ITMI20000200A1 - Traspiratori di ioni - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE dell'Invenzione industriale
Il settore della presente invenzione è il settore dei trasportatori, in particolare dei co-trasportatori di fosfato di sodio.
Base dell’ invenzione
Il fosforo ha un importante ruolo nella struttura delle membrane, nel trasporto e nell'accumulo di energia. In corrispondenza di un pH fisiologico normale (per esempio pH 7,4), il fosfato inorganico (Pi) nel plasma è costituito da una miscela 4:1 di HPO4<2- >e di H2PO4-. Dei 700 g di fosforo presenti nel corpo, 0,1% è presente nel fluido extracellulare in una forma liberamente diffusibile. Il livello piasmatico di Pi viene mantenuto mediante controllo dell'assorbimento di Pi nell'intestino tenue, sotto l'influsso della vitamina D, e mediante l'escrezione di Pi nel rene, sotto l'influsso dell'ormone paratiroideo .
L'assorbimento di Pi richiede un trasporto tran- , sepiteliale. Uno stadio critico del trasporto transepiteliale di Pi è l'assorbimento di Pi in cellule epiteliali. L'assorbimento di Pi viene effettuato da co-trasportatori del fosfato di sodio presentì sulla superficie apicale di opportune cellule epiteliali, per esempio cellule epiteliali intestinali e renali. Fino ad ora, sono stati identificati svariati cotrasportatori del fosfato di sodio, ivi compresi: Na-Pi-1 (coniglio); NPT1 (uomo); Nptl (topo); NaPi-2 (ratto); NaPi-3 (uomo); NaPi-4 (opossum); NaPi-5 (passero); NaPi-6 (coniglio); NaPi-7 (topo); e NaPi di cellule NBL-1 (bue).
Svariate condizioni patologiche sono associate con turbe nel metabolismo di Pi, e tra tali condizioni patologiche sono comprese quelle caratterizzate dalla presenza di ipofosfatemia, per esempio osteomalacia, ipocalciuria e rachitismo e quelle caratterizzate dalla presenza di iperfosf atemia, per esempio iperparatoroidismo, ipocalcemia, carenza di vitamina D, calcificazione del tessuto morbido oppure calcificazione metastatica e simili. In particolare, la iperfosfatemia è una caratteristica di malattia renale e di insufficienza renale ed è una causa che sta alla base di molti dei sintomi gravi osservati nel caso di tali complicazioni renali.
I metodi per il trattamento di anomalie nel metabolismo di Pi sono svariati. Per esempio, nel caso di condizioni patologiche associate con la presenza di ipofosfatemia, tra le metodologie di trattamento sono compresi: variazioni nella dieta per comprendere cibi ricchi di fosforo, integrazione con sali del fosforo, impiego di sostanze terapeutiche, per esempio del dipiridamolo e simili. Nel caso di quelle condizioni patologiche associate con iperfosfatemia, un trattamento in assenza di insufficienza renale può comprendere idratazione e/o impiego di antiacidi a base di alluminio che legano il fosforo nel lumen intestinale . Nel caso in cui sia presente una insufficienza renale, leganti del fosfato e/o modificatori della dieta per limitare l'assunzione di fosforo sono potenzialmente utili, però tipicamente si effettua la dialisi .
A causa dell'ampia varietà di condizioni patologiche caratterizzate dalla presenza di un anormale metabolismo del Pi, sussiste un continuo interesse per l'identificazione dei componenti molecolari responsabili del metabolismo di Pi. Particolarmente interessante sarebbe 1'identificazione del trasportatore intestinale responsabile per l'assorbimento e per la stimolazione di Pi nell'intestino.
Letteratura relativa
Hilfiker et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA (1998) 95:14564-14569 descrive la sequenza di acidi nucleici Npt2B nel topo. E' interessante anche: Feild et al., 'Cloning and Characterization of a Sodium Dependent Phosphate Transporter Isoform Expressed in Human Small Intestine and Lung', pubblicato il 24 dicembre 1998, con il numero di accesso alla genoteca 4071357 e sottoposto dalla Smithkline Beecham Pharmaceutical, 709 Swedeland Road, King of Prussia, PA 19406 il 7 dicembre 1998). Tra i riferimenti che descrivono co-trasportatori del fosfato di sodio, sono compresi: Werner et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA (1991) 88:9608-9612; Chong et al., Genomics (1993) 18:355-359; Chong et al., Am. J. Physiol. (1995) 268: F1038-F1045; Magagnin et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA (1993) 90:5979-5983; Sorribas et al., J. Biol. Chem. (1994) 269:6615-6621; Werner et al., Am. J. Physiol. (1995) 267:F311-F317; Verri et al., Am. J. Physiol. (1995) 268:F626-F633; Collins et al., FASEB J. (1994) 8:862-868; e Helps et al., Eur. J. Biochem. (1995) 228:927-930.
E' interessante anche il brevetto WO 98/37198. Tra i riferimenti che forniscono un'informazione di base riguardante il ruolo di co-trasportatori di fosfato di sodio nel metabolismo del fosforo sono compresi: Tenenhouse, J. Bone Min. Res. (1997) 12: 159, e Harrison's Principles of Internai Medicine, 14° ed. (1988) pg. 2259-2263.
Vengono messi a disposizione un nuovo cotrasportatore del fosfato di sodio intestinale umano (ossia Npt2B) e polipeptidi con esso correlati, e anche composizioni di acidi nucleici che lo codificano. Il polipeptide e le composizioni di acido nucleico soggetto della presente invenzione vengono impiegati in svariate applicazioni, ivi comprese applicazioni di ricerca, di diagnosi e di 'screening' di sostanze terapeutiche e anche in terapie di trattamento. Inoltre vengono messi a disposizione metodi per il trattamento di condizioni patologiche associate con la funzione intestinale Npt2B, per esempio condizioni caratterizzate da anormali livelli di fosfato nel siero, per esempio condizioni di ipofosfatemia e di iperfosfatemia .
La figura 1 indica la sequenza di amminoacidi di Npt2B umano.
La figura 2 indica la sequenza di un acido nucleico che codifica Npt2B umano.
Descrizione dettapliata dell’invenzione
Vengono messi a disposizione un nuovo cotrasportatore di fosfato di sodio intestinale umano (ossia Npt2B) e polipeptidi correlati con esso e anche composizioni di acidi nucleici che lo codificano. Il polipeptide e/o le composizioni di acido nucleico oggetto della presente invenzione vengono impiegati in svariate differenti applicazioni, ivi comprese applicazioni di ricerca, diagnostica e screening di sostanze terapeutiche/scoperta/preparazione. Inoltre, vengono messi a disposizione metodi di trattamento di condizioni patologiche associate con la funzione Npt2B intestinale, per esempio condizioni che sono la conseguenza di anormali livelli di fosfato nel siero, per esempio condizioni di ipofosfatemia e di iperfosfatemia.
Prima che la presente invenzione venga ulteriormente descritta, si deve intendere che la presente invenzione non è limitata alle particolari forme di realizzazione descritte qui di seguito, in quanto si possono effettuare varianti delle particolari forme di realizzazione che rientrano anche esse nell'ambito delle rivendicazioni allegate. Inoltre, si deve intendere che la terminologia impiegata è usata per lo scopo di descrivere particolari forme di realizzazione e non deve venire intesa in senso limitativo. Invece, l'ambito della presente invenzione viene stabilito dalle rivendicazioni allegate.
In questa descrizione e nelle rivendicazioni allegate, le forme singolari 'un', 'una' e 'il' comprendono un riferimento al plurale, a meno che il contesto chiaramente indichi diversamente. A meno che venga diversamente indicato, tutti i termini tecnici e scientifici qui adottati hanno il medesimo significato comunemente adottato da coloro che sono esperti nel settore al quale la presente invenzione appartiene.
Composizioni di polipeptidi
Vengono messi a disposizione un nuovo cotrasportatore del fosfato di sodio umano espresso in cellule epiteliali intestinali e anche composizioni di polipeptidi con esso correlate. Il termine composizioni di polipeptide, così come viene qui usato, si riferisce alla proteina umana di piena lunghezza e anche a sue porzioni o a suoi frammenti. In questo termine sono comprese anche varianti della proteina umana che si trova in natura, dette varianti essendo omologhe oppure sostanzialmente simili alla proteina che si trova in natura, come descritto più dettagliatamente qui di seguito. Nella descrizione che segue della presente invenzione, si usa il termine Npt2B per indicare la molecola di co-trasportatore del fosfato di sodio intestinale umano di tipo selvaggio della presente invenzione.
La proteina Npt2B della presente invenzione è una proteina di membrana avente un certo numero di regioni di transmembrana, in cui il numero di regioni di transmembrana presunto, riferito alla sequenza di amminoacidi, è 10 (come è previsto usando TMpred (www.Ch-embnet.org) riferito alla base TM (Tmbase Adatabase di segmenti di proteine che circondano la membrana. Biol. Chem. Hoppe-Seyler 347, 166). Npt2B è un co-trasportatore di fosfato di sodio tipo II. Nel suo ambiente naturale Npt2B è un co-trasportatore di catione sodio e di anione fosfato. Npt2B viene espresso tra altre posizioni, sulla superficie di cellule epiteliali intestinali, ossia sul lato apicale oppure sul lato luminale intestinale delle cellule epiteliali e, pertanto, effettua il trasporto di ioni sodio e di ioni fosfato dal lumen intestinale nelle cellule epiteliali intestinali. Il Npt2B viene espresso anche in cellule alveolari di tipo II del polmone dove esso può essere coinvolto nel trasporto di fosfato nelle cellule per soddisfare la crescente richiesta della sintesi di glicoproteine della mucina. Npt2B ha una identità di sequenze di amminoacidi 23% con NPT1 umano come descritto in Chong et al., 'Molecular cloning of thè cDNA encoding a human renai sodium phosphate transport protein and its assignment to chromosome 6p21.3-p23', Genomics (1993) 18:355-359 ed una identità 52,5% rispetto a Npt2a umano descritto in Maganin et al., 'Expression Cloning of Human and Rat Renai Cortex Na/Pi co-transport', Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1993) 90:5979-5983 (misurato da MegA-lign, DNAstar (1998) usando l'algoritmo clustale come descritto in D.G. Higgins e P.M. Sharp. Fast and Sensitive multiple Sequence Alignments on a Microcomputer. (1989) CABIOS, 5:151-153. I parametri usati sono ktuple 1, gpa penalty 3, window 5, e diagonals saved 5). Tra le altre caratteristiche di Npt2B sono compresi: siti di glicosilazione potenziale sulle anse extracellulari .
Npt2B ha una sequenza di amminoacidi come indicata nella figura 1 ed identificata come SEQ ID NO: 01. Npt2B ha un peso molecolare, riferito alla sua sequenza di amminoacidi di circa 75 kDa, e più specificamente di 75598.52 dalton (determinato usando Procedimentotean/DNAstar (1997) come per H. Nakashima et al., The Folding Type of a pProtein is Related to thè Amino Acid Composition. J. Biochem (Tokyo) 99:153-162). Il vero peso molecolare di Npt2B può variare a causa di modificazioni della glicosilazione e/o di altre modificazioni di post-tratraduzione. Come tale, l'effettivo peso molecolare di Npt2B verosimilmente è compreso circa tra 70 e 130 kDa.
Inoltre, vengono messi a disposizione omologhi di Npt2B o proteine (oppure loro frammenti) che variano nella sequenza, rispetto alla sequenza di tipo selvaggio della presente invenzione. Con il termine omologo si intende una proteina avente almeno circa 35%, usualmente almeno circa 40% e più usualmente almeno circa 60% di identità di sequenza di amminoacidi rispetto alla proteina Npt2B della presente invenzione, (usando MegAlign, DNAstar (1998) usando un algoritmo clustale come descritto in D.G. Higgins e P.M. Sharp. Fast and Sensitive multiple Sequence Alignments on a Microcomputer (1989) CABIOS, 5: 151-153. I parametri usati sono ktuple 1, gpa penalty 3, window 5, e diagonals saved 5).
Inoltre, vengono messe a disposizione proteine Npt2B che sono sostanzialmente identiche alla proteina hu Npt2B, con il termine sostanzialmente identico indicando che la proteina ha una identità di sequenza di amminoacidi rispetto alla sequenza di Npt2B di almeno circa 60%, usualmente di almeno circa 65% e più usualmente di almeno circa 70%.
