JP2003299491A - 組換え原生生物の形質転換および選択方法およびマーカー - Google Patents
組換え原生生物の形質転換および選択方法およびマーカーInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 組換え原生生物の形質転換および選択方法お
よびマーカーを提供すること。 【解決手段】 遺伝子的に修飾された（組換えされた）
原生生物を陰性マーカーを使用しないで作成する方法
は、該原生生物の栄養要求性突然変異体を作成し、該変
異体を、対応する栄養要求性の相補のための遺伝子を少
なくとも１個含む組換えＤＮＡで形質転換した後、得ら
れた組換え原生生物を対応する相補原生生物だけを生育
することができる最少培地で培養し選択することから構
成されている。この方法は、生産されるタンパク質の遺
伝子にマーカー遺伝子が結合して改変された原生生物に
よって、タンパク質を効率的に産生することができる。
よびマーカーを提供すること。 【解決手段】 遺伝子的に修飾された（組換えされた）
原生生物を陰性マーカーを使用しないで作成する方法
は、該原生生物の栄養要求性突然変異体を作成し、該変
異体を、対応する栄養要求性の相補のための遺伝子を少
なくとも１個含む組換えＤＮＡで形質転換した後、得ら
れた組換え原生生物を対応する相補原生生物だけを生育
することができる最少培地で培養し選択することから構
成されている。この方法は、生産されるタンパク質の遺
伝子にマーカー遺伝子が結合して改変された原生生物に
よって、タンパク質を効率的に産生することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は、陰性選択マーカ
ーを使用しないで遺伝子的に改変された（組換え）原生
生物と、かかる改変原生生物によるタンパク質を効率よ
く作成する作成方法に関するものである。
ーを使用しないで遺伝子的に改変された（組換え）原生
生物と、かかる改変原生生物によるタンパク質を効率よ
く作成する作成方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】異種タンパク質発現による組換え（リコ
ンビナント）タンパク質の生産は、天然資源からタンパ
ク質を回収する選択肢の１つである。例えば、医薬品と
して有用なタンパク質の天然資源は、しばしば非常に限
定されていて、精製するのに非常に費用が掛かったり、
または単に入手できない場合もある。また、かかる天然
資源は、毒性があったりまたは特に感染性を有する物質
が混入しているために、非常に問題がある場合もしばし
ばありうる。他方、現在では、バイオテクノロジーや遺
伝子工学は、異種発現によって、一連のタンパク質を満
足できる量を経済的にかつ安全に生産して、広範囲に適
用することができるようになっている。かかるタンパク
質としては、例えば、抗体（診断用、受動免疫用、研究
用など）、ホルモン（治療用途のインスリン、エリスロ
ポエチン（EPO）、インターロイキン類など）、酵素
（例えば、食品技術、診断、研究用など）、血液因子
（血友病処置用など）、ワクチンなどが挙げられる（Gl
ick & Pasternak 1998, Molecular Biotechnology, ASM
Press, Washing DC, Chapter 10: 227-252）（非特許
文献１）。
ンビナント）タンパク質の生産は、天然資源からタンパ
ク質を回収する選択肢の１つである。例えば、医薬品と
して有用なタンパク質の天然資源は、しばしば非常に限
定されていて、精製するのに非常に費用が掛かったり、
または単に入手できない場合もある。また、かかる天然
資源は、毒性があったりまたは特に感染性を有する物質
が混入しているために、非常に問題がある場合もしばし
ばありうる。他方、現在では、バイオテクノロジーや遺
伝子工学は、異種発現によって、一連のタンパク質を満
足できる量を経済的にかつ安全に生産して、広範囲に適
用することができるようになっている。かかるタンパク
質としては、例えば、抗体（診断用、受動免疫用、研究
用など）、ホルモン（治療用途のインスリン、エリスロ
ポエチン（EPO）、インターロイキン類など）、酵素
（例えば、食品技術、診断、研究用など）、血液因子
（血友病処置用など）、ワクチンなどが挙げられる（Gl
ick & Pasternak 1998, Molecular Biotechnology, ASM
Press, Washing DC, Chapter 10: 227-252）（非特許
文献１）。
【０００３】医薬処方用タンパク質、特にヒトタンパク
質は、生化学的、生物物理的ならびに機能的性質が天然
タンパク質と同一でなければならない。次に、異種遺伝
子発現によるかかるタンパク質の組換え産生中において
は、細菌とは対照的に、真核細胞中においては、例え
ば、ジスルフィド架橋形成、前駆タンパク質のタンパク
質分解的切断、リン酸化、アセチル化、アシル化、硫酸
化、カルボン酸化、ミリスチル化、パルミチル化、特に
グリコシル化などのアミノ酸残基修飾などの一連の翻訳
後タンパク質修飾が発生することを留意する必要があ
る。加えて、真核細胞中のタンパク質は、しばしば、シ
ャペロン（chaperones）が関与する複雑な機構によって
正確な三次元的構造に導かれる。
質は、生化学的、生物物理的ならびに機能的性質が天然
タンパク質と同一でなければならない。次に、異種遺伝
子発現によるかかるタンパク質の組換え産生中において
は、細菌とは対照的に、真核細胞中においては、例え
ば、ジスルフィド架橋形成、前駆タンパク質のタンパク
質分解的切断、リン酸化、アセチル化、アシル化、硫酸
化、カルボン酸化、ミリスチル化、パルミチル化、特に
グリコシル化などのアミノ酸残基修飾などの一連の翻訳
後タンパク質修飾が発生することを留意する必要があ
る。加えて、真核細胞中のタンパク質は、しばしば、シ
ャペロン（chaperones）が関与する複雑な機構によって
正確な三次元的構造に導かれる。
【０００４】これらの修飾は、タンパク質の特定の構造
的かつ機能的性質に関して、例えば、タンパク質の酵素
活性、特異性（レセプター結合、細胞認識など）、折れ
曲がり、溶解性などに関して非常に重要な役割を果たし
ている（Ashford & Platt 1998, in: Post-translation
al Processing - A Practical Approach Ed. Higgins&
Hames, Oxford University Press, Chapter 4: 135-17
4； Glick & Pasternak 1998, Molecular Biotechnolog
y, ASM Press, Washington DC, Chapter 7: 145-169）
（非特許文献２）。タンパク質がその天然構造から逸脱
した改変を受けると、そのタンパク質は不活性化した
り、高いアレルギーポテンシャルを持ったりする。
的かつ機能的性質に関して、例えば、タンパク質の酵素
活性、特異性（レセプター結合、細胞認識など）、折れ
曲がり、溶解性などに関して非常に重要な役割を果たし
ている（Ashford & Platt 1998, in: Post-translation
al Processing - A Practical Approach Ed. Higgins&
Hames, Oxford University Press, Chapter 4: 135-17
4； Glick & Pasternak 1998, Molecular Biotechnolog
y, ASM Press, Washington DC, Chapter 7: 145-169）
（非特許文献２）。タンパク質がその天然構造から逸脱
した改変を受けると、そのタンパク質は不活性化した
り、高いアレルギーポテンシャルを持ったりする。
【０００５】一連の細菌ならびに真核発現システムは組
換えタンパク質の生産のためには確立しているけれど
も、（特に真核タンパク質において）起こりうるタンパ
ク質修飾の全ての領域をカバーし、それで普遍的に使用
することができるユニバーサルシステムは存在していな
い(Castillo 1995, Bioprocess Technology 21: 13-4
5； Geise et al. 1996, Prot. Expr. Purif. 8: 271-2
82; Verma et al. 1998 J. Immunological Methods 21
6: 165-181; Glick & Pasternak 1998, MolecularBiote
chnology ASM Press, Washing DC, Chapter 7: 145-16
9)（非特許文献３)。しかしながら、また、いくつかの
繁用されているシステムが、通常ではない、時には望ま
しくない翻訳後タンパク質修飾を起こすことは極めて問
題である。酵母からの組換え発現タンパク質は、時に
は、マンノース残基によって非常に強力に修飾される。
酵母からのこれらのいわゆる「高マンノース」構造は、
約８個ないし５０個のマンノース残基から構成されてい
るので、最大で５個ないし９個のマンノース残基を有す
る哺乳動物細胞からのマンノースに富む（リッチ）グリ
コプロテイン構造とは著しく異なっている（Moreman et
al. 1994, Glycobiology4(2): 113-125）（非特許文献
４）。これらの酵母に典型的なマンノース構造は強いア
レルゲンであるので、これらを治療用途のための組換え
グリコプロテインの製造に使用することは非常に問題で
ある（Tuite et al. 1999, in Protein Expression - A
Practical Approach, Ed. Higgins & Hames, Oxford U
niversityPress, Chapter 3: especially page 76）
（非特許文献５）。また、酵母には、ハイブリッドもし
くは複雑なグリコプロテイン構造が形成されないので、
発現システムとしての使用を更に束縛されている。
換えタンパク質の生産のためには確立しているけれど
も、（特に真核タンパク質において）起こりうるタンパ
ク質修飾の全ての領域をカバーし、それで普遍的に使用
することができるユニバーサルシステムは存在していな
い(Castillo 1995, Bioprocess Technology 21: 13-4
5； Geise et al. 1996, Prot. Expr. Purif. 8: 271-2
82; Verma et al. 1998 J. Immunological Methods 21
6: 165-181; Glick & Pasternak 1998, MolecularBiote
chnology ASM Press, Washing DC, Chapter 7: 145-16
9)（非特許文献３)。しかしながら、また、いくつかの
繁用されているシステムが、通常ではない、時には望ま
しくない翻訳後タンパク質修飾を起こすことは極めて問
題である。酵母からの組換え発現タンパク質は、時に
は、マンノース残基によって非常に強力に修飾される。
酵母からのこれらのいわゆる「高マンノース」構造は、
約８個ないし５０個のマンノース残基から構成されてい
るので、最大で５個ないし９個のマンノース残基を有す
る哺乳動物細胞からのマンノースに富む（リッチ）グリ
コプロテイン構造とは著しく異なっている（Moreman et
al. 1994, Glycobiology4(2): 113-125）（非特許文献
４）。これらの酵母に典型的なマンノース構造は強いア
レルゲンであるので、これらを治療用途のための組換え
グリコプロテインの製造に使用することは非常に問題で
ある（Tuite et al. 1999, in Protein Expression - A
Practical Approach, Ed. Higgins & Hames, Oxford U
niversityPress, Chapter 3: especially page 76）
（非特許文献５）。また、酵母には、ハイブリッドもし
くは複雑なグリコプロテイン構造が形成されないので、
発現システムとしての使用を更に束縛されている。
【０００６】最近、植物が組換えタンパク質の産生シス
テムとして論議されることが増えてきていて、その産生
システムに使用されているが、哺乳動物に典型的なシア
ル酸に代わって、グリコプロテイン構造にキシロースを
有している（Ashford & Platt)（非特許文献２）。ま
た、植物中に検出されるキシロースおよびα−１，３結
合フコースは、アレルギーの危険性を示しているので問
題でもある（Jenkins etal. 1996, Nature Biotech. 1
4: 975-981）（非特許文献６）。
テムとして論議されることが増えてきていて、その産生
システムに使用されているが、哺乳動物に典型的なシア
ル酸に代わって、グリコプロテイン構造にキシロースを
有している（Ashford & Platt)（非特許文献２）。ま
た、植物中に検出されるキシロースおよびα−１，３結
合フコースは、アレルギーの危険性を示しているので問
題でもある（Jenkins etal. 1996, Nature Biotech. 1
4: 975-981）（非特許文献６）。
【０００７】したがって、主に、哺乳動物培養細胞によ
る組換えタンパク質の非常に低価でかつ必要とされてい
る作成方法の代替法として、新規な真核発現システムに
対する大きな要請がある。かかるシステムは下記の要求
を充足しているのが理想的である。 （１）選択マーカーおよび調節的ＤＮＡ要素（例えば、
転写ならびに翻訳シグナルなど）が入手できること。 （２）発現システムは、できるだけ重要な真核翻訳後タ
ンパク質修飾を有するべきであるが、ヒトに対するアレ
ルゲンを産生しないこと。 （３）組換えタンパク質の生産は、例えば、単純な培地
を用いた製造スケール（数千リットルにもなりうる）で
の細胞または生物の発酵ならびに生産物の単純な後処理
などによって処理できるような、できるだけ簡単でかつ
経済的であること。
る組換えタンパク質の非常に低価でかつ必要とされてい
る作成方法の代替法として、新規な真核発現システムに
対する大きな要請がある。かかるシステムは下記の要求
を充足しているのが理想的である。 （１）選択マーカーおよび調節的ＤＮＡ要素（例えば、
転写ならびに翻訳シグナルなど）が入手できること。 （２）発現システムは、できるだけ重要な真核翻訳後タ
ンパク質修飾を有するべきであるが、ヒトに対するアレ
ルゲンを産生しないこと。 （３）組換えタンパク質の生産は、例えば、単純な培地
を用いた製造スケール（数千リットルにもなりうる）で
の細胞または生物の発酵ならびに生産物の単純な後処理
などによって処理できるような、できるだけ簡単でかつ
経済的であること。
【０００８】原生生物もしくは原生動物（定義について
は、Henderson's Dictionary of Biological Terms, 10
th Edition 1989, Eleanor Lawrence, Longman Scienti
fic& Technical, England or Margulis et al. (Editor
s) 1990. Handbook of Protoctista, Jones & Bartlet
t, Boston; van den Hoek et al. 1995, Algae - AnInt
roduction to Phycology, Cambridge University Press
（非特許文献７）参照）は、酵母、哺乳動物もしくは昆
虫の培養細胞のようなすでに確立した真核発現システム
に対する発現システムとして興味ある代替法となるかも
しれない。これらの生物は、真核細胞の典型的な区分お
よび分化を有している。そのいくつかは、高等真核生物
に比較的密接に関連しているが、他方、酵母または細菌
とさえ培養と生育において同様であり、大規模に単純な
媒体で高細胞密度で比較的簡単に培養することができ
る。
は、Henderson's Dictionary of Biological Terms, 10
th Edition 1989, Eleanor Lawrence, Longman Scienti
fic& Technical, England or Margulis et al. (Editor
s) 1990. Handbook of Protoctista, Jones & Bartlet
t, Boston; van den Hoek et al. 1995, Algae - AnInt
roduction to Phycology, Cambridge University Press
（非特許文献７）参照）は、酵母、哺乳動物もしくは昆
虫の培養細胞のようなすでに確立した真核発現システム
に対する発現システムとして興味ある代替法となるかも
しれない。これらの生物は、真核細胞の典型的な区分お
よび分化を有している。そのいくつかは、高等真核生物
に比較的密接に関連しているが、他方、酵母または細菌
とさえ培養と生育において同様であり、大規模に単純な
媒体で高細胞密度で比較的簡単に培養することができ
る。
【０００９】異種タンパク質を発現するための興味ある
原生生物の１つは、繊毛生物テトラヒメナ（Tetrahymen
a）、特にテトラヒメナ・テルモフィラ（Tetrahymena t
hermophila）である。テトラヒメナは、高等真核生物に
比較的密接に関連していて、それらに典型的な細胞分化
を有している、非病原性で単細胞の真核微生物である。
テトラヒメナ中での翻訳後タンパク質修飾は、酵母や、
その他の真核発現システムに検出されるものよりも、哺
乳動物中のそれにより一層類似している。例えば、テト
ラヒメナには、酵母（「高マンノース」構造）や、植物
もしくは下等動物細胞培養物（キシロース残基）とは異
なって、強力な抗原性糖鎖は見出されていない（上記を
参照）。テトラヒメナは、真正な、完全に分化された真
核生物であるけれども、単純な酵母または細菌とその培
養ならびに生育特性がより一層類似していて、大規模に
比較的低価なスキムミルク培地で容易に培養することが
できる。最適条件下で、世代時間は約１．５〜３時間で
あり、非常に高い細胞密度（48 g/L 乾燥重量に相当す
る2.2 × 107 個/mL）は達成可能である（Kiy and Tied
ke 1992, Appl. Microbiol. Biotechnol. 37: 576-579;
Kiy and Tiedke 1992, Appl. Microbiol. Biotechnol.
