JP2002506614A - セレクチンリガンド活性を有するポドカリキシン様シアロムチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 セレクチンリガンド活性を有するポドカリキシン様蛋白質（例えばＰＣＬＰおよびＰＣＬＰ−２）が提供される。さらにまた、新規なＰＣＬＰ−２蛋白質をコードする核酸組成物が提供される。本ポリペプチドおよび核酸組成物は、研究、診断および治療用薬剤スクリーニングを含む多様な用途の他に、ポドカリキシン様蛋白質活性に関連する症状の治療で有用である。特に、ポドカリキシン様蛋白質のセレクチン結合活性および／またはケモカイン提示活性に関連する疾患を治療する方法が提供される。ここで、そのような疾患には炎症などが含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 アメリカ合衆国特許法３５条§１１９（ｅ）にしたがい、本出願は、アメリカ
合衆国仮特許出願６０／９７４３８９号（１９９８年２月１１日出願）および同
国仮特許出願６０／１１１６６３号（１９９８年１２月１０日出願）の出願日に
ついて優先権を主張する。上記出願は参照により本明細書に含まれる。 本発明は米国予防衛生研究所のグラントＮｏ．ＧＭ２３５４７により政府の支
援を受けて達成された。合衆国政府は本発明に関して一定の権利を有する。 本発明の分野は、細胞接着、特にセレクチン仲介細胞接着およびそれに関連す
る症状の治療である。

【０００２】

【従来技術】

セレクチン仲介結合は、多様な生物学的プロセスで重要かつ主要な役割を果た
す。セレクチンはレクチン様細胞接着分子で、白血球−内皮細胞、白血球−白血
球、白血球−血小板、血小板−内皮細胞、および血小板−血小板相互作用を仲介
する。セレクチン仲介結合が役割を果たす極めて重大なプロセスの１つは、免疫
監視の維持である。

【０００３】 免疫監視の維持は、血液から血管壁を通って組織に入り、最終的には血液に戻
る定常的なリンパ球の再循環を必要とする。血液から全ての二次リンパ系器官（
脾臓を除く）および多くの慢性炎症部位へのリンパ球の再循環は、高内皮性小静
脈と呼ばれる特殊化した後毛細血管小静脈によって仲介される。これらの血管は
、通常と異なる血管内皮細胞の立方形の形態および白血球に対する接着分子（Ｌ
−セレクチン）を管腔内に提示していることによって規定される。このレクチン
様接着分子は血中の全種類の白血球で発現され、白血球のインテグリンにより仲
介されるその後の堅固な拘束と移動の前に、まず最初に白血球を繋留し内皮上を
ローリングさせるために必要である。

【０００４】 これまでにいくつかのセレクチンリガンドが特定された。特定されたマウスの
Ｌ−セレクチン内皮性リガンドは以下のとおりである：ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ
−１、ＭＡｄＣＡＭ−１およびｓｇｐ２００。さらに、ＰＳＧＬ−１がＰ−、Ｅ
−およびＬ−セレクチンのための白血球リガンドとして特定された。ヒトのＬ−
セレクチンのための内皮性リガンドはほとんど特定されていない。しかしながら
、ヒトＣＤ３４は種々のアッセイによってセレクチンリガンド活性をもつことが
分かった。

【０００５】 セレクチン仲介結合事象は正常な生理学的プロセスで重大な役割を果たすが、
セレクチン仲介結合量を調節または加減（例えば制限したり防止したり）するこ
とが望まれる症状が存在する。そのような症状には以下が含まれる：急性または
慢性炎症；自己免疫および関連疾患、移植時の組織の拒絶、粥状硬化症、血管再
建後の再狭窄、損傷性血栓形成など。 上記の症状は全てセレクチン仲介結合事象から生じるので、セレクチンリガン
ドの特定およびそのような結合事象を引き起こすメカニズムの解明には大きな関
心がよせられている。さらにまた、これらの症状および関連する症状の治療方法
の特定、およびその方法で使用する有効な薬剤の特定に大きな関心がもたれてい
る。 したがって、新規なセレクチンリガンドの特定およびセレクチン仲介結合事象
におけるそれらの役割の解明、およびそのような結合事象から生じる症状の治療
方法の開発に継続的な興味がよせられている。

【０００６】 関連文献 米国特許第５７０５６２３号は、糸球体上皮細胞で発現されるポドカリキシン
様蛋白質を開示する。Sassettiら（J. Exp. Med.(June 15, 1998), 187:1965-19
75）は、セレクチンリガンドとしてヒトＰＣＬＰの役割を開示している。ポドカ
リキシンおよびその同族体について記載されている他の参考文献には以下が含ま
れる：Kershaw et al., J. Biol. Chem.(June 20, 1997)272:15708-15714; Kers
haw et al., J. Biol. Chem.(Dec. 20, 1997)270:29439-29446; McNagny et al.
, J. Cell Biol.(Sept. 22, 1997) 138:1395-1407; and Kerjaschki et al., J.
Cell Biol.(1984)98:1591-1596; Hub & Rot, Am. J. of Pathology(March 1998
)152:749-757; Middleton et al., Cell(October 31, 1997)91:385-395。これら
は白血球の輸送におけるケモカインの役割を考察している。 Ｌ−セレクチン結合に関する背景の情報を提供する参考文献には以下が含まれ
る：Lasky et al., Cell(June 12, 1992)69:927-938; Baymhueter et al., Scie
nce(October 15, 1993)262:436-438; Girard & Springer, Immunology Today(19
95)16:449; Rosen & Bertozzi, Current Opinion in Cell Biology(1994)6:663-
673; Celi et al., Seminars in Hematology(1997)34:327-335；および米国特許
第５５８０８６２号。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】

セレクチンリガンド活性をもつポドカリキシン様蛋白質（例えばＰＣＬＰ、Ｐ
ＣＬＰ−２）およびそれらを製造する方法が提供される。さらにセレクチンリガ
ンド活性および／またはケモカイン提示活性をもつ新規なポリペプチド生成物を
コードする核酸組成物が提供される。本ポリペプチドおよび核酸組成物は以下を
含む種々の用途で有用である：研究用途（例えば細胞接着および輸送の生物学的
解明のためにデザインされたアッセイでの応用）、診断用途、および治療薬のス
クリーニングおよび治療のための用途。さらにまた、セレクチン仲介結合事象に
付随する症状（例えば急性および慢性炎症、自己免疫疾患および関連疾患、組織
拒絶など）の治療方法が提供される。

【０００８】

【課題を解決するための手段】

セレクチンリガンド活性および／またはケモカイン提示活性をもつ新規なポリ
ペプチド（例えばＰＣＬＰ、ＰＣＬＰ−２）およびそれらの製造方法が提供され
る。さらにまた、ＰＣＬＰ−２ポリペプチドをコードする核酸組成物が提供され
る。本ポリペプチドおよび核酸組成物は以下を含む種々の用途で有用である：研
究、診断および治療薬スクリーニングのための用途、並びに治療用用途。さらに
また、セレクチン仲介結合事象に付随する症状、例えば急性および慢性炎症、自
己免疫疾患およに関連疾患、組織拒絶などを治療する方法が提供される。

【０００９】 本発明をさらに明らかにする前に、本発明は下記に詳述する個々の実施態様に
限定されないことは理解されるべきである。なぜならば当該個々の実施態様の変
型の作製が可能で、それらはなお本発明の範囲内に含まれるからである。さらに
また、使用されている用語は、個々の実施態様の説明を目的としており、本発明
を限定しようとするものではないことも理解されるべきである。その代わりに、
本発明の範囲は添付の請求の範囲によって確定されるであろう。 本明細書および添付の請求の範囲では、その文脈によって別に明瞭に指示され
ないかぎり単数形は複数の意味を含む。特に規定しないかぎり、本明細書で使用
される全ての技術用語および学術用語は、本発明が属する分野に習熟する者が通
常理解するものと同じ意味を有する。

【００１０】 ポリペプチド組成物 セレクチン結合活性および／またはケモカイン提示活性を有するポドカリキシ
ン様蛋白質が提供される。本ポドカリキシン様蛋白質（例えばＰＣＬＰ、ＰＣＬ
Ｐ−２など）は、ムチンドメインを有するシアロ蛋白質である。すなわちそれら
はシアロムチンで、したがって高度に糖化された糖蛋白質であり、主にＯ−連結
炭水化物鎖領域を含み、これらの炭水化物鎖はセリンまたはスレオニン残基に連
結されている。本蛋白質は以下の４つの別々の領域を有する膜貫通蛋白質である
：（１）ムチンドメイン、（２）システイン富裕ドメイン、（３）膜貫通ドメイ
ン、（４）細胞質ドメイン。さらに、ＰＣＬＰ−２は、それをＰＣＬＰと区別さ
せるアミノ末端ドメインを含んでいる。

【００１１】 ＰＣＬＰ ＰＣＬＰのムチンドメインはこの蛋白質のＮ−末端にある一続きの約２９０残
基の長さのアミノ酸で、セリン、スレオニンおよびプロリンの含有量が高く、こ
れは、これらの固有のアミノ酸の相対的頻度が残りの天然に存在するアミノ酸の
頻度に較べて約２〜５倍過剰であることを意味している。このドメインは配列繰
り返しを含まず、ＣＤ３４のムチンドメインに対する明瞭な配列相同性をもたな
い。この、ムチンドメインの更なる特徴は強いＯ−糖化である。このムチンドメ
インのＣ−末端は長さが約１２０アミノ酸残基のシステイン富裕領域で、ここに
は約４つのシステイン残基が存在する。この領域は生理学的条件下で球状構造を
形成すると考えられている。本ＰＣＬＰの細胞質ドメインは長さが約７５アミノ
酸残基で、ＣＤ３４の細胞質領域と２５％の全体的な配列同一性を有し、さらに
ＣＤ３４の細胞質領域と５０％を越える配列同一性をもつ３つのストレッチを含
んでいる（図２参照）。

【００１２】 本ＰＣＬＰは、ラットのポドカリキシン（Kerjaschki et al., J. Cell Biol. (1984)98:1591-1596)、ニワトリのポドカリキシン、すなわちスロモムチン（Mc
Magny et al., J. Cell Biol. (1997)138:1395-1407)、ウサギおよびヒトのポド
カリキシン（米国特許第５７０５６２３号、この文献は参照により本明細書に含
まれる）およびその同族体のアミノ酸配列を有するであろう。ここで同族体とは
、ムチンドメインを除いて、ヒトＰＣＬＰ蛋白質と少なくとも約４０％、通常は
少なくとも約５０％、およびより通常的には少なくとも約６０％のアミノ酸配列
同一性を有する蛋白質（米国特許第５７０５６２３号およびKershaw et al(J. B
iol. Chem.(1997)272:15708-15714)に記載され、さらにＧｅｎｂａｎｋアクセッ
ション番号Ｕ９７５１９を有する）を意味する。

【００１３】 ＰＣＬＰ−２ ＰＣＬＰ−２では、ムチンドメインは、この蛋白質のアミノ末端ドメインのと
なり合う一続きの長さが約１４０アミノ酸残基で、高含有量のセリン、スレオニ
ンおよびプロリンを含み、これは、これら特定のアミノ酸の相対頻度が、残りの
天然に存在するアミノ酸の頻度の約２〜５倍を越えることを意味する（一般には
これら３つの残基はムチンドメインの残基の数で約３０から４０、通常は３５％
を構成する）。ムチンドメインの特徴はさらに強いＯ−糖化である。ムチンドメ
インのＣ−末端は長さが約１５０アミノ酸残基のシステイン富裕領域で、そこに
は約３つのシステイン残基が存在する。この領域は生理学的条件下で球状構造を
形成すると考えられている。

【００１４】 本ＰＣＬＰの細胞質ドメインは長さが約８０アミノ酸残基で、ＣＤ３４の細胞
質領域と２５％の全体的な配列同一性を有し、さらにＣＤ３４の細胞質領域と５
０％を越える配列同一性をもつ３つのストレッチを含む。アミノ末端ドメインは
長さが約１７０アミノ酸残基で、さらに以下の特徴を有する：（ａ）酸性残基に
富み、酸性アミノ酸残基数に対する％は約２０から４０％、通常は約２５から３
５％で、多くの実施態様では、３０％、または３０％に近い；（ｂ）潜在的チロ
シン硫酸化部位として機能する２つのチロシン残基を有し、さらにグリコサミノ
グリカン鎖によって改変される。上記の特色に加えて、ＰＣＬＰ−２蛋白質は５
つの潜在的なグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合部位（そのうちの１つはアミ
ノまたはＮ−末端ドメイン内の上記の部位である）、および３つの潜在的なＮ−
連結糖化部位を有する。この蛋白質は一般に長さが約３０から３５残基の切断可
能なＮ−末端シグナルペプチドを有する。したがって、発現されたＰＣＬＰ−２
は翻訳後処理を施されて成熟ＰＣＬＰ−２を生じる。

【００１５】 ＰＣＬＰ−２蛋白質は長さが約５００から８００アミノ酸残基の範囲で、通常
は約５５０から７００、より通常的には約５５０から６５０アミノ酸残基の範囲
であり、もっぱらアミノ酸残基数を基準にしたこの蛋白質の計算分子量は約５０
から８０、通常は約５５から７５、より通常的には約６０から６５ｋＤａである
。本ＰＣＬＰ−２蛋白質は糖蛋白質であるので、これら蛋白質の実際の分子量は
上記の計算分子量よりも大きく、典型的には計算分子量よりも約３から５倍大き
い。したがって、実際の分子量は典型的には約１５０から３００ｋＤａ、通常は
約１５０から２５０ｋＤａ、より通常的には約１７５から２２５ｋＤａ、例えば
約２００ｋＤａである。

【００１６】 ある種の実施態様で特に興味深いものはマウスＰＣＬＰ−２蛋白質で、本発明
のこのマウスＰＣＬＰ−２蛋白質は、上記のマウスＰＣＬＰ−２遺伝子によって
コードされるアミノ酸配列を有する。他の実施態様で特に興味深いものはヒトＰ
ＣＬＰ−２蛋白質で、本発明のこのヒトＰＣＬＰ−２蛋白質は、下記の配列番号
：２の配列と実質的に同じかまたは同一なアミノ酸配列を有する。実質的に同じ
ということは、ある蛋白質が、上記のＢＬＡＳＴによって測定したとき配列番号
：２の配列と少なくとも約８０％、通常は少なくとも約９０％、より通常的には
少なくとも約９８％の配列同一性を有する配列をもつことを意味する。

【００１７】 上記の固有のＰＣＬＰ−２蛋白質に加えて、他の種（すなわち他の動物）の同
族体または蛋白質（またはそのフラグメント）もまた提供される。ここでそのよ
うな同族体または蛋白質は多様な種々のタイプの種（通常は哺乳類、例えばゲッ
歯類（例えばマウス、ラット）、家畜動物（例えばウマ、ウシ、イヌ、ネコ）お
よびヒト）に由来するであろう。同族体とは、配列番号：２で特定される固有の
ヒトＰＣＬＰ−２蛋白質と少なくとも約３５％、通常は少なくとも約４０％、よ
り通常は少なくとも約６０％のアミノ酸同一性を有する蛋白質を意味し、この場
合配列同一性は上記のＢＬＡＳＴアルゴリスムを用いて決定される。

【００１８】 本蛋白質のまた別の特色 上記の特徴の他に、本ＰＣＬＰおよびＰＣＬＰ−２はさらに、硫酸化およびシ
アリル化Ｏ−連結オリゴ糖類の密なクラスターをＬ−セレクチンに提示すること
ができるという特徴を有する。本蛋白質はＥ−、Ｐ−またはＬ−セレクチンおよ
びリコンビナントＬ−セレクチンと結合でき、さらにＨＥＶ特異的ＭＥＣＡ−７
９モノクローナル抗体と結合することができる。したがって、本蛋白質は、当業
者が総称的に抹消結節アドレッシン（ＰＮＡｄ）と呼んだ糖蛋白群の中で以前に
特定されたものである。本蛋白質はさらに、in vitroにおける生理学的な流動状
態下でリンパ球の繋留およびローリングを補助することができるという特徴を有
する。上記の特色に加え、ＰＣＬＰ−２のＮ−末端酸性ドメインはある種のケモ
カインまたは化学誘引剤と結合することができる。そのような化学誘引剤には、
二次リンパ系ケモカイン（ＳＬＣ）、ＭＩＰ３αなどが含まれる。

【００１９】 本発明のポドカリキシン様蛋白質（例えばヒトＰＣＬＰ、ヒトＰＣＬＰ−２、
マウスＰＣＬＰ−２、またはその同族体）は非天然の環境下に、例えば天然に存
在する環境から分離された状態で存在する。ある実施態様では、本蛋白質は、そ
の天然の環境下にある蛋白質と比較して本蛋白質に富む組成物として存在する。
したがって、精製ＰＣＬＰおよびＰＣＬＰ−２が提供され、ここで精製とは本蛋
白質が本蛋白質でない他の蛋白質を実質的に含まない組成物として存在すること
を意味し、ここで実質的に含まないとは、組成物の９０％未満、通常は６０％未
満、より通常的には５０％未満が本蛋白質でないか、または他の蛋白質（例えば
非ＰＣＬＰ、非ＰＣＬＰ−２）で構成されていることを意味する。

