JP2001510327A - Ｄｎａを装填した金粒子を用いるミクロキャリヤーボンバードメントによる繊毛虫細胞の遺伝的形質転換 - Google Patents
Ｄｎａを装填した金粒子を用いるミクロキャリヤーボンバードメントによる繊毛虫細胞の遺伝的形質転換Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、繊毛虫内で異種ＤＮＡを発現する方法に関する。繊毛虫細胞は、ミクロキャリヤーボンバードメント法を用いて、ＤＮＡ充填金粒子で首尾よく形質転換することができる。
Description
【発明の詳細な説明】
ＤＮＡを装填した金粒子を用いるミクロキャリヤーボンバードメントによる 繊毛虫細胞の遺伝的形質転換
本発明は、新規の発現系または宿主内で異種ＤＮＡを発現させる方法に関する
。
繊毛虫は、単細胞真核生物である。それらは、事実上、真核細胞の典型的性質
をすべて持ち、同時に、それらを原核生物のように培養することができるという
利点を持つ。このことは、栄養複製（vegetative replication）によって遺伝的
に同一のクローンが個々の細胞から生ずることを意味する。これに関連して、い
くつかの種では、連続培養またはバッチ培養で、非常に高い細胞密度に達するこ
とができる。さらに、大多数の真核生物のように、繊毛虫は、有性生殖すること
ができる。有性生殖は、繊毛虫の場合接合と呼ばれ、異なる交配型（mating typ
e）（交配型は、「複式性（multiple sexes）」である）の細胞を適当な条件下
で接触させることによって誘導することができる。この性質は、繊毛虫をより高
等な真核生物のように交雑でき、例えば、そうすることによって選ばれた特徴を
持つホモ接合株を作り出すことができるという利点を提供する。
大多数の真核生物に典型的な特徴に加えて、繊毛虫は、特にそれらを基礎的な
細胞生物学的研究及びバイオテクノロジーへの応用の両方に適応させる数多くの
構造的機能的特性を持つ。たとえば、異なる様式で分化する二つの型の細胞核：
小さくて転写不活性な通常は二倍体の小核、および通常非常に大きくＤＮＡに富
む大核：は、ほとんどすべての繊毛虫細胞に存在する。小核は、たいてい生殖機
能を持つ、即ち接合の過程の間、減数分裂によってそれらから一倍性配偶子核（
haploid gamete nuclei）が形成される。２つの接合パートナーの配偶子核が融
合して接合子核を形成し、そして、遺伝的に組換えられた小核ゲノムを持つ新し
い細胞世代を作り出すことができる。新しい世代の接合子核は、分裂によって新
しく大核を作り出す。大核は、体細胞プロセスのすべてをコントロールする。そ
れらのゲノムは、永続的に転写される。大核発育の過程の間には、多くの種類
の徹底的な（drastic）排除（elimination）および再体制化（reorganization）
というでき事(events)が起こる。いくつかの種では、小核ゲノムの最大で９８％
が排除され、介在配列が遺伝子から切除され、そして、コード配列を全く新しい
様式［「遺伝子スクランブリング」（"gene scrambling"）］で再配列すること
ができる。この点について試験したすべての繊毛虫では、大核内の遺伝子は、多
かれ少なかれ（to a greater or lesser extent）強く増幅される。検討中の遺
伝子および繊毛虫の種に依存して、コピー数は、数百万程度の大きさになり得る
。
非常に最近、繊毛虫ゲノムの分子生物学的特徴では、いくつかのセンセーショ
ナルな発見がもたらされて。例えば、自己スプライシングイントロン（リボザイ
ム）は、高度に増幅された繊毛虫遺伝子で初めて発見された（Ｃｅｃｈ，Ｔ．Ｒ
．，Ｂ．Ｌ．Ｂａｓｓ，１９８６：Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５５，