38: 141-146）（非特許文献８）。その結果、テトラヒ
メナは、大規模組換えタンパク質の発酵製造に対して非
常に興味があり、哺乳動物細胞よりもより一層有利であ
る。
原生生物の１つは、繊毛生物テトラヒメナ（Tetrahymen
a）、特にテトラヒメナ・テルモフィラ（Tetrahymena t
hermophila）である。テトラヒメナは、高等真核生物に
比較的密接に関連していて、それらに典型的な細胞分化
を有している、非病原性で単細胞の真核微生物である。
テトラヒメナ中での翻訳後タンパク質修飾は、酵母や、
その他の真核発現システムに検出されるものよりも、哺
乳動物中のそれにより一層類似している。例えば、テト
ラヒメナには、酵母（「高マンノース」構造）や、植物
もしくは下等動物細胞培養物（キシロース残基）とは異
なって、強力な抗原性糖鎖は見出されていない（上記を
参照）。テトラヒメナは、真正な、完全に分化された真
核生物であるけれども、単純な酵母または細菌とその培
養ならびに生育特性がより一層類似していて、大規模に
比較的低価なスキムミルク培地で容易に培養することが
できる。最適条件下で、世代時間は約１．５〜３時間で
あり、非常に高い細胞密度（48 g/L 乾燥重量に相当す
る2.2 × 107 個/mL）は達成可能である（Kiy and Tied
ke 1992, Appl. Microbiol. Biotechnol. 37: 576-579;
Kiy and Tiedke 1992, Appl. Microbiol. Biotechnol.
38: 141-146）（非特許文献８）。その結果、テトラヒ
メナは、大規模組換えタンパク質の発酵製造に対して非
常に興味があり、哺乳動物細胞よりもより一層有利であ
る。
【００１０】発現システムとしてのテトラヒメナの別の
有利な側面は、相同ＤＮＡ組換えによる異種遺伝子の組
込みがテトラヒメナで可能であることである。これによ
って、有糸分裂的に安定した形質転換体を発生させるこ
とができる。また、標的遺伝子のノックアウトも相同Ｄ
ＮＡ組換えによって可能である（Bruns & Cassidy-Hanl
ey in: Methods in Cell Biology, Volume 62, Ed. Asa
i & Forney, AcademicPress (1999) 501-512); Hai et
al. in: Methods in Cell Biology, Volume 62, Ed. As
ai & Forney, Academic Press (1999) 514-531; Gaerti
g et al. (1999) Nature Biotech. 17: 462-465; Cassi
dy-Hanley et al. 1997 Genetics 146:135-147）（非特
許文献９）。これらに加えて、体細胞大核または生殖小
核も交互に形質転換できる。大核形質転換の間、安全性
もしくは受容問題に関して有利となりうる無菌の形質転
換体が得られる。
有利な側面は、相同ＤＮＡ組換えによる異種遺伝子の組
込みがテトラヒメナで可能であることである。これによ
って、有糸分裂的に安定した形質転換体を発生させるこ
とができる。また、標的遺伝子のノックアウトも相同Ｄ
ＮＡ組換えによって可能である（Bruns & Cassidy-Hanl
ey in: Methods in Cell Biology, Volume 62, Ed. Asa
i & Forney, AcademicPress (1999) 501-512); Hai et
al. in: Methods in Cell Biology, Volume 62, Ed. As
ai & Forney, Academic Press (1999) 514-531; Gaerti
g et al. (1999) Nature Biotech. 17: 462-465; Cassi
dy-Hanley et al. 1997 Genetics 146:135-147）（非特
許文献９）。これらに加えて、体細胞大核または生殖小
核も交互に形質転換できる。大核形質転換の間、安全性
もしくは受容問題に関して有利となりうる無菌の形質転
換体が得られる。
【００１１】テトラヒメナの形質転換は、ミクロ注入
法、エレクトロポレーション法またはミクロ粒子衝撃法
によって行うことができる。このために数多くのベクタ
ー、プロモーターなどを入手することができる。形質転
換体の選択は、耐性マーカーによって行なわれる。した
がって、テトラヒメナは、ｒＤＮＡベクターで有効に形
質転換される（Tondravi et al. 1986, PNAS 83:4396;
Yu et al. 1989, PNAS 86: 8487-8491）（非特許文献１
０）。その他の形質転換実験において、シクロヘキシミ
ドまたはネオマイシン耐性はテトラヒメナにおいて発現
された（Yao et al. 1991, PNAS 88:9493-9497; Kahn e
t al. 1993, PNAS 90: 9295-9299）（非特許文献１
１）。これらのマーカー遺伝子に加えて、テトラヒメナ
は２個の組換えタンパク質（組換え魚寄生虫抗原とニワ
トリの部分オバルブミン）を有効に発現した（Gaertig
et al. (1999, Nature Biotech. 17: 462-465)）（非特
許文献１２）。選択は、パクリタクセル（Paclitaxel
(Taxol)）で行なった。ガエルテイックら（Gaertig et
al.）によって開発されたこのシステムは特許出願中で
ある（WO 00/46381）（特許文献１）。
法、エレクトロポレーション法またはミクロ粒子衝撃法
によって行うことができる。このために数多くのベクタ
ー、プロモーターなどを入手することができる。形質転
換体の選択は、耐性マーカーによって行なわれる。した
がって、テトラヒメナは、ｒＤＮＡベクターで有効に形
質転換される（Tondravi et al. 1986, PNAS 83:4396;
Yu et al. 1989, PNAS 86: 8487-8491）（非特許文献１
０）。その他の形質転換実験において、シクロヘキシミ
ドまたはネオマイシン耐性はテトラヒメナにおいて発現
された（Yao et al. 1991, PNAS 88:9493-9497; Kahn e
t al. 1993, PNAS 90: 9295-9299）（非特許文献１
１）。これらのマーカー遺伝子に加えて、テトラヒメナ
は２個の組換えタンパク質（組換え魚寄生虫抗原とニワ
トリの部分オバルブミン）を有効に発現した（Gaertig
et al. (1999, Nature Biotech. 17: 462-465)）（非特
許文献１２）。選択は、パクリタクセル（Paclitaxel
(Taxol)）で行なった。ガエルテイックら（Gaertig et
al.）によって開発されたこのシステムは特許出願中で
ある（WO 00/46381）（特許文献１）。
【００１２】原生生物または原生動物についての形質転
換および異種タンパク質発現の方法は、わずか２、３種
について文献に記載されているだけである。また、この
発明において、ゾウリムシ（Paramecium）は別の繊毛生
物として挙げられている（Boileau et al. 1999, J. Eu
karyot. Microbiol. 46: 55-65）（非特許文献１３）。
しかしながら、また、組換えタンパク質の形質転換なら
びに発現についての種々の実験は、寄生原生動物、例え
ば、トリパノソーム（Trypanosoma）、レイシュマニア
（Leishmania）、プラスモジウム（Plasmodium）などに
おいて行なわれた（Beverly 2000, WO 00/58483）（特
許文献２）。これらについての論評も記載されている
（Kelly, 1997, Adv. in Parasitol., Vol. 39, 227-27
0）（非特許文献１４）。また、異種タンパク質発現の
可能性の１つが、例えば、粘菌Dictyostelium discoide
um （Manstein et al. 1995, Gene 162: 129-134, Jung
andWilliams 1997, Biotechnol. Appl. Biochem. 25:
3-8)（非特許文献１５）において示されているけれど
も、例えば、クラミドモナス（Chlamydomonas）(Hallet
al. 1993, Gene 124: 75-81)（非特許文献１６）、ボ
ルボックス（Volvox）(Schiedlmeier et al. 1994, PNA
S 91: 5080-5084)（非特許文献１７）、デイノフラゲラ
類（dinoflagellates） (ten Lohuis & Miller 1998, P
lant Journal 13: 427-435) （非特許文献１８）および
ダイアトーム類（diatoms） (Dunahay et al. 1995, J.
Phycol. 31: 1004-1012)（非特許文献１９）などの光
合成独立栄養原生生物（ミクロ藻類）にも示されてい
る。しかしながら、ほとんどの場合、耐性マーカーまた
は非ヒト選択マーカーが発現された。
換および異種タンパク質発現の方法は、わずか２、３種
について文献に記載されているだけである。また、この
発明において、ゾウリムシ（Paramecium）は別の繊毛生
物として挙げられている（Boileau et al. 1999, J. Eu
karyot. Microbiol. 46: 55-65）（非特許文献１３）。
しかしながら、また、組換えタンパク質の形質転換なら
びに発現についての種々の実験は、寄生原生動物、例え
ば、トリパノソーム（Trypanosoma）、レイシュマニア
（Leishmania）、プラスモジウム（Plasmodium）などに
おいて行なわれた（Beverly 2000, WO 00/58483）（特
許文献２）。これらについての論評も記載されている
（Kelly, 1997, Adv. in Parasitol., Vol. 39, 227-27
0）（非特許文献１４）。また、異種タンパク質発現の
可能性の１つが、例えば、粘菌Dictyostelium discoide
um （Manstein et al. 1995, Gene 162: 129-134, Jung
andWilliams 1997, Biotechnol. Appl. Biochem. 25:
3-8)（非特許文献１５）において示されているけれど
も、例えば、クラミドモナス（Chlamydomonas）(Hallet
al. 1993, Gene 124: 75-81)（非特許文献１６）、ボ
ルボックス（Volvox）(Schiedlmeier et al. 1994, PNA
S 91: 5080-5084)（非特許文献１７）、デイノフラゲラ
類（dinoflagellates） (ten Lohuis & Miller 1998, P
lant Journal 13: 427-435) （非特許文献１８）および
ダイアトーム類（diatoms） (Dunahay et al. 1995, J.
