KR20190035759A - 암의 발증 리스크의 유무를 판정하는 방법 - Google Patents

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Abstract

암의 발증 리스크를 예측하는 방법을 제공하는 것을 과제로 하고, 2480 명의 암 환자의 혈액 및 암 조직으로부터 DNA 시료를 조제하고, NGS 를 사용하여 엑손 부위의 염기 서열의 해석을 실시하고, 상기 암 환자 중 7 명이, 생식 세포 변이인 D49H 변이나 A159D 변이를 갖는 것을 확인하였다.

Description

암의 발증 리스크의 유무를 판정하는 방법
본 발명은, 암의 발증 리스크의 유무를 판정하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 피검자로부터 채취한 생체 시료 중의 인간 p53 의 코돈 159 에 있어서, 알라닌이 아스파르트산으로 치환되는 변이 (이하, 「A159D 변이」 라고 하는 경우가 있다) 및/또는 인간 p53 의 코돈 49 에 있어서, 아스파르트산이 히스티딘으로 치환되는 변이 (이하, 「D49H 변이」 라고 하는 경우가 있다) 의 유무를 검출하는 암의 발증 리스크의 유무를 판정하는 방법에 관한 것이다.
최근, 인간 전체 게놈 서열이 결정된 것에 수반하여, 개인 사이에서 상이한 3 백만개 이상의 1 염기 다형 (Single Nucleotide Polymorphism；SNP) 이 존재하는 것이 밝혀졌다. 이러한 SNP 에 관한 정보에 기초하여, 개인의 형질이나 질병 발증의 예측을 요구하는 요구가 높아지고 있고, 질환과 SNP 의 관련에 대한 해석이 진행되고 있다.
또, 복수의 PCR 프라이머 세트를 사용하여 광범위한 게놈 정보를 한번의 반응에 의해 판독하는 것을 가능하게 한 차세대 DNA 시퀸서 (Next Generation DNA Sequencer；NGS) 의 개발이 진행된 것에 의해, 전체 인구의 1 ％ 이상의 빈도로 관찰되는 SNP 보다 빈도가 낮은, 단일 염기 변이 (Single Nucleotide Variation；SNV) 도 다수 동정 (同定) 되고, 이러한 성과를 바탕으로 한 개별화 의료나 예방 의료의 실현을 향한 대처도 가속화되고 있다. 이 요구를 충족하기 위해서는, 프로모터 영역 등을 포함한 비번역 영역 중의 SNV 를 동정하는 전체 게놈 시퀸서가 이상적이라고 말할 수 있지만, 현재로는 비용적인 면에서 엑손 부위에 주목하여 해석을 실시하는 엑손 해석이 널리 실시되고 있다.
한편, 인간 p53 은, 원래 분자량 53000 의 의미를 갖는 단백질이며, 전체 길이 393 아미노산으로 이루어지고, N 말단으로부터, TAD1 및 TAD2 로 구성되는 전사 활성화 도메인 (Transactivation Domain：TAD), 프롤린 리치 도메인, DNA 결합 도메인 (DNA binding domain：DBD), 4 량체 형성 도메인, 그리고 조절 도메인의 5 개의 영역으로 구성되어 있다. DBD 는 DNA 결합에 관여하는 영역으로, 종양에 있어서 검출되는 유전자 변이의 대부분이 이 영역에 집중하고, TAD 에 있어서 확인되는 유전자 변이는 적다. 인간 p53 은 다채로운 활성에 의해 유전자의 이상으로부터 생체를 지키는 기능을 담당하고 있는 것으로 여겨지고, 주된 활성으로는, 유전자에 이상이 발생한 세포에 있어서의, 유전자 전사 제어를 통한 세포 주기 진행의 제어·유전자 수복 효소의 활성화·아포토시스 유도능 등을 들 수 있다. 인간 p53 유전자 자체에 돌연변이가 생기면, 이들 인간 p53 의 기능이 결손되고, 종양의 발생에 이른다고 하는 메커니즘이 생각되고 있다. 인간 암세포에 있어서의 인간 p53 유전자의 변이는, 대장·위·유선·폐·뇌·식도 등 많은 인간의 종양에 있어서 확인되고 있고, 변이한 인간 p53 의 이상한 축적이 많은 종양 조직에 있어서 관찰되고 있다.
또, 공지된 망라적 변이 인간 p53 라이브러리의 문헌에, A159D 변이 및 D49H 변이에 대한 기재는 있지만 (예를 들어, 특허문헌 1 참조), 이러한 변이와, 질병이나 특정한 형질에 대한 관련에 대해서는 알려져 있지 않다.
A159D 변이는, COSMIC (URL : http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic) 에 종양 조직 8 샘플 및 1 세포주에 있어서의 보고가 있고, 번호 COSM11496 로 등록되어 있다. IRAC 데이터베이스에도, 14 증례의 보고가 있지만, 모두 체세포 변이이다. 생식 세포 변이를 대상으로 한 쿄토 대학의 Human Genetic Variation Database, 토호쿠 메디컬·메가뱅크 기구의 Integrative Japanese Genome Variation Database, Exome Aggregation Consortium (URL : http://exac.broadinstitute.org) 데이터베이스, dbSNP 데이터베이스 (URL : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/) 및 Clinvar (URL : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/) 에는, A159D 변이의 등록은 없다. 또, p53 의 생식 세포 변이가 원인이 되는 리·프라우메니 (Li-Fraumeni) 증후군, 리·프라우메니형 (Li-Fraumeni like) 증후군, 가족성 종양 (Familial cancer) 에 있어서 A159D 변이의 보고는 존재하지 않는다.
D49H 변이에 대해서는, 또한, COSMIC (URL : http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic) 에 등록 번호 COSM11935 의 보고가 있고, IRAC 데이터베이스에 8 증례의 보고가 있지만, 모두 체세포 변이이다. 생식 세포 변이를 대상으로 한 쿄토 대학의 Human Genetic Variation Database 나 토호쿠 메디컬·메가뱅크 기구의 Integrative Japanese Genome Variation Database 에 D49H 변이에 대해서 보고는 없다. Exome Aggregation Consortium (URL : http://exac.broadinstitute.org) 데이터베이스에는, 알레르 빈도로서 0.000008261 의 보고가 있지만, p53 의 생식 세포 변이가 원인이 되는 리·프라우메니 (Li-Fraumeni) 증후군, 리·프라우메니형 (Li-Fraumeni like) 증후군, 가족성 종양 (Familial cancer) 에 있어서 D49H 변이의 보고는 존재하지 않는다. dbSNP 데이터베이스 (URL : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/) 에 등록 번호 rs587780728 로서 D49H 변이의 보고가 있지만, Exome Aggregation Consortium 의 알레르 빈도를 인용하고 있다.
또, p53 은 상동 재조합 관련 단백질과 직접 결합함으로써 물리적으로 그것들 단백질의 기능을 저해하고, 상동 재조합의 진행을 억제함으로써 미수복의 DNA 의 잘못된 복제를 방지하는 기능을 가지고 있다. p53 의 D49H 변이는, p53 단백질이 상동 재조합 관련 단백질의 하나인 RPA (replication protein A) 단백질과 결합하는 데 필수인 48 번째 및 49 번째의 연속하는 아스파르트산 잔기에 위치하고 있다. 이, 양 아미노산 잔기에, D48H/D49H 의 양 변이를 동시에 도입한 p53 을 발현시킨 세포에서는, p53 과 RPA 간의 결합이 형성되지 않기 때문에, RPA 가 기능하는 것이 가능해지고, 결과적으로 상동 재조합이 비제어 상태로 항진하는 것이 보고되어 있다 (비특허문헌 1).
단, 당해 문헌은, D48H/D49H 의 양 변이를 동시에 도입한 p53 에서의 검토이며, 48 번째 및 49 번째 각각의 아미노산 잔기 단독으로의 검토는 실시되어 있지 않다. 또, D48H/D49H 변이형 p53 의 RPA 와의 결합능 및 상동 재조합능에 대한 영향은 검토하고 있기는 하지만, 암의 발생이나 암의 진전과의 관련에 대한 검토 결과, 및 그 변이를 갖는 증례의 임상상의 정보는 나타나 있지 않다. 어디까지나, D48H/D49H 변이를 도입한 것은, 그 부위의 기능 평가라고 하는 관점에 기초한 것이다.
일본 공개특허공보 2003-265187호
Oncogene (2004) 23, 9025-9033
본 발명의 과제는 암의 발증 리스크를 예측하는 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은, 1685 명의 암 환자의 혈액 및 암 조직으로부터 DNA 시료를 조제하고, NGS 를 사용하여 엑손 부위의 염기 서열의 해석을 실시한 바, 상기 암 환자 중 6 명이, 정상적인 일본인에서는 지금까지 전혀 알려져 있지 않았던, TAD2 상에 위치하는 D49H 변이를 갖는 것을 알아내었다. 또, 그 D49H 변이를 갖는 6 명 중 1 예에서, DBD 상에 위치하는 A159D 변이를 알아내었다. 그리고 또, 이러한 변이는 모두 생식 세포 변이인 것을 확인하였다. 본 발명자들은, 새로운 데이터 해석을 계속해서, 추가로 조사한 795 명의 암 환자 중 1 명이 D49H 변이를 갖는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
상기 서술한 바와 같이, p53 의 D49H 변이는 매우 드문 정상인의 생식 세포 계열의 SNV 로서 보고되어 있지만, 암의 가족력을 갖는 암 환자 (가족성 암을 의심하는 환자) 에서는 보고되어 있지 않다. 이번, 암의 가족력을 갖는 암 환자 7 예에서 p53 의 D49H 변이를 찾아내었다. p53 변이에 의한 가족성 암에 있어서 TAD 의 생식 세포 계열 변이는 매우 드물다. D49H 변이는, 가족력이나 임상적 정보로부터, 리·프라우메니 증후군을 비롯한 암 발생의 요인이 될 가능성이 생각되었다. 또한, p53 의 A159D 변이도, 종양에 있어서 p53 의 기능을 실활시키는 변이가 다수 보고되어 있는 DBD 에 위치하기 때문에, 마찬가지로 리·프라우메니 증후군을 비롯한 암 발생의 요인이 될 가능성이 생각된다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
(1) 피검자로부터 채취한 생체 시료 중의, 인간 p53 의 코돈 159 에 있어서 알라닌이 아스파르트산으로 치환되는 변이 및/또는 인간 p53 의 코돈 49 에 있어서 아스파르트산이 히스티딘으로 치환되는 변이의 유무를 검출하는 것을 특징으로 하는 암의 발증 리스크의 유무를 판정하는 방법.
(2) 알라닌이 아스파르트산으로 치환되는 변이가, 알라닌을 코드하는 염기 서열 「GCC」 가 아스파르트산을 코드하는 염기 서열 「GAC」 로 치환되는 변이인 것을 특징으로 하는 상기 (1) 기재의 방법.
(3) 아스파르트산이 히스티딘으로 치환되는 변이가, 아스파르트산을 코드하는 염기 서열 「GAT」 가 히스티딘을 코드하는 염기 서열 「CAT」 로 치환되는 변이인 것을 특징으로 하는 상기 (1) 기재의 방법.
(4) 알라닌이 아스파르트산으로 치환되는 변이가 생식 세포 변이인 것을 특징으로 하는 상기 (1) 또는 (2) 기재의 방법.