Le proteine della presente invenzione sono presenti in un ambiente che non si trova in natura, per esempio sono separate dal loro ambiente naturale. In certe forme di realizzazione, le proteine della presente invenzione sono presenti in una composizione che è arricchita nella proteina della presente invenzione in confronto al suo ambiente naturale. Per esempio, viene messo a disposizione un Npt2B nel quale, con il termine purificato, si intende che il Npt2B è presente in una composizione che è sostanzialmente priva di proteine non-Npt2B, con il termine sostanzialmente priva intendendo che meno di 90%, usualmente meno di 60% e più usualmente meno di 50% della composizione è costituita da proteine non-Npt2B. Le proteine della presente invenzione possono anche essere presenti sotto forma di un isolato, con detto termine intendendo che la proteina è sostanzialmente priva di altre proteine e di altre molecole biologiche che si trovano in natura, per esempio, oligosaccaridi, polinucleotidi e loro frammenti e simili, in cui il termine 'sostanzialmente privo', in questo caso significa che meno di 70%, usualmente meno di 60% e più usualmente meno di 50% della composizione che contiene la proteina isolata è una qualsiasi altra molecola biologica che si trova in natura. In certe forme di realizzazione, le proteine sono presenti in forma sostanzialmente pura, con 'forma sostanzialmente pura' intendendo un grado di purezza di almeno 95%, usualmente di almeno 97% e più usualmente di almeno 99%.
Oltre alle proteine che si trovano in natura, vengono messi a disposizione anche polipeptidi che sono diversi dalle proteine che si trovano in natura, per esempio polipeptidi Npt2B. Con polipeptide Npt2B si intende una sequenza di amminoacidi codificata da una fase di lettura aperta (ORF) del gene che codificata Npt2B descritto più dettagliatamente qui di seguito, ivi compresa la proteina a piena lunghezza Npt2B e suoi frammenti, in particolare frammenti biologicamente attivi e/o frammenti che corrispondono a domini funzionali, per esempio un dominio di transmembrana e simili; e ivi comprese fusioni dei polipeptidi della presente invenzione con altre proteine o con loro parti. Frammenti interessanti, tipicamente, avranno una lunghezza di circa 10 aa, usualmente di almeno circa 50 aa, e possono avere una lunghezza per esempio di 300 aa oppure possono essere più lunghi, però usualmente tale lunghezza non supererà circa 1000 aa, il frammento avendo un tratto di amminoacidi che è identico alla proteina della presente invenzione di almeno circa 10 aa ed usualmente di almeno circa 15 aa, e in molte forme di realizzazione di almeno circa 50 aa di lunghezza.
Si possono ottenere le proteine ed i polipeptidi della presente invenzione, da sorgenti naturali oppure si può produrli sinteticamente. Per esempio, in generale, il Npt2B viene ottenuto da cellule epiteliali dell'intestino, però può anche venire ottenuto da altri tipi di cellule o da altri tessuti nei quali l'espressione di Npt2B viene identificata, per esempio polmone, ecc.
Le proteine della presente invenzione possono anche venire ottenute da mezzi sintetici, per esempio esprimendo un gene riconibinante che codifica una proteina che interessa in un adatto ospite, come descritto più dettagliatamente qui di seguito. Si può adottare qualsiasi procedimento di purificazione di proteine opportuno, adatte metodologie di purificazione di proteine essendo descritte in Guide to Protein Purification, (Deuthser ed.) (Academic press, 1990). Per esempio, si può preparare un U sato dalla sorgente originale, per esempio da cellule epiteliali intestinali oppure dall'ospite espressione e si può purificarle effettuando una cromatografia di esclusione, HPLC, una elettroforesi attraverso gel, una cromatografia di affinità e simili.
Composizioni di acidi nucleici
Inoltre, vengono messe a disposizione composizioni di acidi nucleici che codificano proteine Npt2B oppure loro frammenti e anche gli omologhi Npt2B della presente invenzione. Con il termine composizione di acido nucleico Npt2B si intende una composizione che comprende una sequenza di DNA avente una fase di lettura aperta che codifica Npt2B, ossia, un gene Npt2B e che, in opportune condizioni, può venire espressa come Npt2B. In questo termine sono compresi anche acidi nucleici che sono omologhi oppure sostanzialmente simili o identici agli acidi nucleici che codificano proteine Npt2B. Così, la presente invenzione mette a disposizione geni che codificano il Npt2B umano della presente invenzione e loro omologhi. Il gene Npt2B umano ha la sequenza di acidi nucleici indicato nella figura 2, ed è identificato come SEQ ID N0:2, infra.
La sorgente di geni omologhi può essere qualsiasi specie, per esempio specie di primati, in particolare l'uomo; roditori, per esempio ratti e topi, cani, gatti, buoi, ovini, equini, lieviti, nematodi, ecc. Tra specie di mammiferi, per esempio uomo e topo, gli omologhi hanno una sostanziale somiglianza di sequenza, per esempio una identità di sequenza almeno 75%, usualmente almeno 90%, più usualmente almeno 95% tra sequenze di nucleotidi. La somiglianza di sequenze viene calcolata sulla base di una sequenza di riferimento che può essere una sottospecie di una sequenza più grande, per esempio un motivo conservato, una regione codificante, una regione fiancheggiante, ecc. Una sequenza di riferimento, usualmente, avrà una lunghezza di almeno circa 18 nt, più usualmente di almeno circa 30 nt e può estendersi fino alla sequenza completa che deve venire confrontata. Algoritmi per l'analisi di frequenze sono noti nel settore, per esempio BLAST, descritto in Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10 (usando default setting). Le sequenze qui messe a disposizione sono essenziali per riconoscere proteine correlate con Npt2B e proteine omologhe, e gli acidi nucleici che le codificano, in ricerche database.
Acidi nucleici che codificano la proteina Npt2B e polipeptidi Npt2B della presente invenzione possono essere cDNA oppure DNA genomico oppure un loro frammento. Il termine 'gene Npt2B' dovrà venire inteso nel senso di indicare la fase di lettura aperta che codifica proteine Npt2B specifiche e polipeptidi, e introni Npt2B e anche sequenze di nucleotidi non codificanti 5' e 3' adiacenti, coinvolte nella regolazione di espressione, fino a circa 20 kb al di là della regione codificante, però possibilmente ulteriormente in una direzione o nell'altra direzione. Il gene può venire introdotto in un opportuno vettore per un mantenimento extracromosomico oppure per una integrazione in un genoma ospite.
Il termine 'cDNA' così come viene qui usato ha 10 scopo di comprendere tutti gli acidi nucleici che hanno in comune la trasposizione di elementi di sequenza trovati in specie di mRNA mature naturali, in cui gli elementi di sequenza sono esoni e sono regioni non-codificanti 5' e 3'. Normalmente, le specie di mRNA hanno esoni contigui, gli introni intermedi, quando presenti, venendo rimossi mediante 'splicing' di RNA nucleare per creare una fase di lettura aperta, continua, che codifica una proteina Npt2B.
Una sequenza genomica interessante comprende l'acido nucleico presente tra il codone di inizio e 11 codone di arresto, come definito nelle sequenze elencate, ivi compresi tutti gli introni che, normalmente, sono presenti in un cromosoma nativo. Essa inoltre può comprendere regioni non tradotte 5' e 3' che si trovano nel mRNA maturo. Inoltre, essa può comprendere sequenze di regolazione di trascrizione e di traduzione specifiche, per esempio promotori, ’enhancers', ecc., ivi compreso circa 1 kb, ma possibilmente più di 1 kb di DNA genomico fiancheggiante in corrispondenza dell'estremità 5' oppure dell'estremità 3' della regione trascritta. Il DNA genomico può venire isolato sotto forma di un frammento da 100 kbp oppure più piccolo; e sostanzialmente privo di sequenza cromosomica fiancheggiante. Il DNA genomico che fiancheggia la regione codificante 3' oppure 5' oppure sequenze di regolazione interne come talvolta si trovano in introni, contiene sequenze necessarie per un opportuno tessuto e per una opportuna espressione specifica di stadi.
Le composizioni di acidi nucleici della presente invenzione possono codificare tutta la proteina Npt2B della presente invenzione, oppure una sua parte. Si possono ottenere frammenti a doppio filamento o a filamento singolo dalla sequenza di DNA mediante sintesi chimica di oligonucleotidi secondo metodi tradizionali, mediante digestione con enzimi di restrizione, mediante amplificazione di PCR, ecc. Per la massima parte, i frammenti di DNA saranno di almeno 15 nt, usualmente di almeno 18 nt oppure 25 nt, e possono essere di almeno circa 50 nt.
I geni di Npt2B vengono isolati ed ottenuti con un grado di purezza sostanziale, generalmente diversi rispetto ad un cromosoma intatto. Usualmente, il DNA verrà ottenuto sostanzialmente privo di altre sequen-ze di acidi nucleici che non comprendono una sequenza di Npt2B o un suo frammento, generalmente avendo un grado di purezza di almeno 50%, usualmente di circa almeno 90% e sono tipicamente 'ricombinanti', ossia sono fiancheggiati da uno o più nucleotidi con i quali essi sono normalmente non associati su un cromosoma che si trova in natura.
Una forma di realizzazione preferita della presente invenzione è un polipeptide Npt2B con una sequenza di amminoacidi sostanzialmente identica, in particolare almeno per il 90% identica, alla sequenza SEQ ID NO: 01.
Inoltre, è preferito anche il suddetto polipeptide Npt2B che comprende la sequenza di amminoacidi di SEQ ID NO: 01.
Un altro aspetto preferito della presente invenzione è una proteina oppure un polipeptide come precedentemente indicato, avente una attività di cotrasportatore di fosfato di sodio.
Inoltre, si preferisce un frammento del polipeptide Npt2B come qui precedentemente descritto.
Un ulteriore aspetto preferito della presente invenzione è un acido nucleico che codifica una proteina oppure un polipeptide come descritto sopra, in particolare in cui detto acido nucleico ha una se-quenza di acido nucleico che è sostanzialmente iden-tica alla sequenza di nucleotidi di SEQ ID NO: 02. Si preferisce inoltre un frammento di detto acido nucleico.
Inoltre, un altro aspetto preferito è un acido nucleico isolato oppure un suo mimetico che ibridizza, in condizioni rigorose, con l'acido nucleico come qui precedentemente indicato oppure una sua sequenza complementare.
Un altro aspetto preferito è una cassetta di espressioni che comprende una regione di iniziazione di trascrizione funzionale in un ospite dì espressione, un acido nucleico avente una sequenza di nucleotidi che si trova nell'acido nucleico come precedentemente nella regolazione di trascrizione di detta regione di iniziazione di trascrizione, ed una regione di terminazione di trascrizione funzionali in detto ospite di espressione. Particolarmente preferita è una cellula che comprende una cassetta di espressione come precedentemente indicata, come parte di un elemento extracromosomico oppure integrata nel genoma di una cellula ospite, come risultato di una introduzione di detta cassetta di espressione in detta cellula ospite. Particolarmente preferita è inoltre la progenie cellulare della cellula ospite, come descritto sopra.
Un'ulteriore forma di realizzazione preferita della presente invenzione è un metodo per la produzione di Npt2B, detto metodo consistendo nel fare crescere una cellula come descritta sopra, per cui detto Npt2B viene espresso; ed isolare detto Npt2B sostanzialmente privo di altre proteine.
Inoltre, si preferisce un anticorpo monoclonale che si lega specificamente a Npt2B, in particolare 1'anticorpo nel quale detto anticorpo inibisce l'attività di Npt2B e particolarmente preferito è detto anticorpo monoclonale, in cui detto anticorpo è un anticorpo umanizzato.
Un'altra forma di realizzazione preferita della presente invenzione è un metodo per modulare Npt2B in un ospite, detto metodo consistendo nel somministrare una quantità efficace di un agente modulante di Npt2B a detto ospite, preferibilmente in cui detto agente modulante è una molecola piccola e in particolare in cui detto agente modulante è un anticorpo.
Inoltre, si preferisce l'impiego di un agente modulante di Npt2B per la produzione di un farmaco per la modulazione di Npt2B in un ospite.
Un metodo di screening per identificare agenti modulanti di Npt2B è inoltre un aspetto preferito, detto metodo consistendo nel mettere a contatto una cellula che esprime Npt2B funzionale sulla sua superficie con un agente candidato in presenza di anione fosforo; e determinare la quantità di anione fosforo assorbita da detta cellula. Particolarmente preferito è questo metodo, nel quale detto anione fosforo viene marcato con un marcatore rilevabile e, in particolare, in cui detto marcatore è isotopico.