【００２０】 関連する実施態様では、本蛋白質はそれが天然に存在する環境下で存在する組
成物を実質的に含まない組成物として存在する。例えば、この実施態様の本発明
の組成物を含むヒトＰＣＬＰまたはＰＣＬＰ−２蛋白質は、完全ではないとして
も実質的には他の生物学的な構成成分（例えば蛋白質、炭水化物、脂質など、こ
れらは天然の環境下で本蛋白質とともに存在する）を含まないであろう。したが
って、これらの実施態様の蛋白組成物は、天然に存在する供給源に由来する蛋白
質を精製することによって製造されるものとは必然的に異なる。後者の場合、天
然に存在する供給源から製造した組成物にはなお少なくとも微量の蛋白質成分が
存在するであろう。

【００２１】 本蛋白質はまた単離物として存在する。この場合、単離物とは、本蛋白質が他
の本蛋白質でない蛋白質および他の天然に存在する生物学的分子（例えばオリゴ
糖類、ポリヌクレオチドおよびそのフラグメントなど）を実質的に含まないこと
を意味し、ここで実質的に含まないとは、この単離蛋白質を含む組成物の７０％
未満、通常は６０％未満およびより通常的には５０％未満は他のなんらかの天然
に存在する生物学的分子（例えば非ＰＣＬＰ、非ＰＣＬＰ−２）であることを意
味する。ある実施態様では、本蛋白質は実質的に純粋な形で存在する。ここで実
質的に純粋な形とは、少なくとも９５％、通常は少なくとも９７％、より通常的
には少なくとも９９％純粋であることを意味する。

【００２２】 多くの好ましい実施態様では、本蛋白質はその天然の糖化状態で存在する、す
なわち、本蛋白質は天然に存在する糖蛋白質として見出されるものと同じ糖化パ
ターンを有するであろう。他の実施態様では、この蛋白質は天然に存在しない状
態で糖化されている。天然に存在しない状態で糖化されているとは、この蛋白質
が、（糖化パターンが存在するとして）対応する天然に存在する蛋白質で見出さ
れる糖化パターンと同じでない糖化パターンを有することを意味する。例えば、
本発明およびこの特定の実施態様のヒトＰＣＬＰ−２が、とにかく糖化されてい
るとして、天然に存在するヒトＰＣＬＰ−２の糖化パターンと異なる糖化パター
ンをもつという特徴を有する。したがって、本実施態様の天然に存在しない状態
で糖化されているＰＣＬＰ−２蛋白質は非糖化ＰＣＬＰ−２蛋白質、すなわち共
有結合グリコシル基をもたない蛋白質を含む。

【００２３】 天然に存在する蛋白質に加えて、天然に存在する蛋白質の変型であるポリペプ
チド（例えばＰＣＬＰ−２ポリペプチド）もまた提供される。ＰＣＬＰ−２ポリ
ペプチドとは、下記で述べるＰＣＬＰ−２遺伝子の開放読み枠（ＯＲＦ）によっ
てコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質を意味し、完全な長さのＰＣＬＰ−
２蛋白質およびそのフラグメント、特に生物学的に活性なフラグメントおよび／
または機能的ドメイン（例えばＮ−末端ドメイン、ムチンドメインなど）と一致
するフラグメントが含まれ、さらに本ポリペプチドと他の蛋白質またはその部分
（例えば免疫グロブリンドメイン）との融合物が含まれる。問題のフラグメント
は、典型的には長さが少なくとも約１０アミノ酸（ａａ）、通常は５０ａａであ
ろう。さらにはおそらく長さが３００ａａまたはそれ以上でもよいが、通常は約
１０００ａａを越えないであろう。ここでこのフラグメントは、配列番号：２の
ＰＣＬＰ−２蛋白質（またはその同族体）と同一で、少なくとも約１０ａａ、通
常は少なくとも約１５ａａ、さらに多くの実施態様では少なくとも約５０ａａの
長さの一続きのアミノ酸を有するであろう。

【００２４】 本発明によってさらに提供されるものは、セレクチン結合活性を有する新規な
リガンドである。本明細書で用いられるように、リガンドという用語は、セレク
チンレセプター（特にＥ−、Ｐ−およびＬセレクチン）と結合することができる
任意の化合物を指し、したがって蛋白質およびペプチド、オリゴ糖類などの他に
その結合模倣体（その小分子結合模倣体を含む）が含まれる。本リガンドは、Ｈ
ＥＶ由来ＰＣＬＰまたはＰＣＬＰ−２の結合活性と類似の態様でセレクチンレセ
プターと結合することができ、一般にＨＥＶ由来ＰＣＬＰもしくはＰＣＬＰ−２
またはその機能的同等物のムチン様ドメインを含んでいる。したがって、多くの
実施態様の本リガンドは典型的には、少なくとも、ポリペプチドのセリンおよび
スレオニン残基に共有結合した密なＯ−連結オリゴ糖類を含み、このポリペプチ
ドは、ヒトまたはＰＣＬＰ−２のムチンドメインのアミノ酸配列と少なくとも約
３０％、通常は少なくとも約５０％、より通常的には少なくとも約７０％の配列
同一性を有するアミノ酸配列をもつ。

【００２５】 本蛋白質の製造 天然に存在する供給源から得られる本蛋白質は、一般にセレクチンリガンド提
示細胞（内皮細胞、白血球および血小板を含む）に由来し、好ましくは、哺乳類
二次リンパ系器官の高内皮性小静脈（ＨＥＶ）の内皮細胞、より好ましくはヒト
扁桃ＨＥＶに由来する。本蛋白質はまた合成手段によって、例えば本蛋白質をコ
ードするリコンビナント遺伝子（例えば下記で述べるポリヌクレオチド組成物）
を、セレクチン結合活性をもつ発現蛋白質が提供される態様で翻訳後修飾を起こ
させるために十分な条件下で適切なホストで発現させることにより供給できる。
発現のためには発現カセットを用いてもよい。発現ベクターは転写および翻訳開
始領域を提供し、この開始領域は誘発性でも構造性でもよいが、転写開始領域並
びに転写および翻訳終止領域の転写制御下でコード領域がこの領域に機能的に連
結されている。これらの制御領域はこの遺伝子にとって本来のものでも、または
外来供給源に由来するものでもよい。

【００２６】 一般に発現ベクターはプロモーター配列近くに位置する都合のよい制限部位を
有し、異種蛋白質をコードする核酸配列を挿入させることができる。発現ホスト
で機能する選別マーカーも含むことができる。発現ベクターは融合蛋白質の製造
のために用いることができ、この場合外因性融合ペプチドは更に別の機能性、す
なわち蛋白合成の強化、安定性、特定抗血清との反応性、酵素マーカー（例えば
β−ガラクトシダーゼなど）を提供する。

【００２７】 転写開始領域、当該遺伝子またはそのフラグメント、および転写終了領域を含
む発現カセットを調製できる。特に興味深いものは、機能的なエピトープまたは
ドメイン（通常は少なくとも長さが約８アミノ酸、より通常的には少なくとも長
さが約１５アミノ酸から約２５アミノ酸で当該遺伝子の完全な開放読み枠まで）
の発現を許容する配列の使用である。このＤＮＡを導入した後、構築物を含む細
胞は選別マーカーの手段によって選別でき、これらの細胞を増幅し続いて発現の
ために使用する。

【００２８】 本蛋白質およびペプチドは、発現目的に応じて通常の方法にしたがって原核細
胞または真核細胞で発現できる。大規模蛋白質製造の場合には、単細胞生物（例
えば大腸菌（E. coli)、枯草菌（B. subtilis)、ビール酵母菌（S. cerevisiae)
、バキュロウイルスと組み合わせた昆虫細胞、または高等生物（例えば脊椎動物
、特に哺乳類の細胞（例えばＣＯＳ７細胞))を発現ホスト細胞として用いること
ができる。いくつかの事例では、遺伝子を真核細胞で発現させるのが好ましい。
この場合、蛋白質は天然の折り畳み構造および翻訳後修飾による利益を受ける。
小さなペプチドは研究室で合成することもできる。完全な蛋白質のサブセットで
あるポリペプチドは機能にとって重要な蛋白部分の特定および解明に用いること
ができる。

【００２９】 いったん蛋白質の供給源が特定および／または調製されたら（例えばこの蛋白
質を発現しているトランスフェクトされたホストが調製されたら）、続いてこの
蛋白質を精製して所望の蛋白質を含む組成物を製造する。任意の一般的蛋白質精
製方法を用いることができるが、適切な蛋白精製方法は成書に記載されている（
"Guide to Protein Purification" (Deuthser Ed.), Academic Press, 1990)。 例えば、溶解物を最初の供給源（例えば、ＰＣＬＰまたはＰＣＬＰ−２を発現し
ている天然に存在する細胞もしくは組織、またはＰＣＬＰもしくはＰＣＬＰ−２
を発現している発現ホスト）から調製し、ＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィー、
ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィーなどを用いて精製できる。

【００３０】 核酸組成物 さらにまた提供されるものは、ＰＣＬＰ−２蛋白質およびポリヌクレオチドを
コードする核酸組成物並びにそのフラグメントである。核酸組成物とは、ＰＣＬ
Ｐ−２ポリペプチドをコードする開放読み枠をもつＤＮＡ配列、すなわちＰＣＬ
Ｐ−２活性を有するポリペプチドをコードし、適切な条件下でＰＣＬＰポリペプ
チドとして発現され得る遺伝子を含む組成物を意味する。さらに本用語に包含さ
れるものは、ＰＣＬＰ−２ポリペプチドまたは蛋白質をコードする核酸と相同で
あるか、または実質的に同じ、または同一の核酸である。したがって、本発明は
、哺乳類ＰＣＬＰ−２をコードする遺伝子、例えばヒトＰＣＬＰ−２およびその
同族体並びにマウスＰＣＬＰ−２およびその同族体をコードする遺伝子を提供す
る。

【００３１】 ヒトＰＣＬＰ−２遺伝子のコード配列、すなわちヒトＰＣＬＰ−２蛋白質をコ
ードするヒトｃＤＮＡは、下記の配列番号：１で特定した核酸配列を有する。マ
ウスＰＣＬＰ−２遺伝子のコード配列、すなわちマウスＰＣＬＰ−２蛋白質をコ
ードするマウスｃＤＮＡは、それに由来する以下のＥＳＴを有することを特徴と
する：ＡＡ０４９０２７、Ｗ１３０４７、Ｗ３６４６８、ＡＡ００８８３６、Ｗ
５４２６１、ＡＡ２０８１０６、ＡＡ１５５１７４（ＥＳＴ識別子はそれらのジ
ーンバンク承認番号である）。

【００３２】 上記で特別に列記したものと相同な遺伝子の供給源は、いずれの哺乳類種、例
えば霊長類種（特にヒト）、ゲッ歯類（例えばラットおよびマウス）、イヌ、ネ
コ、ウシ、ヒツジ、ウマなど、並びの非霊長類種、例えば酵母、線虫などでもよ
い。哺乳類種の間、例えばヒトおよびマウスの間では、同族体は、ヌクレオチド
配列間で実質的な配列類似性、例えば少なくとも７５％配列同一性、通常は少な
くとも９０％、より通常的には少なくとも９５％を有する。配列類似性は参考配
列を基にして計算される。この参考配列は、大きな配列のサブセット、例えば保
存モチーフ、コード領域、隣接領域などである。参考配列は通常は長さが少なく
とも約１８ヌクレオチド（ｎｔ）、より通常的には少なくとも３０ｎｔで、比較
されている完全な配列まで広げることができる。配列分析のアルゴリスムは当技
術分野で知られており、例えばAltschulらが記載したＢＬＡＳＴである（J. Mol
. Biol. 215:403-10、デフォールト設定を用いる）。別に表示がなければ、本明
細書で報告した配列類似性の値は上記に引用したＢＬＡＳＴプログラムでデフォ
ールト設定を用いて求めた。本明細書で提供する配列は、データベース検索でＰ
ＣＬＰ−２関連および相同ポリヌクレオチドを認識するために必須である。

【００３３】 本発明のＰＣＬＰ−２蛋白質およびＰＣＬＰ−２ポリペプチドをコードする核
酸はｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの他にそのフラグメントであろう。”ＰＣＬＰ
−２遺伝子”という用語は、個々のＰＣＬＰ−２蛋白質およびポリペプチドをコ
ードする開放読み枠、並びにＰＣＬＰ−２イントロンの他に隣接する５’および
３’非コードヌクレオチド配列を意味しようとするものである。後者の非コード
ヌクレオチド配列は発現の調節に必要で、コード領域を越えて（ただしおそらく
はいずれか一方の方向に）約２０ｋｂまでのものである。当該遺伝子は適切なベ
クターに染色体外維持させるか、またはホストゲノムへ組込ませるために導入で
きる。

【００３４】 本明細書で用いられる”ｃＤＮＡ”という用語は、天然の成熟ｍＲＮＡ種で見
出される配列成分の配置を共有する全ての核酸を含むもので、ここで配列成分と
はエクソン並びに３’および５’非コード領域である。通常、ｍＲＮＡ種は連続
エクソンを有し、さらに介在イントロンが存在する場合には核内ＲＮＡスプライ
シングによって取り除かれ、ＰＣＬＰ−２蛋白質をコードする連続開放読み枠を
作る。

【００３５】 問題のゲノム配列は、列挙した配列で規定されるように開始コドンと終止コド
ンとの間に存在する核酸を含み、この核酸には天然の染色体に存在する全てのイ
ントロンが含まれる。この核酸はさらに成熟ｍＲＮＡに見出される３’および５
’非翻訳領域を含むことができる。それはさらに固有の転写および翻訳調節配列
、例えばプロモーター、エンハンサーなどを含むことができ、これは転写領域の
５’または３’末端のいずれかに約１ｋｂ（おそらくはそれ以上）の隣接するゲ
ノムＤＮＡを含む。ゲノムＤＮＡは１００ｋｂｐまたはそれ以下のフラグメント
として単離され、実質的には隣接する染色体配列を含まない。コード領域（３’
または５’側）またはイントロン内に時々見出される内部調節配列と隣接するゲ
ノムＤＮＡは、適切な組織およびステージでの特異的な発現のために必要な配列
を含む。

【００３６】 本発明の核酸組成物は、下記で極めて詳細に述べるように本ＰＣＬＰ−２蛋白
質およびポリペプチドの全てまたは部分をコードすることができる。二本鎖また
は一本鎖フラグメントは、通常の方法で（制限酵素消化、ＰＣＲ増幅などによっ
て）化学的に合成したオリゴヌクレオチドによってＤＮＡ配列から得ることがで
きる。ほとんどの場合、ＤＮＡフラグメントは少なくとも１５ｎｔ、通常は少な
くとも１８ｎｔまたは２５ｎｔで、少なくとも約５０ｎｔであろう。

【００３７】 本発明のＰＣＬＰ−２遺伝子は、一般に完全な染色体以外のものとして実質的
に純粋に単離および入手できる。通常は、このＤＮＡは、ＰＣＬＰ−２配列また
はそのフラグメントを含まない他の核酸配列を実質的に含まない状態、一般には
少なくとも約５０％、通常は少なくとも約９０％純粋な状態で得られ、さらに典
型的には”リコンビナント”で、すなわち天然に存在する染色体では通常は結合
していない１つまたは２つ以上のヌクレオチドと隣接している。 下記のセクションで極めて詳細に述べる多様な用途の他に、本核酸組成物は、
上記のようにＰＣＬＰ−２ポリペプチド全体または部分の製造のために有用であ
る。

【００３８】 本ポリペプチドおよび核酸組成物の用途 本ポリペプチドおよび核酸組成物は多様な用途で有用である。これの用途には
、研究、診断および治療用薬剤、スクリーニング／開発／製造に関する利用の他
にＰＣＬＰおよび／またはＰＣＬＰ−２活性（例えばセレクチンリガンド活性お
よび／またはケモカイン提示活性）に付随する症状の治療が含まれる。

【００３９】 研究に関する用途 本核酸組成物は多様な研究に関する利用で有用である。問題の研究に関する利
用には以下が含まれる：（ａ）ＰＣＬＰ−２同族体の特定；（ｂ）新規なプロモ
ーター成分の供給源として；（ｃ）ＰＣＬＰ−２発現調節因子の特定；（ｄ）ハ
イブリダイゼーション（例えばＰＣＲ）を利用する場合のプローブおよびプライ
マーとして；（ｅ）生物学的標本での発現パターンの特定；（ｆ）ＰＣＬＰ−２
機能のための細胞または動物モデルの調製；（ｇ）ＰＣＬＰ−２機能のためのin
vitroモデルの調製；など。

