JP6950123B2

JP6950123B2 - がんの発症リスクの有無を判定する方法

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Publication number: JP6950123B2
Application number: JP2018531987A
Authority: JP
Inventors: 建山口; 正俊楠原; 昌邦芹澤; 徹望月; 啓一大島; 慶一畠山; 研一浦上; 俊平大浪; 靖人秋山; 丸山　宏二; 宏二丸山; 謙吾井上; 勇治下田; 剛史長嶋; 吉伸石川
Original assignee: Shizuoka University NUC; Shizuoka Prefecture
Current assignee: Shizuoka University NUC; Shizuoka Prefecture
Priority date: 2016-08-04
Filing date: 2017-08-03
Publication date: 2021-10-13
Anticipated expiration: 2037-08-03
Also published as: JPWO2018025971A1; EP3495494B1; EP3495494A1; KR102413458B1; CN109563550A; US20200255901A1; WO2018025971A1; KR20190035759A; EP3495494A4; US20220389517A1

Description

本発明は、がんの発症リスクの有無を判定する方法に関し、より詳細には、被検者から採取した生体試料中のヒトｐ５３のコドン１５９において、アラニンがアスパラギン酸に置換される変異（以下、「Ａ１５９Ｄ変異」ということがある）及び／又はヒトｐ５３のコドン４９において、アスパラギン酸がヒスチジンに置換される変異（以下、「Ｄ４９Ｈ変異」ということがある）の有無を検出するがんの発症リスクの有無を判定する方法に関する。

近年、ヒト全ゲノム配列が決定されたことに伴い、個人間で相違する三百万個以上の一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphism；ＳＮＰ）が存在することが明らかになった。かかるＳＮＰに関する情報に基づいて、個人の形質や疾病発症の予測を求めるニーズが高まっており、疾患とＳＮＰとの関連についての解析が進められている。

また、複数のＰＣＲプライマーセットを用いて広範なゲノム情報を一度の反応により読み取ることを可能にした次世代ＤＮＡシーケンサー（Next Generation DNA Sequencer；ＮＧＳ）の開発が進んだことにより、全人口の１％以上の頻度で観察されるＳＮＰよりも頻度の低い、単一塩基変異（Single Nucleotide Variation；ＳＮＶ）も多数同定され、かかる成果をもとにした個別化医療や予防医療の実現に向けた取組みも加速化している。このニーズを充足するためには、プロモーター領域などを含めた非翻訳領域中のＳＮＶを同定する全ゲノムシーケンサーが理想的であるといえるが、現在のところコスト的な面からエキソン部位に注目して解析を行うエキソン解析が広く行われている。

一方、ヒトｐ５３は、もともと分子量５３０００の意味を有するタンパク質であり、全長３９３アミノ酸からなり、Ｎ末端から、ＴＡＤ１及びＴＡＤ２から構成される転写活性化ドメイン（Transactivation Domain：ＴＡＤ）、プロリンリッチドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＮＡ binding domain：ＤＢＤ）、四量体形成ドメイン、並びに調節ドメインの５つの領域から構成されている。ＤＢＤはＤＮＡ結合に関与する領域で、腫瘍において検出される遺伝子変異のほとんどがこの領域に集中し、ＴＡＤにおいて認められる遺伝子変異は少ない。ヒトｐ５３は多彩な活性によって遺伝子の異常から生体を守る機能を担っているとされ、主な活性としては、遺伝子に異常が発生した細胞における、遺伝子転写制御を介した細胞周期進行の制御・遺伝子修復酵素の活性化・アポトーシス誘導能等を挙げることができる。ヒトｐ５３遺伝子自体に突然変異が生じると、これらのヒトｐ５３の機能が欠損し、腫瘍の発生に至るというメカニズムが考えられている。ヒトがん細胞におけるヒトｐ５３遺伝子の変異は、大腸・胃・乳腺・肺・脳・食道など多くのヒトの腫瘍において確認されており、変異したヒトｐ５３の異常な蓄積が多くの腫瘍組織において観察されている。

また、公知の網羅的変異ヒトｐ５３ライブラリの文献に、Ａ１５９Ｄ変異及びＤ４９Ｈ変異についての記載はある（例えば、特許文献１参照）が、かかる変異と、疾病や特定の形質についての関連については知られていない。

Ａ１５９Ｄ変異は、ＣＯＳＭＩＣ（URL: http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic）に腫瘍組織８サンプルおよび１細胞株における報告があり、番号ＣＯＳＭ１１４９６で登録されている。ＩＲＡＣデータベースにも、１４症例の報告があるが、すべて体細胞変異である。生殖細胞変異を対象とした京都大学のHuman Genetic Variation Database、東北メディカル・メガバンク機構のIntegrative Japanese Genome Variation Database、Exoｍｅ Aggregation Consortium （URL: http://exac.broadinstitute.org）データベース、ｄｂＳＮＰデータベース（URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/）およびＣｌｉｎｖａｒ（URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/）には、Ａ１５９Ｄ変異の登録はない。また、ｐ５３の生殖細胞変異が原因となるリ・フラウメニ（Li-Fraumeni）症候群、リ・フラウメニ様（Li-Fraumeni like）症候群、家族性腫瘍（Familial cancer）においてＡ１５９Ｄ変異の報告は存在しない。

Ｄ４９Ｈ変異については、さらに、ＣＯＳＭＩＣ（URL: http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic）に登録番号ＣＯＳＭ１１９３５の報告があり、ＩＲＡＣデータベースに８症例の報告があるが、すべて体細胞変異である。生殖細胞変異を対象とした京都大学のHuman Genetic Variation Databaseや東北メディカル・メガバンク機構のIntegrative Japanese Genome Variation DatabaseにＤ４９Ｈ変異について報告はない。Exome Aggregation Consortium （URL: http://exac.broadinstitute.org）データベースには、アレル頻度として0.000008261の報告があるが、ｐ５３の生殖細胞変異が原因となるリ・フラウメニ（Li-Fraumeni）症候群、リ・フラウメニ様（Li-Fraumeni like）症候群、家族性腫瘍（Familial cancer）においてＤ４９Ｈ変異の報告は存在しない。ｄｂＳＮＰデータベース（URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/）に登録番号ｒｓ５８７７８０７２８としてＤ４９Ｈ変異の報告があるが、Exome Aggregation Consortiumのアレル頻度を引用している。

また、ｐ５３は相同組換関連タンパク質と直接結合することで物理的にそれらタンパク質の働きを阻害し、相同組換の進行を抑制することで未修復のＤＮＡの誤った複製を防ぐ働きを有している。ｐ５３のＤ４９Ｈ変異は、ｐ５３タンパク質が相同組換関連タンパク質の一つであるＲＰＡ（replication protein A）タンパク質と結合するうえで必須の４８番目及び４９番目の連続するアスパラギン酸残基に位置している。この、両アミノ酸残基に、Ｄ４８Ｈ／Ｄ４９Ｈの両変異を同時に導入したｐ５３を発現させた細胞では、ｐ５３とＲＰＡ間の結合が形成されないため、ＲＰＡが機能することが可能となり、結果として相同組換が非制御状態で亢進することが報告されている（非特許文献１）。
但し、当該文献は、Ｄ４８Ｈ／Ｄ４９Ｈの両変異を同時に導入したｐ５３での検討であり、４８番目及び４９番目それぞれのアミノ酸残基単独での検討は行われていない。また、Ｄ４８Ｈ／Ｄ４９Ｈ変異型ｐ５３のＲＰＡとの結合能及び相同組換能への影響は検討しているものの、がんの発生やがんの進展との関連についての検討結果、及びその変異を有する症例の臨床像の情報は示されていない。あくまで、Ｄ４８Ｈ／Ｄ４９Ｈ変異を導入したのは、その部位の機能評価という観点に基づいたものである。

特開２００３−２６５１８７号公報

Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００４）２３,９０２５−９０３３

本発明の課題は、がんの発症リスクを予測する方法を提供することにある。

本発明者らは、１６８５人のがん患者の血液及びがん組織からＤＮＡ試料を調製し、ＮＧＳを用いてエキソン部位の塩基配列の解析を行ったところ、上記がん患者のうち６人が、正常な日本人ではこれまでまったく知られていなかった、ＴＡＤ２上に位置するＤ４９Ｈ変異を有することを見いだした。また、そのＤ４９Ｈ変異を有する６人中１例で、ＤＢＤ上に位置するＡ１５９Ｄ変異を見いだした。そしてまた、かかる変異はすべて生殖細胞変異であることを確認した。本発明者らは、さらなるデータ解析を続け、追加で調査した７９５人のがん患者のうち１人がＤ４９Ｈ変異を有することを確認し、本発明を完成するに至った。

上述のとおり、ｐ５３のＤ４９Ｈ変異は極めて希な健常者の生殖細胞系列のＳＮＶとして報告されているが、がんの家族歴を有するがん患者（家族性がんを疑う患者）では報告されていない。今回、がんの家族歴を有するがん患者７例でｐ５３のＤ４９Ｈ変異を見つけた。ｐ５３変異による家族性がんにおいてＴＡＤの生殖細胞系列変異は極めて希である。Ｄ４９Ｈ変異は、家族歴や臨床的情報から、リ・フラウメニ症候群をはじめとするがん発生の要因となる可能性が考えられた。さらに、ｐ５３のＡ１５９Ｄ変異も、腫瘍においてｐ５３の機能を失活させる変異が多数報告されているＤＢＤに位置することから、同様にリ・フラウメニ症候群をはじめとするがん発生の要因となる可能性が考えられる。

すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）被検者から採取した生体試料中の、ヒトｐ５３のコドン１５９においてアラニンがアスパラギン酸に置換される変異及び／又はヒトｐ５３のコドン４９においてアスパラギン酸がヒスチジンに置換される変異の有無を検出することを特徴とするがんの発症リスクの有無を判定する方法。
（２）アラニンがアスパラギン酸に置換される変異が、アラニンをコードする塩基配列「ＧＣＣ」がアスパラギン酸をコードする塩基配列「ＧＡＣ」に置換される変異であることを特徴とする上記（１）記載の方法。
（３）アスパラギン酸がヒスチジンに置換される変異が、アスパラギン酸をコードする塩基配列「ＧＡＴ」がヒスチジンをコードする塩基配列「ＣＡＴ」に置換される変異であることを特徴とする上記（１）記載の方法。
（４）アラニンがアスパラギン酸に置換される変異が生殖細胞変異であることを特徴とする上記（１）又は（２）記載の方法。
（５）アスパラギン酸がヒスチジンに置換される変異が生殖細胞変異であることを特徴とする上記（１）又は（３）記載の方法。
（６）次世代ＤＮＡシーケンサーを用いて変異の有無を検出することを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれか記載の方法。
（７）サンガー法を用いて変異の有無を検出することを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれか記載の方法。