Un'altra forma di realizzazione preferita della presente invenzione è un modello di animale transgenico non umano capace di esprimere Npt2B.
Inoltre, si preferisce l'impiego dì una proteina oppure di un polipeptide come precedentemente definito per lo screening di agenti modulanti del Npt2B.
Un altro aspetto preferito della presente invenzione è l'impiego di un agente modulante di Npt2B per la produzione di un farmaco per il trattamento di un ospite che presenta una condizione patologica associata con l'attività di Npt2B.
Inoltre, si preferisce un metodo per il trattamento di un ospite che presenta una condizione patologica associata con l'attività di Npt2B, detto metodo consistendo nel somministrare a detto ospite un agente modulante di Npt2B, preferibilmente, in cui detto agente modulante di Npt2B è un agonista di Npt2B, in modo particolarmente preferito, in cui detto agente modulante di Npt2B è un antagonista di Npt2B. Molto preferito è il metodo di cui sopra, in cui detta condizione patologica è caratterizzata dalla presenza di iperfosfatemia.
Preparazione di polipeptidi di Npt2B
Oltre alla pluralità di impieghi descritta più dettagliatamente nelle sezioni che seguono, le composizioni di acidi nucleici della presente invenzione vengono impiegate nella preparazione di tutti i polipeptidi di Npt2B oppure di una porzione di essi, come descritto sopra. Per l'espressione, si può impiegare una cassetta di espressione. Il vettore di espressione metterà a disposizione una regione di inizio di trascrizione e di traduzione che può essere inducibile oppure costitutiva, in cui la regione codificante è collegata operativamente sotto il controllo di trascrizioni della regione di inizio di trascrizione ed una regione di terminazione di trascrizione e di traduzione. Queste regioni di controllo possono essere native rispetto al gene Npt2B oppure possono essere derivate da sorgenti esogene.
I vettori di espressione, in generale, hanno opportuni siti di restrizione situati in prossimità della sequenza promotrice, per realizzare l'inserzione di sequenze di acido nucleico che codificano proteine omologhe. Può essere presente un marcatore selezionabile che opera nell'ospite di espressione. Si possono usare vettori dì espressione per la produzione di proteine di fusione, in cui il peptide di fusione esogeno conferisce un'ulteriore funzionalità, ossia fa aumentare la sintesi di proteine, la stabilità, la reattività con antisieri definiti, un marcatore di enzimi, per esempio la β-galattosidasi, ecc.
Si possono preparare cassette di espressione che comprendono una regione di inizio di trascrizione, il gene oppure un suo frammento, ed una regione di terminazione della trascrizione. Particolarmente interessante è l'uso di sequenze che consentono l'espressione di epìtopi funzionali oppure di domini, aventi usualmente una lunghezza di almeno circa 8 amminoacidi, più usualmente una lunghezza di almeno circa 15 amminoacidi, fino a circa 25 amminoacidi, e oltre, e fino alla fase di lettura aperta completa del gene. Dopo introduzione del DNA, le cellule contenenti il costrutto possono venire scelte, per mezzo di un marcatore selezionabile, le cellule possono venire fatte espandere e quindi possono venire usate per 1'espressione .
Proteine e polipeptidi di Npt2B possono venire espressi in procarioti oppure in eucarioti secondo metodi tradizionali, a seconda dello scopo per l'espressione. Nel caso di una produzione in grande scala della proteina, come cellule-ospite di espressione si possono usare un organismo unicellulare, per esempio E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae, cellule di insetti in combinazione con vettori di baculovirus, oppure cellule di un organismo superiore, per esempio cellule di vertebrati, in particolare di mammiferi, per esempio cellule COS 7, HEK 293, CHO, Xenopus Oocytes, ecc. In alcuni casi, è desiderabile esprimere il gene di Npt2B in cellule eucariotiche, nelle quali la proteina di Npt2B trarrà vantaggio da modificazioni di avvolgimento naturale e da modificazioni di post-traslazione. Piccoli peptidi possono anche venire sintetizzati in laboratorio. Si possono usare polipeptidi che sono sottoserie della sequenza Ntp2B completa per identificare e investigare parti della proteina importanti per la funzione,
impieghi del polipeptide Npt2B e delle composizioni di acidi nucleici
Le composizioni di polipeptidi e di acidi nucleici della presente invenzione vengono impiegati in svariate differenti applicazioni, ivi comprese applicazioni nella ricerca, nel settore diagnostico e nello screening/scoperta/preparazione di sostanze terapeutiche e anche in composizioni terapeutiche e in metodi nei quali esse vengono impiegate.
Applicazioni di ricerca
Le composizioni di acidi nucleici della presente invenzione vengono impiegate in svariate applicazioni di ricerca. Tra le applicazioni di ricerca interessanti sono comprese: l'identificazione di omologhi di Npt2B; come sorgente di nuovi elementi promotori; l'identificazione di fattori di regolazione dell'espressione di Npt2B; come sonde e come inneschi in applicazioni di ibridazione, per esempio PCR; l'identificazione di modelli di espressione in campioni biologici, la preparazione di modelli di cellule o di modelli di animali per la funzione di Npt2B; la preparazione di modelli in vitro per la funzione Npt2B; ecc.
Omologhi di Npt2B vengono identificati adottando uno qualsiasi di numerosi metodi. Un frammento del cDNA ottenuto può venire usato come sonda di ibridazione contro una genoteca di cDNA dall'organismobersaglio che interessa, adottando condizioni di bassa drasticità. La sonda può essere un frammento grande, oppure può essere uno o più inneschi corti degenerati. Acidi nucleici aventi una somiglianza di sequenze vengono rivelati mediante ibridazione in condizioni di scarsa drasticità, per esempio, a 50°C e a 6XSSC (cloruro di sodio 0,9 M/citrato di sodio 0,09 M) e rimangono legati quando vengono sottoposti ad un lavaggio a 55°C in 1XSSC (cloruro di sodio 0,15 M/citrato di sodio 0,015 M).
Si può determinare l'identità di sequenze mediante ibridazione in condizioni drastiche, per esempio a 50°C o ad una temperatura elevata e con 0,1XSSC (cloruro di sodio 15 mM/citrato di sodio 0,15 mM). Acidi nucleici aventi una regione di sostanziale identità rispetto alla sequenze di Npt2B ottenute, per esempio varianti alleliche, versioni del gene geneticamente alterate, ecc., si legano alle sequenze, di Npt2B ottenute, in condizioni di ibridazione drastiche. Usando sonde, in particolare usando sonde marcate di sequenze di DNA, si possono isolare geni omologhi oppure geni correlati.
La sequenza della regione fiancheggiante 5' può venire utilizzata per elementi promotori, ivi compresi siti di legame di 'enhancer' che realizzano una regolazione di sviluppo in tessuti nei quali il Npt2B viene espresso. L'espressione specifica in tessuti è utile per determinare il modello di espressione e per ottenere promotori che mimino i modelli nativi di espressione. Polimorfismi che si trovano in natura nella regione del promotore sono utili per determinare variazioni naturali nell'espressione, in particolare quelle che possono venire associate con una malattia.
Come alternativa, si possono introdurre mutazioni nella regione del promotore per determinare l'effetto di alterazione dell'espressione in sistemi sperimentalmente definiti. I metodi per l'identificazione di specifici motivi di DNA coinvolti nel legame di fattori di trascrizione sono noti nel settore, per esempio la somiglianza di sequenze nei confronti di motivi di legame noti, studi di ritardo di gel, ecc. Per esempio, vedi Blackwell et al. (1995), Mol. Med. 1: 194-205; Mortlock et al. (1996), Genome Res. 6:327-33; e Joulin e Richard-Foy (1995), Eur. J. Biochem. 232-620-626.
Si possono usare le sequenze di regolazione per identificare sequenze di azione cis necessarie per la regolazione della trascrizione oppure della traslazione di un'espressione del gene Npt2B, in particolare in differenti tessuti oppure in differenti stadi di sviluppo e per identificare sequenze di azione cis e fattori di azione-trans che regolano oppure mediano l'espressione del gene di Npt2B. Tali regioni di con-trollo della trascrizione o della traslazione possono venire collegate operativamente ad un gene di Npt2B allo scopo di favorire l'espressione di proteine Npt2B di tipo selvaggio o di proteine di Npt2B alterate o di altre proteine interessanti in cellule coltivate, oppure in tessuti embrionali, fetali oppure in tessuti di adulti e per la terapia con geni.
Piccoli frammenti di DNA sono utili come inneschi per PCR, come sonde per lo screening di ibridazione, ecc., frammenti di DNA più grandi, ossia superiori a 100 nt, sono utili per la produzione del polipeptide codificato, come descritto nella precedente sezione. Per l'impiego in reazioni di amplificazione geometrica, per esempio PCR geometrico, si userà una coppia di inneschi. L'esatta composizione delle sequenze di inneschi non è critica ai fini della presente invenzione, però, per la massima parte delle applicazioni, gli inneschi ibridizzeranno con la sequenza oggetto della presente invenzione in condizioni drastiche, come è noto nel settore. E' preferibile scegliere una coppia di inneschi che formi un prodotto di amplificazione di almeno circa 50 nt, preferibilmente di almeno circa 100 nt. Algoritmi per la scelta di sequenze di inneschi generalmente sono noti e sono reperibili in confezionamenti di materiale software di tipo commerciale. Inneschi di amplificazione ibridizzano con filamenti complementari di DNA e si innescheranno tra loro.
Il DNA, inoltre, può venire usato per identificare un'espressione del gene in un campione biologico. Il metodo secondo il quale si esaminano cellule per stabilire la presenza di particolari sequenze di nucleotidi per esempio DNA genomico oppure RNA genomico, è ben descritto in letteratura. In breve, DNA oppure mRNA viene isolato da un campione di cellule. Il mRNA può venire amplificato con RT-PCR, usando transcriptasi inversa per formare un filamento di DNA complementare, seguita da una amplificazione mediante reazione a catena con polimerasi, nella quale si impiegano inneschi specifici per le sequenze di DNA in questione. Come alternativa, il campione di mRNA viene separato mediante elettroforesi su gel, viene trasferito su un adatto supporto, per esempio nitrocellulosa, nylon, ecc., e quindi viene esaminato con un frammento del DNA in questione sotto forma di una sonda. Inoltre, si possono adottare altre tecniche, per esempio prove di legame di oligonucleotidi, ibridazione in situ e ibridazione con sonde di DNA sistemate su un 'chip' solido. La rivelazione di mRNA che ibridizza con la sequenza della presente invenzione è indicativa dell'espressione del gene di Npt2B presente nel campione.
La sequenza di un gene Npt2B, ivi comprese regioni di promotori fiancheggianti e regioni codificanti, può venire sottoposta a mutazione in diversi modi noti nel settore per effettuare variazioni di bersaglio nella resistenza del promotore, nella sequenza della proteina codificata, ecc. Il prodotto nella sequenza di DNA o nella proteina di una tale mutazione usualmente sarà sostanzialmente simile alle sequenze qui indicate, ossia, differirà di almeno un nucleotide o un amminoacido, rispettivamente e può differire di almeno due, ma non più di circa dieci nucleotidi oppure amminoacidi. Le variazioni di sequenza possono essere sostituzioni, inserzioni, delezioni oppure una loro combinazione. Tra le delezioni possono essere comprese inoltre maggiori variazioni, per esempio delezioni, di un dominio oppure di un esone. Tra le altre modificazioni interessanti è compresa una marcatura di epitopi, per esempio con il sistema FLAG, con HA, ecc. Per studi di localizzazione subcellulare, si possono usare proteine di fusione con proteine dotate di fluorescenza verde (GFP).
Tecniche per effettuare una mutagenesi in vitro di geni clonati sono note. Si possono trovare esempi di protocolli per mutagenesi sito-specifica in Gustin et al. (1993), Biotechniques 14:22; Barany (1985), Gene, 37:111-23; Colicelli et al., (1985), Mol. Gen. Genet. 199:537-9; e Prentki et al., (1984), Gene 29: 303-13. Si possono trovare metodi per mutagenesi sito-specifica in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press 1989, pg. 15.3-15.108; Weiner et al. (1983), Gene 126:35-41; Sayers et al. (1992), Biotechniques 13:592-6; Jones e Winistorfer (1992), Biotechniques 12:528-30; Barton et al. (1990), Nucleic Acids Res 18:7349-55; Marotti e Tomich (1989), Gene Anal. Tech. 6:67-70; e Zhu (1989), Anal. Biochem 177:120-4. Si possono usare tali geni sottoposti a mutazione per studiare relazioni struttura-funzione di Npt2B oppure per alterare proprietà della proteina che influiscono sulla sua funzione oppure sulla sua regolazione.
