JP4434611B2 - テトラヒメナにおける組換えヒトタンパク質の発現方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、テトラヒメナでのヒトタンパク質の組換え発現方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
異種タンパク質発現による組換え（リコンビナント）タンパク質の生産は、天然資源からタンパク質を回収する選択肢の１つである。例えば、医薬品としてのタンパク質の天然資源は、しばしば非常に限定されていて、精製するのに非常に費用が掛かったり、または単に入手できない場合もある。また、かかる天然資源は、毒性があったりまたは特に感染性を有する物質が混入しているために、非常に問題がある場合もしばしばありうる。他方、現在では、バイオテクノロジーや遺伝子工学は、異種発現によって、一連のタンパク質を満足できる量を経済的にかつ安全に生産して、広範囲に適用することができるようになっている。かかるタンパク質としては、例えば、抗体（診断用、受動免疫用、研究用など）、ホルモン（治療用途のインスリン、エリスロポエチン（EPO）、インターロイキン類など）、酵素（例えば、食品技術、診断、研究用など）、血液因子（血友病処置用など）、ワクチンなどが挙げられる（Glick & Pasternak 1998, Molecular Biotechnology, ASM Press, Washing DC, Chapter 10: 227-252）（非特許文献１）。
【０００３】
医薬処方用ヒトタンパク質は、生化学的、生物物理的ならびに機能的性質が天然タンパク質と同一でなければならない。更に、異種遺伝子発現によってかかるタンパク質を組換え生産しているときには、細菌とは対照的に、真核細胞中においては、例えば、ジスルフィド架橋形成、前駆タンパク質のタンパク質分解的切断、リン酸化、アセチル化、アシル化、硫酸化、カルボン酸化、ミリスチル化、パルミチル化、特にグリコシル化などのアミノ酸残基修飾などの一連の翻訳後タンパク質修飾が発生することを留意する必要がある。加えて、真核細胞中のタンパク質は、しばしば、シャペロン（chaperones）が関与する複雑な機構によって正しい三次元的構造に導かれる。これらの修飾は、タンパク質の特定の構造的かつ機能的性質に関して、例えば、タンパク質の酵素活性、特異性（レセプター結合、細胞認識など）、折れ曲がり、溶解性などに関して非常に重要な役割を果たしている（Ashford & Platt 1998, in: Post-translational Processing - A Practical Approach Ed. Higgins & Hames, Oxford University Press, Chapter 4: 135-174）（非特許文献２）、（Glick & Pasternak 1998, Molecular Biotechnology, ASM Press, Washington DC, Chapter 7: 145-169）（非特許文献３）。
【０００４】
タンパク質の修飾がその自然構造から逸脱すると、そのタンパク質は不活性化したり、高いアレルギーポテンシャルを持ったりする。
したがって、細菌中でヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を生産すると、要求されたシャペロンが欠如したり、ジスルフィド架橋が正確には形成されなかったりして、タンパク質がしばしば不正に折り曲がったり、不溶性になったりする。したがって、ヒトドナー血液から天然ＨＳＡを生産する選択肢の１つとして、組換えＨＳＡを生産するために種々の真核産生システムが開発されつつある。その領域は、植物から、カビや、トランスジェニック動物や哺乳動物細胞にまで広がっている。
【０００５】
一連の細菌ならびに真核発現システムは組換えタンパク質の産生のためには確立しているけれども、（特に真核タンパク質において）起こりうるタンパク質修飾の全ての領域をカバーし、普遍的に使用することができるユニバーサルシステムは存在していない（Castillo 1995, Bioprocess Technology 21: 13-45; Geise et al. 1996, Prot. Expr. Purif. 8: 271-282; Verma et al. 1998 J. Immunological Methods 216: 165-181; Glick & Pasternak 1998, Molecular Biotechnology ASM Press, Washing DC, Chapter 7: 145-169）（非特許文献４）。しかしながら、また、いくつかの繁用されているシステムが、異常な、時には望ましくない翻訳後タンパク質修飾を起こすことは極めて問題である。酵母から組換え発現されたタンパク質は、時には、マンノース残基によって極めて強力にグリコシル化される（図１参照、タンパク質のグルコシル化）。酵母からのこれらのいわゆる「高マンノース」構造は、約８〜５０個のマンノース残基から構成されているので、最大で５〜９個のマンノース残基を有する哺乳動物細胞からのマンノースに富む（リッチ）グリコプロテインとは著しく異なっている（Moreman et al. 1994, Glycobiology 4(2): 113-125）（非特許文献５）。これらの酵母に典型的なマンノース構造は強力なアレルゲンであるので、これらを治療用途のための組換えグリコプロテイン生産に使用することは非常に問題である（Tuite et al. 1999, in Protein Expression - A Practical Approach, Ed. Higgins & Hames, Oxford University Press, Chapter 3: especially page 76）（非特許文献６）。また、酵母には、ハイブリッドもしくは複雑なグリコプロテイン構造が形成されないので、酵母を発現システムとして使用することは制限されている。他方、最近、植物が組換えタンパク質の産生システムとして論議されることが多くなってきて、その産生システムとして実際に使用されている。かかる植物は、哺乳動物に典型的なシアル酸に代わって、グリコプロテイン構造上にキシロースを有している（Ashford & Platt）（非特許文献２）。しかしながら、植物中に検出されるキシロースおよびα−１，３結合フコース類は、アレルギーの危険性を示しているので、問題でもある（Jenkins et al. 1996, Nature Biotech. 14: 975-981）（非特許文献７）。
【０００６】
その結果、特に、哺乳動物培養細胞による組換えタンパク質の非常に低価でかつ必要とされている生産方法の選択肢として、新規な真核発現システムを開発することが大きく要請されている。
