JP2003265187A - 変異p53ライブラリー - Google Patents
変異p53ライブラリーInfo
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Abstract
くの変異が知られているが、その変異は該p53 の果たす
機能と密接な相関関係を有することも指摘されるように
なってきている。p53 遺伝子を解析するためには、少な
くとも1塩基変異の網羅的変異遺伝子ライブラリーを構
築することが求められる。 【解決手段】 効率よく網羅的変異遺伝子ライブラリー
を構築するためには、変異誘導を指定するオリゴヌクレ
オチドをプライマーとして第1回目のPCR をした後、第
1回目のPCR 産物をメガプライマーとして第2回目のPC
R を行い、さらにこうして得られるPCR 産物をギャップ
リペアベクターを使用することにより達成することがで
きる。得られた網羅的変異遺伝子ライブラリーは、核酸
アレイ作製に有用であるばかりでなく、プロテオミック
ス技術に利用でき、例えばp53 遺伝子の解析に有用であ
る。
Description
基変異を含有している網羅的変異p53 ライブラリーに関
する。さらに、該網羅的変異p53 ライブラリーを使用し
て得られる核酸アレイ及びそれを用いた遺伝子解析技
術、さらにはプロテオミックス技術に関する。本発明
は、新規な一塩基変異を有する変異p53 、その遺伝子、
該遺伝子を保有する形質転換された宿主細胞などにも関
する。
A 塩基配列に対し、種々の欠損、挿入、あるいは置換を
行い、当該タンパク質のアミノ酸配列を変えることによ
って、DNA やタンパク質の構造解析や機能解析を行うこ
とが盛んになっている。更にこれらの研究により、タン
パク質の機能改変を行って産業的に有用なタンパク質を
生産する試みも多くなされつつある。これまでの効率的
に変異を形成する方法としては、特定のDNA 断片を化学
的に処理して変異を導入する方法や、エラーを生じやす
い条件でのPCRにより、ランダムに変異を導入する方法
があるが、それらは(1)変異の導入効率が悪い、(2)1つ
のDNA クローンに複数の変異が導入され易すい、(3) サ
イレント変異、フレームシフト変異またはナンセンス変
異などの生物学的に有用性の低い変異が数多く得られ
る、(4)DNAの一次構造により変異の入りやすい部位と入
りにくい部位があるなどの欠点があり、実際には網羅的
に変異体を得ることは不可能であり、網羅的変異ライブ
ラリーを構築するのに成功したとの報告はない。
技術としては、部位特異的変異導入法があるが、これま
でDNA 塩基配列に種々の欠損、挿入、置換を行う場合に
は、合成オリゴヌクレオチドを用いた点突然変異導入法
が多く用いられている。しかし、これまでの多くの方法
は、変異を導入しようとする塩基配列のオリゴヌクレオ
チドを化学的に合成し、一本鎖DNA の相補的な部分に結
合させた後に、DNA 鎖の合成と環状化を行って環状二本
鎖変異cDNA を得る方法である。したがって、どの方法
も一つの変異体を得るための変異導入効率の改良に視点
が置かれ、変異導入数に関する効率性や、導入された変
異がコードするタンパク質の機能解析を効率化すること
は考慮されていない。このため、DNA断片に網羅的に変
異を導入するには不向きである。
てコードされるタンパク質機能を解析するためには、哺
乳動物細胞を用いる方法が一般的だが、細胞培養、遺伝
子導入、機能アッセイ系に時間とコストがかかり、また
手技も煩雑である。このため解析できる変異体数には限
界がある。一方、酵母を用いて異種(例えばヒト)のcD
NAの機能解析が可能になってきている。例えば、p53 を
含むヒトがん抑制遺伝子の機能解析に酵母を用いること
により、比較的多くの変異体を解析することが可能とな
った。しかしながら、網羅的な変異ライブラリーを効率
よく解析するためには未だ不十分であるのでその改良が
必要である。
瘍関連遺伝子にミスセンス変異が見つかった場合、とき
に、それが病的意義を有するか否かを評価するアッセイ
方法が必要になる。ミスセンス変異の大部分は点変異
(1塩基置換)であることから、遺伝子変異(特にミス
センス変異)を網羅的に評価する方法として、1塩基置
換によって生じうるすべての1アミノ酸置換型変異(ミ
スセンス変異)を目的の遺伝子翻訳領域に構築し、それ
らを発現系により既知の遺伝子産物機能について評価す
る方法が考えられる。そのような網羅的変異解析の結果
をデータベース化することにより、検出された変異が既
知のものであるか新しく報告されたものであるかを問わ
ず、1アミノ酸置換型ミスセンス変異が機能に及ぼす影
響について、データベースにアクセスすることにより確
認することが可能になる。
を解決し、人為的に網羅的点変異ライブラリーを作成
し、変異cDNAによってコードされるタンパク質の機能解
析を効率的に行う方法の開発を目的とするものである。
特に、これまで報告された変異の80%以上がミスセンス
変異であるp53遺伝子について1塩基置換によって生じう
るすべての1アミノ酸置換型変異(2314種類)の構築す
ることは有用である。本発明は、網羅的な点変異ライブ
ラリー作製を、PCR-メガプライマー(PCR-megaprimer)法
と増幅された産物をギャップリペアベクターを使用して
DNA ライブラリー構築を行うことを特徴としているもの
である。本発明の一つの態様では、p53発現ベクター上
への部位特異的変異導入は、2314種類の特異的ミスマッ
チオリゴヌクレオチドを合成した後、PCR-megaprimer法
で各変異を有するp53翻訳領域全長を合成することによ
り行った。目的の変異が正しく導入され、かつ、他の変
異がないことを確認するためにp53 cDNAの翻訳領域全長
をシークエンスした。オリゴヌクレオチドの合成からDN
Aシークエンシングに至るまでの全過程は原則として96
ウェルマイクロプレート上で行った。作成された各p53
変異体の塩基配列特異的DNA結合(WAF1プロモーターを
使用)による転写活性化能を、出芽酵母を用いたGFPリ
ポーターアッセイで評価した。
ラリー中の変異p53 塩基配列は、野生型p53 の第2コド
ンから最終コドン(第393 コドン)のそれぞれにおい
て、1塩基置換に基づいて生じうる1アミノ酸変異を指
定している変異p53 塩基配列であり、該1塩基置換が、
野生型p53 の第2番目から第393 番目までのアミノ酸の
中に一つのアミノ酸変異を生ぜしめるものである。そし
て、該網羅的変異p53 ライブラリーは、野生型p53 の第
2コドンから最終コドンのまでの全ての種類の該1塩基
置換を有する変異p53 塩基配列からなるという網羅的な
特徴を有する集合体である。代表的には、2314種類の変
異p53 塩基配列、すなわち、点変異を有するp53 cDNA塩
基配列を含むものであり、点変異は、1塩基置換によっ
てp53の第2コドンから最終コドン(第393 コドン)に
生じうる全て(2314種類)の1アミノ酸置換を作成でき
るように、野生型塩基配列に導入されたものである(網
羅的変異の導入)。従って、2314種類の変異p53は、塩
基配列、アミノ酸配列ともに野生型p53と1塩基、1ア
ミノ酸だけ異なる。また、2314種類の変異p53の塩基配
列、アミノ酸配列は、互いに異なる。なお、第1コドン
は翻訳開始コドンであり、変異導入により発現が不可能
になり、生物学的意義が少ない。
ダム変異導入法ではなく、部位特異的変異導入法を利用
し、意図した変異を任意に作成可能であり、変異導入に
PCR法を用いることにより、効率良く多くの変異cDNA断
片を作成することが可能である。本発明の変異ライブラ
リー作製法では、変異導入のための合成オリゴヌクレオ
チドは、同一のPCR反応条件で複数の変異導入断片を作
成することができるように設計されている(例えば、26
merで、5'側から14番目の塩基に点変異が導入されてい
る)。そして、変異導入のための合成オリゴヌクレオチ
ドは、1回のPCR反応で多数(96種類)の変異導入断片
を作成することができるように、96ウェル規格のプレー
ト内に作成されて、意図した変異ライブラリー作製に付
されることが可能である。本発明の変異ライブラリー作
製法では、1回目のPCR反応で得られた変異断片を酵母
内にクローン化するために可能なDNA断片にするため
に、メガプライマーPCR法(Sarkar, G. & Sommer, S.
S., The "megaprimer" methodof site-directed mutage
nesis., Biotechniques, 8: 404-407, 1990)を用いてい
る。本発明では、ギャップリペアベクターに変異cDNA断
片を組込むことにより、効率的に組換えの確認並びに保
証が実施でき、大量のライブラリー集合体を正確に作製
できる。
その有する観点は、以下の記載より当業者にとっては明
白であろう。しかしながら、以下の記載及び具体的な実
施例等の記載を含めた本件明細書の記載は本発明の好ま
しい態様を示すものであり、説明のためにのみ示されて
いるものであることを理解されたい。本明細書に開示し
た本発明の意図及び範囲内で、種々の変化及び/又は改
変(あるいは修飾)をなすことは、以下の記載及び本明
細書のその他の部分からの知識により、当業者には容易
に明らかであろう。本明細書で引用されている全ての特
許文献及び参考文献は、説明の目的で引用されているも
ので、それらは本明細書の一部としてその内容はここに
含めて解釈されるべきものである。
る方法は存在せず、さらにp53 遺伝子に網羅的に変異を
導入して、網羅的変異p53 遺伝子ライブラリーを作成す
ることに成功したとの報告はない。多くの変異体を人為
的に得る方法としてランダム変異導入法があるが、それ
で網羅的変異体を作製することは不可能である。また、
部位特異的変異導入法は数多く報告されているが、これ
までの方法は多数の変異体作成には向かない。また、網
羅的に変異を導入した実例はない。p53 遺伝子に関連し
て酵母を用いたヒトcDNAの機能解析の報告はあるが、網
羅的な変異導入と組み合わせて実施された例はない。ミ
スセンス変異の大部分は点変異(1塩基置換)であるこ
と及び遺伝子変異(特にミスセンス変異)を網羅的に評
価するために、網羅的変異p53 遺伝子ライブラリーは、
次のような構築基準に従いその変異p53 遺伝子ライブラ
リーを作成する:1塩基置換によって生じうるすべての
1アミノ酸置換型変異(ミスセンス変異)を目的の遺伝
子翻訳領域に構築するようにする。すなわち、塩基置換
によって生ずる1アミノ酸置換を重複なく、網羅するラ
イブラリーとする。より具体的には、本発明の網羅的1
塩基変異p53 遺伝子ライブラリーは、次のような構築基
準によりそれを作成する: (1) 野生型〔配列番号:2357〕と異なるアミノ酸をコ
ードする1塩基変異である; (2) 当該1アミノ酸置換に関して既にその報告がなさ
れている場合(既知の場合)で且つ該アミノ酸をコード
するコドンが複数存在する場合には、最も多くの報告が
なされているコドンを選択する;及び (3) 当該1アミノ酸置換に関して新規の場合(その報
告が未だ一切なされていない場合)で且つ該アミノ酸を
コードするコドンが複数存在する場合には、自然界にお
いて最も使用頻度の高いコドンを選択する。 p53 遺伝子〔配列番号:2356〕には、72番目のアミノ酸
が ccc/Proの他にcgd/Arg といった遺伝子多型が存在す
ることは知られており、該cgd/Arg 遺伝子多型について
も同様に変異ライブラリーを構築して網羅的変異p53 遺
伝子ライブラリーを作成することができる。本発明はこ
うした遺伝子多型p53 遺伝子に関する網羅的変異p53 遺
伝子ライブラリーも包含する。本明細書中、「ポリメラ
ーゼ連鎖反応」又は「PCR 」とは、一般的に、米国特許
第 4683195号明細書に記載されたような方法を指し、例
えば、所望のヌクレオチド配列をインビトロで酵素的に
増幅するための方法を指している。一般に、PCR 法は、
鋳型核酸と優先的にハイブリダイズすることのできる2
個のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、プライ
マー伸長合成を行うところのサイクルを繰り返し行うこ
とを含むものである。典型的には、PCR 法で用いられる
プライマーは、鋳型内部の増幅されるべきヌクレオチド
配列に対して相補的なプライマーを使用することがで
き、例えば、該増幅されるべきヌクレオチド配列とその
両端において相補的であるか、あるいは該増幅されるべ
きヌクレオチド配列に隣接しているものを好ましく使用
され得る。鋳型核酸(例えば、mRNAを鋳型にして合成さ
れたcDNA) と該遺伝子に基づいてデザインされたプライ
マーとを、10×反応緩衝液 (Pfu DNA ポリメラーゼに添
付されている) 、dNTPs ( デオキシヌクレオシド三リン
酸dATP, dGTP, dCTP, dTTPの混合物)、Pfu DNA ポリメ
ラーゼ及び脱イオン蒸留水と混合する。混合物を、例え
ば、GeneAmp 9700 PCR system, Perkin-Elmer/Cetus な
どの自動サーマルサイクラーを用いて一般的なPCR サイ
クル条件下にそのサイクルを繰り返すが、増幅のための
サイクル数は適宜目的に応じて適当な回数とすることが
できる。アニーリングの反応温度及び時間は適宜実験に
よって適当な値を選択できるし、変性反応及び伸長反応
の時間も、予想されるPCR 産物の鎖長に応じて適当な値
を選択できる。アニーリングの反応温度は、通常プライ
マーと鋳型DNA とのハイブリッドのTm値に応じて変える
ことが好ましい。
(1) p53 塩基配列のうちの1塩基の点変異を指定する変
異オリゴヌクレオチドプライマーを用意し、該プライマ
ーと共通オリゴヌクレオチドプライマーとを組合わせて
使用し且つ野生型p53 塩基配列を有する鋳型核酸を使用
してポリメラーゼチェインリアクション(polymerase ch
ain reaction: PCR)を行って、第1回のPCR 産物を製造
し、次に(2) 共通オリゴヌクレオチドプライマーとを組
合わせて該第1回のPCR 産物をプライマーとして使用し
且つ野生型p53 塩基配列を有する鋳型核酸を使用してPC
R を行い、該第2回のPCR を、2段階の条件下に行っ
て、第2回のPCR 産物を製造し、(3) 該第2回のPCR 産
物をギャップリペアベクターに組込んで、宿主細胞を形
質転換し、所望の変異p53 塩基配列を保有する形質転換
体を選択する。該変異オリゴヌクレオチドプライマー
は、野生型p53 塩基配列からデザインしてほぼその中心
部位に1塩基の点変異を指定するように作製される。PC
R を行って変異誘発を起こさせるのに使用する変異合成
オリゴヌクレオチドとしては、塩基数25〜29のオリゴヌ
クレオチドが好ましい。オリゴヌクレオチドの作製は、
当該分野で知られた方法で行うことができ、例えば自動
DNA 合成装置、例えば、model 381A DNA synthesizer,
Applied Biosystemsなどを用い、フォスフォジエステル
法、フォスフォトリエステル法、フォスフォアミダイト
法などにより合成できる。
はPCR時にミスマッチとなるため、導入変異部は合成オ
リゴヌクレオチドの3'側から可能な限り5'側に離れてい
た方が、PCRの成功のためには有利である。一方、合成
変異オリゴヌクレオチドを使用して合成された1回目の
PCR産物はメガプライマーとして2回目のPCRに使用され
るが、この場合、合成オリゴの5'側がメガプライマーの
3'側になる。このため変異部位はメガプライマーの3'側
(すなわち、変異合成オリゴヌクレオチドの5'側)に近
すぎない方が、2回目のPCR を成功せしめるために望ま
しい。したがって、導入変異塩基部位は変異合成オリゴ
ヌクレオチド配列の中心部位にあるのが望ましい。第1
回目のPCRに用いる共通合成オリゴヌクレオチドは、鋳
型と相同な塩基配列を有し、かつ、各変異合成オリゴヌ
クレオチドと共通合成オリゴヌクレオチドと組み合わせ
たPCR反応がうまくいくことが必要であり、かつギャッ
プリペアの際に、直線化ギャップリペアベクターの5'ま
たは3'端のどちらか一方と100bp以上の相同な配列を提
供することが必要である。さらにまた、第2回目のPCR
に用いる共通合成オリゴヌクレオチドは、鋳型と相同な
塩基配列を有し、かつ、第1回目のPCR産物と組み合わ
せたPCR反応がうまくいくことが必要であり、かつギャ
ップリペアの際に、直線化ギャップリペアベクターの5'
または3'端のどちらか一方と100bp以上の相同な配列を
提供することが必要である。言い換えれば、変異導入さ
れたPCR産物を組込むための直線化したギャップリペア
ベクターは、第2回目のPCR産物の5'または3'端と少な
くとも100bp以上相同であることが必要である。
導入されたPCR産物の組込みの成功を確認できるものが
好ましい。該ギャップリペアベクターは、所定の変異導
入されたPCR産物組込んだ場合、変異導入されたp53 を
発現可能であるものであることが好ましい。かくして、
変異p53 塩基配列は、該ギャップリペアベクター中で作
動可能な状態で連結されていることが望ましい。代表的
なギャップリペアベクターとしては、プラスミドpSS16
、プラスミドp53 Nco1及びプラスミドp53 Stu1由来の
ものが挙げられるがそれには限定されない。宿主細胞と
しては、有利にp53 ポリペプチドあるいはその変異体が
保持されていることを容易に確認できるものが好まし
く、さらには、以下の検出可能なタンパク質をコードす
る核酸の保持を確認するのが容易なものが好ましい。該
宿主細胞は、原核細胞、真核細胞のいずれであってもよ
く、大腸菌、酵母、動物細胞のいずれであってもよい
が、好ましくは酵母を使用できる。変異p53 をコードす
る核酸は、ゲノム中に安定に取込まれるか、或いは自律
複製プラスミド上に維持されてもよい。
ドを保有せしめてあるものを使用できる。レーポーター
プラスミドとしては、p53 ポリペプチドあるいはその変
異体と特異的に相互作用するDNA 配列を持つものであ
る。代表的には、プラスミド中に該DNA 配列は作動可能
な状態で連結されている。該相互作用はp53 ポリペプチ
ドあるいはその変異体が、そのDNA 配列上の結合部位へ
直接的に結合する或いは間接的に結合することによって
特徴づけられものであり、最も好適にはp53 ポリペプチ
ドあるいはその変異体が、該結合部位のDNA に直接結合
する。間接的に結合する場合とは、p53 ポリペプチドあ
るいはその変異体が、該結合部位に結合する別の実体
(一般的には、ある種のタンパク質あるいは核酸)を介
して影響を与える様式で働くものを指す。例えばp53 結
合部位を持つものが利用可能である。p53 結合部位は、
当該分野で知られたものを選択してそれを利用すること
ができる。当該レーポータープラスミドにおいては、検
出可能なタンパク質を発現するように作動可能な状態で
連結されているように構成されたものが好ましい。本発
明で使用される検出可能なタンパク質としては、いかな
る所望のタンパク質であってよい。
るタンパク質は、標準のアッセイ法、例えば比色アッセ
イによって、容易に検出されるβガラクトシダーゼ或い
はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの
様な酵素である。別の好適な実施態様においては、該検
出可能なタンパク質は抗生物質に対する耐性を与える酵
素であって、検出可能なタンパク質のレベルは、細胞が
当該抗生物質の存在下に成育する能力によって測定され
る。更に別の好適な実施態様において、上記検出可能な
タンパク質は、細胞の生存に必要な物質(例えば、アミ
ノ酸、ビタミン、プリン或いはピリミジン)の生成、即
ち、生合成に必須であり、検出可能なタンパク質のレベ
ルは上記のトランスフェクトされた細胞が上記物質の非
存在下に成育する能力によって測定される。より好適な
実施態様においては、該検出可能なタンパク質は、螢光
を発する物質であってよい。該螢光を発する物質として
は、オワンクラゲ (Aequorea victorea)などの発光クラ
ゲ由来の緑色螢光タンパク質(green fluorescent prote
in: GFP)、それを改変した変異体(GFPバリアント)、例
えば、EGFP (Enhanced-humanized GFP), rsGFP (red-sh
ift GFP), 黄色螢光タンパク質 (yellow fluorescent p
rotein: YFP), 緑色螢光タンパク質 (greenfluorescent
protein: GFP),藍色螢光タンパク質 (cyan fluorescen
t protein:CFP), 青色螢光タンパク質 (blue fluoresce
nt protein: BFP), ウミシイタケ (Renilla reniformi
s) 由来のGFP などが挙げられる。
態で連結されている」という用語は、p53 ポリペプチド
あるいはその変異体に対する結合部位が、該変異体ポリ
ペプチドなどによる当該DNA の転写調節を可能にする様
に、上記検出可能なタンパク質をコードするDNA と近接
して配置されていることを意味してよい、あるいはp53
ポリペプチドあるいはその変異体が安定的に保持された
り、任意に発現できるこうな形態でプロモーターなどの
コントロール配列の下流に配置されていることを意味し
てよい。該p53 ポリペプチドあるいはその変異体とレー
ポータープラスミド中の該核酸の結合部位との相互作用
は、p53 ポリペプチドあるいはその変異体遺伝子に依存
して、上記検出可能なタンパク質をコードするDNA の転
写を活性化或いは抑制する様に作用して転写を調節する
ものであることができる。塩基配列の決定は、ダイデオ
キシ法、例えば M13ダイデオキシ法など、Maxam-Gilber
t 法などを用いて行うことができるが、市販のシークエ
ンシングキット、例えば Taqダイプライマーサイクルシ
ークエンシングキット、Sequenase v 2.0kit などを用
いたり、自動塩基配列決定装置、例えば蛍光DNA シーケ
ンサー装置などを用いて行うことが出来る。ダイデオキ
シ法に用いられるポリメラーゼとしては、例えば、DNA
ポリメラーゼ Iのクレノー・フラグメント、AMV 逆転写
酵素、Taq DNA ポリメラーゼ、T7 DNAポリメラーゼ、修
飾 T7 DNA ポリメラーゼなどが挙げられる。
有する変異p53 塩基配列を有する核酸は、例えば、p-Di
rect (Clontech), pCR-Script TM SK(+) (Stratagene),
pGEM-T (Promega), pAmp(TM: Gibco-BRL)などの市販の
プラスミドベクターを用いてそれをクローニングするこ
ともできる。本発明で得られる核酸は、一本鎖DNA 、二
本鎖DNA 、RNA 、DNA:RNA ハイブリッドなどを包含して
よい。本発明で得られたDNA 断片を、下記で詳しく説明
するような適当なベクター、例えば、プラスミドpEX 、
pMAMneo 、pKG5、pET3a (Stratagene) などのベクター
に組込み、下記で詳しく説明するような適当な宿主細
胞、例えば、大腸菌、酵母、胚性幹細胞(ES細胞) 、CH
O 細胞、COS 細胞などで発現させることができる。ま
た、該DNA 断片は、そのままあるいは適当な制御配列を
付加したDNA 断片として、または適当なベクターに組込
み、そして動物などの細胞に導入することができる。所
定の遺伝子を発現するトランスジェニック動物を作成す
ることもできる。動物としては、哺乳動物が挙げられ、
例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ウシな
どが挙げられる。好ましくは、マウスなどの動物の受精
卵に該DNA 断片を導入して、トランスジェニック動物を
作成することができる。その方法は当業者に知られた方
法、例えば、米国特許明細書第4736866 号、同第487000
9 号等に記載された方法に従い行うことができる。
胞などに導入する方法としては当該分野で知られた方法
あるいはそれと実質的に同様な方法で行うことができ、
例えばリチウム酢酸法(例えば、H. Ito et al., Agri
c. Biol. Chem., 47: 1691-1692 (1983); H. Ito et a
l., Agric. Biol. Chem., 48: 341-347 (1984)など)、
リン酸カルシウム法(例えば、F. L. Graham et al., V
irology, 52: 456, 1973など)、DEAE- デキストラン法
(例えば、D. Warden et al., J. Gen. Virol.,3: 371,
1968など)、エレクトロポレーション法(例えば、E.