Si possono usare gli acidi nucleici oggetto della presente invenzione per provocare la formazione di animali non-umani, transgenici oppure una modificazione di geni sito-specifica in linee di cellule. Si possono produrre animali transgenici mediante ricombinazione omologa, nella quale il locus Npt2B endogeno viene alterato. Come alternativa, un costrutto di acido nucleico viene integrato con distribuzione casuale, nel genoma. Tra i vettori per una integrazione stabile, sono compresi plasmidi, retrovirus e altri virus animali, YAC e simili.
Le cellule modificate o gli animali modificati sono utili nello studio della funzione Npt2B e nella sua regolazione. E' interessante l'impiego di geni di Npt2B per costruire modelli di animali transgenici di condizioni patologiche correlate con Npt2B, per esempio iperfosfatemia oppure ipofosfatemia. Così, tra i modelli di animali transgenici della presente invenzione sono compresi prodotti di abbattimento di Npt2B endogeno, nei quali l'espressione di Npt2B endogeno è almeno ridotta se non eliminata, nei quali tali animali inoltre tipicamente esprimono un peptide Npt2B della presente invenzione, ossia la proteina Npt2B della presente invenzione oppure un suo frammento. Nel caso in cui si introduca un acido nucleico avente una sequenza che si trova nel gene Npt2B umano, l'acido nucleico introdotto può essere una sequenza completa oppure una sequenza parziale del gene Npt2B. Un marcatore rivelabile, per esempio lac Z, può venire introdotto nel sito Npt2B, e in questo modo una sovraregolazione dell'espressione di Npt2B darà come risultato una variazione facilmente rivelata nel fenotipo. Inoltre, può essere possibile realizzare un'espressione del gene Npt2B o di sue varianti in cellule o in tessuti nei quali esso non viene normalmente espresso, a livelli che normalmente non sono presenti in tali cellule o in tali tessuti.
I costrutti di DNA per una ricombinazione omologa comprenderanno almeno una porzione del gene di Npt2B della presente invenzione, nella quale il gene ha la modificazione genetica desiderata (le modificazioni genetiche desiderate) e comprende regioni di omologia verso il sito del bersaglio. Non è necessario che costrutti di DNA per una integrazione casuale comprendano regioni di omologia per mediare una ricombinazione. Opportunamente, sono compresi marcatori per una selezione positiva e per una selezione negativa. Nel settore sono noti metodi per produrre cellule aventi modificazioni di geni-bersaglio ottenute tramite una ricombinazione omologa. Per diverse tecniche per il trasferimento di cellule di mammiferi, vedi Keown et al. (1990), Meth. Enzumol. 185:527-537.
Nel caso di cellule staminali embrionali (ES), si può impiegare una linea di cellule ES, oppure si possono ottenere cellule embrioniche da un ospite, per esempio un topo, un ratto, un porcellino d'india. Tali cellule vengono fatte crescere su un opportuno strato di sostanze di alimentazione di fibroblasti oppure vengono fatte crescere in presenza di un fattore che inibisce la leucemia (LIF). Quando si sono trasformate cellule ES oppure cellule embrionali, esse possono venire usate per produrre animali transgenici. Dopo la trasformazione, le cellule vengono applicate su uno strato di alimentazione in un mezzo opportuno. Cellule contenenti il costrutto possono venire rivelate impiegando un mezzo selettivo. Dopo un tempo sufficiente per la crescita di colonie, le colonie vengono prelevate e analizzate per esaminare la comparsa di un ricombinazione omologa oppure di una integrazione del costrutto. Le colonie che sono positive possono venire quindi usate per una manipolazione embrionale e per una iniezione di blastociti. Si ottengono blastociti da femmine superovulate di 4-6 settimane. Le cellule ES vengono trattate con tripsina e le cellule modificate vengono iniettate nel blastocele del blastocista. Dopo iniezione, i blastociti vengono riportati in ciascun corno uterino di femmine pseudogravide. Quindi, si lascia che le femmine terminino la gravidanza e si sottopone a screening la progenie ottenuta per il costrutto. Realizzando un differente fenotipo del blastocisto e delle cellule geneticamente modificate, si può rivelare facilmente una progenie chimerica.
Gli animali chimerici vengono sottoposti a screening per la presenza del gene modificato e i maschi e le femmine aventi la modificazione vengono accoppiati per ottenere una progenie di omozigoti. Se le alterazioni del gene provocano mortalità in corrispondenza di un determinato momento nello sviluppo, i tessuti oppure gli organi possono venire mantenuti sotto forma di innesti o di trapianti allogenici oppure congenici oppure sotto forma di una coltura in vitro. Gli animali transgenici possono essere qualsiasi animale mammifero non umano, per esempio animali da laboratorio, animali domestici, ecc. Si possono usare gli animali transgenici in studi funzionali, nello screening di farmaci, per esempio per determinare l'effetto di un determinato farmaco sull'attività di Npt2B.
Applicazioni diagnostiche
Vengono inoltre messi a disposizione metodi di diagnosi di stati patologici basati su livelli osservati di Npt2B oppure sul livello di espressione del gene Npt2B in un campione biologico che interessa. In questo caso si impiegano campioni, ivi compresi fluìdi biologici come sangue, fluido cerebrospinale, lacrime, saliva, linfa, fluido di dialisi, sperma e fluidi simili, fluidi derivati dalla coltura di organi o di tessuti, e fluidi estratti da tessuti fisiologici. Nel termine sono compresi anche derivati e frazioni di tali fluidi. Le cellule possono venire dissociate, nel caso di tessuti solidi, oppure si possono analizzare sezioni di tessuti. Come alternativa, si può preparare un lisato delle cellule.
Sono disponibili numerosi metodi per determinare il livello di espressione di un gene o di una proteina in un particolare campione. Si può effettuare una diagnosi adottando numerosi metodi per determinare l'assenza oppure la presenza di quantità alterate di Npt2B normale oppure anormale in un campione di un paziente. Per esempio, nella rivelazione, si può utilizzare la colorazione di cellule o di sezioni istologiche con anticorpi marcati, effettuata secondo metodi tradizionali. Le cellule vengono rese permeabili per colorare molecole citoplasmatiche. Gli anticorpi in questione vengono aggiunti al campione di cellule e vengono sottoposti ad incubazione per un periodo di tempo sufficiente a consentire un legame all'epitopo, usualmente per un tempo di almeno circa 10 minuti. L'anticorpo può venire marcato con radioisotopi, enzimi, sostanze fluorescenti, sostanze chemiluminescenti o altri marcatori per una rivelazione diretta. Come alternativa, si impiega un anticorpo o un reagente di secondo stadio per amplificare il segnale. Tali reagenti sono ben noti nel settore. Per esempio, l'anticorpo primario può venire coniugato con biotina, aggiungendo, come reagente di secondo stadio, avidina coniugata con perossidasi di rafano. Come alternativa, l'anticorpo secondario può venire coniugato con un composto fluorescente, per esempio fluoresceina, rodanina, rosso Texas, ecc. Nella rivelazione finale si impiega un substrato che subisce una variazione di colore in presenza della perossidasi. L'assenza oppure la presenza di un anticorpo di legame può venire determinato adottando diversi metodi ivi compresi citometria di flusso di cellule dissociate, microscopia, radiografia, conta mediante scintillazione, ecc.
In alternativa, si può focalizzare l'attenzione sull'espressione di Npt2B. Si possono effettuare studi biochimici per determinare se un polimorfismo di sequenza in una regione che codifica Npt2B oppure in regioni di controllo sia associato con una malattia. Tra i polimorfismi associati con malattie possono essere compresi delezione o troncamento del gene, mutazioni che alterano il livello di espressione, che influiscono sull'attività della proteina, ecc.
Variazioni nella sequenza del promotore o dell'enhancer che possono influire sui livelli di espressione di Npt2B possono venire confrontate con livelli di espressione dell'allele normale, adottando diversi metodi noti nel settore. Tra i metodi per la determinazione della forza del promotore o dell'enhancer sono compresi la quantificazione della proteina naturale espressa, l'inserzione dell'elemento di controllo variante in un vettore con un gene 'reporter', per esempio β-galattosidasi, luciferasi, cloramfenicolo acetiltransferasi, ecc., che realizza un'opportuna quantificazione; e simili.
Sono disponibili numerosi metodi per analizzare acidi nucleici, per stabilire la presenza di una sequenza specifica, per esempio un polimorfismo associato con una malattia. Nel caso in cui siano disponibili notevoli quantità di DNA, si impiega direttamente DNA genomico. Come alternativa, la regione in questione viene clonata in un adatto vettore e viene fatta crescere in quantità sufficiente per effettuare una analisi. Si possono usare cellule che esprimono Npt2B come sorgente di mRNA, che può venire esaminato direttamente oppure può venire sottoposto a trascrizione inversa ottenendo così cDNA per l'analisi. L'acido nucleico può venire amplificato mediante tecniche tradizionali, per esempio la reazione a catene con polimerasì (PCR) per ottenere quantità sufficienti per l'analisi. L'impiego della reazione a catene con polimerasi è descritto in Saiki, et al. (1985), Science 239:487, e si può trovare una rassegna di tecniche in Sambrook et al., Molecular Cloninq: A Laboratory Manual, CSH Press, 1989, pg. 14.2-14.33. Come alternativa, sono noti diversi metodi nel settore nel quale si impiega un legame di oligonucleotidi come mezzo per rivelare polimorfismi, per esempio Riley et al. (1990), Nucl. Acids Res. 18: 2887-2890; e Delahunty et al. (1996), Am. J. Hum. Genet. 58:1239-1246.
In una reazione di amplificazione, si può introdurre un marcatore rivelabile. Tra i marcatori adatti sono compresi fluorocromi, per esempio fluoresceina isotiocianato (FITC) , rodamina, rosso Texas, ficoeritrina, allof icocianina, 6-carbossif luoresceina (6-FAM) , 2',7'-dimetossi-4 ',5'-dicloro- 6-carbossif luoresceina (JOE), 6-carbossi-X-rodamìna (ROX) , 6-carbossi-2' ,4',7',4, 7-esaclorof luoresceina (HEX) , 5-carbossi-fluoresceina (5-FAM) oppure N,N,N',N' -tetrametil-6-carbossirodamina (TAMRA), marcatori radioattivi, per esempio <32>P, <35>S, <3>H; ecc. Il marcatore può essere un sistema a due stadi, nel quale il DNA amplificato viene collegato con biotina, con apteni, ecc., avendo un partner di legame dotato di elevata affinità, per esempio avidina, anticorpi specifici, ecc., in cui il partner di legame è collegato con un marcatore rivelabile. Il marcatore può essere coniugato ad uno degli inneschi oppure ad entrambi gli inneschi. Come alternativa, la massa di nucleotidi usata nell'amplificazione viene marcata in modo da introdurre il marcatore nel prodotto di amplificazione.
L'acido nucleico campione, per esempio un frammento amplificato oppure clonato, viene analizzato adottando uno di numerosi metodi noti nel settore. L'acido nucleico può venire sequenziato adottando il metodo cosiddetto 'dideossi' oppure altri metodi e la sequenza di basi può venire confrontata con una sequenza del gene Npt2B di tipo selvaggio. Inoltre, si può effettuare una ibridazione con una sequenza variante per determinarne la preesenza, mediante analisi Southern blots, dot blots, ecc. Il modello di ibridazione di una sequenza di controllo e di una sequenza variante per una serie di sonde di oligonucleotidi immobilizzate su un supporto solido, come descrìtto in US 5.445.934 oppure in WO 95/35505, può venire usato anch'esso come mezzo per rivelare la presenza di sequenze varianti. Si utilizzano analisi di polimorfismo conformazionale a singolo filamento (SSCP), elettroforesi su gel con gradiente di denaturazione (DGGE) e analisi di eteroduplex in matrici di gel per rivelare variazioni di conformazione provocate da una variazione di sequenza di DNA, come alterazioni nella mobilità elettroforetica. Come alternativa, nel caso in cui un polimorfismo crea oppure distrugge un sito di riconoscimento per una endonucleasi di restrizione, il campione viene fatto digerire con quella endonucleasi e i prodotti vengono sottoposti a frazionamento in base alle dimensioni, per determinare se il frammento è stato digerito. Si effettua il frazionamento mediante elettroforesi attraverso gel oppure mediante elettroforesi capillare, in -particolare gel di acrilammide o gel di agarosio.