【０００７】
かかるシステムは、下記の要求を充足しているのが理想的である。
（１）選択マーカーおよび調節的ＤＮＡ要素（例えば、転写ならびに翻訳シグナルなど）が入手できること。
（２）発現システムは、重要な真核翻訳後タンパク質修飾を有すべきであるが、ヒトに対するアレルゲンを産生しないこと。
（３）組換えタンパク質の生産は、例えば、単純な培地を用いた製造規模（数千リットルにもなりうる）での細胞または生物の発酵や、生産物の単純な処理などによって行うことができるように、できるだけ簡単でかつ経済的であること。細胞が発現タンパク質を細胞外に分泌できれば生産物の後処理が極めて有利でなると考えられる。このようになれば、生産物を含有している培養上清から細胞を簡単に分離することができ、かつ、細胞消化が完全に必要なくなれば、生産物の後処理中に分離すべき混入物の程度を実質的に減少することができることになる。
【０００８】
原生動物、つまり原生生物（定義については、Henderson's Dictionary of Biological Terms, 10^th Edition 1989, Eleanor Lawrence, Longman Scientific & Technical, England or Margulis et al. (Editors) 1990； Handbook of Protoctista, Jones & Bartlett, Boston; van den Hoek et al. 1995, Algae - An Introduction to Phycology, Cambridge University Press参照）（非特許文献８）は、酵母、哺乳動物もしくは昆虫の培養細胞のようなすでに確立した真核発現システムに対する発現システムとして興味ある選択肢の１つとなるかもしれない。これらの生物は、真核で、一般的な単細胞微生物の非常に異種なグループである。これらは真核細胞の典型的な区分と分化とを有している。そのいくつかは、高等真核生物に比較的密接に関連しているが、他方では、酵母または細菌とさえあるときには培養と生育においては同様であり、大規模に単純な培地で高細胞密度で比較的簡単に発酵することができる。
【０００９】
原生生物または原生動物についての形質転換および異種タンパク質発現の方法は、わずか２、３種について文献に記載されているだけである。組換えタンパク質の形質転換ならびに発現に対する異なる試みが、トリパノソーム（Trypanosoma）、レイシュマニア（Leishmania）、プラスモジウム（Plasmodium）などのような特に寄生原生動物についてなされている（Beverly 2000, WO 00/58483）（特許文献１）。またそれらについての論評もなされている（Kelly, 1997, Adv. in Parasitol., Vol. 39, 227-270）（非特許文献９）。また、異種タンパク質発現の可能性は、その他多数の原生生物（真核微生物）、例えば、粘菌Dictyostelium discoideum （Manstein et al. 1995, Gene 162: 129-134, Jung and Williams 1997, Biotechnol. Appl. Biochem. 25: 3-8）（非特許文献１０）、鞭毛生物、例えば、ゾウリムシ（Paramecium）（Boileau et al. 1999, J. Eukaryot. Microbiol. 46: 55-65）（非特許文献１１）およびテトラヒメナ（Tetrahymena）（Gaertig et al. 1999, Nature Biotech. 17: 462-465）（非特許文献１２）および（WO 00/46381）（特許文献２）について示されている。また、タンパク質は、光合成独立栄養原生生物、ミクロ藻類などに異種的に発現することができる。かかる生物としては、例えば、クラミドモナス（Chlamydomonas）（Hall et al. 1993, Gene 124: 75-81）（非特許文献１３）、ボルボックス（Volvox）（Schiedlmeier et al. 1994, PNAS 91: 5080-5084）（非特許文献１４）、デイノフラゲラ（dinoflagellates）（ten Lohuis & Miller 1998, Plant Journal 13: 427-435）（非特許文献１５）およびダイアトーム（diatoms）（Dunahay et al. 1995, J. Phycol. 31: 1004-1012）（非特許文献１６）などが挙げられる。しかしながら、ほとんどの場合、単純な耐性マーカーまたは非ヒト選択マーカーだけか発現されただけである。一方、例えばＥＰＯなどのように特にグリコシル化されたタンパク質が関与している場合、非哺乳動物細胞の自然タンパク質にできるだけ等しいヒトタンパク質の生産に対して特別な挑戦が必要である。
【００１０】
鞭毛生物のうち、テララヒメナは、高等真核生物に比較的密接に関連し、それらに典型的な細胞分化を有する非病原性の単細胞真核微生物である。テララヒメナは、真正な、完全に分化した真核生物であるけれども、単純な酵母または細菌にその培養ならびに生育特性がより一層類似していて、比較的低価なスキムミルク培地を用いて大規模に容易に培養することができる。最適条件下では、世代時間は約１．５〜３時間であり、非常に高い細胞密度（48 g/L 乾燥重量に相当する2.2×10⁷ 個/mL）を達成することができる（Kiy and Tiedke 1992, Appl. Microbiol. Biotechnol. 37: 576-579; Kiy and Tiedke 1992, Appl. Microbiol. Biotechnol. 38: 141-146）（非特許文献１７）。このために、テトラヒメナは、大規模組換えタンパク質の発酵製造にとって非常に興味があり、哺乳動物細胞よりもより一層有利である。
【００１１】
テトラヒメナによって産生されるタンパク質のグリコシル化パターンに関する結論を引き出すために、テトラヒメナ培養培地からのタンパク質サンプルを、ペプチド：Ｎ−グルコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ）による消化前もしくは消化後に、レクチンブロットによって文献記載の方法に従って調べた（非特許文献２）。また、Ｎ−グリカン類が次々とＦＡＣＥ技術（Glyko Inc.）によって単離された。
【００１２】