(5) 아스파르트산이 히스티딘으로 치환되는 변이가 생식 세포 변이인 것을 특징으로 하는 상기 (1) 또는 (3) 기재의 방법.
(6) 차세대 DNA 시퀸서를 사용하여 변이의 유무를 검출하는 것을 특징으로 하는 상기 (1) ∼ (5) 중 어느 하나 기재의 방법.
(7) 생어법을 이용하여 변이의 유무를 검출하는 것을 특징으로 하는 상기 (1) ∼ (5) 중 어느 하나 기재의 방법.
본 발명에 의하면, 피검자로부터 채취한 생체 시료 중의 A159D 변이 및/또는 D49H 변이의 유무에 기초하여, 암의 발증 리스크의 유무를 판정할 수 있다. 특히, 암의 발증 리스크가 있다고 판정된 경우에는 그 결과에 기초하여, 환경이나 생활 습관의 개선 등, 암 예방을 위한 조치를 취할 수 있고, 또, 정기적인 건강진단 등에 의해 암의 발증을 조기에 확인할 수 있다. 또한, 혈연자에게 리·프라우메니 증후군 등 유전성의 위중한 암 관련 질환의 발증자가 있는 경우, 정상인이더라도, 장래 이러한 질병을 발병하거나 가능성이 있을지에 대한 발증 전 진단이 가능해진다.
도 1 은, D49H 변이를 갖는 암 환자 6 명의 엑손 서열에 있어서의 변이의 존재를 Integrative Genomics Viewer (IGV) 에 의해 가시화한 도면을 나타낸다.
도 2 는, D49H 변이를 갖는 암 환자 6 명의 생어법에 의한 인간 p53 유전자의 서열 결정 (일부) 을 나타내는 도면이다.
도 3 은, 루시페라아제 어세이에 사용한 퀴아젠사 Cignal p53 Reporter(luc) Kit (CCS-004L) 의, p53 transcriptional response element (TRE) 의 6 회 탠덤-TATA box-반딧불이 루시페라아제 (Fire fly Luc) 의 구성의 모식도이다.
도 4 는, 각 p53 변이의 루시페라아제 어세이의 결과를 나타내는 도면이다.
도 5 는, 각 p53 변이의 면역 화학 조직 염색의 결과를 나타내는 도면이다.
도 6 은, p53 각 변이의 이뮤노 블로팅의 결과를 나타내는 도면이다.
도 7 은, (a) 각 플라스미드 도입주의 19 일간 배양 후의 콜로니 형성 상태를 나타내는 도면이다. (b) 각 플라스미드 도입주의 19 일간 배양 후의 G418 내성의 콜로니 형성수를 나타내는 그래프이다.
본 발명의 암의 발증 리스크의 유무를 판정하는 방법으로는, 피검자로부터 채취된 생체 시료 중의 A159D 및/또는 D49H 변이의 유무를 검출하는 방법이면 특별히 제한되지 않고, 생어법 등의 종래 공지된 서열 결정 방법을 들 수 있지만, 1 회의 서열 결정 처리에 의해 다수의 피검자에 대해서 단시간에 판정할 수 있다는 점에서, NGS 를 사용하여 염기 서열 결정을 실시하는 방법을 적합하게 들 수 있다.
상기 인간 p53 유전자의 염기 서열로는, 인간 p53 유전자로부터 전사된 성숙 mRNA 의 전체서열, 예를 들어, Ensembl Transcript ID：ENST00000269305 에 등록되어 있는, 「개시 코돈 「aug」」 부터, 「종지 코돈 「uga」」 으로 이루어지는 1182 염기로 이루어지는 염기 서열을 DNA 서열로 나타낸 서열 (서열 번호 1) 을 변이가 없는 야생형의 p53 유전자의 DNA 의 염기 서열로서 나타낼 수 있다. 변이가 없는 야생형의 인간 p53 의 아미노산 서열로는, 서열 번호 2 에 나타내는 393 개의 아미노산으로 이루어지는 아미노산 서열을 나타낼 수 있다.
본 발명에 있어서의 암으로는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 악성 흑색종 (멜라노마), 피부암, 폐암, 기관 및 기관지암, 구강 상피암, 식도암, 위암, 결장암, 직장암, 대장암, 간장암, 간세포암, 간내 담관암, 신장암, 췌장암, 위암, 전립선암, 유방암, 자궁암, 난소암, 맹장선암, 설편평상피암, 뇌종양, 골육종 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 피검자로는, 암 환자여도 되고 비암 환자여도 된다.
본 발명에 있어서, 암의 발증 리스크의 유무를 판정하는 행위로는, D49H 변이를 갖는 경우에 피검자가 이미 암을 발증하고 있거나, 혹은 암의 발증 리스크가 높은 취지, 또는, D49H 변이를 갖지 않는 경우에 D49H 변이에서 기인하는 암의 발증 리스크가 낮은 취지, 를 판정하는 행위를 들 수 있다. D49H 변이로는, 서열 번호 1 에 나타내는 야생형의 인간 p53 유전자에 있어서, 아스파르트산을 코드하는 145 ∼ 147 번째의 염기 「GAT」 가, 히스티딘을 코드하는 「CAT」 또는 「CAC」 로 치환되는 변이를 들 수 있지만, 「CAT」 로 치환되는 변이를 적합하게 들 수 있다.
상기 암의 발증 리스크의 유무를 판정하는 행위로는, A159D 변이를 갖는 경우에 피검자가 이미 암을 발증하고 있거나, 혹은 암의 발증 리스크가 높은 취지, 또는, A159D 변이를 갖지 않는 경우에 A159D 변이에서 기인하는 암의 발증 리스크가 낮은 취지, 를 판정하는 행위를 또한 들 수 있다. A159D 변이로는, 서열 번호 1 에 나타내는 야생형의 인간 p53 유전자에 있어서, 알라닌을 코드하는 475 ∼ 477 번째의 염기 「GCC」 가, 아스파르트산을 코드하는 「GAC」 또는 「GAT」 로 치환되는 변이를 들 수 있지만, 「GAC」 로 치환되는 변이를 적합하게 들 수 있다.
본 발명의 암의 발증 리스크의 유무를 판정하는 방법에는, 이러한 판정을 위한 데이터를 수집하는 행위는 포함되지만, 의사에 의한 진단 행위는 제외된다. 그리고 또, 본 발명의 암의 발증 리스크의 유무를 판정하는 방법에 의한 결과와,다른 검사 결과를 아울러 종합적인 판정을 실시할 수도 있다.
본 발명에 있어서의 피검자로부터 채취된 생체 시료로는, 피검자에 있어서의 D49H 변이의 유무를 검출할 수 있는 시료이면 특별히 제한되지 않고, 일반적으로 핵산 채취에 사용되는 임의의 생물학적 시료를 들 수 있지만, 혈액, 혈장, 혈청, 골수액, 정액, 복강액, 뇨, 흉수, 심낭액, 타액 등의 체액이나, 체모, 장기 등의 조직이나, 암 조직 및 암 조직 용해물을 들 수 있다.
상기 혈액 시료로는, 진단시에 특히 유용한 체액으로서, 혈액을 원심 분리했을 때에 적혈구층과 혈장의 사이에 생기는, 백혈구와 혈소판의 층인 버피 코트를 적합하게 들 수 있으며, 이러한 버피 코트는, 피검자로부터 채취된 혈액을 채혈관에 넣어 원심 분리 후, 적혈구층과 혈장 사이의 층만을 회수함으로써 조제할 수 있다.
상기 암 조직 용해물로는, 피검자의 암 조직을 적출·재단 후, 프로테아제 K 로 대표되는 세린펩티다아제 등의 단백질 분해 효소에 의해 암 조직을 용해 처리 후에, 원심 분리하여 상청을 회수함으로써 조제할 수 있다.
A159D 변이 및/또는 D49H 변이의 유무를 확인하는 대상으로는, 인간 p53 유전자를 적합하게 들 수 있고, 이러한 유전자로는, 게놈 DNA, mRNA 등을 들 수 있지만, RNA 는 DNA 와 비교하여 안정성이 낮기 때문에, 게놈 DNA 를 특히 적합하게 대상으로 할 수 있다.
상기 게놈 DNA 를 조제하는 방법으로는, 상기의 생체 시료로부터, 페놀이나 클로로포름을 사용한 방법 등의 종래 공지된 방법에 의해 추출하는 방법을 들 수 있으며, 또, 바람직하게는, DNeasy Blood ＆ Tissue Kit, QIAamp DNA Blood Midi Kit (모두 Qiagen 사 제조) 등 시판되는 키트를 사용하여 NGS 에 적합한 고순도 DNA 를 조제할 수도 있다.
상기 NGS 를 사용하여 서열 결정을 하는 방법은, 전례가 없는 속도로 폴리뉴클레오티드를 서열 결정하는 능력을 갖는 기술에 기초하는 방법이며, 복수의 프라이머 세트를 사용하여 게놈의 광범위한 범위를 1 회의 시퀀스로 읽음으로써, 수 백만 내지 수 억의 DNA 단편에 대하여 대량 병렬로 처리하는 능력을 갖는다. 서열 결정의 메커니즘으로는, 기종 (시스템) 마다 개별 원리가 사용되고 있고, 예를 들어, 광학 검출을 사용한 Illumina 사의 시스템이나, 단일 분자 서열 결정 시스템을 취하는 Helicos True Single Molecule Sequencing (tSMS) 시스템 (예를 들어, Harris T.D. 들, Science 320 : 106-109 [2008년] 참조) 이나, 투과 전자 현미경법 (TEM) 을 이용하는 Halcyon Molecular 의 시스템이나, 뉴클레오티드가 DNA 사슬에 삽입될 때에, 이온이 방출할 수 있다는 특성을 이용하여 서열 결정을 실시하는 라이프 테크놀로지사의 이온 반도체 시퀸서를 사용하는 시스템에 있어서의 각 메커니즘을 적합하게 들 수 있다. 본 발명에 있어서의 NGS 로는, 1 회의 PCR 반응으로 약 294000 쌍의 프라이머 세트를 사용하여 방대한 수의 타겟 영역을 효율적으로 증폭시킬 수 있는, 이온 반도체 시퀸서를 선택하였다.
상기 NGS 를 사용하여 서열 결정을 하는 경우, 상기 DNA 시료는, 대량 병렬 서열 결정을 균일하게 실시하기 위해서 적합한, 단편화된 다양한 길이를 갖는 DNA 단편의 혼합물인 DNA 라이브러리로서 조제될 필요가 있고, 각 DNA 단편은, 염기 서열을 해석하는 편의를 위해서, 형광 마커나 비즈 등의 부가나, 검체 식별을 위한 어댑터의 라이게이션 등의 처리가 이루어지는 경우도 있다.
상기 DNA 라이브러리의 조제 방법으로는, 종래 공지된 방법을 들 수 있지만, NGS 에 의해 서열 결정을 실시하는 경우에는, 각 NGS 의 기종에 적합한 DNA 라이브러리 제작 키트를 사용하는 것이 바람직하고, 예를 들어, 라이프 테크놀로지사의 NGS 시스템을 사용하는 경우에는, Ion plus fragment library kit, Ion PGMTM Sequencing 400 Kit, Ion AmpliSeqTM Library Kit 2.0, Ion PGMTM Template OT2 400 Kit 등；Illumina 사의 NGS 시스템을 사용하는 경우에는, GENSeq DNA Library Prep Kit 등；을 사용하는 방법을 들 수 있다. 상기 키트를 사용하는 경우에는, 첨부 매뉴얼에 따라서 DNA 라이브러리를 조제할 수 있다.