本発明によると、被検者から採取した生体試料中のＡ１５９Ｄ変異及び／又はＤ４９Ｈ変異の有無に基づいて、がんの発症リスクの有無を判定することができる。特に、がんの発症リスクがあると判定された場合にはその結果に基づいて、環境や生活習慣の改善等、がん予防のための措置をとることができ、また、定期的な健康診断等によりがんの発症を早期に確認することができる。さらに、血縁者にリ・フラウメニ症候群等遺伝性の重篤ながん関連疾患の発症者がいる場合、健常人であっても、将来かかる疾病を発症するか可能性があるかについての発症前診断が可能となる。

Ｄ４９Ｈ変異を有するがん患者６人のエキソン配列における変異の存在をIntegrative Genomics Viewer（ＩＧＶ）によって可視化した図を示す。Ｄ４９Ｈ変異を有するがん患者６名のサンガー法によるヒトｐ５３遺伝子の配列決定（一部）を示す図である。ルシフェラーゼアッセイに用いたキアゲン社Ｃｉｇｎａｌｐ５３Ｒｅｐｏｒｔｅｒ（ｌｕｃ）Ｋｉｔ（ＣＣＳ−００４Ｌ）の、ｐ５３ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｓｐｏｎｓｅｅｌｅｍｅｎｔ（ＴＲＥ）の６回タンデム−ＴＡＴＡｂｏｘ−ホタルルシフェラーゼ（ＦｉｒｅｆｌｙＬｕｃ）の構成の模式図である。各ｐ５３変異のルシフェラーゼアッセイの結果を示す図である。各ｐ５３変異の免疫化学組織染色の結果を示す図である。ｐ５３各変異のイムノブロッティングの結果を示す図である。（ａ）各プラスミド導入株の１９日間培養後のコロニー形成状態を示す図である。（ｂ）各プラスミド導入株の１９日間培養後のＧ４１８耐性のコロニー形成数を示すグラフである。

本発明のがんの発症リスクの有無を判定する方法としては、被検者から採取された生体試料中のＡ１５９Ｄ及び／又はＤ４９Ｈ変異の有無を検出する方法であれば特に制限されず、サンガー法等の従来公知の配列決定方法を挙げることができるが、一回の配列決定処理により多数の被検者について短時間で判定することができるという点で、ＮＧＳを用いて塩基配列決定を行う方法を好適に挙げることができる。

上記ヒトｐ５３遺伝子の塩基配列としては、ヒトｐ５３遺伝子から転写された成熟ｍＲＮＡの全配列、例えば、ＥｎｓｅｍｂｌＴｒａｎｓｃｒｉｐｔＩＤ：ＥＮＳＴ０００００２６９３０５に登録されている、「開始コドン「ａｕｇ」」、から、「終止コドン「ｕｇａ」」からなる１１８２塩基からなる塩基配列をＤＮＡ配列で表した配列（配列番号１）を変異のない野生型のｐ５３遺伝子のＤＮＡの塩基配列として示すことができる。変異のない野生型のヒトｐ５３のアミノ酸配列としては、配列番号２に示される３９３個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示すことができる。

本発明におけるがんとしては特に制限されないが、例えば、悪性黒色腫（メラノーマ）、皮膚がん、肺がん、気管及び気管支がん、口腔上皮がん、食道がん、胃がん、結腸がん、直腸がん、大腸がん、肝臓がん、肝細胞がん、肝内胆管がん、腎臓がん、膵臓がん、胃がん、前立腺がん、乳がん、子宮がん、卵巣がん、盲腸腺がん、舌扁平上皮がん、脳腫瘍、骨肉腫等を挙げることができる。

本発明における被検者としては、がん患者でも非がん患者でもよい。

本発明において、がんの発症リスクの有無を判定する行為としては、Ｄ４９Ｈ変異を有する場合に被検者が既にがんを発症しているか、もしくはがんの発症リスクが高い旨、又は、Ｄ４９Ｈ変異を有さない場合にＤ４９Ｈ変異に起因するがんの発症リスクが低い旨、を判定する行為を挙げることができる。Ｄ４９Ｈ変異としては、配列番号１に示される野生型のヒトｐ５３遺伝子において、アスパラギン酸をコードする１４５〜１４７番目の塩基「ＧＡＴ」が、ヒスチジンをコードする「ＣＡＴ」又は「ＣＡＣ」に置換される変異を挙げることができるが、「ＣＡＴ」に置換される変異を好適に挙げることができる。

上記がんの発症リスクの有無を判定する行為としては、Ａ１５９Ｄ変異を有する場合に被検者が既にがんを発症しているか、もしくはがんの発症リスクが高い旨、又は、Ａ１５９Ｄ変異を有さない場合にＡ１５９Ｄ変異に起因するがんの発症リスクが低い旨、を判定する行為をまた、挙げることができる。Ａ１５９Ｄ変異としては、配列番号１に示される野生型のヒトｐ５３遺伝子において、アラニンをコードする４７５〜４７７番目の塩基「ＧＣＣ」が、アスパラギン酸をコードする「ＧＡＣ」又は「ＧＡＴ」に置換される変異を挙げることができるが、「ＧＡＣ」に置換される変異を好適に挙げることができる。

本発明のがんの発症リスクの有無を判定する方法には、かかる判定のためのデータを収集する行為は含まれるが、医師による診断行為は除外される。そしてまた、本発明のがんの発症リスクの有無を判定する方法による結果と、他の検査結果とを併せて総合的な判定を行うこともできる。

本発明における被検者から採取された生体試料としては、被検者におけるＤ４９Ｈ変異の有無を検出することができる試料であれば特に制限されず、一般的に核酸採取に用いられる任意の生物学的試料を挙げることができるが、血液、血漿、血清、骨髄液、精液、腹腔液、尿、胸水、心嚢液、唾液等の体液や、体毛、臓器等の組織や、がん組織及びがん組織溶解物を挙げることができる。

上記血液試料としては、診断に際し特に有用な体液として、血液を遠心分離した際に赤血球層と血漿との間に生じる、白血球と血小板の層であるバフィーコートを好適に挙げることができ、かかるバフィーコートは、被検者から採取された血液を採血管に入れて遠心分離後、赤血球層と血漿との間の層のみを回収することにより調製することができる。

上記がん組織溶解物としては、被検者のがん組織を摘出・裁断後、プロテアーゼＫに代表されるセリンペプチダーゼ等のタンパク質分解酵素によりがん組織を溶解処理後に、遠心分離して上清を回収することにより調製することができる。

Ａ１５９Ｄ変異及び／又はＤ４９Ｈ変異の有無を確認する対象としては、ヒトｐ５３遺伝子を好適に挙げることができ、かかる遺伝子としては、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ等を挙げることができるが、ＲＮＡはＤＮＡと比較して安定性が低いため、ゲノムＤＮＡを特に好適に対象とすることができる。

上記ゲノムＤＮＡを調製する方法としては、前記の生体試料から、フェノールやクロロホルムを用いた方法等の従来公知の方法により抽出する方法を挙げることができ、また、好ましくは、ＤＮｅａｓｙＢｌｏｏｄ＆ＴｉｓｓｕｅＫｉｔ、ＱＩＡａｍｐＤＮＡＢｌｏｏｄＭｉｄｉＫｉｔ（いずれもQiagen社製）等市販のキットを用いてＮＧＳに適した高純度ＤＮＡを調製することもできる。

前記ＮＧＳを用いて配列決定をする方法は、前例がない速度でポリヌクレオチドを配列決定する能力を有する技術に基づく方法であり、複数のプライマーセットを用いてゲノムの広範な範囲を一回のシーケンスで読むことにより、数百万から数億のＤＮＡ断片に対して大量並列に処理する能力を有する。配列決定のメカニズムとしては、機種（システム）毎に個別の原理が使用されており、例えば、光学検出を用いたIllumina社のシステムや、単一分子配列決定システムをとるHelicos True Single Molecule Sequencing（tSMS）システム（例えば、Harris T.D.ら、Science 320: 106-109 [2008年]参照）や、透過電子顕微鏡法（TEM）を用いるHalcyon Molecularのシステムや、ヌクレオチドがＤＮＡ鎖に組み込まれるときに、イオンが放出し得るという特性を利用して配列決定を行うライフテクノロジー社のイオン半導体シーケンサーを使用するシステムにおける各メカニズムを好適に挙げることができる。本発明におけるＮＧＳとしては、１回のＰＣＲ反応で約２９４０００対のプライマーセットを用いて膨大な数のターゲット領域を効率よく増幅させることができる、イオン半導体シーケンサーを選択した。

上記ＮＧＳを用いて配列決定をする場合、前記ＤＮＡ試料は、大量並列配列決定を均一に行うために適した、断片化された多様な長さを持つＤＮＡ断片の混合物であるＤＮＡライブラリとして調製される必要があり、各ＤＮＡ断片は、塩基配列を解析する便宜のために、蛍光マーカーやビーズ等の付加や、検体識別のためのアダプターのライゲーション等の処理がなされることもある。

上記ＤＮＡライブラリの調製方法としては、従来公知の方法を挙げることができるが、ＮＧＳにより配列決定を行う場合は、各ＮＧＳの機種に適したＤＮＡライブラリ作製キットを用いることが好ましく、例えば、ライフテクノロジー社のＮＧＳシステムを用いる場合は、Ｉｏｎｐｌｕｓｆｒａｇｍｅｎｔｌｉｂｒａｒｙｋｉｔ、ＩｏｎＰＧＭ^ＴＭＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ４００Ｋｉｔ、ＩｏｎＡｍｐｌｉＳｅｑ^ＴＭＬｉｂｒａｒｙＫｉｔ２．０、ＩｏｎＰＧＭ^ＴＭＴｅｍｐｌａｔｅＯＴ２４００Ｋｉｔ等；Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＮＧＳシステムを用いる場合は、ＧＥＮＳｅｑＤＮＡＬｉｂｒａｒｙＰｒｅｐＫｉｔ等；を用いる方法を挙げることができる。上記キットを用いる場合は、添付のマニュアルに従ってＤＮＡライブラリを調製することができる。

上記調製されたＤＮＡライブラリは、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）アッセイキット等のアッセイキットを用いて定量することにより、定量ＤＮＡライブラリとして調製することもできる。

上記定量ＤＮＡライブラリは、配列決定前の前処理に付すことが好ましく、配列解析前の前処理としては、例えば、配列決定用チップの作製を挙げることができる。かかる配列決定用チップの作製としては、上記ライブラリをチップ上にセットし、次いで配列決定に必要な試薬キットとテンプレート液等をセットしてチップを配列決定用チップの作製機器にセッティング後、ラン条件を設定することにより、自動でチップローディングを行う処理を挙げることができ、配列決定用チップの作製機器としては、ＩｏｎＣｈｅｆ^ＴＭシステム（ライフテクノロジー社製）を挙げることができる。