レクチンブロットによる検査で、ミクロソームまたは培地画分のいくつかのタンパク質がＮ−グリコシル化されていることが示された。末端マンノジサッカライドを有するＮ−グリカン類は、両画分（レクチンＧＮＡのＰＮＧａｓｅＦ感受性結合）中で検出された。これらは、マンノースリッチ型のＮ−グリカン類である。その他のＰＮＧａｓｅＦ感受性レクチン結合は検出されなかったので、末端フコース残基（レクチンＡＡＡ）、ガラクトース残基（ＲＣＡ，ＤＳＡ）およびＮ−アセチルグルコサミン残基（ＤＳＡ，ＧＷＡ）の発生は、Ｎ−グリカン類中とは異なって起こりそうにない。媒体タンパク質が強力にグルコシル化されていることが検出されたことは、対応する対照がレクチン結合を示していないことから、使用した媒体による混入が関与していなく、テトラヒメナによって分泌されたタンパク質が関与していることになる。
【００１３】
４種のＮ−グリコシドオリゴサッカライドが次々と単離された。それらの構造は、Ｍａｎ５ＧｌｅＮＡｃ２、Ｍａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎ２ＧｌｃＮＡｃ２である。また、これらは、タニグチらによってTetrahymena pyriformisにおいて検出されたような、マンノースリッチＮ−グリコシド鎖の部分構造である（J. Biol. Chem. 260, 13941-13946 (1985）（非特許文献１８）。また、複雑なもしくはハイブリッドＮ−グリコシド糖鎖が検出されなかったので、レクチンブロットの結果が確認された。
【００１４】
したがって、テトラヒメナは、単純な塩基型のグリコシル化を示している（図１参照）。分泌タンパク質上にＯ−グリコシドを示す兆候は全くなかった。したがって、テトラヒメナは、他の発現システムに比べて非常に有利である。つまり、その糖構造が、酵母（より多くのマンノース残基と通常でない構造とを有するマンノースリッチ）ならびに昆虫や植物（キシロース発生）よりも哺乳動物細胞により一層類似している。また、テトラヒメナの単純なグリコシル化型は、タンパク質の生物学的活性（例えば、清澄化率など）にしばしば強力に影響し、産生を阻害する（例えば、エリスロポエチン産生、８０％偽グリコシル化）ところの複雑なＮ−グリコシド糖構造を一般的に産生する哺乳動物細胞に比べて、ある適用に対しては有利である。したがつて、テトラヒメナは、グリコシル化されたタンパク質、例えばエリスロポエチン（ＥＰＯ）などの発現に特に適している。
【００１５】
テトラヒメナの形質転換は、ミクロ注入法、エレクトロポレーション法またはミクロ粒子衝撃法によって行うことができる。このために数多くのベクター、プロモーターなどを入手することができる。形質転換体は、耐性マーカーによって選択することができる。例えば、テトラヒメナは、ｒＤＮＡベクター（ｒＲＮＡのパロマイシン耐性突然変異の選択）で有効に形質転換することができる（Tondravi et al. 1986, PNAS 83:4396; Yu et al. 1989, PNAS 86: 8487-8491）（非特許文献１９）。その後の形質転換実験において、シクロヘキシミドまたはネオマイシン耐性はテトラヒメナにおいて発現された（Yao et al. 1991, PNAS 88:9493-9497; Kahn et al. 1993, PNAS 90: 9295-9299）（非特許文献２０）。これらのマーカー遺伝子に加えて、（鞭毛生物からの）組換え魚寄生虫抗原がテトラヒメナで発現された。また、部分ニワトリオバルブミンがテトラヒメナで発現された（Gaertig et al., WO 00/46381）（特許文献２）。いずれの場合にも、選択は、パクリタクセル（Paclitaxel (Taxol)）で行われた。このシステムはガエルテイックら（Gaertig et al.）によって開発され、特許出願中である（特許文献２）。
【００１６】
相同ＤＮＡ組換えによる異種遺伝子の組込みはテトラヒメナで可能である。これによって有糸分裂的に安定した形質転換体を発生させることができる。また、標的遺伝子ノックアウトも相同ＤＮＡ組換えによって可能である（Bruns & Cassidy-Hanley in: Methods in Cell Biology, Volume 62, Ed. Asai & Forney, Academic Press (1999) 501-512; Hai et al. in: Methods in Cell Biology, Volume 62, Ed. Asai & Forney, Academic Press (1999) 514-531; Gaertig et al. (1999) Nature Biotech. 17: 462-465 or Cassidy-Hanley et al. 1997 Genetics 146: 135-147）（非特許文献２１）。これらに加えて、体細胞大核または生殖小核も互いに形質転換することができる。大核形質転換の間、安全性もしくは受容問題に関して有利となりうる無菌の形質転換体が得られる。
【００１７】
【特許文献１】
Beverly 2000, WO 00/58483
【特許文献２】
Gaertig et al., WO 00/46381
【非特許文献１】
Glick & Pasternak 1998, Molecular Biotechnology, ASM Press, Washington, DC, Chapter 10: 227-252
【非特許文献２】
Ashford & Platt 1998, in: Post-translational Processing - A Practical Approach Ed. Higgins & Hames, Oxford University Press, Chapter 4: 135-174
【非特許文献３】
Glick & Pasternak 1998, Molecular Biotechnology, ASM Press, Washington DC, Chapter 7: 145-169
【非特許文献４】
Castillo 1995, Bioprocess Technology 21: 13-45: Geise et al. 1996, Prot. Expr. Purif. 8: 271-282: Verma et al. 1998 J. Immunological Methods 216: 165-181; Glick & Pasternak 1998, Molecular Biotechnology ASM Press, Washing DC, Chapter 7: 145-169
【非特許文献５】
Moreman et al. 1994, Glycobiology 4(2): 113-125
【非特許文献６】
Tuite et al. 1999, in Protein Expression - A Practical Approach, Ed. Higgins & Hames, Oxford University Press, Chapter 3: especially page 76