상기 조제된 DNA 라이브러리는, Qubit (등록상표) 어세이 키트 등의 어세이 키트를 사용하여 정량함으로써, 정량 DNA 라이브러리로서 조제할 수도 있다.
상기 정량 DNA 라이브러리는, 서열 결정 전의 전처리에 제공하는 것이 바람직하고, 서열 해석 전의 전처리로는, 예를 들어, 서열 결정용 칩의 제조를 들 수 있다. 이러한 서열 결정용 칩의 제조로는, 상기 라이브러리를 칩 상에 세트하고, 이어서 서열 결정에 필요한 시약 키트와 템플릿액 등을 세트하여 칩을 서열 결정용 칩의 제조 기기에 세팅 후, 런 조건을 설정함으로써, 자동으로 칩 로딩을 실시하는 처리를 들 수 있으며, 서열 결정용 칩의 제조 기기로는, Ion ChefTM 시스템 (라이프 테크놀로지사 제조) 을 들 수 있다.
상기 서열 결정용의 전처리가 된 DNA 라이브러리는, NGS, 예를 들어, 상기 이온 반도체 시퀸서 기술을 사용하는 시스템에 의해 자동 서열 결정 처리가 실시되지만, 이러한 시스템에 있어서는, 뉴클레오티드가 폴리머라아제에 의해 DNA 의 사슬에 삽입되는 경우, 수소 이온이 부산물로서 방출되는 성질을 이용하여, 이온 센서를 갖는 고밀도 어레이를 사용하여, 반도체 기술을 단순한 서열 결정 화학과 조합하여, 코드된 정보 (A, C, G, T) 를 디지털 정보 (0, 1) 에 반도체 칩 상에서 화학적으로 직접 번역한다는 생화학적 순서가 대규모 평행 방법에 의해 실시된다. 예를 들어 어느 특정한 뉴클레오티드가, DNA 의 사슬에 삽입되는 경우, 수소 이온이 방출되고, 이온으로부터의 전하는, 용액의 pH 를 변화시키므로, 솔리드 스테이트 pH 미터를 구비하는 시퀸서는, 염기를 읽어내어, 화학적 정보로부터 디지털 정보로 바꿈으로써 서열이 결정될 수 있다. 결정될 수 있는 염기 서열로는, 전체 게놈 서열이나, 전체 엑손 서열을 들 수 있지만, 시간적인 효율의 점에서 전체 엑손 서열이 바람직하다. 이러한 시스템을 실행하는 기종으로는, Ion PGMTM 시스템이나 Ion ProtonTM 시스템을 예시할 수 있다.
그 외, MiSeq 시스템 (일루미나사 제조), HiSeq 시스템 (일루미나사 제조), Genome Analyzer IIx (일루미나사 제조), Genome Sequencer-FLX (로슈사 제조) 등을 사용하여 NGS 를 실시하는 것도 가능하고, 이들의 조작은, 첨부 매뉴얼에 따라서 실시할 수 있다.
상기 NGS 에 의한 처리에 의해, 생 (生) 데이터로서 얻어진 염기 서열 데이터는, 1 차 해석 (Base calling) 에 있어서 구체적인 염기 정보로 변환되고, 대량의 염기 서열 단편의 데이터를 얻을 수 있다. 2 차 해석에 있어서, 이러한 대량의 염기 서열 단편의 데이터를 사용하여, 표준 게놈 서열에 대한 매핑, 및, PCR 로 생긴 중복 서열의 제거, 어댑터의 제거, 5' 말단이나 3' 말단의 제거, 퀄리티가 낮은 서열이 연속하는 지점의 제거 등의 퀄러티 트리밍이 실시됨으로써, 전체 길이 서열 데이터로 변환된다. 이들 해석은, 통상적으로 사용되는 NGS 에 부속되는 소프트웨어를 사용하여 실시할 수 있다.
상기 2 차 해석에 이어지는, 3 차 해석에 있어서는, NGS 의 출력 데이터를 고속으로 해석함으로써 개개인의 유전적 특성이나 SNP, SNV, 돌연변이 등이 특정된다. 또한, 결정된 서열 데이터를 사용하여 혈액 유래 DNA 시료와 암 유래 DNA 시료의 서열 비교 해석을 실시함으로써, 변이가 생식 세포 변이인지 체세포 변이인지를 구별할 수도 있다. 혈액 유래 DNA 시료에 변이가 있는 경우에는, 생식 세포 변이이고, 암 유래 DNA 시료에 변이가 있고 혈액 유래 DNA 시료에 변이가 없는 경우에는, 체세포 변이라고 판정할 수 있다.
상기 서열 결정은, 또한 패널 해석을 조합하여 실시할 수도 있다. 본 발명에 있어서의 패널 해석으로는, 암 유전자나 암 관련 유전자 등의 특정한 게놈 영역을 증폭하고, 서열 결정을 함으로써, SNV 와 같은 저빈도인 변이도 고감도로 검출할 수 있다. 구체적으로는, 암 유전자 및 암 억제 유전자를 타겟으로 설계된 207 개 지점의 프라이머 페어가, 1 튜브의 프라이머 풀로 제공되고, 2790 개 지점의 변이를 망라적으로 탐색하는 데에 적합한 Ion AmpliSeqTM Hotspot Panel (라이프 테크놀로지사 제조) 이나, 암 유전자 및 암 억제 유전자를 타겟으로 설계된, 약 16000 개 지점의 프라이머 페어가, 4 튜브의 프라이머 풀로 제공되고, 409 종의 암 관련 유전자에 대한 검체간 비교가 가능한 Ion AmpliSeqTM Comprehensive Cancer Panel (라이프 테크놀로지사 제조) 에 의한 해석을 예시할 수 있다.
그 외, 인간 p53 의 코돈 159 부위 및/또는 코돈 49 부위의 1 염기 치환 (점 돌연변이) 을 검출할 수 있는 방법을 단독으로 또는 병용함으로써, 피검자로부터 채취한 생체 시료 중의 인간 p53 의 A159D 변이 및/또는 D49H 변이의 유무를 검출할 수 있고, 예를 들어, 디데옥시뉴클레오티드를 사용하여 DNA 폴리머라아제의 합성을 염기 특이적으로 정지시키는 생어법이나, DNA 의 신장 반응에 수반하여 피롤린산이 방출되는 것을 이용한 파이로 시퀀스법 등을 들 수 있다.
인간 p53 의 코돈 49 부위의 변이를 검출하기 위해서 사용되는 프라이머는, 인간 p53 유전자의 서열 정보에 기초하여 적절히 설계하고, 적당한 올리고 뉴클레오티드 합성 장치를 사용하여 적절히 제조할 수 있다. 예를 들어, 상기 생어법의 프라이머로는, 포워드 프라이머：GCTGCCCTGGTAGGTTTTCT (서열 번호 3) 를 들 수 있으며, 이러한 프라이머는, 상기의 인간 p53 유전자의 코돈 49 부위를 포함하는 서열을 결정하기 위한 프라이머로서 기능할 수 있는 한, 그 서열에 있어서 1 또는 2 이상의 치환, 결실, 부가를 포함하고 있어도 된다.
마찬가지로, 인간 p53 의 코돈 159 부위의 변이를 검출하기 위해서 사용되는 프라이머로는, 포워드 프라이머：GTGAGGAATCAGAGGCCTGG (서열 번호 6) 를 들 수 있으며, 이러한 프라이머는, 상기의 인간 p53 유전자의 코돈 159 부위를 포함하는 서열을 결정하기 위한 프라이머로서 기능할 수 있는 한, 그 서열에 있어서 1 또는 2 이상의 치환, 결실, 부가를 포함하고 있어도 된다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하는데, 본 발명의 기술적 범위는 이들 예시에 한정되는 것은 아니다.
실시예
[실시예 1]
[전체 엑손 해석]
(혈액 유래 DNA 시료의 조제)
1685 명의 암 환자에 대해, 각 환자의 혈액을 3 개의 채혈관 (베노젝트 II 진공 채혈관 (멸균품), 테루모사 제조, EDTA-2Na) 에 채취하고, 냉각 원심기 (AX-320, TOMY 사 제조) 로, 4 ℃ 에서 10 분간 원심하였다. 스포이드를 사용하여, 3 개의 채혈관으로부터 버피 코트 부분을 15 ㎖ 원심 튜브 1 개에 모으고, 각 환자의 버피 코트액으로 하였다.
상기 각 환자의 버피 코트액으로부터, QIAamp DNA Blood Midi Kit＃51185 (QIAGEN 사 제조) 를 사용하여 DNA 를 추출하고, 추출한 DNA 용액을 Qubit (등록상표) 어세이 키트를 사용하여 정량하고, 1685 명의 암 환자에 대해, 각각 100 pM 의 혈액 유래 DNA 시료를 조제하였다.
(암 조직 유래 DNA 시료의 조제)
상기 1685 명의 동일한 암 환자로부터 수술로 적출한 암 조직을 시료로서 사용하였다. 환자마다 암 조직 약 100 ㎎ 을 세단 (細斷) 하고, 세단된 암 조직을 용해하기 위해서, 프로테아제 K 를 첨가하고 54 ℃ 에서 6 시간 교반한 후, 냉각 원심기 (AX-320, TOMY 사 제조) 로, 4 ℃ 에서 10 분간 원심하였다. 상청 약 15 ㎖ 를 원심 튜브 1 개에 넣어, 암 조직 용해액으로 하였다.
상기 암 조직 용해액으로부터, QIAamp DNA Blood Midi Kit＃51185 를 사용하여 DNA 를 추출하고, 추출한 DNA 용액을 Qubit (등록상표) 어세이 키트를 사용하여 정량하고, 1685 명의 암 환자에 대해, 각각 100 pM 의 암 조직 유래 DNA 시료를 조제하였다.
(DNA 라이브러리의 조제)
상기 100 pM 의 혈액 유래 DNA 시료 및 100 pM 의 암 조직 유래 DNA 시료에 대해, 각각 10 ∼ 100 ng 의 DNA 로부터 Ion AmpliSeqTM Library 키트 2.0 (서모피셔사 제조) 을 사용하여, (1) 타겟 영역의 증폭, (2) 프라이머 서열의 제거, (3) 검체를 식별하기 위한 바코드 어댑터의 라이게이션, (4) 정제를 실시하고, 계속해서, 서멀 사이클러로 증폭하고, 이어서 정제를 실시함으로써, 혈액 유래 DNA 라이브러리 및 암 조직 유래 DNA 라이브러리를 얻었다.
상기 혈액 유래 DNA 라이브러리 및 암 조직 유래 DNA 라이브러리를 Ion Library Quantitation 키트 (서모피셔사 제조) 를 사용하여, Q-PCR 법으로 정량하고, 동일 환자의 혈액 DNA 유래 라이브러리와, 암 조직 DNA 유래 라이브러리를 등량 아울러, 50 pM 이 되도록 희석하였다. 희석한 라이브러리, 25 ㎕ 를, 반응 시약 키트인 IonPI Hi-QChef kit 를 사용하고, 자동 전처리 장치 IonChef (서모피셔사 제조) 에 세트하고, 템플릿액이 로드된 순서용 칩을 얻었다. IonProton (서모피셔사 제조) 에 칩을 장착하고, IonPI Hi-Q Sequencing 200 kit (서모피셔사 제조) 를 사용하여, 엑손 서열 결정을 실시하였다.