Phycol. 31: 1004-1012)（非特許文献１９）などの光
合成独立栄養原生生物（ミクロ藻類）にも示されてい
る。しかしながら、ほとんどの場合、耐性マーカーまた
は非ヒト選択マーカーが発現された。
【００１３】したがって、これまでこれらの生物のいず
れも組換えタンパク質の大量生産に使用されていない。
これらの興味あるシステムならびにその他のおそらく興
味あるシステムの多くにとっての大きな問題は、十分に
確立した遺伝子工学手法がないことであり、そのうちで
も特にベクター、マーカーなどの分子生物学的「ツー
ル」がないことである。
れも組換えタンパク質の大量生産に使用されていない。
これらの興味あるシステムならびにその他のおそらく興
味あるシステムの多くにとっての大きな問題は、十分に
確立した遺伝子工学手法がないことであり、そのうちで
も特にベクター、マーカーなどの分子生物学的「ツー
ル」がないことである。
【００１４】細胞を遺伝子的に慎重に改変することがで
きるためには、選択マーカーが存在することは必要条件
である。形質転換した細胞や生物の選択は、一般的に
は、陰性選択マーカーを介して、一般的には抗生物質
（例えば、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイク
リン、ネオマイシンなど）に対する耐性を利用して行わ
れる。これに対して、必須遺伝子を欠失細胞型（この遺
伝子産生物の意味で）に導入することによっては稀にし
か選択は起こらない（陽性選択もしくは選択相補）。こ
れらには、例えば、酵母中のＬＥＵ−もしくはＵＲＡ３
ベース選択システムが含まれる（Glick & Pasternak, M
olecular Biotechnology, Principles and Application
s of Recombinant DNA, 1998, 2nd Edition, ASM Pres
s, WashingtonDC, pages 109-169 参照）（非特許文献
２０）。しかしながら、上記原生生物のうち未だ余り調
べられていない新規生物に対しては、第２の手法は利用
することができない。だから、このシステム、特に生産
規模での組換えタンパク質の生産に対しては非常に制限
されている。
きるためには、選択マーカーが存在することは必要条件
である。形質転換した細胞や生物の選択は、一般的に
は、陰性選択マーカーを介して、一般的には抗生物質
（例えば、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイク
リン、ネオマイシンなど）に対する耐性を利用して行わ
れる。これに対して、必須遺伝子を欠失細胞型（この遺
伝子産生物の意味で）に導入することによっては稀にし
か選択は起こらない（陽性選択もしくは選択相補）。こ
れらには、例えば、酵母中のＬＥＵ−もしくはＵＲＡ３
ベース選択システムが含まれる（Glick & Pasternak, M
olecular Biotechnology, Principles and Application
s of Recombinant DNA, 1998, 2nd Edition, ASM Pres
s, WashingtonDC, pages 109-169 参照）（非特許文献
２０）。しかしながら、上記原生生物のうち未だ余り調
べられていない新規生物に対しては、第２の手法は利用
することができない。だから、このシステム、特に生産
規模での組換えタンパク質の生産に対しては非常に制限
されている。
【００１５】陰性選択は一般的には由々しい欠点を有し
ている。第一に、所望する生産物にとって不必要なＤＮ
Ａを、生産生物に導入しなければならない。これは、生
物学的安全性の点で、特に公共が受け入れるかどうかと
いう点で障害となりうる。他方、生物は、選択圧力を維
持するために全生産時間中に亘って対応する抗生物質の
存在下で培養しなければならない。これは経済的には生
産原価を高騰させることになる。抗生物質自体の費用と
共に、培地などの生産廃物処理の費用を考慮しなければ
ならないばかりか、得られたタンパク質の後処理もより
一層困難になる。しかしながら、経済的な考慮を離れて
も、環境適応性、生物学的ならびに遺伝子工学的安全性
ならびに特に公共の受け入れが非常に問題である。これ
らに加えて、もし生物を繰り返して形質転換しなければ
ならない場合には、純粋に技術的性質の問題も熟慮しな
ければならない。もし数種類の抗生物質に対する耐性を
同時に発現する数種類の抗生物質が同時に存在する場合
には、生物に対して極めて悪影響を及ぼすことになり、
予測できない副作用を導くことにもなる。
ている。第一に、所望する生産物にとって不必要なＤＮ
Ａを、生産生物に導入しなければならない。これは、生
物学的安全性の点で、特に公共が受け入れるかどうかと
いう点で障害となりうる。他方、生物は、選択圧力を維
持するために全生産時間中に亘って対応する抗生物質の
存在下で培養しなければならない。これは経済的には生
産原価を高騰させることになる。抗生物質自体の費用と
共に、培地などの生産廃物処理の費用を考慮しなければ
ならないばかりか、得られたタンパク質の後処理もより
一層困難になる。しかしながら、経済的な考慮を離れて
も、環境適応性、生物学的ならびに遺伝子工学的安全性
ならびに特に公共の受け入れが非常に問題である。これ
らに加えて、もし生物を繰り返して形質転換しなければ
ならない場合には、純粋に技術的性質の問題も熟慮しな
ければならない。もし数種類の抗生物質に対する耐性を
同時に発現する数種類の抗生物質が同時に存在する場合
には、生物に対して極めて悪影響を及ぼすことになり、
予測できない副作用を導くことにもなる。
【００１６】
【特許文献１】WO 00/46381
【特許文献２】Beverly 2000, WO 00/58483
【特許文献３】ドイツ特許出願番号DE 199 57 889 A1
【特許文献４】ドイツ特許出願番号DE 100 44 468 A1
【特許文献５】ドイツ特許出願番号DE 199 57 889 A1
【特許文献６】ドイツ特許出願番号DE 100 44 461 A1
【非特許文献１】Glick & Pasternak 1998, Molecular
Biotechnology, ASM Press, Washing DC, Chapter 10:
227-252
Biotechnology, ASM Press, Washing DC, Chapter 10:
227-252
【非特許文献２】Ashford & Platt 1998, in: Post-tra
nslational Processing- A Practical Approach Ed. Hi
ggins & Hames, Oxford University Press, Chapter 4:
135-174； Glick & Pasternak 1998, Molecular Biote
chnology, ASM Press, Washington DC, Chapter 7: 145
-169
nslational Processing- A Practical Approach Ed. Hi
ggins & Hames, Oxford University Press, Chapter 4:
135-174； Glick & Pasternak 1998, Molecular Biote
chnology, ASM Press, Washington DC, Chapter 7: 145
-169
【非特許文献３】Castillo 1995, Bioprocess Technolo
gy 21: 13-45； Geise et al. 1996, Prot. Expr. Puri
f. 8: 271-282; Verma et al. 1998 J. Immunological
Methods 216: 165-181; Glick & Pasternak 1998, Mole
cular Biotechnology ASM Press, Washing DC, Chapter
7: 145-169
gy 21: 13-45； Geise et al. 1996, Prot. Expr. Puri
f. 8: 271-282; Verma et al. 1998 J. Immunological
Methods 216: 165-181; Glick & Pasternak 1998, Mole
cular Biotechnology ASM Press, Washing DC, Chapter
7: 145-169
【非特許文献４】Moreman et al. 1994, Glycobiology
4(2): 113-125）
4(2): 113-125）
【非特許文献５】Tuite et al. 1999, in Protein Expr
ession - A Practical Approach, Ed. Higgins & Hame
s, Oxford University Press, Chapter 3: especially
page 76
ession - A Practical Approach, Ed. Higgins & Hame
s, Oxford University Press, Chapter 3: especially
page 76
【非特許文献６】Jenkins et al. 1996, Nature Biotec
h. 14: 975-981
h. 14: 975-981
【非特許文献７】Henderson's Dictionary of Biologic
al Terms, 10th Edition1989, Eleanor Lawrence, Long
man Scientific & Technical, England or Margulis et
al. (Editors) 1990. Handbook of Protoctista, Jon
es & Bartlett,Boston; van den Hoek et al. 1995, Al
gae - An Introduction to Phycology,Cambridge Unive
rsity Press
al Terms, 10th Edition1989, Eleanor Lawrence, Long
man Scientific & Technical, England or Margulis et
al. (Editors) 1990. Handbook of Protoctista, Jon
es & Bartlett,Boston; van den Hoek et al. 1995, Al
gae - An Introduction to Phycology,Cambridge Unive
rsity Press
【非特許文献８】Kiy and Tiedke 1992, Appl. Microbi
ol. Biotechnol. 37: 576-579; Kiy and Tiedke 1992,
Appl. Microbiol. Biotechnol. 38: 141-146
ol. Biotechnol. 37: 576-579; Kiy and Tiedke 1992,
Appl. Microbiol. Biotechnol. 38: 141-146
【非特許文献９】Bruns & Cassidy-Hanley in: Methods
in Cell Biology, Volume 62, Ed. Asai & Forney, Ac
ademic Press (1999) 501-512); Hai et al. in:Method
s in Cell Biology, Volume 62, Ed. Asai & Forney, A
cademic Press (1999) 514-531; Gaertig et al. (199
9) Nature Biotech. 17: 462-465; Cassidy-Hanley et
al. 1997 Genetics 146: 135-147
in Cell Biology, Volume 62, Ed. Asai & Forney, Ac
ademic Press (1999) 501-512); Hai et al. in:Method
s in Cell Biology, Volume 62, Ed. Asai & Forney, A
cademic Press (1999) 514-531; Gaertig et al. (199
9) Nature Biotech. 17: 462-465; Cassidy-Hanley et
al. 1997 Genetics 146: 135-147
【非特許文献１０】Tondravi et al. 1986, PNAS 83:43
96; Yu et al. 1989, PNAS 86: 8487-8491
96; Yu et al. 1989, PNAS 86: 8487-8491
【非特許文献１１】Yao et al. 1991, PNAS 88:9493-94
97; Kahn et al. 1993,PNAS 90: 9295-9299
97; Kahn et al. 1993,PNAS 90: 9295-9299
【非特許文献１２】Gaertig et al., 1999, Nature Bio
tech. 17: 462-465
tech. 17: 462-465
【非特許文献１３】Boileau et al. 1999, J. Eukaryo
t. Microbiol. 46: 55-65
t. Microbiol. 46: 55-65
【非特許文献１４】Kelly, 1997, Adv. in Parasitol.,
Vol. 39, 227-270
Vol. 39, 227-270
【非特許文献１５】Manstein et al. 1995, Gene 162:
129-134, Jung and Williams 1997, Biotechnol. Appl.
Biochem. 25: 3-8
129-134, Jung and Williams 1997, Biotechnol. Appl.
Biochem. 25: 3-8
【非特許文献１６】Hall et al. 1993, Gene 124: 75-8
1
1
【非特許文献１７】Schiedlmeier et al. 1994, PNAS 9
1: 5080-5084
1: 5080-5084
【非特許文献１８】ten Lohuis & Miller 1998, Plant
Journal 13: 427-435
Journal 13: 427-435
【非特許文献１９】Dunahay et al. 1995, J. Phycol.
31: 1004-1012
31: 1004-1012
【非特許文献２０】Glick & Pasternak, Molecular Bio
technology, Principlesand Applications of Recombin
ant DNA, 1998, 2nd Edition, ASM Press, Washington
DC, pages 109-169
technology, Principlesand Applications of Recombin
ant DNA, 1998, 2nd Edition, ASM Press, Washington
DC, pages 109-169
【非特許文献２１】Sambrook et al., Molecular Cloni
ng, A Laboratory Manual, Coldspring Harbor, NY
ng, A Laboratory Manual, Coldspring Harbor, NY
【非特許文献２２】www.diversa.com や、www. maxyge
n.comなど
n.comなど
【非特許文献２３】Nakashima S. et al.：Biochem. J.
317, 29-34 (1996)
317, 29-34 (1996)
【非特許文献２４】Benson, D.A. et al., Nuc. Acid R
es., 28 (10), 15-18 (2000)
es., 28 (10), 15-18 (2000)
【非特許文献２５】Wuitschick & Karrer, J. Eukaryo
t. Microbiol. (1999)
t. Microbiol. (1999)
【非特許文献２６】Gaertig et al. (1994) PNAS 91: 4
549-4553)
549-4553)
【非特許文献２７】Sambrook et al. (1989) Molecular
Cloning: A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor L
aboratory, Cold Spring, New York
Cloning: A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor L
aboratory, Cold Spring, New York
【非特許文献２８】Gaertig et al. (1994) Nucl. Acid
s Res. 22: 5391-5398
s Res. 22: 5391-5398
【非特許文献２９】Gaertig et al. 1999 Nature Biote
ch. 17: 462-465
ch. 17: 462-465
【非特許文献３０】Gaertig & Kapler (1999)
【非特許文献３１】Bruns & Cassidy-Hanley, Methods
in Cell Biology, Volume 62 (1999) 229-240
in Cell Biology, Volume 62 (1999) 229-240
【非特許文献３２】Burns & Cassidy-Hanley: Methods
in Cell Biology, Volume 62 (1999) 501-512); Gaerti
g et al. (1999) Nature Biotech. 17: 462-465;Cassid
y-Hanley et al. (1997 Genetics 146: 135-147)
in Cell Biology, Volume 62 (1999) 501-512); Gaerti
g et al. (1999) Nature Biotech. 17: 462-465;Cassid
y-Hanley et al. (1997 Genetics 146: 135-147)
【非特許文献３３】Sanford et al. (1991) Biotechniq
ues 3:3-16; Bruns & Cassidy-Hanley (1999) Methods
in Cell Biology, Volume 62: 501-512
ues 3:3-16; Bruns & Cassidy-Hanley (1999) Methods
in Cell Biology, Volume 62: 501-512
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】先行技術に鑑みて、こ
の発明は、とりわけ組換えタンパク質を効率的に生産す
ることができる遺伝子的に改変した原生生物の陽性選択
を行う選択方法を提供することを目的としている。
の発明は、とりわけ組換えタンパク質を効率的に生産す
ることができる遺伝子的に改変した原生生物の陽性選択
を行う選択方法を提供することを目的としている。
【００１８】
【課題を解決するための手段】この発明の目的は、この
発明の特許請求の範囲に記載する発明ばかりではなく、
該発明から容易に推測できるまたは結論することができ
るその他の発明によっても解決することができる。
発明の特許請求の範囲に記載する発明ばかりではなく、
該発明から容易に推測できるまたは結論することができ
るその他の発明によっても解決することができる。
【００１９】
【発明の実施の形態】この発明に係る組換え原生生物の
生産方法は、原生生物の栄養要求性変異体を作成し、該
変異体を対応する栄養要求性の相補のための少なくとも
１個の遺伝子を含む組換えＤＮＡで形質転換し、更に相
補原生生物だけを生育することができる最少培地で得ら
れた組換え原生生物を選択することによって、驚くほど
簡単に行うことができる。特に、恒久的に選択圧力を維
持するために、この発明は、抗生物質耐性の選択も、望
ましくないおそらく異種の遺伝子が組換え生物中に存在
することも最終的には必要としていない。したがって、
培養培地に抗生物質を添加することも必要としていな
い。また、この方法は、問題なく繰り返して同一生物株
で使用することができ、その他の望ましくない遺伝子を
（過大）発現させることなく、種々の所望の組換え遺伝
子でそれを形質転換することができる。
生産方法は、原生生物の栄養要求性変異体を作成し、該
変異体を対応する栄養要求性の相補のための少なくとも
１個の遺伝子を含む組換えＤＮＡで形質転換し、更に相
補原生生物だけを生育することができる最少培地で得ら
れた組換え原生生物を選択することによって、驚くほど
簡単に行うことができる。特に、恒久的に選択圧力を維
持するために、この発明は、抗生物質耐性の選択も、望
ましくないおそらく異種の遺伝子が組換え生物中に存在
することも最終的には必要としていない。したがって、
培養培地に抗生物質を添加することも必要としていな
い。また、この方法は、問題なく繰り返して同一生物株
で使用することができ、その他の望ましくない遺伝子を
（過大）発現させることなく、種々の所望の組換え遺伝
子でそれを形質転換することができる。
【００２０】また、この発明の別の態様においては、組
換えタンパク質の生産方法は、組換えＤＮＡが、該原生
生物の形質転換のために発現されるタンパク質の機能的
組換え遺伝子を更に少なくとも１個有している組換え原
生生物を上記と同様にして作成することによって行うこ
とができる。次いで、組換え原生生物を培養して、タン
パク質を発現単離することができる。
換えタンパク質の生産方法は、組換えＤＮＡが、該原生
生物の形質転換のために発現されるタンパク質の機能的
組換え遺伝子を更に少なくとも１個有している組換え原
生生物を上記と同様にして作成することによって行うこ
とができる。次いで、組換え原生生物を培養して、タン
パク質を発現単離することができる。
【００２１】この発明の別の態様は、組換え原生生物で
あって、その必須遺伝子がノックアウトされて、組換え
ＤＮＡによる該原生生物の形質転換によって得られる栄
養要求性が好ましくは相補されていることを特徴とする
組換え原生生物に関するものである。
あって、その必須遺伝子がノックアウトされて、組換え
ＤＮＡによる該原生生物の形質転換によって得られる栄
養要求性が好ましくは相補されていることを特徴とする
組換え原生生物に関するものである。
【００２２】この発明の好ましい態様は、必須遺伝子を
ノックアウトすることによって栄養要求性変異体を生産
することである。ノックアウトは、対応する遺伝子の完
全欠失またはその突然変異によって行うことができる。
ここでいう突然変異とは、例えば、個々の塩基対の挿
入、欠失、転化または単なる交換を意味するものと理解
される。遺伝子の欠失、つまり変異は、当業者にとって
公知の方法によって標的生物に対して導入することがで
きた。その中でも、この発明においては、インビトロ突
然変異誘発が、例えば、エラ−プローン(error-prone)
ＰＣＲや、おそらく臨床方法に従ったり（Sambrook et
al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Colds
pring Harbor, NY）（非特許文献２１）、またはエクソ
ンシャフリング(exon-shuffling)や、遺伝子部位飽和突
然変異誘発（例えば、www.diversa.com や、www. maxyg
en.comなど）（非特許文献２２）などによって作用す
る。
ノックアウトすることによって栄養要求性変異体を生産
することである。ノックアウトは、対応する遺伝子の完
全欠失またはその突然変異によって行うことができる。
ここでいう突然変異とは、例えば、個々の塩基対の挿
入、欠失、転化または単なる交換を意味するものと理解
される。遺伝子の欠失、つまり変異は、当業者にとって
公知の方法によって標的生物に対して導入することがで
きた。その中でも、この発明においては、インビトロ突
然変異誘発が、例えば、エラ−プローン(error-prone)
ＰＣＲや、おそらく臨床方法に従ったり（Sambrook et
al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Colds
pring Harbor, NY）（非特許文献２１）、またはエクソ
ンシャフリング(exon-shuffling)や、遺伝子部位飽和突
然変異誘発（例えば、www.diversa.com や、www. maxyg
en.comなど）（非特許文献２２）などによって作用す
る。
【００２３】この発明において、栄養要求性ノックアウ
ト変異体を産生するための必須遺伝子とは、例えば、脂
肪酸、ステロール、アミノ酸の生合成などのための必須
代謝性遺伝子であって、その欠如が対応する分子（脂肪
酸、ステロール、アミノ酸など）を培養培地に添加する
ことによって補償することができるもの（以下、マーカ
ーとも呼ぶ）を意味するものと理解される。かかる遺伝
子を慎重にノックアウトすることによって、細胞は、こ
の代謝経路の産生物に対して栄養要求性となる。このこ
とについては、実施例において、例えば、ステロールお
よびアミノ酸生合成に対して記載している。対応する代
謝産生物、つまり、コレステロールや脂肪酸を添加する
ことによって、細胞はこのノックアウトを生存させるこ
とができる。これらを添加しなければ、細胞は直ぐに死
んでしまうことになる。
ト変異体を産生するための必須遺伝子とは、例えば、脂
肪酸、ステロール、アミノ酸の生合成などのための必須
代謝性遺伝子であって、その欠如が対応する分子（脂肪
酸、ステロール、アミノ酸など）を培養培地に添加する
ことによって補償することができるもの（以下、マーカ
ーとも呼ぶ）を意味するものと理解される。かかる遺伝
子を慎重にノックアウトすることによって、細胞は、こ
の代謝経路の産生物に対して栄養要求性となる。このこ
とについては、実施例において、例えば、ステロールお
よびアミノ酸生合成に対して記載している。対応する代
謝産生物、つまり、コレステロールや脂肪酸を添加する
ことによって、細胞はこのノックアウトを生存させるこ
とができる。これらを添加しなければ、細胞は直ぐに死
んでしまうことになる。
【００２４】したがって、この発明において、対応する
生物の栄養要求性変異体を生産するために、ノックアウ
トの適正な標的は、例えば、トリテルペノイド−サイク
ラーゼ（テトラヒマノール−サイクラーゼと同義）、デ
ルタ−６−デサチュラーゼまたはデルタ−９−デサチュ
ラーゼをコードする遺伝子である。
生物の栄養要求性変異体を生産するために、ノックアウ
トの適正な標的は、例えば、トリテルペノイド−サイク
ラーゼ（テトラヒマノール−サイクラーゼと同義）、デ
ルタ−６−デサチュラーゼまたはデルタ−９−デサチュ
ラーゼをコードする遺伝子である。
【００２５】この発明において、トリテルペノイド−サ
イクラーゼに対する好ましい遺伝子はドイツ特許出願に
記載されている（ドイツ特許出願番号DE 199 57 889 A
1）（特許文献３）。この発明において、デルタ−６−
デサチュラーゼに対する好ましい遺伝子はドイツ特許出
願に記載されている（ドイツ特許出願番号DE 100 44 46
8 A1）（特許文献４）。また、この発明において、デル
タ−９−デサチュラーゼに対する好ましい遺伝子は文献
に記載されている（Nakashima S. et al.：Biochem. J.