【非特許文献７】
Jenkins et al. 1996, Nature Biotech. 14: 975-981
【非特許文献８】
Henderson’s Dictionary of Biological Terms, 10^th Edition 1989, Eleanor Lawrence, Longman Scientific & Technical, England or Margulis et al. (Editors) 1990； Handbook of Protoctista, Jones & Bartlett, Boston; van den Hoek et al. 1995, Algae - An Introduction to Phycology, Cambridge University Press
【非特許文献９】
Kelly, 1997, Adv. in Parasitol., Vol. 39, 227-270
【非特許文献１０】
Manstein et al. 1995, Gene 162: 129-134, Jung and Williams 1997, Biotechnol. Appl. Biochem. 25: 3-8
【非特許文献１１】
(Boileau et al. 1999, J. Eukaryot. Microbiol. 46: 55-65
【非特許文献１２】
Gaertig et al. 1999, Nature Biotech. 17: 462-465
【非特許文献１３】
Hall et al. 1993, Gene 124: 75-81
【非特許文献１４】
Schiedlmeier et al. 1994, PNAS 91: 5080-5084
【非特許文献１５】
ten Lohuis & Miller 1998, Plant Journal 13: 427-435
【非特許文献１６】
Dunahay et al. 1995, J. Phycol. 31: 1004-1012)
【非特許文献１７】
Kiy and Tiedke 1992, Appl. Microbiol. Biotechnol. 37: 576-579; Kiy and Tiedke 1992, Appl. Microbiol. Biotechnol. 38: 141-146
【非特許文献１８】
J. Biol. Chem. 260, 13941-13946 (1985)
【非特許文献１９】
Tondravi et al. 1986, PNAS 83:4396; Yu et al. 1989, PNAS 86: 8487-8491
【非特許文献２０】
Yao et al. 1991, PNAS 88:9493-9497; Kahn et al. 1993, PNAS 90: 9295-9299
【非特許文献２１】
Bruns & Cassidy-Hanley in: Methods in Cell Biology, Volume 62, Ed. Asai & Forney, Academic Press (1999) 501-512); Hai et al. in: Methods in Cell Biology, Volume 62, Ed. Asai & Forney, Academic Press (1999) 514-531; Gaertig et al. (1999) Nature Biotech. 17: 462-465 or Cassidy-Hanley et al. 1997 Genetics 146: 135-147
【非特許文献２２】
Wuitschick & Karrer, J. Eukaryot. Microbiol. (1999)
【非特許文献２３】
Benson, D. A. et al., Nuc. Acid Res., 28 (1), 15-18 (2000)
【非特許文献２４】
Stryer, L., Biochemie, 4^th Edition, Spektrum Akademischer Verlag, 1996, pages 802-3、Alberts, B. et al., Molecular Biology of the Cell, 3^rd Edition, Garland Publishing, New York and London, 1994, Chapter 12、Lodish, H. et al., Molecular Cell Biology, 4^th Edition, W H Freeman & Co. New York, 1999, Chapter 17
【非特許文献２５】
Gaertig et al. (1994) PNAS 91: 4549-4553)
【非特許文献２６】
Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring, New York
【非特許文献２７】
Gaertig & Kapler (1999)
【非特許文献２８】
Jacek Gaertig et al. (1994) PNAS 91: 4549-4553
【非特許文献２９】
Gaertig & Kapler (1999)
【非特許文献３０】
Burns & Cassidy-Hanley: Methods in Cell Biology, Volume 62 (1999) 501-512); Gaertig et al. (1999) Nature Biotech. 17: 462-465; Cassidy-Hanley et al. (1997 Genetics 146: 135-147)
【非特許文献３１】
Sanford et al. (1991) Biotechniques 3:3-16; Bruns & Cassidy-Hanley (1999) Methods in Cell Biology, Volume 62: 501-512
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】
先行技術に鑑みて、この発明は、異なるヒトタンパク質修飾の塩基型にできるだけ相当する翻訳後タンパク質修飾できる簡便でかつ経済的なヒトタンパク質の新規生産方法を提供することを目的としている。また、好ましくは、この発明は、組換えタンパク質の分泌を可能にし、より好ましくは非ヒト分泌シグナル（分泌配列）の使用を必要としないヒトタンパク質の新規な産生方法を提供することを目的とする。
この目的ならびに上記記載で説明した関係から容易に推察でき、またはそれらから結論づけることができる明示していないその他の目的も、特許請求の範囲に記載するこの発明の変法によって解決することができる。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
