JP2003144199A - プレボテラクラスター細菌用プローブおよびこれを用いた検出方法 - Google Patents
プレボテラクラスター細菌用プローブおよびこれを用いた検出方法Info
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- JP2003144199A JP2003144199A JP2001341559A JP2001341559A JP2003144199A JP 2003144199 A JP2003144199 A JP 2003144199A JP 2001341559 A JP2001341559 A JP 2001341559A JP 2001341559 A JP2001341559 A JP 2001341559A JP 2003144199 A JP2003144199 A JP 2003144199A
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- bacterium
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【解決手段】プレボテラクラスター細菌の特定の塩基配
列に相補的な配列を有するプレボテラクラスター細菌用
プローブ、並びにこのプローブを使用するプレボテラク
ラスター細菌の検出、同定法。 【効果】菌を培養することなく、ヒト腸管内から高頻度
に検出されるプレボテラクラスター細菌を迅速、簡便に
検出することができる。
列に相補的な配列を有するプレボテラクラスター細菌用
プローブ、並びにこのプローブを使用するプレボテラク
ラスター細菌の検出、同定法。 【効果】菌を培養することなく、ヒト腸管内から高頻度
に検出されるプレボテラクラスター細菌を迅速、簡便に
検出することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトの腸管内に生
息する細菌叢の中で、高頻度に検出されるプレボテラク
ラスターに特異的なプローブ及び該プローブを使用した
プレボテラクラスター細菌の検出方法に関するものであ
る。
息する細菌叢の中で、高頻度に検出されるプレボテラク
ラスターに特異的なプローブ及び該プローブを使用した
プレボテラクラスター細菌の検出方法に関するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】プレボテラクラスター細菌は、ヒトや動
物の腸管内に最優勢で存在するバクテロイデスグループ
に含まれる菌群で、グラム陰性の無芽胞嫌気性細菌であ
る。特に成人の口腔および大腸内においては、検出頻度
の高い菌群である。
物の腸管内に最優勢で存在するバクテロイデスグループ
に含まれる菌群で、グラム陰性の無芽胞嫌気性細菌であ
る。特に成人の口腔および大腸内においては、検出頻度
の高い菌群である。
【０００３】近年バクテロイデスグループ細菌は、バク
テロイデス(Bacteroides；以下単にB．とも記載する)ク
ラスター、プレボテラ(Prevotella；以下単にP．とも記
載する)クラスター、ポルフィロモナス(Porphyromonas)
クラスター、ニュー１(New１)、ニュー２(New２)の５つ
に大別された(JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Vol. 176,N
o. 3, p 725-732, 1994)。
テロイデス(Bacteroides；以下単にB．とも記載する)ク
ラスター、プレボテラ(Prevotella；以下単にP．とも記
載する)クラスター、ポルフィロモナス(Porphyromonas)
クラスター、ニュー１(New１)、ニュー２(New２)の５つ
に大別された(JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Vol. 176,N
o. 3, p 725-732, 1994)。
【０００４】新分類においては、ヒト腸管内から高頻度
に分離される菌種の大部分がバクテロイデスクラスター
に含まれるが、ポルフィロモナスクラスターに含まれる
バクテロイデス・ディスタソニスやプレボテラクラスタ
ーに含まれるプレボテラ・ブッカエ、プレボテラ・オリ
ス、ニュー1に含まれるバクテロイデス・スプランチニカ
スおよびニュー2に含まれるバクテロイデス・プトレディ
ニス等、バクテロイデスクラスター以外の菌種もヒト腸
管内から分離され(Benno Y., and T. Mitsuoka,1986, D
evelopment of intestinal microflora in humans
and animals. Bifidobacteria Microflora)、生態
学的研究や臨床株の同定等、種々の研究を行う場合の重
要な検出対象となる。
に分離される菌種の大部分がバクテロイデスクラスター