317, 29-34 (1996)）（非特許文献２３）。更に、対応
する配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてaccession no. EM
BL D83478として検索することができる。なお、Ｇｅｎ
Ｂａｎｋについては次の文献を参照するのがよい（Bens
on, D.A. et al., Nuc. Acid Res., 28 (10), 15-18 (2
000)）（非特許文献２４）。その上、これら文献の全て
は本明細書の一部として組み込まれているものとする。
イクラーゼに対する好ましい遺伝子はドイツ特許出願に
記載されている（ドイツ特許出願番号DE 199 57 889 A
1）（特許文献３）。この発明において、デルタ−６−
デサチュラーゼに対する好ましい遺伝子はドイツ特許出
願に記載されている（ドイツ特許出願番号DE 100 44 46
8 A1）（特許文献４）。また、この発明において、デル
タ−９−デサチュラーゼに対する好ましい遺伝子は文献
に記載されている（Nakashima S. et al.：Biochem. J.
317, 29-34 (1996)）（非特許文献２３）。更に、対応
する配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてaccession no. EM
BL D83478として検索することができる。なお、Ｇｅｎ
Ｂａｎｋについては次の文献を参照するのがよい（Bens
on, D.A. et al., Nuc. Acid Res., 28 (10), 15-18 (2
000)）（非特許文献２４）。その上、これら文献の全て
は本明細書の一部として組み込まれているものとする。
【００２６】この発明による細胞は、ノックアウト遺伝
子の再導入による代謝性産生物に対する栄養要求性を必
要としている。この場合、栄養要求性は相補することが
できるといわれている。有効に形質転換された細胞の選
択は、最少培地で、つまり、有効でない形質転換がなさ
れた生物が栄養要求性になる代謝性生成物を除外して行
うことができる。この発明において、最少培地とは、細
胞を生存させることができる必要な構成ブロックを全て
含んでいるが（糖などの炭素源、できればアミノ酸など
の窒素源、ビタミン、微量元素など）、原発生物が栄養
要求性になるための代謝性生産物を含んでいない培地を
意味するものと理解される。
子の再導入による代謝性産生物に対する栄養要求性を必
要としている。この場合、栄養要求性は相補することが
できるといわれている。有効に形質転換された細胞の選
択は、最少培地で、つまり、有効でない形質転換がなさ
れた生物が栄養要求性になる代謝性生成物を除外して行
うことができる。この発明において、最少培地とは、細
胞を生存させることができる必要な構成ブロックを全て
含んでいるが（糖などの炭素源、できればアミノ酸など
の窒素源、ビタミン、微量元素など）、原発生物が栄養
要求性になるための代謝性生産物を含んでいない培地を
意味するものと理解される。
【００２７】栄養要求性を相補するこの遺伝子が、発現
される異種タンパク質をコードする遺伝子に結合してい
る場合には、形質転換体は、選択マーカーを添加するこ
となしに、同定することができ、また、有効で安定した
発現が選択マーカーの添加に依存せずに、典型的な場合
としては、例えば、組換えＥ．ｃｏｌｉにおいて起こ
る。その他の積極的な効果としては、発現される標的遺
伝子に加えて、外来ＤＮＡを細胞に導入する必要がない
ことである。その上、相同組換えが起こる生物（例え
ば、テトラヒメナなど）中においては、ＤＮＡはゲノム
中にランダムには取り込まれることはなく、特定の位
置、つまり、マーカー遺伝子の自然位置に取り込まれ
る。
される異種タンパク質をコードする遺伝子に結合してい
る場合には、形質転換体は、選択マーカーを添加するこ
となしに、同定することができ、また、有効で安定した
発現が選択マーカーの添加に依存せずに、典型的な場合
としては、例えば、組換えＥ．ｃｏｌｉにおいて起こ
る。その他の積極的な効果としては、発現される標的遺
伝子に加えて、外来ＤＮＡを細胞に導入する必要がない
ことである。その上、相同組換えが起こる生物（例え
ば、テトラヒメナなど）中においては、ＤＮＡはゲノム
中にランダムには取り込まれることはなく、特定の位
置、つまり、マーカー遺伝子の自然位置に取り込まれ
る。
【００２８】しかしながら、当業者にとっては、栄養要
求性の相補は対応した異種的またはインビトロで改変さ
れた遺伝子によっても発生することは明らかである。
求性の相補は対応した異種的またはインビトロで改変さ
れた遺伝子によっても発生することは明らかである。
【００２９】この発明においては、形質転換された原生
生物、例えば、原生動物が、上記方法における選択に適
している。かかる原生動物としては、例えば、パラメシ
ウム属やテトラヒメナ属などの鞭毛動物、特にテトラヒ
メナ・テルモフィラが挙げられる。
生物、例えば、原生動物が、上記方法における選択に適
している。かかる原生動物としては、例えば、パラメシ
ウム属やテトラヒメナ属などの鞭毛動物、特にテトラヒ
メナ・テルモフィラが挙げられる。
【００３０】栄養要求性原生生物突然変異体の形質転換
のための組換えＤＮＡは、ベクター、例えば、つまり、
あらゆる形の核酸、例えば、プラスミド、コスミド、ウ
イルス、自立複製配列、ファージ、線状もしくは環状
の、一重もしくは二重ラセンＤＮＡもしくはＲＮＡ分子
であって、標的生物自体において複製することができる
かもしくはそのゲノム中に導入できるが、少なくとも標
的生物中に機能性配列を含んでいるものであってもよ
い。
のための組換えＤＮＡは、ベクター、例えば、つまり、
あらゆる形の核酸、例えば、プラスミド、コスミド、ウ
イルス、自立複製配列、ファージ、線状もしくは環状
の、一重もしくは二重ラセンＤＮＡもしくはＲＮＡ分子
であって、標的生物自体において複製することができる
かもしくはそのゲノム中に導入できるが、少なくとも標
的生物中に機能性配列を含んでいるものであってもよ
い。
【００３１】この発明において、機能性配列とは、組換
え生物においてもその対応する機能性を充足することが
できるそのＤＮＡ断片を意味するものと理解される。
え生物においてもその対応する機能性を充足することが
できるそのＤＮＡ断片を意味するものと理解される。
【００３２】この発明において、機能性遺伝子とは、標
的生物中で発現することができる遺伝子を意味するもの
と理解される。したがって、特に、機能性遺伝子は、コ
ード配列に加えて、該コード配列の転写を導く標的生物
中において機能的であるプロモーターを含んでいる。こ
の種の機能性タンパク質は、そのうちでも、１個もしく
はそれ以上のＴＡＴＡボツクス、ＣＣＡＡＴボックス、
ＧＣボックスまたはエンハンサー配列を有していてもよ
い。それに加えて、機能性遺伝子には、標的生物中にお
いて、転写を中断し、ｍＲＮＡのボリアデニル化を導く
シグナル配列を含んでいてもよい機能性ターミネーター
を含んでいてもよい。また、この機能性遺伝子のコード
配列は、標的生物の翻訳に必要な全ての性質（例えば、
開始コドン（例えば、ＡＴＧ）、停止コドン（例えば、
ＴＧＡ、特にテトラヒメナ内の）、開始前のＡに富む
（リッチ）領域（翻訳開始部位）、コザック配列、ボリ
Ａ部位）などを有している。また、この遺伝子は、対応
する組換え生物（例えば、テトラヒメナ）に対する特定
のコドン用途を有することもできる（Wuitschick & Kar
rer, J. Eukaryot. Microbiol. (1999)）（非特許文献
２５）。
的生物中で発現することができる遺伝子を意味するもの
と理解される。したがって、特に、機能性遺伝子は、コ
ード配列に加えて、該コード配列の転写を導く標的生物
中において機能的であるプロモーターを含んでいる。こ
の種の機能性タンパク質は、そのうちでも、１個もしく
はそれ以上のＴＡＴＡボツクス、ＣＣＡＡＴボックス、
ＧＣボックスまたはエンハンサー配列を有していてもよ
い。それに加えて、機能性遺伝子には、標的生物中にお
いて、転写を中断し、ｍＲＮＡのボリアデニル化を導く
シグナル配列を含んでいてもよい機能性ターミネーター
を含んでいてもよい。また、この機能性遺伝子のコード
配列は、標的生物の翻訳に必要な全ての性質（例えば、
開始コドン（例えば、ＡＴＧ）、停止コドン（例えば、
ＴＧＡ、特にテトラヒメナ内の）、開始前のＡに富む
（リッチ）領域（翻訳開始部位）、コザック配列、ボリ
Ａ部位）などを有している。また、この遺伝子は、対応
する組換え生物（例えば、テトラヒメナ）に対する特定
のコドン用途を有することもできる（Wuitschick & Kar
rer, J. Eukaryot. Microbiol. (1999)）（非特許文献
２５）。
【００３３】この発明によれば、組換えタンパク質の生
産方法において組換え原生生物中で発現されるタンパク
質に対する組換え遺伝子は、相同遺伝子でも、異種遺伝
子でもよい。異種遺伝子の場合には、その遺伝子は脊椎
動物、好ましくはヒトから単離するのが好ましい。この
好ましい例としては、ヒトエリスロポエチンが挙げられ
る。組換えタンパク質、またその組換えタンパク質を含
むバイオマスもしくはその１部によって活性免疫化を達
成することができるためには、この発明において、組換
え原生生物中で発現されるタンパク質に対して好ましい
組換え遺伝子は、ヒトまたは動物中に疾患（例えばマラ
リアなど）を誘発することができる生物からの遺伝子を
挙げることができる。
産方法において組換え原生生物中で発現されるタンパク
質に対する組換え遺伝子は、相同遺伝子でも、異種遺伝
子でもよい。異種遺伝子の場合には、その遺伝子は脊椎
動物、好ましくはヒトから単離するのが好ましい。この
好ましい例としては、ヒトエリスロポエチンが挙げられ
る。組換えタンパク質、またその組換えタンパク質を含
むバイオマスもしくはその１部によって活性免疫化を達
成することができるためには、この発明において、組換
え原生生物中で発現されるタンパク質に対して好ましい
組換え遺伝子は、ヒトまたは動物中に疾患（例えばマラ
リアなど）を誘発することができる生物からの遺伝子を
挙げることができる。
【００３４】
【実施例】以下の実施例は、この発明を説明するもので
あるが、この発明を以下の実施例に限定するものではな
い。 実施例１：生物および培養条件 テトラヒメナ・テルモフィラ（Tetrahymena thermophil
a）（菌株：Ｂ１８６８ＶＩＩＩ、Ｂ２０８６ＩＩ、Ｂ
＊ＶＩ、ＣＵ４２８、ＣＵ４２７、ＣＵ５２２；J. Gae
rtig, University of Georgia, Athens, GA, USAから入
手）を、改良ＳＰＰ培地（２％プロテオスペプトン、
０．１％酵母抽出物、０．２％グルコース、０．００３
％Ｆｅ−ＥＤＴＡ）（Gaertig et al. (1994) PNAS 91:
4549-4553)）（非特許文献２６）と、スキムミルク培
地（２％スキムミルク粉末、０．５％酵母抽出物、１％
グルコース、０．００３％Ｆｅ−ＥＤＴＡ）もしくはＭ
ＹＤ（２％スキムミルク粉末、０．１％酵母抽出物、
０．２％グルコース、０．００３％Ｆｅ−ＥＤＴＡ）
に、抗生物質溶液（１００Ｕ/ｍＬペニシリン、１００
μｇ/ｍＬストレプトマイシンおよび０．２５μｇ/ｍＬ
アンフォテリシンＢ（ＳＰＰＡ培地））を添加して、２
５０ｍＬ容アーレンマイヤーフラスコ中で、３０℃で振
とう（１５０ｒｐｍ）培養した。プラスミドとファージ
はＥ．ｃｏｌｉXL1-Blue、MRF’、TOP10F’もしくはJM1
09 (Stratagene, Invitrogen, GibcoBRL Life Technolo
gies)で増殖し選択した。細菌の培養は、標準濃度の抗
生物質を添加したＬＢ培地もしくはＮＺＹ培地を用いて
標準条件下で培養した（Sambrook et al. (1989) Molec
ular Cloning: ALaboratory Manual, Cold Spring Harb
or Laboratory, Cold Spring, New York)）（非特許文
献２７）。
あるが、この発明を以下の実施例に限定するものではな
い。 実施例１：生物および培養条件 テトラヒメナ・テルモフィラ（Tetrahymena thermophil
a）（菌株：Ｂ１８６８ＶＩＩＩ、Ｂ２０８６ＩＩ、Ｂ
＊ＶＩ、ＣＵ４２８、ＣＵ４２７、ＣＵ５２２；J. Gae
rtig, University of Georgia, Athens, GA, USAから入
手）を、改良ＳＰＰ培地（２％プロテオスペプトン、
０．１％酵母抽出物、０．２％グルコース、０．００３
％Ｆｅ−ＥＤＴＡ）（Gaertig et al. (1994) PNAS 91:
4549-4553)）（非特許文献２６）と、スキムミルク培
地（２％スキムミルク粉末、０．５％酵母抽出物、１％
グルコース、０．００３％Ｆｅ−ＥＤＴＡ）もしくはＭ
ＹＤ（２％スキムミルク粉末、０．１％酵母抽出物、
０．２％グルコース、０．００３％Ｆｅ−ＥＤＴＡ）
に、抗生物質溶液（１００Ｕ/ｍＬペニシリン、１００
μｇ/ｍＬストレプトマイシンおよび０．２５μｇ/ｍＬ
アンフォテリシンＢ（ＳＰＰＡ培地））を添加して、２
５０ｍＬ容アーレンマイヤーフラスコ中で、３０℃で振
とう（１５０ｒｐｍ）培養した。プラスミドとファージ
はＥ．ｃｏｌｉXL1-Blue、MRF’、TOP10F’もしくはJM1
09 (Stratagene, Invitrogen, GibcoBRL Life Technolo
gies)で増殖し選択した。細菌の培養は、標準濃度の抗
生物質を添加したＬＢ培地もしくはＮＺＹ培地を用いて
標準条件下で培養した（Sambrook et al. (1989) Molec
ular Cloning: ALaboratory Manual, Cold Spring Harb
or Laboratory, Cold Spring, New York)）（非特許文
献２７）。
【００３５】実施例２：トリテルペノイド−サイクラー
ゼをノックアウトした構成体の作成 ノックアウト構成体を作成するために、プラスミドｐ４
Ｔ２−１ΔＨ３からのネオ−カセット（Gaertig et al.