この発明に従って、組換えヒトタンパク質の生産方法は、テトラヒメナ細胞を、ヒトタンパク質をコードする少なくとも１個の機能遺伝子を含む組換えＤＮＡで形質転換し、該ヒトタンパク質をコードする遺伝子を発現する該組換えテトラヒメナ細胞を培養した後、該タンパク質を単離することによって、驚くほど簡単に行うことができる。この方法で生産した組換えヒトタンパク質は、その構造は、酵母よりも哺乳動物細胞の構造とより一層類似している、簡単なグルコシル化パターンを有している。他方、その培養ならびに生育的性質は、酵母のそれにより一層類似していて、したがつて低価な媒体で迅速な生育ができ、かつ過度な技術的要求なしに達成することができる。
【００２０】
【発明の実施の形態】
前述したように、この発明に係る組換えヒトタンパク質の生産方法は、テトラヒメナ細胞を、ヒトタンパク質をコードする少なくとも１個の機能遺伝子を含む組換えＤＮＡを用いて形質転換し、該ヒトタンパク質をコードする遺伝子を発現する該組換えテトラヒメナ細胞を培養した後、該タンパク質を単離することからなっている。
この発明に係るテトラヒメナ属の好ましい種は、テトラヒメナ・テルモフィラ（Tetrahymena thermophila）である。
【００２１】
この発明において、ヒトタンパク質とは、対応するコードＤＮＡ配列がヒトから単離することができるタンパク質を意味するものと理解される。組換え発現に最終的に使用されるＤＮＡ配列は、ヒト細胞から単離される必要はなく、修飾された形態で存在していてもよく、または人工的に作成されていてもよい。更に、産生されたタンパク質は、ヒト細胞から単離できるタンパク質に関して、例えば、ある種のアミノ酸が欠失、置換などしたりした変異を有していてもよい。特に、この発明によるヒトタンパク質としては、治療使用目的のヒトタンパク質、例えば、サイトカイン（例えば、インターフェロン、インターロイキン等）、酵素、ホルモン（インスリン、ＥＰＯ、成長ホルモン等）、血液因子（第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子等）などを挙げることができる。
【００２２】
この発明による単純なグリコシル化パターンとは、塩基構造ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ２−５のグリコシル化パターンがほとんどであることを意味しているものと理解される。
【００２３】
この発明による機能遺伝子とは、標的生物において発現することができる遺伝子を意味するものと理解される。したがって、特に、機能遺伝子は、コード配列に加えて、該コード配列の転写を導く標的生物において機能的であるプロモーターを含んでいる。この型の機能性プロモーターは、その中でも、１個もしくはそれ以上のＴＡＴＡボックス、ＣＣＡＡＴボックス、ＧＣボックスもしくはエンハンサー配列を有していてもよい。また、機能遺伝子は、転写において中断を導き、ｍＲＮＡのボリアデニル化を導くシグナル配列を含む標的生物において機能的であるターミネーターを含んでいてもよい。更に、機能遺伝子のコード配列は、標的生物における翻訳に必要な全ての性質（例えば、開始コドン（例えば、ＡＴＧ）、停止コドン（ＴＧＡ）開始前のＡリッチ領域（翻訳開始部位）、コザック配列、ポリＡ部位など）を有している。その上、該遺伝子は、テトラヒメナに特異的なコドン用途を有することもできる（Wuitschick & Karrer, J. Eukaryot. Microbiol. (1999)）（非特許文献２２）。
【００２４】
この発明の好ましい変法においては、発現される遺伝子は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対する遺伝子であり、特にＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ.８３９２８９０の遺伝子またはその変異体である。ＧｅｎＢａｎｋの主体については、Benson, D. A. et al., Nuc. Acid Res., 28 (1), 15-18 (2000)（非特許文献２３）を参照のこと。したがって、産生されたタンパク質はヒト血清アルブミンであることが好ましい。
【００２５】
この発明によれば、組換えＨＳＡの変異体とは、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ.８３９２８９０の遺伝子の配列と、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、特に好ましくは９５％以上相同する遺伝子を有しているものを意味するものと理解される。特に、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ.８３９２８９０の遺伝子の配列から選択された、好ましくは１００ｂｐないし３００ｂｐのプローブは、この遺伝子の変異体上で標準ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイゼーションすることができる。
【００２６】
この発明において、テトラヒメナにおいて組換えＨＳＡが有効に発現されたことが始めて記載されるので、始めてヒトタンパク質がテトラヒメナにおいて有効に発現できたことになる。
【００２７】
この目的のために、リーダー配列を含むＨＳＡの完全コード配列は、ＰＣＲで増幅され、テトラヒメナ発現ベクター中に結合された（実施例２参照）。この構成体でテトラヒメナを形質転換し、タキソール（ｔａｘｏｌ）耐性に対する形質転換体を選択した（実施例３参照）後、プロテアーゼインヒビターを添加したスキムミルク培地で培養した（実施例５参照）。テトラヒメナによって培地内に分泌されたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、ＨＳＡはＨＳＡ特異的抗体を用いたウエスタンブロットで検出された（図２参照）。驚いたことに、組換えＨＳＡが産生されたばかりではなく、それを培地中に分泌したことである。
【００２８】
全ての期待とは反対に、ヒトリーダー配列はテトラヒメナ中で完全に機能的であることが判明した。
発現したタンパク質を分泌するテトラヒメナ細胞は、この発明の好ましい変法を形成する。この変法においては、タンパク質は培養上清から単離することができる。
【００２９】