【００４０】 ＰＣＬＰ−２同族体の特定 ＰＣＬＰ−２の同族体は多数の方法の中の任意の方法によって特定される。供
給されたｃＤＮＡのフラグメントを、興味をもたれている標的生物から得たｃＤ
ＮＡライブラリーに対するハイブリダイゼーションプローブとして用いることが
出来る（ここでは低ストリンジェンシー条件が用いられる）。プローブは大きな
フラグメントでも、１つもしくは２つ以上の短い縮退プライマーでもよい。配列
類似性をもつ核酸は低ストリンジェンシー条件（例えば５０℃、６ＸＳＳＣ（０
．９Ｍ塩化ナトリウム／０．０９Ｍクエン酸ナトリウム))下のハイブリダイゼー
ションによって検出され、１ＸＳＳＣ（０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．０１５
Ｍクエン酸ナトリウム）で５５℃で洗浄したとき結合したままである。配列同一
性はストリンジェントな条件（例えば５０℃またはそれ以上で０．１ＸＳＳＣ（
０．１５ｍＭ塩化ナトリウム／０．１５ｍＭクエン酸ナトリウム))下でのハイブ
リダイゼーションによって決定できる。提供されたＰＣＬＰ−２配列と実質的に
同一の領域を有する核酸（例えば対立遺伝子座の変種、当該遺伝子の遺伝的な変
形型など）は、提供されたＰＣＬＰ−２配列とストリンジェントな条件下で結合
する。ＤＮＡ配列のプローブ、特に標識されたプローブを用いることによって、
相同または関連遺伝子を単離できる。

【００４１】 新規なプロモーターの特定 ５’隣接領域の配列は、ＰＣＬＰ−２が発現される組織で調節を提供するプロ
モーター成分（エンハンサー結合部位を含む）のために利用できる。組織特異的
発現は、発現パターンの決定のため、および天然の発現パターンを模倣するプロ
モーターを提供するために有用である。プロモーター領域における天然に存在す
る多形現象は、天然の発現変動、特に疾患に付随するものを決定するために有用
である。

【００４２】 ＰＣＬＰ−２発現調節因子の特定 また別には、変異をプロモーター領域に導入し、実験的に規定した系で発現を
変化させることの効果を調べることができる。転写因子の結合に必要な固有のＤ
ＮＡモチーフを特定する方法（例えば既知結合モチーフとの配列類似性、ゲル泳
動速度低下実験など）は当技術分野で知られている（例えば以下の文献を参照さ
れたい：Blackwell et al.(1995), Mol. Med. 1:194-205; Mortlock et al.(199
6), Genome Res. 6:327-33; Joulin & Richard-Foy(1995), Eur. J. Biochem. 2
32:620-626）。 調節配列は、（特に異なる組織または発生の段階で）ＰＣＬＰ−２発現の転写
または翻訳調節に必要なシス作動性配列を特定するために、さらにＰＣＬＰ−２
発現を調節または仲介するシス作動性配列およびトランス作動性因子を特定する
ために用いることができる。そのような転写または翻訳制御領域は、野性型もし
くは変型ＰＣＬＰ−２または他の興味をもたれる蛋白質の培養細胞、または胚組
織、胎児組織もしくは成人組織での発現を促進するために、および遺伝子治療の
ために機能的にＰＣＬＰ−２遺伝子に連結することができる。

【００４３】 プローブおよびプライマー 小さなＤＮＡフラグメントはＰＣＲ用プローブ、ハイブリダイゼーションスク
リーニングプローブなどとして有用である。大きなＤＮＡ（すなわち１００ｎｔ
以上）は、先のセクションで述べたようにコードされたポリペプチドの製造に有
用である。増幅反応（例えばＰＣＲ）で使用する場合には、プライマー対が用い
られる。プライマー配列の厳密な組成は本発明にとって重要ではないが、ほとん
どの場合プライマーは対象の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
される。少なくとも約５０ｎｔ、好ましくは少なくとも約１００ｎｔの増幅生成
物を生じるプライマー対を選択するのが好ましい。プライマー配列の選択のため
のアルゴリスムは一般に知られており、市販ソフトとして入手可能である。増幅
プライマーはＤＮＡの相補鎖とハイブリダイズし、プライマーとして互いに増成
を進行させるであろう。

【００４４】 生物学的標本での発現パターンの特定 このＤＮＡはまた生物学的標本で遺伝子の発現を特定するために用いることが
できる。ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡのような特定のヌクレオチド配列の有無につ
いてある細胞を調べる方法は当分野の文献で確立されている。簡単に記せば、Ｄ
ＮＡまたはｍＲＮＡを細胞サンプルから単離する。ｍＲＮＡは、逆転写酵素を用
いて相補的ＤＮＡ鎖を生成し、続いて対象のＤＮＡ配列に固有のプライマーを用
いてポリメラーゼ連鎖反応を実施するＲＴ−ＰＣＲによって増幅できる。また別
にはｍＲＮＡサンプルをゲル電気泳動によって分離し、適切な支持体（例えばニ
トロセルロース、ナイロンなど）に移し、続いてプローブとして本ＤＮＡフラグ
メントを用いて探索する。他の技術、例えばオリゴヌクレオチド結合アッセイ、
in situハイブリダイゼーション、および固体チップ上に並べたＤＮＡプローブ とのハイブリダイゼーションも有用であろう。本配列とハイブリダイズするｍＲ
ＮＡが検出されればサンプルでのＰＣＬＰ−２遺伝子発現が示唆される。

【００４５】 ＰＣＬＰ−２変異体の調製 ＰＣＬＰ−２遺伝子の配列（隣接するプロモーター領域およびコード領域を含
む）は、当技術分野で知られている多様な方法で変異させ、プロモーターの強度
、コードされる蛋白質の配列などにおける意図した変化を発生させることができ
る。そのような変異をもつＤＮＡ配列または蛋白質生成物は、本明細書で提供す
る配列と実質的に類似するであろう。すなわち、少なくともそれぞれ１ヌクレオ
チドまたはアミノ酸が変化し、さらには少なくとも２つのヌクレオチドまたはア
ミノ酸が変化しているが、約１０以上のヌクレオチドまたはアミノ酸が変化して
いることはない。この配列変化は置換、挿入、欠失またはその組み合わせであろ
う。欠失にはより大きな変化、例えばドメインまたはエクソンの欠失がさらに含
まれる。興味をもたれる他の修飾にはエピトープタグ付加（例えばＦＬＡＧ系、
ＨＡなど）が含まれる。細胞内分布を調べるためには、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ
）との融合蛋白質を利用できる。

【００４６】 クローン化遺伝子のin vitro突然変異のための技術は知られている。位置特異
的突然変異のためのプロトコルの例は以下の文献で見出される：Gustin et al.(
1993), Biotechniques 14:22; Barany(1985), Gene 37:111-23; Colicelli et a
l.(1985), Mol. Gen. Genet. 199:537-9; Prentki et al.(1984), Gene 29:303-
13。位置特異的突然変異は以下の文献で見出される：Sambrook et al., Molecul
ar Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press 1989, pp.15.3-15.108; Weiner
et al.(1993), Gene 126:35-41; Sayers et al.(1992), Biotechniques 13:592-
6; Jones & Winistorfer(1992), Biotechniques 12:528-30; Barton et al.(199
0, Nucleic Acids Res. 18:7349-55; Marotti & Tomich(1989), Gene Anal. Tec
h. 6:67-70; Zhu(1989), Anal. Biochem. 177:120-4。そのような変異遺伝子は 、ＰＣＬＰ−２の構造と機能の関係を調べるために、またはその機能または調節
に影響を与える蛋白質の特性を変えるために用いることができる。

【００４７】 ＰＣＬＰ−２機能のin vitroモデルの作製 本核酸は、遺伝子を導入したヒト以外の動物を作製するために、または細胞株
で位置特異的修飾を実施するために用いることができる。遺伝子導入動物は同種
組換えによって作製できるが、この場合正常なＰＣＬＰ−２遺伝子座が改変され
る。また別には、核酸構築物が無作為にゲノムに組み込まれる。安定な組込みの
ためのベクターにはプラスミド、レトロウイルスおよび他の動物ウイルス、ＹＡ
Ｃなどがある。

【００４８】 改変された細胞または動物はＰＣＬＰ−２の機能および調節の研究で有用であ
る。例えば、一連の小さな欠失および／または置換をホストの天然のＰＣＬＰ−
２遺伝子に施し、コレステロール代謝（例えばコレステロールエステル合成、コ
レステロール吸収など）における種々のエクソンの役割を決定できる。興味深い
特別な構築物には、アンチセンスＰＣＬＰ−２（これはＰＣＬＰ−２発現優性ネ
ガティブＰＣＬＰ−２変異の発現およびＰＣＬＰ−２遺伝子の過剰発現を阻害す
る）が含まれる。ＰＣＬＰ−２配列が導入される場合、この導入配列は、ホスト
にとって固有のＰＣＬＰ−２遺伝子の完全配列もしくは部分配列であるか、また
はホスト動物にとって外因性のＰＣＬＰ−２遺伝子（例えばヒトＰＣＬＰ−２配
列）の完全もしくは部分配列であろう。検出可能なマーカー、例えばｌａｃＺは
ｐｃｌｐ−２遺伝子座に導入できる。この場合、ＰＣＬＰ−２発現のアップレギ
ュレーションにより、容易に検出可能な表現型の変化がもたらされるであろう。

【００４９】 ＰＣＬＰ−２遺伝子またはその変種の発現も、通常発現されない細胞または組
織で、そのような細胞または組織では通常は存在しないレベルで、または異常な
発生の時期に提供することができる。 同種組換えのためのＤＮＡ構築物は、ホスト動物種にとって固有のＰＣＬＰ−
２遺伝子の少なくとも一部分を含み（ここでこの遺伝子は所望の遺伝的改変を含
んでいる）、さらに標的遺伝子座に対して相同領域を含んでいる。無作為の組込
みのためのＤＮＡ構築物は組換えを仲介するための相同領域を含む必要はない。
簡便には、陽性および陰性選別用マーカーが包含される。同種組換えによって目
指す遺伝子の改変を含む細胞を作製する方法は当技術分野で知られている。哺乳
類細胞にトランスフェクトする種々の技術については以下の文献を参照されたい
：Keown et al.(1990), Meth. Enzymol. 185:527-537。

【００５０】 胚幹（ＥＳ）細胞のためにはＥＳ細胞株を利用するか、または胚細胞をホスト
（例えばマウス、ラット、モルモットなど）から新しく入手できる。そのような
細胞は適切な線維芽細胞のフィーダー層上で増殖させるか、または白血病抑制因
子（ＬＩＦ）の存在下で増殖させる。ＥＳまたは胚細胞を形質転換させた場合、
それらを用いて遺伝子導入動物を作製できる。形質転換後、細胞を適切な培養液
中でフィーダー層上に静置する。構築物を含む細胞は選択培地を用いて検出でき
る。コロニーが増殖するために十分な時間が経過してから、それらを釣り上げ、
構築物の同種組換えまたは組込みの発生について調べる。続いて陽性コロニーを
胚操作および胚盤胞注入に用いることができる。胚盤胞は、４から６週齢の過排
卵の雌から得られる。ＥＳ細胞をトリプシン処理し、改変細胞を胚盤胞の分割腔
に注入する。注入後、胚盤胞を偽妊娠動物の各子宮角に戻す。続いて雌動物の妊
娠期間を完了させ、得られた子孫を構築物についてスクリーニングする。異なる
表現型の胚盤胞および遺伝的に改変した細胞を提供することによって、キメラ子
孫を容易に検出できる。

【００５１】 キメラ動物を改変遺伝子の有無についてスクリーニングし、改変を有する雌雄
をつがわせて同種接合体の子孫を得る。この遺伝子の変化が発生のある時点で致
死性である場合は、組織または器官を同種異系移植片もしくはコンジェニック移
植片または移植として、またはin vitro培養として維持することができる。遺伝
子導入動物はヒトでない任意の哺乳類（例えば実験動物、家畜など）であろう。
遺伝子導入動物は機能に関する実験、薬剤のスクリーニングなどに用いて、例え
ば候補薬剤のＰＣＬＰ−２活性に対する影響を決定できる。

【００５２】 ＰＣＬＰ−２機能のin vitroモデルの作製 本発明によってさらに提供されるものは、ＰＣＬＰおよびＰＣＬＰ−２機能（
例えばセレクチンリガンドとしてのＰＣＬＰまたはＰＣＬＰ−２の役割、ケモカ
イン提示体としてのＰＣＬＰ−２の役割など）のin vitroモデルである。ＰＣＬ
ＰまたはＰＣＬＰ−２のセレクチンリガンド機能のin vitroモデルでは、ポドカ
リキシン様蛋白質とセレクチンレセプターとの間の結合事象が調節（例えば抑制
）される。一般に、セレクチンレセプターは生理学的条件下でＰＣＬＰ−２と結
合するレセプターで、さらにアミノ末端にＣ型レクチンドメインをもち、続いて
ＥＦＧ様ドメイン、ＳＣＲ、ＣＲＰ、またはｓｕｓｈｉドメインとして知られて
いるいろいろの数の短いコンセンサスリピートが続くセレクチン類レセプターに
属し、それらのレクチンおよびＥＦＧドメインにおいて５０％以上の相同性を共
有する。特に興味深いものは、セレクチンがＬ−、Ｐ−またはＥ−セレクチンの
場合のＰＣＬＰ−２セレクチン結合事象の調節である。セレクチン仲介結合事象
を抑制するin vitroでの方法の場合、典型的にはそのような方法は、セレクチン
レセプターをＨＥＶ由来ポドカリキシン様蛋白質（例えばＰＣＬＰまたはＰＣＬ
Ｐ−２）および競合物質もしくは抑制物質と、セレクチン−ポドカリキシン様蛋
白質結合が生じるために十分な条件下で接触させることを含む。競合物質は、特
異的にセレクチンと結合できる化合物であるか、またはそのような化合物と思わ
れる任意の化合物であろう。この場合、多くの実施態様で特に興味深いものは、
競合物質として上記で述べた本発明のリガンドを使用するものである。個々の方
法に応じて、特定の成分の１つまたは２つ以上（通常は１つ）を標識することが
できる。ここで標識するとは、成分が検出可能な部分（例えば蛍光または放射性
タグ）またはシグナル産生系の１成分（例えば酵素−ストレプトアビジン共役物
と結合させるためのビオチン（この場合酵素は基質を発色生成物に変換すること
ができる))を含むことを意味する。

【００５３】 上記のin vitroの方法は多数の異なる態様でデザインすることができ、当技術
分野で知られているように、この場合多様なアッセイ構成およびプロトコルを用
いることができる。例えば、成分の１つは固形支持体に結合させることができ、
残りの成分をこの支持体に結合させた成分と接触させる。この方法で上記の成分
は実質的に同じ時に、または別の時に一緒にすることができる。例えば、可溶性
Ｌ−セレクチンおよびリガンドを先ず最初に一緒にし、得られた混合物を続いて
基質結合ＨＥＶ由来ＰＣＬＰまたはＰＣＬＰ−２と一緒にする。この接触工程に
続いて、この方法は（必ずというわけではないが）一般に未結合成分を除去する
ための洗浄工程を含む。この場合、そのような洗浄工程は、検出時にバックグラ
ウンドシグナルを生じる標識（例えば放射性または蛍光標識された非特異的に結
合した成分）を除去するために必要な場合に一般に用いられる。任意の洗浄工程
の後で、結合セレクチン−ＰＣＬＰまたはセレクチン−ＰＣＬＰ−２複合体の存
在が続いて検出される。

【００５４】 ケモカインのための提示分子としてのＰＣＬＰ−２の役割を解明するために、
多様なアッセイ様式をまた用いることができる。例えばＥＬＩＳＡ様式を用いる
ことができるが、この場合、ＰＣＬＰ−２のＮ−末端ドメインは安定に固形支持
体の表面と結合している。続いてこの支持体結合ＰＣＬＰ−２をタッグ付加ケモ
カインと接触させ、ケモカインがこのＮ−末端ドメインと結合するか否かを決定
する。第二のケモカインを競合的様式下で加えることによって、ＰＣＬＰ−２と
の結合能力について複数の異なるケモカインの検査が可能になる。得られたデー
タから、ＰＣＬＰ−２のケモカイン提示機能性を容易に決定できる。

【００５５】 上記のin vitroの方法は、哺乳類での細胞接着、特にＰＣＬＰ／セレクチンま
たはＰＣＬＰ−２／セレクチン仲介細胞接着に関する情報を得るためにデザイン
されたアッセイで特に有用である。上記の場合、そのような細胞接着には以下の
反応から生じる細胞接着が含まれる：白血球−内皮相互反応、白血球−白血球相
互反応、血小板−白血球相互反応、血小板−内皮相互反応、および血小板−血小
板相互反応。上記のアッセイはまた、細胞遊走（例えば白血球遊走）に関する情
報を得る場合に有用である。上記のin vitroの方法はまた、セレクチンのＰＣＬ
ＰまたはＰＣＬＰ−２との結合を抑制する成分を特定するためにデザインされた
スクリーニングアッセイで有用である。

