能性または抗原性により行うことができ
る。蛋白質欠損アッセイは、蛋白質の生物活性に影響を
およぼす可能性のある欠失を検出する上で有用である。
Npt2B蛋白質の多形性を検出するために設計された様々
なイムノアッセイをスクリーニングに用いることができ
る。多くの異なる遺伝子変異によって特定の疾患表現型
が現れる場合、スクリーニング法として機能性蛋白質ア
ッセイが有効であることが明らかにされている。コード
されたNpt2B蛋白質の活性を野生型蛋白質との比較によ
り調べてもよい。
【００９５】Npt2B遺伝子発現レベルが関心対象である
本発明の診断法は、典型的には相違を定性的および／ま
たは定量的に測定し、次いでどの相違が異常Npt2B遺伝
子発現パターンの有無に関連しているかを決定する、相
対的相違を調べるための関心対象サンプルのNpt2B核酸
量と対照値との比較を行うことになる。サンプル中の核
酸量を定量する様々な異なる方法が当分野の技術者には
知られており、特に興味深い方法には、Pietuら、Genom
e Res. (1996年6月) 6: 492〜503、Zhaoら、Gene (1995
年4月24日) 156: 207〜213、Soares、Curr. Opin. Biot
echnol. (1997年10月) 8: 542〜546、Raval、J. Pharma
col Toxicol Methods (1994年11月) 32: 125〜127、Cha
lifourら、Anal. Biochem (1994年2月1日) 216: 299〜3
04、Stolz & Tuan、Mol. Biotechnol. (1996年12月) 6:
225〜230、Hongら、BioscienceReports (1982) 2: 90
7、およびMcGraw、Anal. Biochem. (1984) 143: 298に
記載のものが含まれる。同様に興味が持たれるものに、
国際公開公報第97/27317号に記載の方法があり、その開
示を本明細書中で参考として援用する。
【００９６】スクリーニングアッセイ 本Npt2Bポリペプチドを、治療用薬剤を同定するために
設計された様々なスクリーニングアッセイにおいて用い
ることができる。したがって、細胞表面でNpt2Bを発現
するのに十分な方法でトランスフェクションした、宿主
細胞などの細胞モデル、例えばCHO、HEK293、COS7、ア
フリカツメガエル卵母細胞等を用いることができる。次
いで、この細胞をナトリウムおよびリン酸イオンを含む
培地と接触させ、細胞中に内部移行したリン酸アニオン
の量を、対照環境と試験環境の両方で、例えばNpt2B調
節化合物候補、例えばNpt2BアゴニストまたはNpt2Bアン
タゴニストもしくは阻害物質存在下で測定を行い評価す
ることができる。Pi取り込みの検出を補助するために、
培地中に標識したリンを加えるが、これには同位体標
識、例えば32Pまたは33Pなどのあらゆる都合のよいラベ
ルを用いることができる。または、よく知られている電
気生理学的方法を用いる現行の測定法（例えば、電気生
理学、実践アプローチElectrophysiology, A practical
Approach (IRLPress) (1993)参照）を使ってもよく、
これによりPiの取り込みを定量することができる。Pi取
り込みを測定するためのアッセイの例が、Maganinら、P
roc. Nat'l Acad. Sci USA (1993年7月) 90: 5979〜598
3、およびHelpsら、Eur. J. Biochem. (1995) 228: 927
〜930に記載されている。
【００９７】スクリーニングアッセイで同様に興味深い
ものは、前述のヒト以外の機能性Npt2Bを発現するトラ
ンスジェニック動物である。多くの態様において、動物
には内因性Npt2Bが欠けている。スクリーニングへの施
用のためにこのような動物を用いる際には、試験化合物
を動物に投与し、表現型、例えば血清Piレベルに変化が
認められれば、これを対照と比較する。
【００９８】または、インビトロモデルを調製し、用い
てもよい。例えば、Npt2B結合活性をインビトロ環境で
測定してもよく、Npt2BとNpt2B調節物質候補との結合を
モニターする。さらに別のインビトロモデルでは、本Np
t2B共輸送体を取り込む合成脂質二重層を調製し、脂質
二重層の一方の側から他の側へのPiの通過を測定する。
このような合成脂質二重層アッセイの例は、Brutyan
ら、Biochimica et Biophysica Acta (1995) 1236:339
〜344、Wonderlinら、Biophys. J. (1990) 58:289〜29
7、およびSuarez-Islaら、Biochemistry (1983) 22:231
9〜2323に記載されている。
【００９９】このスクリーニングアッセイには他の様々
な試薬が含まれる。これらには、塩、例えばアルブミン
などの中性蛋白質、界面活性剤等の、適当な蛋白質−蛋
白質結合を促進し、且つ／または非特異的もしくはバッ
クグラウンドの相互作用を低減させる試薬が含まれる。
プロテアーゼ阻害物質、ヌクレアーゼ阻害物質、抗菌剤
などのアッセイの効率を改善する試薬を用いることもで
きる。
【０１００】Npt2Bアゴニストまたはアンタゴニストと
してはたらく様々な異なる治療薬候補を、前述の方法で
スクリーニングすることができる。候補物質には多くの
化学物質が含まれるが、これらは典型的には有機分子で
あり、好ましくは分子量が50ダルトンより大きく約2,50
