JP2003250537A - ＡｃｔＲＩＩＢキナーゼの活性に関するアッセイ - Google Patents

ＡｃｔＲＩＩＢキナーゼの活性に関するアッセイ

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アルバート クラスニー フィリップ
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ノルキア マイケル
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規キナーゼ・アッセイ法の提供。 【解決手段】 本発明は、キナーゼ・アッセイ法に、そ
して特に、ＡｃｔＲIIＢキナーゼ・タンパク質の活性及
び／又は活性の調節を計測するための、新規標的ペプチ
ドを使用する新規キナーゼ・アッセイ法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明の分野 本発明は、キナーゼ・アッセイ法に、そして特に、Ａｃ
ｔＲIIＢキナーゼの活性及び／又は活性の調節を計測す
るための新規キナーゼ・アッセイ法に関する。
【０００２】本発明の背景 アクチビン（Ａｃｔｉｖｉｎｓ）は、元来、培養された
脳下垂体細胞において、卵胞刺激ホルモン（ｆｏｌｌｉ
ｃｌｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ（Ｆ
ＳＨ））分泌を刺激する性腺ポリペプチド・ホルモンと
して発見された。２つの密に関連するβサブユニットの
ホモ／ヘテロダイマー（βＡβＡ、βＢβＢ、及びβＡ
βＢ）である３つのアクチビン（Ａ、Ｂ及びＡＢ）があ
る（Valeet al. in Peptide Growth Factors and Their
Receptors : Handbook of Experimental Pharmacolog
y, Vol. 95, p. 221, Sporn and Roberts (Eds.), Spri
nger-Verlag (New York, NY, 1990））。赤血球分化因
子（ＥＤＦ）は、ネズミＦｒｉｅｎｄ赤血白血病細胞の
赤血球分化を誘導するその能力に基づき、フォルボール
・ミリステート・アセテート（ＰＭＡ）−処理されたヒ
ト単球白血球（ＴＨＰ−１）の培養液中で、最初に発見
された（Eto et al., Biochem. Bio phys. Res. Comm.,
142 : 1095 (1987)）。その後、それは、アクチビンＡ
と同一であることが判明した。なぜなら、それは、アク
チビンＡのＢＡサブユニットと同じｍＲＮＡによりコー
ドされていたからである（Murata et al., PNAS, 85 :
2434 (1988））。アクチビンＡは、その後、ヒトＫ５６
２赤血白血病細胞においてヘモグロビン合成を誘導する
ことが示された（Yu et al., Nature, 330 : 765 (198
7））。その上、それは、インビトロ（Yu、前掲；Broxm
eyer, PNAS, 85 : 9052 (1988)）とインビボ（Shiozaki
et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 165 :1155
(1989) ; Schwall et al., Endocrinology, 125 : 1420
(1989)）の両者において、正常な赤血球前駆細胞の増
殖を高める。アクチビンＡとそのｍＲＮＡは、成体ゲッ
歯類の骨髄及び脾臓内で発現される（Meunier et al.,
PNAS, 85 : 247 (1988) ; Shiozaki et al., PANS, 89
: 1553 (1992））。アクチビンＡは、培養においてネ
ズミ及びヒト骨髄間質細胞によっても産生される（Yama
shita etal., Blood, 79 : 304 (1992) ; Shao et al.,
Exp. Hematol, 20 : 1235 (1992)）。さらに、それ
は、最近、ヒト末梢血単球により分泌されることが示さ
れた（Shao、前掲；Eraemaa et al., J. Exp. Med., 17
6 : 1449 (1992））。これらの発見は、アクチビンＡ
が、骨髄内での造血の天然調節物質として作用している
ことを示唆する。
【０００３】アクチビンの生物学的効果は、Ｉ型及びII
型受容体を通じて仲介されると推定されている（Massag
uee, Cell, 69 : 1067 (1992））。現在、２つのＩ型受
容体、ＡｃｔＲＩとＡｃｔＲＩＡ、及び２つの相同なII
型アクチビン受容体、ＡｃｔＲIIとＡｃｔＲIIＢの存在
が知られており、これらの全てが、ＤＮＡクローニング
により特徴付けられている。ＡｃｔＲIIとＡｃｔＲIIＢ
は、いくつかの知られたセリン／トレオニン・キナーゼ
に構造的に関連する。細胞内キナーゼ・ドメインをもつ
トランスメンブラン・タンパク質である（Mathews et a
l., Cell, 65 :973 (1991) ; Attisano et al., Cell,
68 : 97-108 (1992））。