に含まれるが、ポルフィロモナスクラスターに含まれる
バクテロイデス・ディスタソニスやプレボテラクラスタ
ーに含まれるプレボテラ・ブッカエ、プレボテラ・オリ
ス、ニュー1に含まれるバクテロイデス・スプランチニカ
スおよびニュー2に含まれるバクテロイデス・プトレディ
ニス等、バクテロイデスクラスター以外の菌種もヒト腸
管内から分離され(Benno Y., and T. Mitsuoka,1986, D
evelopment of intestinal microflora in humans
and animals. Bifidobacteria Microflora)、生態
学的研究や臨床株の同定等、種々の研究を行う場合の重
要な検出対象となる。
【０００５】従来同定は、菌の表現形質を指標としてな
されていた。ＢＥＲＧＥＹ’Ｓ ＭＡＮＵＡＬ ＯＦ
Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙで
は、無芽胞、非運動性の嫌気性グラム陰性桿菌で、20％
胆汁存在下で発育せず、糖を醗酵しコハク酸、酢酸、乳
酸、蟻酸、あるいはプロピオン酸を産生する菌群をプレ
ボテラ属と同定している。しかしながら、このような表
現形質を基にした同定法では結果が得られるまで数日か
ら数週間の時間を要し、また手技も煩雑で熟練を要す
る。
されていた。ＢＥＲＧＥＹ’Ｓ ＭＡＮＵＡＬ ＯＦ
Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙで
は、無芽胞、非運動性の嫌気性グラム陰性桿菌で、20％
胆汁存在下で発育せず、糖を醗酵しコハク酸、酢酸、乳
酸、蟻酸、あるいはプロピオン酸を産生する菌群をプレ
ボテラ属と同定している。しかしながら、このような表
現形質を基にした同定法では結果が得られるまで数日か
ら数週間の時間を要し、また手技も煩雑で熟練を要す
る。
【０００６】また、近年では、DNA−DNA相同性試験によ
る判定やモノクロナール抗体による検出も行われるよう
になっている。しかしながら、これらの同定法でも時間
や熟練が要求されるため、迅速な検出、同定を行うには
不向きであった。
る判定やモノクロナール抗体による検出も行われるよう
になっている。しかしながら、これらの同定法でも時間
や熟練が要求されるため、迅速な検出、同定を行うには
不向きであった。
【０００７】一方、菌種あるいは菌群特異的なDNAプロ
ーブを用いた同定方法は、系統分類の指標として用いら
れている16S ｒＲＮＡの塩基配列を基にしているため正
確であり、20塩基程度の短いオリゴヌクレオチドプロー
ブを用いれば、核酸抽出の必要がないin situ ハイブリ
ダイゼーションを行うことができ、判定時間がかなり短
縮されるなどの利点がある。プレボテラクラスターに関
するDNAプローブについても報告がなされており、例え
ばマンツらがバクテロイデスクラスターとプレボテラク
ラスターに共通な特異的プローブとして5’-ＣＣＡＡＴ
ＧＴＧＧＧＧＧＡＣＣＴＴ-3’のシークエンスを提案し
ている(Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９６，１４
２，１０９７−１１０６)。しかし、このプローブはバ
クテロイデスクラスターも検出してしまうため、プレボ
テラクラスターのみを特異的に検出できない。また、伊
藤らはプレボテラクラスターに特異的なプライマーとし
て５’−ＣＡＣＲＧＴＡＡＡＣＧＡＴＧＧＡＴＧＣＣ−
３’及び5’−ＧＧＴＣＧＧＧＴＴＧＣＡＧＡＣＣ−
３’の２種類のプライマーを報告しているが（特開２０
０１−１１２４８５号）、これらのプライマーはＰＣＲ
反応等には適用しやすいものの、プローブとして、イン
サイチュハイブリダイゼーションなどに適用するうえで
は、条件設定の困難さなど作業性が問題となっており、
より使用しやすいプローブの設計が求められている。
ーブを用いた同定方法は、系統分類の指標として用いら
れている16S ｒＲＮＡの塩基配列を基にしているため正
確であり、20塩基程度の短いオリゴヌクレオチドプロー
ブを用いれば、核酸抽出の必要がないin situ ハイブリ
ダイゼーションを行うことができ、判定時間がかなり短
縮されるなどの利点がある。プレボテラクラスターに関
するDNAプローブについても報告がなされており、例え
ばマンツらがバクテロイデスクラスターとプレボテラク
ラスターに共通な特異的プローブとして5’-ＣＣＡＡＴ
ＧＴＧＧＧＧＧＡＣＣＴＴ-3’のシークエンスを提案し
ている(Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９６，１４
２，１０９７−１１０６)。しかし、このプローブはバ
クテロイデスクラスターも検出してしまうため、プレボ
テラクラスターのみを特異的に検出できない。また、伊
藤らはプレボテラクラスターに特異的なプライマーとし