0ダルトン未満の小さい有機化合物である。候補物質は
蛋白質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能
基を含み、典型的には少なくともアミン、カルボニル
基、水酸基またはカルボキシル基、好ましくは少なくと
も2つの官能性化学基を含む。候補物質は、前述の官能
基の1つ以上で置換された炭素環もしくは複素環構造お
よび／または芳香族もしくは複数の芳香族構造を含むこ
とが多い。候補物質はまた、ペプチド、糖類、脂肪酸、
ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体
またはそれらの組み合わせを含む生体分子からも見いだ
される。
【０１０１】候補物質は、合成または天然化合物ライブ
ラリーを含む多様な原料から得られる。例えば、無作為
オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含
む、多様な有機化合物および生体分子の無作為および意
図された合成のために多くの手段が使用できる。また
は、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形での天然化
合物のライブラリーを使用できるか、または容易に作る
ことができる。さらに、天然または合成的に作ったライ
ブラリーおよび化合物は、通常の化学的、物理的および
生化学的方法で容易に変更され、組み合わせライブラリ
ーを作るために用いることができる。既知の物質を、ア
シル化、アルキル化、エステル化、アミジン化などの方
向性を持つ、または無作為の化学変更に供して、構造類
似体を生成してもよい。
【０１０２】多くの態様の中で特に興味が持たれるの
は、本Npt2Bを選択的に調節、例えば阻害し、腎臓リン
酸ナトリウム共輸送体、例えばNpt1などの他のリン酸ナ
トリウム共輸送体には影響しない物質を同定するスクリ
ーニング法である。このような物質を同定するために、
最初のアッセイでNpt2Bを阻害する物質を、次いでNpt2B
以外の輸送体を阻害する能力について検定する、多段階
スクリーニングプロトコルを実施することができる。こ
の第二段階のアッセイには、Maganinら、Proc. Nat'l A
cad. Sci USA (1993年7月) 90: 5979〜5983、およびHel
psら、Eur. J. Biochem. (1995) 228: 927〜930に開示
されている方法などのいかなる簡便なアッセイ法も用い
ることができる。
【０１０３】Npt2B核酸およびポリペプチド治療用組成
物 本発明の核酸組成物は、宿主におけるNpt2B活性の増強
が望まれる状態、例えば、低リン酸血症に関連する疾患
状態での治療薬としても用いることができる。Npt2B遺
伝子、遺伝子断片、またはコードされたNpt2B蛋白質も
しくは蛋白質断片は、Npt2B欠損に関連する疾患を治療
するための遺伝子治療において有用である。発現ベクタ
ーを用いて細胞にNpt2B遺伝子を導入することもでき
る。このようなベクターは一般に、プロモーター配列に
隣接した、核酸配列の挿入に用いるために都合のよい制
限酵素切断部位を有している。転写開始領域、標的遺伝
子またはその断片、および転写終結領域を含む転写カセ
ットを調製してもよい。この転写カセットを、細胞中に
一時的または永続的、一般的には少なくとも約1日、よ
り一般的には少なくとも数日から数週間の期間維持され
うる様々なベクター、例えばプラスミド、例えばレンチ
ウイルスなどのレトロウイルス、アデノウイルス等に導
入することができる。
【０１０４】遺伝子またはNpt2B蛋白質は、ウイルス感
染、微量注入、または小胞の融合を含む、いくつの経路
によっても組織または宿主細胞に導入することができ
る。Furthら(1992), Anal Biochem 205:365〜368に記載
されているとおり、筋肉内投与にはジェット注入も用い
ることができる。文献に記載があるとおり、DNAを金微
粒子にコーティングし、粒子射出装置、すなわち「遺伝
子銃」により皮内に送達することもでき（例えば、Tang
ら(1992), Nature 356:152〜154参照）、この方法では
金射出微粒子をDNAでコーティングし、次いで皮膚細胞
中に射出する。
【０１０５】Npt2B活性調節法 本発明により、Npt2B活性を上昇させる方法（例えば、P
i輸送を促進する方法）、ならびにNpt2B活性を低下また
は阻害する方法、例えば、Pi輸送を停止または制限する
方法を含む、細胞中のNpt2B活性調節法が提供される。
このような方法においては、有効な量のNpt2B調節物質
を細胞に接触させる。
【０１０６】同様に、宿主中におけるNpt2B活性の、増
強および阻害を含む、調節法も提供される。このような
方法においては、Npt2Bの活性をインビボで調節する、
例えば通常はNpt2B活性を増強または阻害する有効な量
の活性物質を宿主に投与する。活性物質は、天然または
合成による小分子化合物、抗体、その断片または誘導
体、アンチセンス組成物等を含む、様々な異なる化合物
であり得る。
【０１０７】特定の態様において特に興味が持たれるの
は、Npt2B活性、例えばPi輸送を前記Magagninが記載し
ている卵母細胞輸送アッセイにより測定して、少なくと
も約10分の1、一般的には少なくとも約20分の1、そして
より一般的には少なくとも約25分の1に低下させる物質
である。多くの態様において、特に興味が持たれるの
は、Npt2B活性を対照と比べて少なくとも100分の1に低
下させる化合物の使用法である。