(데이터 해석)
상기 서열 결정 처리에 의해 출력된 생 데이터에 대해, Torrent Suite software ver.4.4 (서모피셔사 제조) 를 사용하여 base-calling, 퀄러티 트리밍, 인간의 참조 서열인 UCSC hg19 에 대한 매핑을 실시하였다. p53 유전자의 11 개 모든 엑손을 커버하는 14 앰플리콘이 증폭된 후, Torrent Variant Caller software (서모피셔사 제조) 를 사용하여 UCSC hg19 서열과 상이한 변이의 추출을 실시하였다. 또한, 동일 환자의 「암 조직 유래 DNA 에 있어서의 UCSC hg19 서열과 상이한 변이」 로부터 「혈액 유래 DNA 에 있어서의 UCSC hg19 서열과 상이한 변이」 를 공제한 체세포 특이적 변이를 얻기 위해서 Ion Reporter ver.4.4 software (서모피셔사 제조) 를 사용하였다. 이상의 방법으로, 1685 명의 암 환자에 대해 혈액 유래 DNA 의 변이 데이터, 암 조직 유래 DNA 의 변이 데이터, 및 체세포 특이적 변이 데이터를 얻었다.
(p53 유전자 변이)
암 환자의 생식 세포 계열에 있어서의 특이적 변이를 찾아내기 위해서, 1685 명, 한사람 한사람의 혈액 유래 DNA 의 데이터를, 먼저, 세계의 인간 게놈 서열의 표준으로 되어 있는 University of California, Santa Cruz (UCSC) 게놈 브라우저 (hg19 판) [Kent WJ, Sugnet CW, Furey TS, Roskin KM, Pringle TH, Zahler AM and Haussler D (2002) The human genome browser at UCSC. Genome Res 12, 996-1006 (URL : https://genome.ucsc.edu/)] 와 비교하여, 이번 대상 환자로 확인되는 p53 유전자의 생식 세포 계열 유전자 다형 또는 변이이고, 또한 아미노산 서열의 변화를 가져오는 비동기 치환 10 종을 추출하였다. 이들의 다형 또는 변이에는, 병적 의의를 갖지 않는 유전자 다형, p53 이상에서 유래하는 유전성 암의 원인이 되는 이미 알려진 또는 미지의 병적 변이가 포함되어 있다. 그래서, 이들 10 종을 이하의 공공 데이터베이스와 비교하여 이미 알려진 또는 미지의 생식 세포 계열 병적 변이인지의 여부를 추측하였다. 사용한 공공 데이터베이스는 다음과 같다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
이 결과, 먼저 10 종류 중 3 종류는 유전자 다형으로서 보고되어 있거나, 이미 리·프라우메니 증후군 관련의 유전성 암 원인 유전자 변이로서 보고되어 있었기 때문에 이번 발명에서는 제외하였다. 또한, 상기, 공공 데이터베이스 (4) IARC TP53 database 에는 시험관 내 실험에 기초하는 변이 단백의 기능이 기재되어 있으므로, 나머지 7 종류 중, 기능 이상이 확인되는 3 종, D49H, Q144R, A159D 의 변이에 주목하며, 생어법 등으로 변이의 존재를 확정하였다. 게다가, D49H 변이는 1685 예 중 6 예 (0.36 ％) 에서 확인되고 있는 것, 모든 증례가 암의 가족력을 갖는 것, 중 1 예는 리·프라우메니형 증후군인 것 등의 정보로부터 원인 유전자일 가능성이 높은 것으로 판단하였다. 또, A159D 변이는, 동시에 D49H 변이가 존재하고, 리·프라우메니형 증후군을 나타낸 증례에 확인되었기 때문에 병적 의의를 갖는 것으로 생각하였다.
또한, D49H 변이는, 상기 공공 데이터베이스 중, (2) COSMIC, (4) IARC TP53 database 에 생식 세포 계열은 아닌, 암에서 처음으로 발생한 체세포 변이 증례가 8 예 보고되어 있고, 이 지견으로부터도 세포암화에 대한 관여가 추측된다.
또, 어느 유전자에 있어서, 다형이나 변이가 병적 의의를 갖는지 여부의 판단에는, 정상인에 있어서 비교적, 고빈도로 확인되는 유전자 다형 (1 ％ 이상) 에서는 병적 의의를 가질 가능성이 낮은 것, 한편, 1 ％ 미만인 변이이고, 또한 매우 희소한 것이거나, 나아가서는, 암에 고율로 확인되는 변이인 경우에는 병적 의의를 가질 가능성이 높은 것이 유용한 지표가 된다. D49H 변이는, 이번 성적에 의해, 암 환자에서 0.36 ％ 라는 고빈도로 확인되고, 그 모든 것이 암의 가족력을 갖고, 또한, 생식 세포 계열 변이를 대상으로 한 상기 공공 데이터베이스 중 일본인을 대상으로 한 (5) iJGVD, (6) HGVD 에 있어서는 보고가 없고 (0.1 ％ 이하), 유일하게, 상기 공공 데이터베이스 (7) ExAC 에 있어서, 알레르 빈도로서 0.0008 ％ 로 매우 출현 빈도가 낮고, 또한, 질환과의 관련은 나타나 있지 않은 보고가 있을 뿐이다.
차세대 DNA 시퀀싱용 가시화 소프트웨어 (Integrative Genomics Viewer) (J. T. Robinson, H. Thorvaldsdottir, W. Winckler et al., Integrative genomics viewer, Nat. Biotechnol. 29 (2011) 24-26) 를 사용하여, 6 명의 변이의 존재를 가시화하였다. 결과를 Integrative Genomics Viewer (IGV) 로서 도 1 에 나타낸다. 6 명 모두 p53 의 D49H 변이가 확인되었다.
이 혈액 유래 DNA 의 데이터에서 얻어진 D49H 변이의 존재를 암 조직 유래 DNA 의 변이 데이터로 확인한 바, 1685 명 중, 6 명에 있어서 존재하였다.
(패널 해석)
또한 확인으로서, 암 조직 유래 DNA 에 대해서, 인간 암 관련 409 유전자의 코딩 영역을 타겟 영역으로 하여, 대상으로 하는 유전자 상의 변이를 망라적으로 해석하기 위해서, 패널 해석을 실시하였다.
10 ng 의 암 조직 DNA 로부터 Ion AmpliSeqTM Library Kit 2.0 및 Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel (모두 서모피셔사 제조) 을 사용하여, 인간 암 관련 409 유전자의 코딩 영역을 타겟 영역으로 하여, 대상 유전자 상의 변이를 망라적으로 해석하였다. 타겟 영역의 증폭, 프라이머 서열을 제거, 검체를 식별하기 위한 바코드 어댑터를 라이게이션 후, 서멀 사이클러로 증폭하여 정제를 실시하고, 암 조직 유래 DNA 라이브러리를 얻었다.
상기 암 조직 유래 DNA 라이브러리를 Ion Library Quantitation Kit (서모피셔사 제조) 를 사용하여, Q-PCR 법으로 정량하고, 100 pM 이 되도록 희석하였다. 희석한 라이브러리, 8 ㎕ 를 반응 시약 키트인 Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit (서모피셔사 제조) 를 사용하여, 자동 전처리 장치 IonChef (서모피셔사 제조) 에 세트하고, 템플릿액이 로드된 시퀀스용 칩을 얻었다. IonProton (서모피셔사 제조) 에 이러한 칩을 장착하고, IonPI Hi-Q Sequencing 200 Kit (서모피셔사 제조) 를 사용하여, 서열 결정을 실시하였다.
(데이터 해석)
상기 서열 결정 처리에 의해 얻어진 출력된 생 데이터에 대해, Torrent Suite softwarever. 4.4 (서모피셔사 제조) 를 사용하여 base-calling, 및 퀄러티 트리밍, 및 인간의 참조 서열인 Comprehensive Cancer Panel 의 409 의 표적으로 하는 암 관련 유전자의 참조 서열에 대한 매핑을 실시하고, 변이의 추출을 실시하였다.
상기 409 의 표적으로 하는 암 관련 유전자를 이하에 나타낸다.
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
(결과)
패널 해석의 결과, 동일한 상기 6 명의 암 환자에게 D49H 변이가 있는 것을 확인하였다.
상기 6 명의 상세를 이하의 표 1 에 기재한다. 6 명의 암의 종류는 각각 골육종 (Osteosarcoma), 유방암 (Breast carcinoma), 설편평상피암 (Squamous cell carcinoma of the tongue), 맹장선암 (Adenocarcinoma of the cecum), 간세포암 (Hepatocellular carcinoma), 위암 (Gastric carcinoma) 이었다. D49H 의 변이는 모두 헤테로형이었다. 또, 이들 6 명은, 모두 가족력을 갖는 암 환자였다. 또, 환자 번호 1 의 12 세의 골육종의 소년은, p53 유전자에 있어서 D49H 변이 뿐만 아니라, 코돈 159 에 있어서도 알라닌으로부터 아스파르트산으로 치환된 변이 (A159D) 를 가지고 있었다. 또한, 표 1 에 나타내는 6 명 외에, 추가로 해석한 795 명의 암 환자 중 1 명이 D49H 변이를 갖는 것을 또한 확인하였다.
지금까지 p53 의 생식 세포 변이가 원인이 되는 리·프라우메니 증후군, 리·프라우메니형 증후군, 가족성 종양에 있어서, 변이의 장소는, DBD 에 집중하고 있고, D49H 변이의 보고는 존재하지 않는다. 또, p53 의 생식 세포 변이가 원인이 되는 리·프라우메니 증후군, 리·프라우메니형 증후군, 가족성 종양에 있어서 A159D 에 대한 보고는 없다.
Figure pct00007
(생어법)
생어법에 의해, 서열 결정을 실시하고, D49H 변이를 확인하였다. 사용한 프라이머 서열은, 이하와 같다.
포워드 프라이머：GCTGCCCTGGTAGGTTTTCT (서열 번호 3)
리버스 프라이머：GTGGATCCATTGGAAGGGCA (서열 번호 4)
PCR 의 반응액은 이하와 같다.
PCR 반응액 (Reaction mixture) 최종 농도
HotStarTaq 마스터 믹스, 2× 12.5 ㎕
포워드 프라이머 (10 μM) 0.5 ㎕ 0.2 μM
리버스 프라이머 (10 μM) 0.5 ㎕ 0.2 μM
무 RNase 워터 (RNase-free water) 10.5 ㎕
템플릿 DNA (50 ng/㎕) 1.0 ㎕
총용량 25.0 ㎕
서멀 사이클러의 조건은 이하와 같다.
초기 PCR 활성 스텝 15 분 95 ℃
3-step cycling (3-스텝 사이클링) :
변성 (Denaturation) 1 분 94 ℃
어닐링 (Annealing) 1 분 60 ℃
신장 (Extension) 1 분 72 ℃
사이클 수 (Number of cycles) 35 사이클
최종 신장 (Final extension) 10 분 72 ℃
얻어진 앰플리콘 (증폭 산물) 의 서열 해석은, 다카라 바이오사에 위탁하였다. 사용한 생어 시퀀싱용의 프라이머는, 포워드 프라이머 : GCTGCCCTGGTAGGTTTTCT (서열 번호 3) 를 사용하였다. 그 결과, 6 예 모두 코돈 49 의 위치에 있어서 gat 로부터 Cat 로의 변이가 확인되었다.