上記配列決定用の前処理がされたＤＮＡライブラリは、ＮＧＳ、例えば、上記イオン半導体シーケンサー技術を使用するシステムにより自動配列決定処理が行われるが、かかるシステムにおいては、ヌクレオチドがポリメラーゼによってＤＮＡの鎖に組み込まれる場合、水素イオンが副産物として放出される性質を利用して、イオンセンサを有する高密度アレイを用いて、半導体技術を単純な配列決定化学と組み合わせて、コードされた情報（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）をデジタル情報（０、１）に半導体チップ上で化学的に直接翻訳するという生化学的手順が大規模平行方法によって行われる。例えばある特定のヌクレオチドが、ＤＮＡの鎖に組み込まれる場合、水素イオンが放出され、イオンからの電荷は、溶液のｐＨを変化させるので、ソリッドステートｐＨメータを備えるシーケンサーは、塩基を読み上げ、化学的情報からデジタル情報へ変えることにより配列が決定されうる。決定されうる塩基配列としては、全ゲノム配列や、全エキソン配列を挙げることができるが、時間的な効率の点で全エキソン配列が好ましい。かかるシステムを実行する機種としては、ＩｏｎＰＧＭ^ＴＭシステムやＩｏｎＰｒｏｔｏｎ^ＴＭシステムを例示することができる。

その他、ＭｉＳｅｑシステム（イルミナ社製）、ＨｉＳｅｑシステム（イルミナ社製）、ＧｅｎｏｍｅＡｎａｌｙｚｅｒＩＩｘ（イルミナ社製）、ＧｅｎｏｍｅＳｅｑｕｅｎｃｅｒ−ＦＬＸ（ロシュ社製）等を用いてＮＧＳを行うことも可能であり、これらの操作は、添付マニュアルに従って行うことができる。

上記ＮＧＳによる処理により、生データとして得られた塩基配列データは、一次解析（Base calling）において具体的な塩基情報に変換され、大量の塩基配列断片のデータを得ることができる。二次解析において、かかる大量の塩基配列断片のデータを用いて、標準ゲノム配列へのマッピング、及び、ＰＣＲで生じた重複配列の除去、アダプターの除去、５’末端や３’末端の除去、クォリティの低い配列が連続する箇所の除去等のクォリティトリミングが行われることにより、全長配列データに変換される。これらの解析は、通常使用されるＮＧＳに付属するソフトウェアを使用して行うことができる。

上記二次解析に続く、三次解析においては、ＮＧＳの出力データを高速に解析することにより個々人の遺伝的特性やＳＮＰ、ＳＮＶ、突然変異等が特定される。さらに、決定された配列データを用いて血液由来ＤＮＡ試料とがん由来ＤＮＡ試料との配列比較解析を行うことにより、変異が生殖細胞変異か体細胞変異かを区別することもできる。血液由来ＤＮＡ試料に変異がある場合は、生殖細胞変異であり、がん由来ＤＮＡ試料に変異があって血液由来ＤＮＡ試料に変異がない場合は、体細胞変異であると判定できる。

上記配列決定は、さらにパネル解析を組み合わせて行うこともできる。本発明におけるパネル解析としては、がん遺伝子やがん関連遺伝子等の特定のゲノム領域を増幅し、配列決定をすることにより、ＳＮＶのような低頻度な変異も高感度に検出することができる。具体的には、がん遺伝子及びがん抑制遺伝子をターゲットに設計された２０７ヶ所のプライマーペアが、１チューブのプライマープールにて提供され、２７９０ヶ所の変異を網羅的に探索するのに適しているＩｏｎＡｍｐｌｉＳｅｑ^ＴＭＨｏｔｓｐｏｔＰａｎｅｌ（ライフテクノロジー社製）や、がん遺伝子及びがん抑制遺伝子をターゲットに設計された、約１６０００ヶ所のプライマーペアが、４チューブのプライマープールにて提供され、４０９種のがん関連遺伝子についての検体間比較が可能であるＩｏｎＡｍｐｌｉＳｅｑ^ＴＭＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＣａｎｃｅｒＰａｎｅｌ（ライフテクノロジー社製）による解析を例示することができる。

その他、ヒトｐ５３のコドン１５９部位及び／又はコドン４９部位の１塩基置換（点突然変異）を検出することができる方法を単独で又は併用することにより、被検者から採取した生体試料中のヒトｐ５３のＡ１５９Ｄ変異及び／又はＤ４９Ｈ変異の有無を検出することができ、例えば、ジデオキシヌクレオチドを用いてＤＮＡポリメラーゼの合成を塩基特異的に停止させるサンガー法や、ＤＮＡの伸長反応に伴ってピロリン酸が放出されることを利用したパイロシーケンス法等を挙げることができる。

ヒトｐ５３のコドン４９部位の変異を検出するために用いられるプライマーは、ヒトｐ５３遺伝子の配列情報に基づいて適宜設計し、適当なオリゴヌクレオチド合成装置を用いて適宜作製することができる。例えば、上記サンガー法のプライマーとしては、フォワードプライマー：ＧＣＴＧＣＣＣＴＧＧＴＡＧＧＴＴＴＴＣＴ（配列番号３）を挙げることができ、かかるプライマーは、前記のヒトｐ５３遺伝子のコドン４９部位を含む配列を決定するためのプライマーとして機能し得る限り、その配列において１又は２以上の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。

同様に、ヒトｐ５３のコドン１５９部位の変異を検出するために用いられるプライマーとしては、フォワードプライマー：ＧＴＧＡＧＧＡＡＴＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧ（配列番号６）を挙げることができ、かかるプライマーは、前記のヒトｐ５３遺伝子のコドン１５９部位を含む配列を決定するためのプライマーとして機能し得る限り、その配列において１又は２以上の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

［実施例１］
［全エキソン解析］
（血液由来ＤＮＡ試料の調製）
１６８５人のがん患者について、各患者の血液を３本の採血管（ベノジェクトII真空採血管（滅菌品）、テルモ社製、ＥＤＴＡ−２Ｎａ）に採取し、冷却遠心機（ＡＸ−３２０、TOMY社製）にて、４℃にて１０分間遠心した。スポイトを用いて、３本の採血管からバフィーコート部分を１５ｍＬ遠心チューブ１本に集め、各患者のバフィーコート液とした。

上記各患者のバフィーコート液から、ＱＩＡａｍｐＤＮＡＢｌｏｏｄＭｉｄｉ Kit＃５１１８５（QIAGEN社製）を用いてＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡ溶液をＱｕｂｉｔ（登録商標）アッセイキットを用いて定量し、１６８５人のがん患者について、それぞれ１００ｐＭの血液由来ＤＮＡ試料を調製した。

（がん組織由来ＤＮＡ試料の調製）
上記１６８５人の同一のがん患者から手術で摘出したがん組織を試料として使用した。患者毎にがん組織約１００ｍｇを細断し、細断されたがん組織を溶解するために、プロテアーゼＫを添加し５４℃にて６時間撹拌した後、冷却遠心機（ＡＸ−３２０、TOMY社製）にて、４℃にて１０分間遠心した。上清約１５ｍＬを遠心チューブ１本に入れて、がん組織溶解液とした。

上記がん組織溶解液から、ＱＩＡａｍｐＤＮＡＢｌｏｏｄＭｉｄｉＫｉｔ＃５１１８５を用いてＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡ溶液をＱｕｂｉｔ（登録商標）アッセイキットを用いて定量し、１６８５人のがん患者について、それぞれ１００ｐＭのがん組織由来ＤＮＡ試料を調製した。

（ＤＮＡライブラリの調製）
上記１００ｐＭの血液由来ＤＮＡ試料及び１００ｐＭのがん組織由来ＤＮＡ試料について、それぞれ１０〜１００ｎｇのＤＮＡからＩｏｎＡｍｐｌｉＳｅｑ^ＴＭＬｉｂｒａｒｙキット２．０（サーモフィッシャー社製）を用いて、（１）ターゲット領域の増幅、（２）プライマー配列の除去、（３）検体を識別するためのバーコードアダプタのライゲ―ション、（４）精製を行い、続いて、サーマルサイクラーで増幅し、次いで精製をおこなうことにより、血液由来ＤＮＡライブラリ及びがん組織由来ＤＮＡライブラリを得た。

上記血液由来ＤＮＡライブラリ及びがん組織由来ＤＮＡライブラリをＩｏｎＬｉｂｒａｒｙＱｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎキット（サーモフィッシャー社製)を用いて、Ｑ−ＰＣＲ法にて定量し、同一患者の血液ＤＮＡ由来ライブラリと、がん組織ＤＮＡ由来ライブラリを等量併せて、５０ｐＭになるよう希釈した。希釈したライブラリ、２５μＬを、反応試薬キットであるＩｏｎＰＩＨｉ−ＱＣｈｅｆｋｉｔを用い、自動前処理装置ＩｏｎＣｈｅｆ（サーモフィッシャー社製）にセットし、テンプレート液がロードされたシーケンス用チップを得た。ＩｏｎＰｒｏｔｏｎ（サーモフィッシャー社製)にチップを装着し、ＩｏｎＰＩＨｉ-ＱＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ２００ｋｉｔ（サーモフィッシャー社製）を用いて、エキソン配列決定をおこなった。

（データ解析）
上記配列決定処理により出力された生データについて、ＴｏｒｒｅｎｔＳｕｉｔｅｓｏｆｔｗａｒｅｖｅｒ．４．４（サーモフィッシャー社製)を用いてbase-calling、クォリティトリミング、ヒトの参照配列であるＵＣＳＣｈｇ１９へのマッピングを行った。ｐ５３遺伝子の１１個すべてのエキソンをカバーする１４アンプリコンが増幅された後、ＴｏｒｒｅｎｔＶａｒｉａｎｔＣａｌｌｅｒｓｏｆｔｗａｒｅ（サーモフィッシャー社製)を用いてＵＣＳＣｈｇ１９配列と異なる変異の抽出を行った。さらに、同一患者の「がん組織由来ＤＮＡにおけるＵＣＳＣｈｇ１９配列と異なる変異」から「血液由来ＤＮＡにおけるＵＣＳＣｈｇ１９配列と異なる変異」を差し引いた体細胞特異的変異を得るためにＩｏｎＲｅｐｏｒｔｅｒｖｅｒ．４．４ｓｏｆｔｗａｒｅ（サーモフィッシャー社製)を使用した。以上の方法で、１６８５人のがん患者について血液由来ＤＮＡの変異データ、がん組織由来ＤＮＡの変異データ、及び体細胞特異的変異データを得た。