５９９−６２９）。テロメア構造、ＤＮＡ直鎖分子の末端構造およびそれを合成
するテロメラーゼの構造も同様に、繊毛虫で初めて解明された（Ｂｌａｃｋｂｕ
ｒｎ，Ｅ．Ｈ．、１９９１：Ｎａｔｕｒｅ，３５０，５６９−５７３）。続いて
、それらの珍しいゲノムの構造のため最初に繊毛虫で発見されたこれらの基本的
プロセスおよび構造もまた、ほとんどすべてのその他の真核生物の特徴であるこ
とが分かった：その他の真核生物で、そのようなことを発見し研究することが、
非常に困難であることは、極めて当然である。
概説した繊毛虫の特徴から、これらの生物体の使用は、バイオテクノロジーの
目的にもまた特に有用であると思われる。簡単に要約すると、次の理由がこの仮
定を支持する：
１． 繊毛虫は、原核微生物のように、クローン培養で、高い細胞密度に、ま
た比較的短い世代時間で培養することの出来る単細胞真核生物である。
２． それらの細胞は、例えば、ＤＮＡ複製、転写およびプロセシング、翻訳
、細胞骨格構造および膜構造、エンドサイトーシスおよびエキソサイトーシスの
プロセス等の領域で、原核生物が持っていないほとんどすべての真核生物の特徴
を示す。
３． 繊毛虫は、共通の系統樹から遅い段階で分岐した真核生物が高度に発達
したものなので、それらの酵素、構造タンパク質および膜タンパク質、さらにま
たそれらの代謝経路は、同一のエレメントが原核生物のすべてに起こる限りにお
いて、原核生物（細菌）に匹敵する構造およびプロセスより、多細胞真核生物（
例えばヒト）に関連する構造およびプロセスと非常に高度な類似性を示す。
４． 遺伝子はすべて、ほとんどの種の繊毛虫の体細胞大核ゲノム内において
、多かれ少なかれ、強く増幅され、結果として通常の条件下でさえ高率で発現す
る特色を持つ。いくつかの遺伝子が増幅される程度は、適当な方法によって増加
させることができる。
繊毛虫が細胞に特異的な、または異種の生成物を単離するために提供すること
のできるバイオテクノロジーへの可能性は、いままではほとんど認識されておら
ず、そして、この可能性を開発するために設計された実験は、未だに研究室での
試験段階にある。繊毛虫から比較的大規模に細胞特異的物質を作りだしそして単
離する最初の将来有望な試みは、ごく最近、発表されただけである（Ｋｉｙ，Ｔ
．，Ａ．Ｔｉｅｄｔｋｅ、１９９１：Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌ．，３５，１４−１８；ｋｉｙ，Ｔ．，Ｇ．Ｓｃｈｅｉｄｇｅｎ−
ｋｌｅｙｂｏｌｄ，Ａ，Ｔｉｅｄｔｋｅ、１９９６：Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍ
ｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１８，２６８−２７４）。
今まで、繊毛虫内で異種遺伝子または修飾された種特異的遺伝子を発現させる
試みは、真核生物を形質転換できる慣用方法が、結果として２、３の例外的場合
のみに充分に高い形質転換率を生ずるだけなので、大抵失敗に終わっている（Ｇ
ａｅｒｔｉｇ，Ｊ．，Ｍ．Ｇｏｒａｖｓｋｙ、１９９２：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，９１９６−９２００）。さらに、一般的に真
核生物の形質転換に成功裡に用いられるいくつかのマーカー系を繊毛虫に用いる
ことは明らかに不可能であったので、繊毛虫での形質転換実験に適当ないかなる
選択マーカーも、いままでほとんど手に入らなかった（Ｗｕｎｎｉｎｇ，Ｉ．Ｕ
．，Ｌｉｐｐｓ，Ｈ．Ｊ．、１９８３：ＥＭＢＯ Ｊ．，２，１７５３−１７５
７；Ｍｅｙｅｒｓ，Ｇ．，Ｅ．Ｈｅｌｆｔｅｎｂｅｉｎ、１９８８：Ｇｅｎｅ，
６
３，３１−４０）。
繊毛虫を首尾良く形質転換することが困難な一つの理由は、多分、細胞が複雑