Neumann et al.,EMBO J, 1: 841, 1982 など)、マイク
ロインジェクション法、リボソーム法、ウイルス感染
法、ファージ粒子法などが挙げられる。こうして所定の
遺伝子をトランスフェクションされた酵母や動物細胞な
どの産生する遺伝子産物は、それを解析することもでき
る。解析には、例えば、モノクローナル抗体などの抗体
を用いた免疫沈降実験あるいはウェスタンブロッティン
グなどを用いることができる。所定の遺伝子を組込むプ
ラスミドとしては遺伝子工学的に常用される宿主細胞
(例えば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞宿主、酵母、ES
細胞、CHO 細胞、COS 細胞等の真核細胞宿主、Sf21等の
昆虫細胞宿主)中で該DNA が発現できるプラスミドであ
ればどのようなプラスミドでもよい。こうした配列内に
は、例えば選択した宿主細胞で発現するのに好適なコド
ンに修飾されていることができるし、制限酵素部位が設
けられていることもできるし、目的とする遺伝子の発現
を容易にするための制御配列、促進配列など、目的とす
る遺伝子を結合するのに役立つリンカー、アダプターな
ど、さらには抗生物質耐性などを制御したり、代謝を制
御したりし、選別などに有用な配列等を含んでいること
ができる。
大腸菌を宿主とするプラスミドでは、トリプトファンプ
ロモーター(trp) 、ラクトースプロモーター(lac) 、ト
リプトファン・ラクトースプロモーター(tac) 、リポプ
ロテインプロモーター(lpp)、λファージ PL プロモー
ター等を、動物細胞を宿主とするプラスミドでは、SV40
レートプロモーター、MMTV LTRプロモーター、RSV LTR
プロモーター、CMV プロモーター、SRαプロモーター等
を、酵母を宿主とするプラスミドでは、GAL1、GAL10 プ
ロモーター等を使用し得る。さらにCYC1, HIS3, ADH1,
PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, EN0, TP
1, AOX1等の制御系を使用することもできる。所望ポリ
ペプチドをコードするDNA のトランスクリプションを促
進するためエンハンサーをベクターに挿入することがで
き、そうしたエンハンサーとしてはプロモーターに働い
てトランスクリプションを促進する作用を持つ、通常お
およそ10〜100 bpの cis作用を持つエレメントのものが
挙げられる。多くのエンハンサーが、グロビン、エラス
ターゼ、アルブミン、α- フェトプロテイン、インシュ
リンなどの哺乳動物遺伝子から知られている。代表的に
は、真核細胞感染性ウイルスから得られるエンハンサー
が好適に使用でき、例えばレプリケーションオリジンの
レート領域にあるSV40エンハンサー (100-270 bp), サ
イトメガロウイルスの初期プロモーターのエンハンサ
ー, ポリオーマのレプリケーションオリジンのレート領
域にあるエンハンサー, アデノウイルスのエンハンサー
などの例が挙げられる。また、必要に応じて、宿主にあ
ったシグナル配列を付加することもでき、それらは当業
者によく知られているものを使用できる。
例えばpBR322, pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, pSP64,
pSP65, pTZ-18R/-18U, pTZ-19R/-19U, pGEM-3, pGEM-
4, pGEM-3Z, pGEM-4Z, pGEM-5Zf(-), pBluescript KS
TM (Stratagene) などが挙げられる。大腸菌での発現に
適したプラスミドベクターとしては、pAS, pKK223 (Pha
rmacia), pMC1403, pMC931, pKC30, pRSET-B (Invitrog
en) なども挙げられる。動物細胞を宿主とするプラスミ
ドとしては、SV40ベクター、ポリオーマ・ウイルスベク
ター、ワクシニア・ウイルスベクター、レトロウイルス
ベクターなどが挙げられ、例えばpcD, pcD-SRα, CDM8,
pCEV4, pME18S, pBC12BI, pSG5 (Stratagene) などが
挙げられる。酵母を宿主とするプラスミドとしては、YI
p 型ベクター、YEp 型ベクター、YRp 型ベクター、YCp
型ベクターなどが挙げられ、例えばpGPD-2などが挙げら
れる。宿主細胞としては、宿主細胞が大腸菌の場合、例
えば大腸菌K12 株に由来するものが挙げられ、例えばNM
533 XL1-Blue, C600, DH1, DH5, DH11S, DH12S, DH5α,
DH10B, HB101, MC1061, JM109, STBL2, BL21(DE3)/pLy
sS などが挙げられる。宿主細胞が酵母の場合、例えば
Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces prom
be, Pichia pastoris, Kluyveromyces 株, Candida, Tr
ichoderma reesia, その他の酵母株などが挙げられ
る。宿主細胞が動物細胞の場合、例えばアフリカミドリ
ザル線維芽細胞由来のCOS-7 細胞、COS-1細胞、CV-1細
胞、ヒト腎細胞由来 293細胞、ヒト表皮細胞由来A431細
胞、ヒト結腸由来 205細胞、マウス線維芽細胞由来のCO
P 細胞、MOP 細胞、WOP 細胞、チャイニーズ・ハムスタ
ー細胞由来のCHO 細胞、CHO DHFR- 細胞、ヒトHeLa細
胞、マウス細胞由来C127細胞、マウス細胞由来NIH 3T3
細胞、マウスL 細胞、9BHK, HL-60, U937, HaK, Jurkat
細胞、ヒトES細胞、マウスES細胞(例えば、EK細胞、ES
-D3 細胞など) 、ハムスターES細胞、ブタES細胞、その
他の形質転換されて得られたセルライン、通常の二倍体
細胞、インビトロの一次培養組織から誘導された細胞株
などが挙げられる。昆虫細胞としては、カイコ核多角体
病ウイルス (Bombyx mori nuclear polyhedrosis viru
s) あるいはそれに由来するものをベクターとし、カイ
コ幼虫あるいはカイコ培養細胞、例えばBM-N細胞などを
用いることが挙げられる。Agrobacterium tumefaciens
などを利用して、植物細胞を宿主細胞として使用するこ
とも可能であり、それに適するベクターと共に、それら
は当該分野で広く知られている。
該分野で知られたあるいは汎用されている制限酵素、逆
転写酵素、DNA 断片をクローン化するのに適した構造に
修飾したりあるいは変換するための酵素であるDNA 修飾
・分解酵素、DNA ポリメラーゼ、末端ヌクレオチジルト
ランスフェラーゼ、DNA リガーゼなどを用いることが出
来る。制限酵素としては、例えば、R. J. Roberts, Nuc
leic Acids Res., 13:r165, 1985; S. Linn et al. ed.
Nucleases, p. 109, Cold Spring Harbor Lab., Cold
Spring Harbor, New York, 1982; R. J. Roberts, D. M
acelis, Nucleic Acids Res., 19: Suppl. 2077, 1991
などに記載のものが挙げられる。逆転写酵素としては、
例えばマウスモロネイ白血病ウイルス (mouse Moloney
leukemiavirus; MMLV) 由来の逆転写酵素 (reverse tra
nscriptase)、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス (avian mye
loblastosis virus; AMV)由来の逆転写酵素などが挙げ
られる。逆転写酵素は、RNase H 欠損体などは好ましく
用いることができ、特にはRNase H 活性を欠いた修飾MM
LV RT が好ましく使用でき、さらには熱安定性の高いも
のが好ましい。適した逆転写酵素としては、MMLV RT (G
ibco-BRL) 、Superscript RT plus (Life Technologie
s) などが挙げられる。
DNA ポリメラーゼ、その誘導体であるクレノウ・フラグ
メント、大腸菌ファージT4 DNAポリメラーゼ、大腸菌フ
ァージT7 DNAポリメラーゼ、耐熱菌DNA ポリメラーゼな
どが挙げられる。末端ヌクレオチジルトランスフェラー
ゼとしては、例えばR. Wu et al. ed., "Methods inEnz
ymology", Vol. 100, p. 96, Academic Press, New Yor
k (1983) に記載の3'-OH 末端にデオキシヌクレオチド
(dNMP)を付加するTdTaseなどが挙げられる。DNA 修飾・
分解酵素としては、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレ
アーゼなどが挙げられ、例えばヘビ毒ホスホジエステラ
ーゼ、脾臓ホスホジエステラーゼ、大腸菌DNA エキソヌ
クレアーゼ I、大腸菌DNA エキソヌクレアーゼIII 、大
腸菌DNAエキソヌクレアーゼ VII、λエキソヌクレアー
ゼ、DNase I 、ヌクレアーゼS1、ミクロコッカス (Micr
ococcus) ヌクレアーゼなどが挙げられる。DNA リガー
ゼとしては、例えば大腸菌DNA リガーゼ、T4 DNAリガー
ゼなどが挙げられる。DNA 遺伝子をクローニングしてDN
A ライブラリーを構築するのに適したベクターとして
は、プラスミド、λファージ、コスミド、P1ファージ、
F因子、YAC などが挙げられ、好ましくはλファージ由
来のベクターが挙げられ、例えばCharon4A 、Charon 21
A、λgt10、λgt11、λDASHII、λFIXII 、λEMBL3 、
λZAPII TM (Stratagene) などが挙げられる。
有する発現ベクターで形質転換された形質転換体は、必
要に応じて適当な選択マーカーを用い、繰り返しクロー
ニングを行うことにより、高い発現能を安定して有する
細胞株を得ることができる。本発明の形質転換体は、本
発明のタンパク質をコードする核酸が発現可能な条件下
で培養し、目的物を生成、蓄積せしめることができる。
該形質転換体は、当該分野で汎用されている培地中で培
養することができる。例えば、大腸菌、枯草菌等の原核
細胞宿主、酵母などを宿主としている形質転換体は、液
体培地を好適に使用することができる。培地中には、該
形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その
他が含有せしめられる。炭素源としては、たとえばグル
コース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素
源としては、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コ
ーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキ
ス、麦芽エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機
または有機物質、無機物としては,例えば、塩化カルシ
ウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム、炭
酸カルシウムなどが挙げられる。また、酵母、ビタミン
類、カザミノ酸、生長促進因子などを添加してもよい。
また、必要によりプロモーターを効率よく働かせるため
に、例えば、3β−インドリル アクリル酸のような薬
剤を加えることができる。培地のpHは約5〜8が望ま
しい。
で約3〜75時間行い、必要により、通気や攪拌を加える
こともできる。宿主が動物細胞である形質転換体を培養
する際、培地としては、たとえば約5〜20%の胎児牛血
清を含むMEM 培地、PRMI1640培地、DMEM培地などが用い
られる。pHは約6〜8であるのが好ましい。培養は通常
約30℃〜40℃で約15〜72時間行い、必要に応じて通気や
攪拌を加える。得られた細胞及び培養液はそれをそのま
ま使用することができる。上記培養細胞から所望生産物
を抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体ある
いは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音
波、リゾチームおよび/または凍結融解などによって菌
体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により
粗抽出液を得る方法などを適宜用いることができる。緩
衝液の中には尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白変性剤
や、トリトン X-100(商品名)、ツウィーン-80 (商品
名)などの界面活性剤を加えてあってもよい。培養液中
に目的生成物が分泌される場合には、培養終了後、それ
自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、
上清を集める。このようにして得られた培養上清、ある
いは抽出液中に含まれる目的生成物は、自体公知の分離
・精製法を適切に組み合わせてその精製を行なうことが
でき、例えば硫酸アンモニウム沈殿法などの塩析、セフ
ァデックスなどによるゲルろ過法、例えばジエチルアミ
ノエチル基あるいはカルボキシメチル基などを持つ担体
などを用いたイオン交換クロマトグラフィー法、例えば
ブチル基、オクチル基、フェニル基など疎水性基を持つ
担体などを用いた疎水性クロマトグラフィー法、色素ゲ
ルクロマトグラフィー法、電気泳動法、透析、限外ろ過
法、アフィニティ・クロマトグラフィー法、高速液体ク
ロマトグラフィー法などにより精製して得ることができ
る。好ましくは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、モ
ノクローナル抗体などの抗原と特異的に反応する抗体な
どを固定化したアフィニティー・クロマトグラフィーな
どで処理し精製分離処理できる。例えば、ゼラチン−ア
ガロース・アフィニティー・クロマトグラフィー、ヘパ
リン−アガロース・クロマトグラフィーなどが挙げられ
る。
常用される融合産生方法を適用し、融合タンパク質とし
て発現させることも可能である。こうした融合タンパク
質はその融合部を利用してアフィニティクロマトグラフ
ィーなどで精製することも可能である。こうした融合タ
ンパク質としては、ヒスチジンタグに融合せしめられた
もの、あるいはマルトース結合タンパク (MBP), グルタ
チオン-S- トランスフェラーゼ (GST)又はチオレドキシ
ン (TRX)のアミノ酸配列に融合せしめられたものなどが
挙げられる。同様に、ポリペプチドは、ヘテロジーニア
スなエピトープのタグを付加され、該エピトープに特異
的に結合する抗体を用いてのイムノアフィニティ・クロ
マトグラフィーによる精製をなし得るようにすることも
できる。更に、上記したGFP などの螢光タンパク質との
融合体として得ることもできる。こうした融合タンパク
質の発現及び精製は、それに適した市販のキットを用い
て行うことができ、キット製造業者あるいはキット販売
業者により明らかにされているプロトコルに従って実施
することもできる。
築されたことから、野生型p53 ライブラリーと網羅的変
異p53 ライブラリーを使用して、網羅的p53 ライブラリ
ーとすることが可能となり、該網羅的p53 ライブラリー
の全部あるいはその一部を利用してプローブを作製した
りすることが可能である。かくして、網羅的p53 ライブ
ラリーを構成する遺伝子群の少なくとも45%以上(集合
体の少なくとも45%以上)のものから得られた網羅的p5
3 プローブを基板に結合せしめてあるか、あるいは(2)
網羅的p53 ライブラリーを構成する遺伝子群の少なくと
も45%以上のものから得られた網羅的p53 核酸を参照配
列として使用することを特徴とする網羅的p53 核酸アレ
イ及びそれを使用した核酸サンプルの解析法が提供でき
る。特には、遺伝学、生化学および医療診断の分野で、
p53 の変異を迅速に決定するための物質および方法が提
供できる。使用する変異p53 ライブラリーは、網羅的p5
3 ライブラリーからできるだけ多く選んで使用するのが
好ましいが、その一部でもよいことは勿論であり、例え
ば網羅的p53 ライブラリー集合体の少なくとも45%以
上、場合によっては55%以上、さらには65%以上、好ま
しくは70%以上、ある場合には75%以上、より好ましく
は80%以上、さらには85%以上、さらに好ましくは90%
以上、もっと好ましくは95〜100 %が用いられる。当該
p53 ライブラリーには、既知の変異p53 遺伝子を有する
ライブラリーを含めたp53 ライブラリーもそれを含めて
ここで使用できる。該網羅的p53 ライブラリー集合体と
は、例えば、2314種類の変異p53 遺伝子ライブラリーと
野生型p53 遺伝子ライブラリーとを少なくとも含んでい
るライブラリー集合体が挙げられる。
酸は、増幅産物を好適に使用できる。増幅産物とは、増
幅反応において産生された、増幅された核酸セグメント
収集物をいう。該増幅とは、親の分子の塩基配列をコピ
ーして、その結果多数の核酸分子へと増加させるような
任意の手段(例えば、逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応、
およびリガーゼ連鎖反応によるもの)をいう。本明細書
中核酸とは、ヌクレオチド単位から構成されるポリマー
をいう。核酸は、天然に存在する核酸(例えば、デオキ
シリボ核酸("DNA") およびリボ核酸("RNA"))ならびに核
酸アナログを含んでよい。核酸アナログは、天然に存在
しない塩基を含むヌクレオチドのポリマーを含む。ま
た、核酸アナログは、ヌクレオチドがホスホジエステル
結合以外の結合を介して結合しているヌクレオチドポリ
マーを含んでよい。従って、ヌクレオチドアナログは、
例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、
ホスホロトリエステル、ホスホルアミデート、ボラノホ
スフェート、メチルホスホネート、キラル−メチルホス
ホネート、2-O-メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸
(PNA) などが挙げられるがこれらには限定されない。こ
のような核酸は、例えば、自動化DNA 合成機を用いて合
成されることもできる。核酸セグメントとは、例えば、
フラグメント化よって作製された大きな核酸のセグメン
トまたは増幅によって作製された大きな核酸のセグメン
トをいう。
る固体支持体をいう。この固体支持体上では増幅産物が
固定され得る。基板は、例えば、紙、ガラス、石英ガラ
ス、アルミナ、サファイア、炭化窒素、窒化珪素、シリ
コンウエハなどの無機材料、ニトロセルロース、ポリマ
ー材料(例えば、ポリプロピレン、ポリカーボネート、
ナイロンなどのプラスチック)、ポリアクリルアミドな
どのゲルが挙げられるが、これらに限定されない。基板
は、適宜、共有結合、親和性結合、静電気的結合などを
含む当業者に知られた手段を適用して核酸鎖が結合でき
るようにしてあるものでもよい。例えば、核酸鎖の末端
領域あるいは基板の表面を、アミノ基、カルボキシル
基、チォール基のような反応性の官能基で修飾したり、
ビオチン、アビジンなどの特異的な親和性を有するペア
ーを構成するタンパク質で修飾したり、シランカップリ
ング剤等の反応性官能基を有する分子で処理したり、負
に帯電したアミノ酸あるいはアミノ酸重合体などでコー
トしておいてもよい。基板と官能基との間には、スベー
サーを介することもできる。該固有の領域とは、標的物
が適用された基板のアドレス可能な位置をいう。増幅産
物を得るにはプライマーを利用できる。本明細書中プラ
イマーとは、指定された鋳型核酸に対して特異的にハイ
ブリダイズし、そして相補的な核酸の合成のための開始
点を提供し得る核酸をいう。このような合成は、合成が
誘発される条件下(すなわち、ヌクレオチド、相補的鋳
型核酸、およびDNA ポリメラーゼといった重合化のため
の因子の存在下)に該核酸プライマーがおかれた場合
に、生じる。プライマーは、代表的に、一本鎖である
が、二本鎖でもあり得る。プライマーは代表的に、デオ
キシリボ核酸であるが、広汎な種々の合成プライマーお
よび天然に存在するプライマーも多くの場合その使用が
できる。プライマーは、鋳型と相補的であり、この鋳型
に対して、そのプライマーはハイブリダイズして合成開
始のための部位として作用するように設計されている
が、その鋳型の正確な配列を反映する必要はない。この
ような場合、そのテンプレートに対するそのプライマー
の特異的なハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼ
ーション条件のストリンジェンシーに依存する。プライ
マーは、例えば、色素原性部分、放射性部分または蛍光
性部分を用いて標識されることができ、そして検出可能
な部分として使用され得る。こうした増幅産物用プライ
マーは、一般的に少なくとも7ヌクレオチド長、そして
好ましくは約10〜30ヌクレオチド長である。
合、別の核酸の指定された配列に対して特異的にハイブ
リダイズし得る核酸をいう。プローブは、標的相補的核
酸に対して特異的にハイブリダイズするが、その鋳型の
正確な相補的配列を反映する必要はない。このような場
合、その標的に対するそのプローブの特異的なハイブリ
ダイゼーションは、そのハイブリダイゼーション条件の
ストリンジェンシーに依存する。プローブは、例えば、
色素原性部分、放射性部分または蛍光性部分を用いて標
識されることができ、そして検出可能な部分として使用
され得る。通常、核酸アレイ技術ではハイブリダイゼー
ション操作を利用して解析がなされる。代表的にはハイ
ブリダイゼーションにおいては、選択されたハイブリダ
イゼーション条件下で第一の核酸が核酸混合物中の第二
の核酸に対してハイブリダイズし、その結果第二の核酸
配列の検出およびその混合物中の第二の核酸と他の核酸
との間の識別が可能である場合、第一の核酸は第二の核
酸に対して「特異的にハイブリダイズ」するという。従
って、例えば、完全に相補的なプローブは、高度にスト
リンジェントでないハイブリダイゼーション条件下でさ
えも標的配列に特異的にハイブリダイズするが、ミスマ
ッチプローブ(すなわち、その配列が、その標的配列と
完全に相補的でないプローブ)は、一般的に、識別可能
な様式で、その標的配列とハイブリダイズするために
は、よりストリンジェントな条件を必要とする。
ストリンジェント度は、多くの因子(例えば、温度、イ
オン強度、pHを含む)に依存して変わる。核酸のハイブ
リダイゼーションついては、例えば、J. Sambrook, E.