【００５６】 診断のための応用 さらにＰＣＬＰ−２活性に付随する症状を診断する方法が提供される。この診
断方法は、例えば問題の生物学的サンプル中のＰＣＬＰ−２の検出レベルまたは
ＰＣＬＰ−２遺伝子の発現レベルを基にしている。本明細書で用いられるサンプ
ルとは、生物学的液体、例えば精液、血液、脳脊髄液、涙、唾液、リンパ液、透
析液など；器官または組織培養に由来する液体；および生理学的組織から抽出し
た液体を含む。この用語にさらに含まれるものはそのような液体の誘導体および
分画である。固形組織の場合には細胞を個々に分離してもよいが、また組織片を
分析してもよい。また別には、細胞の溶解物を調製してもよい。

【００５７】 個々のサンプル中の遺伝子または蛋白質の発現レベルを決定するために多くの
方法を利用することができる。患者のサンプル中の正常または異常ＰＣＬＰ−２
の有無または量の変化を決定できる多くの方法によって、診断を下すことが可能
である。例えば、通常の方法を用いて、細胞または組織切片の標識抗体による染
色を検出に利用することができる。細胞を透過性にして細胞質の分子を染色する
。問題の抗体を細胞サンプルに添加し、エピトープに結合させるために十分な時
間（通常は少なくとも１０分）保温する。抗体は、放射性同位元素、酵素、蛍光
物質、化学発光物質、または他の直接検出用標識で標識できる。また別には、第
二段階抗体または試薬を用いてシグナルを増幅させる。そのような試薬は当技術
分野で周知である。例えば、一次抗体をビオチンに共役させ、セイヨウワサビペ
ルオキシダーゼ共役アビジンを第二段階試薬として添加できる。また別には、二
次抗体を蛍光化合物（例えばフルオレセイン、ローダミン、テキサスレッドなど
）に共役させる。最後の検出にはペルオキシダーゼの存在下で色の変化を受ける
基質を使用する。抗体結合の有無は種々の方法（分離細胞のフローサイトメトリ
ー、顕微鏡法、ラジオグラフィー、シンチレーション計測法などを含む）によっ
て決定できる。

【００５８】 また別にＰＣＬＰ−２の発現に焦点を合わせることができる。ＰＣＬＰ−２コ
ード領域または制御領域の配列多形性が疾患と結びついているか否かを決定する
ために、生化学的実験を実施できる。疾患に結びつく多形性には、遺伝子の欠失
または切断短縮、発現レベルを変化させる突然変異、当該蛋白質の活性に影響を
与える突然変異などが含まれる。 ＰＣＬＰ−２の発現レベルに影響を与えるプロモーターまたはエンハンサー配
列の変化は、当技術分野で知られている種々の方法によって正常な対立遺伝子座
の発現レベルと比較できる。プロモーターまたはエンハンサー強度を決定する方
法には以下が含まれる：発現された正常な蛋白質の定量；種々の制御成分をレポ
ーター遺伝子（例えばβ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼなど）とともにベクターに挿入（これは簡便
な定量を提供する）など。

【００５９】 固有の配列の存在（例えば疾患に結びつく多形性）について核酸を分析するた
めに多数の方法を利用できる。大量のＤＮＡが利用できる場合には、ゲノムＤＮ
Ａが直接用いられる。また別には、問題の領域を適切なベクターでクローニング
し、分析に十分な量に増殖させる。ＰＣＬＰ−２を発現している細胞をｍＲＮＡ
供給源として用いることができる。このｍＲＮＡを直接アッセイするか、または
ｃＤＮＡに逆転写して分析してもよい。核酸は通常の技術（例えばポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ))によって増幅させ、分析のために十分な量を提供することが
できる。ポリメラーゼ連鎖反応の使用は文献に記載されており（Saiki et al.(1
985), Science 239:487)、さらに技術の概略は成書に述べられている（Sambrook
et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press 1989, pp14.2-
14.33)。また別に、オリゴヌクレオチド連結を多形性検出の手段として利用する
多様な方法が当技術分野で知られている（例えば以下を参照されたい：Riley et
al.(1990), Nucl. Acids Res. 18:2887-2890; Delahunty et al.(1996), Am. J
. Hum. Genet. 58:1239-1246）。

【００６０】 検出標識は増幅反応中に加えてもよい。適切な標識には蛍光色素（例えばフル
オレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、テキサスレッド、フ
ィコエリトリン、アロフィコシアニン、６−カルボキシフルオレセイン（６−Ｆ
ＡＭ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフル
オレセイン（ＪＯＥ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カル
ボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、
５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）またはＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テト
ラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ))、放射性標識（例えば³²Ｐ
、³⁵Ｓ、³Ｈなど）が含まれる。標識は２段階系でもよい。この場合、増幅ＤＮ Ａは、結合親和性の高いパートナー（例えばアビジン、特異的抗体などでこの結
合パートナーを検出可能な標識に共役させる）をもつビオチン、ハプテンなどと
共役させる。標識はプライマーの一方または両方に共役させてもよい。また別に
は、増幅に用いるヌクレオチドプールを標識し、それによって標識を増幅生成物
に取り込ませる。

【００６１】 サンプル核酸（例えば増幅またはクローン化フラグメント）は、当技術分野で
知られている多数の方法のいずれかによって分析する。核酸はジデオキシ法また
は他の方法によって配列を決定し、この塩基配列を野性型のＰＣＬＰ−２配列と
比較することができる。変種配列とのハイブリダイゼーション（例えばサザンブ
ロット、ドットブロットなど）を用いて、その存在を調べることもまた可能であ
る。固形支持体に固定したオリゴヌクレオチドプローブアレーとのコントロール
配列および変種配列のハイブリダイゼーションパターン（米国特許第５４４５９
３４号またはＷＯ９５／３５５０５号に記載）もまた、変種配列の存在を検出す
る手段として用いることができる。一本鎖三次元構造多形性(single strand con
formational polymorphism, ＳＳＣＰ）分析、変性グラジエントゲル電気泳動（
ＤＧＧＥ）およびゲルマトリックス中のヘテロデュープレックス分析を用いて、
ＤＮＡ配列の変動によって生じた三次元構造変化を電気泳動の移動性の変化とし
て検出できる。また別には、多形性により制限エンドヌクレアーゼの認識部位が
創出または破壊される場合、サンプルを当該エンドヌクレアーゼで消化し、フラ
グメントが消化されたか否かを決定するために、生成物をサイズ分画する。ゲル
電気泳動または毛細管電気泳動（特にアクリルアミドまたはアガロースゲル）に
よって分画を実施する。

【００６２】 ＰＣＬＰ−２の変異についてのスクリーニングはこの蛋白質の機能的特徴また
は抗原的特徴を基にする。蛋白質の短縮切断アッセイは、この蛋白質の生物学的
活性に影響を及ぼす可能性がある欠失を検出する場合に有用である。ＰＣＬＰ−
２蛋白質の多形性を検出するためにデザインされた種々の免疫アッセイをスクリ
ーニングに用いることができる。多くの多様な遺伝的変異が特定の疾患表現型を
もたらす場合、機能的蛋白質アッセイは効果的なスクリーニングツールであるこ
とが判明した。コードされたＰＣＬＰ−２蛋白質の活性（例えばセレクチンリガ
ンド機能性）は、野性型蛋白質との比較によって決定できる。

【００６３】 ＰＣＬＰ−２発現レベルが問題とされている本発明の診断方法は、典型的には
対象となるサンプルのＰＣＬＰ−２核酸量をコントロール値と比較し、なんらか
の相関的な違いを決定することを含む。この場合、相関的な違いを定性的および
／または定量的に測定し、続いてこの相違と異常なＰＣＬＰ−２発現パターンの
有無との関係を調べる。サンプル中の核酸量を決定する種々の方法が当技術分野
で知られているが、興味深い具体的な方法は以下に記載した文献に含まれている
：Pietu et al., Genome Res.(June 1996), 6:492-503; Zhao et al., Gene(Apr
il 24, 1995), 156:207-213; Soares, Curr. Opin. Biotechnol. (October 1997
), 8:542-546; Raval, J. Pharmacol. Toxicol. Methods(November 1994), 32:1
25-127; Chalifour et al., Anal. Biochem.(February 1, 1994), 216:299-304;
Stolz & Tuan, Mol. Biotechnol.(December 1996), 6:225-230; Hong et al.,
Bioscience Reports(1982), 2:907; McGraw, Anal. Biochem.(1984), 143:298。
さらに興味深い方法はＷＯ９７／２７３１７号に開示されている（この文献は参
照により本明細書に含まれる）。

【００６４】 スクリーニングアッセイ 本ポドカリキンシン様蛋白質（例えばＰＣＬＰおよびＰＣＬＰ−２）は、治療
用薬剤を特定するためにデザインされた種々のスクリーニングアッセイで有用で
ある。このスクリーニング方法は典型的には、特定の候補治療薬剤の存在下での
ＰＣＬＰまたはＰＣＬＰ−２セレクチンリガンドおよび／またはケモカイン提示
活性の定性的／定量的測定を提供するアッセイであろう。例えば、このアッセイ
は、候補抑制物質の存在下および非存在下でのＰＣＬＰまたはＰＣＬＰ−２のセ
レクチンリガンド活性を測定するアッセイであろう。このスクリーニング方法は
in vitroまたはin vivo様式で、これら両様式は当業者には容易に作製できるで あろう。個々の方法に応じて、スクリーニングアッセイの１つまたは２つ以上（
通常は１つ）の成分を標識することができる。ここで、標識とはこれら成分が検
出可能な分子部分（例えば蛍光または放射性タグ）またはシグナル産生系の１構
成成分（例えば酵素が基質を発色生成物に変換させることができる酵素−ストレ
プトアビジン共役物と結合させるためのビオチン）を含むことを意味する。

【００６５】 多様な他の試薬をスクリーニングアッセイに加えることができる。これら試薬
には、塩、中性蛋白質（例えばアルブミン）、洗剤などの最適な蛋白質−蛋白質
結合を促進させ、および／または非特異的またはバックグラウンド反応を減少さ
せるために使用されるような試薬が含まれる。アッセイの効率を改善する試薬、
例えばプロテアーゼ抑制物質、抗菌剤などを用いることができる。

【００６６】 多様な種々の候補薬剤を上記の方法によりスクリーニングすることができる。
候補薬剤には多数の化学物質類が含まれるが、ただしそれらは典型的には有機分
子、好ましくは小さな有機化合物で５０ダルトンより大きく２５００ダルトンよ
り小さな分子量を有する。候補薬剤は蛋白質との構造的相互反応（特に水素結合
）に必要な官能基を含み、典型的には少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキ
シルまたはカルボキシル基、好ましくは少なくとも２つの化学官能基を含む。候
補薬剤はしばしば、上記の官能基の１つまたは２つ以上で置換された環状炭素ま
たは複素環構造および／または芳香族もしくはポリアロマテチック構造を含む。
候補薬剤はまた、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、
その誘導体、構造的類似体またはそれらの組み合わせを含む生物分子の中で見出
される。

【００６７】 候補薬剤は合成または天然の化合物ライブラリーを含む広範囲の多様な供給源
から得ることができる。例えば、多様な有機化合物および生物分子のランダム合
成および特異的誘導合成のために、多数の手段が利用可能で、これらにはランダ
ム化オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現が含まれる。また別には、
天然の化合物ライブラリーとして細菌、真菌、植物および動物の抽出物が利用可
能であり、また容易に製造できる。さらにまた、天然または合成により製造され
たライブラリーおよび化合物は、通常の化学的、物理的および生化学的手段によ
り容易に改変でき、さらに組み合わせ式ライブラリーを作製するために用いるこ
とができる。既知の薬剤を特異的誘導改変または化学的なランダム改変（例えば
アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化など）に付し、構造類似体を製造
できる。

【００６８】 ＰＣＬＰ−２核酸およびポリペプチドの治療用組成物 本発明の核酸組成物はまた、ＰＣＬＰ−２活性をホスト（例えば症状が存在す
るほどＰＣＬＰ−２活性が低い哺乳類ホスト）で増強させたいと所望する状況下
で治療薬として有用である。ＰＣＬＰ−２遺伝子、遺伝子フラグメントまたはコ
ードされたＰＣＬＰ−２蛋白質またはフラグメントが、ＰＣＬＰ−２欠損に付随
する疾患を処置する遺伝子治療で有用である。ＰＣＬＰ−２遺伝子を細胞内に導
入するために発現ベクターを用いることができる。一般にそのようなベクターは
プロモーター配列近くに位置する便利な制限部位を有し、核酸配列の挿入を提供
する。転写開始領域、標的遺伝子またはそのフラグメント、および転写終了領域
を含む転写カセットを調製できる。この転写カセットを種々のベクター（例えば
プラスミド、レトロウイルス（例えばレンチウイルス、アデノウイルスなど))に
導入できる。ここでこれらベクターは細胞内で一過性または安定的に、通常は少
なくとも約１日、より通常的には少なくともほぼ数日から数週間維持される。

【００６９】 この遺伝子またはＰＣＬＰ−２蛋白質は、任意のルート（ウイルス感染、マイ
クロインジェクションまたは小胞の融合を含む）によって組織またはホスト細胞
に導入できる。文献（Furth et al.(1992), Anal. Biochem. 205:365-368）にし
たがって、筋肉内投与のためにジェットインジェクションもまた用いることがで
きる。ＤＮＡを金微粒子上に被覆し、粒子噴射装置または文献に記載された”遺
伝子銃”（Tang et al.(1992), Nature 356:152-154)によって薬剤を配送するこ
とができる（ここでは金の微小弾丸がＤＮＡで被覆され、皮膚の細胞内に発射さ
れる）。

【００７０】 ホストでＰＣＬＰまたはＰＣＬＰ−２活性を調節する方法 さらにまた、in vivoのホストで、例えばポドカリキシン様蛋白質活性、例え ばＰＣＬＰまたはＰＣＬＰ−２活性（例えばセレクチンリガンドおよび／または
ケモカイン提示活性）を調節（例えば抑制）する方法が提供される。そのような
方法では、ＰＣＬＰまたはＰＣＬＰ−２のセレクチン結合および／またはケモカ
イン提示活性を調節する活性を有する薬剤の有効量がホストに投与される。別な
実施態様では、ケモカイン−ＰＣＬＰ−２相互作用を阻害する薬剤が用いられる
。活性薬剤は多様な種々のＰＣＬＰまたはＰＣＬＰ−２活性調節剤であり、この
調節剤は多様な種々の標的部位に作用するであろう。

【００７１】 興味をもたれる活性薬剤の１つのタイプは、ＰＣＬＰまたはＰＣＬＰ−２がも
はやセレクチンレセプターに認識されずおよび／または当該レセプターと結合で
きず、および／またはケモカインを提示できなくなるような態様でこれら蛋白質
と結合する能力をもつ薬剤である。また他の実施態様では、活性薬剤は、ケモカ
イン−ＰＣＬＰ−２相互反応を抑制するような態様で標的ケモカイン（例えばＳ
ＬＣまたはＭＩＰ−３α）と反応する薬剤であろう。活性薬剤は多様な種々の化
合物で、天然に存在するかまたは合成された小分子化合物、抗体、そのフラグメ
ントまたは誘導体、アンチセンス組成物などを含む。

【００７２】 興味をもたれる天然に存在するかまたは合成された小分子化合物には多数の化
学物質類が含まれるが、ただしそれらは典型的には有機分子、好ましくは小さな
有機化合物で、５０ダルトンより大きく約２５００ダルトンより小さい分子量を
有する。候補薬剤は蛋白質との構造的反応（特に水素結合）に必要な官能基を含
み、典型的には少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシ
ル基、好ましくは少なくとも２つの化学官能基を含む。候補薬剤は、上記の官能
基の１つまたは２つ以上で置換された環状炭素または複素環構造および／または
芳香族またはポリアロマチック構造をしばしば含む。候補薬剤はまた、ペプチド
、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、その誘導体、構造的類似体
またはその組み合わせを含む生物分子中に見出される。

【００７３】 活性薬剤にはまた抗体（ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両抗体）
およびその結合フラグメント、例えばＦｖ、Ｆ（ａｂ’）2およびＦａｂが含ま れ、そのような抗体は好ましくはＰＣＬＰ−２の機能的ドメイン、例えばムチン
またはＮ−末端ドメインを認識する。そのような抗体は当業者に知られている方
法にしたがって製造できるが、この場合これらの抗体はヒト化されてホストの許
容性が改善される。

【００７４】 適切な抗体は、ホスト動物を本発明のポドカリキシン様蛋白質（例えば本発明
のＰＣＬＰまたはＰＣＬＰ−２ポリペプチド組成物で見出されるもの）の全体ま
たはその一部分で免疫することによって得られる。適切なホスト動物にはマウス
、ラット、ヒツジ、ヤギ、ハムスター、ウサギなどが含まれる。免疫原蛋白質の
供給源はマウス、ヒト、ラット、サルなどであろう。一般にホスト動物は免疫原
と異なる種である。例えばヒトのＰＣＬＰ−２はマウスなどを免疫するために用
いられる。