でかつ安定な表層構造に取巻かれていることにある。
最近、強固で固い細胞壁に取り囲まれている植物細胞が、ミクロキャリヤーボ
ンバードメント（microcarrier bombardment）法を用いて、非常に効率よく形質
転換できることが知られるようになってきた（Ｂｏｙｎｔｏｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｎ．
Ｗ．Ｇｉｌｌｈａｍ，Ｅ．Ｈ．Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｐ．Ｈｏｓｌｅｒ，Ａ．Ｍ．
Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｊｏｎｅｓ，Ｂ．Ｌ．Ｒａｎｄｏｌｐ−Ａｎｄｅｒｓ
ｏｎ，Ｄ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｔ．Ｍ．Ｋｌｅｉｎ，Ｋ．Ｂ．Ｓｈａｒｋ，Ｊ
．Ｃ．Ｓａｎｆｏｒｄ，１９８８：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，１５３４−１５３
７；Ｋｌｅｉｎ，Ｔ．Ｍ．，Ｌ．Ｋｏｒｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｃ．Ｓａｎｆｏｒｄ
，Ｍ．Ｅ．Ｆｒｏｍｍ、１９８９：Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９１，４４
０−４４４；Ｋｌｅｉｎ，Ｔ．Ｍ．，Ｅ．Ｄ．Ｗｏｌｆ，Ｒ．Ｗｕ，Ｊ．Ｃ．Ｓ
ａｎｆｏｒｄ、１９８７：Ｎａｔｕｒｅ，３２７，７０−７３）。このバイオリ
ッスティックな方法（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄ）は、いままでに最適
化されており（Ｓｔａｎｆｏｒｄ，Ｊ．Ｃ．，Ｆ．Ｄ．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ａ．Ｒ
ｕｓｓｅｌｌ、１９９３：Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２１７，４８３−５０
９）、また哺乳動物細胞（Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ−ＭｃＥｌｌｉｇｏｔｔ，Ｓ
．、１９９２：Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１０３６−１０４０）お
よびウニの卵（Ａｋａｓａｋａ，Ｋ．，Ａ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｋ．Ｈｉｊｉ
ｋａｔａ，Ｙ．Ｌｕｃｈｉ，Ｊ．Ｍｏｒｏｋｕｍａ，Ｍ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，
Ｈ．Ｍｏｒｉｋａｗａ，Ｈ．Ｓｈｉｍａｄａ、１９９５：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｍａｒｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４（３
），２５５−２６１）を形質転換するために成功裡に用いることができた。この
形質転換法の具体的特徴は、その方法がクロロプラストまたはミトコンドリアの
ような細胞内成分を形質転換することを可能にさえすることである。（Ｂｏｙｎ
ｔｏｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｎ．Ｗ．Ｇｉｌｌｈａｍ，Ｅ．Ｈ．Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｐ．