【０１０８】同様に興味深いのは、Npt2B活性を低下さ
せる一方で、他のリン酸ナトリウム共輸送体、例えばNp
t1等の活性を、仮に低下があったとしても実質的には低
下させない物質の使用法である。したがって、この態様
における物質はNpt2B選択的阻害物質である。ある物質
が前述のNpt2B活性低下を引き起こすが、少なくとも1つ
の他のタイプのリン酸ナトリウム共輸送体の活性を実質
的に低下させない場合に選択的であると考えられ、ただ
しここで言う実質的に（低下）させないとは、前記Maga
gnin記載のとおりに測定して10分の1未満、一般的には5
分の1未満、そして多くの場合1分の1未満の低下を意味
する。
【０１０９】関心対象となる天然または合成による小分
子化合物には多くの化学物質が含まれるが、典型的には
これらは有機分子であり、好ましくは分子量が50ダルト
ンより大きく約2,500ダルトン未満の小さい有機化合物
である。候補物質は蛋白質との構造的相互作用、特に水
素結合に必要な官能基を含み、典型的には少なくともア
ミン、カルボニル基、水酸基またはカルボキシル基、好
ましくは少なくとも2つの官能性化学基を含む。候補物
質は、前述の官能基の1つまたは2つ以上で置換された炭
素環もしくは複素環構造および／または芳香族もしくは
複数の芳香族構造を含むことが多い。候補物質はまた、
ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミ
ジン、誘導体、構造類似体またはそれらの組み合わせを
含む生体分子からも見いだされる。
【０１１０】活性物質として同様に興味深いのは、宿主
中の標的Npt2B活性を、阻害はしないとしても少なくと
も低下させる抗体である。適当な抗体は、宿主動物を標
的蛋白質、例えばNpt2Bの全部または一部を含むペプチ
ドで免疫化することにより得られる。適当な宿主動物に
は、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ハムスター、ウサ
ギ等が含まれる。蛋白質免疫原の起源はマウス、ヒト、
ラット、サル等であり得る。例えばマウスを免疫化する
ためにヒトNpt2Bを用いるなど、宿主動物は一般に免疫
原とは異なる種である。
【０１１１】免疫原は完全な蛋白質、またはその断片お
よび誘導体を含んでいてもよい。好ましい免疫原はNpt2
Bのすべてまたは一部を含み、これらの残基は本来の標
的蛋白質上で見られる、グリコシレーションなどの翻訳
後修飾を含む。細胞外領域を含む免疫原は当技術分野に
おいて周知の様々な方法、例えば通常の組換え法を用い
たクローン化遺伝子の発現、HECからの単離等により産
生される。
【０１１２】ポリクローナル抗体の調製において、第一
段階は宿主動物の標的蛋白質による免疫化であり、この
標的蛋白質は好ましくは、約1%未満の混入物しか含まな
い実質的に純粋な形である。免疫原は完全な蛋白質、そ
の断片または誘導体を含んでいてもよい。宿主動物の免
疫応答を高めるために、標的蛋白質をアジュバントと組
み合わせてもよく、適当なアジュバントにはミョウバ
ン、デキストラン、硫酸塩、大きいポリマーアニオン、
油水乳濁液、例えばフロイントアジュバント、完全フロ
イントアジュバント等が含まれる。また、標的蛋白質を
合成担体蛋白質または合成抗原と結合させてもよい。様
々な宿主を免疫化してポリクローナル抗体を産生するこ
とができる。このような宿主には、ウサギ、モルモッ
ト、齧歯類、例えばマウス、ラット、ヒツジ、ヤギ等が
含まれる。標的蛋白質を宿主に、通常は皮内に、初回投
与に続き1回かそれ以上、通常は少なくとも2回の追加免
疫により投与する。免疫化に続き、宿主から血液を採取
し、その後血球から血清を分離する。得られた抗血清中
のIgを、アンモニウム塩分別、DEAEクロマトグラフィな
どの既知の方法を用いてさらに分別することができる。
【０１１３】モノクローナル抗体を通常の方法で産生す
ることができる。一般に、免疫化した宿主動物の脾臓お
よび／またはリンパ節からプラズマ細胞を得る。プラズ
マ細胞を骨髄腫細胞との融合により不死化してハイブリ
ドーマ細胞を生成する。個々のハイブリドーマの培養上
清を標準法を用いてスクリーニングし、所望の特異性を
持った抗体を産生するものを同定する。ヒト蛋白質に対
するモノクローナル抗体産生に適した動物には、マウ
ス、ラット、ハムスター等が含まれる。マウス蛋白質に
対する抗体を産生するための動物は一般にハムスター、
モルモット、ウサギ等である。抗体をハイブリドーマ細
胞上清または腹水から通常の方法、例えば不溶性支持
体、蛋白質Aセファロース等に結合させたNpt2Bを用いた
アフィニティクロマトグラフィにより精製することがで
きる。
【０１１４】抗体は、通常の多重結合性構造の代わりに
一本鎖で産生することができる。一本鎖抗体はJostら(1
994) J.B.C. 269:26267〜73他に記載されている。H鎖の
様々な領域とL鎖の様々な領域をコードするDNA配列を、
グリシンおよび／またはセリンを含む少なくとも約4個
の小さい中性アミノ酸をコードするスペーサーにライゲ
ーションする。この融合体によりコードされる蛋白質
は、元の抗体の特異性および親和性を保持する様々な機
能性領域を構築することができる。
【０１１５】インビボでの使用、特にヒトへの注入のた
めに、抗体の抗原性を低下させることが望ましい。遮断
薬に対するレシピエントの免疫応答が、治療が有効な期
間を短縮する可能性がある。抗体をヒト化する方法は当
技術分野では周知である。ヒト化抗体は遺伝形質を転換