앰플리콘의 서열은, 표 1 에 나타내는 환자 번호 1 ∼ 6 의 6 명 중 어느 것에 있어서도 서열 번호 5 에 나타내는 서열이었다. 또한, 이상의 결과는, 추가로 특정된 D49H 의 변이를 갖는 환자 1 명에 대해서도 동일하게 적용할 수 있는 것이었다.
Figure pct00008
환자 번호 1 에서 검출한 A159D 에 대해서 서열 결정을 실시하였다. 사용한 프라이머 서열은, 이하와 같다.
포워드 프라이머：GTGAGGAATCAGAGGCCTGG (서열 번호 6)
리버스 프라이머：GCACACCTATAGTCCCAGCC (서열 번호 7)
PCR 의 반응액은 이하와 같다.
PCR 반응액 (Reaction mixture) 최종 농도
HotStarTaq 마스터 믹스, 2× 12.5 ㎕
포워드 프라이머 (10 μM) 0.5 ㎕ 0.2 μM
리버스 프라이머 (10 μM) 0.5 ㎕ 0.2 μM
무 RNase 워터 10.5 ㎕
템플릿 DNA (50 ng/㎕) 1.0 ㎕
총용량 25.0㎕
서멀 사이클러의 조건은 이하와 같다.
초기 PCR 활성 스텝 15 분 95 ℃
3-스텝 사이클링 :
변성 1 분 94 ℃
어닐링 1 분 60 ℃
신장 1 분 72 ℃
사이클 수 35 사이클
최종 신장 10 분 72 ℃
얻어진 앰플리콘 (증폭 산물) 의 서열 해석은, 다카라 바이오사에 위탁하였다. 사용한 생어 시퀀싱용의 프라이머는, 포워드 프라이머 : GTGAGGAATCAGAGGCCTGG (서열 번호 6) 를 사용하였다. 그 결과, 이하의 서열 번호 8 에 나타내는 바와 같이, gcc 로부터 gAc 로의 변이가 검출되었다. 이것은 코돈 159 의 위치에 있어서의 알라닌으로부터 아스파르트산으로의 치환에 상당한다.
Figure pct00009
[실시예 2]
[p53 변이형 유전자에 있어서의 전사 활성]
(p53 변이형 유전자 발현 플라스미드의 제조)
D49H 및 A159D 의 변이가 p53 의 전사 활성에 어떠한 영향을 각각 주는지에 대해서, p53 을 결실한 p53 null 의 골육종 세포주인 Saos-2 세포주를 사용하여 리포터 어세이를 실시함으로써 검토를 실시하였다. 이하에 나타내는 6 종류의 변이형 p53 을 배양 세포에 있어서 발현 가능한 플라스미드를 제조하고 검토에 사용하였다. 각 플라스미드는, 1182 염기로 이루어지는 야생형 p53 서열을 포함하고, 인간 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 의존적으로 야생형 p53 을 발현 가능한, EX-B0105-M02 플라스미드 (Genecopoeia 사 제조) 를 템플릿에, PrimeSTAR (등록상표) Mutagenesis Basal 키트 (다카라 바이오 주식회사 제조) 를 사용하여, 이하의 표 2 에 나타내는 프라이머와 PCR 반응을 실시함으로써 제조하였다. 그리고 PCR 반응 산물을, 형질 전환 수용성의 대장균 E. coliHST08 Premium Competent Cells (다카라 바이오 주식회사 제조) 에 도입하고, 암피실린 함유 LB 한천 배지에 있어서 대장균 콜로니를 단리함으로써 클론화하였다. 각 클론을 암피실린 함유 LB 배지에 있어서 배양하고 회수 후, QIAprep Spin Miniprep Kit (주식회사 퀴아젠 제조) 를 사용하여 플라스미드를 추출하고, 그 플라스미드를 사용하여 생어법에 의한 목적 변이의 도입의 확인을 실시하였다.
Figure pct00010
PCR 의 반응액은 이하와 같다.
PrimeSTAR Max Premix, 2×：5.0 ㎕
포워드 프라이머 (5 pmol/㎕)：0.5 ㎕
리버스 프라이머 (5 pmol/㎕)：0.5 ㎕
DNase-free water：4.0 ㎕
EX-B0105-M02 플라스미드 (20 pg/㎕)：1.0 ㎕
총용량：11.0 ㎕
서멀 사이클러의 조건은 이하와 같다.
98 ℃ 20 초
98 ℃ 10 초*
55 ℃ 20 초*
72 ℃ 2 분*
*40 사이클
72 ℃ 2 분
플라스미드의 서열 해석은, 유로핀제노믹스 주식회사에 위탁하였다. 사용한 생어 시퀀싱용의 프라이머는, pEZ-M02-SeqF：CAGCCTCCGGACTCTAGC (서열 번호 21), pEZ-M02-SeqR：TAATACGACTCACTATAGGG (서열 번호 22), 및, TP53-SR3：GAGGAGCTGGTGTTGTTG (서열 번호 23) 를 사용하였다.
(p53 변이형 유전자)
이번 검토에 사용한 6 종류의 p53 변이형 유전자는 이하와 같다. D49H 및 A159D 이외의 4 종류의 변이는 실험의 컨트롤로서 사용하였다.
1) D49H：야생형의 인간 p53 유전자의 TAD2 에 존재하는 변이로서, 서열 번호 1 에 나타내는 서열에 있어서, 아스파르트산을 코드하는 145 ∼ 147 번째의 염기 「GAT」 가 히스티딘을 코드하는 「CAT」 로 치환된 변이이다.
2) A159D：야생형의 인간 p53 유전자의 DBD 에 존재하는 변이로서, 서열 번호 1 에 나타내는 서열에 있어서, 알라닌을 코드하는 475 ∼ 477 번째의 염기 「GCC」 가 아스파르트산을 코드하는 「GAC」 로 치환된 변이이다.
3) S46A：야생형의 인간 p53 유전자의 TAD2 에 존재하는 변이로서, 서열 번호 1 에 나타내는 서열에 있어서, 세린을 코드하는 136 ∼ 138 번째의 염기 「TCC」 가 알라닌을 코드하는 「GCC」 로 치환된 변이이다. 이 부위의 인산화는, 아포토시스 유도에 있어서 중요하다.
4) P47S：야생형의 인간 p53 유전자의 TAD2 에 존재하는 변이로서, 서열 번호 1 에 나타내는 서열에 있어서, 프롤린을 코드하는 139 ∼ 141 번째의 염기 「CCG」 가 세린을 코드하는 「TCG」 로 치환된 변이이다. 활성화 p53 은 시스틴/글루타민산 교환 수송체 (xCT) 의 발현을 억제함으로써, 세포 내의 산화 스트레스에 대한 감수성이 높아지고, 산화 스트레스 존재하에 있어서의 세포사가 유도 (페로토시스) 되는 것이 알려져 있지만, P47S 는, p53 의 페로토시스 유도능만을 저하시키는 것이 알려져 있다.
5) D49A：야생형의 인간 p53 유전자의 TAD2 에 존재하는 변이로서, 서열 번호 1 에 나타내는 서열에 있어서, 아스파르트산을 코드하는 145 ∼ 147 번째의 염기 「GAT」 가 알라닌을 코드하는 「GCT」 로 치환된 변이이다. 이러한 변이는, p53 과 결합하는 REB 결합 단백질 (REB binding protein) 과의 NCBD 도메인과의 상호 작용에 영향을 주는 변이이다.
6) R175H：야생형의 인간 p53 유전자의 DBD 에 존재하는 변이로서, 서열 번호 1 에 나타내는 서열에 있어서, 아르기닌을 코드하는 523 ∼ 525 번째의 염기 「CGC」 가 히스티딘을 코드하는 「CAC」 로 치환된 변이이다. 이러한 변이는, 종양에 있어서, 매우 높은 빈도로 검출되는 DBD 에 존재하는 변이이다.
(p53 변이형 유전자에 있어서의 전사 활성 측정을 목적으로 한 리포터 어세이를 위한 트랜스펙션)
본 실험에서는, 실험 음성 컨트롤 플라스미드 pReceiver-M02CT (p53 서열을 포함하지 않는 빈 플라스미드, Genecopoeia 사 제조), 야생형 p53 발현 플라스미드 (EX-B0105-M02 플라스미드) 및, 제조한 6 종류의 변이형 p53 발현 플라스미드의, 합계 8 종류의 유전자 발현용 플라스미드를 사용하였다. 상기 각 유전자 발현 플라스미드 500 ng 과, 2.5 ㎕ 의 p53 reporter mix (p53 TRE-TATA box-반딧불이 루시페라아제 플라스미드 및 야광버섯 루시페라아제를 포함하는, 주식회사 퀴아젠 제조) 의 플라스미드 혼합 용액, 및 2.5 ㎕ 의 negative control mix (p53TRE 서열을 포함하지 않는 빈 반딧불이 루시페라아제 리포터 플라스미드 및 야광버섯 루시페라아제를 포함하는, 주식회사 퀴아젠 제조) 의 플라스미드 혼합 용액의, 2 종류의 플라스미드 혼합 용액을 상기 8 종류의 각 유전자 발현 플라스미드에 대해 준비하였다. 합계 16 종류의 플라스미드 혼합 용액 각각에, 1.5 ㎕ 의 P3000 용액 (서모피셔 사이언티픽 주식회사 제조) 을 첨가하고, Opti-MEM 배지 (서모피셔 사이언티픽 주식회사 제조) 를 첨가함으로써 합계 25 ㎕ 로 맞춘 후에, 30 분간 실온에서 정치 (靜置) 하였다. 각 플라스미드 혼합 용액에 대해 1.5 ㎕ 의 Lipofectamine3000 용액 (서모피셔 사이언티픽 주식회사 제조) 과, 23.5 ㎕ 의 Opti-MEM 배지를 혼합한 Lipofectamine 혼합 용액을 준비하고, 상기 각 플라스미드 혼합 용액에 첨가하고 천천히 혼합한 후에, 10 분간 실온에서 정치하고 트랜스펙션 용액으로 하였다. 이 전체량 50 ㎕ 의 각 트랜스펙션 용액을, 24 웰 플레이트 (코닝) 상에서 10 ％ (v/v) 열 불활성화한 소태아 혈청을 포함하는 로즈웰파크 기념 연구소 배지 1640 (RPMI1640, 서모피셔 사이언티픽 주식회사) 을 사용하여 24 시간 배양한 Saos-2 세포의 1 웰에 대하여 적하함으로써 트랜스펙션 처리를 실시하였다. 이 트랜스펙션에 사용한 세포는, 전날에 8 × 104 개의 Saos-2 세포를, 0.5 ㎖ 의 10 ％ (v/v) 열 불활성화한 소태아 혈청 함유 RPMI1640 배지에 현탁한 세포 현탁액을, 24 웰 플레이트의 각 웰에 분주함으로써 준비하였다.
(세포 배양)
상기 리포펙션 처리 후 24 시간 배양하고, 트랜스펙션 용액의 제거를 위해 배지 교환을 실시하였다. 추가로 24 시간 배양하고, 배양 후의 각 세포를, 세포에 있어서의 2 종류의 루시페라아제 활성을, 안정적인 발광 시그널로서 정량할 수 있는, 듀얼-글로 루시페라아제·리포터 시스템 (Dual-Glo Luciferase Reporter System) (Progema 사 제조) 을 사용하는 리포터 어세이용의 세포 시료로서 사용하였다.