Ｈｏｓｌｅｒ，Ａ．Ｍ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｊｏｎｅｓ，Ｂ．Ｌ．Ｒａｎ
ｄｏ
ｌｐｈ−Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｔ．Ｍ．Ｋｌｅｉｎ，Ｋ
．Ｂ．Ｓｈａｒｋ，Ｊ．Ｃ．Ｓａｎｆｏｒｄ，１９８８：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４
０，１５３４−１５３７；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｓ．Ａ．，Ｐ，Ｑ，Ａｎｚｉａｎ
ｏ，Ｋ．Ｓｈａｒｋ，Ｊ．Ｃ．Ｓａｎｆｏｒｄ，Ｒ．Ａ．Ｂｕｔｏｗ、１９８８
、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，１５３８−１５４１）。
本発明の目的は、新しい発現系または宿主内で異種ＤＮＡを発現させる方法を
提供することにある。
本発明の目的は、独立請求項１および１７によって、特に従属請求項２から１
６および１８から２１の望ましい実施態様によって達成される。
従って、本発明は、発現系で異種のＤＮＡを発現する方法であって、発現系と
して形質転換された繊毛虫細胞を用いることを含む前記の方法に関する。
２． 異種ＤＮＡ配列が遺伝子である、請求項１記載の方法。
３． ＤＮＡ配列がヒト起源である、請求項１または２に記載の方法。
４． ＤＮＡが動物起源である、請求項１または２に記載の方法。
５． ＤＮＡが野菜起源である、請求項１または２に記載の方法。
６． ＤＮＡが細菌起源である、請求項１または２に記載の方法。
７． ＤＮＡが真菌起源である、請求項１または２に記載の方法。
８． 以下の段階：
ａ）以下のＤＮＡ部分配列
ｉ）繊毛虫内で活性であり、発現させるべき異種ＤＮＡの転写を
引き起こすプロモーター；
ii）センス方向でプロモーターに連結された、発現させるべき異
種ＤＮＡ；
iii）転写を終結させ、そして繊毛虫内で活性である、終止シグ
ナル；
iv）所望であれば、宿主細胞内でのベクターの複製をもたらす、
適当なｏｒｉ（複製開始点）：
を含む発現ベクターの調製、および、
ｂ）段階（ａ）に記載した発現ベクターでの繊毛虫の形質転換：
を特に含む、請求項１から７のいずれか一項またはそれ以上の項に記載の方法。
９． ミクロキャリヤーボンバードメント法を用いて繊毛虫細胞をＤＮＡ充
填金粒子で形質転換する、請求項１から８のいずれか一項またはそれ以上の項に
記載の方法。
１０． 異種ＤＮＡを含むプラスミドｐＲＴ１０３ｇｕｓを繊毛虫細胞の形質
転換に用いる、請求項８または９に記載の方法。
１１． プラスミドが、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、
異種ＤＮＡのコード領域、およびポリアデニル化シグナルを含む、請求項１０記
載の方法。
１２． 繊毛虫細胞がホロトリチア（Ｈｏｌｏｔｒｉｃｈｉａ）、ペリトリチ
ア（Ｐｅｒｉｔｒｉｃｈｉａ）、スピロトリチア（Ｓｐｉｒｏｔｒｉｃｈｉａ）
およびスクトリア（Ｓｕｃｔｏｒｉａ）の群から選択される、請求項１から１１
のいずれか一項またはそれ以上の項に記載の方法。
１３． 繊毛虫細胞が、テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）、パラメシ
ウム（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ）、コルピディウム（Ｃｏｌｐｉｄｉｕｍ）、コル
ポダ（Ｃｏｌｐｏｄａ）、グラウコマ（Ｇｌａｕｃｏｍａ）、プラチオフリア（
Ｐｌａｔｙｏｐｈｒｙａ）、ボルチセルラ（Ｖｏｒｔｉｃｅｌｌａ）、ポトマク
ス（Ｐｏｔｏｍａｃｕｓ）、シュードコニレムブス（Ｐｓｅｕｄｏｃｏｈｎｉｌ
ｅｍｂｕｓ）、エウプロテス（Ｅｕｐｌｏｔｅｓ）、エンゲルマニエルラ（Ｅｎ