F. Fritsch & T. Maniatis,Molecular Cloning: A Labo
ratory Manual (2nd edition), Vol. 1 to 3, ColdSpri
ng Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Ne
w York (1989); Tijssen, Techniques in Biochemistry
and Molecular Biology (Hybridization with Nucleic
Probes, "Overview of principles of hybridization
and the strategy of nucleic acid assays"), Elsevie
r Science Publishers B.V. (1993);Krika, Nonisotopi
c DNA Probe Techniques, Academic Press, CA (1992);
Shena et al., Science, 270: 467-470 (1995)などに
見い出すことができる。一般的に、「ストリンジェント
な条件」としては、規定されたイオン強度、pHにおける
特定の配列についての熱融解点(Tm)より約5℃〜約10℃
低く選択する。この場合、該Tmは標的に相補的なプロー
ブの50%が標的配列にハイブリダイズして(ある規定さ
れたイオン強度、pHおよび核酸濃度において)平衡状態
となる温度である。ストリンジェント条件は、塩濃度が
約1.0Mナトリウムイオン未満である条件であり、代表的
には、約0.01〜1.0Mナトリウムイオン濃度(または別の
塩)で、pH7.0 〜8.3 であり、そして温度は、短いプロ
ーブ(例えば、10〜50ヌクレオチド)については少なく
とも約30℃であり、そして長いプローブ(例えば、50ヌ
クレオチドを超える)については、少なくとも約60℃で
ある。また、ストリンジェント条件は脱安定化剤(例え
ば、ホルムアミド)を添加することによって達成される
こともできる。選択的ハイブリダイゼーションまたは特
異的なハイブリダイゼーションについては、陽性シグナ
ルは、バックグラウンドの少なくとも2倍、好ましくは
バックグラウンドハイブリダイゼーションの10倍であ
る。例えば、5 ×SSPE (750 mM NaCl, 50 mM NaPO4, 5
mM EDTA, pH7.4) であり、そして25〜30℃の温度の条件
が特異的なプローブハイブリダイゼーションとして選ぶ
ことも可能である
イゼーション条件」としては、40%ホルムアミド、1M N
aCl, 1% SDS の緩衝液中での37℃でのハイブリダイゼー
ション、および 1×SSC で45℃での洗浄が挙げられる。
陽性ハイブリダイゼーションは、少なくともバックグラ
ウンドの2倍である。当業者は、別のハイブリダイゼー
ションおよび洗浄条件を利用して、類似のストリンジェ
ンシーの条件を提供することができるものであることは
それを容易に認識できよう。解析には、検出が含めれて
よく、この場合検出あるいは検出するとは、サンプル中
における分析物の存在、非存在または量を決定すること
を指してよく、さらにサンプル中における分析物の量を
定量することを含んでよい。核酸アレイ技術では、標識
された核酸又は検出可能な部分を有する核酸などを有利
に利用できる。当該標識又は検出可能な部分としては、
分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学
的な手段によって検出可能な成分が挙げられる。有用な
標識としては、例えば、32P, 35S、蛍光色素、高電子密
度試薬、酵素(例えば、ELISA において一般的に使用さ
れるようなもの)、ビオチン−ストレプトアビジン、ジ
オキシゲニン、ハプテンおよび抗血清もしくはモノクロ
ーナル抗体が利用可能なタンパク質、標的に対して相補
的な配列を有する核酸分子などが挙げられる。例えば、
Cy5-dCTP, フルオレッセイン-dCTP なども有利に使用で
きる。
ナル(例えば、放射性シグナル、色素原性シグナルまた
は蛍光性シグナル)を生成し、これを使用して、サンプ
ル中で結合された検出可能な部分の量を定量し得るもの
である。標識は、共有結合的にまたはイオン結合、ファ
ンデルワールス結合または水素結合を介して、プライマ
ーもしくはプローブ中に取り込まれるかまたはプライマ
ーもしくはプローブに付着され得る(例えば、放射性核
種の取り込み、またはストレプトアビジンによって認識
されるビオチン化ヌクレオチドなど)。標識は、直接ま
たは間接的に検出可能であり得る。間接的な検出は、そ
の標識に対する直接または間接的に検出可能な第二の部
分の結合を含み得る。例えば、その標識は、結合パート
ナーのリガンド(例えば、ビオチン(これは、ストレプ
トアビジンについての結合パートナーである))または
相補性配列(それに対してそのヌクレオチドが特異的に
ハイブリダイズし得る)についての結合パートナーであ
るヌクレオチド配列であり得る。その結合パートナー
は、それ自身が直接検出可能であり得、例えば、抗体は
それ自身が蛍光分子を用いて標識され得る。その結合パ
ートナーはまた、間接的に検出可能であり得、例えば、
分岐DNA 分子の一部であり得る相補的なヌクレオチド配
列を有する核酸であり、この核酸は次いで、他の標識さ
れた核酸分子とのハイブリダイゼーションを通して検出
可能である。
ョン計数、密度測定またはフローサイトメトリにより達
成される。核酸アレイ技術で使用されるサンプルは、代
表的には、個体に由来するものである。個体は、一般的
に生物の集団由来の個体で、ウイルス、単細胞生物(例
えば、原核生物または真核生物)、動物などが挙げられ
る。動物集団としては、脊椎動物、哺乳動物、霊長類、
およびヒトが挙げられる。また、その集団は、細胞培養
由来の細胞の集団であってもよく、例えば、転移性細胞
または突然変異誘発に供せられた細胞などが挙げられ
る。核酸アレイ技術は、分析される個体由来の核酸を含
むサンプルを使用して行うことができる。ゲノムDNA の
アッセイについては、実質的にいかなる生物学的サンプ
ルも好適に使用できる。例えば、哺乳動物由来の好都合
な組織サンプルは、全血、精液、唾液、涙液、尿、糞
便、汗、頬(口腔)、皮膚、および毛髪を含む。正常細
胞、疾患細胞、正常組織、腫瘍組織などいずれのもので
あることもできる。cDNAまたはmRNAのアッセイについて
は、組織サンプルは、標的核酸が発現される器官から得
られなければならない。
ルからの核酸の増幅を含んでよい。核酸セグメントを増
幅するためのいくつかの方法が当該分野で公知である。
好ましい方法は、ポリメラーゼ連鎖反応 (polymerase c
hain reaction: PCR)である。一般的には、PCR Technol
ogy: Principles and Applications for DNAAmplifica
tion (H.A.Erlich, Freeman Press, NY, NY,1992); PC
R Protocols:A Guide to Methods and Applications (I
nnis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA,
1990); Mattila et al., Nucleic Acids Res., 19, 496
7 (1991); Eckert et al., PCR Methods and Applicat
ions, 1, 17(1991); PCR (McPherson et al.(Ed.), IR
L Press,Oxford); 及び米国特許第4,683,202号(Mulli
s)。増幅のためのプライマーは、標的サンプルにおける
目的の領域に隣接されるように選択される。例えば、プ
ライマーは、既知の変動の部位および両側のいくつかの
塩基に隣接するように、またはエキソンに隣接するよう
に、または全コード配列もしくは遺伝子に隣接するよう
に設計され得る。
(LCR)(WuおよびWallace, Genomics,4, 560(1989), Land
egren et al., Science, 241, 1077(1988))、転写増幅
(Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 1173
(1989))及び自己維持的配列複製(Guatelli et al., Pr
oc. Nat. Acad. Sci. USA, 87, 1874(1990)を参照のこ
と)および核酸に基づく配列増幅(NASBA) を含む。後の
2つの増幅方法は、等温転写に基づく等温反応を含み、
これは増幅産物としてそれぞれ約30または100 対1の比
で、一本鎖RNA(ssRNA)および二本鎖DNA (dsDNA) の両方
を生成する。本発明の核酸アレイ技術では、個々のアド
レス可能な位置にある固体基板上に、所定の増幅産物を
固定化する工程が含まれる。こうした位置は、固有の領
域といわれる。従って、該増幅産物を固定化することに
より、固有の特徴を持つアレイが生まれる。通常の操作
では、すべての個体由来のサンプルは、単一の基板上に
配列せしめられる。さもなくば、すべての個体を収容す
るために同じ数だけの基板が必要となる場合もある。該
アレイは、任意の所望の形をとることができるしかし、
直交性に配置された行および列を持つアレイは、しばし
ばその操作並びに配置処理が容易となる。個体由来の増
幅されたマーカーをいくつかの画分に分け、次いでサン
プルを配置するためのいくつかの方法が知られている。
された遺伝的マーカーを含む産物のセットは、1つ以上
の基板上に固定される。このように配置することによ
り、基板に検出プローブを適用した場合の処理を単純化
することができる。アレイ上にスポットされる数は、基
板および固有の領域作製技術の能力に依存する。増幅産
物を固体支持体上に固定するためには、いくつかの手法
が利用可能である。核酸は、直接的に核酸を結合する基
板(例えば、紙、ガラス、またはニトロセルロース)に
結合され得る。あるいは、それらはリンカー(例えば、
基板に結合したオリゴヌクレオチドリンカー、シリル化
処理されたアクティブサイトなど)を通して結合され得
る。スポットする一つの方法としては、それぞれの反応
領域アレイ(それは通常不活性な領域によって互いに分
離されている)を有する基板が利用される。1つの実施
態様においては、第1の核酸溶液は、適切に誘導体化さ
れた基板の第1の領域上にスポットされ、次に、第2の
核酸サンプルが第2の領域上にスポットされ、第3の核
酸サンプルが第3の領域上にスポットされるなど、それ
ぞれがそこに位置する増幅産物を有する領域の数まで続
くように処理されるものである。
ウェル形式のアレイ(例えば、96ウェルプレート)中で
調製されるものである。ピンが、ウェルの中に浸漬さ
れ、核酸を含む液体を拾い上げ、次いでピンは核酸を結
合する基板(例えば、紙、ガラス、またはニトロセルロ
ース)に押しつけられる。従って、サンプル中の核酸は
アレイ中に固定される。各々のウェルからの増幅産物
は、基板上の異なる位置にスポットされる。別の方法
は、噴霧して行うものである。この方法では、例えば、
液体サンプルを含む毛細管のアレイを使用する。毛細管
が基板の表面に接触された場合、サンプルの一滴がそこ
に付着することになる。また別の噴霧法としては、イン
クジェット技術を利用するものである。このようなイン
クジェット技術は、プリンターで一般に使用されてお
り、そこでは、微小なインク滴が、基板(例えば、紙)
上の特定の位置に噴霧される。この技術に従えば、毛細
管はノズル端から核酸サンプルを含むウェルにまで連結
されており、この方法で非常に高密度に固定された核酸
サンプルを配置したアレイを作製することが可能であ
る。
なヌクレオチド配列を検出するためには任意の方法であ
ってよい。好ましい方法は、標的配列へプローブを特異
的にハイブリダイズさせる工程、およびハイブリダイズ
させたプローブを検出する工程を包含する。ハイブリダ
イズさせたプローブは、例えば、質量スペクトルによっ
て直接的に検出され得るか、プローブまたはハイブリダ
イゼーションと関連する標識を検出することによって、
間接的に検出されることができる。直接的に検出するた
めの方法は、質量スペクトルであり、ハイブリダイズさ
せたプローブは、基板から脱離され、その分子量に基づ
いて同定される(例えば、MALDI-TOF)。標識としては、
特異的な配列を有する固定分子と関連してその検出を可
能にするような標識であってよい。
に対して特異的なプローブをハイブリダイズさせること
によって特異的な配列を検出する工程、およびハイブリ
ダイズさせたプローブを検出する工程を包含する。ハイ
ブリダイズさせたプローブは、例えば、質量スペクトル
を通して直接的に、または標識の使用を通して間接的に
検出されることができる。別の手法に従った標識に基づ
く検出法では、標識は、この配列を有する分子によって
放出されるようなものである。例えば、固定された分子
は、標識され、次いで、標的に対する特異的プローブを
そこにハイブリダイズさせると、二本鎖分子が作製され
る。次いで、二本鎖DNA を切断するような特異的または
非特異的エンドヌクレアーゼによる切断処理を当該基板
に適用される。これにより、標識が放出される。また、
互いに区別することが可能で且つ異なる波長で蛍光を発
するような蛍光標識がいくつか存在しているので、それ
を利用することもできる。基板上で特定の配列を有する
固定化された核酸を検出する1つの方法は、該配列を有
する核酸と特異的にハイブリダイズする標識化核酸プロ
ーブと当該基板とを接触させることである。その固有の
領域における当該標識の存在を検出することによって該
配列の存在が検出される。一般的に、2つの区別可能な
標識を使用した場合、該標識は、2つの異なる波長で蛍
光を発する蛍光標識であることができ、そうすると、両
方の標識が存在する場合、両方の波長が検出されよう。
各波長の光量比を測定することによって、各波長の光量
比の関数として、ハイブリダイズしたプローブの量の比
を決定し得る。
ンアッセイは、選択されたハイブリダイゼーション条件
下でアレイを標識化サンプルと接触させる工程、必要に
応じて、このアレイを洗浄して、未反応分子を除去する
工程、および標的分子とプローブとの間の反応の証拠に
ついて生物学的アレイを分析する工程を含み得る。これ
らの工程は、液体を取り扱う工程を含む。これらの工程
は、このアレイにおける検出工程を現在使用可能な自動
化液体取り扱いシステムを用いて自動化することもでき
る。液体の取り扱いは、ウェル中のサンプルの均一処理
を可能にする。マイクロタイターロボットを利用した装
置および液体取り扱い装置が、例えばTecan AGから市販
されている。当該アレイは、液体処理デバイスによって
操作することもできる。該ロボット利用デバイスは、適
切な反応条件(例えば、温度)を設定し、アレイに試薬
を添加し、適切な時間、アレイをインキュベートし、未
反応物質を除去し、アレイ基板を洗浄するなどして、検
出アッセイを実施するようにプログラムすることができ
る。この特定の反応条件は、アッセイの目的、例えば、
プローブのハイブリダイゼーションまたはオリゴヌクレ
オチドへの標識の付着に依存して選択することができ
る。所望に応じて、該アレイは、アレイリーダーでの使
用に適したパッケージにすることもできる。
シグナルを検出する工程では、アレイリーダーを使用す
ることが必要となる。このアレイリーダーの性状は、標
的分子に結合されている標識の型に依存して決められ
る。1つの実施態様においては、このアレイリーダー
は、核酸アレイを固定するための本体を有するものであ
る。第1波長を有する励起用光源からの励起用放射光
は、アレイから次のような励起応答を介して通過してい
くが、この励起光により、基板上の核酸アレイの領域が
励起され、励起放射が生じる。対応して、サンプル上の
標識化物質は、励起波長とは異なる波長を有する放射光
を発光する。次いで、光収集系が、サンプルからの励起
光を収集し、検出器上に画像化する。検出器は、当該検
出された放射量に比例してシグナルを生成する。このシ
グナルは集められ、発光が起こった複数の領域と関連す
る画像を提示する。1つの実施態様では、異なる領域を
位置付けしてスキャンするために、そして異なる位置の
アレイについてそれぞれ問診することを可能にするよう
に、多軸平行移動ステージ(multi-axis translation st
age)を使用して、核酸アレイを移動させることができ
る。かくして、該核酸アレイの二次元画像を得ることが
できる。
セスを通じて、励起光の焦点面にサンプルを保つように
するため、自動焦点とすることもできる。さらに、温度
コントローラーでもって、スキャンされている間、特定
の温度でサンプルが維持されるようにすることもでき
る。多軸平行移動ステージ、温度コントローラー、自動
焦点機構、ならびに画像およびデータ収集に関連した電
子工学技法は、適切にプログラムされたデジタルコンピ
ューターによって管理されることができる。別の実施態
様において、蛍光プローブは、CCD 画像システムと組み
合わせて使用される。多くの市販のマイクロプレートリ
ーダーでは、代表的には、光源は、アレイの上に配置さ
れ、そして光ダイオード検出器はアレイの下に配置され
る。本方法のために、この光源は、より高出力のランプ
またはレーザーで置き換えることができる。1つの実施
態様では、光ダイオード検出器は、このアレイを迅速に
画像化し得るCCD カメラおよび画像工学技術と置き換え
ることができる。光ファイバーを利用してCCD 検出器に
光を導くこともできる。また、該レーザーは、核酸アレ
イの下に配置され、そして光は、核酸アレイの下部を形
成している透過ウエハまたは基板を通して、その方向が
決められてよい。別の実施態様では、該CCD アレイは、
核酸アレイのウエハに組み込むこともできる。
いてもよい。励起光学は、励起光をサンプルの行に対し
て焦点をあわせ、同時にサンプルのストリップをスキャ
ニングまたは画像化する。アレイからの、表面に結合し
た蛍光標識は、光に応じてアレイから蛍光を発する。収
集光学は、光検出器の線状アレイ上へ発光を画像化す
る。共焦点技術を使用することによって、実質的に、光
の焦点面からの発光のみが画像化される。一旦ストリッ
プがスキャンされると、一次元画像を提示するデータ
が、コンピューターのメモリに保存される。1つの実施
態様によると、多軸平行移動ステージは、定常速度でデ
バイスを動かして、データを連続的に取り込みそして処
理する。あるいは、検流型(galvometric) スキャナーま
たは回転多面体鏡が使用されて、サンプルを横切る励起
光をスキャンし得る。結果として、このサンプルの二次
元画像が得られる。別の実施態様において、収集光学系
は、分光器に発光を指示し、該分光器は、光検出器の二
次元アレイ上に発光スペクトルを画像化する。分光器を
用いることによって、このアレイのスペクトル的に完全
に分解された画像が得られる。アレイの読み込み時間
は、蛍光の光学的性状(例えば、蛍光量子収率など)な
らびに検出器の感度に依存する。CCD 検出器を用いてア
レイ画像を読むに十分なシグナル対ノイズ比は、フルオ
レセインについては、Arイオンレーザーまたはランプか
らの励起光を用いて得られることができる。レーザー出
力を増加させることによって、そしてその発光がCCD 検
出器の最大感度により緊密に一致するような螢光色素Cy
3 又はCy5 に変更することによって、5秒未満で各アレ
イを読むことが容易に可能である。データは、プログラ
ム可能なデジタルコンピューターの使用で、最も容易に
分析される。コンピュータープログラムは、一般的に、
コードを保存する読み込み可能なメディアを含むもので
ある。特定のコードは、各固有の領域についての位置、
および個体の同一性、およびその各固有の領域における
マーカーなどについて記憶して置くことに充てられる。
また、このプログラムはそのメモリにおいて、このマー
カーの参照配列を含んでいることができる。このコンピ
ューターはまた、特定のシグナルの検出を特定のプロー
ブと相関させ、そしてハイブリダイゼーションの存在を
特定の遺伝子構造の存在と相関させるコードを含み得
る。このコンピューターは、プローブと、特定の特徴に
おけるセグメントとの間のハイブリダイゼーション反応
からのハイブリダイゼーションデータをインプットとし
て受け取るコードを含んでいてよい。このコンピュータ
ーはまた、ある遺伝子の単一コピーまたは二重コピーの
存在とのハイブリダイゼーションの存在または程度に関
するコードを含んでいてよい。該コンピュータープログ
ラムは、インプットとしてプログラマーからの指示を受
け取るコードを含んでいてよい。
別のフォーマットに変換することもできる。データ分析
は、例えば、回収したデータから基板位置の関数として
蛍光強度を決定する工程、孤立したデータ(予め決定さ
れた静止分布から逸脱したデータ)を除去する工程、お
よび残存するデータからの標的の相対結合親和性を計算
する工程を含んでいてよい。生成されるデータは、標的
とプローブとの間での結合親和性の違いや光の放射性状
の違いによりそれぞれ変化する各領域毎の色の変化の画
像として表示されることができる。あるいは、このデー
タは、各サンプルおよび試験された各マーカーについて
の遺伝型を示すリストとして提示することもできる。
における核酸とのハイブリダイゼーションを含む場合で
あって、素早く実行するためのCCD 画像化システムと連
動された場合には、本システムの1つの適用形態は、こ
のハイブリダイゼーションのオンまたはオフの割合を試
験することによってアッセイの結果を得るようなもので
ある。この方法の1つの形態では、各アドレスで結合す
る量は、標的がアレイと接触された後のいくつかの時点
で決定される。全ハイブリダイゼーションの量は、各時
点で結合する量に基づいて、結合の速度論の関数として
決定され得る。従って、到達する平衡を待つことは必要
ではない。それぞれ異なる核酸毎に、温度、サンプル攪
拌の程度、洗浄条件(例えば、pH、溶媒特性、温度)な
どがどの様にハイブリダイゼーションの割合の影響を与
えるかは、容易に決定することが可能で、その割合およ
びシグナル対ノイズ比についての条件を最大とするよう
に決定することもできる。アレイ上で実施されるハイブ
リダイゼーションアッセイの結果は、一般的に、プログ
ラム可能なデジタルコンピューターによって分析され
る。このようなコンピューターは、そのメモリに、全て
の増幅産物の同一性(個体および全ての増幅反応で増幅
されたセグメントの同一性を含む)を保存し得る。それ
ゆえ、行において個体および列において増幅反応を有す
る(または、その逆)直交アレイが各使用について好ま
しいが、増幅産物は、任意の配列(ランダムを含む)に
置くことができる。
ノ酸置換の変異を有する変異p53 タンパク質の集合体が
提供されており、当該変異p53 タンパク質は上記したよ
うに標識を有する融合タンパク質として発現させたり、
標識タンパク質として発現させるなどして、p53 タンパ
ク質の網羅的な変異を有するタンパク質セットを与える
ことから、プロテオミックス (proteomics) 技術に利用
できると期待される。本発明の網羅的p53 ライブラリー
(網羅的p53 発現ライブラリー) を利用して、組換え融
合タンパク質を in situ 発現誘導可能な系を構築し、
プロテインチップ(プロテイン)アレイを構成すること
もできる。また、発現させた組換え変異p53 タンパク質
セットを利用し、当該タンパク質あるいはその酵素消化
物などのペプチドフラグメントのデータ、2次元ポリア
クリルアミドゲル電気泳動 (2-DE) などの電気泳動パタ
ーンデータなどを収集することも可能である。データ収
集には、質量分析技術を有効に利用でき、例えばエレク
ロスプレーイオン化法 (electrospray ionization: ES
I) 、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法 (matri
x-assisted laser desorption/ionization: MALDI) を
利用したものが挙げられる。こうした分析装置として
は、例えばMALDI-TOF 分析計、ESI-3 連四重極分析計、
ESI-イオントラップ分析計などが挙げられる。代表的に
は、ゲルで分離することにより、所定タンパク質及びそ
のフラグメントの分離・移動特性などのデータが得ら
れ、質量分析機でゲルで分離したタンパク質を酵素消化
したペプチドなどから、消化酵素と連動した分解特性、
フラグメント情報などのデータが得られる。こうして得
られたデータは、データベース化され、蓄積され、それ
に適当なアルゴリズムが適用され、コンピューター解析
システムと連動せしめられて使用される。当該タンパク
質解析は、ロボットシステムを使用することができる。
該ロボットシステムは、例えばゲルからあらかじめ決め
られたスポットを切り出す特殊化された装置、コンピュ
ーター制御のタンパク質消化モジュール、ゲルあるいは
転写後の膜から染色されたタンパク質を検出する画像解
析システム、取り出された消化された断片を質量分析に
付与する装置、それぞれの段階で各データを取得、蓄
積、解析処置し、任意の目的に合致するように最適な処
理を遂行するプログラムを備えたコンピューターを含ん
でいる。本発明で網羅的変異p53 ライブラリー構築に使
用した変異合成オリゴヌクレオチドプライマー及び共通
オリゴヌクレオチドプライマーは、所定のp53 塩基配列
を増幅するのに好適に使用できる他、TaqManケミストリ
のプローブとしても有用である。TaqManプローブはその
両端部に二種類の螢光色素(一方はレポーター(reporte
r)色素、他方は消光(quencher)色素)でラベルされたオ
リゴヌクレオチドで、ターゲット領域と特異的にアニー
ルする。TaqManプローブが分解していない状態では、励
起光によりレポーター色素から発せられた螢光は、物理
的に近い距離にある消光色素に吸収され、結果的に消光
色素の螢光のみが観察されるが、該TaqManプローブを反
応液に加えてPCR を行うと、TaqManプローブ、プライマ
ーの順にターゲット配列とアニールするが、Taq DNA ポ
リメラーゼによる反応が進行するにしたがい、Taq DNA
ポリメラーゼの有する5'→3'エキソヌクレアーゼ活性に
より、TaqManプローブは5'末端から加水分解され、レポ
ーター色素と消光色素の間の距離が離れることとなり、
抑制されていたレポーター色素の螢光強度が増加し、定
量的なPCR データを得ることができる。これをRT-PCRな
どを使用しmRNA発現量の定量、変異部位の検出などに使
用可能である。
的変異p53 ライブラリーやそれに基づいた核酸アレイな
どが提供され、それらは 1) 変異p53の機能回復を起こしうる薬剤候補(小分子
など)があった場合、その薬剤候補が、どの変異p53に
対して有効か、または無効かを判定するのに有用であ
り、 2) 遺伝子診断に関連して、腫瘍などからは、多種類の
p53遺伝子変異がみつかるが、転写、翻訳されてできる
変異p53タンパク質の個々について、機能へ及ぼす影響
を診断することを可能にし、しかも、機能に及ぼす影響
についての情報をそれに追加することができる。さら
に、3) 野生型p53によって転写活性化される下流遺伝
子は多数報告されており、一方、腫瘍において見出され
る変異p53は、癌になるためにいわば必要な変異である
わけであるが、該変異によってタンパク質が失う転写活
性化機能は、p53の下流遺伝子のうち複数ではあるが全
てに対してではないと考えられる。つまり、下流遺伝子
が仮に20個であるとして、変異によって転写活性化され
ない遺伝子はそのうち、例えば13個で、残りの7個はそ
の変異p53 により転写されることがありうることから、
腫瘍において見つかる変異の下流遺伝子に対する転写活
性化能のスペクトルを調べると、おそらくがん抑制によ
り重要な遺伝子が浮かび上がってくると考えられる。こ
のように、本発明により、p53遺伝子の下流遺伝子であ
ることの検索手段としても有用である。
型p53が転写活性化できない遺伝子の転写活性化をおこ
なうことが知られていることから、p53は変異によって
機能を失うだけではなく、新たに野生型にはない機能
(この機能はおそらく、「がん」に有利な機能)を獲得
しうると考えられ、したがって、個々の変異p53によっ
て、機能を獲得するかしないかを調べ、さらに機能を獲
得する場合にも、その獲得する機能がそれぞれ異なる可
能性があることから、これらのことを解明するのに有用
である。加えて、5) 酵母ライブラリー2300余のクロー
ンの機能から変異p53タンパク質の構造を推定するだけ
ではなく、X線構造解析やNMR解析によって既に解析され
ている野生型p53タンパク質構造を微修正するのにも使
用できる(protein modelingに役立つ)。そして、現在
のコンピューターによるタンパク質構造解析(in silic
o protein modeling)技術を適用し、多くの変異の生物
学的機能解析データを収集し、変異によるタンパク質機
能への影響をなどを推定するのに利用可能である。
IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによる
か、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語
の意味に基づくものである。A:アラニン、C:システイ
ン、D:アスパラギン酸、E:グルタミン酸、F:フェニルア
ラニン、G:グリシン、H:ヒスチジン、I:イソロイシン、
K:リジン、L:ロイシン、M:メチオニン、N:アスパラギ
ン、P:プロリン、Q:グルタミン、R:アルギニン、S:セリ
ン、T:スレオニン、V:バリン、W:トリプトファン、Y:チ
ロシンADH1プロモーター: 出芽酵母ADH1(alcohol dehyd
rogenase I) 遺伝子の転写調節領域を含む遺伝子断片。
本プロモーターにより、ブドウ糖添加培地で下流に接続
した遺伝子の転写を、本プロモーターにより常時活性化
することができる。AmpR/ori: AmpRは大腸菌のアンピシ
リン耐性遺伝子でβラクタマーゼをコードいている領
域。ori は DNAの複製オリジンであり、AmpR/oriは、こ
れら遺伝子がセットで、例えばプラスミドpBluescript
TMなどから切り出されて利用されているものである。プ
ラスミドを大腸菌で少量または大量調製するときにプラ
スミド上に必要な配列である。酵母・大腸菌シャトルベ
クターに利用されて有用な領域である。CEN/ARS: CENは
出芽酵母染色体DNA のセントロメア配列であり、ARS は
autonomous replication sequence である。これらをセ
ットで保有したプラスミドは酵母1細胞あたり1コピー
安定に複製される。LEU2: ロイシン生合成遺伝子領域
で、レポーター遺伝子として利用できる。
するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具
体的な態様の参考のために提供されているものである。
これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明する
ためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定
したり、あるいは制限することを表すものではない。本
発明では、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可
能であることは理解されるべきである。全ての実施例
は、他に詳細に記載するもの以外は、標準的な技術を用
いて実施したもの、又は実施することのできるものであ
り、これは当業者にとり周知で慣用的なものである。以
下の実施例における通常慣用される分子生物学的技術と
しては、標準的な実験マニュアル、例えば J. Sambroo
k, E. F. Fritsch & T. Maniatis, MolecularCloning:
A Laboratory Manual (2nd edition), Cold Spring Har
bor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York
(1989); D. M. Glover et al. (ed.), "DNA Cloning",
2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Ser
ies),IRL Press, Oxford University Press (1995); R.
Saiki et al., Science, 230: 1350, 1985; R. Saiki
et al., Science, 239: 487, 1988; H. A. Erlich (e
d.), PCR Technology, Stockton Press, 1989 ; ; M.
A. Innis et al. (ed.), "PCR Protocols: a guide to
methods and applications", Academic Press, NewYork
(1990)); M. J. McPherson, P. Quirke and G. R. Tay
lor (ed.), PCR: apractical approach, IRL Press, Ox
ford (1991); M. A. Frohman et al., Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 85, 8998-9002 (1988) などに記載の方法
に準じて行っているし、また市販の試薬あるいはキット
を用いている場合はそれらに添付の指示書(protocols)
や添付の薬品等を使用している(それらの中にある記載
はそれを参照することにより本明細書の開示に含められ
る) 。
に使用する鋳型DNA としては、p53の翻訳領域内に設計
したプライマーとともにPCR を行ったときに容易に増幅
可能なプライマーをその配列内に設計可能なことが必須
で、その長さは各々少なくとも300bp 以上が望ましいあ
るいは必須で、また、ATG の上流に該 ATGより下流の配
列の翻訳領域をRNA に転写するためのプロモーター配列
が、該 ATGより下流の翻訳領域をRNA に転写することが
可能であるように存在していることが求められる。また
終止コドンTGAより下流の配列は、転写されるRNAの末端
部分を決定しうる配列であることが望ましい。こうした
点を考慮して鋳型DNA を選択した。部位特異的変異導入
のためのPCR反応に用いた鋳型DNA配列を、図1の太実線
に示す。鋳型はp53 cDNAの翻訳領域(図1の太実線のう
ちの翻訳開始コドンATGから翻訳停止コドンTGAまで:野
生型p53 cDNA配列 (open reading frame: ORF)を〔配列
番号:2356〕に示す)と、その5'側および3'側にプラス
ミドpLS76由来の配列を含むDNA断片であり、制限酵素Xh
oIとEagIでプラスミドpLS76 (Ishioka, C., et al., Na
ture Genetics, 5: 124-129, 1993)を切断し、アガロー
スゲル電気泳動で短い方のDNA断片を切り出し、ファル
マシアのGFXキット等で精製して作成する。最終的に0.1
ng/ml濃度になるようにTE緩衝液で調整する。特に、当
該鋳型DNA は、プロモーター部位を含有しており、有利
にそれを使用できる。
する合成オリゴヌクレオチド(変異合成オリゴヌクレオ
チド)は、96ウェルプレート26枚に同じ濃度に希釈・分
注されて保存されている〔プレート番号:#1、#2、#5-#
28) 。各96ウェルプレートに分注されている変異合成オ
リゴヌクレオチドは、原則として互いにp53 cDNA上の隣
接した位置にあるように置いてある。各変異合成オリゴ
ヌクレオチドは#1と#2以外は、原則的に26塩基からな
り、5'側から14塩基目に、目的の点変異が導入されてい
る。これらの鋳型上での位置を図2(小さい黒い矢印)
に示す。部位特異的変異導入のための作成した2314種類
の1塩基置換を有する合成オリゴヌクレオチド(変異合
成オリゴヌクレオチド)の配列 (5'→3') とそれを使用
して得られる変異酵母クローン名(変異合成オリゴヌク
レオチド名と同一)を下記〔一塩基変異p53 クローン及
び変異誘導用合成オリゴヌクレオチドリスト〕に示す。
オチド 上記鋳型DNAと相同な配列で上記(1-1) の変異合成オリ
ゴヌクレオチドと共にPCR反応に用いる合成オリゴヌク
レオチド(共通合成オリゴヌクレオチド:LS5, LS6, LS
8, LS9, OHK-8, OHK-9, OHK-10, OHK-13) の配列を下に
示す。
置を、図2または図3(太い黒い矢印)に示す。
オリゴヌクレオチドは共通合成オリゴヌクレオチドLS6
と、また、(2)#12-#16の変異合成オリゴヌクレオチドは
共通合成オリゴヌクレオチドLS5と、(3)#17-#25は共通
合成オリゴヌクレオチド OHK-8またはOHK-13と、(4)#26
-#28は共通合成オリゴヌクレオチドLS8との組合せで、
下記の反応条件でPCR反応を行う。反応は96ウェルプレ
ートで行う。
USA) を使用し、市販のサーマル・サイクラー(ABI 970
0 (ABI)) を用いて行った。1回目のPCR産物を図3(点
模様の線)に示す。PCR産物の一部(2 ml)をアガロース
ゲルで電気泳動で確認後、残りの産物を市販のPCR産物
精製用96ウェルプレート(ミリポア) にて精製した。
産物をメガプライマーとし、上記共通合成オリゴヌクレ
オチドと組合せて第2回目のPCR反応を行う。(1) プレ
ート#1, #2, #5-#11の変異合成オリゴヌクレオチド由来
の第1回目PCR産物は共通合成オリゴヌクレオチド LS5
と、また、(2) #12-#16 の変異合成オリゴヌクレオチド
由来のPCR産物は共通合成オリゴヌクレオチド LS6と、
(3) #17-#25の変異合成オリゴヌクレオチド由来のPCR産
物は共通合成オリゴヌクレオチド OHK-9と、(4)#26-#28
の変異合成オリゴヌクレオチド由来のPCR産物は共通合
成オリゴヌクレオチドOHK-10との組合せで、下記の反応
条件でPCR反応を行う他、その他は上記第1回目PCRと同
様である。反応は96ウェルプレートで行う。
ている。これにより、メガプライマーが大きなPCR産物
であり、共通合成オリゴヌクレオチドと比べてTm値が大
きく異なっても、確実なPCR反応が実施できている。つ
まり、増幅されるDNA量の不足、全く増幅されない、及
び非特異的増幅の出現などを巧妙に防止している。第2
回目のPCR産物を図4(点模様の線)に示す。PCR産物の
一部(2μl)をアガロースゲルで電気泳動で確認後、残り
は4℃にて保存した。
由来のものに対しては、プラスミドpSS16 (Ishioka,
C., et al., Nature Genetics, 5: 124-129, 1993)の制
限酵素Hind III/StuI消化により直線化したギャップリ
ペアベクターを、(2) プレート#17-#25 由来のものに対
しては、プラスミドp53Nco1のBamHI (またはNcoI)消
化により直線化したギャップリペアベクターを、(3) プ
レート#26-#28 由来のものに対してはプラスミドp53Stu
1のHindIII消化により直線化したギャップリペアベクタ
ーを使用した。図5に各プラスミド構造の概略図を示
す。なお、p53Nco1は、NcoI部位を2個所有するプラス
ミドpLSC53AをNcoIで消化し、リガーゼでセルフ・ライ
ゲーションして作製した(本工程により、pLSC53Aのp53
cDNA配列のうちN末端側の一部(p53 cDNAの約40%)が除去
される)。また、p53Stu1 は、pLSC53AをBamHIとStuIで
の消化により、p53 cDNAのN末端側の大部分(p53cDNAの
約87%)を切り出し、これをプラスミドpLSXのクローニン
グ部位上のBamHIとSmaI間に挿入して作製した。pLSX
は、プラスミドpLS76 からp53 cDNAを除去し、BamHI, S
maI, HindIIIからなるクローニング部位を挿入して作製
し、pLSC53Aは、pLSXのクローニング部位BamHIとHindII
I 間にPCR で作成したp53 cDNAを挿入して作製した(p53
cDNA 両端に制限酵素部位BamHI とHindIII を保持して
いる点でpLS76 とは異なる) 。
よる変異p53 cDNAの発現ベクターへの組み換えと、酵母
での変異p53タンパク質の発現 リチウム酢酸法による形質転換:出芽酵母ハプロイド株
YPH499 (Stratagene, La Jolla, CA, USA)を、p53レポ
タープラスミドであるpAS03G (Shimada, A., et al., C
ancer Res., 59: 2781-2786, 1999)で形質転換し、SC-t
rp培地(トリプトファン欠損合成培地)で維持する。次
に、この株に2回目のPCR産物とギャップリペアベクタ