(1994) Nucl. Acids Res. 22: 5391-5398）（非特許文
献２８）を、トリテルペノイド−サイクラーゼのゲノム
配列中に挿入した（ドイツ特許出願番号DE 199 57 889
A1）（特許文献５）。この遺伝子は、テトラヒメナのヒ
ストンＨ４プロモーターと、そのＢＴＵ２遺伝子の３’
フランキング配列との制御下にあるネオマイシン耐性遺
伝子である。テトラヒメナ中のこの構成体はパロモマイ
シン耐性を仲介する。プラスミドｐ４Ｔ２−１ΔＨ３は
ＥｃｏＲＶ/ＳｍａＩで切断され、上記ネオ−カセット
を含むほぼ１．４ｋｂフラグメントを、ＥｃｏＲＶで切
断したプラスミドｐｇＴＨＣを用いてテトラヒメナのト
リテルペノイド−サイクラーゼのゲノム配列中に結合し
た。これによって、プラスミドｐｇＴＨＣ：：ｎｅｏが
作成された（図２参照）。この形質転換中、トリテルペ
ノイド−サイクラーゼに対する遺伝子は、相同組換えに
よって、この構成体と置換されて、細胞のパロモマイシ
ン耐性が仲介された。
ゼをノックアウトした構成体の作成 ノックアウト構成体を作成するために、プラスミドｐ４
Ｔ２−１ΔＨ３からのネオ−カセット（Gaertig et al.
(1994) Nucl. Acids Res. 22: 5391-5398）（非特許文
献２８）を、トリテルペノイド−サイクラーゼのゲノム
配列中に挿入した（ドイツ特許出願番号DE 199 57 889
A1）（特許文献５）。この遺伝子は、テトラヒメナのヒ
ストンＨ４プロモーターと、そのＢＴＵ２遺伝子の３’
フランキング配列との制御下にあるネオマイシン耐性遺
伝子である。テトラヒメナ中のこの構成体はパロモマイ
シン耐性を仲介する。プラスミドｐ４Ｔ２−１ΔＨ３は
ＥｃｏＲＶ/ＳｍａＩで切断され、上記ネオ−カセット
を含むほぼ１．４ｋｂフラグメントを、ＥｃｏＲＶで切
断したプラスミドｐｇＴＨＣを用いてテトラヒメナのト
リテルペノイド−サイクラーゼのゲノム配列中に結合し
た。これによって、プラスミドｐｇＴＨＣ：：ｎｅｏが
作成された（図２参照）。この形質転換中、トリテルペ
ノイド−サイクラーゼに対する遺伝子は、相同組換えに
よって、この構成体と置換されて、細胞のパロモマイシ
ン耐性が仲介された。
【００３６】実施例３：発現構成体ｐＢＴＨＣの作成
ベクターｐＢＩＣＨ３（Gaertig et al. 1999 Nature B
iotech. 17: 462-465）（非特許文献２９）、（WO 00/4
5381)（特許文献１）は、テトラヒメナ・テルモフィラ
ＢＴＵ１遺伝子の非コード調節配列によってフランキン
グされたイチチオフィトラス（Ichthyophthrius）Ｉ抗
原（Ｇ１）プレプロテインのコード配列を含んでいる。
テトラヒマノール−サイクラーゼ発現構成体ｐＢＴＨＣ
を作成するために、開始部位にＮｓｉＩ切断部位を有す
る改変プラスミド（ｐＢＩＣＨ３−Ｎｓｉ）（J. Gaert
ig, University of Georgia, Athens, GA, USAより提
供）を使用した。この目的のために、テトラヒメナのテ
トラヒマノール−サイクラーゼを、コード配列の開始と
停止部位にあるＮｓｉＩとＢａｍＨＩ切断部位にＰＣＲ
によって挿入した。テトラヒマノール−サイクラーゼの
完全ｃＤＮＡ配列（ｐＴＨＣ）を含む単離された単離プ
ラスミドを、テンプレートとしてＰＣＲに使用した。プ
ライマーの配列は下記の通りである。 THC-Nsi-F: 5’-CTCTTTCATACATGCATAAGATACTCATAGGC-
3’ （配列番号１）および THC-Bam-R: 5’- GGCTTGGATCCTCAAATATTTTATTTTTATACAG
G-3’ （配列番号２） 上記プライマーを使用して、ＮｓｉＩおよびＢａｍＨＩ
切断部位によってフランキングされたテトラヒマノール
−サイクラーゼの完全コード配列を含むＰＣＲ生産物が
得られた。得られたＰＣＲ生産物とプラスミドｐＢＩＣ
Ｈ３Ｎ−Ｎｓｉは、制限酵素ＮｓｉＩとＢａｍＨＩで切
断し、アガロースゲルで精製した後、結合した（図３参
照）。そのようにして作成した発現構成体ｐＢＴＨＣ
は、ＢＴＵ１遺伝子の調節配列中の正確な読み取りフレ
ームに挿入されたトリテルペノイド−サイクラーゼをコ
ードする完全配列を含んでいる。テトラヒメナの形質転
換のために、得られた構成体は、制限酵素ＸｂａＩとＳ
ａｌＩで消化して線状化した。この有効な形質転換中
に、ＢＴＵ１遺伝子は、相同組換えによってこの構成体
で置換されたので、細胞のパクリタクセル（Ｐａｃｌｉ
ｔａｘｅｌ）に対する細胞耐性が仲介された。
iotech. 17: 462-465）（非特許文献２９）、（WO 00/4
5381)（特許文献１）は、テトラヒメナ・テルモフィラ
ＢＴＵ１遺伝子の非コード調節配列によってフランキン
グされたイチチオフィトラス（Ichthyophthrius）Ｉ抗
原（Ｇ１）プレプロテインのコード配列を含んでいる。
テトラヒマノール−サイクラーゼ発現構成体ｐＢＴＨＣ
を作成するために、開始部位にＮｓｉＩ切断部位を有す
る改変プラスミド（ｐＢＩＣＨ３−Ｎｓｉ）（J. Gaert
ig, University of Georgia, Athens, GA, USAより提
供）を使用した。この目的のために、テトラヒメナのテ
トラヒマノール−サイクラーゼを、コード配列の開始と
停止部位にあるＮｓｉＩとＢａｍＨＩ切断部位にＰＣＲ
によって挿入した。テトラヒマノール−サイクラーゼの
完全ｃＤＮＡ配列（ｐＴＨＣ）を含む単離された単離プ
ラスミドを、テンプレートとしてＰＣＲに使用した。プ
ライマーの配列は下記の通りである。 THC-Nsi-F: 5’-CTCTTTCATACATGCATAAGATACTCATAGGC-
3’ （配列番号１）および THC-Bam-R: 5’- GGCTTGGATCCTCAAATATTTTATTTTTATACAG
G-3’ （配列番号２） 上記プライマーを使用して、ＮｓｉＩおよびＢａｍＨＩ
切断部位によってフランキングされたテトラヒマノール
−サイクラーゼの完全コード配列を含むＰＣＲ生産物が
得られた。得られたＰＣＲ生産物とプラスミドｐＢＩＣ
Ｈ３Ｎ−Ｎｓｉは、制限酵素ＮｓｉＩとＢａｍＨＩで切
断し、アガロースゲルで精製した後、結合した（図３参
照）。そのようにして作成した発現構成体ｐＢＴＨＣ
は、ＢＴＵ１遺伝子の調節配列中の正確な読み取りフレ
ームに挿入されたトリテルペノイド−サイクラーゼをコ
ードする完全配列を含んでいる。テトラヒメナの形質転
換のために、得られた構成体は、制限酵素ＸｂａＩとＳ
ａｌＩで消化して線状化した。この有効な形質転換中
に、ＢＴＵ１遺伝子は、相同組換えによってこの構成体
で置換されたので、細胞のパクリタクセル（Ｐａｃｌｉ
ｔａｘｅｌ）に対する細胞耐性が仲介された。
【００３７】実施例４：テトラヒマノール−サイクラー
ゼ発現構成体ｐＢＴＨＣによるテトラヒメナの大核形質
転換 テトラヒメナ・テルモフィラ細胞（ＣＵ５２２）５×１
０６個を形質転換に使用した。この細胞を、ＳＰＰＡ培
地５０ｍＬ中で、揺とう装置に取り付けた２５０ｍＬ容
アーレンマイヤーフラスコを用いて１５０ｒｐｍで振と
うしながら３０℃で約３〜５×１０５個/ｍＬの細胞濃
度になるまで培養した。その後、５分間遠心分離（１２
００ｇ）することによって得られた細胞をペレット化
し、その細胞ペレットを１０ｍＭＴｒｉ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）５０ｍＬに再懸濁し、前と同様に遠心分離し
た。この洗浄工程を繰り返し、細胞濃度３×１０５個/
ｍＬの細胞を１０ｍＭＴｒｉ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５、抗
生物質添加）に再懸濁し、２５０ｍＬ容アーレンマイヤ
ーフラスコに移し、振とうすることなく３０℃で１６〜
１０時間培養した（飢餓相）。この飢餓相後、細胞数を
再度決定して、上記同様に遠心分離し、細胞を１０ｍＭ
Ｔｒｉ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を用いて細胞濃度５×１
０6個/ｍＬに調節した。このうちの細胞懸濁液１ｍＬを
形質転換に使用した。形質転換は小核衝撃法（下記に説
明する）で行った。再生するために、細胞をアーレンマ
イヤーフラスコのＳＰＰＡ培地に取り、振とうすること
なしに３０℃で培養した。３時間培養した後、最終濃度
２０μｍのパクリタクセルを添加し、アリコート１００
μＬの細胞を９６ウエルマイクロタイタープレートに移
した。得られた細胞を湿らせて暗くしたボックス中にお
いて３０℃で培養した。２〜３日後、パクリタクセル耐
性クローンが同定された。陽性のクローンを２５μｍパ
クリタクセル添加の新規培地で再培養した。パクリタク
セル濃度を増加して（８０μｍまで）培養することによ
って、完全「フェノタイプ・アソートメント（phenotyp
ic assortment）」に達した（Gaertig & Kapler (199
9)）（非特許文献３０）。
ゼ発現構成体ｐＢＴＨＣによるテトラヒメナの大核形質
転換 テトラヒメナ・テルモフィラ細胞（ＣＵ５２２）５×１
０６個を形質転換に使用した。この細胞を、ＳＰＰＡ培
地５０ｍＬ中で、揺とう装置に取り付けた２５０ｍＬ容
アーレンマイヤーフラスコを用いて１５０ｒｐｍで振と
うしながら３０℃で約３〜５×１０５個/ｍＬの細胞濃
度になるまで培養した。その後、５分間遠心分離（１２
００ｇ）することによって得られた細胞をペレット化
し、その細胞ペレットを１０ｍＭＴｒｉ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）５０ｍＬに再懸濁し、前と同様に遠心分離し
た。この洗浄工程を繰り返し、細胞濃度３×１０５個/
ｍＬの細胞を１０ｍＭＴｒｉ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５、抗
生物質添加）に再懸濁し、２５０ｍＬ容アーレンマイヤ
ーフラスコに移し、振とうすることなく３０℃で１６〜
１０時間培養した（飢餓相）。この飢餓相後、細胞数を
再度決定して、上記同様に遠心分離し、細胞を１０ｍＭ
Ｔｒｉ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を用いて細胞濃度５×１
０6個/ｍＬに調節した。このうちの細胞懸濁液１ｍＬを
形質転換に使用した。形質転換は小核衝撃法（下記に説
明する）で行った。再生するために、細胞をアーレンマ
イヤーフラスコのＳＰＰＡ培地に取り、振とうすること
なしに３０℃で培養した。３時間培養した後、最終濃度
２０μｍのパクリタクセルを添加し、アリコート１００
μＬの細胞を９６ウエルマイクロタイタープレートに移
した。得られた細胞を湿らせて暗くしたボックス中にお
いて３０℃で培養した。２〜３日後、パクリタクセル耐
性クローンが同定された。陽性のクローンを２５μｍパ
クリタクセル添加の新規培地で再培養した。パクリタク
セル濃度を増加して（８０μｍまで）培養することによ
って、完全「フェノタイプ・アソートメント（phenotyp
ic assortment）」に達した（Gaertig & Kapler (199
9)）（非特許文献３０）。
【００３８】クローンの分析のために、ＳＰＰＡ培養液
約４ｍＬをパクリタクセルを用いて培養し、ＤＮＡを単
離し（Jacek Gaertig et al. (1994) PNAS 91: 4549-45
53）（非特許文献３１）、ＤＮＡをＢＴＵ１遺伝子座に
組込み、ＰＣＲで増幅した。下記配列を有するＢＴＵ１
特異的プライマーは、開始コドンの約５０ｂｐ前および
停止コドンの３ｂｐ後にそれぞれあるプライマーとして
使用した。 BTU1-5’F (AAAAATAAAAAAGTTTGAAAAAAAACCTTC （配列番号３） BTU1-3R’ GTTTAGCTGACCGATTCAGTTC （配列番号４） 得られたＰＣＲ生産物は、１％アガロースゲル上で制限
酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｃＩまたはＰｓｔＩを用いて
切断されるかまたは切断されないかを分析した。完全
「フェノタイプ・アソートメント」を、ＢＴＵ１特異的
プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲによって検査した（Ga
ertig & Kapler (1999)）（非特許文献３０）。
約４ｍＬをパクリタクセルを用いて培養し、ＤＮＡを単
離し（Jacek Gaertig et al. (1994) PNAS 91: 4549-45
53）（非特許文献３１）、ＤＮＡをＢＴＵ１遺伝子座に
組込み、ＰＣＲで増幅した。下記配列を有するＢＴＵ１
特異的プライマーは、開始コドンの約５０ｂｐ前および
停止コドンの３ｂｐ後にそれぞれあるプライマーとして
使用した。 BTU1-5’F (AAAAATAAAAAAGTTTGAAAAAAAACCTTC （配列番号３） BTU1-3R’ GTTTAGCTGACCGATTCAGTTC （配列番号４） 得られたＰＣＲ生産物は、１％アガロースゲル上で制限
酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｃＩまたはＰｓｔＩを用いて
切断されるかまたは切断されないかを分析した。完全
「フェノタイプ・アソートメント」を、ＢＴＵ１特異的
プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲによって検査した（Ga
ertig & Kapler (1999)）（非特許文献３０）。
【００３９】実施例５：デルタ−６−デサチュラーゼを
ノックアウトした構成体ｐｇＤＥＳ６：：ｎｅｏの作成 ノックアウト構成体を作成するために、プラスミドｐ４
Ｔ２−１ΔＨ３からのネオ−カセット（ドイツ特許出願
番号DE 199 57 889 A1）（特許文献５）を、デルタ−６
−デサチュラーゼのゲノム配列中に挿入した。この遺伝