(루시페라아제 어세이)
배지 제거 후, 각 웰에 100 ㎕ 의 Reporter Lysis Buffer (Promega 사 제조) 를 첨가하고, 동결·융해를 3 회 반복함으로써 세포를 용해하였다. 세포 용해액 80 ㎕ 를 96 웰 PCR 플레이트 (닛폰 제네틱스 주식회사 제조) 로 옮기고, 460 g 으로 2 분간 원심함으로써 세포 용해에 수반하여 생긴 잔류물을 침전시켰다. 상청 50 ㎕ 를 화학 발광 측정용의 96 웰 플레이트 (코닝사 제조) 로 옮기고, 거기에 50 ㎕ 의 Dual-Glo Luciferase reagent (Promega 사 제조) 를 첨가하고, 쉐이커를 사용하여 15 분간 실온에서 교반한 후에, GLOMAX multi detection system (Promega 사 제조) 을 사용하여 반딧불이 루시페라아제의 발광치를 측정하였다. 다음으로, 50 ㎕ 의 Dual-Glo Stop ＆ Glo Reaget (Promega 사 제조) 를 첨가하고, 쉐이커를 사용하여 15 분간 실온에서 교반함으로써, 반딧불이 루시페라아제의 소광과 야광버섯 루시페라아제의 발광 반응을 실시하고, GLOMAX multi detection system 으로 그 발광치를 측정하였다. 결과를 도 4 에 나타낸다. 또한, 도 4 의 Y 축 (Luc/RLuc) 은, 각 플라스미드 도입 Saos-2 세포의 존재하에서 얻어지는, 반딧불이 루시페라아제 활성 (Luc) 에 대해, 야광버섯 루시페라아제 (RLuc) 에 의한 결과를 데이터의 내부 표준 컨트롤치로서 나누고, 표준화 한 형광치를 전사 활성으로서 나타내었다.
(결과)
도 4 로부터 분명한 바와 같이, D49H 변이형 p53 의 전사 활성은, 야생형 p53 의 전사 활성과 비교하여, 약 45 ％ 낮았다. 한편, A159D 변이형 p53 의 전사 활성은, 거의 검출되지 않았다.
또한, 악성 종양에 있어서 매우 높은 빈도로 검출되는 p53 에 있어서의 R175H 의 변이는, p53 의 입체 구조의 안정성에 영향을 줌으로써, 완전하게 p53 의 기능을 실활시키는 것이 알려져 있다 (Oncogene (2007) 26, 2226-2242 등). 이러한 R175H 변이를 도입한 Saos-2 세포주에 있어서는, 그 전사 활성이 완전히 소실하는 것이 나타났다. 상기 A159D 변이형 p53 에 있어서도, R175H 변이형 p53 에 있어서의 전사 활성의 저하와 동일한 정도의, 현저한 전사 활성의 저하가 보였다.
S46A 변이형 p53 에 있어서는, 그 전사 활성은, 야생형 p53 과 비교하여, 약 20 ％ 저하되었다. P47S 변이형 p53 에 있어서는, 그 전사 활성은, 야생형 p53 과 비교하여, 약 12 ％ 저하되었다. D49A 변이형 p53 에 있어서는, 그 전사 활성은, 야생형 p53 과 비교하여, 약 20 ％ 저하되어 있고, D49H 이외의 TAD2 의 변이를 갖는 세포에 있어서는 약간의 전사 활성의 저하가 확인되었다.
또한, 이 실시예 2 의 각 변이가 p53 의 전사 활성에 주는 영향에 대한 검토는, Saos-2 세포와 동일한 p53 null 세포주인 폐암의 유래의 NIH-H1299 세포를 사용하여 동일한 실험 방법으로 실시하였다. A159D 변이형 p53 에 있어서는, 그 전사 활성의 소실이 관찰되었다. D49H 변이형 p53 에서는, 야생형 p53 에 비해 약 40 ％ 의 전사 활성의 저하가 관찰되었다. 양 p53 null 세포주를 사용한 전사 활성 측정에 있어서, D49H 변이형 p53 및 A159D 변이형 p53 은 일치한 결과를 나타내었다 (데이터 나타내지 않음).
[실시예 3]
[핵 이행에 대한 검토]
상기, D49H 변이형 p53 및 A159D 변이형 p53 에 있어서의 전사 활성의 저하가, 핵 이행 빈도의 저하에서 기인하는 것인지의 여부에 대해서 확인하기 위해서, p53 null 인 Saos-2 세포주에 있어서 A159D 변이형 p53, D49H 변이형 p53 및 야생형 p53 을 일과성 발현시키고, 각각의 p53 단백의 세포 내의 국재를 면역 화학 조직 염색에 의해 검토를 검토하였다. 플라스미드 pReceiver-M02CT 를 음성 컨트롤로서 사용하였다.
4 웰의 Nunc Lab-Tek Chamber Slide System (서모피셔 사이언티픽 주식회사 제조) 의 각 웰에, 8 × 104 개의 Saos-2 세포를, 0.5 ㎖ 의 10 ％ (v/v) 열 불활성화한 소태아 혈청 함유 RPMI1640 배지에 현탁한 세포 현탁액을 분주하고 24 시간 배양하였다. 500 ng 의 상기 각 변이형 p53 발현 플라스미드, 야생형 p53 발현 플라스미드, 또는 pReceiver-M02CT 플라스미드의 각 DNA 용액에, 1 ㎕ 의 P3000 용액 (서모피셔 사이언티픽 주식회사 제조) 을 첨가하고, Opti-MEM 배지 (서모피셔 사이언티픽 주식회사 제조) 를 첨가함으로써 합계 25 ㎕ 에 맞춘 후에, 30 분간 실온에서 정치하였다. 이 조제한 각 플라스미드 용액 각각에 대해 1.5 ㎕ 의 Lipofectamine3000 용액 (서모피셔 사이언티픽 주식회사 제조) 과, 23.5 ㎕ 의 Opti-MEM 배지를 혼합한 Lipofectamine 혼합 용액을 준비하고, 상기 각 플라스미드 용액에 첨가하고 천천히 혼합한 후에, 10 분간 실온에서 정치하여 트랜스펙션 용액으로 하였다. 이 전체량 50 ㎕ 의 각 트랜스펙션 용액을, 전날보다 4 웰의 Nunc Lab-Tek Chamber Slide System 상에서 배양한 Saos-2 세포의 1 웰에 대하여 적하함으로써 트랜스펙션 처리를 실시하였다. 그 후 24 시간 배양하고, 트랜스펙션 용액 제거를 위한 배지 교환을 실시한 후, 추가로 24 시간 배양하고 고정한 세포를 면역 화학 조직 염색에 제공하였다.
상기한 바와 같이 트랜스펙션을 실시한 챔버 슬라이드의 각 웰에, 500 ㎕ 의 4 ％ 파라포름알데히드 용액을 분주하고, 실온에서 30 분간 정치함으로써 세포의 고정을 실시하였다. 파라포름알데히드 용액을 제거 후 PBS 로 3 회 세정을 실시한 후에, 0.1 ％ Triton-X 용액을 각 웰에 500 ㎕ 분주하고, 실온에서 5 분간 정치함으로써 세포의 침투 처리를 실시하였다. PBS 로 3 회 세정을 실시한 후에, 5 ％ 말 혈청 용액을 분주하고, 실온에서 5 분간 정치함으로써 블로킹을 실시하였다. 항 p53 모노클로날 항체 (Clone DO-7, Agilent 사 제조) 를 Antibody Diluent (Agilent 사 제조) 용액을 사용하여 100 배 희석함으로써 1 차 항체 용액을 준비하고, 200 ㎕ 씩 각 웰에 분주한 후에, 실온에서 12 시간 이상 정치함으로써 항원 항체 반응을 실시하였다. PBS 로 3 회 세정 후, HRP (고추냉이 퍼옥시다아제) 표지된 2 차 항체 Envision+System-HRP Labelled Polymer Anti-mouse (Agilent 사 제조) 용액을 슬라이드 상에 마운트하고, 실온에서 1 시간 반응시켰다. 그 후 PBS 로 3 회 세정한 후에, 슬라이드를 과산화수소수와 DAB (diamino benzidine) 및 기질 완충액 (Agilent 사 제조) 의 혼합액에 담그고, 4 ∼ 5 분간 발색 반응시켰다. PBS 로 세정 후, 헤마톡실린 (HE) 으로 2 ∼ 3 분간 핵 염색을 실시하고, 슬라이드를 유수 (流水) 로 1 분간 세정하였다. 결과를 도 5 에 나타낸다.
(결과)
도 5 로부터 분명한 바와 같이, 상기 각 세포에 있어서 면역 조직 염색을 실시한 결과, p53 단백질이 갈색으로 염색되었다. HE 에 의해 청색으로 염색되어 있는 부분이 핵이다. 야생형 p53 뿐만이 아니라, A159D 변이형 p53 및 D49H 변이형 p53 을 발현시킨 세포에 있어서, 세포질 뿐만 아니라 특히 핵내에 있어서 강하게 p53 의 염색이 관찰되었다. 이 결과로부터, 핵 이행이, D49H 변이형 p53 및 A159 변이형 p53 에 있어서, 야생형 p53 과 동일한 정도로 실시되어 있는 것이 확인되었다. 따라서, D49H 변이형 p53 및 A159 변이형 p53 에 있어서 확인된 전사 활성의 저하는, 핵 이행 빈도의 상이에 의한 것이 아니라, 각 변이에 의해 야기되는 p53 단백질의 기능 변성에 기초하는 것일 가능성이 큰 것으로 판단하였다.
[실시예 4]
[p53 각 변이형의 이뮤노 블로팅]
각 변이형 p53 에 있어서의, p53 의 인산화나 p53 하류의 유전자의 발현에 대한 영향에 대해 평가를 실시하기 위해서, 이뮤노 블로팅을 실시하였다.