（ｐ５３遺伝子変異）
がん患者の生殖細胞系列における特異的な変異を探し出すために、１６８５人、一人ひとりの血液由来ＤＮＡのデータを、まず、世界のヒトゲノム配列の標準とされているUniversity of California, Santa Cruz (UCSC)ゲノムブラウザー(hg19版)[Kent WJ, Sugnet CW, Furey TS, Roskin KM, Pringle TH, Zahler AM and Haussler D (2002) The human genome browser at UCSC. Genome Res 12, 996-1006（URL:https://genome.ucsc.edu/）]と比較し、今回の対象患者で認められるｐ５３遺伝子の生殖細胞系列遺伝子多型又は変異であって、かつアミノ酸配列の変化を来す非同期置換１０種を抽出した。これらの多型又は変異には、病的意義を持たない遺伝子多型、ｐ５３異常に由来する遺伝性がんの原因となる既知又は未知の病的変異が含まれている。そこで、これら１０種を以下の公共データベースと比較して既知又は未知の生殖細胞系列病的変異であるか否かを推測した。使用した公共データベースは次のとおりである。（１） dbSNP [Sherry ST, Ward MH, Kholodov M, Baker J, Phan L, Smigielski EM and Sirotkin K (2001) dbSNP: the NCBI database of genetic variation. Nucleic Acids Res 29, 308-311 (URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)], （２） COSMIC [Forbes SA, Beare D, Gunasekaran P, Leung K, Bindal N, Boutselakis H, Ding M, Bamford S, Cole C, Ward S, Kok CY, Jia M, De T, Teague JW, Stratton MR, McDermott U and Campbell PJ (2015) COSMIC: exploring the world's knowledge of somatic mutations in human cancer. Nucleic Acids Res 43, D805-811（URL: http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic）], （３） ClinVar [Landrum MJ, Lee JM, Benson M, Brown G, Chao C, Chitipiralla S, Gu B, Hart J, Hoffman D, Hoover J, Jang W, Katz K, Ovetsky M, Riley G, Sethi A, Tully R, Villamarin-Salomon R, Rubinstein W and Maglott DR (2016) ClinVar: public archive of interpretations of clinically relevant variants. Nucleic Acids Res 44, D862-868 (URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/）], （４） IARC TP53 database [Petitjean A, Mathe E, Kato S, Ishioka C, Tavtigian SV, Hainaut P and Olivier M (2007) Impact of mutant p53 functional properties on TP53 mutation patterns and tumor phenotype: lessons from recent developments in the IARC TP53 database. Hum Mutat 28, 622-629 (URL: http://p53.iarc.fr/)], （５）iJGVD. [Nagasaki M, Yasuda J, Katsuoka F, Nariai N, Kojima K, Kawai Y, Yamaguchi-Kabata Y, Yokozawa J, Danjoh I, Saito S, Sato Y, Mimori T, Tsuda K, Saito R, Pan X, Nishikawa S, Ito S, Kuroki Y, Tanabe O, Fuse N, Kuriyama S, Kiyomoto H, Hozawa A, Minegishi N, Douglas Engel J, Kinoshita K, Kure S, Yaegashi N, ToMMo Japanese Reference Panel Project and Yamamoto M (2015) Rare variant discovery by deep whole-genome sequencing of 1,070 Japanese individuals. Nat Commun 6, 8018 (URL: http://ijgvd.megabank.tohoku.ac.jp/ ). （６） HGVD [Higasa K, Miyake N, Yoshimura J, Okamura K, Niihori T, Saitsu H, Doi K, Shimizu M, Nakabayashi K, Aoki Y, Tsurusaki Y, Morishita S, Kawaguchi T, Migita O, Nakayama K, Nakashima M, Mitsui J, Narahara M, Hayashi K, Funayama R, Yamaguchi D, Ishiura H, Ko WY, Hata K, Nagashima T, Yamada R, Matsubara Y, Umezawa A, Tsuji S, Matsumoto N and Matsuda F (2016) Human genetic variation database, a reference database of genetic variations in the Japanese population. J Hum Genet (2016) doi:101038/jhg201612 (URL: http://www.genome.med.kyoto-u.ac.jp/SnpDB/ )], （７）ExAC [Exome Aggregation Consortium (ExAC) (URL: http://exac.broadinstitute.org) (Version 0.3.1).]

この結果、まず１０種類のうち３種類は遺伝子多型として報告されていたり、すでにリ・フラウメニ症候群関連の遺伝性がん原因遺伝子変異として報告されていたため今回の発明からは除外した。さらに、上記、公共データベース（４）ＩＡＲＣＴＰ５３ｄａｔａｂａｓｅには試験管内実験に基づく変異蛋白の機能が記載されているので、残りの７種類のうち、機能異常が認められる３種、Ｄ４９Ｈ、Ｑ１４４Ｒ、Ａ１５９Ｄの変異に注目し、サンガー法などで変異の存在を確定した。加えて、Ｄ４９Ｈ変異は１６８５例中６例（０．３６％）で認められていること、すべての症例ががんの家族歴を有すること、うち１例はリ・フラウメニ様症候群であることなどの情報から原因遺伝子である可能性が高いと判断した。また、Ａ１５９Ｄ変異は、同時にＤ４９Ｈ変異が存在し、リ・フラウメニ様症候群を呈した症例に認められたため病的意義を有すると考えた。
なお、Ｄ４９Ｈ変異は、上記公共データベースのうち、（２）ＣＯＳＭＩＣ、（４）ＩＡＲＣＴＰ５３ｄａｔａｂａｓｅに生殖細胞系列ではない、がんで初めて発生した体細胞変異症例が８例報告されており、この知見からも細胞がん化への関与が推測される。

また、ある遺伝子において、多型や変異が病的意義を有するか否かの判断には、健常人において比較的、高頻度に認められる遺伝子多型（１％以上）では病的意義を持つ可能性が低いこと、一方、１％未満である変異で、かつ極めて希なものか、さらには、がんに高率に認められる変異である場合には病的意義を持つ可能性が高いことが有用な指標となる。Ｄ４９Ｈ変異は、今回の成績によって、がん患者で０．３６％という高頻度に認められ、そのすべてががんの家族歴を有し、さらに、生殖細胞系列変異を対象とした上記公共データベースのうち日本人を対象とした（５）ｉＪＧＶＤ、（６）ＨＧＶＤにおいては報告がなく（０．１％以下）、唯一、上記公共データベース（７）ＥｘＡＣにおいて、アレル頻度として０．０００８％と極めて出現頻度が低く、かつ、疾患との関連は示されていない報告があるのみである。

次世代ＤＮＡシーケンシング用可視化ソフトウェア（Integrative Genomics Viewer）（J.T. Robinson, H. Thorvaldsdottir, W. Winckler et al., Integrative genomics viewer, Nat. Biotechnol. 29 (2011) 24-26）を用いて、６人の変異の存在を可視化した。結果をIntegrative Genomics Viewer（ＩＧＶ）として図１に示す。６人ともｐ５３のＤ４９Ｈ変異が確認された。

この血液由来ＤＮＡのデータで得られたＤ４９Ｈ変異の存在をがん組織由来ＤＮＡの変異データで確認したところ、１６８５人中、６人において存在した。

（パネル解析）
さらに確認として、がん組織由来ＤＮＡについて、ヒトがん関連４０９遺伝子のコーディング領域をターゲット領域として、対象とする遺伝子上の変異を網羅的に解析するために、パネル解析をおこなった。

１０ｎｇのがん組織ＤＮＡからＩｏｎＡｍｐｌｉＳｅｑ^ＴＭＬｉｂｒａｒｙＫｉｔ２．０及びＩｏｎＡｍｐｌｉＳｅｑＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＣａｎｃｅｒＰａｎｅｌ（いずれもサーモフィッシャー社製）を用いて、ヒトがん関連４０９遺伝子のコーディング領域をターゲット領域として、対象遺伝子上の変異を網羅的に解析した。ターゲット領域の増幅、プライマー配列を除去、検体を識別するためのバーコードアダプタをライゲ―ション後、サーマルサイクラーで増幅して精製をおこない、がん組織由来ＤＮＡライブラリを得た。

上記がん組織由来ＤＮＡライブラリをＩｏｎＬｉｂｒａｒｙＱｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎＫｉｔ（サーモフィッシャー社製)を用いて、Ｑ−ＰＣＲ法にて定量し、１００ｐＭになるよう希釈した。希釈したライブラリ、８μＬを反応試薬キットであるＩｏｎＰＩＨｉ−ＱＯＴ２２００Ｋｉｔ(サーモフィッシャー社製)を用い、自動前処理装置ＩｏｎＣｈｅｆ（サーモフィッシャー社製）にセットし、テンプレート液がロードされたシーケンス用チップを得た。ＩｏｎＰｒｏｔｏｎ（サーモフィッシャー社製)にかかるチップを装着し、ＩｏｎＰＩＨｉ-ＱＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ２００Ｋｉｔ（サーモフィッシャー社製）を用いて、配列決定を行った。

（データ解析）
上記配列決定処理により得られた出力された生データについて、ＴｏｒｒｅｎｔＳｕｉｔｅｓｏｆｔｗａｒｅｖｅｒ．４．４（サーモフィッシャー社製）を用いてｂａｓｅ−ｃａｌｌｉｎｇ，及びクォリティトリミング、及びヒトの参照配列であるＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＣａｎｃｅｒＰａｎｅｌの４０９の標的とするがん関連遺伝子の参照配列へのマッピングを行ない、変異の抽出をおこなった。