子は、テトラヒメナのヒストンＨ４プロモーターと、Ｂ
ＴＵ２遺伝子の３’フランキング配列との制御下にある
ネオマイシン耐性遺伝子である。テトラヒメナ中のこの
構成体は、パロモマイシン耐性を仲介する。プラスミド
ｐ４Ｔ２−１ΔＨ３はＥｃｏＲＶ/ＳｍａＩで切断さ
れ、上記ネオ−カセットを含むほぼ１．４ｋｂフラグメ
ントを、ＥｃｏＲＶで切断したプラスミドｐｇＤＥＳ６
（ドイツ特許出願番号DE 10044 461 A1）（特許文献
６）を用いてテトラヒメナのデルタ−６−デサチュラー
ゼ（図５参照）のゲノム配列中に結合した。これによっ
て、プラスミドｐｇＤＥＳ６：：ｎｅｏが作成された。
形質転換中、デルタ−６−デサチュラーゼに対する遺伝
子は、相同組換えによって、この構成体と置換されて、
細胞のパロモマイシン耐性が仲介された。
ノックアウトした構成体ｐｇＤＥＳ６：：ｎｅｏの作成 ノックアウト構成体を作成するために、プラスミドｐ４
Ｔ２−１ΔＨ３からのネオ−カセット（ドイツ特許出願
番号DE 199 57 889 A1）（特許文献５）を、デルタ−６
−デサチュラーゼのゲノム配列中に挿入した。この遺伝
子は、テトラヒメナのヒストンＨ４プロモーターと、Ｂ
ＴＵ２遺伝子の３’フランキング配列との制御下にある
ネオマイシン耐性遺伝子である。テトラヒメナ中のこの
構成体は、パロモマイシン耐性を仲介する。プラスミド
ｐ４Ｔ２−１ΔＨ３はＥｃｏＲＶ/ＳｍａＩで切断さ
れ、上記ネオ−カセットを含むほぼ１．４ｋｂフラグメ
ントを、ＥｃｏＲＶで切断したプラスミドｐｇＤＥＳ６
（ドイツ特許出願番号DE 10044 461 A1）（特許文献
６）を用いてテトラヒメナのデルタ−６−デサチュラー
ゼ（図５参照）のゲノム配列中に結合した。これによっ
て、プラスミドｐｇＤＥＳ６：：ｎｅｏが作成された。
形質転換中、デルタ−６−デサチュラーゼに対する遺伝
子は、相同組換えによって、この構成体と置換されて、
細胞のパロモマイシン耐性が仲介された。
【００４０】実施例６：ノックアウトした構成体ｐｇＴ
ＨＣ：：ｎｅｏおよびｐｇＤＥＳ６：：ｎｅｏによるテ
トラヒメナの小核ならびに大核形質転換 異なる対形成型のテトラヒメナ株（ＣＵ４２８ＶＩＩお
よびＢ２０８６ＩＩ）を、別々に、アーレンマイヤーフ
ラスコ中で、ＳＰＰ培地を用いて３０℃で振とう（１５
０ｒｐｍ）培養した。細胞密度３〜５×１０５個/ｍＬ
の細胞を室温で５分間遠心分離した（１２００ｇ）。得
られた細胞を１０ｍトリスＭＨＣｌ（ｐＨ７．５）５０
ｍＬで３回洗浄し、最後に１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ
７．５）５０ｍＬに再懸濁した後、抗生物質溶液と混合
した。その後、混合溶液をアーレンマイヤーフラスコ中
で振とうすることなしに３０℃で培養した。約４時間
後、両方の培養液中の細胞数を再決定して、１０ｍＭト
リスＨＣｌ（ｐＨ７．５）を用いて細胞密度を３×１０
５個/ｍＬに設定した。次に、細胞液を更に１６〜２０
時間３０℃で培養した。この飢餓相後、両培養液から同
じ数（絶対数）の細胞を２Ｌ容アーレンマイヤーフラス
コ中に入れて混合した。得られた細胞を３０℃で培養し
（接合開始）、２時間後に接合の効率を決定した。有効
な形質転換のためには、約３０％の細胞が対としてこの
時点で存在していなければならなかった。小核形質転換
のために、１×１０７個の接合細胞（５×１０５個の
対）を、接合後、３時間、３．５時間、４時間および
４．５時間経過して、１２００ｇで５分間遠心分離し、
得られた細胞ペレットを１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ
７．５）１ｍＬに再懸濁した。新規な大核チャージの形
質転換のために、細胞を、接合開始後、１１時間して、
上記と同様にして遠心分離し、得られた細胞ペレットを
トリスＨＣｌに再懸濁した。
ＨＣ：：ｎｅｏおよびｐｇＤＥＳ６：：ｎｅｏによるテ
トラヒメナの小核ならびに大核形質転換 異なる対形成型のテトラヒメナ株（ＣＵ４２８ＶＩＩお
よびＢ２０８６ＩＩ）を、別々に、アーレンマイヤーフ
ラスコ中で、ＳＰＰ培地を用いて３０℃で振とう（１５
０ｒｐｍ）培養した。細胞密度３〜５×１０５個/ｍＬ
の細胞を室温で５分間遠心分離した（１２００ｇ）。得
られた細胞を１０ｍトリスＭＨＣｌ（ｐＨ７．５）５０
ｍＬで３回洗浄し、最後に１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ
７．５）５０ｍＬに再懸濁した後、抗生物質溶液と混合
した。その後、混合溶液をアーレンマイヤーフラスコ中
で振とうすることなしに３０℃で培養した。約４時間
後、両方の培養液中の細胞数を再決定して、１０ｍＭト
リスＨＣｌ（ｐＨ７．５）を用いて細胞密度を３×１０
５個/ｍＬに設定した。次に、細胞液を更に１６〜２０
時間３０℃で培養した。この飢餓相後、両培養液から同
じ数（絶対数）の細胞を２Ｌ容アーレンマイヤーフラス
コ中に入れて混合した。得られた細胞を３０℃で培養し
（接合開始）、２時間後に接合の効率を決定した。有効
な形質転換のためには、約３０％の細胞が対としてこの
時点で存在していなければならなかった。小核形質転換
のために、１×１０７個の接合細胞（５×１０５個の
対）を、接合後、３時間、３．５時間、４時間および
４．５時間経過して、１２００ｇで５分間遠心分離し、
得られた細胞ペレットを１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ
７．５）１ｍＬに再懸濁した。新規な大核チャージの形
質転換のために、細胞を、接合開始後、１１時間して、
上記と同様にして遠心分離し、得られた細胞ペレットを
トリスＨＣｌに再懸濁した。
【００４１】形質転換はミクロ粒子衝撃法によって発生
した（下記参照）。テトラヒマノール−サイクラーゼを
ノックアウトした変異体を培養するために、コレステロ
ール１０μｇ/ｍＬを培地に添加した。デルタ−６−デ
サチュラーゼをノックアウトした変異体を培養するため
に、ボラージュ（Ｂｏｒａｇｅ）オイル（20-25% GLA;
SIGMA）２００μｇ/ｍＬを培地に添加した。パロモマイ
シン耐性に対する選択によって形質転換された細胞を同
定することができた。小核の形質転換中、接合開始１１
時間後、パロモマイシン（最終濃度１００μｇ/ｍＬ）
を添加した後、アリコート１００μＬずつを９６ウエル
マイクロタイタープレートの各ウエルに分配した。つい
で、その細胞を湿ったボックス中３０℃で培養し、２な
いし３日後、耐性クローンが同定した。真正の小核形質
転換体は、６−メチルプリンに対する耐性によって大核
形質転換体と区別できた。大核の形質転換の間、形質転
換後約４時間経過して、パロモマイシン（最終濃度１０
０μｇ/ｍＬ）を添加し、アリコート１００μＬずつを
９６ウエルマイクロタイタープレートの各ウエルに分配
した。次いで、その細胞を湿ったボックス中３０℃で培
養した。２ないし３日後、耐性クローンを同定した。陽
性クローンをパロモマイシン１２０μｇ/ｍＬを添加し
た新規な培地で再培養した。このように高濃度のパロモ
マイシンの存在下で細胞を培養することによって、数世
代後に完全「フェノタイプ・アソートメント（phenotyp
ic assortment）」に達した（Gaertig & Kapler (199
9)）（非特許文献３０）。得られた小核形質転換体をＢ
＊ＶＩ株と交差させることによって、同型接合のノック
アウト変異体を作成した（Bruns & Cassidy-Hanley, Me
thods in Cell Biology, Volume 62 (1999) 229-240）
（非特許文献３１）。
した（下記参照）。テトラヒマノール−サイクラーゼを
ノックアウトした変異体を培養するために、コレステロ
ール１０μｇ/ｍＬを培地に添加した。デルタ−６−デ
サチュラーゼをノックアウトした変異体を培養するため
に、ボラージュ（Ｂｏｒａｇｅ）オイル（20-25% GLA;
SIGMA）２００μｇ/ｍＬを培地に添加した。パロモマイ
シン耐性に対する選択によって形質転換された細胞を同
定することができた。小核の形質転換中、接合開始１１
時間後、パロモマイシン（最終濃度１００μｇ/ｍＬ）
を添加した後、アリコート１００μＬずつを９６ウエル
マイクロタイタープレートの各ウエルに分配した。つい
で、その細胞を湿ったボックス中３０℃で培養し、２な
いし３日後、耐性クローンが同定した。真正の小核形質
転換体は、６−メチルプリンに対する耐性によって大核
形質転換体と区別できた。大核の形質転換の間、形質転
換後約４時間経過して、パロモマイシン（最終濃度１０
０μｇ/ｍＬ）を添加し、アリコート１００μＬずつを
９６ウエルマイクロタイタープレートの各ウエルに分配
した。次いで、その細胞を湿ったボックス中３０℃で培
養した。２ないし３日後、耐性クローンを同定した。陽
性クローンをパロモマイシン１２０μｇ/ｍＬを添加し
た新規な培地で再培養した。このように高濃度のパロモ
マイシンの存在下で細胞を培養することによって、数世
代後に完全「フェノタイプ・アソートメント（phenotyp
ic assortment）」に達した（Gaertig & Kapler (199
9)）（非特許文献３０）。得られた小核形質転換体をＢ
＊ＶＩ株と交差させることによって、同型接合のノック
アウト変異体を作成した（Bruns & Cassidy-Hanley, Me
thods in Cell Biology, Volume 62 (1999) 229-240）
（非特許文献３１）。
【００４２】実施例７：実施例４：バイオリステイック
（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）形質転換（マイクロ粒子衝撃
法） テトラヒメナ・テルモフィラの形質転換を、文献に記載
されているようなバイオリステイック（ｂｉｏｌｉｓｔ
ｉｃ）形質転換によって行った（Burns & Cassidy-Hanl
ey: Methods in Cell Biology, Volume 62 (1999) 501-
512); Gaertiget al. (1999) Nature Biotech. 17: 462
-465; Cassidy-Hanley et al. (1997 Genetics 146: 13
5-147)）（非特許文献３２）。バイオリステイックＰＤ
Ｓ１０００/Ｈｅパーテイクルデリバリーシステム（Bio
listic（登録商標）PDS-1000/He Particle Delivery Sy
stem (BIO-RAD)）は対応するハンドブックに詳細に記載
されている。形質転換には、金粒子（０．６μｍ；ＢＩ
Ｏ−ＲＡＤ）６ｍｇを線状化したプラスミドＤＮＡに装
填した（Sanford et al. (1991) Biotechniques 3:3-1
6; Bruns & Cassidy-Hanley (1999) Methods in Cell B
iology, Volume 62: 501-512）（非特許文献３３）。 金粒子の製造：０．６μｍの金粒子（ＢＩＯ−ＲＡＤ）
６０ｍｇをエタノール１ｍＬ中に再懸濁した。この目的
のために、その粒子を３度それぞれ１〜２分間渦巻き状
に激しく混合した。次いで、粒子を１分間遠心分離（１
００００ｒｐｍ）し、その上清をピペットで注意深く除
去した。得られた金粒子を殺菌水１ｍＬ中に再懸濁し、
上記と同様に遠心分離した。この洗浄工程を１度繰り返
して、得られた粒子を５０％グリセロール１ｍＬに再懸
濁し、そのアリコート１００μＬを２０℃で保存した。
（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）形質転換（マイクロ粒子衝撃
法） テトラヒメナ・テルモフィラの形質転換を、文献に記載
されているようなバイオリステイック（ｂｉｏｌｉｓｔ
ｉｃ）形質転換によって行った（Burns & Cassidy-Hanl
ey: Methods in Cell Biology, Volume 62 (1999) 501-
512); Gaertiget al. (1999) Nature Biotech. 17: 462
-465; Cassidy-Hanley et al. (1997 Genetics 146: 13
5-147)）（非特許文献３２）。バイオリステイックＰＤ
Ｓ１０００/Ｈｅパーテイクルデリバリーシステム（Bio
listic（登録商標）PDS-1000/He Particle Delivery Sy
stem (BIO-RAD)）は対応するハンドブックに詳細に記載
されている。形質転換には、金粒子（０．６μｍ；ＢＩ
Ｏ−ＲＡＤ）６ｍｇを線状化したプラスミドＤＮＡに装
填した（Sanford et al. (1991) Biotechniques 3:3-1
6; Bruns & Cassidy-Hanley (1999) Methods in Cell B
iology, Volume 62: 501-512）（非特許文献３３）。 金粒子の製造：０．６μｍの金粒子（ＢＩＯ−ＲＡＤ）
６０ｍｇをエタノール１ｍＬ中に再懸濁した。この目的
のために、その粒子を３度それぞれ１〜２分間渦巻き状
に激しく混合した。次いで、粒子を１分間遠心分離（１
００００ｒｐｍ）し、その上清をピペットで注意深く除
去した。得られた金粒子を殺菌水１ｍＬ中に再懸濁し、
上記と同様に遠心分離した。この洗浄工程を１度繰り返
して、得られた粒子を５０％グリセロール１ｍＬに再懸
濁し、そのアリコート１００μＬを２０℃で保存した。
【００４３】形質転換体の製法：マクロキャリアーホル
ダー、マクロキャリアーおよびストップスクリーンを１
００％エタノール中に数時間保存し、破裂デイスクをイ
ソプロパノールに保存した。次いで、マクロキャリアー
をマクロキャリアーホルダー中に挿入した後、空気乾燥
した。 金ＤＮＡの粒子への装填：全ての仕事は４℃で行なっ
た。金粒子、作成したベクター、２．５ＭＣａＣｌ２、
１Ｍスパーミジン、７０％と１００％エタノールを氷上