【００７５】 免疫原は完全な蛋白質、またはそのフラグメントおよび誘導体を含む。好まし
い免疫原は本蛋白質の全てまたは部分を含み、ここで残りの部分は、天然の蛋白
質で見出される翻訳後修飾（例えば糖化）を含む。細胞外ドメインを含む免疫原
は当術分野で知られている多様な方法、例えば通常の組換え法を用いるクローン
化遺伝子の発現、ＨＥＣからの単離などによって製造できる。

【００７６】 ポリクローナル抗体の製造のためには、第一の工程はホスト動物の本蛋白質に
よる免疫で、この場合、本蛋白質は好ましくは実質的に純粋な形で、約１％未満
の夾雑物を含む。免疫原は完全なポドカリキシン様蛋白質、そのフラグメントま
たは誘導体を含むであろう。ホスト動物の免疫反応を高めるために、本蛋白質は
アジュバントと結合させることができる。適切なアジュバントにはミョウバン、
デキストラン、硫酸塩、大型のポリマー陰イオン、油と水の乳濁液（例えばフロ
イントのアジュバント、フロイントの完全アジュバント）などが含まれる。蛋白
質はまた合成担体蛋白質または合成抗原と共役させてもよい。種々のホストを免
疫してポリクローナル抗体を製造できる。そのようなホストにはウサギ、モルモ
ット、ゲッ歯類（例えばマウス、ラット、ヒツジ、ヤギ）などが含まれる。蛋白
質は通常は皮内に、第１回の投与に続いて１回または２回以上、通常は少なくと
も２回の更なるブースター投与によりホストに投与される。免疫の後、ホストの
血液を採集し、続いて血液細胞から血清を分離する。得られた抗血清に含まれる
Ｉｇを、既知の方法（例えばアンモニウム塩分画、ＤＥＡＥクロマトグラフィー
など）によってさらに分画することができる。

【００７７】 モノクローナル抗体は通常の技術によって製造する。一般には、免疫ホスト動
物の脾臓および／またはリンパ節がプラズマ細胞の供給源を提供する。プラズマ
細胞をミエローマ細胞と融合させて不朽化し、ハイブリドーマ細胞を製造する。
個々のハイブリドーマの培養上清を標準的技術を用いてスクリーニングし、所望
の特異性をもつ抗体を産生するものを特定する。ヒトの蛋白質に対するモノクロ
ーナル抗体を産生させるために適した動物にはマウス、ラット、ハムスターなど
が含まれる。マウスの蛋白質に対する抗体を作製する動物は、一般にハムスター
、モルモット、ウサギなどである。ハイブリドーマ細胞の上清または腹水液から
得た抗体を通常の技術、例えば不溶支持体（蛋白Ａセファロース）に結合させた
ＰＣＬＰまたはＰＣＬＰ−２を用いるアフィニティークロマトグラフィーによっ
て精製することができる。

【００７８】 抗体は、通常のマルチマー構造の代わりに単鎖として製造できる。単鎖抗体は
Jostらおよび他の研究者が記載している（Jost et al.(1994), J.B.C. 269:2626
7-73）。重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡ配列を少なく
とも約４アミノ酸の小さな中性アミノ酸（グリシンおよび／またはセリンを含む
）をコードするスペーサーと連結する。この融合物によってコードされる蛋白質
は、本来の抗体の特異性および親和性を保持する機能的な可変領域の集合組立を
可能にする。

【００７９】 in vivo、特にヒトに注射するために用いる場合は、抗体の抗原性を減少させ ることが好ましい。阻害剤に対するレシピエントの免疫反応は治療が有効な期間
を短縮させる可能性があるであろう。抗体をヒト化する方法は当技術分野で知ら
れている。ヒト化抗体は、ヒトの免疫グロブリンの定常領域の遺伝子を導入した
動物の生成物でもよい（例えば国際特許出願ＷＯ９０／１００７７号およびＷＯ
９０／０４０３６号を参照されたい）。また別には、問題の抗体は組換えＤＮＡ
技術によって操作し、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジ領域、および／またはフ
レームワークドメインを、対応するヒト配列で置換してもよい（ＷＯ９２／０２
１９０号参照）。

【００８０】 キメラ免疫グロブリン遺伝子の構築のためのＩｇｃＤＮＡを使用することは当
技術分野で知られている（Liu et al.(1987), P.N.A.S. 84:3439および(1987) J
. Immunol. 139:3521)。ｍＲＮＡはハイブリドーマまたは抗体を産生する他の細
胞から単離し、ｃＤＮＡを製造するために使用する。問題のｃＤＮＡを特別なプ
ライマーを用いてポリメラーゼ連酸反応によって増幅することができる（米国特
許第４６８３１９５号および４６８３２０２号）。また別には、ライブラリーを
作製し、問題の配列を単離するためにスクリーニングする。抗体の可変領域をコ
ードするＤＮＡ配列を続いてヒトの定常領域の配列と融合させる。ヒトの定常領
域の遺伝子配列は文献に記載されている（Kabat et al.(1991) "Sequences of P
roteins of Immunological Interest", N.I.H. publication no.91-3242)。ヒト
のＣ領域遺伝子は既知のクローンから容易に入手できる。アイソタイプの選択は
所望のエフェクター機能、例えば補体固定または抗体依存細胞性細胞毒性によっ
て誘導される。好ましいアイソタイプはＩｇＧ１、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４であ
る。ヒトの軽鎖定常領域（カッパまたはラムダのいずれか）を用いることができ
る。キメラヒト化抗体を続いて通常の方法によって発現させる。

【００８１】 抗体フラグメント（例えばＦｖ、Ｆ（ａｂ’）2およびＦａｂ）は、例えばプ ロテアーゼまたは化学的切断によって、完全な蛋白質を切断することによって製
造できる。例えば、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントの一部分をコードするキメラ遺 伝子は、ＣＨ１ドメインおよびＨ鎖のヒンジ領域、続いて翻訳終止コドンを含み
、短縮分子を生じる。 ＨおよびＬのＪ領域のコンセンサス配列を用いて、その後ヒトＣ領域セグメン
トへＶ領域セグメントを連結するために、Ｊ領域に有用な制限部位を導入すべく
、プライマーとして使用するオリゴヌクレオチドをデザインすることができる。
Ｃ領域のｃＤＮＡを位置特異的変異で改変し、ヒト配列内の同様な位置に制限部
位を配置することができる。

【００８２】 発現ベクターにはプラスミド、レトロウイルス、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来エピソー
ムなどが含まれる。便利なベクターは、機能的に完全なヒトＣＨまたはＣＬ免疫
グロブリン配列をコードし、さらに任意のＶＨまたはＶＬ配列が容易に挿入され
発現されるように適切な制限部位が作製されているベクターである。そのような
ベクターでは、通常スプライシングは、挿入されたＪ領域内のスプライス供与部
位とヒトＣ領域に先行するスプライス受容部位との間で、およびヒトＣＨエクソ
ン内に生じるスプライス領域でも発生する。ポリアデニル化および転写終了は、
コード領域下流の固有の染色体部位で生じる。得られたキメラ抗体は任意の強力
なプロモーターに結合させることができる。このプロモーターには、レトロウイ
ルスＬＴＲ（例えばＳＶ−４０初期プロモーター（Okayama et al.(1983), Mol.
Cell. Bio. 3:280)、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ（Gorman et al.(1982), P.N.A
.S. 79:6777)およびモロニーネズミ白血病ウイルスＬＴＲ（Grosschedl et al.(
1985), Cell 41:885);天然のＩｇプロモーターなどが含まれる。 ＰＣＬＰまたはＰＣＬＰ−２活性を抑制する具体的な抗体には、Sawadaらが記
載したＭＥＣＡ−７９．２Ｈ５（Biochem Biophys. Res. Com. 193:337-347）な
どが含まれる。

【００８３】 活性薬剤としての問題の調節物質には、通常は１つまたは２つ以上の共有結合
の破壊による化学的変化によって、ＰＣＬＰまたはＰＣＬＰ−２の特にムチンド
メインの構造を、この蛋白質がもはやセレクチンレセプターと結合することがで
きないように変化させる薬剤もまた含まれる。そのような薬剤には、この蛋白質
構造に存在する１つまたは２つ以上の結合を切断し、それによって当該蛋白質が
もはやセレクチンレセプターによって認識されないように当該構造を破壊する酵
素が含まれる。そのような酵素には以下が含まれる：エンドペプチダーゼ（例え
ばＯ−シアロ糖蛋白質エンドペプチダーゼなど）；シアリダーゼ（例えばアース
ロバクター・ウレアファシエンス（Arthrobacter ureafaciens）シアリダーゼ、
クロストリジウム・パーフリンゲンス（Clostridium perfringens)シアリダーゼ
、ニューカッスル病ウイルスシアリダーゼなど）；スルファターゼ（例えばＧａ
ｌ−６−スルファターゼおよびＧｌｃＮＡｃ−６−スルファターゼなど）；プロ
テアーゼ（例えばＯＳＧＥ、触媒性抗体など）；フコシダーゼなど。

【００８４】 さらに本発明の実施態様では、活性薬剤はこの蛋白質（例えばＰＣＬＰまたは
ＰＣＬＰ−２）の発現を調節、および一般には減少させる薬剤である。そのよう
な薬剤には、アンチセンス試薬（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）、発現抑制薬剤な
どが含まれる。アンチセンス試薬は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ
）、特に天然の核酸で化学的改変をもつ合成ＯＤＮまたはそのようなアンチセン
ス分子をＲＮＡとして発現する核酸構築物であろう。アンチセンス配列は標的遺
伝子のｍＲＮＡと相補的で、標的の遺伝子生成物の発現を抑制する。アンチセン
ス分子は種々のメカニズムによって、例えば、翻訳に利用できるｍＲＮＡ量を減
少させることや、リボヌクレアーゼＨの活性化、または立体的妨害によって、遺
伝子発現を抑制する。１つのアンチセンス分子またはアンチセンス分子の組み合
わせを投与することができる。組み合わせの場合は、多数の異なる配列を含むこ
とができる。

【００８５】 アンチセンス分子は、適切なベクターで標的遺伝子配列の全部または部分の発
現によって製造できる。転写開始は、アンチセンス鎖がＲＮＡ分子として製造さ
れるように方向を定める。または、アンチセンス分子は合成オリゴヌクレオチド
でもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは一般に長さが少なくとも約７ヌク
レオチド、通常は少なくとも約１２ヌクレオチド、より通常的には少なくとも約
２０ヌクレオチドで、約５００ヌクレオチドを越えず、通常は約５０ヌクレオチ
ドを越えず、より通常的には長さが約３５ヌクレオチドを越えない。ここで長さ
は抑制効率、特異性（交差反応が存在しないことを含む）などによって決定され
る。短いオリゴヌクレオチド（長さが７から８塩基）は遺伝子発現の強力で選択
的な抑制物質であることが分かった（Wagner et al.(1996), Nature Biotechnol
. 14:840-844）。

【００８６】 内因性センス鎖のｍＲＮＡ配列の特定領域をアンチセンス配列と相補性をもつ
ように選択する。オリゴヌクレオチドについて特定配列を選択する場合経験によ
る方法を用いる。ここではいくつかの候補配列が、in vitroモデルまたは動物モ
デルで標的遺伝子の発現抑制についてアッセイされる。配列組み合わせもまた用
いることができるが、この場合、ｍＲＮＡ配列のいくつかの領域がアンチセンス
相補性のために選択される。

【００８７】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは当技術分野で知られている方法で化学的に
合成できる（以下の文献を参照のこと：Wagner et al.(1993）上掲書、およびMi
lligan et al.,上掲書）。好ましいオリゴヌクレオチドは、それらの細胞内安定
性および結合親和性を高めるために天然のホスホジエステル構造を化学的に改変
されている。多数のそのような改変が文献に記載されているが、それら改変は骨
格、糖または複素環塩基の化学構造の変更である。

【００８８】 骨格の化学構造でとりわけ有用な変更は以下のとおりである：ホスホロチオエ
ート；ホスホロジチオエート（この場合、非架橋酸素の両方がイオウで置換され
ている）；ホスホロアミダイト；アルキルホスホトリエステルおよびボラノホス
フェート。アキラルホスフェート誘導体には３’−Ｏ’−５’−Ｓ−ホスホロチ
オエート、３’−Ｓ−５’−Ｏ−ホスホロチオエート、３’−ＣＨ２−５’−Ｏ
−ホスホネートおよび３’−ＮＨ−５’−Ｏ−ホスホロアミデートが含まれる。
ペプチド核酸は完全なリボースホスホジエステル骨格をペプチド結合で置換され
ている。糖の改変もまた安定性と親和性を強化させるために利用される。デオキ
シリボースのα−アノマーを用いることができるが、この場合塩基は天然のβ−
アノマーと比較して倒置されている。リボース糖の２’−ＯＨを変化させて２’
−Ｏ−メチルまたは２’−Ｏ−アリル糖を形成させることができ、これによって
親和性をもたらすことなく分解に対して耐性を提供する。複素環塩基の改変は適
切な塩基の対合形成を維持する必要がある。いくつかの有用な置換には、デオキ
シチミジンをデオキシウリジンに；デオキシシチジンを５−メチル−２’−デオ
キシシチジンおよび５−ブロモ−２’−デオキシシチジンに置換するものが含ま
れる。５−プロピニル−２’−デオキシウリジンおよび５−プロピニル−２’−
デオキシシチジンは、デオキシチミジンおよびデオキシシチジンと置換したとき
それぞれ親和性および生物学的活性を高めることが示された。

【００８９】 アンチセンス抑制物質の代替として、触媒性核酸化合物（例えばリボザイム、
アンチセンス共役物など）は遺伝子発現を抑制するために用いることができる。
リボザイムはin vitroで合成してホストに投与するか、または標的細胞内でリボ
ザイムを合成する発現ベクターによってコードしてもよい（例えば以下の文献を
参照されたい：国際特許出願ＷＯ９５／２３２２５号；Beigelman et al.(1995)
, Nucl. Acids Res. 23:4434-42)。触媒活性に関するオリゴヌクレオチドの例は
ＷＯ９５／０６７６４号に記載されている。アンチセンスＯＤＮの金属複合体、
例えばテルピジルＣｕ（ＩＩ）との共役（ｍＲＮＡ加水分解を仲介することがで
きる）は文献に記載されている（Bashkin et al.(1995), Appl. Biochem. Biote
chnol. 54:43-56)。

【００９０】 また別の実施態様では、そのような薬剤は、活性を有する蛋白質が細胞表面に
提示されないように翻訳後に当該蛋白質（例えばＰＣＬＰまたはＰＣＬＰ−２）
を変化させる薬剤である。そのような薬剤には、グリコシルまたはスルホトラン
スフェラーゼの抑制物質などである。 さらにまた別の実施態様では、活性な薬剤はポドカリキシン様蛋白質の競合物
質（例えばＰＣＬＰまたはＰＣＬＰ−２競合物質）であろう。そのような競合物
質には、可溶性ＰＣＬＰまたはＰＣＬＰ−２およびそのセレクチン結合フラグメ
ントを含む上記で述べた本発明のセレクチンリガンドが含まれる。これらは、天
然の供給源または合成により製造されたものから得られる。後者は、例えば組換
えＤＮＡ技術（例えば、発現リコンビナントの翻訳後改変が可能な環境下でＰＣ
ＬＰまたはＰＣＬＰ−２をコードするリコンビナント遺伝子を発現させ、ＰＣＬ
ＰまたはＰＣＬＰ−２様セレクチン結合活性をもつ化合物を得る）によって製造
される。

【００９１】 上記で述べるように有効量の活性薬剤をホストに投与するが、ここで”有効量
”とは所望の結果を得るために十分な投与量を意味する。一般に、所望の結果は
、コントロールと比較したとき少なくともセレクチン結合量が減少することであ
る。 本方法では、活性な薬剤は、ＰＣＬＰおよび／またはＰＣＬＰ−２活性（例え
ばセレクチン結合活性、ケモカイン提示活性など）の所望の抑制をもたらすこと
ができる任意の通常の手段を用いてホストに投与できる。したがって、当該薬剤
は治療で投与するために多様な製剤に取り込ませることができる。より具体的に
は、本発明の薬剤は、適切な医薬的に許容できる担体または希釈剤と組み合わせ
ることによって医薬組成物として製剤化するか、または固形、半固形、液体、ま
たは気体形の調製物（例えば錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、座薬、
注射液、吸入剤およびエアロゾル）として製剤化できる。

【００９２】 したがって、薬剤の投与は多様な方法（経口、頬内、直腸内、非経口、腹腔内
、皮内、経皮、口唇内投与などを含む）で達成できる。 医薬剤形の場合、これら薬剤は医薬的に許容できる塩の形で投与するか、また
は単独もしくは適切な結合形、および他の医薬的に活性な化合物と組み合わせて
用いることができる。以下の方法および賦形剤は単なる例で限定を目的とするも
のではない。 経口調製物の場合、薬剤は単独または適切な添加剤と組み合わせて使用し、錠
剤、粉末、顆粒またはカプセルを以下のものを用いて製造できる：例えば通常の
添加剤（例えばラクトース、マンニトール、トウモロコシ澱粉またはジャガイモ
澱粉）；結合剤（例えば結晶セルロース、セルロース誘導体、アラビアゴム、ト
ウモロコシ澱粉またはゼラチン）；崩壊剤（例えばトウモロコシ澱粉、ジャガイ
モ澱粉またはカルボキシメチルセルロースナトリウム）；潤滑剤（例えばタルク
またはステアリン酸マグネシウム）；さらに所望の場合は希釈剤、緩衝剤、湿潤
剤、保存料および香料。