上記４０９の標的とするがん関連遺伝子を以下に示す。
PDE4DIP IL7R MMP2 IRF4 AURKB TLR4 ERBB4 PAX7 FH SBDS
MTOR ERCC5 SDHC LPP CKS1B ATRX TCF3 BLNK UBR5
FOXP4 SUFU NBN WT1 MPL KDR TP53 NTRK1 PTEN
CDK6 AFF1 TCF7L1 PDGFRB REL MLL3 EP300 MALT1 MITF
HNF1A EPHA3 SETD2 STK11 FLT1 TGFBR2 LCK MEN1 NUP98
FANCA RAF1 RARA ERG EXT1 TRIM33 NLRP1 MARK4 MYD88
SMAD2 NSD1 PML MAP3K7 FGFR1 ERCC1 MET BAI3 NUP214
BLM AXL CREBBP SDHB ZNF384 GATA3 MN1 MAP2K2 SH2D1A
PTPRD UGT1A1 SGK1 TCF7L2 PDGFB PIK3C2B TFE3 JAK3 JAK1
CSMD3 FGFR2 FLCN ITGA9 ERCC4 KIT PRKAR1A EXT2 NCOA2
GDNF CTNNA1 CYP2D6 EPHA7 STK36 GATA2 HOOK3 ABL2 CCND2
AKT1 LAMP1 JAK2 PIK3R1 GRM8 CDKN2C CYP2C19 MAF SMO
PDGFRA BMPR1A TIMP3 ETV4 TGM7 TET1 MAPK1 FOXP1 IGF2
LRP1B MAML2 EPHB6 TSC1 COL1A1 TLX1 ASXL1 MYH11 BRIP1
AURKC TNK2 IDH1 PTPN11 KDM5C PAX3 PER1 CARD11 PTGS2
SDHD POU5F1 NF1 BIRC5 PALB2 MLL2 SEPT9 CDK12 PIK3CG
WHSC1 GNAS PLCG1 MDM2 DDB2 MLL GUCY1A2 CTNNB1 AKT2
MYCL1 MAP2K1 EGFR NFKB1 PAK3 IKBKB IL21R BCL3 MTRR
LIFR DICER1 SOX11 CBL ITGB3 IKZF1 DNMT3A TCL1A CCNE1
TBX22 TAF1 CIC CD79A BCR CCND1 RUNX1T1 SMUG1 PIK3CA
IGF2R NOTCH2 FLT3 PRKDC ALK EZH2 PSIP1 MSH6 WAS
PMS1 IL2 ERBB3 ATM CDK8 FAS TAF1L BCL11A NUMA1
ESR1 ERBB2 CREB1 NIN SAMD9 SYK ARNT CASC5 DDIT3
MARK1 ADAMTS20 CDK4 CDH1 EP400 DDR2 PLAG1 CD79B
DEK FLI1 CRTC1 IRS2 SMARCB1 CMPK1 DCC CHEK1 SMARCA4
XPO1 FOXL2 LTK MUC1 GNAQ BCL2 NFKB2 MLH1 XPA
HRAS EML4 PTPRT RALGDS PIK3CB FOXO3 MYH9 MAP2K4 ITGB2
PPP2R1A TET2 ING4 IDH2 APC SMAD4 BCL6 CDKN2B NPM1
FGFR4 G6PD AKAP9 CDH11 PIK3CD CDKN2A BCL9 MAPK8 ERCC3
PTCH1 RECQL4 IGF1R TPR BCL10 BRD3 PGAP3 SF3B1 TSHR
MYC KAT6A THBS1 RHOH ATR GNA11 TAL1 JUN CSF1R
ETV1 BCL2L1 BCL11B RNASEL BIRC2 NTRK3 PIK3R2 ABL1 KEAP1
PLEKHG5 NF2 CRBN DPYD GPR124 SSX1 TSC2 FANCF AR
CRKL CDH2 DAXX KDM6A FLT4 ATF1 IL6ST LTF FGFR3
HSP90AB1 NKX2-1 MAGI1 ETS1 TCF12 RAD50 ARID2 KRAS
BCL2L2 MYCN SYNE1 BRAF PAX5 NCOA1 NOTCH1 PPARG AKT3
TNFAIP3 NCOA4 CHEK2 CDH5 FOXO1 PKHD1 MCL1 MUTYH FANCC
PAX8 IKBKE HIF1A TRRAP SOCS1 CDH20 EPHB4 ZNF521 HLF
RET RUNX1 XPC ARID1A MRE11A MBD1 TNFRSF14 HCAR1
EPHB1 RB1 CDC73 KAT6B SOX2 FAM123B SDHA NRAS AURKA
LPHN3 VHL WRN DST BAP1 ROS1 MSH2 CYLD SRC
FBXW7 MDM4 CEBPA GATA1 ERCC2 PBX1 PRDM1 RPS6KA2 FN1
MTR BUB1B PHOX2B PBRM1 FANCG HSP90AA1 ICK MLLT10
RRM1 MAGEA1 FANCD2 PIM1 TRIM24 USP9X TRIP11 MAFB NFE2L2
PMS2 RNF2 NOTCH4 KLF6 BIRC3 RNF213 PARP1 ACVR2A TOP1
POT1 AFF3 MYB FZR1 XRCC2 BTK ITGA10

（結果）
パネル解析の結果、同じ上記６人のがん患者にＤ４９Ｈ変異があることを確認した。

上記６人の詳細を以下の表１に記載する。６人のがんの種類はそれぞれ骨肉腫（Osteosarcoma）、乳がん（Breast carcinoma）、舌扁平上皮がん（Squamous cell carcinoma of the tongue）、盲腸腺がん（Adenocarcinoma of the cecum）、肝細胞がん（Hepatocellular carcinoma）、胃がん（Gastric carcinoma）であった。Ｄ４９Ｈの変異はいずれもヘテロ型であった。また、これら６人は、すべて家族歴を有するがん患者であった。また、患者番号１の１２歳の骨肉腫の少年は、ｐ５３遺伝子においてＤ４９Ｈ変異のみならず、コドン１５９においてもアラニンからアスパラギン酸へ置換された変異（Ａ１５９Ｄ）を有していた。なお、表１に示す６人のほか、追加で解析した７９５人のがん患者のうち１人がＤ４９Ｈ変異を有することをさらに確認している。

これまでｐ５３の生殖細胞変異が原因となるリ・フラウメニ症候群、リ・フラウメニ様症候群、家族性腫瘍において、変異の場所は、ＤＢＤに集中しており、Ｄ４９Ｈ変異の報告は存在しない。また、ｐ５３の生殖細胞変異が原因となるリ・フラウメニ症候群、リ・フラウメニ様症候群、家族性腫瘍においてＡ１５９Ｄについての報告はない。

（サンガー法）
サンガー法により、配列決定を行い、Ｄ４９Ｈ変異を確認した。使用したプライマー配列は、以下のとおりである。

フォワードプライマー：ＧＣＴＧＣＣＣＴＧＧＴＡＧＧＴＴＴＴＣＴ（配列番号３）
リバースプライマー：ＧＴＧＧＡＴＣＣＡＴＴＧＧＡＡＧＧＧＣＡ（配列番号４）

ＰＣＲの反応液は以下のとおりである。
ＰＣＲ反応液（Reaction mixture）最終濃度
ＨｏｔＳｔａｒＴａｑマスターミックス，２× １２．５μＬ
フォワードプライマー（１０μＭ）０．５μｌ０．２μＭ
リバースプライマー（１０μＭ）０．５μｌ０．２μＭ
ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅｗａｔｅｒ１０．５μＬ
テンプレートＤＮＡ（５０ｎｇ／μｌ）１．０μＬ
総容量２５．０μＬ

サーマルサイクラーの条件は以下のとおりである。
Initial PCR activation step １５分９５℃
3-step cycling:
Denaturation １分９４℃
Annealing １分６０℃
Extension １分７２℃
Number of cycles ３５サイクル
Final extension １０分７２℃

得られたアンプリコン（増幅産物）の配列解析は、タカラバイオ社に委託した。使用したサンガーシーケンシング用のプライマーは、フォワードプライマー: ＧＣＴＧＣＣＣＴＧＧＴＡＧＧＴＴＴＴＣＴ（配列番号３）を用いた。その結果、６例ともコドン４９の位置においてｇａｔからＣａｔへの変異が確認された。

アンプリコンの配列は、表１に示す患者番号１〜６の６人のいずれにおいても配列番号５に示される配列であった。なお、以上の結果は、追加で特定されたＤ４９Ｈの変異を有する患者１名についても同様に適用できるものであった。

GTGGATCCATTGGAAGGGCAggcccaccacccccaccccaaccccagccccctagcagagacctgtgggaagcgaaaattccatgggactgactttctgctcttgtctttcagacttcctgaaaacaacgttctggtaaggacaagggttgggctggggacctggagggctggggacctggagggctggggggctggggggctgaggacctggtccctgactgctcttttcacccatctacagtcccccttgccgtcccaagcaatggatgatttgatgctgtccccggacCatattgaacaatggttcactgaagacccaggtccagatgaagctcccagaatgccagaggctgctccccccgtggcccctgcaccagcagctcctacaccggcggcccctgcaccagccccctcctggcccctgtcatcttctgtcccttcccAGAAAACCTACCAGGGCAGC（配列番号５）

患者番号１で検出したＡ１５９Ｄについて配列決定を行った。使用したプライマー配列は、以下のとおりである。

フォワードプライマー：ＧＴＧＡＧＧＡＡＴＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧ（配列番号６）
リバースプライマー：ＧＣＡＣＡＣＣＴＡＴＡＧＴＣＣＣＡＧＣＣ（配列番号７）

得られたアンプリコン（増幅産物）の配列解析は、タカラバイオ社に委託した。使用したサンガーシーケンシング用のプライマーは、フォワードプライマー: ＧＴＧＡＧＧＡＡＴＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧ（配列番号６）を用いた。その結果、以下の配列番号８に示す通り、ｇｃｃからｇＡｃの変異が検出された。これはコドン１５９の位置におけるアラニンからアスパラギン酸への置換に相当する。

GCACACCTATAGTCCCAGCCacttaggaggctgaggtgggaagatcacttgaggccaggagatggaggctgcagtgagctgtgatcacaccactgtgctccagcctgagtgacagagcaagaccctatctcaaaaaaaaaaaaaaaaaagaaaagctcctgaggtgtagacgccaactctctctagctcgctagtgggttgcaggaggtgcttacgcatgtttgtttctttgctgccgtcttccagttgctttatctgttcacttgtgccctgactttcaactctgtctccttcctcttcctacagtactcccctgccctcaacaagatgttttgccaactggccaagacctgccctgtgcagctgtgggttgattccacacccccgcccggcacccgcgtccgcgAcatggccatctacaagcagtcacagcacatgacggaggttgtgaggcgctgcccccaccatgagcgctgctcagatagcgatggtgagcagctggggctggagagacgacagggctggttgcccagggtccccaggCCTCTGATTCCTCAC（配列番号８）

［実施例２］
［ｐ５３変異型遺伝子における転写活性］
（ｐ５３変異型遺伝子発現プラスミドの作製）
Ｄ４９Ｈ及びＡ１５９Ｄの変異がｐ５３の転写活性にどのような影響をそれぞれ与えるかについて、ｐ５３を欠失したｐ５３ｎｕｌｌの骨肉腫細胞株であるＳａｏｓ−２細胞株を用いてレポーターアッセイを行うことにより検討を行った。以下に示す６種類の変異型ｐ５３を培養細胞において発現可能なプラスミドを作製し検討に用いた。各プラスミドは、１１８２塩基からなる野生型ｐ５３配列を含み、ヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター依存的に野生型ｐ５３を発現可能な、ＥＸ−Ｂ０１０５−Ｍ０２プラスミド（Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ社製）をテンプレートに、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＢａｓａｌキット（タカラバイオ株式会社製）を用い、以下の表２に示すプライマーとＰＣＲ反応を行うことで作製した。そしてＰＣＲ反応産物を、形質転換受容性の大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉＨＳＴ０８ＰｒｅｍｉｕｍＣｏｍｐｅｔｅｎｔＣｅｌｌｓ（タカラバイオ株式会社製）に導入し、アンピシリン含有ＬＢ寒天培地において大腸菌コロニーを単離することによりクローン化した。各クローンをアンピシリン含有ＬＢ培地において培養し回収後、ＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（株式会社キアゲン製）を用いてプラスミドを抽出し、そのプラスミドを用いてサンガー法による目的変異の導入の確認を行った。