【０００４】アクチビン受容体に関する他の文献は、Ma
thews et al., Science, 255 : 1702-05 (1992) ; Math
ews et al., J. Biol. Chem., 268 : 19013-18 (1993)
; 及びHilden et al., Blood, 83 : 2163-70 (1994)
を含む。
【０００５】ＡｃｔＲIIＢは、単一−トランスメンブラ
ン受容体キナーゼである。ミオスタチン（成長及び分化
因子−８又はＧＤＦ−８ともいわれる、ＴＧＦ−ベータ
（トランスフォーミング成長因子）スーパーファミリー
のメンバー）は、骨格筋におけるＡｃｔＲIIＢキナーゼ
の天然リガンドの中の１である。ＡｃｔＲIIＢキナーゼ
を通じてのミオスタチンによるシグナリングは、骨格筋
質量の負の調節をもたらす。したがって、ＡｃｔＲIIＢ
キナーゼ活性の阻害剤は、もろさ（ｆｒａｉｌｔｙ）に
寄与する筋肉質量の加齢関連損失を防止し又は反転さ
せ；そしてそれ故、潜在的なＡｃｔＲIIＢキナーゼ・リ
ガンドの、スクリーニング、特にハイスループット・ス
クリーニングのための有用なアッセイを提供することが
本発明の１つの目的である。なぜなら、このようなリガ
ンドの発見は、もろさのために好適な医薬療法の発見を
導くことができるからである。
【０００６】プロテイン・キナーゼは、タンパク質又は
ペプチドの１以上の部位にリン酸（ｐｈｏｓｐｈａｔ
ｅ）基を付着させることによりそのタンパク質及びペプ
チドを共有結合的に修飾する酵素である。プロテイン・
キナーゼは、多くの細胞シグナル伝達プロセスにおいて
重要な役割をもつ、最大の酵素群の中の１を代表する。
分子生物学的技術におけるゲノム計画その他の最近の発
展に因り、特徴付けられていない生化学的特性及び基質
特異性をもつ新規キナーゼが、より頻繁に発見されるよ
うになってきた。伝統的なプロテイン・キナーゼ・アッ
セイ法は、リン酸供与体として標識されたＡＴＰと、対
応のキナーゼ認識モチーフを含むリン酸受容体としての
基質ペプチドを含む。上記キナーゼ反応後、上記基質ペ
プチドは、適当なフィルター上に捕獲される。未反応の
標識されたＡＴＰと代謝産物は、トリクロロ酢酸沈殿、
及び徹底的な洗浄を含むさまざまな技術により上記放射
性ペプチド基質から、分離される。いくつかの正電荷を
もつ残査の付加は、リン酸セルロース紙上への捕獲、そ
の後の洗浄を許容する。上記基質ペプチドに取り込まれ
た放射能は、シンチレーションカウンターにより検出さ
れる。このアッセイ法は、比較的単純であり、妥当な感
度をもち、そして上記ペプチド基質は、そのアッセイ法
の要求に合うように、配列と濃度の両者の点において、
調節されることができる。例示的なキナーゼ、アッセイ
法に関するより詳細な事項については、米国特許第５，
７５９，７８７号を参照のこと。
【０００７】本発明の要約 第１の局面においては、本発明は、ＡｃｔＲIIＢのキナ
ーゼ活性を測定するためのアッセイ法であって、好適な
媒質内でＡｃｔＲIIＢ、標識されたリン酸供与体と、標
的ペプチドとを、上記ＡｃｔＲIIＢが、上記の標識され
たリン酸供与体を使用して上記標的ペプチドをリン酸化
することができるようにインキュベートして、それによ
り標識された標的ペプチドを作り、そして上記標識され
た標的ペプチド中に存在する標識の量を計測するステッ
プを含む前記アッセイ法を提供する。
【０００８】第２の局面においては、本発明は、Ａｃｔ
ＲIIＢキナーゼのモジュレーター（調節物質）を発見す
るためのアッセイ法であって、適当な媒体中で、第１反
応において、ＡｃｔＲIIＢキナーゼと、標識されたリン
酸供与体と、標的ペプチドとを、上記ＡｃｔＲIIＢキナ
ーゼが、上記標識されたリン酸供与体を使用して上記標
的ペプチドをリン酸化することができるように、インキ
ュベートして、それにより標識された標的ペプチドを作
り、そして第２反応において、ＡｃｔＲIIＢキナーゼ
と、標識されたリン酸供与体と、標的ペプチドと、テス
ト化合物とをインキュベートし、上記第１反応と第２反
応からの上記標識された標的ペプチド中に存在する標識
の量を計測し、そして上記第２反応における標識された
標的ペプチドの量を、上記第１反応における標識された
標的ペプチドの量と比較するステップを含み、ここで、
上記の標識された標的ペプチドの量の統計的有意差が、
上記テスト化合物がＡｃｔＲIIＢキナーゼの調節物質で
あることを示す、前記アッセイ法を提供する。
【０００９】第３の局面においては、本発明は、タンパ
ク質ｃａｔＡｃｔＲIIＢキナーゼであって、配列番号２
に示す配列をもつものを提供する。
【００１０】詳細な説明 当業者は、詳細な説明及び本発明を記載する添付の請求
の範囲中に使用する用語を十分に理解するであろう。
【００１１】しかしながら、別段の定めなき限り、以下
の用語は、以下に記載する意味をもつ。
【００１２】「ＡｃｔＲIIＢ」とは、タンパク質アクチ
ビン受容体IIＢ、又はしばしば、アクチビン受容体タン
パク質をコードする遺伝子を意味する。「ＡｃｔＲIIＢ
キナーゼ」は、単なる「ＡｃｔＲIIＢ」と等価である。
但し、「ＡｃｔＲIIＢキナーゼ」は、ＡｃｔＲIIＢのキ