6 웰 플레이트 (코닝 제조) 의 각 웰에, 4 × 105 개의 Saos-2 세포를, 2 ㎖ 의 10 ％ (v/v) 열 불활성화한 소태아 혈청 함유 RPMI1640 배지에 현탁한 세포 현탁액을 분주하고 24 시간 배양하였다. 2500 ng 의 각 변이형 p53 발현 플라스미드 (D49H, A159D, S46A, P47S, D49A 및 R175H), 야생형 p53 발현 플라스미드, 또는 음성 컨트롤용의 pReceiver-M02CT 플라스미드의 각 DNA 용액에, 5 ㎕ 의 P3000 용액 (서모피셔 사이언티픽 주식회사 제조) 을 첨가하고, Opti-MEM 배지 (서모피셔 사이언티픽 주식회사 제조) 를 첨가함으로써 합계 125 ㎕ 에 맞춘 후에, 30 분간 실온에서 정치하였다. 이 조제한 각 플라스미드 용액 각각에 대해 7.5 ㎕ 의 Lipofectamine3000 용액 (서모피셔 사이언티픽 주식회사 제조) 과, 117.5 ㎕ 의 Opti-MEM 배지를 혼합한 Lipofectamine 혼합 용액을 준비하고, 상기 각 플라스미드 용액에 첨가하고 천천히 혼합한 후에, 10 분간 실온에서 정치하여 트랜스펙션 용액으로 하였다. 이 전체량 250 ㎕ 의 각 트랜스펙션 용액을, 전날보다 6 웰 플레이트 상에서 배양한 Saos-2 세포의 1 웰에 대하여 적하함으로써 트랜스펙션 처리를 실시하였다. 그 후 24 시간 배양하고, 트랜스펙션 용액 제거를 위한 배지 교환을 실시한 후, 추가로 24 시간 배양하였다. 각 웰로부터 배지 제거 후, 1 ㎖ 의 빙랭 PBS 로 세정한 후에, 500 ㎕ 의 빙랭 PBS 를 재차 더하고 Cell Lifter (코닝사 제조) 를 사용하여 세포를 박리한 후에, 원심 분리하여 얻은 세포 펠릿에, 56 ㎕ 의 Lysis buffer mix (M-PER mammalian protein extraction reagent 에 1/50 량의 EDTA-free Halt protease inhibitor cocktail 및 Halt phosphatase inhibitor cocktail 을 첨가한 용액 (서모피셔 사이언티픽 주식회사 제조) 을 첨가하고, 빙상에서 45 분간 정치함으로써 세포를 용해하여 단백질 용액을 조제하였다. 단백질 양은, BCA protein assay reagent (서모피셔 사이언티픽 주식회사 제조) 를 사용하여 측정하고, Lysis buffer mix 를 첨가함으로써, 0.5 μg/㎕ 의 단백질 용액으로 조제하였다. 20 ㎕ (10 μg) 의 단백질 용액을 10 ％ 의 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 에 의해 분리한 후에, 니트로셀룰로오스 시트 (바이오·라드 래버러토리즈 주식회사 제조) 에 전사하였다. 다음으로, 니트로셀룰로오스 시트를 Tris-buffered saline-Tween 20 (TBST, CST 재팬 주식회사 제조) 으로 조제한 5 ％ 스킴 밀크 또는 5 ％ 소 혈청 알부민 용액에, 실온에서 1 시간 담금으로써 블로킹 한 후에, 5 ％ 스킴 밀크 또는 5 ％ 소 혈청 알부민 용액으로 희석한 1 차 항체 용액에 12 시간 이상 4 ℃ 에서 침지함으로써 항원 항체 반응을 실시하였다. TBST 로 상온으로 3 회 세정 후, 5 ％ 스킴 밀크 용액으로 희석한 HRP (고추냉이 퍼옥시다아제) 표지된 2 차 항체 (Promega 사 제조) 용액에 실온에서 1 시간 침지하였다. TBST 로 상온에서 5 회 세정 후, 항원 항체 반응의 시그널을 SuperSignal WestPico Chemiluminescent Substrate (서모피셔 사이언티픽 주식회사 제조) 를 사용하여 발광시키고, ImageQuant LAS4000 system (GE 헬스케어·재팬 주식회사 제조) 을 사용하여 검출하였다. 결과를 도 6 에 나타낸다.
(1 차 항체)
p53, 46 번째의 세린 잔기가 인산화한 p53, p21 의 단백질 발현 레벨을 이하의 1 차 항체를 사용하여 검출하였다. β-액틴은, 양성 컨트롤로서 사용하고 있다.
p53 항체：p53 (7F5) Rabbit mAb (2527, CST 재팬 주식회사)
46 번째의 세린 잔기가 인산화한 p53 항체：Phospho-p53 (Ser46) Antibody (2521, CST 재팬 주식회사)
p21 항체 : p21 Waf1/Cip1 (12D1) Rabbit mAb (2947, CST 재팬 주식회사)
β-액틴 항체 : β-Actin Antibody (C4) (sc-47778, Santa Cruz Biotechnology 사 제조)
(결과)
각 p53 단백질의 발현량에 대해서는, 도 6 으로부터 분명한 바와 같이, 야생형 p53 및 각 변이형 p53 의 발현량은, 거의 동등하였다.
46 번째의 세린 잔기의 인산화는, p53 의 아포토시스 유도에 있어서 중요한 번역 후 수식인 것이 보고되어 있다. D49H 변이의 근방에 위치하기 때문에, 46 번째의 세린 잔기의 인산화에 대한 영향에 대해서 검토를 실시하였다. 46 번째의 세린 잔기가 인산화된 p53 단백질의 발현량에 대해서는, D49H 변이형 p53, A159D 변이형 p53, D49A 변이형 p53, R175H 변이형 p53 에 있어서는, 야생형 p53 에 있어서의 발현량과 거의 동등하였다. 한편, 46 번째의 세린 잔기가 알라닌으로 치환되어 있는 S46A 변이형 p53 과 47 번째의 프롤린 잔기가 세린으로 치환되어 있는 P47S 변이형 p53 에 있어서는 발현량이 저하되어 있었다. 이러한 결과에 의해, 코돈 46 및 47에 있어서의 변이는, 지금까지의 보고대로 46 번째의 세린 잔기의 인산화에 영향을 주는 변이인 것이 확인되었다. 한편, D49H 변이 및 A159D 변이는, 46 번째의 세린 잔기의 인산화에 영향을 주는 변이가 아닌 것이 분명해졌다.
p21 은, p53 의 활성화에 수반하여 발현이 증가하는 주요한 p53 제어하에 있는 단백이며, 셀 사이클을 정지시키는 기능을 갖는다. 그래서, 각 변이의 p21 의 발현에 대한 영향을 평가하였다. p21 단백질의 발현량에 대해서는, 도 6 으로부터 분명한 바와 같이, D49H 변이형 p53, S46A 변이형 p53, P47S 변이형 p53, 및 D49A 변이형 p53 에 있어서는, 야생형 p53 에 있어서의 발현량과 거의 동등하였다. A159D 변이형 p53 에 있어서는, p21 단백질의 발현이 거의 관찰되지 않았다. 이러한 결과는, 복수의 암종에 있어서 고빈도로 확인되는 p53 의 기능 실활형 변이 R175H 변이형 p53 과 일치하는 것이다. 이 결과는, A159D 변이 및 R175H 변이가, p53 의 하류의 셀 사이클의 제어에 영향을 주는 것을 나타내고 있다.
[실시예 5]
[세포 증식 시험]
p53 null 의 세포주 (NCI-H1299 세포) 에서는, 네오마이신 내성 유전자를 갖는 플라스미드를 사용하여 야생형의 p53 을 트랜스펙션하고, 셀렉션 마커인 구성 물질 G418 (네오마이신 유도체) 로 처리하면, 네오마이신 내성 유전자가 포함되어 있음에도 불구하고, p53 에 의한 아포토시스 유도가 일어나는 것이 보고되어 있다. 또, 유전자 변이의 세포 증식에 대한 영향을 평가하는 방법으로서, 대상 변이를 발현하는 플라스미드 (네오마이신 내성 유전자를 갖는다) 를 트랜스펙션 후 셀렉션 마커인 항생 물질 G418 로 2 ∼ 3 주간 배양하고, 그 때의 콜로니 형성수로 평가하는 방법이 보고되어 있다. 이러한 지견을 전제로, 이하의 세포 증식 시험을 실시하였다.
본 실험에서 사용하고 있는 유전자 발현용 플라스미드도 셀렉션 마커로서 네오마이신 내성 유전자를 갖는다. 6 웰 플레이트 (코닝사 제조) 의 각 웰에, 4 × 105 개의 Saos-2 세포를, 2 ㎖ 의 10 ％ (v/v) 열 불활성화한 소태아 혈청 함유 RPMI1640 배지에 현탁한 세포 현탁액을 분주하고 24 시간 배양하였다. 2500 ng 의 각 p53 변이형 유전자 발현 플라스미드 (D49H, A159D, S46A, P47S, D49A 및 R175H), p53 야생형 유전자 발현 플라스미드, 또는 음성 컨트롤용의 pReceiver-M02CT 플라스미드의 각 DNA 용액에, 5 ㎕ 의 P3000 용액 (서모피셔 사이언티픽 주식회사 제조) 을 첨가하고, Opti-MEM 배지 (서모피셔 사이언티픽 주식회사 제조) 를 첨가함으로써 합계 125 ㎕ 에 맞춘 후에, 30 분간 실온에서 정치하였다. 이 조제한 각 플라스미드 용액 각각에 대해 7.5 ㎕ 의 Lipofectamine3000 용액 (서모피셔 사이언티픽 주식회사 제조) 과, 117.5 ㎕ 의 Opti-MEM 배지를 혼합한 Lipofectamine 혼합 용액을 준비하고, 상기 각 플라스미드 용액에 첨가하고 천천히 혼합한 후에, 10 분간 실온에서 정치하여 트랜스펙션 용액으로 하였다. 이 전체량 250 ㎕ 의 각 트랜스펙션 용액을, 전날부터 6 웰 플레이트 상에서 배양한 Saos-2 세포의 1 웰에 대하여 적하함으로써 트랜스펙션 처리를 실시하였다. 그 후 48 시간 배양한 후에, Trypsin-EDTA 용액 (서모피셔 사이언티픽 주식회사 제조) 을 첨가하고 세포를 박리하여 세포수의 계측을 실시하였다. 세포 농도를 3.6 × 104 개/㎖ 로 조정하고, 1 ㎖ 를 25 ㎠ 플라스크 (코닝사 제조) 에 넣고, 거기에 4 ㎖ 의 10 ％ (v/v) 열 불활성화한 소태아 혈청 및 2 ㎎ 의 Geneticin (G418, 서모피셔 사이언티픽 주식회사 제조) 함유 RPMI1640 배지를 분주하였다. 이에 따라 G418 의 종농도는 0.4 mg/㎖ 가 된다. 거기로부터 19 일간 배양한 후에, PBS 로 세정하고, 크리스탈 바이올렛 용액에 의한 고정·염색을 실시하고, 콜로니수의 계측을 실시하였다. 결과를 도 7 (a) 및 (b) 에 나타낸다.
(결과)
도 7 (a) 및 (b) 로부터 분명한 바와 같이, D49H 변이형 p53, D49A 변이형 p53, S46A 변이형 p53, 및 P47S 변이형 p53 의 각 p53 의 TAD2 상의 변이형 p53 은, 야생형 p53 과 마찬가지로 거의 콜로니는 형성되지 않았다. 한편, A159 변이형 p53 및 R175H 변이형 p53 에 있어서는, 다수의 콜로니가 확인되고, 그들 콜로니수는, Empty 주보다 많은 것이 확인되었다.
(고찰)
D49H 변이형 p53, D49A 변이형 p53, S46A 변이형 p53, 및 P47S 변이형 p53 의 각 변이형 p53 에 있어서의 콜로니 형성수는 적고, 야생형 p53 과 동등한 아포토시스 유도에 관한 기능을 유지하고 있는 것으로 판단하였다. 한편, 콜로니 형성수가 많았던 A159 변이형 p53 및 R175H 변이형 p53 에 있어서는, 이러한 기능이 실활하고 있고, 아포토시스가 일어나지 않는 것으로 생각된다. 상기 결과로부터, A159D 변이형 p53 은, 마찬가지로 DBD 상의 변이를 갖는 R175H 변이형 p53 과 동일한 다수의 콜로니가 확인되었기 때문에, A159D 변이형 p53 및 R175H 변이형 p53 은, 아포토시스 유도능이 현저하게 낮다는 점에서, 암의 발생 및 암의 진전에 영향을 주는 변이일 가능성이 높은 것을 시사하고 있다.