したヒト免疫グロブリン定常域遺伝子を有する動物が産
生するものであってもよい（例えば、国際特許出願公開
公報第90/10077号および第90/04036号を参照された
い）。または、関心対象となる抗体を組換えDNA法によ
り操作して、CH1、CH2、CH3、ヒンジ領域、および／ま
たはフレーム枠領域を対応するヒトの配列で置換するこ
ともできる（国際公開公報第92/02190号参照）。
【０１１６】キメラ免疫グロブリン遺伝子構築のための
Ig cDNAの使用法が当技術分野で知られている（Liuら(1
987) P.N.A.S. 84:3439および(1987) J. Immunol. 139:
3521）。mRNAをハイブリドーマまたは抗体を産生する他
の細胞から単離し、cDNAを産生するために用いる。関心
対象となるcDNAは特異的プライマーを用いたポリメラー
ゼ連鎖反応により増幅させることができる（米国特許第
4683195号および第4683202号）。または、ライブラリー
を作成し、スクリーニングして関心対象となる配列を単
離する。次いで、抗体の様々な領域をコードするDNA配
列をヒト定常域配列に融合する。ヒト定常域遺伝子の配
列は、Kabatら(1991) Sequences of Proteins of Immun
ological Interest, N.I.H. publication no. 91-3242
に記載されている。ヒトC領域遺伝子は既知のクローン
から容易に入手できる。アイソタイプは、補体結合など
所望のエフェクター機能、または抗体依存性細胞障害の
活性に応じて選択する。好ましいアイソタイプはIgG1、
IgG3およびIgG4である。ヒトL鎖定常域、カッパまたは
ラムダのいずれかを用いることができる。次いで、キメ
ラヒト化抗体を通常の方法で発現させる。
【０１１７】Fv、F(ab')2およびFabなどの抗体断片を完
全な蛋白質の切断、例えばプロテアーゼまたは化学的切
断により調製することができる。または、欠損型遺伝子
を設計する。例えば、F(ab')2断片の一部をコードする
キメラ遺伝子はH鎖のCH1領域およびヒンジ領域をコード
するDNA配列と、続いて翻訳停止コドンを含み、欠損分
子を生成する。
【０１１８】V領域セグメントをヒトC領域セグメントに
続いて結合するために有用な制限酵素切断部位をJ領域
に導入するためのプライマーとして用いるオリゴヌクレ
オチドを、HおよびLJ領域のコンセンサス配列を用いて
設計することができる。C領域cDNAを特定部位の突然変
異誘発により修飾して、ヒト配列の類似の位置に制限酵
素切断部位を置くことができる。
【０１１９】発現ベクターには、プラスミド、レトロウ
イルス、YACs、EBV由来エピソームなどが含まれる。便
利なベクターは、機能的に完全なヒトCHまたはCL免疫グ
ロブリン配列をコードし、いかなるVHまたはVL配列も容
易に挿入および発現できるように操作された適当な制限
酵素切断部位を有するものである。このようなベクター
においては、挿入されたJ領域のスプライシングドナー
部位とヒトC領域の前のスプライシングアクセプター部
位との間で通常スプライシングが起こり、同様にヒトCH
エキソン内のスプライシング領域でも起こる。ポリアデ
ニル化および転写終結がコード領域下流の本来の染色体
部位で起こる。得られたキメラ抗体は、例えばSV-40初
期プロモーター（Okayamaら(1983) Mol. Cell. Bio. 3:
280）、ラウス肉腫ウイルスLTR（Gormanら(1982) P.N.
A.S. 79:6777）、およびモロニーネズミ白血病ウイルス
LTR（Grosschedlら(1985) Cell 41:885）といったレト
ロウイルスLTRs、本来のIgプロモーターなどを含むいか
なる強プロモーターにも結合することができる。
【０１２０】本発明のさらに他の態様において、活性物
質は宿主中で標的蛋白質をコードする遺伝子の発現を調
節する、一般には低下させるかまたはダウンレギュレー
ションする物質である。例えば、細胞中のNpt2Bの発現
をダウンレギュレーションするためにアンチセンス分子
を用いることができる。アンチセンス試薬は、アンチセ
ンス・オリゴヌクレオチド（ODN）、特に本来の核酸か
ら化学的修飾された合成ODN、またはこのようなアンチ
センス分子をRNAとして発現する核酸構成物であっても
よい。アンチセンス配列は標的遺伝子のmRNAに対して相
補的で、標的遺伝子産物の発現を阻害する。アンチセン
ス分子は様々なメカニズム、例えばリボヌクレアーゼH
の活性化を通して翻訳に使用できるmRNAの量を低下させ
る、または立体障害により遺伝子の発現を阻害する。ア
ンチセンス分子1個または複数の組み合わせを投与して
もよく、組み合わせは複数の異なる配列を含むことがで
きる。
【０１２１】アンチセンス分子は、適当なベクター中で
標的遺伝子配列のすべてまたは一部の発現により産生す
ることができ、この場合、転写開始はアンチセンス鎖が
RNA分子として産生するよう方向付けられている。また
は、アンチセンス分子は合成オリゴヌクレオチドであ
る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは一般に、ヌクレ
オチドが少なくとも約7個、一般的には少なくとも約12
個、より一般的には少なくとも約20個の長さで、且つヌ
クレオチドが約500個以下、一般的には約50個以下、よ
り一般的には約35個以下の長さであり、この長さは阻害
の有効性、交叉反応性がないことを含む特異性等により
決定される。塩基が7個から8個の長さの短いオリゴヌク