ナーゼ活性及び／又はキナーゼ触媒部分を強調すること
が望まれるとき、典型的に使用される。別段の定めなき
限り、ＡｃｔＲIIＢとは、ヒト、マウス、又はその他の
生物において見られるタンパク質をいう（例えば、ヒト
に関しては、Hilden et al., Blood, 83 (8) : 2163-70
(1994）を、マウスに関しては、Attisano et al., Cel
l, 68 : 97-108 (1992) を；そしてアフリカツメガエル
に関しては、Mathews et al., Science, 255 : 1702-05
(1992)を参照のこと）。さらに、別段の定めなき限
り、ＡｃｔＲIIＢとは、そのタンパク質の天然対立物、
及び人工物（例えば、遺伝子操作された）その変異体の
全てをいう。
【００１３】「ｃａｔＡｃｔＲIIＢ」とは本発明におけ
る使用のためにデザインされたＡｃｔＲIIＢタンパク質
の修飾バージョンを意味する。ＡｃｔＲIIＢは、その触
媒部分を保持し、そして酵素活性のために不必要な疎水
性部分を除去することにより修飾され、こうして優れた
溶解特性をもつ酵素が作られる。修飾されていないＡｃ
ｔＲIIＢも本発明において働くであろうが、上記修飾バ
ージョンが目下好ましい。ｃａｔＡｃｔＲIIＢは、好ま
しくは、ヒトＡｃｔＲIIＢのアミノ酸１６７〜５１２
（配列番号２）から成る。これらのアミノ酸は、上記タ
ンパク質の触媒（細胞質）ドメインに相当し、そしてま
た、受託番号＃７７５３３のヌクレオチド５０３〜１５
４３に対応する（Hilden et al., Blood, 83 (8) : 216
3-70 (1994）を参照のこと）。
【００１４】「ｈｉｓ−ＡｃｔＲIIＢ」と「ｈｉｓ−ｃ
ａｔＡｃｔＲIIＢ」とは、そのタンパク質がさらなる精
製の容易化のためにヒスチジン又はｈｉｓ６を含むよう
に遺伝子操作されている構築物から発現されたＡｃｔＲ
IIＢ又はｃａｔＡｃｔＲIIＢタンパク質である。
【００１５】「リン酸供与体」とは、ＡｃｔＲIIＢによ
り触媒される酵素反応に関係する化合物を意味し、ここ
で、リン酸供与体は、ＡｃｔＲIIＢにより基質に転移さ
れるホスホリル基を失う。最も一般的なリン酸供与体
は、ヌクレオチド３リン酸及び２リン酸である。本発明
における使用のために目下最も好ましいリン酸供与体
は、ＡＴＰである。
【００１６】「低下した（ｒｅｄｕｃｅｄ）」とは、統
計的に有意な減少（すなわち、ｐ＜０．１）を意味す
る。 「上昇した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」とは、統計的に有
意な上昇（すなわち、ｐ＜０．１）を意味する。
【００１７】「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅｓ）」と
は、統計的に有意な上昇又は減少（完全な排除を含む）
を意味する。
【００１８】その最も基本的な形態においては、キナー
ゼ・アッセイ法は、単に、キナーゼ・タンパク質、適当
な基質、リン酸供与体、及び生じる反応量を計測するた
めの手段のコンビネーションである。もちろん、この過
度に単純化したプランにおいては、多くの複雑な結合が
可能である。本発明の場合、ＡｃｔＲIIＢのキナーゼ活
性、又はより特に、ＡｃｔＲIIＢの修飾バージョン（本
明細書中ｃａｔＡｃｔＲIIＢといい、以下を参照のこ
と）のキナーゼ活性を計測するためのアッセイ法を創出
しようとしたとき、問題が生じた。キナーゼ・アッセイ
法のために一般に使用される基質は、Ｍｙｅｌｉｎ Ｂ
ａｓｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ、又はＭＢＰである。それ
は、一般に、ほとんどのキナーゼのための良好な標的で
あり、そして容易に、かつ、安価に得られる。しかしな
がら、ｃａｔＡｃｔＲIIＢのキナーゼ活性を計測するた
めの基質としてＭＢＰを使用しようとしたとき、この企
ては驚くべきことに失敗した（本明細書中実施例１と実
施例２を参照のこと）。したがって、他の基質を使用す
ることが必要とされた。
【００１９】本発明のキナーゼ・アッセイのための基質
は、「標的ペプチド」といわれる。この小さなペプチド
は、本明細書中に記載するように、その形態の全てにお
いて、ＡｃｔＲIIＢタンパク質のための優れた基質であ
る。それは、ＡｃｔＲIIＢによる特異的認識のための必
要な認識モチーフ、及びリン酸化されるべき必要なアミ
ノ酸を含む。最も好ましい態様においては、標的ペプチ
ドは、長さ２７アミノ酸であり、以下の配列：H2 N-Val
-Tyr-Asp-Leu-Ser-Thr-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Leu-P
ro-Leu-Phe-Val-Gln-Arg-Thr-Val-Ala-Arg-Thr-Ile-Val
-Leu-COOH （配列番号１）をもつ。ＡｃｔＲIIＢは、好
ましい標的ペプチドにおけるように、それらが適当に間
隔をあけて配置されるとき、アミノ酸配列ＳＴＳＧＳＧ
ＳとＲＴＶＡＲＴを認識する。しかしながら、それら