Uno screening per mutazioni in Npt2B può essere basato sulle caratteristiche funzionali oppure sulle caratteristiche antigeniche della proteina. Saggi di troncamento di proteine sono utili per rivelare delezioni che possono influire sull'attività biologica della proteina. Nello screening si possono effettuare diversi immunosaggi destinati a rivelare polimorfismi in proteine Npt2B. Nel caso in cui molte diverse mutazioni genetiche portino ad un particolare fenotipo di malattia, prove su proteine funzionali si sono rilevate efficaci strumenti di screening. L'attività della proteina Npt2B codificata può venire determinata mediante confronto con la proteina di tipo selvaggio.
Metodi diagnostici della presente invenzione nei quali il livello di espressione del gene Npt2B è interessante, tipicamente, comporteranno un confronto tra l'abbondanza di acido nucleico Npt2B di un campione in questione con quella di un campione di controllo per determinare eventuali differenze relative, le differenze potendo venire misurate qualitativamente e/o quantitativamente, dette differenze venendo quindi messe in relazione con la presenza oppure con l'assenza di un modello di espressione del gene Npt2B anormale. A coloro che sono esperti nel settore, sono noti svariati e differenti metodi per determinare l'abbondanza di acido nucleico in un campione, e tra i particolari metodi in questione sono compresi quelli descritti in: Pietu et al., Genome Res. (giugno 1996) 6:492-503; Zhao et al, Gene (24 giugno 1995) 156: 207-213; Soares, Curr. Opin. Biotechnol. (ottobre 1997) 8:542-546; Raval, J. Pharmacol Toxicol Methods (novembre 1994) 32: 125-127; Chalifour et al., Anal. Biochem (1 febbraio 1994) 216: 299-304; Stolz & Tuan, Mol. Biotechnol. (dicembre 19960 6:225-230; Hong et al., Bioscience Reports (1982) 2: 907; e McGraw, Anal. Biochem. (1984) 143:298. Sono interessanti anche i metodi descritti in W097/27317, la cui descrizione viene qui riportata come riferimento.
Saggi di screening
I polipeptidi Npt2B della presente invenzione vengono impiegati in diversi saggi di screening destinati ad identificare sostanze terapeutiche. Così, si può usare un modello di cellula per esempio una cellula ospite, per esempio CHO, HEL293, COS7, Xenoplus Oocyte, ecc., che è stata transfettata in modo sufficiente ad esprimere Npt2B sulla sua superficie. Quindi, si può mettere a contatto la cellula con un mezzo che comprende ioni sodio e ioni fosfato e misurare la quantità di anioni fosfato che sono situati all'interno della cellula, effettuando le misurazioni in ambienti di controllo e in ambienti di saggio, per esempio in presenza di un composto modulante Npt2B candidato, per esempio un agonista di Npt2B oppure un antagonista di Npt2B oppure un inibitore. Per favorire la rivelazione dì un assorbimento di Pi, fosforo marcato è presente nel mezzo, in cui si può impiegare qualsiasi marcatore opportuno, per esempio un marcatore isotopico, per esempio come e presente in <32>P oppure <33>P. Come alternativa, si possono effettuare misurazioni di corrente adottando metodi elettrofisiologici ben noti (vedi per esempio Electrophysiology, A practical Approach (IRL Press) (1993)), dai quali si può determinare l'assorbimento di Pi. Esempi di saggi per la misurazione dell'assorbimento di Pi vengono descritti in: Maganin et al., Proc. Nat'l Acad. Sci USA (luglio 1993) 90:5979-5983; e Helps et al., Eur. J. Biochem. (1995) 228:927-930.
In saggi di screening sono inoltre interessanti animali non-umani, transgenici, che esprimono Npt2B funzionale, detti animali essendo descritti sopra. In molte forme di realizzazione, gli animali non presentano Npt2B endogeno. Impiegando tali animali per applicazioni di screening, si somministra un composto (si somministrano composti) all'animale, e si confrontano le variazioni che si ottengono nel fenotipo, per esempio il livello di Pi nel siero, eventualmente, con un controllo.
Come alternativa, si possono preparare ed impiegare modelli in vitro. Per esempio, si può misurare l'attività di legame di Npt2B in un ambiente in vitro nel quale si controllano casi di legame tra Npt2B e agenti modulanti di Npt2B candidati. In altri modelli in vitro, si preparano bistrati di lipidi sintetici nei quali è presente il co-trasportatore Npt2B della presente invenzione e si misura un passaggio di Pi da un lato del bistrato di lipide ad un altro. Si possono trovare descritti esempi di tali saggi di bistrati di lipidi sintetici in: Brutyan et al., Biochimica et Biophysica Acta (1995) 1236:339-344; Wonderlin et al., Biophys. J. (1990) 58:289-297; e Suarez-Isla et al. Biochemistry (1983) 22:2319-2323.
Nel saggio di screening possono essere inclusi svariati altri reagenti. Tra questi sono compresi reagenti come sali, proteine neutre, per esempio albumina, detergenti, ecc., che vengono usati per facilitare un legame proteina-proteina ottimale e/o ridurre interazioni non-specifiche oppure interazioni di fondo. Si possono usare reagenti che fanno migliorare l'efficienza del saggio, per esempio inibitori della proteasi, inibitori della nucleasi, sostanze antimicrobiche, ecc.
Mediante i metodi di cui sopra, si possono sottoporre a screening svariate e differenti sostanze terapeutiche che servono come agonisti di Npt2B oppure come antagonisti di Npt2B. Le sostanze adatte per questo scopo comprendono numerose classi di prodotti chimici, sebbene tipicamente esse siano molecole organiche, preferibilmente composti organici piccoli aventi un peso molecolare superiore a 50 e inferiore a circa 2500 dalton. Le suddette sostanze terapeutiche adatte contengono gruppi funzionali necessari per una interazione strutturale con proteine, in particolare legami di idrogeno e tipicamente tra essi sono compresi gruppi amminici, gruppi carbonilici, gruppi ossidrilici oppure gruppi carbossilici, preferibilmente almeno due dei gruppi chimici funzionali. Le sostanze adatte spesso sono costituite da strutture di atomi di carbonio cicliche oppure eterocicliche e/o da strutture aromatiche oppure poliaromatiche sostituite con uno o più dei suddetti gruppi funzionali. Inoltre, si trovano sostanze adatte tra biomolecole ivi compresi peptidi, saccaridi, acidi grassi, steroidi, purine, pirimidine, derivati, analoghi strutturali oppure loro combinazioni.
Si ottengono sostanze adatte da un'ampia varietà di sorgenti, ivi comprese raccolte di composti sintetici oppure naturali. Per esempio numerosi mezzi sono reperibili per una sintesi casuale e diretta di un'ampia varietà di composti organici e di biomolecole, ivi compresa l'espressione di oligonucleotidi e di oligopeptidi casuale. Come alternativa, sono reperibili o sono facilmente prodotte raccolte di composti naturali sotto forma di estratti di batteri, di funghi, di vegetali e di animali. Inoltre, raccolte naturali oppure raccolte prodotte sinteticamente e composti vengono facilmente modificati adottando metodi chimici, fisici e biochimici tradizionali e possono venire usati per produrre raccolte di combinazione di prodotti. Sostanze farmacologiche note possono venire sottoposte a modificazioni chimiche dirette o casuali, per esempio acilazione, alchilazione, esterificazione, ammidificazìone, ecc., per ottenere analoghi strutturali.
Particolarmente interessanti in molte forme di realizzazione sono metodi di screening nel quale si identificano sostanze che modulano selettivamente, per esempio, inibiscono il Npt2B della presente invenzione e non altri co-trasportatori del fosfato di sodio, per esempio i co-trasportati del fosfato di sodio renali, per esempio Nptl. Per identificare tali sostanze, si può realizzare un protocollo di screening multi-stadio, in cui sostanze che inibiscono Npt2B, in un primo saggio, vengono quindi analizzate per ciò che riguarda la loro possibilità di inibire sostanze che non sono trasportatori di Npt2B. Si può effettuare qualsiasi saggio opportuno in questo saggio di secondo stadio, per esempio i saggi descritti in Maganin et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA (luglio 1993) (90:5979-5983; e Helps et al., Eur. J. Biochem (1995), 228:927-930.
Acido nucleico Npt2B e composizioni terapeutiche di polipeptidi
Le composizioni di acido nucleico della presente invenzione vengono impiegate inoltre come sostanze terapeutiche in casi nei quali si desidera fare aumentare l'attività di Npt2B in un ospite, per esempio stadi patologici associati con ipofosfatemia. I geni di Npt2B, frammenti di geni o la proteina Npt2B codificata oppure frammenti di proteine, sono utili nella terapia con geni per trattare anomalie associate con difetti di Npt2B. Si possono usare vettori di espressione per introdurre il gene Npt2B in una cellula. In generale, tali vettori hanno opportuni siti di restrizione situati in prossimità della sequenza dei promotori per ottenere l'inserzione di sequenze di acidi nucleici. Si possono preparare cassette di trascrizione che comprendono una regione di inizio di trascrizione, il gene-bersaglio oppure un suo frammento, e una regione di terminazione della trascrizione. Si possono introdurre le cassette di trascrizione in svariati vettori, per esempio plasmidi; retrovirus per esempio lentivirus; adenovirus, e simili, in cui i vettori possono venire mantenuti momentaneamente oppure stabilmente nelle cellule, usualmente per un periodo di almeno circa un giorno, più usualmente per un periodo di almeno circa parecchi giorni fino a parecchie settimane.
Il gene oppure la proteina Npt2B può venire introdotto in tessuti oppure in cellule-ospite adottando numerosi metodi, ivi compresi infezione virale, microiniezione o fusione di vescicole. Si può anche usare una iniezione per una somministrazione intramuscolare, come descritto da Furth et al., (1992), Anal Biochem 205:365-368. Il DNA può venire applicato su microparticelle di oro e può venire sommistrato per via intradermica impiegando un dispositivo per il bombardamento di particelle, o 'pistola dei geni' come descritto in letteratura (vedi, per esempio, Tang et al. (1992), Nature 356:152-154, in cui microproiettili di oro vengono rivestiti con il DNA, quindi vengono bombardati in cellule della pelle.
Metodi di modulazione dell'attività di Npt2B
La presente invenzione mette a disposizione metodi per modulare l'attività di Npt2B in una cellula, ivi compresi metodi per fare aumentare l'attività di Npt2B (per esempio metodi per fare aumentare il trasporto di Pi), e anche metodi per ridurre o inibire l'attività di Npt2B, per esempio metodi di bloccaggio del trasporto di Pi oppure di limitazione del trasporto di Pi. In tali metodi, una quantità efficace di un agente modulante di Npt2B viene messa in contatto con la cellula.
Inoltre, vengono messi a disposizione metodi di modulazione, ivi compreso il metodo di aumento ed inibizione dell'attività di Npt2B in un ospite. In tali metodi, sì somministra all'ospite una quantità efficace di una sostanza attiva che modula l'attività di Npt2B in vivo, per esempio usualmente fa aumentare oppure inibisce l'attività di Npt2B. La sostanza attiva può essere costituita da svariati differenti composti, ivi compresi un composto costituito da una piccola molecola naturale oppure sintetica, un anticorpo, un suo frammento oppure un suo derivato, una composizione antisenso e simili.
In certe forme di realizzazione sono particolarmente interessanti sostanze che fanno diminuire l'attività di Npt2B, per esempio il trasporto di Pi, di almeno 10 volte, usualmente di almeno circa 20 volte e più usualmente di almeno circa 25 volte, come misura effettuata con il saggio di trasporto di oociti, come descritto nel lavoro di Magagnin di cui sopra. In molte forme di realizzazione, è particolarmente interessante l'impiego di composti che fanno diminuire l'attività di Npt2B di almeno 100 volte, in confronto ad un controllo.