で冷却した。線状化ベクターＤＮＡ（１μｇ/ ｍＬ）１
０μＬを作成した金粒子１００μＬに添加し、１０秒間
注意深く渦巻き状に振とうした。次いで、２．５ＭＣａ
Ｃｌ２１００μＬをまず添加して、１０秒間渦巻き状に
振とうした後、１Ｍスパーミジン４０μＬを添加して１
０秒間注意深く渦巻き状に振とうした。更に、７０％エ
タノール２００μＬを添加した後、得られた粒子を１分
間渦巻き状に振とうした後、１００００ｒｐｍで１分間
遠心分離した。得られたペレットを１００％エタノール
に再懸濁し、遠心分離した後、１００％エタノール３５
μＬに再懸濁した。上記のように作成した粒子をピペッ
トでマクロキャリアーの中心に注意深く導入した。次い
で、形質転換のために、マクロキャリアーを吸湿性のシ
リカゲルを詰めたボックス中に保存した。
ダー、マクロキャリアーおよびストップスクリーンを１
００％エタノール中に数時間保存し、破裂デイスクをイ
ソプロパノールに保存した。次いで、マクロキャリアー
をマクロキャリアーホルダー中に挿入した後、空気乾燥
した。 金ＤＮＡの粒子への装填：全ての仕事は４℃で行なっ
た。金粒子、作成したベクター、２．５ＭＣａＣｌ２、
１Ｍスパーミジン、７０％と１００％エタノールを氷上
で冷却した。線状化ベクターＤＮＡ（１μｇ/ ｍＬ）１
０μＬを作成した金粒子１００μＬに添加し、１０秒間
注意深く渦巻き状に振とうした。次いで、２．５ＭＣａ
Ｃｌ２１００μＬをまず添加して、１０秒間渦巻き状に
振とうした後、１Ｍスパーミジン４０μＬを添加して１
０秒間注意深く渦巻き状に振とうした。更に、７０％エ
タノール２００μＬを添加した後、得られた粒子を１分
間渦巻き状に振とうした後、１００００ｒｐｍで１分間
遠心分離した。得られたペレットを１００％エタノール
に再懸濁し、遠心分離した後、１００％エタノール３５
μＬに再懸濁した。上記のように作成した粒子をピペッ
トでマクロキャリアーの中心に注意深く導入した。次い
で、形質転換のために、マクロキャリアーを吸湿性のシ
リカゲルを詰めたボックス中に保存した。
【００４４】形質転換：製造した細胞（上記参照）１ｍ
Ｌを円形フイルターの中心に導入し、１０ｍＭｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を用いてペトリ皿中で湿らせ
て、バイオリステイックＰＤＳ−１０００/Ｈｅパーテ
イクルデリバリシステムの形質転換チェンバーの最下層
の挿入ストリップ中に導入した。作成した金粒子を用い
て、圧力９００ｐｓｉ（４５０ｐｓｉ破裂デイスク２
個）、真空度２７インチＨｇで形質転換チェンバー中で
形質転換を行なった。次いで、得られた細胞をＳＰＰＡ
培地５０ｍＬを入れたアーレンマイヤーフラスコに直ち
に移し、振とうすることなく３０℃で培養した。
Ｌを円形フイルターの中心に導入し、１０ｍＭｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を用いてペトリ皿中で湿らせ
て、バイオリステイックＰＤＳ−１０００/Ｈｅパーテ
イクルデリバリシステムの形質転換チェンバーの最下層
の挿入ストリップ中に導入した。作成した金粒子を用い
て、圧力９００ｐｓｉ（４５０ｐｓｉ破裂デイスク２
個）、真空度２７インチＨｇで形質転換チェンバー中で
形質転換を行なった。次いで、得られた細胞をＳＰＰＡ
培地５０ｍＬを入れたアーレンマイヤーフラスコに直ち
に移し、振とうすることなく３０℃で培養した。
【００４５】実施例８：ゲノムテトラヒマノール−サイ
クラーゼプラスミドｐｇＴＨＣによるテトラヒマノール
ノツクアウト変異体の再作成−形質転換 形質転換は実施例４と同様にして行った。テトラヒメナ
・テルモフィラからのテトラヒマノールノツクアウト変
異体（実施例参照）を形質転換に使用した。細胞の培養
をコレステロール１０ｍｇ/ｍＬを添加したＳＰＰＡ培
地中で行った。ゲノムテトラヒマノール−サイクラーゼ
（図１参照）のゲノム断片での形質転換（上記参照）
後、細胞をコレステロール無添加のＳＰＰＡ培地に取
り、アーレンマイヤーフラスコを用いて振とうせずに３
０℃で培養した。３時間後、得られた細胞をアリコート
１００μＬずつ９６ウエルマイクロタイタープレートの
各ウエルに移し、得られた細胞を湿らせ暗くしたボック
ス中で３０℃で培養した。２〜３日後、第１のコレステ
ロール栄養要求性クローンを同定した。約５〜７日後、
陽性クローンを新規培地中に再播種した。約２週間細胞
を再播種し、個別の細胞を繰り返し単離することによっ
て、完全な「フェノタイプアソートメント」が達成され
た（Gaertig & Kapler (1999)）（非特許文献３０）。
これらのクローンは対照としてパロモマイシンを添加し
てＳＰＰＡ培地中で培養した。約３〜５日後、培養菌株
の全てが死んでいた。得られたクローンは、相同組換え
によりネオ遺伝子が損失したことによってパロモマイシ
ン耐性を欠失した。
クラーゼプラスミドｐｇＴＨＣによるテトラヒマノール
ノツクアウト変異体の再作成−形質転換 形質転換は実施例４と同様にして行った。テトラヒメナ
・テルモフィラからのテトラヒマノールノツクアウト変
異体（実施例参照）を形質転換に使用した。細胞の培養
をコレステロール１０ｍｇ/ｍＬを添加したＳＰＰＡ培
地中で行った。ゲノムテトラヒマノール−サイクラーゼ
（図１参照）のゲノム断片での形質転換（上記参照）
後、細胞をコレステロール無添加のＳＰＰＡ培地に取
り、アーレンマイヤーフラスコを用いて振とうせずに３
０℃で培養した。３時間後、得られた細胞をアリコート
１００μＬずつ９６ウエルマイクロタイタープレートの
各ウエルに移し、得られた細胞を湿らせ暗くしたボック
ス中で３０℃で培養した。２〜３日後、第１のコレステ
ロール栄養要求性クローンを同定した。約５〜７日後、
陽性クローンを新規培地中に再播種した。約２週間細胞
を再播種し、個別の細胞を繰り返し単離することによっ
て、完全な「フェノタイプアソートメント」が達成され
た（Gaertig & Kapler (1999)）（非特許文献３０）。
これらのクローンは対照としてパロモマイシンを添加し
てＳＰＰＡ培地中で培養した。約３〜５日後、培養菌株
の全てが死んでいた。得られたクローンは、相同組換え
によりネオ遺伝子が損失したことによってパロモマイシ
ン耐性を欠失した。
【００４６】実施例９：デルタ−６−デサチュラーゼプ
ラスミドｐｇＤＥＳ６によるデルタ−６−デサチュラー
ゼをノックアウトした変異体の再作成−形質転換 形質転換は実施例４と同様にして行った。形質転換のた
めに、テトラヒメナ・テルモフィラのデルタ−６−デサ
チュラーゼ・ノツクアウト変異体（実施例５を参照）を
使用した。この細胞の培養を、ボラージオイル（20-25%
GLA; SIGMA）２００μｇ/ｍＬを添加したＳＰＰＡ培地
中で行った。ゲノムデルタ−６−デサチュラーゼフラグ
メント（図６参照）で形質転換した（上記参照）後、得
られた細胞をボラージオイル無添加ＳＰＰＡ培地に取
り、アーレンマイヤーフラスコを用いて振とうせずに３
０℃で培養した。３時間後、得られた細胞をアリコート
１００μＬずつ９６ウエルマイクロタイタープレートの
各ウエルに移し、細胞を湿らせ暗くしたボックス中で３
０℃で培養した。約２〜３日後、第１のＧＬＡ栄養要求
性クローンを同定した。約５〜７日後、陽性クローンを
新規培地中に再播種した。約２週間細胞を再播種して個
別の細胞を繰り返し単離することによって、完全な「フ
ェノタイプ・アソートメント」が達成された（Gaertig
& Kapler (1999)）（非特許文献３０）。これらのクロ
ーンは対照のためにパロモマイシンを添加したＳＰＰＡ
培地中で培養した。３〜５日後、培養菌株の全てが死ん
でいた。得られたクローンは、相同組換えによりネオ遺
伝子が損失してパロモマイシン耐性を欠失した。
ラスミドｐｇＤＥＳ６によるデルタ−６−デサチュラー
ゼをノックアウトした変異体の再作成−形質転換 形質転換は実施例４と同様にして行った。形質転換のた
めに、テトラヒメナ・テルモフィラのデルタ−６−デサ
チュラーゼ・ノツクアウト変異体（実施例５を参照）を
使用した。この細胞の培養を、ボラージオイル（20-25%
GLA; SIGMA）２００μｇ/ｍＬを添加したＳＰＰＡ培地
中で行った。ゲノムデルタ−６−デサチュラーゼフラグ
メント（図６参照）で形質転換した（上記参照）後、得
られた細胞をボラージオイル無添加ＳＰＰＡ培地に取
り、アーレンマイヤーフラスコを用いて振とうせずに３
０℃で培養した。３時間後、得られた細胞をアリコート
１００μＬずつ９６ウエルマイクロタイタープレートの
各ウエルに移し、細胞を湿らせ暗くしたボックス中で３
０℃で培養した。約２〜３日後、第１のＧＬＡ栄養要求
性クローンを同定した。約５〜７日後、陽性クローンを
新規培地中に再播種した。約２週間細胞を再播種して個
別の細胞を繰り返し単離することによって、完全な「フ
ェノタイプ・アソートメント」が達成された（Gaertig
& Kapler (1999)）（非特許文献３０）。これらのクロ
ーンは対照のためにパロモマイシンを添加したＳＰＰＡ
培地中で培養した。３〜５日後、培養菌株の全てが死ん
でいた。得られたクローンは、相同組換えによりネオ遺
伝子が損失してパロモマイシン耐性を欠失した。
【００４７】実施例１０：ネオマイシン遺伝子を結合し
たプラスミドｐｇＴＨＣによる再作成―形質転換 形質転換は実施例７と同様に行なった。次ぎのようにし
て構成したベクターを使用した。テトラヒマノール−サ
イクラーゼ（ｐｇＴＨＣ）のゲノムフラグメントを制限
酵素Ｂｇ１ＩＩで切断した。この酵素は、３’非翻訳領
域中の位置４５３７のコードエキソン外のゲノムフラグ
メントを切断する。両端をスムーズにするためにＴ４Ｄ
ＮＡボリメラーゼと一緒に培養した後、ネオマイシンカ
セットをプラスミド中に結合した。このために、プラス
ミドｐ４Ｔ２−１ΔＨ３をＥｃｏＲＶ/ＳｍａＩで切断
し、上記ネオ−カセットを含んでいるほぼ１．４ｋｂ断
片をすでに切断したプラスミドｐｇＴＨＣのテトラヒメ
ナのトリテルペノイド―サイクラーゼの３’非翻訳配列
中に結合した。この構成体（ｐｇＴＨＣ＋ｎｅｏ、図４
参照）をテトラヒマノール変異体の形質転換のために使
用した。形質転換（上記参照）した後、得られた細胞を
コレステロール無添加のＳＰＰＡ培地に取り、アーレン
マイヤーフラスコ中で振とうせずに３０℃で培養した。
３時間後、パロモマイシンを添加して、得られた細胞を
アリコート１００μＬずつ９６ウエルマイクロタイター
プレートの各ウエルに移し、得られた細胞を湿らせ暗く
したボックス中で３０℃で培養した。約２〜３日後、第
１のコレステロール栄養要求性であると共に、同時にパ
ロモマイシンに対して耐性を有しているクローンが同定
された。得られた陽性クローンを、コレステロールまた
はパロモマイシンを添加した新規培地中に再播種した。
約２週間細胞を再播種して個別の細胞を繰り返し単離す
ることによって、完全な「フェノタイプアソートメン
ト」が達成された（Gaertig & Kapler (1999)）（非特
許文献３０）。これらの細胞は、パロモマイシンを添加
した後でさえ良好な生育を示した。
たプラスミドｐｇＴＨＣによる再作成―形質転換 形質転換は実施例７と同様に行なった。次ぎのようにし
て構成したベクターを使用した。テトラヒマノール−サ
イクラーゼ（ｐｇＴＨＣ）のゲノムフラグメントを制限
酵素Ｂｇ１ＩＩで切断した。この酵素は、３’非翻訳領
域中の位置４５３７のコードエキソン外のゲノムフラグ
メントを切断する。両端をスムーズにするためにＴ４Ｄ
ＮＡボリメラーゼと一緒に培養した後、ネオマイシンカ
セットをプラスミド中に結合した。このために、プラス
ミドｐ４Ｔ２−１ΔＨ３をＥｃｏＲＶ/ＳｍａＩで切断
し、上記ネオ−カセットを含んでいるほぼ１．４ｋｂ断
片をすでに切断したプラスミドｐｇＴＨＣのテトラヒメ
ナのトリテルペノイド―サイクラーゼの３’非翻訳配列
中に結合した。この構成体（ｐｇＴＨＣ＋ｎｅｏ、図４
参照）をテトラヒマノール変異体の形質転換のために使
用した。形質転換（上記参照）した後、得られた細胞を
コレステロール無添加のＳＰＰＡ培地に取り、アーレン
マイヤーフラスコ中で振とうせずに３０℃で培養した。
３時間後、パロモマイシンを添加して、得られた細胞を
アリコート１００μＬずつ９６ウエルマイクロタイター
プレートの各ウエルに移し、得られた細胞を湿らせ暗く
したボックス中で３０℃で培養した。約２〜３日後、第
１のコレステロール栄養要求性であると共に、同時にパ
ロモマイシンに対して耐性を有しているクローンが同定
された。得られた陽性クローンを、コレステロールまた
はパロモマイシンを添加した新規培地中に再播種した。
約２週間細胞を再播種して個別の細胞を繰り返し単離す
ることによって、完全な「フェノタイプアソートメン
ト」が達成された（Gaertig & Kapler (1999)）（非特
許文献３０）。これらの細胞は、パロモマイシンを添加
した後でさえ良好な生育を示した。
【００４８】実施例１１：ネオマイシン遺伝子を結合し
たプラスミドｐｇＤＥＳ６による再作成―形質転換 形質転換は実施例９と同様に行なうことができる。次ぎ
のようにして構成されたベクターを使用した。デルタ−
６−デサチュラーゼ（ｐｇＤＥＳ６）のゲノムフラグメ
ントを制限酵素ＳｍａＢＩで切断した。この酵素は、
５’非翻訳領域中の位置７４７のコードエキソン外のゲ
ノムフラグメントを切断する。プラスミドｐ４Ｔ２−１
ΔＨ３をＥｃｏＲＶ/ＳｍａＩで切断し、上記ネオ−カ
セットを含んでいるほぼ１．４ｋｂ断片を、テトラヒメ
ナのデルタ−６−デサチュラーゼの５’非翻訳配列中の
すでに切断したプラスミドｐｇＤＥＳ６に結合した。こ
の構成体（ｐｇＤＥＳ６＋ｎｅｏ、図７参照）をデルタ
−６−デサチュラーゼ変異体の形質転換のために使用し
た。形質転換（上記参照）した後、得られた細胞をボラ
ージオイル無添加のＳＰＰＡ培地に取り、アーレンマイ
ヤーフラスコ中で振とうせずに３０℃で培養した。３時
間後、パロモマイシンを添加して、得られた細胞をアリ
コート１００μＬずつ９６ウエルマイクロタイタープレ