が、ＡｃｔＲIIＢにより効率的に認識されるように十分
に配列番号１に似ている限り、別のペプチド配列も、本
発明において機能的であると予想される。
【００２０】キナーゼ・アッセイ法を有用なものにする
ためには、上記反応を計測することができる、すなわ
ち、既知量の時間内でキナーゼにより、どれだけの量の
リン酸化が触媒されたかを測定することができなければ
ならない。これを行うための目下最も簡単な知られた方
法は、生成物内の計測されることができる標識（及び標
識された反応体から分化した標識された生成物）を提供
するリン酸化反応の１の反応体を提供することである。
最も一般的には、これは、放射性標識されたＡＴＰを提
供することにより行われ、その使用においては、キナー
ゼ反応は、放射性標識された標的ペプチドをもたらすで
あろう。ＡＴＰから標的ペプチドに移されるホスホリル
基は、酸素とリンの原子を含むので、標識として上記原
子の中のいずれの放射性同位元素を使用することが理論
的に可能である。実際には、リン（ 32Ｐ又は33Ｐ）が好
ましい選択である。直接放射性標識に加えて、上記ペプ
チドのリン酸化形態に特異的な抗体を利用する間接標識
付け又は捕獲方法がある。このアプローチは、ラジオ−
イムノアッセイと非放射計測イムノアッセイの両者の基
礎を形作る。後者においては、リンペプチド特異的抗体
（又は２次抗体）は、完全な酵素活性を担持することが
でき、例えば、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ
は、発色団基質の使用による検出を可能にするであろ
う。又は上記抗体は、いくつかの容易に検出される蛍光
団又はリン光団を担持することができる。基質ペプチド
が、基質としてのその好適性を妨害しない適当な蛍光団
を含む場合、リンペプチド特異的抗体が、蛍光分極検出
シナリオにおいて使用されうる。リン酸化されていない
ペプチドが、リン酸化されたペプチド／抗体複合体に比
較してより速い回転拡散をもつであろうので、上記基質
の上記２形態（非結合と抗体結合）は、偏光を使用して
分析の間に区別されうる。目下好ましい態様において
は、32Ｐ又は33Ｐを含むＡＴＰが使用され、ここで、反
応混合物中のＡＴＰの合計濃度は、約７．４μＭ〜７．
６μＭの間にあり、放射性標識されるＡＴＰ合計の約
０．００１％〜０．００４％である。これは、反応容量
の約０．２〜０．５μCi／mlの好ましい放射性レベルを
もたらす。
【００２１】当業者により理解されるであろうが、上記
キナーゼ酵素自体及び必要な反応体に加えて、効率的、
かつ、反復可能なアッセイ計測のためには、適当な溶
媒、塩、及び反応を容易にする各種因子から成る適当な
媒質中で反応を行うことも必要である。水は好ましい媒
質であるが、他の溶媒が、全体として又はより好ましく
は水と混合して使用されることもできる。これらは、Ｄ
ＭＳＯ、エタノール、この他の溶媒であって、酵素活性
に潜在的に適合性であると知られているものを含む。も
ちろん、適当なpHレンジを維持するために、アッセイに
バッファーを含むことが好ましい。有用なバッファー
は、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、ＭＯＰＳなどを含む。pHは
好ましくは、約６．３〜８．３であり、そしてより好ま
しくは約６．８〜８．８である。最も好ましい態様にお
いては、pHは約７．３である。最適活性のために反応混
合物中に塩を含むことが重要である。特に、適当な濃度
において、ＭｇＣｌ2 とＭｎＣｌ2 を含むことが好まし
い。最後に、特定の界面活性剤、補因子、なども好まし
く含まれる。これらの中では、ＢＳＡ又は他の溶解性強
化タンパク質、並びにＥＤＴＡ又は他の重金属スカベン
ジング化合物がある。
【００２２】５０〜１００°Ｆ（１０〜３７．８℃）の
間の温度において本アッセイ法のキナーゼ反応物をイン
キュベートすることが好ましい。より好ましくは、反応
は、６５〜８０°Ｆ（１８．３〜２６．７℃）の間の温
度で生じる。それは好ましくかつ容易に達成されるの
で、反応は、最善には、室温で（典型的には約７２°Ｆ
（２２．３℃）でインキュベートされる。このインキュ
ベーション期間は、数分〜数時間のいずれかの期間継続
し、２０分〜９０分の時間期間が好ましい。より好まし
いのは、４０〜８０分の間のインキュベーション時間で
あり、７５分間が目下最も好ましい。
【００２３】キナーゼ・アッセイ法を実施した後、予め
決定された時機にＡｃｔＲIIＢ酵素反応を停止させるこ
とが必要である。反応が正確な知られた時機に停止され
ない場合、１の反応からの結果を他の反応からの結果と
比較することができない。もちろん、それがキナーゼ反
応の結果の正確な計測を妨害しないかぎり、いずれかの
反応の妥当な停止方法を使用することができる。例え
ば、特定の化合物が、ＡｃｔＲIIＢタンパク質を速く変
性させ、分解し、又は他の方法で不能にする反応混合物
に添付されることができる。このような化合物は、ＴＣ
Ａ、リン酸、ＳＤＳなどを含む。あるいは、ＡｃｔＲII
Ｂタンパク質が永久的に変性される点まで、反応混合物
を加熱することができる。このような行為は、少なくと
も約１６０°Ｆ（７１．１℃）の温度までの加熱を必要