ーをリチウム酢酸法により導入し、SC-trp-leu培地(ロ
イシン及びトリプトファン欠損合成培地)で培養する
と、酵母細胞内で第2回目のPCR産物とギャップリペア
ベクターの相同DNA部分間で組み換え(DNA相同組み換
え)が起こりp53を発現しうる環状プラスミドを生じた
クローンだけが選択される(図6〜8)。リチウム酢酸
法による形質転換は、例えば酵母細胞を一晩培養したも
のを10 ml のSDAcas液体培地(1%のカザミノ酸及び20μ
g/mlのアデニンを含んだSD液体培地(0.67% の酵母窒素
源 (yeast nitrogen base, Difco), 2% のグルコース))
中でA600 0.2程度まで希釈し、次いで、30℃でA600 0.6
-1.0になるまで生育し、次に遠心してペレットとし、1
mlの酢酸リチウム溶液(0.1MのLiOAc, 10mM のTris-HC
l, 1 mMのEDTA Na2, pH7.5)に懸濁する。遠心後、細胞
を50μl のLiOAc 溶液に再懸濁し、このLiOAc 処理細胞
を、50μgの直線化したギャップリペアベクターと共に
変異を導入したPCR産物を含む1.5ml 溶液に加え、次い
で、40% のポリエチレングリコール3350-4000 を含むLi
OAc 溶液(300μ1)を添加した。この混合物を撹拌下に30
℃で30分間、次いで42℃で15分間インキュベートした。
こうして得られた細胞を採集し、70-100μl の滅菌水に
再懸濁し、次いで、SC-trp-leu培地(ロイシン及びトリ
プトファン欠損合成培地)で培養する。
入の確認 図6〜8にDNA相同組み換えによって酵母細胞内に作成
されたp53発現ベクターを示す。密な点模様の線はPCR由
来の変異含有p53 cDNA部分であり、横向きの矢印で示し
たシークエンス用プライマー(合成オリゴヌクレオチ
ド)で各クローンについて目的の変異が導入されている
ことと、他の変異が導入されていないことを確認した。
ョン法に従い、Tag DNA ポリメラーゼあるいは修飾T7 D
NAポリメラーゼ及び蛍光標識あるいは放射性標識された
プライマーを用いて行った。例えば、DTCSキット(ベッ
クマンコールター), BigDyeTM Terminator Cycle Seque
nceing FS Ready Reaction Kit (Applied Biosystems J
apan)などの反応試薬で反応後、CEQ2000 (ベックマン
コールター), ABI PRISMTM 3700 DNA Analyzer (Applie
d Biosystems Japan), ABI PRISM TM 377 DNA Sequencer
(Applied Biosystems Japan) などを使用して解析され
る。
母クローンは、酵母細胞内に1アミノ酸置換を伴うp53
を発現する。各酵母クローンはp53レポータープラスミ
ド pAS03G を保持しているため、発現したp53タンパク
質が野生型p53同様の塩基配列特異的転写活性化機能を
保持している場合は、酵母クローンはpAS03GのGFPマー
カー遺伝子からGFPを発現するので、GFP の螢光を観察
することにより、転写活性化能を検知できる。すなわ
ち、p53レポータープラスミド pAS03G は、p53 結合部
位 (p53 responsive element: p53RE)をGFPマーカー遺
伝子のプロモーター領域(WAF1プロモーターを使用)に
含んでおり(p53の下流遺伝子のうちの一つであるp21/W
AF1遺伝子のプロモーターをマーカー遺伝子GFPの5'側に
挿入されてい有するもので、p21/WAF1遺伝子はこれまで
にp53の下流遺伝子であることが報告されている遺伝子
の中で最初に報告され、かつ確実にp53の下流遺伝子で
あることが認められている)、発現したp53タンパク質
の塩基配列特異的転写活性化機能に障害がある場合は、
酵母クローンはGFPを発現しない、または野生型の場合
と比較して弱くGFPを発現する。-80℃に保存された変異
p53酵母クローンを室温で解凍後、96ウェル型レプリケ
ーターを用いて96ウェル対応の角形シャーレに作成した
寒天培地上に、各クローンを接種し、培養することによ
り、1枚の寒天培地で96変異クローンの機能解析が可能
である。機能解析の結果は、下記〔一塩基変異p53 クロ
ーン及び変異誘導用合成オリゴヌクレオチドリスト〕に
示してある。該リスト中、0: GFPの読みが野生型の30%
未満、1: GFPの読みが野生型の30〜70% 、2: GFPの読み
が野生型の 71 〜100%であることを示す。栄養要求性マ
ーカーであるHIS3、URA3やADE2遺伝子を、利用して機能
アッセイを行うこともできる。
ーの保存 各変異p53酵母クローンは、20%グリセリン含有SC-trp-l
eu液体培地に懸濁し、96ウェルプレート内に入れ(96ウ
ェル内の位置は変異合成オリゴヌクレオチドの場合と同
じ)、-80℃で保存されている。以下の〔一塩基変異p53
クローン及び変異誘導用合成オリゴヌクレオチドリス
ト〕に、それらを保存してあるプレート番号並びにプレ
ート内での位置、変異酵母クローン名(変異合成オリゴ
ヌクレオチド名と同一)、野生型p53 の中の変異対象の
コドン、目的変異コドン、変異合成オリゴヌクレオチド
配列 (5'→3') 、既に報告されている変異の数、転写活
性能を測定した結果及び配列表の配列番号をその順に記
載する。なお、野生型p53のアミノ酸配列(アミノ末端
からカルボキシ末端の順序)を〔配列番号:2357〕に示
すと共に、一文字表記で示したアミノ酸配列は: MEEPQSDPSVEPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSPLPSQAMDDLMLSPDDI
EQWFTEDPGPDEAPRMPEAAPRVAPAPAAPTPAAPAPAPSWPLSSSVPSQ
KTYQGSYGFRLGFLHSGTAKSVTCTYSPALNKMFCQLAKTCPVQLWVDST
PPPGTRVRAMAIYKQSQHMTEVVRRCPHHERCSDSDGLAPPQHLIRVEGN
LRVEYLDDRNTFRHSVVVPYEPPEVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGGMNRRP
ILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVRVCACPGRDRRTEEENLRKKGEPHHELP
PGSTKRALPNNTSSSPQPKKKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALEL
KDAQAGKEPGGSRAHSSHLKSKKGQSTSRHKKLMFKTEGPDSD* (ここで、*はストップコドンを示す)である。
ttgCagatggccatgg 70 1 954 3 H Y163F TAC TTC ctgtgactgc
ttgAagatggccatgg 0 2 955 4 A K164E AAG GAG tgctgtgact
gctCgtagatggccat 12 0 956 4 B K164Q AAG CAG tgctgtgact
gctGgtagatggccat 5 1 957 4 C K164T AAG ACG gtgctgtgac
tgcGtgtagatggcca 0 1 958 4 D K164R AAG AGG gtgctgtgac
tgcCtgtagatggcca 2 1 959 4 E K164M AAG ATG gtgctgtgac
tgcAtgtagatggcca 4 1 960 4 F K164N AAG AAC tgtgctgtga
ctgGttgtagatggcc 4 1 961 4 G Q165K CAG AAG atgtgctgtg
actTcttgtagatggc 0 2 962 4 H Q165E CAG GAG atgtgctgtg
actCcttgtagatggc 1 2 963 5 A Q165P CAG CCG catgtgctgt
gacGgcttgtagatgg 3 1 964 5 B Q165R CAG CGG catgtgctgt
gacCgcttgtagatgg 4 1 965 5 C Q165L CAG CTG catgtgctgt
gacAgcttgtagatgg 3 1 966 5 D Q165H CAG CAC tcatgtgctg
tgaGtgcttgtagatg 0 2 967 5 E S166T TCA ACA gtcatgtgct
gtgTctgcttgtagat 13 2 968 5 F S166P TCA CCA gtcatgtgct
gtgGctgcttgtagat 1 2 969 5 G S166A TCA GCA gtcatgtgct
gtgCctgcttgtagat 2 2 970 5 H S166L TCA TTA cgtcatgtgc
tgtAactgcttgtaga 7 2 971 6 A Q167K CAG AAG tccgtcatgt
gctTtgactgcttgta 1 1 972 6 B Q167E CAG GAG tccgtcatgt
gctCtgactgcttgta 1 2 973 6 C Q167P CAG CCG ctccgtcatg
tgcGgtgactgcttgt 0 1 974 6 D Q167R CAG CGG ctccgtcatg
tgcCgtgactgcttgt 7 1 975 6 E Q167L CAG CTG ctccgtcatg
tgcAgtgactgcttgt 1 1 976 6 F Q167H CAG CAC cctccgtcat
gtgGtgtgactgcttg 8 1 977 6 G H168N CAC AAC acctccgtca
tgtTctgtgactgctt 2 1 978 6 H H168D CAC GAC acctccgtca
tgtCctgtgactgctt 1 1 979 7 A H168Y CAC TAC acctccgtca
tgtActgtgactgctt 7 2 980 7 B H168P CAC CCC aacctccgtc
atgGgctgtgactgct 3 0 981 7 D H168L CAC CTC aacctccgtc
atgAgctgtgactgct 4 0 983 7 E H168Q CAC CAG caacctccgt
catCtgctgtgactgc 1 0 984 7 F M169V ATG GTG acaacctccg
tcaCgtgctgtgactg 4 2 985 7 G M169L ATG CTG acaacctccg
tcaGgtgctgtgactg 0 1 986 7 H M169K ATG AAG cacaacctcc
gtcTtgtgctgtgact 2 1 987 8 A M169T ATG ACG cacaacctcc
gtcGtgtgctgtgact 3 1 988 8 B M169R ATG AGG cacaacctcc
gtcCtgtgctgtgact 0 2 989 8 C M169I ATG ATC tcacaacctc
cgtGatgtgctgtgac 17 1 990 8 D T170P ACG CCG ctcacaacct
ccgGcatgtgctgtga 1 1 991 8 E T170A ACG GCG ctcacaacct
ccgCcatgtgctgtga 4 2 992 8 F T170S ACG TCG ctcacaacct
ccgAcatgtgctgtga 2 2 993 8 G T170K ACG AAG cctcacaacc
tccTtcatgtgctgtg 1 1 994 8 H T170R ACG AGG cctcacaacc
tccCtcatgtgctgtg 0 2 995 9 A T170M ACG ATG cctcacaacc
tccAtcatgtgctgtg 4 2 996 9 B E171K GAG AAG cgcctcacaa
cctTcgtcatgtgctg 4 2 997 9 C E171Q GAG CAG cgcctcacaa
cctGcgtcatgtgctg 0 2 998 9 D E171A GAG GCG gcgcctcaca
accGccgtcatgtgct 1 1 999 9 E E171G GAG GGG gcgcctcaca
accCccgtcatgtgct 2 0 1000 9 F E171V GAG GTG gcgcctcaca
accAccgtcatgtgct 2 1 1001 9 G E171D GAG GAC agcgcctcac
aacGtccgtcatgtgc 1 1 1002 9 H V172I GTT ATT cagcgcctca
caaTctccgtcatgtg 1 2 1003 10 A V172L GTT CTT cagcgcctca
caaGctccgtcatgtg 1 1 1004 10 B V172F GTT TTT cagcgcctca
caaActccgtcatgtg 7 0 1005 10 C V172D GTT GAT gcagcgcctc
acaTcctccgtcatgt 5 0 1006 10 D V172A GTT GCT gcagcgcctc
acaGcctccgtcatgt 7 1 1007 10 E V172G GTT GGT gcagcgcctc
acaCcctccgtcatgt 4 0 1008 10 F V173M GTG ATG gggcagcgcc
tcaTaacctccgtcat 40 0 1009 10 G V173L GTG CTG gggcagcgcc
tcaGaacctccgtcat 45 0 1010 11 A V173A GTG GCG ggggcagcgcctcGcaacctccgtca 11 0 1012 11 B V173G GTG GGG ggggcagcgcctcCcaacctccgtca 9 0 1013 11 C R174G AGG GGG tgggggcagcgccCcacaacctccgt 1 0 1014 11 D R174W AGG TGG tgggggcagcgccAcacaacctccgt 10 1 1015 11 E R174K AGG AAG gtgggggcagcgcTtcacaacctccg 7 2 1016 11 F R174T AGG ACG gtgggggcagcgcGtcacaacctccg 1 1 1017 11 G R174M AGG ATG gtgggggcagcgcAtcacaacctccg 3 1 1018 11 H R174S AGG AGC ggtgggggcagcgGctcacaacctcc 4 1 1019 12 A R175S CGC AGC tggtgggggcagcTcctcacaacctc 17 1 1020 12 B R175G CGC GGC tggtgggggcagcCcctcacaacctc 14 0 1021 12 C R175C CGC TGC tggtgggggcagcAcctcacaacctc 16 2 1022 12 D R175H CGC CAC atggtgggggcagTgcctcacaacct 540 0 1023 12 E R175P CGC CCC atggtgggggcagGgcctcacaacct 4 0 1024 12 F R175L CGC CTC atggtgggggcagAgcctcacaacct 14 0 1025 12 G C176S TGC AGC tcatggtgggggcTgcgcctcacaac 20 0 1026 12 H C176R TGC CGC tcatggtgggggcGgcgcctcacaac 5 0 1027
ggtTggggcagcgcct 4 1 1038 2 D H178D CAC GAC cagcgctcat
ggtCggggcagcgcct 6 0 1039 2 E H178Y CAC TAC cagcgctcat
ggtAggggcagcgcct 7 2 1040 2 F H178P CAC CCC gcagcgctca
tggGgggggcagcgcc 7 0 1041 2 G H178R CAC CGC gcagcgctca
tggCgggggcagcgcc 1 1 1042 2 H H178L CAC CTC gcagcgctca
tggAgggggcagcgcc 0 2 1043 3 A H178Q CAC CAG agcagcgctc
atgCtgggggcagcgc 0 1 1044 3 B H179N CAT AAT gagcagcgct
catTgtgggggcagcg 13 1 1045 3 C H179D CAT GAT gagcagcgct
catCgtgggggcagcg 17 1 1046 3 D H179Y CAT TAT gagcagcgct
catAgtgggggcagcg 56 0 1047 3 E H179P CAT CCT tgagcagcgc
tcaGggtgggggcagc 3 1 1048 3 F H179R CAT CGT tgagcagcgc
tcaCggtgggggcagc 78 0 1049 3 G H179L CAT CTT tgagcagcgc
tcaAggtgggggcagc 22 1 1050 3 H H179Q CAT CAG ctgagcagcg
ctcCtggtgggggcag 9 1 1051 4 A E180K GAG AAG tctgagcagc
gctTatggtgggggca 2 1 1052 4 B E180Q GAG CAG tctgagcagc
gctGatggtgggggca 1 1 1053 4 C E180A GAG GCG atctgagcag
cgcGcatggtgggggc 0 1 1054 4 D E180G GAG GGG atctgagcag
cgcCcatggtgggggc 1 1 1055 4 E E180V GAG GTG atctgagcag
cgcAcatggtgggggc 0 2 1056 4 F E180D GAG GAC tatctgagca
gcgGtcatggtggggg 1 1 1057 4 G R181S CGC AGC ctatctgagc
agcTctcatggtgggg 2 1 1058 4 H R181G CGC GGC ctatctgagc
agcCctcatggtgggg 1 1 1059 5 A R181C CGC TGC ctatctgagc
agcActcatggtgggg 18 1 1060 5 B R181H CGC CAC gctatctgag
cagTgctcatggtggg 24 1 1061 5 C R181P CGC CCC gctatctgag
cagGgctcatggtggg 11 0 1062 5 D R181L CGC CTC gctatctgag
cagAgctcatggtggg 3 1 1063 5 E C182S TGC AGC tcgctatctg
agcTgcgctcatggtg 6 2 1064 5 F C182R TGC CGC tcgctatctg
agcGgcgctcatggtg 3 2 1065 5 H C182Y TGC TAC atcgctatct
gagTagcgctcatggt 3 2 1067 6 A C182F TGC TTC atcgctatct
gagAagcgctcatggt 0 2 1068 6 B C182W TGC TGG catcgctatc
tgaCcagcgctcatgg 0 2 1069 6 C S183T TCA ACA ccatcgctat
ctgTgcagcgctcatg 0 2 1070 6 D S183P TCA CCA ccatcgctat
ctgGgcagcgctcatg 2 2 1071 6 E S183A TCA GCA ccatcgctat
ctgCgcagcgctcatg 0 2 1072 6 F S183L TCA TTA accatcgcta
tctAagcagcgctcat 2 2 1073 6 G D184N GAT AAT agaccatcgc
tatTtgagcagcgctc 4 2 1074 6 H D184H GAT CAT agaccatcgc
tatGtgagcagcgctc 1 2 1075 7 A D184Y GAT TAT agaccatcgc
tatAtgagcagcgctc 2 2 1076 7 B D184A GAT GCT cagaccatcg
ctaGctgagcagcgct 0 2 1077 7 C D184G GAT GGT cagaccatcg
ctaCctgagcagcgct 2 2 1078 7 D D184V GAT GTT cagaccatcg
ctaActgagcagcgct 0 2 1079 7 E D184E GAT GAG ccagaccatc
gctCtctgagcagcgc 0 2 1080 7 F S185R AGC CGC gccagaccat
cgcGatctgagcagcg 0 2 1081 7 G S185G AGC GGC gccagaccat
cgcCatctgagcagcg 0 2 1082 7 H S185C AGC TGC gccagaccat
cgcAatctgagcagcg 1 2 1083 8 A S185N AGC AAC ggccagacca
tcgTtatctgagcagc 0 2 1084 8 B S185T AGC ACC ggccagacca
tcgGtatctgagcagc 0 2 1085 8 C S185I AGC ATC ggccagacca
tcgAtatctgagcagc 2 2 1086 8 D D186N GAT AAT ggggccagac
catTgctatctgagca 2 2 1087 8 E D186H GAT CAT ggggccagac
catGgctatctgagca 0 2 1088 8 F D186Y GAT TAT ggggccagac
catAgctatctgagca 1 2 1089 8 G D186A GAT GCT aggggccaga
ccaGcgctatctgagc 0 2 1090 8 H D186G GAT GGT aggggccaga
ccaCcgctatctgagc 2 2 1091 9 A D186V GAT GTT aggggccaga
ccaAcgctatctgagc 0 2 1092 9 B D186E GAT GAG gaggggccag
accCtcgctatctgag 1 2 1093 9 C G187S GGT AGT ggaggggcca
gacTatcgctatctga 5 2 1094 9 E G187C GGT TGT ggaggggccagacAatcgctatctga 4 2 1096 9 F G187D GGT GAT aggaggggccagaTcatcgctatctg 1 2 1097 9 G G187A GGT GCT aggaggggccagaGcatcgctatctg 0 1 1098 9 H G187V GGT GTT aggaggggccagaAcatcgctatctg 1 2 1099 10 A L188M CTG ATG tgaggaggggccaTaccatcgctatc 0 2 1100 10 B L188V CTG GTG tgaggaggggccaCaccatcgctatc 4 2 1101 10 C L188Q CTG CAG ctgaggaggggccTgaccatcgctat 0 2 1102 10 D L188P CTG CCG ctgaggaggggccGgaccatcgctat 0 1 1103 10 E L188R CTG CGG ctgaggaggggccCgaccatcgctat 0 2 1104 10 F A189T GCC ACC tgctgaggaggggTcagaccatcgct 3 1 1105 10 G A189P GCC CCC tgctgaggaggggGcagaccatcgct 3 1 1106 10 H A189S GCC TCC tgctgaggaggggAcagaccatcgct 0 0 1107 11 A A189D GCC GAC atgctgaggagggTccagaccatcgc 0 0 1108 11 B A189G GCC GGC atgctgaggagggCccagaccatcgc 2 1 1109 11 C A189V GCC GTC atgctgaggagggAccagaccatcgc 10 2 1110 11 D P190T CCT ACT agatgctgaggagTggccagaccatc 2 1 1111 11 E P190A CCT GCT agatgctgaggagCggccagaccatc 1 0 1112 11 F P190S CCT TCT agatgctgaggagAggccagaccatc 4 1 1113 11 G P190H CCT CAT aagatgctgaggaTgggccagaccat 1 1 1114 11 H P190R CCT CGT aagatgctgaggaCgggccagaccat 1 1 1115 12 A P190L CCT CTT aagatgctgaggaAgggccagaccat 23 0 1116 12 B P191T CCT ACT ataagatgctgagTaggggccagacc 5 1 1117 12 C P191A CCT GCT ataagatgctgagCaggggccagacc 0 2 1118 12 D P191S CCT TCT ataagatgctgagAaggggccagacc 2 2 1119 12 E P191H CCT CAT gataagatgctgaTgaggggccagac 2 1 1120 12 F P191R CCT CGT gataagatgctgaCgaggggccagac 1 2 1121 12 G P191L CCT CTT gataagatgctgaAgaggggccagac 2 1 1122 12 H Q192K CAG AAG cggataagatgctTaggaggggccag 0 2 1123
actGggataagatgct 11 0 1151 4 E R196L CGA CTA atttccttcc
actAggataagatgct 1 0 1152 4 F V197M GTG ATG aaatttcctt
ccaTtcggataagatg 3 0 1153 4 G V197L GTG CTG aaatttcctt
ccaGtcggataagatg 2 0 1154 4 H V197E GTG GAG caaatttcct
tccTctcggataagat 4 0 1155 5 A V197A GTG GCG caaatttcct
tccGctcggataagat 0 1 1156 5 B V197G GTG GGG caaatttcct
tccCctcggataagat 8 0 1157 5 C E198K GAA AAA cgcaaatttc
cttTcactcggataag 2 2 1158 5 D E198Q GAA CAA cgcaaatttc
cttGcactcggataag 2 2 1159 5 E E198A GAA GCA acgcaaattt
cctGccactcggataa 0 2 1160 5 F E198G GAA GGA acgcaaattt
cctCccactcggataa 1 0 1161 5 G E198V GAA GTA acgcaaattt
cctAccactcggataa 0 2 1162 5 H E198D GAA GAC cacgcaaatt
tccGtccactcggata 1 0 1163 6 A G199R GGA AGA acacgcaaat
ttcTttccactcggat 5 2 1164 6 B G199E GGA GAA cacacgcaaa
tttTcttccactcgga 10 0 1165 6 C G199A GGA GCA cacacgcaaa
tttGcttccactcgga 1 1 1166 6 D G199V GGA GTA cacacgcaaa
tttActtccactcgga 3 0 1167 6 E N200H AAT CAT tccacacgca
aatGtccttccactcg 0 2 1168 6 F N200D AAT GAT tccacacgca
aatCtccttccactcg 1 0 1169 6 G N200Y AAT TAT tccacacgca
aatAtccttccactcg 0 0 1170 6 H N200T AAT ACT ctccacacgc
aaaGttccttccactc 0 2 1171 7 A N200S AAT AGT ctccacacgc
aaaCttccttccactc 2 2 1172 7 B N200I AAT ATT ctccacacgc
aaaAttccttccactc 0 0 1173 7 C N200K AAT AAG actccacacg
caaCtttccttccact 1 1 1174 7 D L201M TTG ATG tactccacac
gcaTatttccttccac 0 2 1175 7 E L201V TTG GTG tactccacac
gcaCatttccttccac 0 2 1176 7 F L201W TTG TGG atactccaca
cgcCaatttccttcca 0 2 1177 7 G L201S TTG TCG atactccaca
cgcGaatttccttcca 0 2 1178 8 A R202S CGT AGT aaatactccacacTcaaatttccttc 4 2 1180 8 B R202G CGT GGT aaatactccacacCcaaatttccttc 0 2 1181 8 C R202C CGT TGT aaatactccacacAcaaatttccttc 4 1 1182 8 D R202H CGT CAT caaatactccacaTgcaaatttcctt 8 2 1183 8 E R202P CGT CCT caaatactccacaGgcaaatttcctt 3 1 1184 8 F R202L CGT CTT caaatactccacaAgcaaatttcctt 4 0 1185 8 G V203M GTG ATG tccaaatactccaTacgcaaatttcc 1 0 1186 8 H V203L GTG CTG tccaaatactccaGacgcaaatttcc 3 0 1187 9 A V203E GTG GAG atccaaatactccTcacgcaaatttc 7 0 1188 9 B V203A GTG GCG atccaaatactccGcacgcaaatttc 2 2 1189 9 C V203G GTG GGG atccaaatactccCcacgcaaatttc 0 1 1190 9 D E204K GAG AAG tcatccaaatactTcacacgcaaatt 2 2 1191 9 E E204Q GAG CAG tcatccaaatactGcacacgcaaatt 0 2 1192 9 F E204A GAG GCG gtcatccaaatacGccacacgcaaat 1 2 1193 9 G E204G GAG GGG gtcatccaaatacCccacacgcaaat 1 0 1194 9 H E204V GAG GTG gtcatccaaatacAccacacgcaaat 1 1 1195 10 A E204D GAG GAC tgtcatccaaataGtccacacgcaaa 0 1 1196 10 B Y205N TAT AAT ctgtcatccaaatTctccacacgcaa 2 0 1197 10 C Y205H TAT CAT ctgtcatccaaatGctccacacgcaa 5 0 1198 10 D Y205D TAT GAT ctgtcatccaaatCctccacacgcaa 12 0 1199 10 E Y205S TAT TCT tctgtcatccaaaGactccacacgca 8 0 1200 10 F Y205C TAT TGT tctgtcatccaaaCactccacacgca 69 0 1201 10 G Y205F TAT TTT tctgtcatccaaaAactccacacgca 4 0 1202 10 H L206V TTG GTG tttctgtcatccaCatactccacacg 0 2 1203 11 A L206M TTG ATG tttctgtcatccaTatactccacacg 1 2 1204 11 B P223S CCT TCT gagccaacctcagAcggctcataggg 1 0 1205 11 C P223A CCT GCT gagccaacctcagCcggctcataggg 1 1 1206 11 D P223T CCT ACT gagccaacctcagTcggctcataggg 0 0 1207 11 E P223L CCT CTT agagccaacctcaAgcggctcatagg 3 0 1208 11 F P223R CCT CGT agagccaacctcaCgcggctcatagg 0 0 1209 11 G P223H CCT CAT agagccaacctcaTgcggctcatagg 3 0 1210 11 H E224Q GAG CAG tcagagccaacctGaggcggctcata 0 2 1211 12 A E224K GAG AAG tcagagccaacctTaggcggctcata 4 1 1212 12 B E224V GAG GTG gtcagagccaaccAcaggcggctcat 2 2 1213 12 C E224G GAG GGG gtcagagccaaccCcaggcggctcat 1 2 1214 12 D E224A GAG GCG gtcagagccaaccGcaggcggctcat 0 2 1215 12 E E224D GAG GAC agtcagagccaacGtcaggcggctca 5 2 1216 12 F V225I GTT ATT cagtcagagccaaTctcaggcggctc 1 2 1217 12 G V225L GTT CTT cagtcagagccaaGctcaggcggctc 1 2 1218 12 H V225F GTT TTT cagtcagagccaaActcaggcggctc 2 2 1219
合成オリゴヌクレオチドで括弧を付してその塩基配列が
示されているものは、26mer よりも短い22mer のものか
ら、それよりはるかに長い70merの長さのオリゴヌクレ
オチドが示されているが、こうした合成オリゴヌクレオ
チドを使用しても所望のPCR 産物は得られないという結
果を得ている。例えば、プレート#1のなかのD228Y, C22
9Y及びC229W 用の変異合成オリゴヌクレオチド〔配列番
号:1345〕, 〔配列番号:1355〕及び〔配列番号:135
8〕の塩基長は、それぞれ30, 34, 36であったが、1回
目のPCR は不成功であった。また、22〜24mer の長さの
変異合成オリゴヌクレオチドを使用して所望のPCR 産物
を得ている例は、GCに富んだものであることに留意する
必要がある。したがって、変異合成オリゴヌクレオチド
としては、26mer 程度であって、そのほぼ中心位置に一
塩基変異部位を持つものが好ましいことが認められる。
製によるp53 変異の機能を評価した結果、(1)転写活性
化ドメインとC末端側の機能調節ドメインはミスセンス
変異による感受性(転写活性化能への影響)が極めて低
く、逆にDNA結合ドメインと4量体形成ドメインは感受
性が高かった、(2)DNA結合ドメインの中で、特に高度に
保存されているアミノ酸残基は感受性が高かった、(3)
転写機能を傷害する変異、変異報告頻度、系統解析に基
づくアミノ酸残基の保存性の3者には相関が認められ
た、(5) Li-Fraumeni 症候群に報告されているミスセン
ス変異はすべてp53 転写活性化能を失っていることを確
認できた、及び(6)未報告の温度感受性変異を多数見い
だした。かくして、本発明に基づけば、複数のp53下流
遺伝子のプロモーターに関してのリポーターアッセイ、
野生型p53と変異p53の共発現によるドミナントネガティ
ブ変異の同定、発現変異p53タンパク質の抗原性変化な
どについて解析し、個々のミスセンス変異に対応したデ
ータベースを構築することが可能である。そして、網羅
的変異の機能解析をさらに発展させることにより、がん
の個別化による治療法選択、発癌に関する分子疫学的研
究やタンパク質構造解析研究等に役立つ。
異cDNAライブラリーを効率的に作成することができる。
また、当該作成された網羅的p531塩基置換変異cDNAラ
イブラリーは機能解析情報付きであり、ゲノミックス技
術、プロテオミックス技術に利用することができて有用
である。本発明では、網羅的p53 1塩基置換変異cDNAラ
イブラリーを使用して核酸アレイを構成することがで
き、効率的な遺伝子解析技術、診断薬や治療薬の開発に
役立つと期待される。本発明は、前述の説明及び実施例
に特に記載した以外も、実行できることは明らかであ
る。上述の教示に鑑みて、本発明の多くの改変及び変形
が可能であり、従ってそれらも本件添付の請求の範囲の
範囲内のものである。
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequ
ence: Mutagenic oligonucleotide for
PCR
ggctcgacgc tagtatctga ctgcgg 26 <210> 37 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 37 ggctcgacgc tagcatctga ctgcgg 26 <210> 38 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 38 ggctcgacgc tagaatctga ctgcgg 26 <210> 39 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 39 gggctcgacg ctatgatctg actgcg 26 <210> 40 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 40 gggctcgacg ctacgatctg actgcg 26 <210> 41
<211> 26
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<213> Artificial Sequence