ＰＣＲの反応液は以下のとおりである。
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘＰｒｅｍｉｘ，２×：５．０μＬ
フォワードプライマー（５ｐｍｏｌ／μＬ）：０．５μＬ
リバースプライマー（５ｐｍｏｌ／μＬ）：０．５μＬ
ＤＮａｓｅ−ｆｒｅｅｗａｔｅｒ：４．０μＬ
ＥＸ−Ｂ０１０５−Ｍ０２プラスミド（２０ｐｇ／μＬ）：１．０μＬ
総容量：１１．０μＬ
サーマルサイクラーの条件は以下のとおりである。
９８℃ ２０秒
９８℃ １０秒^＊
５５℃ ２０秒^＊
７２℃ ２分^＊
^＊４０サイクル
７２℃ ２分

プラスミドの配列解析は、ユーロフィンジェノミクス株式会社に委託した。使用したサンガーシーケンシング用のプライマーは、ｐＥＺ−Ｍ０２−ＳｅｑＦ：ＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＣＴＣＴＡＧＣ（配列番号２１）、ｐＥＺ−Ｍ０２−ＳｅｑＲ：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ（配列番号２２）、及び、ＴＰ５３−ＳＲ３：ＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＴＴＧＴＴＧ（配列番号２３）を用いた。

（ｐ５３変異型遺伝子）
今回の検討に用いた６種類のｐ５３変異型遺伝子は以下のとおりである。Ｄ４９Ｈ及びＡ１５９Ｄ以外の４種類の変異は実験のコントロールとして用いた。
１）Ｄ４９Ｈ：野生型のヒトｐ５３遺伝子のＴＡＤ２に存在する変異であって、配列番号１に示される配列において、アスパラギン酸をコードする１４５〜１４７番目の塩基「ＧＡＴ」がヒスチジンをコードする「ＣＡＴ」に置換された変異である。
２）Ａ１５９Ｄ：野生型のヒトｐ５３遺伝子のＤＢＤに存在する変異であって、配列番号１に示される配列において、アラニンをコードする４７５〜４７７番目の塩基「ＧＣＣ」がアスパラギン酸をコードする「ＧＡＣ」に置換された変異である。
３）Ｓ４６Ａ：野生型のヒトｐ５３遺伝子のＴＡＤ２に存在する変異であって、配列番号１に示される配列において、セリンをコードする１３６〜１３８番目の塩基「ＴＣＣ」がアラニンをコードする「ＧＣＣ」に置換された変異である。この部位のリン酸化は、アポトーシス誘導において重要である。
４）Ｐ４７Ｓ：野生型のヒトｐ５３遺伝子のＴＡＤ２に存在する変異であって、配列番号１に示される配列において、プロリンをコードする１３９〜１４１番目の塩基「ＣＣＧ」がセリンをコードする「ＴＣＧ」に置換された変異である。活性化ｐ５３はシスチン／グルタミン酸交換輸送体（ｘＣＴ）の発現を抑制することにより、細胞内の酸化ストレスに対する感受性が高くなり、酸化ストレス存在下における細胞死が誘導（フェロトーシス）されることが知られているが、Ｐ４７Ｓは、ｐ５３のフェロトーシス誘導能のみを低下させることが知られている。
５）Ｄ４９Ａ：野生型のヒトｐ５３遺伝子のＴＡＤ２に存在する変異であって、配列番号１に示される配列において、アスパラギン酸をコードする１４５〜１４７番目の塩基「ＧＡＴ」がアラニンをコードする「ＧＣＴ」に置換された変異である。かかる変異は、ｐ５３と結合するＣＲＥＢ binding proteinとのＮＣＢＤドメインとの相互作用に影響を与える変異である。
６）Ｒ１７５Ｈ：野生型のヒトｐ５３遺伝子のＤＢＤに存在する変異であって、配列番号１に示される配列において、アルギニンをコードする５２３〜５２５番目の塩基「ＣＧＣ」がヒスチジンをコードする「ＣＡＣ」に置換された変異である。かかる変異は、腫瘍において、極めて高い頻度で検出されるＤＢＤに存在する変異である。

（ｐ５３変異型遺伝子における転写活性測定を目的としたレポーターアッセイのためのトランスフェクション）
本実験では、実験陰性コントロールプラスミドｐＲｅｃｅｉｖｅｒ−Ｍ０２ＣＴ（ｐ５３配列を含まない空のプラスミド、Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ社製）、野生型ｐ５３発現プラスミド（ＥＸ−Ｂ０１０５−Ｍ０２プラスミド）及び、作製した６種類の変異型ｐ５３発現プラスミドの、計８種類の遺伝子発現用プラスミドを用いた。上記各遺伝子発現プラスミド５００ｎｇと、２．５μＬのｐ５３ｒｅｐｏｒｔｅｒｍｉｘ（ｐ５３ＴＲＥ−ＴＡＴＡｂｏｘ−ホタルルシフェラーゼプラスミド及びウミシイタケルシフェラーゼを含む、株式会社キアゲン製）のプラスミド混合溶液、及び２．５μＬのｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｍｉｘ（ｐ５３ＴＲＥ配列を含まない空のホタルルシフェラーゼレポータープラスミド及びウミシイタケルシフェラーゼを含む、株式会社キアゲン製）のプラスミド混合溶液の、２種類のプラスミド混合溶液を上記８種類の各遺伝子発現プラスミドについて準備した。計１６種類のプラスミド混合溶液それぞれに、１．５μＬのＰ３０００溶液（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を加え、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を加えることで合計２５μＬにあわせた後に、３０分間室温にて静置した。各プラスミド混合溶液について１．５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００溶液（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）と、２３．５μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を混ぜ合わせたＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ混合溶液を準備し、上記各プラスミド混合溶液に加えゆっくりと混ぜ合わせた後に、１０分間室温にて静置しトランスフェクション溶液とした。この全量５０μＬの各トランスフェクション溶液を、２４ウエルプレート（コーニング）上で１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化したウシ胎児血清を含むロズウェルパーク記念研究所培地１６４０（ＲＰＭＩ１６４０、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を用いて２４時間培養したＳａｏｓ−２細胞の１ウエルに対し滴下することでトランスフェクション処理を行った。このトランスフェクションに使用した細胞は、前日に８×１０^４個のＳａｏｓ−２細胞を、０．５ｍＬの１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化したウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した細胞懸濁液を、２４ウエルプレートの各ウエルに分注することにより準備した。

（細胞培養）
上記リポフェクション処理後２４時間培養し、トランスフェクション溶液の除去のため培地交換を行った。さらに２４時間培養し、培養後の各細胞を、細胞における２種類のルシフェラーゼ活性を、安定な発光シグナルとして定量することができる、デュアル−グロルシフェラーゼ・レポーターシステム（Ｄｕａｌ−ＧｌｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＲｅｐｏｒｔｅｒＳｙｓｔｅｍ）（Ｐｒｏｇｅｍａ社製）を用いるレポーターアッセイ用の細胞試料として用いた。

（ルシフェラーゼアッセイ）
培地除去後、各ウエルに１００μＬのＲｅｐｏｒｔｅｒＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を加え、凍結・融解を３回繰り返すことにより細胞を溶解した。細胞溶解液８０μＬを９６ウエルＰＣＲプレート（日本ジェネティクス株式会社製）に移し、４６０ｇで２分間遠心することで細胞溶解に伴い生じた残渣を沈殿させた。上清５０μＬを化学発光測定用の９６ウエルプレート（コーニング社製）に移し、そこに５０μＬのＤｕａｌ−ＧｌｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を加え、シェーカーを用いて１５分間室温で撹拌した後に、ＧＬＯＭＡＸｍｕｌｔｉｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてホタルルシフェラーゼの発光値を測定した。次に、５０μＬのＤｕａｌ−ＧｌｏＳｔｏｐ＆ＧｌｏＲｅａｇｅｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を加え、シェーカーを用いて１５分間室温で撹拌することで、ホタルルシフェラーゼの消光とウミシイタケルシフェラーゼの発光反応を行い、ＧＬＯＭＡＸｍｕｌｔｉｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍでその発光値を測定した。結果を図４に示す。なお、図４のＹ軸（Ｌｕｃ/ＲＬｕｃ）は、各プラスミド導入Ｓａｏｓ−２細胞の存在下で得られる、ホタルルシフェラーゼ活性（Ｌｕｃ）について、ウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）による結果をデータの内部標準コントロール値として割り、標準化した蛍光値を転写活性として表した。

（結果）
図４から明らかなとおり、Ｄ４９Ｈ変異型ｐ５３の転写活性は、野生型ｐ５３の転写活性と比較して、約４５％低かった。一方、Ａ１５９Ｄ変異型ｐ５３の転写活性は、ほとんど検出されなかった。

なお、悪性腫瘍において極めて高い頻度で検出されるｐ５３におけるＲ１７５Ｈの変異は、ｐ５３の立体構造の安定性に影響を与えることにより、完全にｐ５３の機能を失活させることが知られている（Oncogene (2007) 26, 2226-2242等）。かかるＲ１７５Ｈ変異を導入したＳａｏｓ−２細胞株においては、その転写活性が完全に消失することが示された。上記Ａ１５９Ｄ変異型ｐ５３においても、Ｒ１７５Ｈ変異型ｐ５３における転写活性の低下と同程度の、顕著な転写活性の低下がみられた。

Ｓ４６Ａ変異型ｐ５３においては、その転写活性は、野生型ｐ５３と比較して、約２０％低下した。Ｐ４７Ｓ変異型ｐ５３においては、その転写活性は、野生型ｐ５３と比較して、約１２％低下した。Ｄ４９Ａ変異型ｐ５３においては、その転写活性は、野生型ｐ５３と比較して、約２０％低下しており、Ｄ４９Ｈ以外のＴＡＤ２の変異を有する細胞においては若干の転写活性の低下が確認された。