とする。
【００２４】キナーゼ反応が完結し、そしてＡｃｔＲII
Ｂタンパク質活性が失われた後、標識された標的基質の
単離が、典型的には要求される。標的基質が単離されな
い場合、使用されなかった標識された反応体により生成
されたシグナルから、標識された基質により生成された
シグナルを区別することは、典型的には不可能である。
しかしながら、いくつかの場合、標識された標的基質を
単離することは必要ではなく、そしてこの場合には、即
時の計測が行われる。例えば、ある場合には、アッセ
イ、例えば、シンチレーション近位アッセイが行われ、
この場合には、標識された基質の単離は不要である。
【００２５】当業者は、使用されなかった標識された反
応体から、標識された標的基質を単離するための多くの
手段を知っている。典型的な例は、ゲル電気泳動、沈
澱、濾過、クロマトグラフィー、免疫沈降、などであ
る。目下、標的ペプチドのＴＣＡ沈澱により標識された
標的タンパク質を分離することが好ましい。
【００２６】優れた分離方法は、団体支持体への標識さ
れた標的基質の特異的結合、その後の使用されなかった
標識された反応体の洗い流しである。この方法のため
に、多種多様の団体支持体を使用しうる。適当な支持体
の選択において考慮すべき要因は、固定化受容体の接着
及び機能保持、結合のための接近可能な表面積、洗浄の
便利さ、費用、ハイスループット能力などを含む。しば
しば、団体支持体は、反応リザーバーの壁自体であろ
う。好ましい支持体は、シグナル強度とシグナル対ノイ
ズ比を最大化する。例示的な支持体は、ポリスチレン・
マイクロタイター・プロット、微細繊維、ポリマー又は
シリカ−ベースのビーズなどを含み、好ましくは、最大
タンパク質結合を提供するために予め活性化される。使
用するとき、ビーズを、サイズ、レンジ、及び構造によ
り選択して、表面積、フィルター保存及びアッセイ・イ
ンキュベーションの間のビーズ懸濁時間を最大化する。
【００２７】一旦、標識された標的基質が、使用されな
かった標識された反応体から分離されれば、標識された
標的基質の量を計測することが必要となる。この計測を
行うための手段は、使用される標識のタイプに依存す
る。放射性標識された標的基質のためには、存在する放
射能の量は、シンチレーション・カウンティング、定量
的オートラジオグラフィー濃度計、フォトイメージング
などを含む、当業者に知られたさまざまな手段の中の１
において計測される。
【００２８】標的基質が蛍光標識により標識付けされる
場合、標識の量は、定量的分光光度計測、蛍光／化学発
光イメージングなどにより計測される。
【００２９】キナーゼ活性を検出するための他の方法
は、リン酸化されたタンパク質及びペプチドとリン酸化
されなかったタンパク質及びペプチドの間の電荷の差異
に因る分離に基づく。これらに関しては、とりわけ、ゲ
ル電気泳動及びＨＰＬＣに基づく技術が使用されてき
た。これらの技術とともに、分光光度計測及び蛍光計測
検出が使用されてきた。タンパク質キナーゼ活性を検出
するために使用される今日までの多くの方法の説明に関
しては、国際特許出願公開ＷＯ９３／１０４６１及び米
国特許第５，１２０，６４４号及び同第５，１４１，８
５２号を参照のこと、また、Toomik et al., Analytica
l Biochemistry, 209 : 348-53 (1993）を参照のこと。
【００３０】上記キナーゼ、基質、ＮＴＰ、及び第１受
容体に加えて、上記反応混合物は、テスト化合物、例え
ば、予め選択されたキナーゼ阻害剤又は調節物質、又は
特にハイスループット医薬スクリーニングのためには、
ライブラリー由来テスト化合物を含むこともできる。極
めて簡単に言えば、キナーゼ反応の計測を通じて、上記
テスト化合物の存在を通じて上記キナーゼ反応が上昇す
るか又は低下するかどうかを測定することができる。反
応速度が上昇する場合、テスト化合物は、アゴニストで
あろう。反応速度が低下する場合、テスト化合物はアン
タゴニストであろう。
【００３１】ライブラリー由来テスト化合物は、多くの
化学クラスを包含する。但し、典型的には、それらは、
有機化合物；好ましくは小さな有機化合物である。ライ
ブラリーは、合成及び／又は天然由来の化合物を含みう
る。例えば、無作為オリゴヌクレオチドの発現を含む、
多種多様な有機化合物及び生体分子の無作為及び指定合
成のために、さまざまな手段を利用することができる。
あるいは、バクテリア、真菌、植物、及び動物抽出物の
形態における天然化合物のライブラリーは、入手可能で
あり又は容易に製造される。さらに、天然及び合成によ
り製造されたライブラリー及び化合物は、慣用の化学、
物理、及び生化学的手段を通して容易に修飾される。さ
らに、知られた薬理学的剤が、直接又は無作為化学修
飾、例えば、アシル化、アルキル化、エステル化、アミ
ド化などに供されて、構造アナログが作られることがで
きる。上記剤は、標準的な逐次的希釈又は知られた調節
物質への類推により決定される量で、提供される。さら
に、上記混合物は、通常、追加の試薬、例えば、塩、バ
ッファーなどを含み、キナーゼ活性が容易にし又は最大
化される。