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ence: <400> 41 gggctcgacg ctaagatctg actgcg 26 <210> 42 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 42 gggggctcga cgcgaggatc tgactg 26 <210> 43 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 43 gggggctcga cgccaggatc tgactg 26 <210> 44 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 44 gggggctcga cgcaaggatc tgactg 26 <210> 45 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 45 agggggctcg acgttaggat ctgact 26 <210> 46 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 46 agggggctcg acggtaggat ctgact 26 <210> 47 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 47 agggggctcg acgataggat ctgact 26 <210> 48 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 48 agagggggct cgatgctagg atctga 26 <210> 49 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 49 agagggggct cgaggctagg atctga 26 <210> 50 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 50 agagggggct cgaagctagg atctga 26 <210> 51 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 51 cagagggggc tcgtcgctag gatctg 26 <210> 52 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 52 cagagggggc tcggcgctag gatctg 26 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oligonucleotide for PCR <400> 58 actcagaggg ggcacgacgc taggat 26 <210> 59 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 59 gactcagagg ggggtcgacg ctagga 26 <210> 60 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 60 tgactcagag gggtctcgac gctagg 26 <210> 61 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 61 tgactcagag gggcctcgac gctagg 26 <210> 62 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 62 tgactcagag gggactcgac gctagg 26 <210> 63 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 63 ctgactcaga gggtgctcga cgctag 26 <210> 64 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 64 ctgactcaga gggcgctcga cgctag 26 <210> 65 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 65 ctgactcaga gggagctcga cgctag 26 <210> 66 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 66 tcctgactca gagtgggctc gacgct 26 <210> 67 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 67 tcctgactca gagcgggctc gacgct 26 <210> 68 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 68 tcctgactca gagagggctc gacgct 26 <210> 69 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 69 ttcctgactc 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ence: Mutagenic oligonucleotide for
PCR <400> 70 ttcctgactc agacggggct cgacgc 26 <210> 71 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 71 ttcctgactc agaaggggct cgacgc 26 <210> 72 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 72 gtttcctgac tcataggggg ctcgac 26 <210> 73 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 73 gtttcctgac tcacaggggg ctcgac 26 <210> 74 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 74 tgtttcctga ctctgagggg gctcga 26 <210> 75 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 75 tgtttcctga ctcggagggg gctcga 26 <210> 76 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 76 tgtttcctga ctccgagggg gctcga 26 <210> 77 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 77 aatgtttcct gacgcagagg gggctc 26 <210> 78 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 78 aatgtttcct gacccagagg gggctc 26 <210> 79 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 79 aatgtttcct gacacagagg gggctc 26 <210> 80 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 80 aaatgtttcc tgattcagag ggggct 26 <210> 81 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 81 aaatgtttcc tgagtcagag ggggct 26 <210> 82
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ence: Mutagenic oligonucleotide for
PCR
aaatgtttcc tgaatcagag ggggct 26 <210> 83 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 83 gaaaatgttt ccttactcag aggggg 26 <210> 84 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 84 gaaaatgttt cctcactcag aggggg 26 <210> 85 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 85 tgaaaatgtt tccggactca gagggg 26 <210> 86 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 86 tgaaaatgtt tcccgactca gagggg 26 <210> 87 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 87 tgaaaatgtt tccagactca gagggg 26 <210> 88 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of 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PCR <400> 99 taggtctgaa aatctttcct gactca 26 <210> 100 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 100 taggtctgaa aatatttcct gactca 26 <210> 101 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 101 cataggtctg aaattgtttc ctgact 26 <210> 102 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 102 cataggtctg aaagtgtttc ctgact 26 <210> 103 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 103 cataggtctg aaactgtttc ctgact 26 <210> 104 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 104 ccataggtct gaatatgttt cctgac 26 <210> 105 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 105 ccataggtct gaagatgttt cctgac 26 <210> 106 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 106 ccataggtct gaacatgttt cctgac 26 <210> 107 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 107 ttccataggt ctgtaaatgt ttcctg 26 <210> 108 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 108 ttccataggt ctggaaatgt ttcctg 26 <210> 109 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 109 ttccataggt ctgcaaatgt ttcctg 26 <210> 110 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 110 tttccatagg 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<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequ
ence: <400> 116 tagtttccat aggactgaaa atgttt 26 <210> 117 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 117 gtagtttcca tagctctgaa aatgtt 26 <210> 118 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 118 agtagtttcc atatgtctga aaatgt 26 <210> 119 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 119 agtagtttcc atacgtctga aaatgt 26 <210> 120 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 120 aagtagtttc cattggtctg aaaatg 26 <210> 121 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 121 aagtagtttc catgggtctg aaaatg 26 <210> 122 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 122 aagtagtttc catcggtctg aaaatg 26 <210> 123 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 123 ggaagtagtt tccttaggtc tgaaaa 26 <210> 124 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 124 ggaagtagtt tccctaggtc tgaaaa 26 <210> 125 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 125 aggaagtagt ttcgataggt ctgaaa 26 <210> 126 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 126 aggaagtagt ttcaataggt ctgaaa 26 <210> 127 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 127 caggaagtag 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Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 133 tttcaggaag taggttccat aggtct 26 <210> 134 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 134 ttttcaggaa gtattttcca taggtc 26 <210> 135 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 135 ttttcaggaa gtactttcca taggtc 26 <210> 136 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 136 gttttcagga agttgtttcc ataggt 26 <210> 137 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 137 gttttcagga agtggtttcc ataggt 26 <210> 138 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 138 gttttcagga agtcgtttcc ataggt 26 <210> 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PCR <400> 155 cagaacgttg tttacaggaa gtagtt 26 <210> 156 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 156 acagaacgtt gttgtcagga agtagt 26 <210> 157 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 157 gacagaacgt tgtgttcagg aagtag 26 <210> 158 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 158 gacagaacgt tgtcttcagg aagtag 26 <210> 159 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 159 gacagaacgt tgtattcagg aagtag 26 <210> 160 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 160 ggacagaacg ttggtttcag gaagta 26 <210> 161 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 183 gacggcaagg ggggcagaac gttgtt 26 <210> 184 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 184 gacggcaagg gggccagaac gttgtt 26 <210> 185 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 185 ggacggcaag gggtacagaa cgttgt 26 <210> 186 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 186 ggacggcaag gggcacagaa cgttgt 26 <210> 187 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 187 ggacggcaag gggaacagaa cgttgt 26 <210> 188 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 188 tgggacggca aggtggacag aacgtt 26 <210> 189 <211> 26 <212> DNA 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PCR <400> 194 gcttgggacg gcatggggga cagaac 26 <210> 195 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 195 gcttgggacg gcacggggga cagaac 26 <210> 196 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 196 tgcttgggac ggccaggggg acagaa 26 <210> 197 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 197 tgcttgggac ggcgaggggg acagaa 26 <210> 198 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 198 ttgcttggga cgggaagggg gacaga 26 <210> 199 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 199 attgcttggg acgtcaaggg ggacag 26 <210> 200 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 200 attgcttggg acgccaaggg ggacag 26 <210> 201 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 201 attgcttggg acgacaaggg ggacag 26 <210> 202 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 202 cattgcttgg gactgcaagg gggaca 26 <210> 203 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 203 cattgcttgg gaccgcaagg gggaca 26 <210> 204 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 204 cattgcttgg gacagcaagg gggaca 26 <210> 205 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 205 tccattgctt 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Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 211 tcatccattg ctttggacgg caaggg 26 <210> 212 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 212 tcatccattg cttcggacgg caaggg 26 <210> 213 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 213 atcatccatt gctggggacg gcaagg 26 <210> 214 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 214 atcatccatt gctcgggacg gcaagg 26 <210> 215 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 215 atcatccatt gctagggacg gcaagg 26 <210> 216 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 216 aatcatccat tgcgtgggac ggcaag 26 <210> 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Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 222 caaatcatcc attacttggg acggca 26 <210> 223 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 223 atcaaatcat ccactgcttg ggacgg 26 <210> 224 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 224 atcaaatcat ccagtgcttg ggacgg 26 <210> 225
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Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 299 tcagtgaacc attcttcaat atcgtc 26 <210> 300 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 300 ttcagtgaac catggttcaa tatcgt 26 <210> 301 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 301 ttcagtgaac catcgttcaa tatcgt 26 <210> 302 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 302 ttcagtgaac catagttcaa tatcgt 26 <210> 303 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 303 cttcagtgaa ccagtgttca atatcg 26 <210> 304 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 304 tcttcagtga acctttgttc aatatc 26 <210> 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gccactggca ttctgg 26 <210> 398 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 398 cggggggagc agcgtctggc attctg 26 <210> 399 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 399 acggggggag cagtctctgg cattct 26 <210> 400 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 400 acggggggag caggctctgg cattct 26 <210> 401 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 401 acggggggag cagactctgg cattct 26 <210> 402 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 402 cacgggggga gcatcctctg gcattc 26 <210> 403 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 403 cacgggggga gcaccctctg gcattc 26 <210> 404 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 404 cacgggggga gcaacctctg gcattc 26 <210> 405 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 405 gccacggggg gagtagcctc tggcat 26 <210> 406 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 406 gccacggggg gaggagcctc tggcat 26 <210> 407 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 407 gccacggggg gagaagcctc tggcat 26 <210> 408 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 408 ggccacgggg ggatcagcct ctggca 26 <210> 409 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 409 ggccacgggg ggaccagcct ctggca 26 <210> 410 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 410 ggccacgggg ggaacagcct ctggca 26 <210> 411 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 411 ggggccacgg gggtagcagc ctctgg 26 <210> 412 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 412 ggggccacgg gggcagcagc ctctgg 26 <210> 413 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 413 ggggccacgg gggaagcagc ctctgg 26 <210> 414 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 414 aggggccacg gggtgagcag cctctg 26 <210> 415 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 415 aggggccacg gggcgagcag cctctg 26 <210> 416 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 416 aggggccacg gggagagcag cctctg 26 <210> 417 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 417 gcaggggcca cggtgggagc agcctc 26 <210> 418 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 418 gcaggggcca cggcgggagc agcctc 26 <210> 419 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 419 gcaggggcca cggagggagc agcctc 26 <210> 420 <211> 26 <212> DNA 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PCR <400> 425 tggtgcaggg gcctcggggg gagcag 26 <210> 426 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 426 tggtgcaggg gccgcggggg gagcag 26 <210> 427 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 427 tggtgcaggg gccccggggg gagcag 26 <210> 428 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 428 gctggtgcag gggtcacggg gggagc 26 <210> 429 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 429 gctggtgcag ggggcacggg gggagc 26 <210> 430 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 430 gctggtgcag gggacacggg gggagc 26 <210> 431 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 442 ggagctgctg gtgaaggggc cacggg 26 <210> 443 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 443 aggagctgct ggttcagggg ccacgg 26 <210> 444 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 444 aggagctgct ggtccagggg ccacgg 26 <210> 445 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 445 aggagctgct ggtacagggg ccacgg 26 <210> 446 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 446 gtaggagctg ctgttgcagg ggccac 26 <210> 447 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 447 gtaggagctg ctgctgcagg ggccac 26 <210> 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Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 492 ggctggtgca gggcccgccg gtgtag 26 <210> 493 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 493 ggctggtgca gggaccgccg gtgtag 26 <210> 494 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 494 ggggctggtg cagtggccgc cggtgt 26 <210> 495 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 495 ggggctggtg cagcggccgc cggtgt 26 <210> 496 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 496 ggggctggtg cagaggccgc cggtgt 26 <210> 497 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 497 gggggctggt gcatgggccg ccggtg 26 <210> 498 <211> 26 <212> DNA 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PCR <400> 503 ggagggggct ggttcagggg ccgccg 26 <210> 504 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 504 ggagggggct ggtccagggg ccgccg 26 <210> 505 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 505 ggagggggct ggtacagggg ccgccg 26 <210> 506 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 506 caggaggggg ctgttgcagg ggccgc 26 <210> 507 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 507 caggaggggg ctgctgcagg ggccgc 26 <210> 508 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 508 caggaggggg ctgatgcagg ggccgc 26 <210> 509 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequ
ence: Mutagenic oligonucleotide for
PCR <400> 1211 tcagagccaa cctgaggcgg ctcata 26 <210> 1212 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1212 tcagagccaa ccttaggcgg ctcata 26 <210> 1213 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1213 gtcagagcca accacaggcg gctcat 26 <210> 1214 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1214 gtcagagcca accccaggcg gctcat 26 <210> 1215 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1215 gtcagagcca accgcaggcg gctcat 26
<210> 1216