ｇｅｌｍａｎｉｅｌｌａ）およびスチロニチア（Ｓｔｙｌｏｎｙｃｈｉａ）の群
から選択される、請求項１２記載の方法。
１４． 繊毛虫スチロニチア・レムナエ（Ｓｔｙｌｏｎｙｃｈｉａ ｌｅｍｎ
ａｅ）種の細胞を発現系として用いる、請求項１３記載の方法。
１５． 異種ＤＮＡがインビトロで修飾される、請求項１から１４のいずれか
一項またはそれ以上の項に記載の方法。
１６． 発現生成物がタンパク質である、請求項１から１５のいずれか一項に
記載の方法。
１７． 異種ＤＮＡで形質転換することによって得ることのできる、繊毛虫。
１８． 形質転換が、ミクロキャリヤーボンバードメント法を用いて、ＤＮＡ
を充填した金粒子で行われた、請求項１７記載の繊毛虫。
１９． 以下の手順段階：
ａ）以下のＤＮＡ部分配列：
ｉ）繊毛虫内で活性であり、発現させる異種ＤＮＡの転写を引き
起こすプロモーター；
ii）センス方向でプロモータに連結される、発現させる異種ＤＮ
Ａ；
iii）転写を終結させ、そして繊毛虫内で活性である、終止シグ
ナル；
iv）所望であれば、宿主細胞内でのベクターの複製をもたらす、
適当なｏｒｉ（複製開始点）：
を含む発現ベクターの調製、および
ｂ）段階（ａ）に記載の発現ベクターでの繊毛虫細胞の形質転換：
によって得ることのできる、請求項１７または１８に記載の繊毛虫。
２０． 異種ＤＮＡを含むプラスミドｐＲＴ１０３ｇｕｓで形質転換された、
請求項１７から１９のいずれか一項またはそれ以上の項に記載の繊毛虫。
２１． プラスミドがカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、異
種ＤＮＡコード領域、およびポリアデニル化シグナルを含む、請求項２０記載の
繊毛虫。
２２． 発現べクターが、細胞から分泌される遺伝子生成物をもたらすシグナ
ル配列をさらに含む、請求項８記載の方法。
２３． 発現ベクターが、細胞から分泌される遺伝子生成物をもたらすシグナ
ル配列をさらに含む、請求項１９記載の繊毛虫。
以下に記載する実験用混合物は、初め繊毛虫細胞を形質転換するためにＤＮＡ
充填金粒子（DNA-loaded gold particles）でのミクロキャリヤーボンバードメ
ント法に適用するために用いられた。実験結果は、Ｂｉｏｒａｄ（バイオラド）
社から入手できるヘリウムガス動力装置（helium gas-powered appatatus）を用
いるこの方法によって、非常に簡単に且つ効果的に繊毛虫細胞を形質転換するこ
とが可能であることを示している。また、実験は、用いられる異種遺伝子が繊毛
虫細胞内に形質転換された後に、機能遺伝子生成物（functional gene product
）として発現されることを示している。それ故、この方法は、組み換えにどちら
が適当であるかによって変わるが、異種（「外来」）遺伝子および同種遺伝子の
両方で、バイオテクノロジーの目的のために繊毛虫を効果的に形質転換する可能
性を提供する。繊毛虫の好都合な分子生物学的特性は、最初に記載したように、
この形質転換技術を用いると、結果として、バイオテクノロジーへの応用につい
て、はじめから比較的大規模に開発できるようになる。
実施例：
１． ミクロキャリヤー粒子上へのＤＮＡの析出（precipitation）。
金の粒子（直径１．６μｍ）を４０ｍｇ／ｍｌの濃度で水中に懸濁する。２５
μｌの粒子の懸濁液を、５μｌのＤＮＡ溶液（ＴＥバッファー中濃度１μｇ／μ
ｌ）、２５μｌの２．５Ｍ ＣａＣｌ2溶液および２０μｌの０．１Ｍスペルミ
ジン溶液と共に、渦巻き攪拌しながら、混合する。室温で１０分間インキュベー
トした後、粒子をミニフュージ（ｍｉｎｉｆｕｇｅ）中で遠心分離（１２，００
０ｒｐｍ）することによって析出させる。５０μｌの上清を取り除いて捨て、残
さを再懸濁する。ボンバードメント用に３μｌの残さをピペットで膜（ラプチャ