【００３２】厳密には必要とされないが、事実上、上記
キナーゼ反応物のための一連の対照を含むことが高く有
用である。テスト化合物が１の反応混合物に添加される
場合、対照キナーゼ反応物に（テスト化合物だけを含ま
ない）同一容積の類似組成物を添加することが重要であ
る。その後、これはテスト化合物を含有する溶液の溶
媒、塩、又は他の成分により引き起こされるキナーゼ活
性のいずれかの変化の原因となるであるであろう。
【００３３】実験反応にできるだけ類似するポジティブ
及びネガティブ・コントロールのキナーゼ反応物を含む
が、キナーゼ活性の知られた調節物質を含むこともひじ
ょうに助けとなる。知られていないテスト化合物ととも
に、キナーゼ活性の知られた阻害剤及びアンタゴニスト
をテストすることにより、キナーゼ応答性における予想
外の変動をコントロールすることがより容易になる。
【００３４】本発明の最も重要な局面の中の１は、Ａｃ
ｔＲIIＢキナーゼの調節物質に関するハイスループット
・スクリーニング（ＨＴＳ）における使用のためのその
好適生である。反応は単純で、小容積で（例えば、マイ
クロタイター・プレート上で）行われることができ、そ
して再現性があるので、好ましいやり方で、化合物の巨
大なライブラリーをスクリーンし、そしてＡｃｔＲIIＢ
キナーゼの活性を調節する化合物を発見することができ
る。
【００３５】このような新たに発現された調節物質は、
ヒト及び動物のための潜在的な医薬である。
【００３６】本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細
な説明及び請求の範囲から明らかであろう。本発明は、
特定の態様に関して説明してきたけれども、実行されう
る他の変更及び修正も本発明の一部であり、そしてまた
添付の請求の範囲内にあることは理解されるであろう。
本願は、一般に、本発明の本質に従う本発明の均等物、
変更、使用、又は改作であって、本分野内の知られた又
は慣用の実務内にある本願の開示からの逸脱を含むもの
を包含することを意図される。さらなるガイダンスは、
分子生物学、タンパク質科学、免疫学その他の標準的な
テキストブック中に見られる。本願明細書中に引用する
文献の全てを全体としてここに援用する。
【００３７】実施例 実施例１− オートラジオグラフ・アッセイ法 ２５mM ＨＥＰＥＳ（pH７．３）中に、２．５μｇ／ml
ｈｉｓ−ｃａｔＡｃｔＲIIＢキナーゼ、１mg／ml標的
ペプチド又は２．５μＭミエリン塩基タンパク質（ＭＢ
Ｐ）、１０μＭ ＡＴＰ、１０μCi〔32Ｐ〕γ−ＡＴＰ
（６０００Ci／mmol）、１mg／mlウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）、及び５mMナトリウム・オルトバナデートを
含む２０μｌ反応混合物を、周囲温度で３０分間走らせ
た。この反応を、β−メルカプトエタノール及び微量の
ブロモフェノール・ブルーを含む３×Ｌｅａｍｍｌｉバ
ッファー１／３容（１８８mM Ｔｒｉｓ pH６．８、３
％ＳＤＳ、２４％グリセロール、２５％ｖ／ｖβ−メル
カプトエタノール）を添加することにより、停止させ
た。停止させた反応物を、沸騰させずに、１８％ポリア
クリルアミド／トリス／グリシン・ゲル上に直接ロード
した。このゲルを、約１０ボルトにおいて走らせて、適
当な分離を許容し、水中で５分間洗浄し、そして半乾燥
ブロッティング・バッファー（４８mM Ｔｒｉｓ塩基、
３９mMグリシン、２０％メタノール、０．３７５％ＳＤ
Ｓ）中で５分間平衡にした。次に反応生成物を、Ｂｉｏ
−Ｒａｄ半乾燥ブロッティング装置内で２０ボルトにお
いて４８分間、ニトロセルロース・フィルター上にブロ
ットし、そしてオートラジオグラフィーにより可視化及
び／又は定量した。
【００３８】標的ペプチドを含む反応混合物において
は、標識された標的ペプチドと自己リン酸化されたｈｉ
ｓ−ｃａｔＡｃｔＲIIＢキナーゼにそれぞれ対応する、
３Kdと４０Kdにおいて、バンドを可視化した。ＭＢＰを
含む反応混合物においては、標識されたＭＢＰと自己リ
ン酸化されたｈｉｓ−ｃａｔＡｃｔＲIIＢキナーゼにそ
れぞれ対応する、１８Kdと４０Kdにおいて、バンドを可
視化した。最後に、標的ペプチドとＭＢＰのどちらも含
有しない対照反応混合物においては、可視化された唯一
のバンドは、４０Kdにおける自己リン酸化されたｈｉｓ
−ｃａｔＡｃｔＲIIＢキナーゼであった。それ故、本反
応条件が、ＡｃｔＲIIＢ−触媒リン酸化（キナーゼ）活
性を誘導することは明らかである。
【００３９】実施例２− シンチレーション法 ２５mM ＨＥＰＥＳ（pH７．３）、３mM ＭｇＣｌ2 、
１mM ＭｎＣｌ2 、０．１mM ＥＤＴＡ、１mM ＤＴ
Ｔ、０．２mMナトリウム・オルトバナデート、１００μ
ｇ／ml ＢＳＡ、１０μＭ ＡＴＰ、０．２５μCi〔33
Ｐ〕γ−ＡＴＰ、及び１６．５μｇ／ml ｈｉｓ−ｃａ
ｔＡｃｔＲIIＢキナーゼを含む一連の反応混合物を、室
温で８０分間、Ｄｕｒａｐｏｒｅ（Millipore ）フィル
ター・プレート内で直接、合計１００μｌにおいて走ら
せた。この反応を、等容積の氷冷ＴＣＡ（１０％又は２
５％ｖ／ｖ）の添加により停止させた。４℃で１時間