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1216 agtcagagcc aacgtcaggc ggctca 26 <210> 1217 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1217 cagtcagagc caatctcagg cggctc 26 <210> 1218 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1218 cagtcagagc caagctcagg cggctc 26 <210> 1219 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1219 cagtcagagc caaactcagg cggctc 26 <210> 1220 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1220 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacactatgt cgaaaagtgt ttctgtcatc 60 ccaatactcc 70 <210> 1221 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1221 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacactatgt cgaaaagtgt ttctgtcatc 60 cgaatactcc 70 <210> 1222 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1222 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacactatgt cgaaaagtgt ttctgtcatc 60 gaaatactc 69 <210> 1223 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1223 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacactatgt cgaaaagtgt ttctgtcatt 60 caaatact 68 <210> 1224 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1224 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacactatgt cgaaaagtgt ttctgtcatg 60 caaatact 68 <210> 1225 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1225 tgtggagtat ttgcatgaca gaaaca 26 <210> 1226 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1226 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacactatgt cgaaaagtgt ttctgtcata 60 caaatact 68 <210> 1227 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1227 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacactatgt cgaaaagtgt ttctgtcagc 60 caaatac 67 <210> 1228 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1228 gtggagtatt tggctgacag aaacac 26 <210> 1229 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1229 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacactatgt cgaaaagtgt ttctgtcacc 60 caaatac 67 <210> 1230 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1230 gtggagtatt tgggtgacag aaacac 26 <210> 1231 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1231 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacactatgt cgaaaagtgt ttctgtcaac 60 caaatac 67 <210> 1232 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1232 gtggagtatt tggttgacag aaacac 26 <210> 1233 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1233 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacactatgt cgaaaagtgt ttctgtcctc 60 caaata 66 <210> 1234 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1234 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacactatgt cgaaaagtgt ttctgttatc 60 caaat 65 <210> 1235 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1235 ggagtatttg gataacagaa acactt 26 <210> 1236 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1236 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacactatgt cgaaaagtgt ttctgtgatc 60 caaat 65 <210> 1237 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1237 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacactatgt cgaaaagtgt ttctgtaatc 60 caaat 65 <210> 1238 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1238 ggagtatttg gattacagaa acactt 26 <210> 1239 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1239 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacactatgt cgaaaagtgt ttctggcatc 60 caaa 64 <210> 1240 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1240 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacactatgt cgaaaagtgt ttctgccatc 60 caaa 64 <210> 1241 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1241 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacactatgt cgaaaagtgt ttctgacatc 60 caaa 64 <210> 1242 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1242 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacactatgt cgaaaagtgt ttctttcatc 60 caa 63 <210> 1243 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1243 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacactatgt cgaaaagtgt ttccgtcatc 60 ca 62 <210> 1244 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1244 gccaacctca 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Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1249 atttggatga cagcaacact tttcga 26 <210> 1250 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1250 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacactatgt cgaaaagtgt ctctgtcat 59 <210> 1251 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1251 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacactatgt cgaaaagtgt gtctgtcat 59 <210> 1252 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1252 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacactatgt cgaaaagtgt atctgtcat 59 <210> 1253 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1253 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacactatgt cgaaaagtgc ttctgtca 58 <210> 1254 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1254 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacactatgt cgaaaagtgg ttctgtca 58 <210> 1255 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1255 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacactatgt cgaaaagtga ttctgtca 58 <210> 1256 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1256 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacactatgt cgaaaagtct ttctgtc 57 <210> 1257 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1257 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacactatgt cgaaaagggt ttctgt 56 <210> 1258 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1258 gccaacctca ggcggctcat 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PCR <400> 1263 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacactatgt cgaatagtgt ttc 53 <210> 1264 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1264 tgacagaaac actattcgac atagtg 26 <210> 1265 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1265 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacactatgt cgaagagtgt ttc 53 <210> 1266 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1266 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacactatgt cgaacagtgt ttc 53 <210> 1267 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1267 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacactatgt cgataagtgt tt 52 <210> 1268 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1268 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacactatgt cgagaagtgt tt 52 <210> 1269 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1269 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacactatgt cgacaagtgt tt 52 <210> 1270 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1270 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacactatgt ccaaaagtgt 50 <210> 1271 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1271 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacactatgt tgaaaagtg 49 <210> 1272 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1272 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacactatgt ggaaaagtg 49 <210> 1273 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1273 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacactatgt agaaaagtg 49 <210> 1274 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1274 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacactattt cgaaaag 47 <210> 1275 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1275 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacactatct cgaaaag 47 <210> 1276 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1276 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacactatat cgaaaag 47 <210> 1277 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1277 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacactaggt cgaaaa 46 <210> 1278 <211> 46 <212> DNA <213> 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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1282 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacacaatgt cgaa 44 <210> 1283 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1283 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacattatgt cga 43 <210> 1284 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1284 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacagtatgt cga 43 <210> 1285 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1285 acttttcgac atactgtggt ggtgcc 26 <210> 1286 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1286 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cacaatatgt cga 43 <210> 1287 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1287 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac caccctatgt cg 42 <210> 1288 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1288 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac catactatgt c 41 <210> 1289 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1289 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cagactatgt c 41 <210> 1290 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1290 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac ctcactatgt 40 <210> 1291 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1291 tttcgacata gtgaggtggt gcccta 26 <210> 1292 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1292 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cgcactatgt 40 <210> 1293 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1293 gccaacctca ggcggctcat agggcaccac cccactatgt 40 <210> 1294 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1294 gccaacctca ggcggctcat agggcaccat cacactat 38 <210> 1295 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1295 gccaacctca ggcggctcat agggcaccag cacactat 38 <210> 1296 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1296 gccaacctca ggcggctcat agggcacctc cacacta 37 <210> 1297 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1297 cgacatagtg tggaggtgcc ctatga 26 <210> 1298 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1298 gccaacctca ggcggctcat agggcaccgc cacacta 37 <210> 1299 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1299 gccaacctca ggcggctcat agggcacccc cacacta 37 <210> 1300 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1300 gccaacctca ggcggctcat agggcatcac cacac 35 <210> 1301 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1301 gccaacctca ggcggctcat agggcagcac cacac 35 <210> 1302 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1302 gccaacctca ggcggctcat agggctccac caca 34 <210> 1303 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1303 gccaacctca ggcggctcat agggcgccac caca 34 <210> 1304 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1304 gccaacctca ggcggctcat agggccccac caca 34 <210> 1305 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1305 gccaacctca ggcggctcat aggtcaccac ca 32 <210> 1306
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Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1306 gccaacctca ggcggctcat aggccaccac ca 32 <210> 1307 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1307 gccaacctca ggcggctcat aggacaccac ca 32 <210> 1308 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1308 gccaacctca ggcggctcat agtgcaccac c 31 <210> 1309 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1309 gccaacctca ggcggctcat agcgcaccac c 31 <210> 1310 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1310 gccaacctca ggcggctcat agagcaccac c 31 <210> 1311 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1311 gccaacctca 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Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1339 gagccgcctg aggttggccc tgactgtac 29 <210> 1340 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1340 gagccgcctg aggttggcgc tgactgtac 29 <210> 1341 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1341 gagccgcctg aggttggcta tgactgtac 29 <210> 1342 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1342 gagccgcctg aggttggctt tgactgtac 29 <210> 1343 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1343 gagccgcctg aggttggctg tgactgtacc 30 <210> 1344 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1344 gagccgcctg aggttggctc 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1381 gagccgcctg aggttggctc tgactgtacc accatcctct acaacta 47 <210> 1382 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1382 gagccgcctg aggttggctc tgactgtacc accatcccct acaacta 47 <210> 1383 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1383 gagccgcctg aggttggctc tgactgtacc accatccgct acaacta 47 <210> 1384 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1384 gagccgcctg aggttggctc tgactgtacc accatccagt acaacta 47 <210> 1385 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1385 gagccgcctg aggttggctc tgactgtacc accatccaca acaacta 47 <210> 1386 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1386 gagccgcctg aggttggctc tgactgtacc accatccacc acaacta 47 <210> 1387 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1387 gagccgcctg aggttggctc tgactgtacc accatccacg acaacta 47 <210> 1388 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1388 gagccgcctg aggttggctc tgactgtacc accatccact tcaactacat g 51 <210> 1389 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1389 gagccgcctg aggttggctc tgactgtacc accatccact ccaactacat g 51 <210> 1390 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1390 gagccgcctg aggttggctc tgactgtacc accatccact gcaactacat g 51 <210> 1391 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1391 gagccgcctg aggttggctc tgactgtacc accatccact actactacat gtg 53 <210> 1392 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1392 caccatccac tactactaca tgtgta 26 <210> 1393 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1393 gagccgcctg aggttggctc tgactgtacc accatccact accactacat gtg 53 <210> 1394 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1394 gagccgcctg aggttggctc tgactgtacc accatccact acgactacat gtg 53 <210> 1395 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1395 gagccgcctg 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Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1405 gagccgcctg aggttggctc tgactgtacc accatccact acaactccat gtgtaa 56 <210> 1406 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1406 atccactaca actccatgtg taaaca 26 <210> 1407 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1407 gagccgcctg aggttggctc tgactgtacc accatccact acaactgcat gtgtaa 56 <210> 1408 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1408 gagccgcctg aggttggctc tgactgtacc accatccact acaactacct gtgtaac 57 <210> 1409 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1409 ccactacaac tacctgtgta acagtt 26 <210> 1410 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1410 gagccgcctg aggttggctc tgactgtacc accatccact acaactacgt gtgtaac 57 <210> 1411 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1411 ccactacaac tacgtgtgta acagtt 26 <210> 1412 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1412 gagccgcctg aggttggctc tgactgtacc accatccact acaactacaa gtgtaacag 59 <210> 1413 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1413 cactacaact acaagtgtaa cagttc 26 <210> 1414 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1414 gagccgcctg aggttggctc tgactgtacc accatccact acaactacac gtgtaacag 59 <210> 1415 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1415 gagccgcctg aggttggctc tgactgtacc accatccact acaactacag gtgtaacag 59 <210> 1416 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1416 gagccgcctg aggttggctc tgactgtacc accatccact acaactacat atgtaacag 59 <210> 1417 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1417 gagccgcctg aggttggctc tgactgtacc accatccact acaactacat gagtaacagt 60 t 61 <210> 1418 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1418 ctacaactac atgagtaaca gttcct 26 <210> 1419 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1419 gagccgcctg aggttggctc tgactgtacc accatccact acaactacat gcgtaacagt 60 t 61 <210> 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<400> 1448 atgtgtaaca gtttctgcat gggcgg 26 <210> 1449 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1449 gtgtaacagt tccagcatgg gcggca 26 <210> 1450 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1450 gtgtaacagt tcccgcatgg gcggca 26 <210> 1451 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1451 gtgtaacagt tccggcatgg gcggca 26 <210> 1452
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<223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1463 cagttcctgc atgtgcggca tgaacc 26 <210> 1464 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1464 agttcctgca tggacggcat gaaccg 26 <210> 1465 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1465 agttcctgca tggccggcat gaaccg 26 <210> 1466 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1466 agttcctgca tggtcggcat gaaccg 26 <210> 1467 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1467 ttcctgcatg ggcagcatga accgga 26 <210> 1468 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1468 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<223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1474 ctgcatgggc ggcctgaacc ggaggc 26 <210> 1475 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1475 tgcatgggcg gcaagaaccg gaggcc 26 <210> 1476 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1476 tgcatgggcg gcacgaaccg gaggcc 26 <210> 1477 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1477 tgcatgggcg gcaggaaccg gaggcc 26 <210> 1478 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1478 gcatgggcgg catcaaccgg aggccc 26 <210> 1479 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1479 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<212> DNA
<220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1568 ctggaagact ccaatggtaa tctact 26 <210> 1569 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1569 ctggaagact ccactggtaa tctact 26 <210> 1570 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1570 ctggaagact ccattggtaa tctact 26 <210> 1571 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1571 ggaagactcc agtagtaatc tactgg 26 <210> 1572 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1572 ggaagactcc agtcgtaatc tactgg 26 <210> 1573 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1573 ggaagactcc agttgtaatc tactgg 26 <210> 1574 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1574 gaagactcca gtgataatct actggg 26 <210> 1575 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1575 gaagactcca gtgctaatct actggg 26 <210> 1576 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1576 gaagactcca gtgttaatct actggg 26 <210> 1577 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1577 agactccagt ggtcatctac tgggac 26 <210> 1578 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1578 agactccagt ggtgatctac tgggac 26 <210> 1579 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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<212> DNA
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<212> DNA