E' interessante anche l'impiego di sostanze che, realizzando una diminuzione dell'attività di Npt2B non fanno diminuire sostanzialmente l'attività di altri co-trasportatori del fosfato di sodio, per esempio Nptl, ecc. Così, dette sostanze in questa forma di realizzazione sono inibitori selettivi di Npt2B. Si considera che un agente sia selettivo se esso realizza la diminuzione di attività di Npt2B di cui sopra, ma sostanzialmente non fa diminuire l'attività di almeno un altro tipo di co-trasportatore del fosfato di sodio, sostanzialmente ciò significando una diminuzione di meno di 10 volte, usualmente una diminuzione di meno di 5 volte, e in molti casi una diminuzione di meno di 1 volta, detta attività venendo misurata come descritto sopra nel lavoro di Magagnin.
Tra i composti della presente invenzione costituiti da piccole molecole naturali oppure sintetiche, sono comprese numerose classi di prodotti chimici, sebbene tipicamente esse siano molecole organiche, preferibilmente composti organici di molecole piccole aventi un peso molecolare superiore a 50 e inferiore a circa 2.500 dalton. Le sostanze adatte, contengono gruppi funzionali necessari per una interazione strutturale con proteine, in particolare legame idrogeno e tipicamente contengono gruppi amminici, carbonilici, ossidrilici oppure carbossilici, preferibilmente almeno due dei gruppi chimici funzionali. Le sostanze adatte spesso sono costituite da strutture con atomi di carbonio cicliche oppure da strutture eterocicliche e/o da strutture aromatiche oppure poliaromatiche sostituite con uno o più dei suddetti gruppi funzionali. Si trovano adatte sostanze anche tra biomolecole che comprendono peptidi, saccaridi, acidi grassi, steroidi, purine, pirimidine, loro derivati, loro analoghi strutturali oppure loro combinazioni.
Come sostanze attive sono interessanti anche anticorpi che fanno almeno diminuire, se non inibiscono l'attività di Npt2B bersaglio nell'ospite. Si ottengono adatti anticorpi immunizzando un animale—ospite con peptidi che comprendono tutta la proteinabersaglio oppure una porzione della proteinabersaglio per esempio Npt2B. Tra gli animali-ospite adatti sono compresi topi, ratti, pecore, capre, criceti, conigli, eco. L'origine dell'immunogeno proteico può essere un topo, l'uomo, un ratto, una scimmia, ecc. L'animale-ospite, in generale, sarà una specie differente rispetto all'immunogeno, per esempio Npt2B umano usato per immunizzare topi, eco.
L'immunogeno può comprendere la proteina completa, oppure suoi frammenti e suoi derivati. Tra gli immunogeni preferiti sono compresi tutto il Npt2B oppure una parte di Npt2B, questi residui contenendo le modificazioni di post-traduzione, per esempio glicosilazione, che si trovano nella proteina-bersaglio nativa. Si producono immunogeni che comprendono il dominio extracellulare adottando svariati metodi noti nel settore, per esempio espressione di geni clonati usando metodi ricombinanti tradizionali, isolamento da HEC, ecc.
Per la preparazione di anticorpi policlonali, il primo stadio è la immunizzazione dell'animale-ospite con la proteina-bersaglio, in cui la proteina bersaglio preferibilmente sarà in forma sostanzialmente pura, che contiene meno di circa 1% di contaminante. L'immunogeno può essere costituito da tutta la proteina-bersaglio, da suoi frammenti o da suoi derivati. Per fare aumentare la risposta immunitaria dell'animale-ospite, la proteina-bersaglio può venire combinata con una sostanza coadiuvante, tra le sostanze coadiuvanti adatte essendo comprese allume, destrano, solfato, anioni polimerici grandi, emulsioni olio in acqua, per esempio l'adiuvante di Freund, l'adiuvante completo di Freund e simili. La proteinabersaglio può anche venire coniugata con proteine di supporto sintetiche o con antigeni sintetici. Svariati ospiti possono venire immunizzati per produrre gli anticorpi policlonali. Tra tali ospiti sono compresi conigli, porcellini d'india, roditori, per esempio topi, ratti, pecore, capre, e simili. La proteinabersaglio viene somministrata all'ospite, usualmente per via intradermica, con un dosaggio iniziale seguito da uno o più, usualmente almeno due, ulteriori dosaggi dì richiamo. Dopo l'immunizzazione, il sangue prelevato dall'ospite verrà raccolto, quindi si effettuerà la separazione del siero dalle cellule del sangue. Il Ig presente nell'antisiero ottenuto può venire sottoposto ad ulteriore frazionamento adottando metodi noti per esempio frazionamento con sali di ammonio, cromatografia DEAE e simili.
Si producono anticorpi monoclonali mediante tecniche tradizionali. In generale, la milza e/o i nodi linfatici di un animale-ospite immunizzato costituiscono una sorgente di cellule del plasma. Le cellule del plasma vengono immortalate mediante fusione con cellule di mielomi per produrre cellule di ibridomi. Il surnatante della coltura proveniente da singoli ibridomi viene sottoposto a screening adottando teeniche standard per identificare quelle che producono anticorpi aventi la specificità desiderata. Tra gli animali adatti per la produzione di anticorpi monoclonali nei confronti della proteina umana sono compresi topi, ratti, criceti, ecc. Per stimolare gli anticorpi contro la proteina di topo, l'animale in generale sarà un criceto, un porcellino d'india, un coniglio, ecc. L'anticorpo può venire purificato dai surnatanti di cellule di ibridomi o asciti fluidi mediante tecniche tradizionali, per esempio cromatografia di affinità, usando Npt2B legato ad un supporto insolubile, sefarosio proteina A, ecc.
L'anticorpo può venire prodotto sotto forma di una singola catena, invece che nella forma della normale struttura multimerica. Anticorpi a singola catena sono descritti in Jost et al. (1994) J.B.C. 269: 26267-73 e in altre fonti di letteratura. Sequenze di DNA che codificano la regione variabile della catena pesante e la regione variabile della catena leggera vengono collegate ad uno spaziatore che codifica almeno circa 4 amminoacidi di amminoacidi neutri piccoli, ivi comprese la glicina e/o la serina. La proteina codificata mediante questa fusione consente l'assemblaggio di una regione variabile funzionale che conserva la specificità e l'affinità dell 'anticorpo originale.
Per l'impiego in vivo, in particolare per iniezioni nell'uomo, è desiderabile fare diminuire 1'antigenicità dell'anticorpo . Una risposta immunitaria di un ricevente nei confronti dell'agente bloccante, potenzialmente farà diminuire il periodo di tempo durante il quale la terapia è efficace. Nel settore sono noti metodi per umanizzare anticorpi. L'anticorpo umanizzato può essere il prodotto di un animale avente geni di regioni costanti di immunoglobuline umane transgeniche (vedi per esempio le domande di brevetti WO 90/10077 e WO 90/04036). Come alternativa, l'anticorpo della presente invenzione può venire costruito mediante ingegneria genetica mediante tecniche del DNA ricombinante per sostituire i domini principali CHI, CH2, CH3 e/o il dominio di intelaiatura con la corrispondente sequenza umana (WO 92/02190) .
L'impiego di Ig cDNA per la costruzione di geni chimerici di immunoglobuline è noto nel settore (Liu et al. (1987) P.N.A .S. 84:3439 e (1987) J. Immunol.
139:3521) . mRNA viene isolato da un ibridoma o da un'altra cellula che produce 1'anticorpo e viene usato per produrre cDNA. Il cDNA in questione può venire amplificato mediante la reazione a catene con polimerasi usando specifici inneschi (brevetti U.S. NO.
4.683.195 e 4.683.202). In alternativa, si prepara una genoteca e la si sottopone a screening per isolare la sequenza che interessa. La sequenza di DNA che codifica la regione variabile dell'anticorpo viene quindi fatta fondere con sequenze con regioni costanti umane. Le sequenze di geni con regioni costanti umane si possono trovare descritte in Kabat et al (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, N.I.H., pubblicazione NO. 91-3242. Geni di regioni C umani sono facilmente reperibili da cloni noti. La scelta di un isotipo verrà guidata dalle funzioni di effettori desiderate, per esempio un fissaggio del complemento oppure una attività in una citotossicità di cellule dipendente da anticorpi. Isotipi prefeirti sono IgGl, IgG3 e IgG4. Si possono usare una o l'altra delle regioni costanti a catena leggera umane kappa oppure lambda. L'anticorpo umanizzato, chimerico, viene quindi espresso mediante metodi tradizionali .
Si possono preparare frammenti di anticorpi, per esempio Fv, F(ab')2 e Fab mediante scissione della proteina intatta, per esempio mediante scissione con proteasi oppure mediante scissione chimica. Come alternativa, si progetta un gene troncato. Per esempio, un gene chimerico che codifica una porzione del frammento F(ab')2 comprenderà la sequenza di DNA che codificano il dominio CH1 e la regione cardine della catena H, seguite da un codone di arresto di traduzione per ottenere la molecola troncata.
Si possono usare sequenze di consenso di regioni H e LJ per progettare oligonucleotidi per l'impiego come inneschi per introdurre siti di restrizione utili nella regione J per un successivo legame di segmenti di regioni V a segmenti di regioni C umane. Il cDNA di regioni C può venire modificato mediante mutagenesi sito-diretta, per sostituire un sito di restrizione in corrispondenza della posizione analoga nella sequenza umana.
Tra i vettori di espressione sono compresi plasmidi, retrovirus, YAC, episomi derivati da EBV e simili. Un vettore opportuno è un vettore che codifica una sequenza di immunoglobuline CH o CL umane funzionalmente completa, con opportuni siti di restrizione disposti in modo che qualsiasi sequenza VH o qualsiasi sequenza VL possa venire facilmente inserita ed espressa. In tali vettori, usualmente avviene uno 'splicing' tra il sito del donatore ’splice' nella regione J inserita e il sito dell'accettore 'splice' che precede la regione C umana, e inoltre in corrìspondenza delle regioni 'splice' che si hanno all'interno degli esoni CH umani. Una poliadenilazione ed una terminazione di trascrizione avvengono in corrispondenza di siti cromosomici nativi a valle delle regioni codificanti. L'anticorpo chimerico che si ottiene può venire collegato a qualsiasi promotore forte, ivi compresi gli LTR retrovirali, per esempio il promotore precoce SV-40, (Okayama et al. (1983) Mol. Celi. Bio. 3:280), LTR del virus del sarcoma di Rous (Gorman et al. (1982) P,N.A.S. 79:6777), e il LTR del virus della leucemia del topo moloney (Grosschedl et al. (1985) Celi. 41:885); promotori Ig nativi, ecc.
In ancora altre forme di realizzazione della presente invenzione, la sostanza attiva è una sostanza che modula e in generale fa diminuire oppure regola verso il basso, l'espressione del gene che codifica la proteina-bersaglio dell'ospite. Per esempio, si possono usare molecole antisenso per regolare verso il basso l'espressione di Npt2B in cellule. Il reagente antisenso può essere costituito da oligonucleotidi antisenso (ODN), in particolare può essere costituito da un ODN sintetico che contiene modificazioni chimiche ottenuto da acidi nucleici presenti in natura oppure da costrutti di acidi nucleici che esprimono tali molecole antisenso come RNA. La sequenza antisenso è complementare rispetto al mRNA del gene bersagliato e inibisce l'espressione dei prodotti del gene bersagliati. Molecole antisenso inibiscono l'espressione di geni tramite diversi meccanismi, per esempio facendo diminuire la quantità di mRNA reperibile per traduzione, mediante attivazione di RNAasi H oppure mediante impedimento sterico. Si può somministrare una molecola antisenso oppure si può somministrare una combinazione di molecole antisenso, tale combinazione potendo comprendere parecchie sequenze differenti.
Si possono produrre molecole antisenso mediante espressione di tutta una sequenza di gene-bersaglio oppure di una parte di una sequenza di gene-bersaglio in un opportuno vettore, in cui l'inizio di trascrizione viene orientato in modo che venga prodotto un filamento antisenso sotto forma di una molecola di RNA. Come alternativa, la molecola antisenso è un oligonucleotide sintetico. In generale, oligonucleotidi antisenso avranno una lunghezza dì almeno circa 7, usualmente di almeno circa 12, più usualmente di almeno circa 20 nucleotidi e avranno una lunghezza di non più di circa 500, usualmente non più di circa 50, più usualmente non più di circa 35 nucleotidi, la lunghezza essendo regolata dall'efficienza di inibizione, dalla specificità, ivi compresa l'assenza di reattività incrociata, e simili. Si è trovato che oligonucleotidi corti, aventi una lunghezza compresa tra 7 e 8 basi, possono essere forti e selettivi inibitori di espressione di geni (vedi Wagner et al. (1996), Nature Biotechnol. 14:840-844).