【００９３】 薬剤は、それらを適切な水性または非水性媒体（例えば植物油もしくは他の同
様な油、合成脂肪酸グリセリド、高脂肪酸もしくはプロピレングリコールのエス
テル）中に溶解、懸濁または乳化させて注射用調製物として製剤化できる。らに
所望の場合は通常の添加物（例えば可溶化剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤
および保存料）を添加できる。 薬剤は吸入により投与するエアロゾル製剤として利用できる。本発明の化合物
は、加圧された許容可能な爆発剤（例えばジクロロジフルオロメタン、プロパン
、窒素など）中で製剤化できる。 さらに、薬剤は多様な基剤（例えば乳化基剤または水溶性基剤）と混合して座
薬にすることができる。本発明の化合物は座薬により直腸に投与できる。座薬は
、体温で融解するが室温では固体である担体（例えばココアバター、カルボワッ
クスおよびポリエチレングリコール）を含むことができる。

【００９４】 経口用または直腸投与用の１回分（単位）剤形（例えばシロップ、エリキシル
および懸濁液）では、単位剤形（例えば茶匙一杯、大さじ一杯、錠剤または座薬
）が１つまたは２つ以上の抑制物質を含む予め定めた量の組成物を含有するよう
に提供される。同様に、注射用または静脈内投与用の単位剤形は、滅菌水、通常
の食塩水または別の医薬的に許容できる賦形剤中の溶液として組成物中に抑制物
質を含むことができる。 本明細書で使用される“単位剤形”という用語は、ヒトおよび動物の個々の投
薬として適切な物理的に切り離された単位を指し、各剤形は、医薬的に許容され
た希釈剤、担体または賦形剤と一緒に所望の効果をもたらすために計算された十
分な量の予め定められた本発明の化合物を含んでいる。本発明の新規な単位剤形
の細目は、使用される個々の化合物、達成されるべき効果、および各化合物のホ
スト内での薬理的消長によって左右される。

【００９５】 医薬的に許容できる賦形剤（例えば担体、アジュバント、または希釈剤）は一
般に容易に入手できる。さらにまた、医薬的に許容可能な補助剤（例えばｐＨ調
節剤および緩衝剤、張度調節剤、安定剤、湿潤剤など）も一般に容易に入手でき
る。 投薬レベルは、個々の化合物、症状の重篤度および患者の副作用に対する感受
性の関数として変動しうることは当業者には容易に理解されるところである。あ
る化合物の好ましい投与量は、多様な手段によって当業者には容易に決定できよ
う。

【００９６】 本方法は、セレクチン−ポドカリキシン様蛋白質（例えばセレクチン−ＰＣＬ
Ｐ、またはセレクチン−ＰＣＬＰ−２）結合反応、および／またはケモカイン−
白血球相互反応、特にＬ−、Ｅ−またはＰ−セレクチン仲介結合事象を包含する
種々の多様な症状の治療に有用である。そのような症状には、炎症部位への白血
球の帰巣、二次リンパ器官への白血球の正常な帰巣、血小板と活性化内皮との相
互反応、血管内での血小板−血小板および血小板−白血球相互反応などに関連ま
たは起因する症状が含まれる。したがって、本方法で治療できる特定の症状には
以下が含まれる：急性または慢性炎症；自己免疫疾患および関連疾患、例えば全
身性紅斑性狼瘡、慢性関節リューマチ、結節性多発性動脈炎、多発性筋炎および
皮膚筋炎、進行性全身性硬化症（びまん性強皮症）、糸球体腎炎、重症筋無力症
、ショーグレン症候群、橋本病およびグレーヴズ病、副腎炎、上皮小体機能低下
症および関連疾患；悪性貧血；糖尿病；多発性硬化症および関連する脱髄性疾患
；ブドウ膜炎天疱瘡および類天疱瘡；肝硬変および肝の他の疾患；潰瘍性大腸炎
；心筋炎；限局性腸炎；成人呼吸促迫症候群；薬剤反応の局所症状（皮膚炎など
）；皮膚の炎症関連またはアレルギー反応；アトピー性皮膚炎および乳児湿疹；
接触皮膚炎、扁平苔癬性乾癬；アレルギー性腸症；アトピー性疾患（例えばアレ
ルギー性鼻炎および気管支喘息）；移植拒否（心臓、腎臓、肺臓、肝臓、膵臓島
細胞、その他）；感染性生物に対する過敏反応または損傷性反応；ストレプトコ
ッカス症後発症状（例えばリューマチ熱の心臓症状など）；移植時の組織拒絶；
粥状硬化症；血管形成術後の再狭窄；損傷性塞栓、再灌流障害など。

【００９７】 治療とは、ホストに影響を及ぼす病的状態に付随する症状の少なくとも軽減を
意味し、ここで軽減は広い意味で用いられ、治療されるべき病的状態に付随する
パラメーター（例えば炎症およびそれに付随する痛みのような症候）の少なくと
も規模の減少を指す。したがって、治療には、ホストがもはや病的状態または少
なくとも当該病的状態の特徴となる症候を患うことがないように、病的状態また
は少なくともそれに付随する症候が完全に抑制される（例えば発生が抑えられる
）か、または停止（例えば終了）する状態が含まれる。

【００９８】 本方法にしたがって多様なホストを治療することができる。一般にそのような
ホストは”哺乳動物”または”哺乳綱”である。これらの用語は哺乳類に入る生
物を広く指すために用いられ、食肉目（例えばイヌおよびネコ）、ゲッ歯目（例
えばマウス、モルモットおよびラット）および霊長目（ヒト、チンパンジーおよ
びサル）を含む。多くの実施態様ではホストはヒトである。 活性薬剤の単位投与量を含むキット（通常は経口または注射投与形）が提供さ
れる。そのようなキットでは、当該単位投与量を含む容器の他に、用途および問
題の症状の治療における薬効を記載した指示用パッケージ挿入物が存在するであ
ろう。好ましい化合物および単位投与量は上記で述べたようなものである。 以下の実施例は主に説明を目的として提供される。製剤、投与量、投与方法お
よび本発明の他のパラメーターは、本発明の範囲を逸脱することなく種々に改変
または置換することができることは当業者には容易に理解されよう。

【００９９】

【実施例】

Ｉ．ＰＣＬＰ Ａ．材料と方法 １．抗体炭水化物およびＩｇ−キメラ マウス抗ＰＣＬＰモノクローナル抗体、３Ｄ３（ＩｇＧ）、２Ａ４（ＩｇＭ）
および４Ｆ１０（ＩｇＭ）を文献（Kershaw et al., J. Cell Biol., 272:15707
-15714(1997)）にしたがって作製し、ハイブリドーマ培養上清を製造した。さら
に、３Ｄ３抗体は腹水としてもまた製造した。ＭＥＣＡ−７９（ラットＩｇＭ）
ハイブリドーマを米国菌培養収集所（Rockville, MD)から入手し、腹水として製
造し、製造元の推奨にしたがってセファロース結合抗ラットＩｇκ（Zymed, Sou
th San Francisco, CA）で精製した。抗体は、文献（Harlow & Lane, "Antibodi
es:A Laboratory Manual.(Cold Spring Harbor Press, 1988))にしたがってＮＨ
Ｓ−ビオチン（Sigma, St Louis, MO)でビオチン付加を実施した。精製抗Ｌセレ
クチンモノクローナル抗体ＬＡＭ１−３をThomas Tedder博士(Duke University,
NC)から入手した。フコイジンはシグマ社（Sigma, St. Louis, MO）から購入し
た。Ｌ−セレクチン／ＩｇＧキメラおよびＣＤ４／ＩｇＧキメラは、ヒトＩｇＧ
１のＦｃドメインと融合させたネズミのＬ−セレクチンまたはヒトＣＤ４の完全
な細胞外ドメインから成る。これらのキメラ蛋白質はトランスフェクトした２９
３細胞の上清から採集し、以前に報告されたように（Watson et al., J. Cell B
iol., 117:895(1990))蛋白−Ａで精製した。アースロバクター・ウラファシエン
ス（Arthrobacter urafaciens)シアリダーゼはオックスフォードグリコシステム
ズ社（Oxford glycosystems, Oxford, UK)から購入した。Ｏ−シアロ糖蛋白エン
ドペプチダーゼ（ＯＳＧＥ）はセーダーレーンバイオロジカルズ社（Cedar Lane
Biologicals, Ontario, Canada)から購入した。

【０１００】 ２．細胞 ジャーカットＴ細胞はArt Weiss博士(University of California, San Franci
sco)の研究室から入手し、ＲＰＭＩ−１６４０培養液（１００Ｕ／ｍｌのペニシ
リン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭグルタミンおよび５％熱
不活化ＦＣＳ（Hyclone, Logan, UT）を補充）で維持した。ヒトＴリンパ球は、
文献（Giblin et al., J. Immunol., 159:3498-3507(1997))の記載にしたがって
標準的なグラジエント技術を用いて静脈血サンプルから単離した。簡単に記せば
、血液を健常なドナーから採集し、ＥＤＴＡを最終濃度５ｍＭで添加して凝固と
細胞の活性化を防止した。血液サンプルは、陽イオンを含まない１／２容のＨＢ
ＳＳで希釈し、ヒストパーク（Histopaque）１０７７（Sigma)に重層した。５０
０ｘｇで２０分室温で遠心した後、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）分画を採集し、陽
イオンを含まない冷ＨＢＳＳ（０．２％ＢＳＡ補充）で希釈し、さらに遠心して
単離細胞を回収した。Ｔリンパ球はＢ細胞および単球枯渇によって得た。ＰＢＭ
Ｃを飽和量のマウス抗ＣＤ１４（単球マーカー）、マウス抗ＣＤ１９（Ｂ細胞マ
ーカー）で処理し、続いてヒツジ抗マウスＩｇＧ結合常磁性体粒子（Dynal, Lak
e Success, NY)で処理した。標識細胞を続いて磁石（Dynal)を用いて除去した。

【０１０１】 ３．免疫組織化学 ヒトの扁桃の外科標本(University of California(San Francisco)から入手）
をＯ．Ｃ．Ｔ媒体（Miles Inc., Elkhart, IN)に包埋して凍結するか、または中
性緩衝液処理ホルマリンで固定してパラフィン包埋した。パラフィン包埋ヒトリ
ンパ節または虫垂の切片を特定の病変をもたないことが判明した保存標本から入
手した。５０ｍＭのカコジレート（ｐＨ７）中の１％のパラホルムアルデヒドで
１２μｍの凍結切片を２０分固定した。セイヨウワサビペルオキシダーゼ検出の
場合は、内因性ペルオキシダーゼは、ＰＢＳ中の０．３％Ｈ₂Ｏ₂、０．２Ｍ Ｎ
ａＮ₃で抑制した。切片を５％ヤギ血清でブロッキングし、さらに未希釈ハイブ リドーマ培養上清で一晩４℃で染色した。続いて５％ヤギ血清および２．５％ヒ
ト血清中のビオチン付加ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：２５０希釈、重鎖および軽鎖
特異的）（Vector, Burlingame, CA）、続いてＰＢＳ中のＡＢＣエリート試薬（
Vector）、最後にＡＥＣクロマゲン（Biomeda, Foster City, CA）とともに連続
的に切片を保温した。クロマゲンによる発色後、切片をヘマトキシリン水溶液で
対比染色し、パーマフルアー（Permafluor, Lipshaw, Pittsburgh, PA)でマウン
トした。各反応の後はＰＢＳを用いて洗浄した。蛍光検出の場合は、凍結切片を
固定およびブロッキングし、ＰＣＬＰ抗体で上記のように保温した。続いて５％
ヤギ血清および２．５％ヒト血清中のＦＩＴＣ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ（Zymed,
South San Francisco, CA）；５％ヤギ血清、２．５％ヒト血清および２．５％
ラット血清中の１μｇ／ｍｌビオチン付加ＭＥＣＡ−７９；および５％ヤギ血清
、２．５％ヒト血清および２．５％ラット血清中のテキサスレッド共役ストレプ
トアビジン（Vector）とともに連続的に切片を保温した。各工程の後で切片をＰ
ＢＳで洗浄し、ベクタシールド（Vector) でマウントした。

【０１０２】 ４．ＰＮＡｄ単離 ヒトの扁桃の凍結外科標本は、米国立癌研究所が資金提供したヒト組織共同ネ
ットワーク、西部支部（Cooperative Human Tissue Network, Western Division
,Case Western University）から入手した。組織は２％トリトンＸ−１００、１
μｇ／ｍｌロイペプチン、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、１μＭペプスタチン、
１０μｇ／ｍｌペファブロックおよび５ｍＭＥＤＴＡを含むＰＢＳ中でガラス／
テフロンホモジナイザーで均質化させた。この溶解物を４℃で３０分揺り動かし
、続いて２００００×ｇで２０分４℃で遠心した。続いて溶解物をＰＢＳで２倍
希釈し、０．２μｍのフィルターに通した。この清澄溶解物を１ｍｌのセファロ
ース−４Ｂカラム（CNBr activated, Sigma）（カラムは２．４ｍｇのアフィニ ティー精製ＭＥＣＡ−７９と共役させたもの）を通した。カラムを０．１％トリ
トンＸ−１００、ＰＢＳ−ＴＸ含有ＰＢＳで洗浄し、続いて２５ｍＭｎ−オクチ
ルグルコシド含有ＰＢＳで洗浄した。続いて、ＰＮＡｄを２５ｍＭｎ−オクチル
グルコシド含有１００ｍＭトリエチルアミンで溶出させ、さらに１／１０容の３
Ｍトリス（ｐＨ６．８）で中性にした。この物質をセントリコン−３０微量濃縮
装置を用いて濃縮し、２５ｍＭｎ−オクチルグルコシド含有ＰＢＳで希釈し、再
び濃縮した。この精製蛋白質をＢＣＡアッセイ（Pierce, Rockford, IL）を用い
て定量し、先に記載された方法（Moller et al., Anal. Biochem., 209:169-175
(1993)）を基にＳＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続く銀強化アルシアンブルー染色によ
って純度を調べた。７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを２５％エタノール、１０％
酢酸で一晩固定した。続いて、それらを固定液中の０．１２５％アルシアンブル
ーで１時間染色し、さらに固定液で３０分の脱染色工程を３回実施した。続いて
ゲルを５％グルタルアルデヒド水で１時間保温し、続いて３０分４回の洗浄を１
０％エタノール、５％酢酸で実施した。その後ゲルを水で１０分づつ３回洗浄し
、さらに０．４％硝酸銀で３０分保温した。続いてゲルを簡単に水で洗い流し、
２．５％炭酸ナトリウム中の０．０１３％のホルムアルデヒドで反応させた。こ
の反応は１％の酢酸で停止させた。

【０１０３】 ５．免疫沈澱およびウェスタンブロッティング 蛋白Ａ−セファロースファストフロービーズ（Fast Flow Beads, Pharmacia,
Uppsala, Sweden)を２００μｌの３Ｄ３ハイブリドーマ培養上清または６μｇの
精製マウスＩｇＧ（Caltag, San Francisco, CA)とともに充填し、ＰＢＳ−ＴＸ
で洗浄した。約５０ｎｇのＰＮＡｄおよび０．１μｌのＮＧＳを含有する１００
μｌのＰＢＳ−ＴＸを続いてビーズに添加し、一晩４℃で揺り動かした。上清を
採集し、１００μｌのＰＢＳ−ＴＸで２回洗浄したビーズとともにプールした。
続いてこの未結合分画を４倍容積のアセトンで−２０℃で沈澱させて遠心で集め
、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液に溶解して煮沸した。ビーズをＰＢＳ−ＴＸ
で十分に洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中で煮沸して溶出させた。７
．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをホェファー（Hoeffer)ＴＥシリーズエレクトロブ
ロッター（Applied Biosysytems, Foster City, CA）に移し、１０ｍＭのＣＡＰ
Ｓ、１０％メタノール中で２２Ｖ、１６時間予備ブロットを実施した。このブロ
ットを続いて０．１％トゥイーン−２０、ＰＢＳＴ、および３％脱脂粉乳を含む
ＰＢＳで１時間ブロッキングした。続いて、ブロットをブロッキング溶液中の１
μｇ／ｍｌのＭＥＣＡ−７９または１／５０希釈の３Ｄ３上清のいずれか、ブロ
ッキング溶液中の１／１０００希釈ビオチン付加マウス抗ラットＩｇμ（Caltag
, South San Francisco. CA)または１／１０００希釈ビオチン付加ヤギ抗マウス
ＩｇＧ（Vector）、および最後にＰＢＳＴ中の１／２０００希釈セイヨウワサビ
ペルオキシダーゼ共役ストレプトアビジン（Caltag）と連続的に保温した。ブロ
ットを各保温の後ＰＢＳＴで洗浄し、ＥＣＬ基質（Amersham, Arlington Height
s, IL)を用いて反応を進展させた。３Ｄ３ｍＡｂによる検出の場合は、ＭＥＣＡ
−７９による検出の場合よりも５〜１０倍のＰＮＡｄを用いた。