ーディスク）（ｒｕｐｔｕｒｅ ｄｉｓｋ）上にのせる。
２． 用いられたマーカープラスミド
プラスミドｐＲＴ１０３ｇｕｓを形質転換に用いた。このプラスミドは、アン
ピシリン耐性、カリフラワーモザイクウイスル３５Ｓプロモーター、大腸菌β−
ガラクトシダーゼ遺伝子コード領域、およびポリアデニル化シグナルを持ち、植
物の形質転換に成功裡に用いられている。
３． 形質転換および用いられた生物体
形質転換は、ＢＩＯ−ＲＡＤ（バイオラド）社から入手できるバイオリスティ
ック粒子運搬システム（ＢＩＯＬＩＳＴＩＣ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｄｅｌｉｖｅ
ｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ）（ＰＤＳ−１，０００／Ｈｅ）を用いて、行った。
繊毛虫スチロニチア・レムナエ（Stylonychia lemnae）種［繊毛虫、ヒポトリ
チダ（Hypotrichida）］、Ｄｏ−６／Ｅ株、の細胞を形質転換実験に用いた。細
胞は、実験前一日間断食させた。実験の直前、それらを、メッシュ幅３０μｍの
ナイロンガーゼ上で濃縮し、プラスチックのペトリ皿内、可能な最小量の培養液
［（プリングスヘイム溶液）（Pringsheim's solution）］でリンスした。濃縮
細胞を含む皿を形質転換用装置の容器の床上においた。装置で許される可能な最
大距離から、ボンバードメントを行った。バースト圧（burs tpressure）４５０
ｐｓｉおよび関連するラプチャーディスクを用いた。ボンバードメント後すぐに
、細胞を培養液内に希釈し、飼料となる生物［クロロゴニウム エロンガツム（
Chlorogonium elongatum）］を用いて栄養補給（feeding）を低レベルで開始し
た。
４．グルクロニダーゼ活性の表示
グルクロニダーゼの基質として、２５ｍｇの５−ブロモ−４−クロロ−３−イ
ンドリルグルクロニドを、４ｍｌのＤＭＳＯおよび４０ｍｌの１０ｍＭ ＥＤＡ
、１００ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．０、０．１％トリトン（
Ｔｒｉｔｏｎ）中に溶解する。形質転換実験後２日目に、形質転換された繊毛虫
細胞を、ろ過によりろフィルター上に集めた。繊毛虫細胞を含むフィルターを、
基質溶液中、３２℃でインキュベートした。トリトンを含む溶液で細胞を部分的
に溶解させる。短い時間の後、形質転換されたグルクロニダーゼ遺伝子を発現す
る細胞は、はっきりした青色の発色によって認識することができる。形質転換さ
れていないがその他は同様に処理した対照細胞は、インキュベーションの数時間
後でさえ、いかなる青色の発色も示さない。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １． 発現系として形質転換された繊毛虫細胞を用いることを含む、発現系 で異種ＤＮＡを発現させる方法。 ２． 異種ＤＮＡ配列が遺伝子である、請求項１記載の方法。 ３． ＤＮＡ配列がヒト起源である、請求項１または２に記載の方法。 ４． ＤＮＡが動物起源である、請求項１または２に記載の方法。 ５． ＤＮＡが野菜起源である、請求項１または２に記載の方法。 ６． ＤＮＡが細菌起源である、請求項１または２に記載の方法。 ７． ＤＮＡが真菌起源である、請求項１または２に記載の方法。 ８． 以下の段階： ａ）以下のＤＮＡ部分配列 ｉ）繊毛虫内で活性であり、発現させるべき異種ＤＮＡの転写を 引き起こすプロモーター； ii）センス方向でプロモーターに連結された、発現させるべき異 種ＤＮＡ； iii）転写を終結させ、そして繊毛虫内で活性である、終止シグ ナル； iv）所望であれば、宿主細胞内でのベクターの複製をもたらす、 適当なｏｒｉ（複製開始点）： を含む発現ベクターの調製、および、 ｂ）段階（ａ）に記載した発現ベクターでの繊毛虫の形質転換： を特に含む、請求項１から７のいずれか一項またはそれ以上の項に記載の方法。 ９． ミクロキャリヤーボンバードメント法を用いて繊毛虫細胞をＤＮＡ充 填金粒子で形質転換する、請求項１から８のいずれか一項またはそれ以上の項に 記載の方法。 １０． 異種ＤＮＡを含むプラスミドｐＲＴ１０３ｇｕｓを繊毛虫細胞の形質 転換に用いる、請求項８または９に記載の方法。 １１． プラスミドが、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、 異種ＤＮＡのコード領域、およびポリアデニル化シグナルを含む、請求項１０記 載の方法。 １２． 繊毛虫細胞がホロトリチア（Ｈｏｌｏｔｒｉｃｈｉａ）、ペリトリチ ア（Ｐｅｒｉｔｒｉｃｈｉａ）、スピロトリチア（Ｓｐｉｒｏｔｒｉｃｈｉａ） およびスクトリア（Ｓｕｃｔｏｒｉａ）の群から選択される、請求項１から１１ のいずれか一項またはそれ以上の項に記載の方法。 １３． 繊毛虫細胞が、テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）、パラメシ ウム（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ）、コルピディウム（Ｃｏｌｐｉｄｉｕｍ）、コル ポダ（Ｃｏｌｐｏｄａ）、グラウコマ（Ｇｌａｕｃｏｍａ）、プラチオフリア（ Ｐｌａｔｙｏｐｈｒｙａ）、ボルチセルラ（Ｖｏｒｔｉｃｅｌｌａ）、ポトマク ス（Ｐｏｔｏｍａｃｕｓ）、シュードコニレムブス（Ｐｓｅｕｄｏｃｏｈｎｉｌ ｅｍｂｕｓ）、エウプロテス（Ｅｕｐｌｏｔｅｓ）、エンゲルマニエルラ（Ｅｎ ｇｅｌｍａｎｉｅｌｌａ）およびスチロニチア（Ｓｔｙｌｏｎｙｃｈｉａ）の群 から選択される、請求項１２記載の方法。 １４． 繊毛虫スチロニチア・レムナエ（Ｓｔｙｌｏｎｙｃｈｉａ ｌｅｍｎ ａｅ）種の細胞を発現系として用いる、請求項１３記載の方法。 １５． 異種ＤＮＡがインビトロで修飾される、請求項１から１４のいずれか 一項またはそれ以上の項に記載の方法。 １６． 発現生成物がタンパク質である、請求項１から１５のいずれか一項に 記載の方法。 １７． 異種ＤＮＡで形質転換することによって得ることのできる、繊毛虫。 １８． 形質転換が、ミクロキャリヤーボンバードメント法を用いて、ＤＮＡ を充填した金粒子で行われた、請求項１７記載の繊毛虫。 １９． 以下の手順段階： ａ）以下のＤＮＡ部分配列： ｉ）繊毛虫内で活性であり、発現させる異種ＤＮＡの転写を引き 起こすプロモーター； ii）センス方向でプロモータに連結される、発現させる異種ＤＮ Ａ； iii）転写を終結させ、そして繊毛虫内で活性である、終止シグ ナル； iv）所望であれば、宿主細胞内でのベクターの複製をもたらす、 適当なｏｒｉ（複製開始点）： を含む発現ベクターの調製、および ｂ）段階（ａ）に記載の発現ベクターでの繊毛虫細胞の形質転換： によって得ることのできる、請求項１７または１８に記載の繊毛虫。 ２０． 異種ＤＮＡを含むプラスミドｐＲＴ１０３ｇｕｓで形質転換された、 請求項１７から１９のいずれか一項またはそれ以上の項に記載の繊毛虫。 ２１． プラスミドがカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、異 種ＤＮＡコード領域、およびポリアデニル化シグナルを含む、請求項２０記載の 繊毛虫。 ２２． 発現ベクターが、細胞から分泌される遺伝子生成物をもたらすシグナ ル配列をさらに含む、請求項８記載の方法。 ２３． 発現ベクターが、細胞から分泌される遺伝子生成物をもたらすシグナ ル配列をさらに含む、請求項１９記載の繊毛虫。
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