Una specifica regione o specìfiche regioni della sequenza di mRNA endogeno con filamento in senso è scelta in modo da essere complementare con la sequenza antisenso. La scelta di una specifica sequenza per 1'-oligo-nucleotide può venire effettuata usando un metodo empirico, nel quale si analizzano parecchie sequenze candidate per l'inibizione di espressione del gene-bersaglio in un modello in vitro o in un modello su animali. Si può anche adottare una combinazione di sequenze, nel caso in cui si scelgano parecchie regioni della sequenza mRNA per una complementazione antisenso.
Oligonucleotidi antisenso possono venire sintetizzati chimicamente mediante metodi noti nel settore (vedi Wagner et al. (1993), supra, e Milligan et al., supra). Oligonucleotidi preferiti sono chimicamente modificati rispetto alla struttura del fosfodiestere naturale, allo scopo di fare aumentare la stabilità intracellulare e l'affinità di legame. Parecchie di tali modificazioni sono state descritte in letteratura ed esse alterano la chimica dello scheletro, degli zuccheri oppure delle basi eterocicliche.
Tra i cambiamenti utili nella chimica della struttura, vi sono: fosforotioati; fosforoditioati, nei quali entrambi gli ossigeni di non-legame sono sostituiti con zolfo; fosforo ammiditi; alchil fosfotriesteri e boranofosfati . Tra i derivati di fosfati achirali sono compresi 3'-0'-5'-S-fosforotioato, 3'-S-5'-0-fosforotioato, 3'-CH2-5'-0-fosfonato e 3'-NH-5'-O-fosforoammidato. Acidi nucleici di peptidi sostituiscono l'intero scheletro di fosfodiestere del ribosio con un legame peptidico. Modificazioni di zucchero vengono anch'esse usate per fare aumentare la stabilità e l'affinità. Si può usare l'anomero-Π del deossiribosio, la base venendo invertita rispetto all'anomero-D naturale. Il 2'-OH dello zucchero ribosio può venire alterato per formare zuccheri 2'-O-metilici oppure zuccheri 2'-0-allilici, e ciò realizza una resistenza nei confronti di una degradazione senza compromettere l'affinità. Una modificazione delle basi eterocicliche deve mantenere un opportuno appaiamento delle basi. Tra alcune sostituzioni utili sono comprese deossiuridina al posto di deossitimidina; 5-metil-2'-deossicitidina e 5-bromo-2'-deossicitidina al posto della deossicitidina. Si è messo in evidenza che la 5-propinil-2'deossiuridina e la 5-propinil-2'-deossicitidina fanno aumentare l'affinità e l'attività biologica, quando vengono impiegate al posto della deossitimidina e rispettivamente della deossicitidina.
Come alternativa rispetto agli inibitori antisenso, si possono usare composti di acidi nucleici catalitici, per esempio ribozimi, coniugati antisenso, ecc., per inibire l'espressione del gene. Si possono sintetizzare ribozimi in vitro e si può somministrarli al paziente, oppure si può codificarli su un vettore di espressione, dal quale il ribozima viene sintetizzato nella cellula bersagliata (per esempio, vedi domanda di brevetto internazionale WO 9523225 e Beigelman et al. (1995), Nucl. Acids Res.
23:4434-42). Esempi di oligonucleotidi dotati di attività catalitica sono descritti in WO 9506764. Coniugati di ODN anti-senso con un complesso di un metallo, per esempio terpiridilCu(II), capaci di mediare una idrolisi di mRNA sono descritti in Bashkin et al. (1995), Appi. Biochem. Biotechnol. 54:43-56.
Come indicato sopra, all'ospite viene somministrata una quantità efficace di sostanza attiva, l'espressione 'quantità efficace' indicando un dosaggio sufficiente per ottenere il risultato desiderato. In generale, il risultato desiderato è almeno un aumento oppure una diminuzione nell'assorbimento intestinale degli anioni fosfato, misurato mediante livelli di Pi nel plasma, in confronto ad un controllo.
Nei metodi della presente invenzione, la sostanza attiva (le sostanze attive) può venire somministrata all'ospite adottando qualsiasi metodo opportuno che può ottenere la desiderata modulazione dell'attività Npt2B, per esempio una diminuzione desiderata nell'assorbimento di Pi e nei livelli di Pi nel plasma. Così, la sostanza attiva può venire introdotta in svariate formulazioni per effettuare una somministrazione terapeutica. Più in particolare, le sostanze attive della presente invenzione possono venire formulate ottenendo composizioni farmaceutiche mediante combinazione con opportuni supporti o opportuni diluenti farmaceuticamente accettabili e possono venire formulati in modo da ottenere preparati in forma solida, semi-solida, liquida, oppure gassosa, per esempio compresse, capsule, polveri, granuli, pomate, soluzioni, supposte, preparati iniettabili, preparati per inalazione e aerosol.
Così, una somministrazione delle sostanze attive può venire effettuata in diversi modi, ivi compresi una somministrazione per via orale, attraverso la bocca, per via rettale, per via parenterale, intraperitoneale, intradermica, transdermica, intratracheale, ecc.
In forme di dosaggio farmaceutiche, le sostanze attive possono venire somministrate sotto forma di loro sali farmaceuticamente accettabili, oppure possono anche venire usate da sole, oppure in una opportuna associazione e anche in combinazione con altri composti farmaceuticamente attivi. I metodi e gli eccipienti che seguono sono semplicemente esemplificativi e non sono in alcun modo limitativi.
Nel caso di preparati per una somministrazione orale, le sostanze attive possono venire usate da sole, oppure in combinazione con opportuni additivi per preparare compresse, polveri, granuli oppure capsule, per esempio con additivi tradizionali, per esempio lattosio, mannitolo, amido di mais, oppure amido di patate, con agenti leganti, per esempio cellulosa cristallina, derivati della cellulosa, acacia, amido di mais oppure gelatine, con disaggreganti, per esempio amido di mais, amido di patate oppure sodio carbossimetilcellulosa; con lubrificanti, per esempio talco oppure stearato di magnesio; e, se si desidera, con diluenti, sostanze-tampone, umidificanti, agenti di conservazione e aromatizzanti.
Le sostanze attive possono venire formulate per ottenere preparati per uso iniettabile, sciogliendole, mettendole in dispersione oppure emulsionandole in un solvente acquoso oppure non acquoso, per esempio oli vegetali oppure altri oli simili, gliceridi di acidi alifatici sintetici, esteri di acidi alitatici superiori oppure propilen glicol; e, se si desidera, con additivi tradizionali, per esempio solubilizzantì, sostanze isotoniche, disperdenti, emulsionanti, stabilizzanti ed agenti di conservazione.
Le sostanze attive possono venire impiegate in una formulazione per aerosol da somministrare mediante inalazione. I composti della presente invenzione possono venire formulati in propellenti accettabili sotto pressione, per esempio diclorodifluorometano, propano, azoto e simili.
Inoltre, le sostanze attive possono venire preparate ottenendo supposte mediante miscelazione con una varietà di basi, per esempio basi emulsionanti oppure basi solubili in acqua. I composti della presente invenzione possono venire somministrati per via rettale sotto forma di supposte. Le supposto possono contenere sostanze-veicolo per esempio burro di cacao, cere e polietilen glicoli, che fondono alla temperatura del corpo, e solidificano a temperatura ambiente.
Si possono realizzare forme di dosaggio unitario per una somministrazione orale oppure rettale, per esempio sciroppi, elisir e sospensioni, in cui ciascuna unità di dosaggio, per esempio, un dosaggio di sostanze che può venire contenuta in un cucchiaino da tè, un dosaggio di sostanze che può venire contenuta in un cucchiaio da tavola, compresse oppure supposte, contiene una predeterminata quantità della composizione contenente uno o più inibitori. In modo simile, forme di dosaggio unitario per somministrazione mediante iniezione oppure somministrazione endovenosa, possono contenere l'inibitore (gli inibitori) in una composizione sotto forma di una soluzione in acqua sterile, in soluzione salina normale o in un'altra sostanza-veicolo farmaceuticamente accettabile.
L'espressione 'forma di dosaggio unitario' così come viene qui usata, si riferisce a unità fisicamente singole adatte come dosaggi unitari per l'uomo e per animali, ciascuna unità contenendo una predeterminata quantità di composti della presente invenzione, calcolata in quantità sufficiente ad ottenere l'effetto desiderato, in associazione con un diluente, un supporto o una sostanza-veicolo farmaceuticamente accettabile. Le indicazioni riguardanti le nuove forme di dosaggio unitario della presente invenzione dipendono dal particolare composto impiegato e dall'effetto da ottenere e dalla farmacodinamica associata con ciascun composto nell'ospite.
Gli eccipienti farmaceuticamente accettabili, per esempio sostanze-veicolo, sostanze ausiliarie, supporti oppure diluenti, sono facilmente reperibili per le persone. Inoltre, sono facilmente reperibili per le persone sostanze ausiliarie farmaceuticamente accettabili, per esempio sostanze che regolano il pH e sostanze-tampone, sostanze che regolano la tonicità, stabilizzanti, tensioattivi e simili.
Nel caso in cui la sostanza attiva sia un polipeptide, un polinucleotide, un suo analogo oppure un suo prodotto mimetico, per esempio una composizione antisenso, essa può venire introdotta in tessuti oppure in cellule ospite tramite numerose vie, ivi comprese infezione virale, microiniezione oppure fusione dì vescicole. Una iniezione può venire anche usata nel caso di una somministrazione intramuscolare, come descritto da Furth et al. (1992), Anal Biochem 205: 365-368. Il DNA può venire applicato su miscroparticelle di oro e può venire somministrato per via intradermica usando un dispositivo di bombardamento di particelle, o 'pistola per geni' come descritto in letteratura (vedi per esempio, Tang et al (1992), Nature, 356:152-154), i microproiettili di oro venendo ricoperti con il DNA terapeutico, quindi venendo incorporati in cellule della pelle.
Coloro che sono esperti nel settore intenderanno facilmente che i livelli di dosaggio possono variare in funzione del composto specifico, in funzione della gravità dei sintomi ed in funzione della tendenza del soggetto a presentare effetti collaterali. Dosaggi preferiti per un determinato composto sono facilmente determinabili da coloro che sono esperti nel settore adottando svariati metodi.
I metodi della presente invenzione vengono impiegati nel trattamento di svariati stati patologici che coinvolgono l'attività di Npt2B. Così, tra gli stati patologici che possono venire trattati secondo i metodi della presente invenzione sono compresi malattie caratterizzate da un assorbimento di Pi elevato in modo abnorme e stati patologici caratterizzati da un assorbimento di Pi anormalmente basso. Stati patologici che derivano da una attività di Npt2B anormalmente bassa sono quelli caratterizzati dalla presenta di ipofosfatemia e tra essi sono compresi: osteomalacia, scarso contenuto di calcio nell'urina, rachitismo e simili. Stati patologici derivanti da una attività di Npt2B anormalmente elevata sono quelli caratterizzati dalla presenza di iperfosfatemia e tra essi sono compresi: iperparatiroidismo, ipocalcemia, carenza di vitamina D, calcificazione del tessuto morbido o calcifinazione metastatica e simili. Particolarmente interessante è l'impiego dei metodi della presente invenzione per trattare iperfosfatemia generata da insufficienza renale, per esempio provocata da malattie renali, derivanti da una fuzione renale per lo meno compromessa, e simili.
Con il termine trattamento si intende almeno un miglioramento dei sintomi associati con lo stato patologico che affligge l'ospite. Il termine miglioramento venendo usato in un senso ampio per indicare almeno una diminuzione nell'entità dì un parametro, per esempio un sintomo, associato con lo stato patologico che viene trattato, per esempio una iperfosfatemia. Come tale, un trattamento comprende inoltre casi nei quali la condizione patologica, oppure almeno i sintomi associati con essa, vengono completamente inibiti, per esempio, si impedisce che essi si presentino oppure vengono bloccati, per esempio vengono fatti terminare, in modo che l'ospite non presenta più uno stato patologico oppure almeno non presenta più i sintomi che caratterizzano lo stato patologico.