なお、この実施例２の各変異がｐ５３の転写活性に与える影響についての検討は、Ｓａｏｓ−２細胞と同じｐ５３ｎｕｌｌ細胞株である肺がんの由来のＮＩＨ−Ｈ１２９９細胞を用いて同様の実験方法で行った。Ａ１５９Ｄ変異型ｐ５３においては、その転写活性の消失が観察された。Ｄ４９Ｈ変異型ｐ５３では、野生型ｐ５３に比べ約４０％の転写活性の低下が観察された。両ｐ５３ｎｕｌｌ細胞株を用いた転写活性測定において、Ｄ４９Ｈ変異型ｐ５３及びＡ１５９Ｄ変異型ｐ５３は一致した結果を示した（データ示さず）。

［実施例３］
［核移行についての検討］
上記、Ｄ４９Ｈ変異型ｐ５３及びＡ１５９Ｄ変異型ｐ５３における転写活性の低下が、核移行頻度の低下に起因するものであるか否かについて確認するため、ｐ５３ｎｕｌｌであるＳａｏｓ−２細胞株においてＡ１５９Ｄ変異型ｐ５３、Ｄ４９Ｈ変異型ｐ５３及び野性型ｐ５３を一過性発現させ、それぞれのｐ５３タンパクの細胞内の局在を免疫化学組織染色により検討を検討した。プラスミドｐＲｅｃｅｉｖｅｒ−Ｍ０２ＣＴを陰性コントロールとして使用した

４ウエルのＮｕｎｃＬａｂ−ＴｅｋＣｈａｍｂｅｒＳｌｉｄｅＳｙｓｔｅｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）の各ウエルに、８×１０^４個のＳａｏｓ−２細胞を、０．５ｍＬの１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化したウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した細胞懸濁液を分注し２４時間培養した。５００ｎｇの上記各変異型ｐ５３発現プラスミド、野生型ｐ５３発現プラスミド、又はｐＲｅｃｅｉｖｅｒ−Ｍ０２ＣＴプラスミドの各ＤＮＡ溶液に、１μＬのＰ３０００溶液（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を加え、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を加えることで合計２５μＬにあわせた後に、３０分間室温にて静置した。この調製した各プラスミド溶液それぞれについて１．５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００溶液（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）と、２３．５μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を混ぜ合わせたＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ混合溶液を準備し、上記各プラスミド溶液に加えゆっくりと混ぜ合わせた後に、１０分間室温にて静置しトランスフェクション溶液とした。この全量５０μＬの各トランスフェクション溶液を、前日より４ウエルのＮｕｎｃＬａｂ−ＴｅｋＣｈａｍｂｅｒＳｌｉｄｅＳｙｓｔｅｍ上で培養したＳａｏｓ−２細胞の１ウエルに対し滴下することでトランスフェクション処理を行った。その後２４時間培養し、トランスフェクション溶液除去のための培地交換を行った後、さらに２４時間培養し固定した細胞を免疫化学組織染色に供した。

上記のとおりトランスフェクションを行ったチャンバースライドの各ウエルに、５００μＬの４％パラホルムアルデヒド溶液を分注し、室温で３０分間静置することで細胞の固定を行った。パラホルムアルデヒド溶液を除去後ＰＢＳで３回洗浄を行った後に、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ溶液を各ウエルに５００μＬ分注し、室温で５分間静置することで細胞の浸透処理を行った。ＰＢＳで３回洗浄を行った後に、５％ウマ血清溶液を分注し、室温で５分間静置することでブロッキングを行った。抗ｐ５３モノクローナル抗体（ＣｌｏｎｅＤＯ−７、Ａｇｉｌｅｎｔ社製）をＡｎｔｉｂｏｄｙＤｉｌｕｅｎｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）溶液を用いて１００倍希釈することで１次抗体溶液を準備し、２００μＬずつ各ウエルに分注した後に、室温で１２時間以上静置することで抗原抗体反応を行った。ＰＢＳで３回洗浄後、ＨＲＰ（西洋わさびペルオキシダーゼ）標識された二次抗体Ｅｎｖｉｓｉｏｎ+ Ｓｙｓｔｅｍ− ＨＲＰＬａｂｅｌｌｅｄＰｏｌｙｍｅｒＡｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）溶液をスライド上にマウントし、室温で１時間反応させた。その後ＰＢＳで３回洗浄した後に、スライドを過酸化水素水とＤＡＢ（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）および基質緩衝液（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）の混合液に浸し、４〜５分間発色反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ヘマトキシリン（ＨＥ）で２〜３分間核染色を行い、スライドを流水で１分間洗浄した。結果を図５に示す。

（結果）
図５から明らかなとおり、上記各細胞において免疫組織染色を行った結果、ｐ５３タンパク質が茶色に染色された。ＨＥにより青色に染色されている部分が核である。野生型ｐ５３だけでなく、Ａ１５９Ｄ変異型ｐ５３及びＤ４９Ｈ変異型ｐ５３を発現させた細胞において、細胞質だけでなく特に核内において強くｐ５３の染色が観察された。この結果より、核移行が、Ｄ４９Ｈ変異型ｐ５３及びＡ１５９変異型ｐ５３において、野生型ｐ５３と同程度に行われていることが確認された。したがって、Ｄ４９Ｈ変異型ｐ５３及びＡ１５９変異型ｐ５３において確認された転写活性の低下は、核移行頻度の相違によるものではなく、各変異により引き起こされるｐ５３タンパク質の機能変性に基づくものである可能性が大きいと判断した。

［実施例４］
［ｐ５３各変異型のイムノブロッティング］
各変異型ｐ５３における、ｐ５３のリン酸化やｐ５３下流の遺伝子の発現への影響について評価を行うため、イムノブロッティングを行った。

６ウエルプレート（コーニング製）の各ウエルに、４×１０^５個のＳａｏｓ−２細胞を、２ｍＬの１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化したウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した細胞懸濁液を分注し２４時間培養した。２５００ｎｇの各変異型ｐ５３発現プラスミド（Ｄ４９Ｈ，Ａ１５９Ｄ，Ｓ４６Ａ，Ｐ４７Ｓ，Ｄ４９Ａ及びＲ１７５Ｈ）、野生型ｐ５３発現プラスミド、又は陰性コントロール用のｐＲｅｃｅｉｖｅｒ−Ｍ０２ＣＴプラスミドの各ＤＮＡ溶液に、５μＬのＰ３０００溶液（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を加え、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を加えることで合計１２５μＬにあわせた後に、３０分間室温にて静置した。この調製した各プラスミド溶液それぞれについて７．５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００溶液（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）と、１１７．５μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を混ぜ合わせたＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ混合溶液を準備し、上記各プラスミド溶液に加えゆっくりと混ぜ合わせた後に、１０分間室温にて静置しトランスフェクション溶液とした。この全量２５０μＬの各トランスフェクション溶液を、前日より６ウエルプレート上で培養したＳａｏｓ−２細胞の１ウエルに対し滴下することでトランスフェクション処理を行った。その後２４時間培養し、トランスフェクション溶液除去のための培地交換を行った後、さらに２４時間培養した。各ウエルから培地除去後、１ｍＬの氷冷ＰＢＳで洗浄した後に、５００μＬの氷冷ＰＢＳを再度加えＣｅｌｌＬｉｆｔｅｒ（コーニング社製）を用いて細胞を剥離した後に、遠心分離して得た細胞ペレットに、５６μＬのＬｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒｍｉｘ（Ｍ−ＰＥＲｍａｍｍａｌｉａｎｐｒｏｔｅｉｎｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｒｅａｇｅｎｔに１／５０量のＥＤＴＡ−ｆｒｅｅＨａｌｔｐｒｏｔｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｃｏｃｋｔａｉｌ及びＨａｌｔｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｃｏｃｋｔａｉｌを加えた溶液（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を加え、氷上にて４５分間静置することで細胞を溶解しタンパク質溶液を調製した。タンパク質量は、ＢＣＡｐｒｏｔｅｉｎａｓｓａｙｒｅａｇｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を用いて測定し、Ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒｍｉｘを加えることで、０．５μｇ／μＬのタンパク質溶液に調製した。２０μＬ（１０μｇ）のタンパク質溶液を１０％のｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離した後に、ニトロセルロースシート（バイオ・ラッドラボラトリーズ株式会社製）に転写した。次に、ニトロセルロースシートをＴｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ−Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ、ＣＳＴジャパン株式会社製）で調製した５％スキムミルク又は５％ウシ血清アルブミン溶液に、室温で１時間浸すことでブロッキングした後に、５％スキムミルク又は５％ウシ血清アルブミン溶液で希釈した一次抗体溶液に１２時間以上４℃で浸漬することで抗原抗体反応を行った。ＴＢＳＴにて常温で３回洗浄後、５％スキムミルク溶液で希釈したＨＲＰ（西洋わさびペルオキシダーゼ）標識された二次抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）溶液に室温で１時間浸漬した。ＴＢＳＴにて常温で５回洗浄後、抗原抗体反応のシグナルをＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＷｅｓｔＰｉｃｏＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＳｕｂｓｔｒａｔｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を用いて発光させ、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔＬＡＳ４０００ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）を用いて検出した。結果を図６に示す。

（一次抗体）
ｐ５３、４６番目のセリン残基がリン酸化したｐ５３、ｐ２１のタンパク質発現レベルを以下の一次抗体を用いて検出した。β−アクチンは、陽性コントロールとして用いている。
ｐ５３抗体：ｐ５３（７Ｆ５）ＲａｂｂｉｔｍＡｂ（２５２７、ＣＳＴジャパン株式会社）
４６番目のセリン残基がリン酸化したｐ５３抗体：Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ５３（Ｓｅｒ４６）Ａｎｔｉｂｏｄｙ（２５２１、ＣＳＴジャパン株式会社）
ｐ２１抗体:ｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１（１２Ｄ１）ＲａｂｂｉｔｍＡｂ（２９４７、ＣＳＴジャパン株式会社）
β−アクチン抗体:β−ＡｃｔｉｎＡｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃ４）（ｓｃ−４７７７８、ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）

（結果）
各ｐ５３タンパク質の発現量については、図６から明らかなとおり、野生型ｐ５３及び各変異型ｐ５３の発現量は、ほぼ同等であった。

４６番目のセリン残基のリン酸化は、ｐ５３のアポトーシス誘導において重要な翻訳後修飾であることが報告されている。Ｄ４９Ｈ変異の近傍に位置することから、４６番目のセリン残基のリン酸化への影響について検討を行った。４６番目のセリン残基がリン酸化されたｐ５３タンパク質の発現量については、Ｄ４９Ｈ変異型ｐ５３、Ａ１５９Ｄ変異型ｐ５３、Ｄ４９Ａ変異型ｐ５３、Ｒ１７５Ｈ変異型ｐ５３においては、野生型ｐ５３における発現量とほぼ同等であった。一方、４６番目のセリン残基がアラニンに置換されているＳ４６Ａ変異型ｐ５３と４７番目のプロリン残基がセリンに置換されているＰ４７Ｓ変異型ｐ５３においては発現量が低下していた。かかる結果により、コドン４６及び４７における変異は、これまでの報告通り４６番目のセリン残基のリン酸化に影響を与える変異であることが確認された。一方で、Ｄ４９Ｈ変異及びＡ１５９Ｄ変異は、４６番目のセリン残基のリン酸化に影響を与える変異ではないことが明らかになった。