レオチドは、遺伝子発現の強力な選択的阻害剤であり得
ることが明らかにされている（Wagnerら(1996), Nature
Biotechnol. 14:840〜844参照）。
【０１２２】内因性センス鎖mRNA配列の1つまたは複数
の特異的領域を、アンチセンス配列と相補的となるよう
に選択する。オリゴヌクレオチドに対する特異的配列の
選択には、インビトロまたは動物モデルにおける標的遺
伝子の発現阻害についていくつかの候補配列を検定する
経験的方法を用いることができる。配列の組み合わせも
用いることができ、mRNA配列のいくつかの領域をアンチ
センス相補性について選択する。
【０１２３】アンチセンス・オリゴヌクレオチドは当技
術分野において周知の方法により化学的に合成すること
ができる（前記Wagnerら(1993)、および前記Milliganら
参照）。好ましいオリゴヌクレオチドは、細胞内の安定
性と結合親和性を高めるために、本来のホスホジエステ
ル構造から化学的に修飾されている。骨格、糖または複
素環塩基の化学を変える多くのこのような修飾が文献に
記載されている。
【０１２４】骨格の化学の有用な変更には、ホスホロチ
オエート、非架橋酸素の両方がイオウで置換されている
ホスホロジチオエート、ホスホロアミダイト、アルキル
リン酸トリエステルおよびボラノホスフェートがある。
アキラルなリン酸塩誘導体には、3'-O'-5'-S-ホスホロ
チオエート、3'-S-5'-O-ホスホロチオエート、3'-CH2-
5'-O-ホスホネートおよび3'-NH-5'-O-ホスホロアミデー
トが含まれる。ペプチド核酸は全リボースホスホジエス
テル骨格をペプチド結合で置き換える。安定性および親
和性を増強するために糖の修飾も用いられる。天然□-
アノマーに関して塩基が反転しているデオキシリボース
の□-アノマーを用いることもできる。リボース糖の2'-
OHを変更して、親和性を損なうことなく分解抵抗性を提
供する2'-O-メチルまたは2'-O-アリール糖としてもよ
い。複素環塩基の修飾は適当な塩基対を維持しなければ
ならない。いくつかの有用な置換には、デオキシチミジ
ンの代わりにデオキシウリジン、デオキシシチジンの代
わりに5-メチル-2'-デオキシシチジンおよび5-ブロモ-
2'-デオキシシチジンが含まれる。5-プロピニル-2'-デ
オキシウリジンおよび5-プロピニル-2'-デオキシシチジ
ンはそれぞれ、デオキシチミジンおよびデオキシシチジ
ンと置換した場合に親和性および生理活性を増強するこ
とが明らかにされている。
【０１２５】アンチセンス阻害物質の代わりに、触媒核
酸化合物、例えばリボザイム、アンチセンス結合体等を
用いて遺伝子発現を阻害してもよい。リボザイムをイン
ビトロで合成し、患者に投与してもよく、または発現ベ
クター上でコードし、それにより標的細胞中でリボザイ
ムを合成してもよい（例えば、国際特許出願公開公報第
9523225号、およびBeigelmanら(1995), Nucl. Acids Re
s. 23:4434〜42を参照されたい）。触媒活性を備えるオ
リゴヌクレオチドの例が国際公開公報9506764に記載さ
れている。mRNA加水分解を仲介することができるアンチ
センスODNと金属錯体との結合体、例えばテルピリジルC
u(II)が、Bashkinら(1995), Appl. Biochem. Biotechno
l. 54:43〜56に記載されている。
【０１２６】前述のとおり、有効な量の活性物質を宿主
に投与する、ただし「有効な量」は所望の結果を生じさ
せるために十分な投与量を意味する。一般に、所望の結
果は少なくとも、血漿Piレベルを測定し、対象と比較し
ての、リン酸アニオンの腸管吸収における増強または低
減である。
【０１２７】本方法において、Npt2B活性の望まれる調
節、例えばPi吸収および血漿Piレベルの望まれる低下を
来すことができるあらゆる都合のよい方法を用いて活性
物質を宿主に投与することができる。したがって、この
物質を治療上投与するための様々な製剤中に取り込むこ
とができる。特に、本発明の物質は適当な、薬学的に許
容される担体または希釈剤との組み合わせにより薬学的
組成物に調合することができ、また錠剤、カプセル、粉
末、顆粒、軟膏、溶液、坐剤、注射剤、吸入剤およびエ
アロゾルなどの固形、半固形、液体またはガス状の製剤
に調合してもよい。
【０１２８】このように、この物質の投与は、経口、口
腔内、直腸内、非経口、腹腔内、皮内、経皮、気管内投
与等を含む、様々な方法で達成することができる。
【０１２９】薬学的投与形態において、この物質はその
薬学的に許容される塩の形で投与することができ、また
は単独もしくは適当な他の薬理活性化合物との連合、な
らびに組み合わせでも用いることができる。下記の方法
および賦形剤は単に例示的なものに過ぎず、本発明を制
限するものではない。
【０１３０】経口製剤として、この物質は単独または適
当な添加物との組み合わせで用いて、錠剤、粉末、顆粒
またはカプセルを作ることができ、例えば、ラクトー
ス、マンニトール、コーンスターチまたは馬鈴薯デンプ
ンなどの通常の添加物との組み合わせ、結晶セルロー
ス、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチまた
はゼラチンなどの結合剤との組み合わせ、コーンスター
チ、馬鈴薯デンプンまたはカルボキシメチルセルロース
ナトリウムなどの崩壊剤との組み合わせ、タルクまたは
ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤との組み合わ