Svariati tipi di ospiti sono trattabili secondo i metodi della presente invenzione. In generale, tali ospiti sono 'mammiferi' oppure 'mammalian ' , usando questo termine per indicare in senso ampio organismi che rientrano nella classe dei mammiferi, ivi compresi gli ordini dei carnivori (per esempio cani e gatti), dei roditori (per esempio topi, porcellini d'india e ratti) e dei primati (per esempio uomo, scimpanzé e scimmie). In molte forme di realizzazione l'ospite sarà l'uomo.
Vengono messi a disposizione kit contenenti dosi unitarie della sostanza attiva, usualmente dosi somministrabili per via orale oppure dosi somministrabili per via iniettabile. In tali kit, oltre ai contenitori che contengono i dosaggi unitari, sarà présente un inserto di confezionamento di tipo informativo che descrive l'impiego ed i vantaggi che si aspettano dai farmaci nel trattamento di uno stato patologico in questione. Composti preferiti e dosi unitarie preferite sono quelli qui descritti sopra.
Gli esempi che seguono vengono riportati principalmente a scopo esemplificativo. Risulterà facilmente evidente a coloro che sono esperti nel settore, che formulazioni, dosaggi, metodi di somministrazione ed altri parametri di questa invenzione possono venire ulteriormente modificati o sostituiti in diversi modi, senza allontanarsi dallo spirito e dall'ambito della presente invenzione.
PARTE SPERIMENTALE
A. Identificazione della sequenza di Npt2B
Un confronto di sequenze di proteine cotrasportatori di fosfato di sodio tipo II derivate da differenti specie reperibili da databasi pubblici ha messo in evidenza che, mentre per lo più, dette sequenze erano molto strettamente correlate, le sequenze di bovini e di passeri formavano un sottogruppo distinto. I database Incyte LifeSeq sono stati così ricercati per cloni Npt2-simili che assomigliavano più strettamente alla sequenza bovina rispetto alla sequenza umana. Si sono identificati numerosi cloni, tre di essi sono stati ottenuti e si è determinata la sequenza di DNA degli inserti completi. Si è effettuata una sequenziazione di DNA usando un apparecchio di sequenziazioni automatico PE/Applied Biosystems Model 373A, Poster City, CA) usando un kit di sequenziazione per una dideossi terminazione di un colorante del venditore.
Un confronto tra le sequenze ha messo in evidenza che esse rappresentavano il medesimo cDNA e che la sequenza più lunga era soltanto un clone parziale, che non presentava circa 150 amminoacidi a partire dal terminale-N, sulla base di una omologia rispetto alla proteina bovina. Si è usata la sequenza di consenso per sottoporre ulteriormente a screening i database LifeSeq e si è identificato un notevole numero di cloni ivi compreso quello che sembrava contenere la sequenza codificante di piena lunghezza. Si è ottenuto questo ultimo da Incyte e lo si è sottoposto a sequenziazione . Ciò ha rivelato la presenza di una fase di lettura aperta di 689 amminoacidi che si è dimostrata essere un componente umano della sottofamiglia dei co-trasportatori bovino/passero tipo II. La maggioranza dei cloni identificati nei database LifeSeq provenivano da raccolte ottenute da campioni di tessuto di polmoni, tuttavia, alcuni dei cloni provenivano da raccolte di origine intestino tenue ed ovaie. Ciò ha indicato che questo cDNA potrebbe essere un candidato per il co-trasportatore del fosfato di sodio intestinale umano. Esperimenti nei quali si è usato RT-PCR hanno confermato l'espressione di questo gene in cDNA derivato da campioni di intestino tenue umano (ottenuti dalla Clontech Corporation, Palo Alto, CA). Successivamente, una assegnazione di questa sequenza come trasportatore intestinale umano è stata rinforzata da un elevato grado di omologia rispetto a sequenze di trasportatori intestinali per Xenopus (A. Ishizuya-Oka et al. (1997) Temporal and Spatial Expression of an Intestinal Na+/P043” Cotransporter Correlates With Epithelial Transformation During Thyroid Hormone-Dependent Frog Metamorphosis . Develoment Genetics 20:53-66) e per il topo (H. Hilfiker et al., Characterization of a maurine type II sodium-phosphate cotransporter expressed in mamraalian sma 11 intestine. PNAS 199895: 146465-14569).
B. Espressione in cellule di mammiferi e protocollo di saggio per trasportatore Na/Pi
Il cDNA di Npt2B umano viene clonato ottenendo un adatto vettore di espressione di mammiferi costitutivo per esempio pcDNA3 .1 oppure pREP9 (entrambi della Invitrogen, Carlsbad, California) . Se necessario il cDNA viene clonato in un vettore inducibile, per esempio pLK-neo, un vettore inducibile da glucocorticoidi (dal Professor Nicholas Fasel, Istituto di Biochimica dell'Università di Losanna, Svizzera; come descritto in Gene, 111, 199-206 (1992)). Numerose linee di cellule di mammiferi, per esempio HEK 293, CHO, MDCK, BHK e NIH 3T3 vengono transfettate con i costrutti di espressione e vengono sottoposte a screening per un'espressione stabile del trasportatore ricombinante, effettuando una variante del saggio descritto qui di seguito.
Cellule che esprimono il trasportatore vengono seminate in piastre per coltura di tessuti da 96 pozzetti a 50.000 fino a 100.000 cellule per pozzetto in 200 μΐ di un mezzo adatto e vengono lasciate aderire per 3-16 ore. Immediatamente prima del saggio, le cellule vengono lavate tre volte con tampone di lavaggio privo di sodio e di fosfato (N-metil-D-glucammina 137 mM, KC1 5,4 mM, CaCl2 2,8 mM, MgCl2 1,2 mM, HEPES 10 mMM, pH regolato a 7,4 con HC1). Quindi, si aggiungono i seguenti componenti: (1) 50 μl di un tampone di reazione (NaCl 137 mM, KC1 5,4 mM, CaCl2 2,8 mM, MgCl2 1,2 mM, KH2P04 0,1 mM, HEPES 10 mM, pH regolato a 7,4 con KOH) (2) 40 μΐ di composti in esame diluiti in tampone di reazione e (3) 10 μΐ di una soluzione di fosfato 10X (concentrazione di fosfato finale: 100 μΜ) contenente <32>P (0,25 μCί) oppure <33>P (0,5 μCί) sotto forma di tracciante. Le piastre vengono sottoposte ad incubazione a temperatura ambiente per 20-30 minuti e la reazione viene bloccata rimuovendo la soluzione di assorbimento e lavando le cellule tre volte con soluzione di blocco raffreddata con ghiaccio (NaCl 137 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 7,2). La radioattività assorbita dalle cellule viene determinata mediante conta dopo l'aggiunta di 150 μΐ di un 'cocktail' di scintillazione. I controlli sono costituiti da cellule sottoposte ad incubazione senza il composto in esame (soltanto la sostanza-veicolo) e da cellule sottoposte ad incubazione con N-metil-D-glucammina nel tampone di reazione invece che sodio. L'attività di inibizione viene espressa come inibizione percentuale di assorbimento, dipendente dal sodio, del tracciante. Realizzando il protocollo di cui sopra, si sottopongono a screening sostanze terapeutiche candidate per determinare la loro attività di modulazione di Npt2B.
Dai risultati e dalla discussione di cui sopra, risulta evidente che la presente invenzione mette a disposizione un nuovo co-trasportatore di fosfato di sodio intestinale umano e anche polipeptidi con esso correlati e composizioni di acidi nucleici che lo codificano. Queste composizioni di polipeptidi e di acidi nucleici vengono impiegate in svariate e diverse applicazioni ivi comprese applicazioni nel settore della ricerca, della diagnostica, dello screening e in applicazioni terapeutiche. Inoltre, vengono messi a disposizione nuovi metodi per il trattamento di malattie associate con anomalie in livelli di fosfato nel plasma, in quanto l'identificazione del cotrasportatore fosfato di sodio della presente invenzione, mette a disposizione un ulteriore bersaglio per sostanze terapeutiche destinate a tali malattie. Pertanto, la presente invenzione mette a disposizione un notevole contributo per il suddetto settore.
Tutte le pubblicazioni e le domande di brevetto citate in questa descrizione vengono qui riportate come riferimento e si intende che ciascuna singola pubblicazione o ciascuna singola domanda di brevetto sono state specificamente e singolarmente citate da incorporare come riferimento. La citazione di qualsiasi pubblicazione avviene per la sua descrizione prima della data di deposito e si dovrà intendere che essa non viene indicata come una ammissione che la presente invenzione non sia stata intitolata prima di tale data di pubblicazione in virtù della priorità dell'invenzione.
Sebbene la precedente invenzione sia stata descritta dettagliatamente a scopo illustrativo ed esemplificativo ai fini di chiarezza di comprensione, è facilmente evidente per coloro che sono esperti nel settore, alla luce delle indicazioni della presente invenzione, che si possono effettuare certe variazioni e certe modifiche senza allontanarsi dallo spirito o dall'ambito delle rivendicazioni allegate.
Claims (24)
- RIVENDICAZIONI 1. Polipeptide Npt2B con una sequenza di amminoacidi sostanzialmente identica alla sequenza di SEQ ID NO:01.
- 2. Polipeptide Npt2B che è per almeno il 90% identico al polipeptide secondo la rivendicazione 1.
- 3. Polipeptide Npt2B secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 oppure 2 che comprende la sequenza di amminoacidi di SEQ ID NO:01.
- 4. Proteina oppure polipeptide come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, avente attività di co-trasportatore di fosfato di sodio.
- 5. Frammento del polipeptide Npt2B secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4.
- 6. Acido nucleico che codifica una proteina oppure un polipeptide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5.
- 7. Acido nucleico secondo la rivendicazione 6, in cui detto acido nucleico ha una sequenza di acido nucleico che è sostanzialmente identica alla sequenza di nucleotidi di SEQ ID NO:02.
- 8. Frammento dell'acido nucleico secondo le rivendicazioni 6 oppure 7.
- 9. Acido nucleico isolato oppure un suo mimetico che ibridizza in condizioni precise con l'acido nucleico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 6 a 8, oppure una sua sequenza complementare.
- 10. Cassetta di espressione che comprende una regione di inizio di trascrizione funzionale in un ospite di espressione, un acido nucleico avente una sequenza di nucleotidi che si trova nell'acido nucleico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 6 a 9 con regolazione di trascrizione di detta regione di inizio di trascrizione, ed una regione di termine di trascrizione funzionale in detto ospite di espressione .
- 11. Cellula che comprende una cassetta di espressione secondo la rivendicazione 10 come parte di un elemento extracromosomico oppure integrata nel genoma di una cellula ospite come risultato di una introduzione di detta cassetta di espressione in detta cellula ospite.
- 12. Progenie cellulare della cellula ospite secondo la rivendicazione 10 oppure 11.
- 13. Metodo per produrre Npt2B, detto metodo consistendo nel fare crescere una cellula secondo la rivendicazione 11 oppure 12, per cui detto Npt2B viene espresso; ed isolare detto Npt2B sostanzialmente privo di altre proteine.
- 14. Anticorpo monoclonale che si lega specificamente a Npt2B.
- 15. Anticorpo secondo la rivendicazione 14, in cui detto anticorpo inibisce l'attività di Npt2B.
- 16. Anticorpo monoclonale secondo la rivendicazione 14 oppure 15, in cui detto anticorpo è un anti-corpo umanizzato.
- 17. Metodo per modulare Npt2B in un ospite, detto metodo consistendo nel somministrare a detto ospi-te una quantità efficace di un agente modulante di Npt2B.
- 18 . Impiego di un agente modulante Npt2B per la produzione di un farmaco per la modulazione di Npt2B in un ospite.
- 19. Metodo di screening per identificare agenti modulanti di Npt2B, detto metodo consistendo nel porre a contatto una cellula che esprime Npt2B funzionale sulla sua superficie con una sostanza candidata, in presenza di anione fosforo e determinare la quantità dell'anione fosforo assorbita da detta cellula.
- 20. Metodo secondo la rivendicazione 19, cui detto anione fosforo viene marcato con un marcatore rivelabile .
- 21. Metodo secondo la rivendicazione 19 oppure 20, in cui detto marcatore è isotopico.
- 22. Modello dì animale transgenico non-umano, capace di esprimere Npt2B.
- 23. Impiego di una proteina oppure di un polipeptide come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5 per lo screening di agenti modulanti di Npt2B.
- 24. Invenzione come precedentemente descritta.
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