後、沈澱を真空下で、回収した。沈澱を、冷ＴＣＡで５
回洗浄した。一夜乾燥させた後、シンチラントを、上記
ウェルに添加し、そしてプレートを、Ｐａｒａｌｕｘモ
ードにおいてＭｉｃｒｏｂｅｔａ１４５０Ｔｒｉｌｕｘ
内でカウントした。異なる反応は、標的ペプチド（１７
６μＭ）、ＭＢＰ（２μＭ）を含むか又は基質を含んで
いなかった。結果を図１に示す。
【００４０】上記結果から分かるように、ｈｉｓ−ｃａ
ｔＡｃｔＲIIＢがＭＢＰをリン酸化するオートラジオグ
ラフ法から知られているとしても、ＭＢＰとの反応は、
予想外にネガティブな結果をもたらした。生成された唯
一のシグナルは、ネガティブ・コントロール（基質な
し）において見られるように、ｈｉｓ−ｃａｔＡｃｔＲ
IIＢタンパク質の自己リン酸化に起因すると考えられ
る。しかしながら、上記反応は、基質としての標的ペプ
チドとともに、ひじょうに良好に行われた。
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> PFIZER PRODUCTS INC. <120> ASSAY FOR ACTIVITY OF THE ActRIIB KINASE <130> B035340 <140> 60/360,607 <141> 2002-02-28 <160> 2 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artifical sequence <400> 1 Val Tyr Asp Leu Ser Thr Ser Gly Ser Gly Ser Gly Leu Pro Leu Phe 1 5 10 15 Val Gln Arg Thr Val Ala Arg Thr Ile Val Leu 20 25 <210> 2 <211> 346 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Tyr Gly His Val Asp Ile His Glu Asp Pro Gly Pro Pro Pro Pro Ser 1 5 10 15 Pro Leu Val Gly Leu Lys Pro Leu Gln Leu Leu Glu Ile Lys Ala Arg 20 25 30 Gly Arg Phe Gly Cys Val Trp Lys Ala Gln Leu Met Asn Asp Phe Val 35 40 45 Ala Val Lys Ile Phe Pro Leu Gln Asp Lys Gln Ser Trp Gln Ser Glu 50 55 60 Arg Glu Ile Phe Ser Thr Pro Gly Met Lys His Glu Asn Leu Leu Gln 65 70 75 80 Phe Ile Ala Ala Glu Lys Arg Gly Ser Asn Leu Glu Val Glu Leu Trp 85 90 95 Leu Ile Thr Ala Phe His Asp Lys Gly Ser Leu Thr Asp Tyr Leu Lys 100 105 110 Gly Asn Ile Ile Thr Trp Asn Glu Leu Cys His Val Ala Glu Thr Met 115 120 125 Ser Arg Gly Leu Ser Tyr Leu His Glu Asp Val Pro Trp Cys Arg Gly 130 135 140 Glu Gly His Lys Pro Ser Ile Ala His Arg Asp Phe Lys Ser Lys Asn 145 150 155 160 Val Leu Leu Lys Ser Asp Leu Thr Ala Val Leu Ala Asp Phe Gly Leu 165 170 175 Ala Val Arg Phe Glu Pro Gly Lys Pro Pro Gly Asp Thr His Gly Gln 180 185 190 Val Gly Thr Arg Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Glu Gly Ala Ile 195 200 205 Asn Phe Gln Arg Asp Ala Phe Leu Arg Ile Asp Met Tyr Ala Met Gly 210 215 220 Leu Val Leu Trp Glu Leu Val Ser Arg Cys Lys Ala Ala Asp Gly Pro 225 230 235 240 Val Asp Glu Tyr Met Leu Pro Phe Glu Glu Glu Ile Gly Gln His Pro 245 250 255 Ser Leu Glu Glu Leu Gln Glu Val Val Val His Lys Lys Met Arg Pro 260 265 270 Thr Ile Lys Asp His Trp Leu Lys His Pro Gly Leu Ala Gln Leu Cys 275 280 285 Val Thr Ile Glu Glu Cys Trp Asp His Asp Ala Glu Ala Arg Leu Ser 290 295 300 Ala Gly Cys Val Glu Glu Arg Val Ser Leu Ile Arg Arg Ser Val Asn 305 310 315 320 Gly Thr Thr Ser Asp Cys Leu Val Ser Leu Val Thr Ser Val Thr Asn 325 330 335 Val Asp Leu Pro Pro Lys Glu Ser Ser Ile 340 345