【０１０４】 ６．ＰＣＬＰｍＲＮＡの検出 高内皮性細胞（ＨＥＣ）は、以前に記載された方法（Girard & Springer, Imm
unology Today(1995), 16:449-457)を改変したものを用いて、ＭＥＣＡ−７９に
よる免疫磁性選別でヒト扁桃の外科標本から精製した。扁桃のコラゲナーゼ消化
後、基質細胞を染色緩衝液（１％ＢＳＡおよび５ｍＭＥＤＴＡ含有ＰＢＳ）中に
２ｘ１０⁸細胞／ｍｌで再懸濁させ、１０⁷細胞につき０．３μｇのＭＥＣＡ− ７９とともに氷上で１５分維持した。細胞を遠心で採集し、染色緩衝液中で１回
洗浄し、さらに３０μｌのビオチン付加マウス抗ラットＩｇμ（Caltag）ととも
に１５分氷上で維持した。細胞を染色緩衝液で再び洗浄し、３００μｌのストレ
プトアビジン共役常磁性体ビーズ（Miltani, Auburn, CA)を添加し、氷上で１５
分維持した。製造元の推奨にしたがって、ＭＳ＋カラムおよび”ミニ−ＭＡＣＳ
”磁石（Miltani)を用いてＭＥＣＡ−７９陽性細胞を単離した。純度は顕微鏡に
よる形態学的基準、およびシアニン−３−共役ストレピトアビジン（Caltag）を
用いる免疫蛍光法によるＭＥＣＡ−７９の発現によって評価した。

【０１０５】 ヒト臍帯静脈内皮細胞、ＨＵＶＥＣはクロンティクス社（Clonetics, San Die
go, CA）から購入し、推奨にしたがって増殖させた。扁桃リンパ球はヒト扁桃の
外科標本を細切し、遊離リンパ球を目の細かいスクリーンを通して冷ＲＰＭＩ−
１６４０培養液を用いて洗い流した。

【０１０６】 全ＲＮＡはＨＥＣ、ＨＵＶＥＣおよびリンパ球からＲＮＡｚｏｌＢ（Tel-Test
, Friendswood, TX)を用いて単離した。第一鎖ｃＤＮＡは、ＡＭＶ逆転写酵素（
Gibco-BRL)を製造元の推奨にしたがって用い、ランダムヘキサマーのプライミン
グにより２μｇの全ＲＮＡから製造した。ｃＤＮＡの段階希釈をクレンタク（Kl
entaq)ポリメラーゼミックス（Clontech, Palo Alto, CA)および下記のプライマ
ーを用いて増幅させた： ＰＣＬＰの場合には、 ５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＣＡＧＡＴＧＣＣＡＧＣＣＡＧＣＴＣＴＡＣＧ−３’
および ５’−ＴＴＴＧＡＡＴＴＣＣＴＴＣＡＴＧＴＣＡＣＴＧＡＣＣＣＣＴＧＣ−３’
を用い、さらにヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）
の場合には、 ５’−ＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＡＣＡＴＣＡＡＡＧＣＡＣＴＧ−３’および ５’−ＴＣＣＡＡＣＡＣＴＴＣＧＴＧＧＧＧＴＣＣＴ−３’を用いた。得られた
増幅ＤＮＡの１／２を１％アガロースゲル上で電気泳動し、臭化エチジウム染色
で可視化した。

【０１０７】 ７．ＭＥＣＡ−７９反応性ＰＣＬＰの精製 洗剤溶解物はＰＮＡｄ単離について述べたように１０ｇのヒト扁桃から製造し
た。この材料を２ｍｌの蛋白Ａ共役セファロースカラムに２回通した。続いて、
２ｍｌの３Ｄ３腹水を結合させ、記載（Harlow & Lane, 1988)にしたがってジメ
チルパミリデート（Pierce, Rockford, IL）を共有結合させた、０．５ｍｌの蛋
白Ａカラムに、未結合材料を通した。ＰＢＳ−ＴＸで洗浄した後、結合物質を０
．１％トリトンＸ−１００を含む１００ｍＭトリエチルアミンで溶出させ、１／
１０容の３Ｍトリス（ｐＨ６．８）で中和させた。続いて、ＰＮＡｄ単離で述べ
たように、ＭＥＣＡ−７９共役セファロースでこのサンプルを精製した。得られ
た材料の１／６０をＳＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続くＭＥＣＡ−７９によるウェス
タンブロッティングによって分析した。

【０１０８】 ８．並列プレートフローチャンバー分析 精製ＰＣＬＰをトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）（ｐＨ８．５）で１：１０または
１：２０に希釈し、細菌学用ペトリ皿（Corning, San Mateo, CA）を４℃で一晩
被覆した。ブロッキングのために、このプレートを３％ＢＳＡで１時間室温で処
理した。 基質被覆スライドを並列プレートフローチャンバーの下方壁として取り入れ、倒
立位相差顕微鏡（Diaphot 200; Nikon Inc., Garden City, NY）のステージに載
せた。全てのフロー実験は室温で実施した。壁のずれ応力は以前に記載（Lawren
ce & Springer, Cell(1991), 65:859-873)されたように算定した。細胞は、０．
２％ＢＳＡを含む陽イオン非含有ＨＢＳＳに１ｘ１０⁷細胞／ｍｌの濃度で保存 し、フローチャンバーに灌流させる直前に０．２％ＢＳＡ含有ＨＢＳＳで１：１
０に希釈した。ジャーカット細胞をずれ応力０．８ダイン／ｃｍ²でチャンバー に注入し、Ｔリンパ球は１．２５ダイン／ｃｍ²で注入した。３分後、細胞繋留 率（視野当たり毎分繋留される細胞数）を２から４視野を分析して決定した。抑
制実験の場合、細胞（１０⁷／ｍｌ）を０．２％ＢＳＡを含む陽イオン非含有Ｈ ＢＳＳ中で１５０μｇ／ｍｌのＬＡＭ１−３（抗Ｌ−セレクチン）または１００
μｇ／ｍｌのフコイジン（Sigma)と２０分予備保温した。フローチャンバーに注
入する前に細胞懸濁液を０．２％ＢＳＡ含有ＨＢＳＳで１０倍希釈した。基質は
ＭＥＣＡ−７９（１：２０に希釈した腹水）または３Ｄ３（抗ＰＣＬＰ、１：２
０に希釈した腹水）とともに室温で１時間保温した。被覆ＰＣＬＰは、０．１Ｍ
の酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中のシアリダーゼ５０ｍＵ／ｍｌまたはコント
ロールとして０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）単独で処理した。Ｏ−シア
ログリコプロテアーゼは、０．２４ｍｇ／ｍｌの総蛋白濃度にＰＢＳ中で１０倍
希釈し、固定ＰＣＬＰを室温で１時間処理するために用いた。

【０１０９】 Ｂ．結果 １．高内皮性細胞はＰＣＬＰを発現する ヒトＰＣＬＰに対して特異的な３つの異なるモノクローナル抗体をヒトの二次
リンパ系器官の切片の免疫組織化学染色のために用いた。第一に、ヒト扁桃の凍
結切片をＰＣＬＰｍＡｂ（４Ｆ１０）およびＭＥＣＡ−７９で同時に染色して２
色免疫蛍光実験を実施した。ＰＣＬＰおよびＭＥＣＡ−７９エピトープの両方を
発現しているＨＥＶが観察された。ＰＣＬＰは、血管の内腔面の高内皮性細胞の
表面に濃縮されていた。同様な染色パターンが２つの他のＰＣＬＰｍＡｂ（３Ｄ
３および２Ａ４）で得られた。さらにまた、腎臓のポドカリキシンについて（Ke
rjaschki et al., J. Cell Biol.(1984), 98:1591-1596）、さらに多数の組織の
スロンボムチンについて（McMagny et al., J. Cell Biol. (1997), 138:1395-1
407)血管内皮の管腔面での局在が報告された。リンパ節および虫垂のパラフィン
包埋サンプルのＨＥＶもまたＰＣＬＰｍＡｂ（２Ａ４）で染色され、ＰＣＬＰ発
現は粘膜性および非粘膜性リンパ系器官の両方でＨＥＶに特徴的であることが示
された。

【０１１０】 ＰＣＬＰ発現はＨＥＶに限定されなかった。なぜならば、染色はこれらリンパ
系器官内の多種類の血管の内皮細胞に付随していたからである。ＰＣＬＰ染色は
また筋肉の動脈、細動脈および毛細血管にも見出された。これらの発見は、ポド
カリキシンおよびその同族体の非リンパ系組織の血管内皮上の発現を示す以前の
実験と一致する（例えば以下を参照されたい：Kershaw et al.上掲書；McMagny
et al.上掲書）。

【０１１１】 これらの実験から、扁桃の大半のＨＥＶはＰＣＬＰ発現が陽性であるが、一方
少数は発現が微弱か陰性であることがまた明白であった。この観察はまた２色免
疫蛍光実験でも認められた。この場合、いくつかのＭＥＣＡ−７９陽性血管はほ
とんどまたは全くＰＣＬＰを発現しなかった。対照的に、ＣＤ３４は、同じ扁桃
切片の実質的に全てのＨＥＶで検出された。これらのＰＣＬＰ陰性ＨＥＶは、し
かしながらリンパ節または虫垂では認められず、このことは、この不均一性は扁
桃に限られ、おそらく組織の炎症状態の結果であるとことを示唆している。

【０１１２】 続いてＲＴ−ＰＣＲを用い、精製した高内皮細胞（ＨＥＣ）内のＰＣＬＰｍＲ
ＮＡの存在を示した。ＭＥＣＡ−７９発現細胞をコラゲナーゼ消化扁桃基質から
免疫磁性選別によって精製した。この方法によって、形態学的およびＭＥＣＡ−
７９発現によって評価した場合、わずかな夾雑リンパ球を含む９５％以上の純粋
なＨＥＣが得られる。全ＲＮＡをＨＥＣ、扁桃リンパ球および初代培養内皮細胞
（ＨＵＶＥＣ）から抽出した。続いて逆転写ｃＤＮＡの段階希釈をＰＣＬＰまた
はヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）に特異的なプ
ライマーを用いて増幅させた。構造的に発現されるＨＰＲＴのｍＲＮＡのレベル
を各サンプルの全ｃＤＮＡ量の標準化に用いた。ＰＣＬＰｍＲＮＡは容易にＨＥ
ＣおよびＨＵＶＥＣｃＤＮＡの両方で検出されたが、リンパ球サンプルでは稀に
しか検出できなかった。このデータをＨＰＲＴ発現について標準化した場合、Ｐ
ＣＬＰｍＲＮＡレベルは、ＨＥＣの場合よりも約２倍ＨＵＶＥＣで高かった。重
要なことには、ＨＥＣにおけるＰＣＬＰ発現レベルはリンパ球サンプルの場合よ
り１６倍高く、ＨＥＣ調製物中で検出されるＰＣＬＰｍＲＮＡはリンパ球の夾雑
の結果ではないことを担保した。さらに、逆転写酵素をｃＤＮＡ反応から省略し
たとき、ＰＣＲ生成物は観察されず、全ての生成物は増幅ｃＤＮＡの結果であり
、夾雑ゲノムＤＮＡによるものではないことが確認された。

【０１１３】 ２．扁桃ＰＣＬＰはＭＥＣＡ−７９エピトープを提示し、Ｌ−セレクチンと結
合する ＨＥＶ由来ＰＣＬＰがＭＥＣＡ−７９エピトープをもち、したがってＬ−セレ
クチンのためのリガンドとなりえることを決定するために、ＰＣＬＰｍＡｂ（３
Ｄ３）およびＭＥＣＡ−７９を用いて、ＭＥＣＡ−７９精製扁桃溶解物（すなわ
ちＰＮＡｄ）についてウェスタンブロッティングを実施した（図４）。ＭＥＣＡ
−７９によってＭｒ２１０、１６０、１１５および６０の主要バンドが検出され
、以前の性状決定実験と一致した（Berg et al.(1991), J. Cell Biol. 114:343
-349）。３Ｄ３抗体はＰＮＡｄ中のＭｒ１６０成分を特異的に認識し、このバン
ドはＰＣＬＰを表していることを示唆した。

【０１１４】 ＰＮＡｄのＭｒ１６０成分がＰＣＬＰと同一であることは３Ｄ３抗体による免
疫沈澱によって確認された。ＰＮＡｄを３Ｄ３で免疫沈澱させたとき、Ｍｒ１６
０は未結合分画から特異的に失われ、結合分画にはこの成分のみが見出された。
この結果は、Ｍｒ１６０バンドはＰＣＬＰのＭＥＣＡ−７９反応形を表している
ことを示している。多くの実験で、３Ｄ３抗体は、再現性をもってＭｒ１６０バ
ンドを最大５０％枯渇させた。抗体量を増加させても沈澱は増強されず、このこ
とは、ＨＥＶ由来ＰＣＬＰの糖型（これは３Ｄ３抗体と反応しない）が存在する
ことを示唆している。この抗体は、大腸菌（E. coli)で生成された非糖化形ＰＣ
ＬＰに対して作製されたので、非反応性である天然の糖化分子が存在することは
驚くにあたらない。しかしながら、非反応性物質が同じ見かけの分子量をもつ異
なる糖蛋白質であることも形式的には可能である。

【０１１５】 ＨＥＶ由来ＰＣＬＰとＬ−セレクチンとの直接反応を示すために、ＰＮＡｄの
同じ調製物についてリコンビナントＬ−セレクチン／ＩｇＧキメラとの沈澱を実
施した。本質的にＰＣＬＰバンドの全ておよびＰＮＳｄの９０％以上がＬ−セレ
クチン／ＩｇＧキメラと沈澱し、一方、ＰＮＡｄおよびコントロールＣＤ４／Ｉ
ｇＧキメラ間では反応は認められなかった。さらに、結合物質はＥＤＴＡの添加
によって溶出して、ＰＣＬＰおよびＣＤ３４は２つの未特定ＰＮＡｄ成分（Ｍｒ
２００および６５）と同様にＬ−セレクチンとカルシウム依存態様で結合するこ
とを示した（これは、セレクチン−炭水化物相互反応の特徴である（Rosen & Be
rtozzi, Current Biology(1994), 6:663-673）。

【０１１６】 ３．ＨＥＶ由来ＰＣＬＰはシアロムチンである シアロムチンのペプチド骨格を特異的に加水分解するＯ−シアロ糖蛋白質エン
ドペプチダーゼ（ＯＳＧＥ）、金属プロテアーゼでＰＮＡｄを消化した（A. Mel
lors & Lo. Methods in Enzymology(1995), 248:728-740)。ＰＮＡｄをＯＳＥＧ
で処理したとき、Ｍｒ１６０ＰＣＬＰバンドを含む、ＭＥＣＡ−７９で検出され
る実質的に全ての物質が排除された。興味深いことには、低分子量の切断生成物
は全く検出されず、生じた切断生成物は非常に小さいか、または完全なペプチド
骨格がＭＥＣＡ−７９エピトープの提示に必須であるかのいずれかを示唆してい
る。

【０１１７】 ＨＥＶ由来ＰＣＬＰのシアリル化を直接示すために、ＰＮＡｄをシアリダーゼ
で消化し続いて３Ｄ３抗体でウェスタンブロッティングを実施した。この処置に
よってＰＣＬＰの電気泳動の移動度が明瞭に増加し、シアル酸の存在が明示され
た。糸球体ＰＣＬＰを含む多くの糖蛋白質からシアル酸を除去することによって
、荷電の損失による移動度の減少がもたらされるが、ＰＣＬＰの反応態様はＨＥ
Ｖ由来ＧｌｙＣＡＭ−１およびＣＤ３４並びにＰＮＡｄ成分の反応態様と同様で
あった（データは示されていない）。上記から、ＭＥＣＡ−７９がスルフェート
依存エピトープと結合することが示されたので、全てのＰＮＡｄ成分は硫酸化さ
れていると結論することができる。したがって、シアリダーゼ処理後のＰＣＬＰ
の異常な電気泳動の態様は、シアル酸の損失後に糖蛋白質の陰性荷電を維持する
スルフェートの存在に帰することができる。ＯＳＧＥおよびシアリダーゼの両方
に対するＰＣＬＰの感受性から、ＣＤ３４およびＨＥＶの他の全ての既知のＬ−
セレクチンリガンドと同様、ＨＥＶ由来形の構造がシアロムチン様であることが
示唆される。