したがって、この発明の特に好ましい変法は、ヒトタンパク質をコードする遺伝子が、テトラヒメナによって発現されたタンパク質の分泌を惹起するヒトリーダー配列を含んでいることからなる組換えヒトタンパク質の生産方法に関するものである。リーダー配列（シグナル配列の同義語）またはリーダーペプチド（またはシグナルペプチド）についての記載は、例えば、次を参照するとよい（Stryer, L., Biochemie, 4^th Edition, Spektrum Akademischer Verlag, 1996, pages 802-3、Alberts, B. et al., Molecular Biology of the Cell, 3^rd Edition, Garland Publishing, New York and London, 1994, Chapter 12、Lodish, H. et al., Molecular Cell Biology, 4^th Edition, W H Freeman & Co. New York, 1999, Chapter 17）（非特許文献２４）。特に好ましいリーダー配列としては、ヌクレオチド配列 atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttcc （配列番号５）を含むか、またはアミノ酸配列 Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala （配列番号６）を含むリーダーペプチドをコードしている。別の好ましい変法においては、リーダー配列は、プロペプチド配列 aggggtgtg ttcgtcga （配列番号７）を含むか、またはアミノ酸配列 Arg Gly Val Phe Arg Arg （配列番号８)をコードしている。
【００３０】
この発明の別の変法においては、ヒトタンパク質は組換えテトラヒメナ細胞の表面上で発現される。
また、この発明の別の変法は、ヒトタンパク質をコードしているＤＮＡを含む組換えテトラヒメナ細胞に関する。組換えテトラヒメナ細胞は組換えヒト遺伝子を発現するのが好ましい。発現遺伝子はヒトリーダー配列を含んでいるのが特に好ましい。上記ヒトリーダー配列は、好ましくは、配列番号５を含むか、または配列番号６を含むリーダーペプチドをコードしている。また、別の好ましい変法においては、プロペプチド配列（配列番号７）に相当する配列を含むか、または配列番号７を含むプロペプチドをコードしている。
【００３１】
特に好ましくは、組換えテトラヒメナ細胞は、組換えヒトタンパク質を分泌する。好ましい変法においては、この方法において発現され分泌されたタンパク質は、ヒト血清アルブミン、特にＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ.８３９２８９０の遺伝子またはその変異体の発現生産物である。
【００３２】
この発明の別の変法は、テトラヒメナに典型的なグリコシル化パターンを有することによって特徴付けられる組換えヒトタンパク質に関する。また、この発明の別の変法は、ヒトリーダー配列を含むテトラヒメナでのヒトタンパク質の発現のための発現ベクターに関するものである。この発明において、発現ベクターとは、環状もしくは線状のＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸分子、例えば、プラスミド、コスミド、もしくはホスト細胞中に組換え遺伝子を組み込み、細胞中に遺伝子を発現することができる人工クロモソームなどを意味するものと理解される。ベクターは、細胞中にエピソーム的に存在することができ、つまり、ホスト細胞のゲノム中で自己複製もしくは該ゲノム中へ組込まれることができるものである。組込みは、無作為にまたは相同組換えによっても発生させることができる。また、発現されている組換え遺伝子に加えて、この発明に係るかかる発現ベクターは、オリＥ．ｃｏｌｉ（ori E. coli）特異的マーカーなどのようなクローニング目的のためにＥ．ｃｏｌｉにおいて複製することができるために、多重クローニング部位、自律複製配列、ホストに対するマーカー遺伝子ならびに全ての必要な配列などのようなこの目的に有用な別の配列を含んでいてもよい。
テトラヒメナにおけるヒトタンパク質の発現の成功例はこの発明において始めて記載されている。
【００３３】
【実施例】
下記実施例は、この発明を説明するのに資するものであって、この発明をこれら実施例に限定するものではない。
実施例１：生物および培養条件
テトラヒメナ・テルモフィラ（Tetrahymena thermophila）（菌株：Ｂ１８６８ＶＩＩＩ、Ｂ２０８６ＩＩ、Ｂ＊ＶＩ、ＣＵ４２８、ＣＵ４２７、ＣＵ５２２；J. Gaertig, University of Georgia, Athens, GA, USAから入手）を、改良ＳＰＰ培地（２％プロテオスペプトン、０．１％酵母抽出物、０．２％グルコース、０．００３％Ｆｅ−ＥＤＴＡ）（Gaertig et al. (1994) PNAS 91: 4549-4553)）（非特許文献２５）と、スキムミルク培地（２％スキムミルク粉末、０．５％酵母抽出物、１％グルコース、０．００３％Ｆｅ−ＥＤＴＡ）もしくはＭＹＤ（２％スキムミルク粉末、０．１％酵母抽出物、０．２％グルコース、０．００３％Ｆｅ−ＥＤＴＡ）に、抗生物質溶液（１００Ｕ/ｍＬペニシリン、１００μｇ/ｍＬストレプトマイシンおよび０．２５μｇ/ｍＬアンフォテリシンＢ（ＳＰＰＡ培地））を添加して、２５０ｍＬ容アーレンマイヤーフラスコ中で、３０℃で振とう（１５０ｒｐｍ）培養した。
プラスミドとファージはＥ．ｃｏｌｉXL1-Blue、MRF’、TOP10F’もしくはJM109 (Stratagene, Invitrogen, GibcoBRL Life Technologies)で増殖し選択した。細菌の培養は、標準濃度の抗生物質を添加したＬＢ培地もしくはＮＺＹ培地を用いて標準条件下で培養した（Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring, New York)）（非特許文献２６）。
【００３４】
実施例２：発現構成体ｐＢＨＳＡの作成
ベクターｐＢＩＣＨ３(Gaertig et al. 1999 Nature Biotech. 17: 462-465, WO 00/45381)（非特許文献２７）は、テトラヒメナ・テルモフィラＢＴＵ１遺伝子の非コード調節配列によってフランキングされたイチチオフィトラス（Ichthyophthrius）Ｉ抗原（Ｇ１）プレプロテインのコード配列を含んでいる。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ.８３９２８９０）発現構成体ｐＢＨＳＡを産生するために、開始部位にＮｓｉＩ切断部位を有する改変プラスミド（ｐＢＩＣＨ３−Ｎｓｉ）（J. Gaertig, University of Georgia, Athens, GA, USAより提供）を使用した。この目的のために、ＮｓｉＩおよびＢａｍＨＩ切断部位を、コードＨＳＡ配列の開始と停止部位にＰＣＲによって挿入した。ＨＳＡの完全ｃＤＮＡ配列を含む単離されたプラスミド（ＡＴＣＣ３２３３２４）は、テンプレートとしてＰＣＲに使用した。プライマーの配列は下記の通りである。