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、シンチレーション・カウンティング法
を使用して走らせたいくつかのキナーゼ反応の結果の図
による比較を表す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マイケル ノルキア アメリカ合衆国，コネチカット 06340, グロトン，イースタン ポイント ロー ド，ファイザー グローバル リサーチ アンド ディベロップメント (72)発明者 バーバラ アン オコンナー アメリカ合衆国，コネチカット 06340, グロトン，イースタン ポイント ロー ド，ファイザー グローバル リサーチ アンド ディベロップメント (72)発明者 ロビン ホイットニー スペンサー アメリカ合衆国，コネチカット 06340, グロトン，イースタン ポイント ロー ド，ファイザー グローバル リサーチ アンド ディベロップメント Ｆターム(参考） 4B050 CC03 DD11 LL03 4B063 QA01 QA18 QQ20 QQ95 QR07 QR41 QR42 QR48 QR50 QR57 QR84 QS12 QS36 QX07

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＡｃｔＲIIＢのキナーゼ活性の測定のた
    めのアッセイ法であって、以下のステップ： ａ）好適な媒体中で、ＡｃｔＲIIＢと、標識されたリン
    酸供与体と、及び標的ペプチドとを、上記ＡｃｔＲIIＢ
    が上記標識されたリン酸供与体（ｐｈｏｓｐｈｏｄｏｎ
    ｏｒ）を使用して上記標的ペプチドをリン酸化すること
    ができるように、インキュベートして、それにより標識
    された標的ペプチドを作り；及び ｂ）上記標識された標的ペプチド中に存在する標識の量
    を計測する、を含む前記アッセイ法。
  2. 【請求項２】 前記標的ペプチドが、配列番号１に示す
    配列を有する、請求項１に記載のアッセイ法。
  3. 【請求項３】 前記ＡｃｔＲIIＢがｃａｔＡｃｔＲIIＢ
    である、請求項１に記載のアッセイ法。
  4. 【請求項４】 前記計測ステップの前に、残存する標識
    されたリン酸供与体から前記の標識された標的ペプチド
    を単離するステップをさらに含む、請求項１に記載のア
    ッセイ法。
  5. 【請求項５】 前記インキュベーション・ステップが、
    ＡｃｔＲIIＢの潜在的な阻害剤の添加をさらに含む、請
    求項１に記載のアッセイ法。
  6. 【請求項６】 ＡｃｔＲIIＢキナーゼのモジュレーター
    を発見するためのアッセイ法であって、以下のステッ
    プ： ａ）好適な媒体中で、ＡｃｔＲIIＢと、上記標識された
    リン酸供与体と、上記標的ペプチドとを、上記ＡｃｔＲ
    IIＢキナーゼが標識されたリン酸供与体を使用して標的
    ペプチドをリン酸化することができるように、第１反応
    においてインキュベートして、それにより、標識された
    標的ペプチドを作り、そして第２反応において、Ａｃｔ
    ＲIIＢキナーゼと、標識されたリン酸供与体と、標的ペ
    プチドと、テスト化合物とを、インキュベートし； ｂ）上記第１反応と上記第２反応からの上記の標識され
    た標的ペプチド中に存在する標識の量を計測し；及び ｃ）上記第２反応における標識された標的ペプチドの量
    を、上記第１反応からの標識された標的ペプチドの量と
    比較する、を含み、ここで、上記の標識された標的ペプ
    チドの量の統計的に有意な差が、上記テスト化合物がＡ
    ｃｔＲIIＢキナーゼのモジュレーターであることを示
    す、前記アッセイ法。
  7. 【請求項７】 前記標的ペプチドが、配列番号１に示す
    配列を有する、請求項６に記載のアッセイ法。
  8. 【請求項８】 前記ＡｃｔＲIIＢがｃａｔＡｃｔＲIIＢ
    である、請求項６に記載のアッセイ法。
  9. 【請求項９】 前記計測ステップの前に、前記第１反応
    と前記第２反応における残存する標識されたリン酸供与
    体から前記の標識された標的ペプチドを単離するステッ
    プをさらに含む、請求項６に記載のアッセイ法。
  10. 【請求項１０】 前記タンパク質が、配列番号２に示す
    配列を有する、タンパク質ｃａｔＡｃｔＲIIＢキナー
    ゼ。
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