せ、そして望まれる場合には希釈液、緩衝剤、湿潤剤、
保存剤および着香料との組み合わせで用いる。
【０１３１】この物質は、植物または他の類似の油、合
成脂肪族系酸グリセリド、高級脂肪族系酸のエステルま
たはプロピレングリコールなどの水性または非水性溶媒
中、また望まれる場合には可溶化剤、等張剤、懸濁剤、
乳濁剤、安定剤および保存剤などの通常の添加物と共に
溶解、懸濁または乳濁させることにより、注射用製剤に
調合することができる。
【０１３２】この物質は吸入により投与されるエアロゾ
ル製剤で用いることができる。本発明の化合物は、ジク
ロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧され
た許容される噴射剤に調合することができる。
【０１３３】さらに、この物質は、乳化基剤または水溶
性基剤などの様々な基剤と混合することにより坐剤に作
ることができる。本発明の化合物は、坐剤により直腸内
に投与することができる。坐剤は、室温では固形である
が、体温で融解する、カカオ脂、カーボワックスおよび
ポリエチレングリコールなどの賦形剤を含み得る。
【０１３４】例えば小匙、大匙、錠剤または坐剤という
各投与単位が、1つまたは複数の阻害物質を含む組成物
のあらかじめ決められた量を含む、シロップ、エリキシ
ル、および懸濁液などの経口または直腸投与用の単位投
与形態が提供されうる。同様に、注射または静脈内投与
用の単位投与形態は、組成物中の阻害物質を、滅菌水、
生理食塩水または他の薬学的に許容される担体の溶液と
して含むことができる。
【０１３５】「単位投与形態」という用語は、本明細書
中では、ヒトおよび動物対象者に対する単位投与量とし
て適当な物理的に分離した単位を意味し、各単位は薬学
的に許容される希釈液、担体または賦形剤と関連して望
まれる効果を発揮するのに十分な量で計算した、本発明
の化合物のあらかじめ決められた量を含む。本発明の新
しい単位投与形態の規格は、用いる化合物の種類および
達成される効果、ならびに宿主中の各化合物に関連する
薬力学によって異なる。
【０１３６】賦形剤、アジュバント、担体または希釈液
などの薬学的に許容される賦形剤は、一般大衆が容易に
入手できる。さらに、pH調節および緩衝剤、張力調製
剤、安定剤、湿潤剤などの薬学的に許容される補助物質
も、一般大衆が容易に入手できる。
【０１３７】この物質がポリペプチド、ポリヌクレオチ
ド、その類似体または擬似体、例えばアンチセンス組成
物である場合、これをウイルス感染、微量注入、または
小胞の融合を含む、いくつの経路によっても組織または
宿主細胞に導入することができる。Furthら(1992), Ana
l Biochem 205:365〜368に記載されているとおり、筋肉
内投与にはジェット注入も用いることができる。文献に
記載があるとおり、DNAを金微粒子にコーティングし、
粒子射出装置、すなわち「遺伝子銃」により皮内に送達
することもでき（例えば、Tangら(1992), Nature 356:1
52〜154参照）、この方法では金射出微粒子を治療用DNA
でコーティングし、次いで皮膚細胞中に射出する。
【０１３８】当業者は、用量レベルが化合物の種類、症
状の重症度および対象者の副作用に対する感受性に相関
して変動しうるということを容易に認識すると思われ
る。所与の化合物の好ましい用量は、当分野の技術者に
よって様々な方法で容易に決定される。
【０１３９】本方法は、Npt2Bの作用に関与する様々な
異なる疾患状態の治療において使用することができる。
このように、本方法によって治療できる疾患状態には、
異常に高いPi吸収を特徴とする疾患と、異常に低いPi吸
収を特徴とする疾患状態とが含まれる。異常に低いNpt2
B活性の結果生じる疾患状態は、低リン酸血症の存在を
特徴とするもので、骨軟化症、低カルシウム尿症、くる
病等が含まれる。異常に高いNpt2B活性の結果生じる疾
患状態は、高リン酸血症の存在を特徴とするもので、上
皮小体機能亢進症、低カルシウム血症、ビタミンD欠乏
症、軟部組織または転移性石灰化等が含まれる。特に興
味が持たれるのは、腎機能不全、例えば腎疾患よって生
じ、少なくとも腎機能が損傷された状態等が原因の高リ
ン酸血症を治療するために本方法を使用することであ
る。
【０１４０】治療とは、宿主を苦しめる病的状態に関連
する症状の少なくとも改善を意味し、この場合の改善は
パラメーター、例えば高リン酸血症などの治療中の病的
状態に関連する症状の強度の少なくとも低下を意味する
広い意味で用いられる。このように、治療は、宿主が病
的状態、または少なくとも病的状態の特徴となる症状を
これ以上経験しないように、病的状態、または少なくと
もそれに関連する症状が完全に阻止される、例えば発症
が妨害、または停止される状態を含む。
【０１４１】様々な宿主が本方法によって治療可能であ
る。一般に、このような宿主は「哺乳類」または「哺乳
動物」で、この場合これらの用語は、食肉類（例えばイ
ヌおよびネコ）、齧歯類（例えばマウス、モルモット、
およびラット）、および霊長類（例えばヒト、チンパン
ジー、およびサル）を含む哺乳動物綱の生物を広く意味
して用いられる。多くの態様において、宿主はヒトであ
る。
【０１４２】活性物質の単位用量、通常は経口または注
射用量を含むキットが提供される。このようなキットに
は、単位用量を含む容器に加えて、関心対象となる病的
状態を治療する際の薬剤の使用法および付随する利益に
ついて説明する添付文書が含まれる。好ましい化合物お
よび単位用量は本明細書中で前述しているものである。