HSA-Nsi-1：5’-GGCACAATGCATTGGGTAACCTTTATTAGC-3’
（配列番号１）および
HSA-Bam-R：5’-AAATGGGATCCTCATAAGCCTAAGGCAGCTTGAC-3’
（配列番号２）
上記プライマーを使用して、ＮｓｉＩおよびＢａｍＨＩ切断部位によってフランキングされたＨＳＡの完全コード配列を含むＰＣＲ生産物が得られた。得られたＰＣＲ生産物とプラスミドｐＢＩＣＨ３Ｎ−Ｎｓｉは、制限酵素ＮｓｉＩとＢａｍＨＩで切断され、アガロースゲルで精製した後、結合された。そのようにして生成された発現構成体ｐＢＨＳＡは、ＢＴＵ１遺伝子の調節配列中の正確な読み取りフレーム（reading frame）に挿入された完全ＨＳＡコード配列を含んでいる。テトラヒメナの形質転換のために、得られた構成体は、制限酵素ＳａｃＩＩとＸｈｏＩで消化して線状化した。
この形質転換中に、ＢＴＵ１遺伝子は、相同組換えによってこの構成体で置換されたので、細胞のパクリタクセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）に対する細胞耐性が付与された。
【００３５】
実施例３：ｐＢＨＳＡによるテトラヒメナの大核形質転換
テトラヒメナ・テルモフィラ細胞（ＣＵ５２２）５×１０^６個を形質転換に使用した。細胞をＳＰＰＡ培地５０ｍＬに播種し、揺とう装置に取り付けた２５０ｍＬ容アーレンマイヤーフラスコを用いて１５０ｒｐｍで振とうしながら３０℃で約３〜５×１０^５個/ｍＬの細胞濃度になるまで培養した。５分間遠心分離（１２００ｇ）した後、細胞をペレット化し、得られた細胞ペレットを１０ｍＭＴｒｉ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）５０ｍＬに再懸濁し、前と同様に遠心分離した。この洗浄工程を繰り返し、細胞濃度３×１０^５個/ｍＬの細胞を１０ｍＭＴｒｉ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５、抗生物質添加）に再懸濁し、２５０ｍＬ容アーレンマイヤーフラスコに移し、振とうすることなく３０℃で１６〜１０時間培養した（飢餓相）。この飢餓相後、細胞数を再度決定して、上記同様に遠心分離し、細胞を１０ｍＭＴｒｉ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で細胞濃度５×１０⁶個/ｍＬに調節した。このうち、細胞懸濁液１ｍＬを形質転換に使用した。形質転換は大核衝撃法（下記に説明する）にて行った。再生のために、細胞をＳＰＰＡ培地に取り、アーレンマイヤーフラスコ中で振とうすることなしに３０℃で培養した。３時間培養した後、最終濃度２０μｍのパクリタクセルを添加し、アリコート１００μＬの細胞を９６ウエルマイクロタイタープレートの各ウエルに移した。ついで、細胞を湿らせて暗くしたボックス中て３０℃で培養した。２〜３日後、パクリタクセル耐性クローンが同定された。陽性のクローンを２５μｍパクリタクセルを添加した新規培地で再培養した。パクリタクセル濃度を増加して（８０μｍまで）培養することによって、完全「フェノタイプ・アソートメント」（phenotypic assortment））に達した（Gaertig & Kapler (1999)）（非特許文献２７）。
【００３６】
クローンの分析のために、ＳＰＰＡ培養液約４ｍＬをパクリタクセルと培養し、ＤＮＡを単離し（Jacek Gaertig et al. (1994) PNAS 91: 4549-4553）（非特許文献２８）、ＤＮＡをＢＴＵ１遺伝子座に組込み、ＰＣＲで増幅した。下記配列を有するＢＴＵ１特異的プライマーは、開始コドンの約５０ｂｐ前および停止コドンの３ｂｐ後にそれぞれあるプライマーとして使用した。
BTU1-5’F (AAAAATAAAAAAGTTTGAAAAAAAACCTTC
（配列番号３）
BTU1-3R’ (GTTTAGCTGACCGATTCAGTTC
（配列番号４）
得られたＰＣＲ生産物は、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｃＩまたはＰｓｔＩを用いて切断されるかまたは切断されないかを分析した。完全「フェノタイプ・アソートメント」を、ＢＴＵ１特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲによってチェックした（Gaertig & Kapler (1999)）（非特許文献２９）。
【００３７】
実施例４：バイオリステイック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）形質転換（マイクロ粒子衝撃法）
テトラヒメナ・テルモフィラの形質転換は、文献に記載されているようなバイオリステイック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）形質転換によって行った（Burns & Cassidy-Hanley: Methods in Cell Biology, Volume 62 (1999) 501-512); Gaertig et al. (1999) Nature Biotech. 17: 462-465; Cassidy-Hanley et al. (1997 Genetics 146: 135-147)）（非特許文献３０）。バイオリステイックＰＤＳ１０００/Ｈｅパーテイクルデリバリーシステム（Biolistic（登録商標）PDS-1000/He Particle Delivery System (BIO-RAD)）の取り扱いは対応するハンドブックに詳細に記載されている。
形質転換には、金粒子（０．６μｍ；ＢＩＯ−ＲＡＤ）６ｍｇに線状化したプラスミドＤＮＡ（Sanford et al. (1991) Biotechniques 3:3-16; Bruns & Cassidy-Hanley (1999) Methods in Cell Biology, Volume 62: 501-512）（非特許文献３１）を挿入した。
金粒子の製造：０．６μｍの金粒子（ＢＩＯ−ＲＡＤ）６０ｍｇをエタノール１ｍＬ中に再懸濁した。この目的のために、粒子を３度それぞれ１〜２分間渦巻き状に激しく混合した。次いで、粒子を１分間遠心分離（１００００ｒｐｍ）し、その上清をピペットで注意深く除去した。得られた金粒子を殺菌水１ｍＬ中に再懸濁し、上記と同様に遠心分離した。この洗浄工程を１度繰り返して、得られた粒子を５０％グリセロール１ｍＬに再懸濁し、そのアリコート１００μＬを２０℃で保存した。