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Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1648 gaggtgcgtg tttatgcctg tcctgg 26 <210> 1649 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1649 gaggtgcgtg tttttgcctg tcctgg 26 <210> 1650 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1650 aggtgcgtgt ttgggcctgt cctggg 26 <210> 1651 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1651 ggtgcgtgtt tgtacctgtc ctggga 26 <210> 1652 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1652 ggtgcgtgtt tgtccctgtc ctggga 26 <210> 1653 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1653 ggtgcgtgtt 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<223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1666 gtttgtgcct gtcatgggag agaccg 26 <210> 1667 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1667 gtttgtgcct gtcgtgggag agaccg 26 <210> 1668 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1668 gtttgtgcct gtcttgggag agaccg 26 <210> 1669 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1669 ttgtgcctgt cctaggagag accggc 26 <210> 1670 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1670 ttgtgcctgt ccttggagag accggc 26 <210> 1671 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1671 tgtgcctgtc ctgagagaga ccggcg 26 <210> 1672 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1672 tgtgcctgtc ctgcgagaga ccggcg 26 <210> 1673 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1673 tgtgcctgtc ctgtgagaga ccggcg 26 <210> 1674 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1674 tgcctgtcct gggggagacc ggcgca 26 <210> 1675 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1675 gcctgtcctg ggaaagaccg gcgcac 26 <210> 1676 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1676 gcctgtcctg ggacagaccg gcgcac 26 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1677 gcctgtcctg ggatagaccg gcgcac 26 <210> 1678 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1678 cctgtcctgg gagcgaccgg cgcaca 26 <210> 1679 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1679 ctgtcctggg agaaaccggc gcacag 26 <210> 1680 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1680 ctgtcctggg agacaccggc gcacag 26 <210> 1681 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1681 ctgtcctggg agataccggc gcacag 26 <210> 1682 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1682 tgtcctggga 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Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1706 gaccggcgca caggggaaga gaatct 26 <210> 1707 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1707 gaccggcgca cagtggaaga gaatct 26 <210> 1708 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1708 accggcgcac agacgaagag aatctc 26 <210> 1709 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1709 ccggcgcaca gagaaagaga atctcc 26 <210> 1710 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1710 ccggcgcaca gagcaagaga atctcc 26 <210> 1711 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1711 cggcgcacag 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1858 agcactgccc aactacacca gctcct 26 <210> 1859 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1859 gcactgccca acaccaccag ctcctc 26 <210> 1860 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1860 gcactgccca acagcaccag ctcctc 26 <210> 1861 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1861 gcactgccca acatcaccag ctcctc 26 <210> 1862 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1862 cactgcccaa caagaccagc tcctct 26 <210> 1863 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1863 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<223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1869 gcccaacaac accggctcct ctcccc 26 <210> 1870 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1870 gcccaacaac acctgctcct ctcccc 26 <210> 1871 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1871 cccaacaaca ccaactcctc tcccca 26 <210> 1872 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1872 cccaacaaca ccacctcctc tcccca 26 <210> 1873 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1873 cccaacaaca ccatctcctc tcccca 26 <210> 1874 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1874 caacaacacc agcacctctc cccagc 26 <210> 1875 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1875 caacaacacc agcccctctc cccagc 26 <210> 1876 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1876 caacaacacc agcgcctctc cccagc 26 <210> 1877 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1877 aacaacacca gctactctcc ccagcc 26 <210> 1878 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1878 aacaacacca gctgctctcc ccagcc 26 <210> 1879 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1879 aacaacacca gcttctctcc ccagcc 26 <210> 1880 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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<211> 26
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Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1920 cagccaaaga agataccact ggatg 25 <210> 1921 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1921 agccaaagaa gaacccactg gatgg 25 <210> 1922 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1922 gccaaagaag aaaacactgg atgga 25 <210> 1923 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1923 gccaaagaag aaagcactgg atggag 26 <210> 1924 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1924 gccaaagaag aaatcactgg atggag 26 <210> 1925 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1925 ccaaagaaga 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Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1931 aagaagaaac caccggatgg agaata 26 <210> 1932 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1932 aagaagaaac cacgggatgg agaata 26 <210> 1933 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1933 gaagaaacca ctgaatggag aatatt 26 <210> 1934 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1934 gaagaaacca ctgcatggag aatatt 26 <210> 1935 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1935 gaagaaacca ctgtatggag aatatt 26 <210> 1936 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1936 aagaaaccac 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Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1942 aaaccactgg atgcagaata tttcac 26 <210> 1943 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1943 aaaccactgg atgtagaata tttcac 26 <210> 1944 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1944 accactggat ggaaaatatt tcaccc 26 <210> 1945 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1945 accactggat ggacaatatt tcaccc 26 <210> 1946 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1946 ccactggatg gagcatattt caccct 26 <210> 1947 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1947 ccactggatg 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Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1953 ctggatggag aatctttcac ccttca 26 <210> 1954 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1954 ctggatggag aatgtttcac ccttca 26 <210> 1955 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1955 ctggatggag aatttttcac ccttca 26 <210> 1956 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1956 ggatggagaa tatatcaccc ttcaga 26 <210> 1957 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1957 ggatggagaa tatctcaccc ttcaga 26 <210> 1958 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1958 ggatggagaa 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Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1964 tggagaatat ttctcccttc agatcc 26 <210> 1965 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1965 ggagaatatt tcaaccttca gatccg 26 <210> 1966 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1966 ggagaatatt tcatccttca gatccg 26 <210> 1967 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1967 agaatatttc accattcaga tccgtg 26 <210> 1968 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1968 agaatatttc accgttcaga tccgtg 26 <210> 1969 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1969 agaatatttc 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Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1975 tatttcaccc ttccgatccg tgggcg 26 <210> 1976 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1976 tatttcaccc ttcggatccg tgggcg 26 <210> 1977 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1977 tatttcaccc ttctgatccg tgggcg 26 <210> 1978 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1978 atttcaccct tcacatccgt gggcgt 26 <210> 1979 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1979 tttcaccctt cagctccgtg ggcgtg 26 <210> 1980 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1980 tttcaccctt 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Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1986 cacccttcag atcagtgggc gtgagc 26 <210> 1987 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1987 cacccttcag atcggtgggc gtgagc 26 <210> 1988 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1988 cacccttcag atctgtgggc gtgagc 26 <210> 1989 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1989 acccttcaga tccatgggcg tgagcg 26 <210> 1990 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1990 acccttcaga tccctgggcg tgagcg 26 <210> 1991 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1991 acccttcaga 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Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1997 tcagatccgt gggagtgagc gcttcg 26 <210> 1998 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1998 tcagatccgt gggggtgagc gcttcg 26 <210> 1999 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 1999 tcagatccgt gggtgtgagc gcttcg 26 <210> 2000 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2000 cagatccgtg ggcatgagcg cttcga 26 <210> 2001 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2001 cagatccgtg ggcctgagcg cttcga 26 <210> 2002 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2002 cagatccgtg 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Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2008 tccgtgggcg tgaccgcttc gagatg 26 <210> 2009 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2009 ccgtgggcgt gagagcttcg agatgt 26 <210> 2010 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2010 ccgtgggcgt gagggcttcg agatgt 26 <210> 2011 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2011 ccgtgggcgt gagtgcttcg agatgt 26 <210> 2012 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2012 cgtgggcgtg agcacttcga gatgtt 26 <210> 2013 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2013 cgtgggcgtg 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Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2019 gggcgtgagc gctccgagat gttccg 26 <210> 2020 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2020 gggcgtgagc gctgcgagat gttccg 26 <210> 2021 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2021 gcgtgagcgc ttcaagatgt tccgag 26 <210> 2022 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2022 gcgtgagcgc ttccagatgt tccgag 26 <210> 2023 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2023 cgtgagcgct tcgcgatgtt ccgaga 26 <210> 2024 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2024 cgtgagcgct 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Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2030 gagcgcttcg agacgttccg agagct 26 <210> 2031 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2031 gagcgcttcg agaggttccg agagct 26 <210> 2032 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2032 agcgcttcga gatcttccga gagctg 26 <210> 2033 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2033 gcgcttcgag atgatccgag agctga 26 <210> 2034 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2034 gcgcttcgag atgctccgag agctga 26 <210> 2035 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2035 gcgcttcgag 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Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2041 ttcgagatgt tcccagagct gaatga 26 <210> 2042 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2042 ttcgagatgt tcctagagct gaatga 26 <210> 2043 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2043 cgagatgttc cgaaagctga atgagg 26 <210> 2044 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2044 cgagatgttc cgacagctga atgagg 26 <210> 2045 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2045 gagatgttcc gagcgctgaa tgaggc 26 <210> 2046 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2046 gagatgttcc gagggctgaa tgaggc 26 <210> 2047 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2047 gagatgttcc gagtgctgaa tgaggc 26 <210> 2048 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2048 agatgttccg agacctgaat gaggcc 26 <210> 2049 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2049 gatgttccga gagatgaatg aggcct 26 <210> 2050 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2050 gatgttccga gaggtgaatg aggcct 26 <210> 2051 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2051 atgttccgag agcagaatga ggcctt 26 <210> 2052 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2052 atgttccgag agccgaatga ggcctt 26 <210> 2053 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2053 atgttccgag agcggaatga ggcctt 26 <210> 2054 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2054 gttccgagag ctgcatgagg ccttgg 26 <210> 2055 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2055 gttccgagag ctggatgagg ccttgg 26 <210> 2056 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2056 gttccgagag ctgtatgagg ccttgg 26 <210> 2057 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2057 ttccgagagc tgactgaggc cttgga 26 <210> 2058 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2058 ttccgagagc tgagtgaggc cttgga 26 <210> 2059 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2059 ttccgagagc tgattgaggc cttgga 26 <210> 2060 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2060 tccgagagct gaaggaggcc ttggaa 26 <210> 2061 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2061 ccgagagctg aataaggcct tggaac 26 <210> 2062 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2062 ccgagagctg aatcaggcct tggaac 26 <210> 2063 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2063 cgagagctga atgcggcctt ggaact 26 <210> 2064 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2064 cgagagctga atggggcctt ggaact 26 <210> 2065 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2065 cgagagctga atgtggcctt ggaact 26 <210> 2066 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2066 gagagctgaa tgacgccttg gaactc 26 <210> 2067 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2067 agagctgaat gagaccttgg aactca 26 <210> 2068 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2068 agagctgaat gagcccttgg aactca 26 <210> 2069 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2069 agagctgaat gagtccttgg aactca 26 <210> 2070 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2070 gagctgaatg aggacttgga actcaa 26 <210> 2071 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2071 gagctgaatg agggcttgga actcaa 26 <210> 2072 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2072 gagctgaatg aggtcttgga actcaa 26 <210> 2073 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2073 gctgaatgag gccatggaac tcaagg 26 <210> 2074 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2074 gctgaatgag gccgtggaac tcaagg 26 <210> 2075 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2075 ctgaatgagg cctgggaact caagga 26 <210> 2076 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2076 ctgaatgagg cctcggaact caagga 26 <210> 2077 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2077 tgaatgaggc cttcgaactc aaggat 26 <210> 2078 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2078 gaatgaggcc ttgaaactca aggatg 26 <210> 2079 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2079 gaatgaggcc 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Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2085 tgaggccttg gaagtcaagg atgccc 26 <210> 2086 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2086 tgaggccttg gaattcaagg atgccc 26 <210> 2087 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2087 gaggccttgg aacacaagga tgccca 26 <210> 2088 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2088 gaggccttgg aacccaagga tgccca 26 <210> 2089 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2089 gaggccttgg aacgcaagga tgccca 26 <210> 2090 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2090 ggccttggaa 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of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2096 cttggaactc aagaatgccc aggct 25 <210> 2097 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2097 cttggaactc aagcatgccc aggct 25 <210> 2098 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2098 cttggaactc aagtatgccc aggct 25 <210> 2099 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2099 ttggaactca aggctgccca ggctg 25 <210> 2100 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2100 ttggaactca agggtgccca ggctg 25 <210> 2101 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2101 ttggaactca aggttgccca ggctg 25 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Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2107 gaactcaagg atggccaggc tggga 25 <210> 2108 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2108 gaactcaagg atgtccaggc tggga 25 <210> 2109 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2109 actcaaggat gccaaggctg ggaag 25 <210> 2110 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2110 actcaaggat gccgaggctg ggaag 25 <210> 2111 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2111 ctcaaggatg ccccggctgg gaagg 25 <210> 2112 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2112 ctcaaggatg cccgggctgg gaagg 25 <210> 2113 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Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2129 gcccaggctg ggagggagcc aggggg 26 <210> 2130 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2130 gcccaggctg ggatggagcc aggggg 26 <210> 2131 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2131 cccaggctgg gaacgagcca gggggg 26 <210> 2132 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2132 ccaggctggg aagaagccag ggggga 26 <210> 2133 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2133 ccaggctggg aagcagccag ggggga 26 <210> 2134 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2134 caggctggga aggcgccagg ggggag 26 <210> 2135 <211> 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Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2140 ggctgggaag gagtcagggg ggagca 26 <210> 2141 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2141 gctgggaagg agcaaggggg gagcag 26 <210> 2142 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2142 gctgggaagg agcgaggggg gagcag 26 <210> 2143 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2143 gctgggaagg agctaggggg gagcag 26 <210> 2144 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2144 tgggaaggag ccaaggggga gcaggg 26 <210> 2145 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2145 tgggaaggag ccatggggga gcaggg 26 <210> 2146 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2146 gggaaggagc cagaggggag cagggc 26 <210> 2147 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2147 gggaaggagc cagcggggag cagggc 26 <210> 2148 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2148 gggaaggagc cagtggggag cagggc 26 <210> 2149 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2149 gaaggagcca gggaggagca gggctc 26 <210> 2150 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2150 gaaggagcca gggtggagca gggctc 26 <210> 2151 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2151 aaggagccag gggagagcag ggctca 26 <210> 2152 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2152 aaggagccag gggcgagcag ggctca 26 <210> 2153 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2153 aaggagccag gggtgagcag ggctca 26 <210> 2154 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2154 ggagccaggg gggcgcaggg ctcact 26 <210> 2155 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2155 ggagccaggg gggggcaggg ctcact 26 <210> 2156 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2156 ggagccaggg gggtgcaggg ctcact 26 <210> 2157 <211> 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Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2239 caaaaagggt cagactacct cccgcc 26 <210> 2240 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2240 caaaaagggt cagcctacct cccgcc 26 <210> 2241 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2241 caaaaagggt caggctacct