【０１４３】下記の実施例は主に例示のために示すもの
である。製剤、用量、投与法、および本発明の他のパラ
メーターは、本発明の精神および範囲から逸脱すること
なく様々な方法で変更または置換することができること
を、当業者であれば容易に理解すると思われる。
【０１４４】
【実施例】実施例１．Npt2B配列の同定 公共のデータベースから入手可能な異なる種からのII型
リン酸ナトリウム共輸送体蛋白質配列の比較から、ほと
んどは非常に密接に関係しているが、ウシとフラウンダ
ーの配列は異なる亜科を形成しているようであることが
明らかにされた。したがって、ヒトよりもウシの配列に
より密接に類似しているNpt2Bクローンについて、Incyt
e LifeSeqデータベースを検索した。多くのクローンが
同定され、そのうちの3つを入手して全挿入部のDNA配列
を決定した。DNA塩基配列決定は自動シーケンサー（PE/
Applied Biosystems Model 373A、カリフォルニア州フ
ォスターシティ）で、製造業者の色素ジデオキシ停止シ
ーケンシングキットを用いて実施した。ウシ蛋白質への
相同性に基づく配列の比較より、これらが同じcDNAに相
当し、最長のものはN-末端から約150アミノ酸を欠いた
部分クローンにすぎないことが明らかにされた。コンセ
ンサス配列を用いてLifeSeqデータベースをさらにスク
リーニングし、コード配列の全長を含むと考えられるも
のを含む、より多くのクローンを同定した。後者をIncy
teから入手して配列決定した。これにより、ウシ／フラ
ウンダーII型共輸送体亜科のヒトのものと考えられる68
9アミノ酸のオープンリーディングフレームがあること
が判明した。LifeSeqデータベースで同定したクローン
の大部分は、肺関連組織サンプル由来ライブラリーから
のものであったが、クローンのいくつかは小腸および卵
巣由来ライブラリーからのものであった。このことか
ら、このcDNAがヒト腸リン酸ナトリウム共輸送体の候補
の可能性があることが示唆された。RT-PCRを用いた実験
により、ヒト小腸サンプル（Clontech Corporation、カ
リフォルニア州パロアルトから入手）由来のcDNA中でこ
の遺伝子の発現が確認された。続いて、この配列のヒト
腸輸送体としての割当てが、アフリカツメガエル（A. I
shizuya-Okaら(1997)腸Na+/PO4 3-共輸送体の時間的およ
び空間的発現は甲状腺ホルモンに依存するカエル変態中
の上皮形質転換に相関するTemporal and Spatial Expre
ssion of an Intestinal Na+/PO4 3- Cotransporter Cor
relates With Epithelial Transformation During Thyr
oid Hormone-Dependent Frog Metamorphosis. Developm
ent Genetics2053〜66）およびマウス（H. Hilfiker
ら、哺乳動物小腸で発現されたネズミII型リン酸ナトリ
ウム共輸送体の特性分析(Characterization of a murin
e type II sodium-phosphate cotransporter expressed
in mammalian small intestine.) PNAS 1998 95: 1456
4〜14569）腸輸送体で報告されている配列との高度の相
同性により強められた。
【０１４５】実施例２．哺乳動物細内における発現およ
びNa/Pi輸送体のアッセイプロトコル ヒトNpt2BのcDNAを、pcDNA3.1またはpREP9（いずれもIn
vitrogen、カリフォルニア州カールスバッドから）など
の適当な哺乳動物構成発現ベクター中にクローン化す
る。必要があれば、cDNAをpLK-neoなどの誘導ベクタ
ー、グルココルチコイド誘導ベクター（スイス、Univer
sity of Lausannne、Institute of BiochemistryのNich
olas Fasel教授より、Gene, 111, 199〜206 (1992)に記
載）中にクローン化する。多くの哺乳動物細胞系統、例
えばHEK293、CHO、MDCK、BHKおよびNIH3T3を発現構成物
でトランスフェクションし、下記のアッセイの一つを用
いて組換え輸送体の安定な発現についてスクリーニング
する。
【０１４６】輸送体を発現する細胞を96穴組織培養プレ
ートに、1穴あたり適当な培地200μl中、細胞50,000か
ら100,000個でのせ、3〜16時間付着させる。アッセイの
直前に、ナトリウムおよびリン酸を含まない洗浄緩衝液
（137mM N-メチル-D-グルカミン、5.4mM KCl、2.8mM Ca
Cl2、1.2mM MgCl2、10mM HEPES、HClでpH7.4に調製）で
細胞を3回洗浄する。次いで下記の成分を加える：(1)反
応緩衝液50μl（137mM NaCl、5.4mM KCl、2.8mM CaC
l2、1.2mM MgCl2、0.1mM kH2PO4、10mM HEPES、KOHでpH
7.4に調製）、(2)反応緩衝液で希釈した試験化合物40μ
l、および(3)トレーサーとして32P（0.25μCi）または
33P（0.5μCi）のいずれかを含む10Xリン酸溶液10μl
（リン酸の最終濃度100μM）。プレートを室温で20〜30
分間インキュベートし、取り込み溶液を除去して細胞を
氷冷した停止溶液（137mM NaCl、10mM Tris-HCl、pH7.