形質転換体の作成：マクロキャリアーホルダー、マクロキャリアーおよびストップスクリーンを１００％エタノール中に数時間放置し、破裂デイスクをイソプロパノール中に放置した。次いで、マクロキャリアーをマクロキャリアーホルダー中に挿入した後、空気乾燥した。
ＤＮＡの金粒子への組込み：全ての作業は４℃で行なった。金粒子、生産ベクター、２．５ＭＣａＣｌ_２、１Ｍスパーミジン、７０％と１００％エタノールを氷冷した。線状化ベクターＤＮＡ（１μｇ/ ｍＬ）１０μＬを作成した金粒子１００μＬに添加し、１０秒間注意深く渦巻き状に振とうした。２．５ＭＣａＣｌ_２１００μＬをまず添加して、１０秒間渦巻き状に振とうした後、１Ｍスパーミジン４０μＬを添加して１０秒間注意深く渦巻き状に振とうした。７０％エタノール２００μＬを添加して、得られた粒子を１分間渦巻き状に振とうした後、１００００ｒｐｍで１分間遠心分離した。得られたペレットを１００％エタノール２０μＬに再懸濁し、遠心分離した後、１００％エタノール３５μＬに再懸濁した。
上記のように製造した粒子をピペットでマクロキャリアーの中心に注意深く導入した。次いで、形質転換のために、マクロキャリアーを吸湿性のシリカゲルを詰めたボックス中に配置した。
形質転換：作成した細胞（上記参照）１ｍＬを円形フイルターの中心に導入し、１０ｍＭｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）でペトリ皿中で湿らせて、バイオリステイックＰＤＳ−１０００/Ｈｅパーテイクルデリバリシステムの形質転換チェンバーの最下層の挿入ストリップ中に導入した。作成した金粒子による形質転換は、圧力９００ｐｓｉ（４５０ｐｓｉ破裂デイスク２個）、真空度２７インチＨｇで形質転換チェンバー中で行なった。次いで、得られた細胞をＳＰＰＡ培地５０ｍＬを入れたアーレンマイヤーフラスコに直ちに移し、振とうすることなく３０℃で培養した。
【００３８】
実施例５：テトラヒメナ中でのＨＳＡの発現
陽性形質転換体からと、コントロールとして非形質転換テトラヒメナ野生株細胞からのプロテアーゼインヒビター（完全ＥＤＴＡ欠如プロテアーゼインヒビター・カクテルタブレット、Roche Diagnostics GmbH）を添加したスキムミルク培地２０ｍＬを入れたアーレンマイヤーフラスコを用いて培養した。２４時間および４８時間（約１×１０^６個/ｍＬの細胞密度）後、細胞を遠心分離し、その上清の残りに１０分の１容量の氷冷ＴＣＡを混合し、氷上で３０分間培養した後、４℃で３０分間最大ｒｐｍで遠心分離した。得られたペレットを氷冷アセトン３００μＬで洗浄し、４℃で５分間最大ｒｐｍで遠心分離した。得られた上清を取り除いて、ペレットを真空乾燥し、サンプルバッファー１５０μＬに再懸濁し、９５℃で１０分間培養した。このように培養画分から回収したタンパク質と、テトラヒメナによって培地中に分泌されたタンパク質とを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる標準方法によって分離し、ＨＳＡ特異的抗体（Sigma）を用いてウエスタンブロット（図２参照）で検出した。自然ＨＳＡ（Sigma）を陽性コントロールとして使用した。
【００３９】

【図面の簡単な説明】
【図１】Ｎ―結合タンパク質グリコシル化を示す図。マンノースリッチ型：５〜９個のマンノースと２個のＧｌｃＮＡｃ残基単純塩基型：２〜５個のマンノースと２個のＧｌｃＮＡｃ残基複雑型：ガラクトース、フコース、シアル酸残基（Ｎ−アセチルノイラミン酸）酵母Ｎ−グリカン類は、８〜５０個のマンノース残基を有するマンノースリッチ型だけから構成されている。植物の複雑型は、シアル酸を有していないが、キシロース残基（アレルギーポテンシャル）を有している。
【図２】テトラヒメナにおけるＨＳＡ発現を示す図。１列と２列：ｐＢＨＳＡによって形質転換された２４時間後と４８時間後のテトラヒメナの培地画分Ｋ列：対照としての自然ＨＳＡ。クーマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥと、ＨＳＡ抗体と二次抗体（アルカリホスファターゼに結合した）でウエスタンブロット。

Claims (13)

1. テトラヒメナの組換えヒト糖タンパク質の発現方法において、該方法が、
   （ａ）テトラヒメナ細胞を、ヒト糖タンパク質をコードする少なくとも１個の機能性遺伝子を有する組換えＤＮＡで形質転換する工程と、
   （ｂ）該組換えテトラヒメナ細胞を培養して該遺伝子を発現させる工程と、
   （ｃ）該糖タンパク質を単離する工程と、
   からなることを特徴とするテトラヒメナの組換えヒト糖タンパク質の発現方法。
2. 請求項１に記載するテトラヒメナの組換えヒト糖タンパク質の発現方法において、該テトラヒメナ細胞が該糖タンパク質を分泌することを特徴とするテトラヒメナの組換えヒト糖タンパク質の発現方法。
3. 請求項１に記載するテトラヒメナの組換えヒト糖タンパク質の発現方法において、該テトラヒメナ細胞が該糖タンパク質をその表面で発現することを特徴とするテトラヒメナの組換えヒト糖タンパク質の発現方法。
4. 請求項２に記載するテトラヒメナの組換えヒト糖タンパク質の発現方法において、該糖タンパク質が培養上清から単離されることを特徴とするテトラヒメナの組換えヒト糖タンパク質の発現方法。
5. 請求項１ないし４のいずれか１項に記載するテトラヒメナの組換えヒト糖タンパク質の発現方法において、該ヒト糖タンパク質をコードする該遺伝子がヒトリーダー配列からなることを特徴とするテトラヒメナの組換えヒト糖タンパク質の発現方法。
6. 請求項５に記載するテトラヒメナの組換えヒト糖タンパク質の発現方法において、該ヒトリーダー配列が、テトラヒメナ細胞による発現糖タンパク質の分泌を導くことからなることを特徴とするテトラヒメナの組換えヒト糖タンパク質の発現方法。
7. ヒト糖タンパク質をコードするＤＮＡを含有することを特徴とする組換えテトラヒメナ細胞。
8. 糖タンパク質をコードする組換えヒト遺伝子を発現することを特徴とする組換えテトラヒメナ細胞。
9. 請求項８に記載する組換えテトラヒメナ細胞において、該発現遺伝子がヒトリーダー配列を含有していることを特徴とする組換えテトラヒメナ細胞。
10. 組換えヒト糖タンパク質を分泌することを特徴とする組換えテトラヒメナ細胞。
11. 塩基構造GlcNAc2-Man2-5のグリコシル化パターンを有することを特徴とする組換えヒト糖タンパク質。
12. ヒトリーダー配列を含むヒト糖タンパク質をテトラヒメナ細胞で発現するための発現ベクター。
13. 医薬の製造のためのヒト組換え糖タンパク質の使用において、該糖タンパク質がテトラヒメナ細胞で発現され、そこから単離されることを特徴とする使用。

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