cccgcc 26 <210> 2242 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2242 aaaaagggtc agtatacctc ccgcca 26 <210> 2243 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2243 aaaaagggtc agtgtacctc ccgcca 26 <210> 2244 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2244 aaaaagggtc agtttacctc ccgcca 26 <210> 2245 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2245 aaagggtcag tctccctccc gccata 26 <210> 2246 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2246 aaagggtcag tctgcctccc gccata 26 <210> 2247 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2247 aaagggtcag tcttcctccc gccata 26 <210> 2248 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2248 aagggtcagt ctaactcccg ccataa 26 <210> 2249 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2249 aagggtcagt ctatctcccg ccataa 26 <210> 2250 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 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Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2327 aagacagaag ggcttgactc agactg 26 <210> 2328 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2328 gacagaaggg cctaactcag actgac 26 <210> 2329 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2329 gacagaaggg cctcactcag actgac 26 <210> 2330 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2330 gacagaaggg ccttactcag actgac 26 <210> 2331 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2331 acagaagggc ctgcctcaga ctgaca 26 <210> 2332 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2332 acagaagggc ctggctcaga ctgaca 26 <210> 2333 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2333 acagaagggc ctgtctcaga ctgaca 26 <210> 2334 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2334 cagaagggcc tgagtcagac tgacat 26 <210> 2335 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2335 agaagggcct gacacagact gacatt 26 <210> 2336 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2336 agaagggcct gacccagact gacatt 26 <210> 2337 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2337 agaagggcct gacgcagact gacatt 26 <210> 2338 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2338 gaagggcctg acttagactg acattc 26 <210> 2339 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2339 agggcctgac tcaaactgac attctc 26 <210> 2340 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2340 agggcctgac tcacactgac attctc 26 <210> 2341 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2341 agggcctgac tcatactgac attctc 26 <210> 2342 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2342 gggcctgact cagcctgaca ttctcc 26 <210> 2343 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2343 gggcctgact caggctgaca ttctcc 26 <210> 2344 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2344 gggcctgact cagtctgaca ttctcc 26 <210> 2345 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mutagenic oligonucleotide for PCR <400> 2345 ggcctgactc agagtgacat tctcca 26 <210> 2346 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 2346 cgggatccat ggaggagccg cagtca 26 <210> 2347 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 2347 gcgaagcttc agtctgagtc aggccctt 28 <210> 2348 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 2348 cgggacaaag caaatggaag 20 <210> 2349 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 2349 gtttcctcgt cattgttctc gttcc 25 <210> 2350 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 2350 atgctgagga ggggccagac catcg 25 <210> 2351 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 2351 gaaaccactg gatggagaat atttcacc 28 <210> 2352 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 2352 tcaactccaa gctgatcccc cctcg 25 <210> 2353 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 2353 ggaagagaat ctccgcaaga 20 <210> 2354 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 2354 cgctgctcag atagcgatgg t 21 <210> 2355 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 2355 cggctcatag ggcaccacca 20 <210> 2356 <211> 1182 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1182) <400> 2356 atg gag gag ccg cag tca gat cct agc gtc gag ccc cct ctg agt cag 48 Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln 1 5 10 15 gaa aca ttt tca gac cta tgg aaa cta ctt cct gaa aac aac gtt ctg 96 Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu 20 25 30 tcc ccc ttg ccg tcc caa gca atg gat gat ttg atg ctg tcc ccg gac 144 Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp 35 40 45 gat att gaa caa tgg ttc act gaa gac cca ggt cca gat gaa gct ccc 192 Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro 50 55 60 aga atg cca gag gct gct ccc ccc gtg gcc cct gca cca gca gct cct 240 Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Pro Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro 65 70 75 80 aca ccg gcg gcc cct gca cca gcc ccc tcc tgg ccc ctg tca tct tct 288 Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser 85 90 95 gtc cct tcc cag aaa acc tac cag ggc agc tac ggt ttc cgt ctg ggc 336 Val Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly 100 105 110 ttc ttg cat tct ggg aca gcc aag tct gtg act tgc acg tac tcc cct 384 Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro 115 120 125 gcc ctc aac aag atg ttt tgc caa ctg gcc aag acc tgc cct gtg cag 432 Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln 130 135 140 ctg tgg gtt gat tcc aca ccc ccg ccc ggc acc cgc gtc cgc gcc atg 480 Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met 145 150 155 160 gcc atc tac aag cag tca cag cac atg acg gag gtt gtg agg cgc tgc 528 Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys 165 170 175 ccc cac cat gag cgc tgc tca gat agc gat ggt ctg gcc cct cct cag 576 Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln 180 185 190 cat ctt atc cga gtg gaa gga aat ttg cgt gtg gag tat ttg gat gac 624 His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp 195 200 205 aga aac act ttt cga cat agt gtg gtg gtg ccc tat gag ccg cct gag 672 Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu 210 215 220 gtt ggc tct gac tgt acc acc atc cac tac aac tac atg tgt aac agt 720 Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser 225 230 235 240 tcc tgc atg ggc ggc atg aac cgg agg ccc atc ctc acc atc atc aca 768 Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr 245 250 255 ctg gaa gac tcc agt ggt aat cta ctg gga cgg aac agc ttt gag gtg 816 Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val 260 265 270 cgt gtt tgt gcc tgt cct ggg aga gac cgg cgc aca gag gaa gag aat 864 Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn 275 280 285 ctc cgc aag aaa ggg gag cct cac cac gag ctg ccc cca ggg agc act 912 Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr 290 295 300 aag cga gca ctg ccc aac aac acc agc tcc tct ccc cag cca aag aag 960 Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys 305 310 315 320 aaa cca ctg gat gga gaa tat ttc acc ctt cag atc cgt ggg cgt gag 1008 Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu 325 330 335 cgc ttc gag atg ttc cga gag ctg aat gag gcc ttg gaa ctc aag gat 1056 Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp 340 345 350 gcc cag gct ggg aag gag cca ggg ggg agc agg gct cac tcc agc cac 1104 Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His 355 360 365 ctg aag tcc aaa aag ggt cag tct acc tcc cgc cat aaa aaa ctc atg 1152 Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met 370 375 380 ttc aag aca gaa ggg cct gac tca gac tga 1182 Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp 385 390 <210> 2357 <211> 393 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2357 Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln 1 5 10 15 Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu 20 25 30 Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp 35 40 45 Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro 50 55 60 Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Pro Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro 65 70 75 80 Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser 85 90 95 Val Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly 100 105 110 Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro 115 120 125 Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln 130 135 140 Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met 145 150 155 160 Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys 165 170 175 Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln 180 185 190 His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp 195 200 205 Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu 210 215 220 Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser 225 230 235 240 Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr 245 250 255 Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val 260 265 270 Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn 275 280 285 Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr 290 295 300 Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys 305 310
315 320 Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr
Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu 325
330 335 Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn
Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp 340 345
350 Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly
Ser Arg Ala His Ser Ser His 355 360
365 Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr
Ser Arg His Lys Lys Leu Met 370 375
380 Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp
385 390
ドであるpLS76 の特徴的な構造部分並びに制限酵素XhoI
とEagI切断部位を示す。翻訳開始コドンATGから翻訳停
止コドンTGAまでの野生型p53 cDNAのORF を含み、その
5'側および3'側にプラスミドpLS76由来の配列を含むDNA
断片で、部位特異的変異導入のためのPCR反応に用いた
鋳型DNA配列を黒い太実線に示す。
型DNA 配列並びに各変異合成オリゴヌクレオチド及び共
通合成オリゴヌクレオチドとの間の配置関係を模式的に
示す。中央の黒太実線は、p53 cDNAの翻訳領域(ATGか
らTGAまで)と、その両端のプラスミドpLS76由来の配列
を示す。小さい黒矢印は変異合成オリゴヌクレオチドプ
レート名(各プレートはそれぞれ96種類の変異合成オリ
ゴヌクレオチドを含む) とそれらのp53 cDNA上でのおお
よその位置を示す。太い黒矢印は共通合成オリゴヌクレ
オチドを示す。
り得られた各PCR 産物及び共通合成オリゴヌクレオチド
との間の配置関係を模式的に示す。黒太実線は、p53 cD
NAの翻訳領域(ATGからTGAまで)と、その両端のプラス
ミドpLS76由来の配列を示す。細い点模様の線は、第1
回目のPCR 産物を示す。太い黒矢印は共通合成オリゴヌ
クレオチドを示す。
り得られた各PCR 産物との間の配置関係を模式的に示
す。黒太実線は、p53 cDNAの翻訳領域(ATGからTGAま
で)と、その両端のプラスミドpLS76由来の配列を示
す。細い点模様の線は、第2回目のPCR 産物を示す。
るギャップリペアベクターの特徴的な構造並びに制限酵
素切断部位の概略図を示す。ギャップリペアベクターと
して、プラスミドpSS16 、プラスミドp53Nco1及びプラ
スミドp53Stu1由来のものが示してある。
に使用するギャップリペアベクター(プラスミドpSS16
由来)との関係を模式的に示す。横向きの矢印はシーク
エンシングに使用した合成オリゴヌクレオチドの位置を
示す。点模様の太線は、変異導入されたDNA 配列部分を
示す。
に使用するギャップリペアベクター(プラスミドp53Nco
1由来)との関係を模式的に示す。横向きの矢印はシー
クエンシングに使用した合成オリゴヌクレオチドの位置
を示す。点模様の太線は、変異導入されたDNA 配列部分
を示す。
に使用するギャップリペアベクター(プラスミドp53Stu
1由来)との関係を模式的に示す。横向きの矢印はシー
クエンシングに使用した合成オリゴヌクレオチドの位置
を示す。点模様の太線は、変異導入されたDNA 配列部分
を示す。
Claims (16)
- 【請求項1】 網羅的変異p53 ライブラリーは、少なく
とも複数の変異p53 遺伝子ライブラリーから構成される
集合体で、 (A) 一つの変異p53 遺伝子ライブラリーは少なくとも一
つの変異p53 塩基配列を保持するものであり、 (1) 該一つの変異p53 塩基配列は、配列番号:2356の
野生型p53 塩基配列あるいはその遺伝子多型のうちの1
塩基について塩基置換の変異を含有するものであり且つ (2) 該野生型p53 塩基配列あるいはその遺伝子多型の
第2コドンから最終コドン(第393 コドン)までのもの
から選ばれたコドンの1塩基置換に基づいて生じうる1
アミノ酸変異を指定しているもので、 (B) 該網羅的変異p53 ライブラリーは、 次なる網羅的特徴: (i) (a) 配列番号:2357の野生型p53 アミノ酸配列あ
るいはその遺伝子多型の第2番目から第393 番目までの
各アミノ酸部位において、それぞれ1アミノ酸変異を有
するものを、当該第2番目から第393 番目までのアミノ
酸に関して、すべてのセットを含んでいるか、あるいは (b) 配列番号:2357の野生型p53 アミノ酸配列あるいは
その遺伝子多型の第2番目から第393 番目までの各アミ
ノ酸部位において、それぞれアミノ酸変異を指定する1
塩基置換を少なくとも有する変異p53 塩基配列を保持す
る一つの変異p53 遺伝子ライブラリーを、当該第2番目
から第393 番目までのアミノ酸に関して、すべてのセッ
トを含んでいる、 (ii) 配列番号:2356の野生型p53 塩基配列あるいは
その遺伝子多型のうちの第2コドンから最終コドン(第
393 コドン)までの各コドンに対応する各1アミノ酸変
異に対し、それぞれ少なくとも一つの対応する1塩基置
換を有する変異p53 塩基配列を保持する変異p53 遺伝子
ライブラリーのセットを含んでいる、及び (iii) 該アミノ酸変異は、野生型p53 アミノ酸配列あ
るいはその遺伝子多型の第2番目から第393 番目までの
各アミノ酸に関して当該対応するコドン毎の1塩基置換
で生ずる可能性のあるアミノ酸変異のすべての種類の変
異セットを含んでいる、 から成る群から選ばれたものの少なくとも一つを満足す
るか、あるいは 次なる構築基準: (iv) 1塩基置換によって生じうるすべての1アミノ
酸置換型変異(ミスセンス変異)を配列番号:2356の野
生型p53 塩基配列のうちの第2コドンから最終コドン
(第393 コドン)までの遺伝子翻訳領域に構築するよう
にする、 (v) 配列番号:2356の野生型p53 塩基配列のうちの第
2コドンから最終コドン(第393 コドン)までの遺伝子
翻訳領域において、塩基置換によって生ずる1アミノ酸
置換を重複なく、網羅するライブラリーとする、及び (vi) 塩基置換に関し、配列番号:2356の野生型p53
塩基配列のうちの第2コドンから最終コドン(第393 コ
ドン)までの遺伝子翻訳領域において、(1)野生型〔配
列番号:2357〕と異なるアミノ酸をコードする1塩基変
異である;(2)当該1アミノ酸置換に関して既にその報告
がなされている場合(既知の場合)で且つ該アミノ酸を
コードするコドンが複数存在する場合には、最も多くの
報告がなされているコドンを選択する; 及び(3) 当該1
アミノ酸置換に関して新規の場合(その報告が未だ一切
なされていない場合)で且つ該アミノ酸をコードするコ
ドンが複数存在する場合には、自然界において最も使用
頻度の高いコドンを選択するから成る群から選ばれたも
のの少なくとも一つを満足するものであることを特徴と
する網羅的変異p53 ライブラリー。 - 【請求項2】 野生型p53 の第2コドンから最終コドン
までの塩基配列に点変異を有するものである請求項1記
載の網羅的変異p53 ライブラリー。 - 【請求項3】 点変異を有するp53 塩基配列であって、
2314種類の変異p53 塩基配列からなる集合体であること
を特徴とする請求項1又は2記載の網羅的変異p53 ライ
ブラリー。 - 【請求項4】 該変異p53 ライブラリーが、〔一塩基変
異p53 クローン及び変異誘導用合成オリゴヌクレオチド
リスト〕中の変異酵母クローン名に示されたクローン中
に保持された変異p53 塩基配列であることを特徴とする
請求項1〜3のいずれか一記載の網羅的変異p53 ライブ
ラリー。 - 【請求項5】 (1) 配列番号:2356の野生型p53 塩基配
列の第2コドンから最終コドンまでのコドンの1塩基の
点変異を指定する変異合成オリゴヌクレオチドを用意
し、該変異合成オリゴヌクレオチドをプライマーとし、
該プライマーと共通オリゴヌクレオチドプライマーとを
組合わせて使用し且つ野生型p53 塩基配列を有する鋳型
核酸を使用してポリメラーゼ連鎖反応(polymerase chai
n reaction: PCR)を行って、第1回目のPCR 産物を製造
し、次に(2) 共通オリゴヌクレオチドプライマーと組合
わせて該第1回目のPCR 産物をプライマーとし野生型p5
3 塩基配列を有する鋳型核酸を使用してPCR を行い且つ
該第2回目のPCR を2段階の条件下に行って第2回目の
PCR 産物を製造し、(3) 該第2回目のPCR 産物をギャッ
プリペアベクターに組込んで、宿主細胞を形質転換し、
所望の変異p53 塩基配列を保有する形質転換体を選択す
ることを特徴とする網羅的変異p53 ライブラリーの製造
法。 - 【請求項6】 変異合成オリゴヌクレオチドが、塩基数
が少なくとも25〜29であり且つほぼその中心部位に1塩
基の点変異を指定するものであり、網羅的変異p53 ライ
ブラリーは、少なくとも複数の上記変異p53 遺伝子ライ
ブラリーから構成される集合体で、 次なる網羅的特徴: (i) (a) 配列番号:2357の野生型p53 アミノ酸配列あ
るいはその遺伝子多型の第2番目から第393 番目までの
各アミノ酸部位において、それぞれ1アミノ酸変異を有
するものを、当該第2番目から第393 番目までのアミノ
酸に関して、すべてのセットを含んでいるか、あるいは (b) 配列番号:2357の野生型p53 アミノ酸配列あるいは
その遺伝子多型の第2番目から第393 番目までの各アミ
ノ酸部位において、それぞれアミノ酸変異を指定する1
塩基置換を少なくとも有する変異p53 塩基配列を保持す
る一つの変異p53 遺伝子ライブラリーを、当該第2番目
から第393 番目までのアミノ酸に関して、すべてのセッ
トを含んでいる、 (ii) 配列番号:2356の野生型p53 塩基配列あるいは
その遺伝子多型のうちの第2コドンから最終コドン(第
393 コドン)までの各コドンに対応する各1アミノ酸変
異に対し、それぞれ少なくとも一つの対応する1塩基置
換を有する変異p53 塩基配列を保持する変異p53 遺伝子
ライブラリーのセットを含んでいる、及び (iii) 該アミノ酸変異は、野生型p53 アミノ酸配列あ
るいはその遺伝子多型の第2番目から第393 番目までの
各アミノ酸に関して当該対応するコドン毎の1塩基置換
で生ずる可能性のあるアミノ酸変異のすべての種類の変
異セットを含んでいる、 から成る群から選ばれたものの少なくとも一つを満足す
るか、あるいは 次なる構築基準: (iv) 1塩基置換によって生じうるすべての1アミノ
酸置換型変異(ミスセンス変異)を配列番号:2356の野
生型p53 塩基配列のうちの第2コドンから最終コドン
(第393 コドン)までの遺伝子翻訳領域に構築するよう
にする、 (v) 配列番号:2356の野生型p53 塩基配列のうちの第
2コドンから最終コドン(第393 コドン)までの遺伝子
翻訳領域において、塩基置換によって生ずる1アミノ酸
置換を重複なく、網羅するライブラリーとする、及び (vi) 塩基置換に関し、配列番号:2356の野生型p53
塩基配列のうちの第2コドンから最終コドン(第393 コ
ドン)までの遺伝子翻訳領域において、(1)野生型〔配
列番号:2357〕と異なるアミノ酸をコードする1塩基変
異である;(2)当該1アミノ酸置換に関して既にその報告
がなされている場合(既知の場合)で且つ該アミノ酸を
コードするコドンが複数存在する場合には、最も多くの
報告がなされているコドンを選択する; 及び(3) 当該1
アミノ酸置換に関して新規の場合(その報告が未だ一切
なされていない場合)で且つ該アミノ酸をコードするコ
ドンが複数存在する場合には、自然界において最も使用
頻度の高いコドンを選択するから成る群から選ばれたも
のの少なくとも一つを満足するものであることを特徴と
する請求項5記載の網羅的変異p53 ライブラリーの製造
法。 - 【請求項7】 網羅的変異p53 ライブラリーが、(1) 野
生型p53 の第2コドンから最終コドン(第393 コドン)
のそれぞれにおいて、1塩基置換に基づいて生じうる1
アミノ酸変異を指定している変異p53 塩基配列を有する
遺伝子ライブラリーからなり、(2) 該1塩基置換が、野
生型p53 の第2番目から第393 番目までのアミノ酸の中
に一つのアミノ酸変異を生ぜしめるものであり、且つ
(3) 該遺伝子ライブラリーは、 次なる網羅的特徴: 野生型p53 の第2コドンから最終コドンまで392個の
各コドンの、すべてのアミノ酸変異セットを有する集合
体であることを特徴とする請求項5又は6記載の網羅的
変異p53 ライブラリーの製造法。 - 【請求項8】 配列番号 1〜29, 31〜37, 39〜53, 56〜
93, 95〜132, 134〜152, 154〜170, 172〜181, 183〜19
7, 199〜203, 205〜221, 223〜237, 239〜245,247〜25
2, 255〜263, 265〜269, 271, 273 〜304, 306, 307, 3
09〜319, 321〜323, 325〜346, 348, 349, 351〜354, 3
57〜362, 364〜368, 370〜388, 390, 392, 393, 395, 3
97〜401, 404〜410, 412〜416, 418, 419, 421〜423, 4
25〜437,439〜443, 446, 448 〜461, 463〜468, 470〜4
74, 476〜480, 482〜484, 486,488 〜491, 494, 495, 4
97, 498, 500〜504, 506〜508, 510〜519, 521, 522, 5
24〜528, 530〜533, 535〜539, 541〜543, 545, 547, 5
48, 551 〜556, 558〜560, 562〜572, 574〜588, 590〜
595, 597〜606, 609, 611 〜613, 617〜629, 631〜633,
635, 636, 642, 645, 646, 651, 652, 654 〜657, 65
9, 662 〜668, 670〜674, 676, 677, 679, 681, 683〜6
90, 692〜699, 702〜707, 709, 711 〜717,721〜723, 7
25〜727, 729, 732, 739, 741, 743, 746, 747, 750, 7
51, 753, 758, 759, 764, 774, 783, 796, 797, 799, 8
02, 805, 807, 813, 818, 829, 830, 836 〜838, 849,
854, 855, 860, 863, 866, 868〜870, 872, 874, 876,
891,893, 894, 897, 898, 900, 929, 934, 935, 943, 9
52, 955, 958, 962, 967, 974, 986, 989, 995, 998, 1
032, 1033, 1043, 1044, 1054, 1056, 1066, 1068〜107
0, 1072, 1077, 1079〜1082, 1084, 1085, 1088, 1090,
1092, 1098, 1100,1102〜1104, 1107, 1108, 1118, 11
23〜1125, 1142, 1143, 1148, 1149, 1156,1160, 1162,
1168, 1170, 1171, 1173, 1175〜1178, 1181, 1190, 1
192, 1196,1203, 1207, 1209, 1211, 1215, 1220, 122
1, 1223, 1226, 1228, 1232, 1236,1239, 1243, 1249,
1252, 1254, 1256, 1257, 1259, 1264, 1266, 1269, 12
74,1279, 1306, 1309, 1316, 1318, 1321, 1324, 1333,
1334, 1336, 1339〜1341,1343, 1348, 1357, 1359, 13
61, 1363, 1366, 1368, 1373, 1376, 1382, 1383,1393,
1399, 1407, 1427, 1479, 1500, 1501, 1509, 1510, 1
511, 1515, 1535,1539, 1541, 1548, 1555, 1568〜157
0, 1572, 1575, 1579, 1580, 1582, 1583,1585, 1588,
1590, 1593, 1602, 1604, 1606, 1609, 1613, 1662, 16
72, 1673,1681, 1691, 1696, 1699, 1701, 1702, 1705,
1716, 1717, 1721, 1726, 1728,1729, 1733, 1734, 17
38, 1744, 1746, 1754, 1755, 1759, 1761〜1764, 176
6,1767, 1775, 1777, 1780〜1782, 1786, 1787, 1789,
1790, 1793, 1794, 1797,1800, 1803, 1804, 1807, 181
1, 1812, 1817, 1819〜1821, 1823, 1824, 1828,1829,
1831, 1833, 1835〜1837, 1839〜1844, 1846〜1851, 18
53〜1855, 1857〜1864, 1866, 1868, 1869, 1871〜188
3, 1887〜1893, 1895, 1897〜1902, 1905〜1912, 1914,
1916〜1918, 1920〜1925, 1928〜1931, 1933〜1938, 1
940, 1943〜1946, 1948〜1956, 1959〜1969, 1971〜197
7, 1979〜1992, 1994, 1995, 1997,1999, 2001〜2010,
2016〜2037, 2039, 2042〜2045, 2047〜2052, 2054〜20
70,2072〜2076, 2078〜2082, 2084〜2096, 2098〜2109,
2111, 2113〜2121, 2123,2125〜2131, 2133〜2147, 21
49〜2161, 2163〜2165, 2167〜2170, 2172, 2173,2175,
2177〜2258, 2260〜2293及び2295〜2345から成る群か
ら選ばれた変異合成オリゴヌクレオチドに対応する1塩
基置換の点変異を、配列番号:2356の野生型p53 塩基配
列のうちに有する変異p53 塩基配列であることを特徴と
する核酸。 - 【請求項9】 請求項8記載の核酸を含有することを特
徴とするプラスミド。 - 【請求項10】 請求項8記載の核酸又は請求項9記載
のプラスミドで形質転換されたことを特徴とする宿主細
胞。 - 【請求項11】 請求項10記載の形質転換体を培養
し、培養物からリコンビナントタンパク質を分離するこ
とを特徴とするタンパク質の製法。 - 【請求項12】 請求項8記載の核酸でコードされるア
ミノ酸配列を有し、請求項8記載の変異合成オリゴヌク
レオチドに対応するアミノ酸変異を有する変異p53 タン
パク質であることを特徴とするタンパク質。 - 【請求項13】 野生型p53 ライブラリー及び請求項1
〜4のいずれか一記載の網羅的変異p53 ライブラリーか
らなることを特徴とする網羅的p53 ライブラリー。 - 【請求項14】 (1) 請求項13記載の網羅的p53 ライ
ブラリーを構成する遺伝子群のうちの少なくとも45%以
上(集合体の少なくとも45%以上)のものから得られた
網羅的p53 プローブを基板に結合せしめてあるか、ある
いは(2) 請求項13記載の網羅的p53 ライブラリーを構
成する遺伝子群のうちの少なくとも45%以上のものから
得られた網羅的p53 核酸を参照配列として使用すること
を特徴とする網羅的p53 核酸アレイ。 - 【請求項15】 〔一塩基変異p53 クローン及び変異誘
導用合成オリゴヌクレオチドリスト〕中の変異酵母クロ
ーン名に示されたクローン中に保持された変異p53 塩基
配列を使用してp53 プローブを得、網羅的p53 プローブ
が基板上に結合せしめてあるか、あるいは〔一塩基変異
p53 クローン及び変異誘導用合成オリゴヌクレオチドリ
スト〕中の変異酵母クローン名に示されたクローン中に
保持された変異p53 塩基配列の核酸を網羅的に参照配列
として使用することを特徴とする請求項14記載の核酸
アレイ。 - 【請求項16】 野生型p53 塩基配列及び2314種類の1
塩基の点変異を持つ変異p53 塩基配列を有している請求
項14又は15記載の核酸アレイ。
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