2）で3回洗浄することにより反応を停止する。細胞が取
り込んだ放射活性を、150μlのシンチレーションカクテ
ルを加えた後に計数して求める。対照は試験化合物なし
（賦形剤のみ）でインキュベートした細胞と、ナトリウ
ムの代わりにN-メチル-D-グルカミンを加えた反応緩衝
液中でインキュベートした細胞で構成される。阻害活性
をトレーサーのナトリウム依存性取り込みの阻害パーセ
ンテージで表す。前述のプロトコルを用いて、治療薬候
補をそのNpt2B調節活性についてスクリーニングする。
【０１４７】前述の結果および考察より、新規ヒト腸リ
ン酸ナトリウム共輸送体、ならびにこれに関係するポリ
ペプチドおよびこれをコードする核酸組成物が本発明に
より提供されることは明らかである。これらのポリペプ
チドおよび核酸組成物は、研究、診断、スクリーニング
および治療への施用を含む様々な異なる施用例において
使用できる。同様に、本リン酸ナトリウム共輸送体の同
定により、血漿リン酸濃度の異常に関連する疾患に対す
る治療薬の他の標的が提供されるため、このような疾患
を治療する新しい方法が提供される。したがって、本発
明は当分野に多大な貢献をする。
【０１４８】本明細書中に引用した出版物および特許出
願は全て、個々のものを具体的且つ個別に参考として援
用することを示しているように、本明細書に参考として
組み入れられる。いかなる出版物の引用も出願日が前の
ものを開示するためのものであり、本発明が先の発明に
よりこのような出版物に先行する資格がないことを認め
るものであると解釈されるべきではない。
【０１４９】前述の発明を明確な理解のために実例とし
て詳細に述べてきたが、本発明の内容に照らして見れ
ば、請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく
これに特定の変更および修正を加えることができるとい
うことが当業者には容易に理解できると思われる。
【０１５０】
【発明の効果】本発明により、新規なヒト腸リン酸ナト
リウム共輸送体（すなわちNpt2B）とそれに関係するポ
リペプチド、ならびにこれをコードする核酸組成物が提
供された。本ポリペプチドおよび核酸組成物は、研究、
診断、および治療薬スクリーニングへの施用を含む様々
な施用例、ならびに治療において使用できる。また、腸
Npt2Bの機能に関連する疾患の状態、例えば低リン酸血
症および高リン酸血症などの血清リン酸塩濃度の異常を
特徴とする状態の治療法も提供された。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ヒトNpt2Bのアミノ酸配列を示す図である。
【図２】 ヒトNpt2Bをコードする核酸配列（1〜2650
位）を示す図である。
【図３】 図2の続きであり、ヒトNpt2Bをコードする核
酸配列（2651〜4137位）を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/14 Ａ６１Ｐ 7/08 ４Ｃ０８４ 7/08 13/02 ４Ｈ０４５ 13/02 13/12 13/12 19/00 19/00 19/08 19/08 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ａ (72)発明者 サリアナラヤナ サンクラティ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 サン マテオ 31スト アベニュー 719 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BB03 BB20 CA25 CB01 CB07 CB11 CB14 CB17 DA12 DA13 DA14 DA36 DA37 FA16 FA37 FB01 FB02 FB05 4B024 AA01 AA11 BA80 CA01 CA04 CA11 DA02 DA03 EA04 FA02 FA07 GA18 4B063 QA05 QQ08 QQ89 QR57 QR59 QR60 QR69 QR77 QR80 QS03 QS05 QS36 QX07 4B064 AG01 AG27 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA90X AA91X AA93X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA17 NA14 ZA511 ZA811 ZA961 ZB211 ZC211 ZC212 ZC231 ZC412 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA00 DA76 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号：１のアミノ酸配列を含むNpt2
    Bポリペプチド。
  2. 【請求項２】 リン酸ナトリウム共輸送活性を有する、
    請求項１記載の蛋白質またはポリペプチド。
  3. 【請求項３】 請求項１または２記載の蛋白質またはポ
    リペプチドをコードする核酸。
  4. 【請求項４】 配列番号:２の核酸配列を含む核酸配列
    を有する、請求項３記載の核酸。
  5. 【請求項５】 発現宿主中で機能する転写開始領域と、
    該転写開始領域の転写調節下で請求項３または４記載の
    核酸に認められるヌクレオチド配列を有する核酸と、該
    発現宿主中で機能する転写終結領域とを含む発現カセッ
    ト。
  6. 【請求項６】 宿主細胞中に導入した結果、染色体外要
    素の一部としての、または該宿主細胞のゲノム中に取り
    込まれた、請求項５記載の発現カセットを含む細胞。
  7. 【請求項７】 請求項６記載の宿主細胞の後代細胞。
  8. 【請求項８】 Npt2Bの製造方法であって、該Npt2Bを発
    現する請求項６または７記載の細胞を増殖させること
    と、他の蛋白質を実質的に含まない該Npt2Bを単離する
    こととを含む方法。
  9. 【請求項９】 Npt2Bに特異的に結合するモノクローナ
    ル抗体。
  10. 【請求項１０】 Npt2Bの機能を阻害する請求項９記載
    の抗体。
  11. 【請求項１１】 ヒト化抗体である請求項９または１０
    記載のモノクローナル抗体。
  12. 【請求項１２】 Npt2B調節物質を同定するためのスク
    リーニング法であって、リンアニオン存在下、細胞表面
    で機能性Npt2Bを発現する細胞を候補物質と接触させる
    ことと、該細胞によるリンアニオンの取り込み量を定量
    することとを含む方法。
  13. 【請求項１３】 リンアニオンが検出可能なラベルで標
    識されている、請求項１２記載の方法。
  14. 【請求項１４】 ラベルが同位体である、請求項１２ま
    たは１３記載の方法。
  15. 【請求項１５】 ヒトを除く宿主中でNpt2Bを調節する
    方法であって、該宿主に、請求項１２から１４のいずれ
    か一項記載の方法により同定されたNpt2B調節物質の有
    効量を投与することを含む方法。
  16. 【請求項１６】 宿主中でNpt2Bを調節するための医薬
    品の製造を目的とする請求項１２から１４のいずれか一
    項記載の方法により同定されたNpt2B調節物質の使用。
  17. 【請求項１７】 Npt2Bを発現可能なヒト以外のトラン
    スジェニック動物モデル。
  18. 【請求項１８】 Npt2B調節物質をスクリーニングする
    ための請求項１から２のいずれか一項記載の蛋白質また
    はポリペプチドの使用。
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