ｐ２１は、ｐ５３の活性化に伴い発現が増加する主要なｐ５３制御下にあるタンパクであり、セルサイクルを停止させる働きをもつ。そこで、各変異のｐ２１の発現への影響を評価した。ｐ２１タンパク質の発現量については、図６から明らかなとおり、Ｄ４９Ｈ変異型ｐ５３、Ｓ４６Ａ変異型ｐ５３、Ｐ４７Ｓ変異型ｐ５３、及びＤ４９Ａ変異型ｐ５３においては、野生型ｐ５３における発現量とほぼ同等であった。Ａ１５９Ｄ変異型ｐ５３においては、ｐ２１タンパク質の発現がほとんど観察されなかった。かかる結果は、複数のがん腫において高頻度で認められるｐ５３の機能失活型変異Ｒ１７５Ｈ変異型ｐ５３と一致するものである。この結果は、Ａ１５９Ｄ変異及びＲ１７５Ｈ変異が、ｐ５３の下流のセルサイクルの制御に影響を与えることを示している。

［実施例５］
［細胞増殖試験］
ｐ５３ｎｕｌｌの細胞株（ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞）では、ネオマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドを用いて野生型のｐ５３をトランスフェクションし、セレクションマーカーである構成物質Ｇ４１８（ネオマイシン誘導体）で処理すると、ネオマイシン耐性遺伝子が含まれているにも関わらず、ｐ５３によるアポトーシス誘導が起きることが報告されている。また、遺伝子変異の細胞増殖への影響を評価する方法として、対象変異を発現するプラスミド（ネオマイシン耐性遺伝子を有する）をトランスフェクション後セレクションマーカーである抗生物質Ｇ４１８で２〜３週間培養し、その際のコロニー形成数で評価する方法が報告されている。かかる知見を前提に、以下の細胞増殖試験を行った。

本実験で用いている遺伝子発現用プラスミドもセレクションマーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を有する。６ウエルプレート（コーニング社製）の各ウエルに、４×１０^５個のＳａｏｓ−２細胞を、２ｍＬの１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化したウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した細胞懸濁液を分注し２４時間培養した。２５００ｎｇの各ｐ５３変異型遺伝子発現プラスミド（Ｄ４９Ｈ，Ａ１５９Ｄ，Ｓ４６Ａ，Ｐ４７Ｓ，Ｄ４９Ａ及びＲ１７５Ｈ）、ｐ５３野生型遺伝子発現プラスミド、又は陰性コントロール用のｐＲｅｃｅｉｖｅｒ−Ｍ０２ＣＴプラスミドの各ＤＮＡ溶液に、５μＬのＰ３０００溶液（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を加え、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を加えることで合計１２５μＬにあわせた後に、３０分間室温にて静置した。この調製した各プラスミド溶液それぞれについて７．５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００溶液（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）と、１１７．５μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を混ぜ合わせたＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ混合溶液を準備し、上記各プラスミド溶液に加えゆっくりと混ぜ合わせた後に、１０分間室温にて静置しトランスフェクション溶液とした。この全量２５０μＬの各トランスフェクション溶液を、前日より６ウエルプレート上で培養したＳａｏｓ−２細胞の１ウエルに対し滴下することでトランスフェクション処理を行った。その後４８時間培養した後に、Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を加え細胞を剥離し細胞数の計測を行った。細胞濃度を３．６×１０^４個／ｍＬに調整し、１ｍＬを２５ｃｍ^２フラスコ（コーニング社製）に入れ、そこに４ｍＬの１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化したウシ胎児血清及び２ｍｇのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇ４１８、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）含有ＲＰＭＩ１６４０培地を分注した。これによりＧ４１８の終濃度は０．４ｍｇ／ｍＬになる。そこから１９日間培養した後に、ＰＢＳで洗浄し、クリスタルバイオレット溶液による固定・染色を行い、コロニー数の計測を行った。結果を図７（ａ）及び（ｂ）に示す。

（結果）
図７（ａ）及び（ｂ）から明らかなとおり、Ｄ４９Ｈ変異型ｐ５３、Ｄ４９Ａ変異型ｐ５３、Ｓ４６Ａ変異型ｐ５３、及びＰ４７Ｓ変異型ｐ５３の各ｐ５３のＴＡＤ２上の変異型ｐ５３は、野生型ｐ５３同様にほとんどコロニーは形成されなかった。一方、Ａ１５９変異型ｐ５３及びＲ１７５Ｈ変異型ｐ５３においては、多数のコロニーが確認され、それらのコロニー数は、Ｅｍｐｔｙ株よりも多いことが確認された。

（考察）
Ｄ４９Ｈ変異型ｐ５３、Ｄ４９Ａ変異型ｐ５３、Ｓ４６Ａ変異型ｐ５３、及びＰ４７Ｓ変異型ｐ５３の各変異型ｐ５３におけるコロニー形成数は少なく、野生型ｐ５３と同等のアポトーシス誘導に関する機能を維持していると判断した。一方、コロニー形成数が多かったＡ１５９変異型ｐ５３及びＲ１７５Ｈ変異型ｐ５３においては、かかる機能が失活しており、アポトーシスが起こらないと考えられる。上記結果より、Ａ１５９Ｄ変異型ｐ５３は、同じくＤＢＤ上の変異を有するＲ１７５Ｈ変異型ｐ５３同様多数のコロニーが確認されたことから、Ａ１５９Ｄ変異型ｐ５３及びＲ１７５Ｈ変異型ｐ５３は、アポトーシス誘導能が顕著に低いという点で、がんの発生及びがんの進展に影響を与える変異である可能性が高いことを示唆している。

（まとめ）
以上のとおり、Ａ１５９Ｄ変異型ｐ５３が導入された細胞においては、完全なる転写活性の喪失と細胞増殖の促進が示された。これらの結果は、複数のがん種において高頻度で認められるＲ１７５Ｈのｐ５３の機能失活型変異の表現型と一致していた。また、今回の検討で確認されたＡ１５９Ｄ変異による、ｐ５３機能の喪失は、当該変異が、リ・フラウメニ症候群の主要な原因の一つの変異である可能性が高いことを示唆している。一方で、Ｄ４９Ｈ変異においてはＡ１５９Ｄ変異型ｐ５３のような顕著な表現型への影響を観察されなかったものの、野生型ｐ５３に比べ約４０％の有意な転写活性の低下が認められた。

［実施例６］
［Ｄ４９Ｈ変異型ｐ５３と野生型ｐ５３における、結合親和性の考察］
これまでに報告されている２複合体の立体構造としては、以下の６種類を例示することができる。
（１）Ｘ−ｒａｙにより解析された複合体
１）複製タンパク質Replication Protein A（ＲＰＡ）との複合体
（２）ＮＭＲにより解析された複合体
１）Ｔｆｂ１（transcription factorｂ１）との複合体
２）基本転写因子の一つであるtranscription factor for polymerase II（ＴＦＩＩＨ）との複合体
３）転写を調節するコアクチベーターとよばれる因子であるＣＲＥＢ−binding protein（ＣＢＰ）との複合体
４）転写を調節するコアクチベーターとよばれる因子であるｐ３００との複合体
５）非ヒストン核タンパク質であるHigh Mobility Group Box 1（ＨＭＧＢ１）との複合体

結合している複合体を、分離に必要な余分な仕事量を無視しうる十分な距離まで隔てられた構成要素部分に分解させる際に行わなければならない仕事量を表す熱力学的ポテンシャルであるギブス自由エネルギー変化ΔＧは、一般に、以下の式１で表すことができる。

以下の式２により、結合親和性を表す平衡定数Ｋと、ΔＧ、ΔＨ、ΔＳといった熱力学量とが関係づけられるので、上述の複合体のΔＧを分子動力学シミュレーションの結果を用いて見積ることで複合体の結合親和性を評価した。ＮＶＩＤＩＡ社製グラフィックカードを据えたＬｉｎｕｘＯＳマシンによる高速分子動力学シミュレーションを行い、熱平衡に達していると考えられた４８０−５１０ナノ秒の範囲におけるΔＨと、２５℃におけるＴΔＳを計算することでΔＧを見積り、各複合体の結合親和性を評価した。

（但し、
Ｇ：ギブズエネルギー（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）
Ｋ：結合定数
Ｒ：気体定数（ｋｃａｌ／Ｋ／ｍｏｌ）
Ｔ：絶対温度（Ｋ）
Ｈ：エンタルピー（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）
Ｓ：エントロピー（ｋｃａｌ／Ｋ／ｍｏｌ）

ＮＭＲを初期構造とする複合体の結合親和性（ΔＧ）の評価を、以下の表３に示す。

（結果）
上記表３から明らかなとおり、分子動力学シミュレーションとインシリコ結合親和性の評価においてはｐ５３（野生型（ＷＴ））−ＣＢＰよりもｐ５３（Ｄ４９Ｈ）−ＣＢＰの方が結合は弱かった。ｐ５３の関与は、ｐ５３にＤ４９Ｈの変異が入ることによりＣＢＰの結合が弱まることが原因の一つであると示唆された。

本発明は、医薬分野において非常に有用である。

Claims

被検者から採取した生体試料中の、ヒトｐ５３のコドン１５９においてアラニンがアスパラギン酸に置換される生殖細胞変異及び／又はヒトｐ５３のコドン４９においてアスパラギン酸がヒスチジンに置換される生殖細胞変異の有無を検出することを特徴とする、リ・フラウメニ症候群、リ・フラウメニ様症候群、又は家族性腫瘍の発症リスクの有無を判定する方法。
アラニンがアスパラギン酸に置換される生殖細胞変異が、アラニンをコードする塩基配列「ＧＣＣ」がアスパラギン酸をコードする塩基配列「ＧＡＣ」に置換される変異であることを特徴とする請求項１記載の方法。
アスパラギン酸がヒスチジンに置換される生殖細胞変異が、アスパラギン酸をコードする塩基配列「ＧＡＴ」がヒスチジンをコードする塩基配列「ＣＡＴ」に置換される変異であることを特徴とする請求項１記載の方法。
次世代ＤＮＡシーケンサーを用いて、生殖細胞変異の有無を検出することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の方法。
サンガー法を用いて、生殖細胞変異を検出することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の方法。