(정리)
이상과 같이, A159D 변이형 p53 이 도입된 세포에 있어서는, 완전한 전사 활성의 상실과 세포 증식의 촉진이 나타났다. 이들 결과는, 복수의 암종에 있어서 고빈도로 확인되는 R175H 의 p53 의 기능 실활형 변이의 표현형과 일치하고 있었다. 또, 이번 검토로 확인된 A159D 변이에 의한, p53 기능의 상실은, 당해 변이가, 리·프라우메니 증후군의 주요한 원인의 하나의 변이일 가능성이 높은 것을 시사하고 있다. 한편, D49H 변이에 있어서는 A159D 변이형 p53 과 같은 현저한 표현형에 대한 영향을 관찰되지 않기는 했지만, 야생형 p53 에 비해 약 40 ％ 의 유의한 전사 활성의 저하가 확인되었다.
[실시예 6]
[D49H 변이형 p53 과 야생형 p53 에 있어서의, 결합 친화성의 고찰]
지금까지 보고되어 있는 2 복합체의 입체 구조로는, 이하의 6 종류를 예시할 수 있다.
(1) X-ray 에 의해 해석된 복합체
1) 복제 단백질 Replication Protein A (RPA) 와의 복합체
(2) NMR 에 의해 해석된 복합체
1) Tfb1 (transcription factorb1) 과의 복합체
2) 기본 전사 인자의 하나인 transcription factor for polymerase II (TFIIH) 와의 복합체
3) 전사를 조절하는 코액티베이터라고 불리는 인자인 CREB-binding protein (CBP) 과의 복합체
4) 전사를 조절하는 코액티베이터라고 불리는 인자인 p300 과의 복합체
5) 비히스톤 핵 단백질인 High Mobility Group BoX 1 (HMGB1) 과의 복합체
결합하고 있는 복합체를, 분리에 필요한 여분의 작업량을 무시할 수 있는 충분한 거리까지 멀어진 구성 요소 부분으로 분해시킬 때에 실시해야 할 작업량을 나타내는 열 역학적 포텐셜인 깁스 자유에너지 변화 ΔG 는, 일반적으로, 이하의 식 1 로 나타낼 수 있다.
Figure pct00011
이하의 식 2 에 의해, 결합 친화성을 나타내는 평형 정수 (定數) K 와, ΔG, ΔH, ΔS 와 같은 열 역학량이 관련지어지므로, 상기 서술한 복합체의 ΔG 를 분자 동역학 시뮬레이션의 결과를 사용하여 추정함으로써 복합체의 결합 친화성을 평가하였다. NVIDIA 사 제조 그래픽 카드를 설치한 Linux OS 머신에 의한 고속 분자 동역학 시뮬레이션을 실시하고, 열 평형에 도달하고 있는 것으로 생각된 480-510 나노 초의 범위에 있어서의 ΔH 와, 25 ℃ 에 있어서의 TΔS 를 계산함으로써 ΔG 을 추정하고, 각 복합체의 결합 친화성을 평가하였다.
Figure pct00012
(단,
G：깁스 에너지 (kcal/㏖)
K：결합 정수
R：기체 정수 (kcal/K/㏖)
T：절대 온도 (K)
H：엔탈피 (kcal/㏖)
S：엔트로피 (kcal/K/㏖)
NMR 을 초기 구조로 하는 복합체의 결합 친화성 (ΔG) 의 평가를, 이하의 표 3 에 나타낸다.
Figure pct00013
(결과)
상기 표 3 으로부터 분명한 바와 같이, 분자 동역학 시뮬레이션과 인실리코 결합 친화성의 평가에 있어서는 p53(야생형 (WT))-CBP 보다 p53(D49H)-CBP 의 쪽이 결합은 약했다. p53 의 관여는, p53 에 D49H 의 변이가 들어감으로써 CBP 의 결합이 약해지는 것이 원인의 하나인 것으로 시사되었다.
산업상 이용가능성
본 발명은 의약 분야에 있어서 매우 유용하다.
SEQUENCE LISTING <110> SHIZUOKA PREFECTURE <120> METHOD FOR DETERMINING PRESENCE OR ABSENCE OF RISK OF DEVELOPING CANCER <130> SCC1603 <140> JP2016-154067 <141> 2016-08-04 <160> 23 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1182 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Inventor:YAMAGUCHI, Ken; KUSUHARA, Masatoshi; SERIZAWA, Masakuni; MOCHIZUKI, Tohru; OHSHIMA, Keiichi; HATAKEYAMA, Keiichi; URAKAMI , Kenichi; OHNAMI, Shumpei; AKIYAMA, Yasuto; MARUYAMA, Kouji; INO UE, Kengo; SHIMODA, Yuji; NAGASHIMA, Takeshi; ISHIKAWA, Yoshinobu <400> 1 atggaggagc cgcagtcaga tcctagcgtc gagccccctc tgagtcagga aacattttca 60 gacctatgga aactacttcc tgaaaacaac gttctgtccc ccttgccgtc ccaagcaatg 120 gatgatttga tgctgtcccc ggacgatatt gaacaatggt tcactgaaga cccaggtcca 180 gatgaagctc ccagaatgcc agaggctgct ccccccgtgg cccctgcacc agcagctcct 240 acaccggcgg cccctgcacc agccccctcc tggcccctgt catcttctgt cccttcccag 300 aaaacctacc agggcagcta cggtttccgt ctgggcttct tgcattctgg gacagccaag 360 tctgtgactt gcacgtactc ccctgccctc aacaagatgt tttgccaact ggccaagacc 420 tgccctgtgc agctgtgggt tgattccaca cccccgcccg gcacccgcgt ccgcgccatg 480 gccatctaca agcagtcaca gcacatgacg gaggttgtga ggcgctgccc ccaccatgag 540 cgctgctcag atagcgatgg tctggcccct cctcagcatc ttatccgagt ggaaggaaat 600 ttgcgtgtgg agtatttgga tgacagaaac acttttcgac atagtgtggt ggtgccctat 660 gagccgcctg aggttggctc tgactgtacc accatccact acaactacat gtgtaacagt 720 tcctgcatgg gcggcatgaa ccggaggccc atcctcacca tcatcacact ggaagactcc 780 agtggtaatc tactgggacg gaacagcttt gaggtgcgtg tttgtgcctg tcctgggaga 840 gaccggcgca cagaggaaga gaatctccgc aagaaagggg agcctcacca cgagctgccc 900 ccagggagca ctaagcgagc actgcccaac aacaccagct cctctcccca gccaaagaag 960 aaaccactgg atggagaata tttcaccctt cagatccgtg ggcgtgagcg cttcgagatg 1020 ttccgagagc tgaatgaggc cttggaactc aaggatgccc aggctgggaa ggagccaggg 1080 gggagcaggg ctcactccag ccacctgaag tccaaaaagg gtcagtctac ctcccgccat 1140 aaaaaactca tgttcaagac agaagggcct gactcagact ga 1182 <210> 2 <211> 393 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln 1 5 10 15 Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu 20 25 30 Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp 35 40 45 Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro 50 55 60 Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Pro Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro 65 70 75 80 Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser 85 90 95 Val Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly 100 105 110 Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro 115 120 125 Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln 130 135 140 Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met 145 150 155 160 Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys 165 170 175 Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln 180 185 190 His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp 195 200 205 Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu 210 215 220 Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser 225 230 235 240 Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr 245 250 255 Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val 260 265 270 Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn 275 280 285 Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr 290 295 300 Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys 305 310 315 320 Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu 325 330 335 Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp 340 345 350 Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His 355 360 365 Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met 370 375 380 Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp 385 390 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward Primer <400> 3 gctgccctgg taggttttct 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse Primer <400> 4 gtggatccat tggaagggca 20 <210> 5 <211> 465 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gtggatccat tggaagggca ggcccaccac ccccacccca accccagccc cctagcagag 60 acctgtggga agcgaaaatt ccatgggact gactttctgc tcttgtcttt cagacttcct 120 gaaaacaacg ttctggtaag gacaagggtt gggctgggga cctggagggc tggggacctg 180 gagggctggg gggctggggg gctgaggacc tggtccctga ctgctctttt cacccatcta 240 cagtccccct tgccgtccca agcaatggat gatttgatgc tgtccccgga ccatattgaa 300 caatggttca ctgaagaccc aggtccagat gaagctccca gaatgccaga ggctgctccc 360 cccgtggccc ctgcaccagc agctcctaca ccggcggccc ctgcaccagc cccctcctgg 420 cccctgtcat cttctgtccc ttcccagaaa acctaccagg gcagc 465 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward Primer <400> 6 gtgaggaatc agaggcctgg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse Primer <400> 7 gcacacctat agtcccagcc 20 <210> 8 <211> 558 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 gcacacctat agtcccagcc acttaggagg ctgaggtggg aagatcactt 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TP53_A159D-sdmR2 <400> 12 ggccatgtcg cggacgcggg tgccgg 26 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TP53_S46A-sdmF2 <400> 13 gatgctggcc ccggacgata ttgaac 26 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TP53_S46A-sdmR2 <400> 14 tccggggcca gcatcaaatc atccat 26 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TP53_P47S-sdmF2 <400> 15 gctgtcctcg gacgatattg aacaat 26 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TP53_P47S-sdmR2 <400> 16 tcgtccgagg acagcatcaa atcatc 26 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TP53_D49A-sdmF2 <400> 17 ccggacgcta ttgaacaatg gttcac 26 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TP53_D49A-sdmR2 <400> 18 ttcaatagcg tccggggaca gcatca 26 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TP53_R175H-sdmF2 <400> 19 gtgaggcact gcccccacca tgagcg 26 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TP53_R175H-sdmR2 <400> 20 ggggcagtgc ctcacaacct ccgtca 26 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pEZ-M02-SeqF <400> 21 cagcctccgg actctagc 18 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pEZ-M02-SeqR <400> 22 taatacgact cactataggg 20 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TP53-SR3 <400> 23 gaggagctgg tgttgttg 18

Claims (7)

  1. 피검자로부터 채취한 생체 시료 중의, 인간 p53 의 코돈 159 에 있어서 알라닌이 아스파르트산으로 치환되는 변이 및/또는 인간 p53 의 코돈 49 에 있어서 아스파르트산이 히스티딘으로 치환되는 변이의 유무를 검출하는 것을 특징으로 하는 암의 발증 리스크의 유무를 판정하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    알라닌이 아스파르트산으로 치환되는 변이가, 알라닌을 코드하는 염기 서열 「GCC」 가 아스파르트산을 코드하는 염기 서열 「GAC」 로 치환되는 변이인 것을 특징으로 하는, 암의 발증 리스크의 유무를 판정하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    아스파르트산이 히스티딘으로 치환되는 변이가, 아스파르트산을 코드하는 염기 서열 「GAT」 가 히스티딘을 코드하는 염기 서열 「CAT」 로 치환되는 변이인 것을 특징으로 하는, 암의 발증 리스크의 유무를 판정하는 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    알라닌이 아스파르트산으로 치환되는 변이가 생식 세포 변이인 것을 특징으로 하는, 암의 발증 리스크의 유무를 판정하는 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
    아스파르트산이 히스티딘으로 치환되는 변이가 생식 세포 변이인 것을 특징으로 하는, 암의 발증 리스크의 유무를 판정하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    차세대 DNA 시퀸서를 사용하여, 변이의 유무를 검출하는 것을 특징으로 하는, 암의 발증 리스크의 유무를 판정하는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    생어법을 이용하여, 변이의 유무를 검출하는 것을 특징으로 하는, 암의 발증 리스크의 유무를 판정하는 방법.
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