ートの各ウエルに移し、得られた細胞を湿らせ暗くした
ボックス中で３０℃で培養した。約２〜３日後、第１の
コレステロール栄養要求性であると共に、同時にパロモ
マイシンに対して耐性を有しているクローンが同定され
た。得られた陽性クローンを、コレステロールまたはパ
ロモマイシンを含んでいる新規培地中に再播種した。約
２週間細胞を再播種して個別の細胞を繰り返し単離する
ことによって、完全な「フェノタイプ・アソートメン
ト」が達成された（Gaertig & Kapler (1999)）（非特
許文献３０）。これらの細胞は、パロモマイシンを添加
した後でさえ良好な生育を示した。
たプラスミドｐｇＤＥＳ６による再作成―形質転換 形質転換は実施例９と同様に行なうことができる。次ぎ
のようにして構成されたベクターを使用した。デルタ−
６−デサチュラーゼ（ｐｇＤＥＳ６）のゲノムフラグメ
ントを制限酵素ＳｍａＢＩで切断した。この酵素は、
５’非翻訳領域中の位置７４７のコードエキソン外のゲ
ノムフラグメントを切断する。プラスミドｐ４Ｔ２−１
ΔＨ３をＥｃｏＲＶ/ＳｍａＩで切断し、上記ネオ−カ
セットを含んでいるほぼ１．４ｋｂ断片を、テトラヒメ
ナのデルタ−６−デサチュラーゼの５’非翻訳配列中の
すでに切断したプラスミドｐｇＤＥＳ６に結合した。こ
の構成体（ｐｇＤＥＳ６＋ｎｅｏ、図７参照）をデルタ
−６−デサチュラーゼ変異体の形質転換のために使用し
た。形質転換（上記参照）した後、得られた細胞をボラ
ージオイル無添加のＳＰＰＡ培地に取り、アーレンマイ
ヤーフラスコ中で振とうせずに３０℃で培養した。３時
間後、パロモマイシンを添加して、得られた細胞をアリ
コート１００μＬずつ９６ウエルマイクロタイタープレ
ートの各ウエルに移し、得られた細胞を湿らせ暗くした
ボックス中で３０℃で培養した。約２〜３日後、第１の
コレステロール栄養要求性であると共に、同時にパロモ
マイシンに対して耐性を有しているクローンが同定され
た。得られた陽性クローンを、コレステロールまたはパ
ロモマイシンを含んでいる新規培地中に再播種した。約
２週間細胞を再播種して個別の細胞を繰り返し単離する
ことによって、完全な「フェノタイプ・アソートメン
ト」が達成された（Gaertig & Kapler (1999)）（非特
許文献３０）。これらの細胞は、パロモマイシンを添加
した後でさえ良好な生育を示した。
【００４９】
［配列表］SEQUENCE LISTING
<110> Celanese Ventures GmbH
<120> Method and Marker for Simple Transformation and Selection of Reco
mbinant Protists
<130> 53047
<160> 4
<170> PatentIn Version 3.1
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
ctctttcata catgcataag atactcatag gc
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
ggcttggatc ctcaaatatt ttatttttat acagg
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
aaaaataaaa aagtttgaaa aaaaaccttc
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
gtttagctga ccgattcagt tc
【図１】テトラヒマノール遺伝子ｐｇＴＨＣの構造を示
す図。
す図。
【図２】テトラヒマノールノックアウト構成体ｐｇＴＨ
Ｃ：：ｎｅｏの構造を示す図。
Ｃ：：ｎｅｏの構造を示す図。
【図３】発現構成体ｐｇＢＴＨＣの構造を示す図。
【図４】テトラヒマノール―サイクラーゼ/ネオ構成体
ｐｇＴＨＣ＋ｎｅｏの構造を示す図。
ｐｇＴＨＣ＋ｎｅｏの構造を示す図。
【図５】デルタ−６−デサチュラーゼノックアウト構成
体ｐｇＤＥＳ６：：ｎｅｏの構造を示す図。
体ｐｇＤＥＳ６：：ｎｅｏの構造を示す図。
【図６】ゲノムデルタ−６−デサチュラーゼ遺伝子ｐｇ
ＤＥＳ６の構造を示す図。
ＤＥＳ６の構造を示す図。
【図７】ゲノムデルタ−６−デサチュラーゼ/ネオ構成
体ｐｇＤＥＳ６＋ｎｅｏの構造を示す図。
体ｐｇＤＥＳ６＋ｎｅｏの構造を示す図。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA07 BA80 CA01 CA03
CA06 DA02 DA20 EA03 EA04
FA10 GA11 HA01
4B064 AG01 CC24 DA01 DA20
4B065 AA86X AA86Y AB01 AC10
AC14 BA02 BA25 CA24 CA60
Claims (12)
- 【請求項１】 組換え原生生物の作成方法であって、該
原生生物の栄養要求性変異体を作成する作成工程（ａ）
と、対応する栄養要求性の相補のための少なくとも１個
の遺伝子を含む、組換えＤＮＡで該変異体を形質転換す
る形質転換工程（ｂ）と、対応する相補原生生物だけを
生育することができる最少培地で組換え原生生物を選択
する選択工程（ｃ）と、からなることを特徴とする組換
え原生生物の作成方法。 - 【請求項２】 請求項１に記載する作成方法において、
該栄養要求性変異体が必須遺伝子をノックアウトするこ
とによって生産されることを特徴とする組換え原生生物
の作成方法。 - 【請求項３】 請求項２に記載する作成方法において、
ノックアウトされた遺伝子がトリテルペノイド−サイク
ラーゼ、デルタ−６−デサチュラーゼまたはデルタ−９
−デサチュラーゼであることを特徴とする組換え原生生
物の作成方法。 - 【請求項４】 請求項１ないし３のいずれか１項に記載
する作成方法において、該原生生物が原生動物、好まし
くは繊毛生物、さらに好ましくはゾウリムシもしくはテ
トラヒメナ、特に好ましくはテトラヒメナ・テルモフィ
ラ（Tetrahymena thermophila）であることを特徴とす
る組換え原生生物の作成方法。 - 【請求項５】 請求項１ないし４のいずれか１項に記載
する作成方法において、該栄養要求性原生生物変異体を
形質転換するための組換えＤＮＡがトリテルペノイド−
サイクラーゼ、デルタ−６−デサチュラーゼまたはデル
タ−９−デサチュラーゼのための遺伝子を含んでいるこ
とを特徴とする組換え原生生物の作成方法。 - 【請求項６】 必須遺伝子がノックアウトされている変
異を含んでいることを特徴とする組換え原生生物。 - 【請求項７】 請求項６に記載する組換え原生生物にお
いて、該ノックアウトに由来する栄養要求性が組換えＤ
ＮＡによる原生生物の形質転換によって相補されること
を特徴とする組換え原生生物。 - 【請求項８】 請求項７に記載する組換え原生生物にお
いて、該組換えＤＮＡがトリテルペノイド−サイクラー
ゼ、デルタ−６−デサチュラーゼまたはデルタ−９−デ
サチュラーゼのための遺伝子を含んでいることを特徴と
する組換え原生生物。 - 【請求項９】 請求項６ないし８のいずれか１項に記載
する組換え原生生物において、該ノックアウトされた遺
伝子がトリテルペノイド−サイクラーゼ、デルタ−６−
デサチュラーゼまたはデルタ−９−デサチュラーゼをコ
ードしていることを特徴とする組換え原生生物。 - 【請求項１０】 請求項６ないし９のいずれか１項に記
載する組換え原生生物において、該原生生物が原生動
物、好ましくは繊毛生物、さらに好ましくはゾウリムシ
もしくはテトラヒメナ、特に好ましくはテトラヒメナ・
テルモフィラ（Tetrahymena thermophila）であること
を特徴とする組換え原生生物。 - 【請求項１１】 組換えタンパク質の作成方法であっ
て、該作成方法が、組換え原生生物の形質転換のための
組換えＤＮＡが、発現されるタンパク質に対する少なく
とも１個の機能的組換え遺伝子を更に含んでいるところ
の、請求項１ないし５のいずれか１項に記載する該原生
生物を作成する作成工程（ａ）と、該組換え原生生物を
培養して、該タンパク質を発現する工程（ｂ）と、該タ
ンパク質を単離する単離工程（ｃ）と、からなることを
特徴とする組換えタンパク質の作成方法。 - 【請求項１２】 請求項１１に記載する組換えタンパク
質の作成方法において、発現されるタンパク質に対する
該組換え遺伝子が脊椎動物、好ましくはヒトから単離さ
れることを特徴とする組換えタンパク質の作成方法。
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|---|---|---|---|
| DE10214406A DE10214406A1 (de) | 2002-03-30 | 2002-03-30 | Verfahren und Marker zur einfachen Transformation und Selektion von rekombinanten Protisten |
| DE10214406.0 | 2002-03-30 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003299491A true JP2003299491A (ja) | 2003-10-21 |
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|---|---|---|---|
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| Country | Link |
|---|---|
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007511238A (ja) * | 2003-11-19 | 2007-05-10 | ダウ グローバル テクノロジーズ インコーポレイティド | 改良タンパク質発現系 |
| JP2009508509A (ja) * | 2005-09-20 | 2009-03-05 | シリアン アクチェンゲゼルシャフト | テトラヒメナ二元機能性ジヒドロ葉酸還元酵素−チミジル酸合成酵素欠損およびその使用 |
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|---|---|---|---|---|
| GB2471093A (en) * | 2009-06-17 | 2010-12-22 | Cilian Ag | Viral protein expression in ciliates |
| GB201003701D0 (en) | 2010-03-05 | 2010-04-21 | Cilian Ag | System for the expression of a protein |
Citations (6)
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|---|---|---|---|---|
| JP2000050888A (ja) * | 1998-07-15 | 2000-02-22 | Roche Diagnostics Gmbh | 栄養要求性を相補することによる、抗生物質によらない選抜に基づく新規の大腸菌／宿主ベクタ―系 |
| WO2000046381A1 (en) * | 1999-02-04 | 2000-08-10 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Recombinant expression of heterologous nucleic acids in protozoa |
| WO2000058483A2 (en) * | 1999-03-26 | 2000-10-05 | Washington University | Protozoan expression system |
| WO2001020000A1 (de) * | 1999-09-10 | 2001-03-22 | Celanese Ventures Gmbh | Nucleinsäure aus tetrahymena kodierend für eine delta-6-desaturase, ihre herstellung und verwendung |
| WO2001032896A1 (en) * | 1999-11-05 | 2001-05-10 | Jena Bioscience Gmbh | Protein expression systems for non-pathogenic <i>kinetoplastidae</i> |
| JP2001211891A (ja) * | 1999-12-01 | 2001-08-07 | Celanese Ventures Gmbh | トリテルペノイドシクラーゼをコードするテトラヒメナ由来の新規核酸、その製造および応用 |
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| WO2000052176A1 (de) * | 1999-03-03 | 2000-09-08 | Cilian Ag | β-HEXOSAMINIDASE SOWIE DIESE KODIERENDE DNA-SEQUENZ AUS CILIATEN UND DEREN VERWENDUNG |
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2003
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2011
- 2011-12-29 US US13/339,454 patent/US20120172576A1/en not_active Abandoned
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