【０１１８】 ＰＮＡｄの３Ｄ３抗体によるウェスタンブロッティングは、主要Ｍｒ１６０バ
ンドの他にしばしば高分子量バンド（＞Ｍｒ２００）を提示した。このバンドは
ＰＣＬＰのＳＤＳ耐性のマルチマー形（以前に文献（Dekan et al., 1991）に記
載された）と考えられた。このバンドの分子量は、ＰＮＡｄの主要なＭｒ２１０
成分と一致しなかった。しかしながら、この仮定的マルチマーと類似の分子量を
もつ薄いバンドが時にＰＮＡｄに観察され、おそらくは同じ種を示している。

【０１１９】 ４．ＰＣＬＰは流動下でＬ−セレクチン依存接着を仲介する ＭＥＣＡ−７９反応性ＰＣＬＰを、３Ｄ３共役セファロース続いてＭＥＣＡ−
７９共役セファロースで連続処理して扁桃溶解物から精製した。精製物質のＭＥ
ＣＡ−７９によるウェスタンブロッティングにより、予想されたようにＭｒ１６
０のバンドが示された。この物質を並列プレートラミナーフローチャンバーの一
方の面に被覆し、末梢血Ｔリンパ球またはジャーカットＴリンパ腫細胞のどちら
かを生理学的な流速でチャンバーに注入した。このような条件下では、両細胞タ
イプは一過性にＰＣＬＰ被覆面に接着したが、ウシ血清アルブミンで被覆した面
には接着しなかった。０．８ダイン／ｃｍ²では、ＰＣＬＰ上のジャーカット細 胞のローリング速度は５０．１＋／−１４．１μｍ／秒で、これはこれらの細胞
が未分画ＰＮＡｄ上をローリングする速度に匹敵した（データは示されていない
）。この接着はＬ−セレクチンに依存していた。なぜならば、ジャーカット細胞
をＬ−セレクチンｍＡｂまたはＬ−セレクチン拮抗剤フコイジンのどちらかと予
備処理することによって接着が完全に抑制されたからである。さらにまた、被覆
ＰＣＬＰをＯ−シアロ糖蛋白質エンドペプチダーゼまたはアースロバクター・ウ
レファシエンスシアリダーゼのどちらかで処理したとき、ジャーカット細胞との
相互反応は停止し、これによって、ＰＣＬＰのシアロムチン様構造とＬ−セレク
チン結合にシアル酸が必須であることが示された。最後に、被覆した基質をＭＥ
ＣＡ−７９で処理することによって、ジャーカット細胞との全ての相互反応が停
止し、リンパ球Ｌ−セレクチンは固定ＰＣＬＰと結合し、ＭＥＣＡ−７９非反応
性夾雑物質と結合しないことが確認された。対照的に、固定ＰＣＬＰと３Ｄ３抗
体との処理はリンパ球の接着に影響を与えなかった。この抗体は蛋白質の決定基
を認識するので、この結果は驚くにあたらない。これらの結果から、固定したＭ
ＥＣＡ−７９反応性ＰＣＬＰは、生理学的流動条件下でリンパ球のＬ−セレクチ
ン依存繋留およびローリングを仲介することがわかる。

【０１２０】 ＩＩ．ＰＣＬＰ−２ Ａ．ＰＣＬＰ−２の特定とクローニング ＣＤ３４とＰＣＬＰの細胞質テールのアラインメントによって顕著な配列相同
性が明らかになった。ＰＣＬＰの細胞質テールを用いてＮＣＢＩジーンバンクの
ＥＳＴデータベースを探索し、我々はいくつかのマウスＥＳＴ（これらは同じ遺
伝子を示し、ＰＣＬＰおよびＣＤ３４と顕著な相同性を共有する）を特定するこ
とができた。そのようなＥＳＴクローンの１つを入手しその同一性を証明するた
めに配列を決定した。プローブとしてこのクローンを用いて種々のマウス組織由
来のｍＲＮＡでノザンブロットを実施し、転写物のサイズおよびその発現パター
ンを決定した。ただ１つの２．５ｋｂの転写物が検出されたが、これは脳内で豊
富に発現され、心臓、精巣、腎臓、および肝臓では少なかった。完全な長さのヒ
トｃＤＮＡクローンをクローニングするために、ＰＣＲプライマーをこのマウス
の配列を基に作製し、マウスｃＤＮＡおよびヒトｃＤＮＡの両方から固有の精製
物を増幅させた。これらのプライマーを利用するＰＣＲアッセイを用いてヒトの
脳のライブラリーをスクリーニングした（脳のライブラリーは、各々が５０００
プラスミドクローンを含む９６のマスタープールとして得られた）。各々が１０
０大腸菌クローンを含むサブプールをいくつかの陽性マスタープールから入手し
た。陽性サブプールをＬＢプレートに分散させ、個々のコロニーをスクリーニン
グして単一陽性クローンを得た。

【０１２１】 この手法によって２つの別個のクローンが得られ、長い方は２．３ｋｂであっ
た（図１参照）。このｃＤＮＡ（配列番号：１）は６０５のアミノ酸（配列番号
：２）をもつ蛋白質を予想し、これは約１７０アミノ酸Ｎ−末端ドメインを含み
、これは３０％の酸性残基の他に硫酸化されていると思われる２つのチロシンか
ら成る。この酸性ドメインには１４０アミノ酸の長さのムチン様ドメイン（３５
％セリン、スレオニンおよびプロリン）、システイン含有ドメイン、予想膜貫通
セグメント、および８０アミノ酸の長さの細胞質テールが続く。他の予想される
特色には、５つの潜在的グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合部位（１つはＮ−
末端酸性ドメイン中）、および３つの潜在的Ｎ−連結糖化部位が含まれる。ヒト
ＩｇＧ１のＦｃドメインと融合させたこのｃＤＮＡの塩基１−６３０（アミノ末
端酸性ドメインを表す）の、ＣＯＳ−７細胞での発現によって、約７０ｋＤの主
要な蛋白質バンドが生成された。これを蛋白Ａ−セファロースで精製し、アミノ
末端の配列分析を実施した。グリシン３３が天然の蛋白質のアミノ末端として特
定され、先行するアミノ酸は切断可能なシグナルペプチドを表していることが示
唆された。

【０１２２】 Ｂ．ＰＣＬＰ−２に対する抗体の製造 ＰＣＬＰ−２の２つのドメインを６−Ｈｉｓ融合蛋白質として大腸菌で発現さ
せ、精製してウサギの免疫に使用した。免疫原として膜基部のシステイン含有ド
メインおよび細胞質テールを選択した。両抗血清はＥＬＩＳＡおよびウェスタン
ブロットによって免疫抗原と反応する。特異性を改善するために、両血清の抗体
を抗原共役セファロースで精製した。

【０１２３】 Ｃ．ヒトＰＣＬＰ−２の発現パターン プローブとしてヒトＰＣＬＰ−２クローンを用いてノザンブロットを実施し、
ヒトの組織でのこの遺伝子の発現パターンを決定した。マウスで分かるように、
脳では２．５ｋｂの転写物が主に検出され、膵臓、腎臓、筋肉、成人および胎児
肝臓、骨髄、末梢血白血球、胸腺、リンパ節および脾臓での発現は少なかった。
これを示すために、ＣＤ３４およびＰＣＬＰと同様に、ＰＣＬＰ−２を内皮細胞
で発現させ、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、培養ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）
に由来するｃＤＮＡでＰＣＬＰ−２ｍＲＮＡを検出した。ＰＣＬＰ−２ｍＲＮＡ
はまた、ＭＥＣＡ−７９抗体を用いた免疫磁性選別によってヒト扁桃から精製し
たＨＥＣでも検出された。ＰＣＬＰ−２の内皮性発現は、ヒトの扁桃の凍結切片
を抗ＰＣＬＰ−２抗体で上記のように染色して確認した。染色はＨＥＶを含む血
管内皮でのみ認められた。

【０１２４】 Ｄ．ＰＣＬＰ−２の生化学的性状 完全な長さのＰＣＬＰ−２ｃＤＮＡをＣＯＳ−７細胞で発現させて³⁵ＳＯ₄で 代謝によって標識し、細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ＰＣＬＰ−２
のトランスフェクションによって２００ｋＤの硫酸化蛋白質が生成されたが、Ｃ
Ｄ３４では得られなかった。この２００ｋＤのバンドは特異抗体による免疫沈澱
でＰＣＬＰ−２であることが示された。ＰＣＬＰ−２ペプチドの予想分子量は６
５ｋＤであるので、天然の分子は炭水化物によって広範囲に改変されていると考
えられた。³⁵ＳＯ₄の強い取り込み（ＣＤ３４よりはるかに多い）から、硫酸化 ＧＡＧ鎖の存在および／または２つの細胞外チロシンの硫酸化が考えられる。

【０１２５】 生化学的性状検査用により多くの材料を産生させるために、可溶性で分泌され
る蛋白質を製造する目的でＰＣＬＰ−２の細胞外ドメインをヒトＩｇＧ１のＦｃ
ドメインに融合させた（ＰＣＬＰ−２／ＩｇＧ）。同時に、ＰＣＬＰ−２のＮ−
末端酸性ドメインのみを含むＩｇＧ融合蛋白質を製造した（Ｎ−末端／ＩｇＧ）
。これらのＰＣＬＰ−２構築物の発現および³⁵ＳＯ₄標識は、抗ヒトＩｇＧ−ア ガロースによる沈澱で精製できる分泌性の硫酸化分子を生じた（ＩｇＧＦｃドメ
イン単独の発現では当該分子は得られなかった）。両ＰＣＬＰ−２構築物のコン
ドロイチン硫酸は、これら融合蛋白質をＧＡＧ分解酵素で消化して示した。ヘパ
リナーゼの混合物は効果がなかったが、コンドロイチナーゼＡＢＣは両ＰＣＬＰ
−２融合蛋白質から大半のスルフェートを除去した。特に低分子量種は両方の事
例でコンドロイチナーゼの影響を受けなかった。この種は、炭水化物またはチロ
シンのどちらかについておそらく別のスルフェート改変を含んでいるのであろう
。ＰＣＬＰ−２のムチン様特色を明らかに示すために、融合蛋白質をＯ−シアロ
糖蛋白質エンドペプチダーゼ（ＯＳＧＥ）で消化した。完全な長さの融合蛋白質
（これはムチン様ドメインを含んでいる）のみがＯＳＧＥで分解され、このドメ
インのムチン様特色を明らかにした。

【０１２６】 Ｅ．ＰＣＬＰ−２はケモカインと結合する 多くのケモカインは塩基性ヘパリン結合ドメインを含むことが知られている。
ＰＣＬＰ−２のＮ−末端の酸性の性質のために、ケモカインはこの蛋白質と結合
することができるか否かを調べた。これによって、内皮表面でのケモカイン固定
の新規なメカニズムの可能性が明らかにされるであろう。ＰＣＬＰ−２／ＩｇＧ
融合蛋白質を固定し、ＦＬＡＧ付加ＳＬＣの結合をビオチン付加抗ＦＬＡＧ抗体
で検出することができるＥＬＩＳＡアッセイを開発した。このアッセイを用いる
ことにより、ＳＬＣ／ＦＬＡＧはＰＣＬＰ−２／ＩｇＧと結合するが、ＣＤ３４
／ＩｇＧとは結合しないことが示された。ＣＤ３４およびＰＣＬＰ−２は、ＰＣ
ＬＰ−２の酸性Ｎ−末端を除いて実質的に類似しているので、我々はＳＬＣがこ
の固有のドメインに結合したと考えた。これを明らかにするために、Ｎ−末端／
ＩｇＧ融合蛋白質を固定し、完全な長さの蛋白質のように同様なレベルでＳＬＣ
の結合を支持することを示した。結合特異性は、ヘパリンまたはＳＬＣ／ＦＬＡ
Ｇのどちらかを用いた阻害によって示した。他のケモカインがＰＣＬＰ−２と結
合することができるか否かを決定するために、Ｎ−末端／ＩｇＧのＳＬＣ／ＦＬ
ＡＧへの結合をケモカインが阻害する能力について非標識ケモカインをテストす
るアッセイを実施した。これまでテストした小さなパネルのうちで、ＭＩＰ３α
は効果的にＰＣＬＰ−２へのＳＬＣ／ＦＬＡＧ結合を阻害することができたが、
ＳＤＦ−１αおよびＥＬＣはできなかった。これらの結果は、全部ではないにし
てもいくつかのケモカインはＰＣＬＰ−２のアミノ末端ドメインに結合すること
ができることを示している。

【０１２７】 上記の結果および考察から、ＰＣＬＰおよびＰＣＬＰ−２は糖蛋白質のＰＮＡ
ｄ類に属する糖蛋白質であることが明らかである。さらにまた、セレクチン結合
事象および／または白血球遊走を抑制する新規な方法が提供されることが明らか
である。したがって、本発明は、細胞輸送を惹起させるメカニズムを解明するた
めの新たな手段を提供する。さらに、本発明は、セレクチン結合事象および／ま
たは白血球遊走に起因する症状（例えば急性および慢性炎症など）を治療する新
規な手段を提供する。

【０１２８】 本明細書で引用される全ての文献および特許出願は、個々の文献また は特許出願がそれぞれ個別に参照により本明細書に含まれると同様に、参照によ
り本明細書に含まれる。いずれの文献の引用も出願日前に内容を開示せんとする
ためであり、先の発明のために本発明がそのような出願に先行する権利をもたな
いことを容認するものと解してはならない。 理解を深めるために説明と実施例によって前述の発明を詳細に述べてきたが、
本発明の教示を土台にしていくつかの変更および改変が、添付の請求の範囲を逸
脱することなく為しえることは当業者には明白であろう。

【０１２９】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ヒトのＰＣＬＰ−２のアミノ酸配列（配列番号：２）および核酸配列 （配列番号：１）を提供する。

【図２】 ＰＣＬＰおよびＣＤ３４の細胞質テールのアラインメントを提供する。 ５０％以上相同な領域が枠で囲まれている。潜在的な蛋白質キナーゼ（Ｓ／Ｔ−
Ｘ−Ｒ／Ｋ）およびカゼインキナーゼＩＩ燐酸化（Ｓ／Ｔ−ＸＸ−Ｄ／Ｅ）部位
は丸で囲まれている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 16/18 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 サセッティ、クリストファー、エム． アメリカ合衆国 94804 カリフォルニア 州 リッチモンド バーリンゲイム アベ ニュー 5615 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA15 BA80 CA04 CA07 CA12 DA01 DA02 DA05 DA11 4B064 AG01 AG27 CA01 CA02 CA10 CA19 CA20 CC01 CC24 CE12 DA01 DA13 4C084 AA06 BA34 CA53 CA56 CA59 DA31 NA14 ZA541 ZA891 ZB111 ZC781 4C085 AA13 AA14 BB12 CC04 CC13 DD22 DD32 DD62 EE06 FF24 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA76 EA20 EA54 FA72 FA74 GA26

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 セレクチン結合活性を有するポドカリキシン様蛋白質。
2. 【請求項２】 前記蛋白質がＰＣＬＰである請求項１に記載のポドカリキシ
   ン様蛋白質。
3. 【請求項３】 前記蛋白質がＰＣＬＰ−２である請求項２に記載のポドカリ
   キシン様蛋白質。
4. 【請求項４】 その天然の環境下以外で存在する、ＰＣＬＰ−２ポリペプチ
   ドをコードするポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】 前記ポリヌクレオチドが配列番号：１と実質的に類似また は同一配列を有する請求項４に記載のポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 請求項１に記載のポリヌクレオチドの断片。
7. 【請求項７】 配列番号：２の配列と実質的に類似または同一のアミノ酸 配列を有するＰＣＬＰ−２ポリペプチド。
8. 【請求項８】 請求項７に記載のポリペプチドの断片。
9. 【請求項９】 発現ホストで機能する転写開始領域、前記転写開始領域の転
   写調節下にある請求項４に記載の核酸で見出されるヌクレオチド配列を有するポ
   リヌクレオチド、および前記発現ホストで機能する転写終了領域を含む発現カセ
   ット。
10. 【請求項１０】 請求項９に記載の発現カセットをホスト細胞に導入した結
    果として、染色体外成分の部分としてまたはホスト細胞のゲノムに組み込まれた
    状態で前記発現カセットを含む細胞またはその子孫。
11. 【請求項１１】 ＰＣＬＰ−２ポリペプチドが発現されている請求項１０に
    記載の細胞を増殖させ、前記ポリペプチドを他の蛋白質を実質的に含まない状態
    で単離することを含むＰＣＬＰ−２ポリペプチドを製造する方法。
12. 【請求項１２】 特異的にＰＣＬＰ−２に結合するモノクローナル抗体。
13. 【請求項１３】 セレクチンおよび／またはポドカリキシン様蛋白質を、セ
    レクチンとポドカリキシン様蛋白質との間の結合事象を阻害する薬剤と接触させ
    ることを含む、セレクチンとポドカリキシン様蛋白質との間の結合事象を阻害す
    る方法。
14. 【請求項１４】 ＰＣＬＰ−２を、ＰＣＬＰ−２のケモカイン提示活性を調
    節する薬剤と接触させることを含む、ケモカインによって誘発される白血球補充
    を調節する方法。