て５’−ＣＡＣＲＧＴＡＡＡＣＧＡＴＧＧＡＴＧＣＣ−
３’及び5’−ＧＧＴＣＧＧＧＴＴＧＣＡＧＡＣＣ−
３’の２種類のプライマーを報告しているが（特開２０
０１−１１２４８５号）、これらのプライマーはＰＣＲ
反応等には適用しやすいものの、プローブとして、イン
サイチュハイブリダイゼーションなどに適用するうえで
は、条件設定の困難さなど作業性が問題となっており、
より使用しやすいプローブの設計が求められている。
【０００８】更に、FISH法に用いる特異的なプローブを
設計するにあたっては、特異的な配列を有するプローブ
であっても16SｒＲＮＡの標的部位によっては、反応性
が低いあるいは反応しない場合があるため注意が必要で
ある（APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY， １
９９８，６４，４９７３−４９８２）。これは、ｒＲＮ
Ａ分子内における高次構造あるいはｒＲＮＡとタンパク
との複合体形成がプローブの結合の妨げになっているた
めと考えられている。
設計するにあたっては、特異的な配列を有するプローブ
であっても16SｒＲＮＡの標的部位によっては、反応性
が低いあるいは反応しない場合があるため注意が必要で
ある（APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY， １
９９８，６４，４９７３−４９８２）。これは、ｒＲＮ
Ａ分子内における高次構造あるいはｒＲＮＡとタンパク
との複合体形成がプローブの結合の妨げになっているた
めと考えられている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】このように、表現形質
の違いやＤＮＡ−ＤＮＡ相同性試験からプレボテラクラ
スター細菌の検出、同定を行うには、長時間を要し、操
作が煩雑である等の問題があった。また、プレボテラク
ラスターに特異的なプライマーは以前から報告されてい
るものの、プローブとして使用するには条件設定の困難
さなど作業性に問題があった。このため、これらの菌群
をハイブリダイゼーション法により迅速かつ簡便に検出
することは困難であった。また、プレボテラクラスター
細菌の検出は、主に糞便や歯垢等の生体試料を対象とし
て行われるが、糞便等には様々な夾雑物が含まれてお
り、夾雑物自身の非特異的な蛍光の影響などによって、
ハイブリダイズ後の蛍光検出が阻害される場合がある。
このため、これらのような対象に対しても優れた特異
性、反応性を有するプローブが望まれる。
の違いやＤＮＡ−ＤＮＡ相同性試験からプレボテラクラ
スター細菌の検出、同定を行うには、長時間を要し、操
作が煩雑である等の問題があった。また、プレボテラク
ラスターに特異的なプライマーは以前から報告されてい
るものの、プローブとして使用するには条件設定の困難
さなど作業性に問題があった。このため、これらの菌群
をハイブリダイゼーション法により迅速かつ簡便に検出
することは困難であった。また、プレボテラクラスター
細菌の検出は、主に糞便や歯垢等の生体試料を対象とし
て行われるが、糞便等には様々な夾雑物が含まれてお
り、夾雑物自身の非特異的な蛍光の影響などによって、
ハイブリダイズ後の蛍光検出が阻害される場合がある。
このため、これらのような対象に対しても優れた特異
性、反応性を有するプローブが望まれる。
【００１０】従って、本発明は、ヒトの腸内細菌叢にお
いて高頻度に検出されるプレボテラクラスター細菌の検
出、同定を迅速、簡便かつ高感度に行えるプレボテラク
ラスター細菌特異的プローブを提供することを目的とし
ている。また、本発明は該プローブを用いた細菌叢の解
析及びプレボテラクラスター細菌の検出方法を提供する
ことも目的としている。
いて高頻度に検出されるプレボテラクラスター細菌の検
出、同定を迅速、簡便かつ高感度に行えるプレボテラク
ラスター細菌特異的プローブを提供することを目的とし
ている。また、本発明は該プローブを用いた細菌叢の解
析及びプレボテラクラスター細菌の検出方法を提供する
ことも目的としている。
【００１１】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に本発明者らは鋭意研究を行った結果、プレボテラクラ
スター細菌に特異的な塩基配列がｒＲＮＡ上に存在して
おり、このうち配列番号１に記載した配列をプローブと
して用いれば、細菌の培養を行うことなく、検体中の細
菌内の核酸を検出することにより、迅速、正確、簡便か
つ高感度にプレボテラクラスター細菌の検出、同定が可
能になることを見出し本発明を完成した。
に本発明者らは鋭意研究を行った結果、プレボテラクラ
スター細菌に特異的な塩基配列がｒＲＮＡ上に存在して
おり、このうち配列番号１に記載した配列をプローブと
して用いれば、細菌の培養を行うことなく、検体中の細
菌内の核酸を検出することにより、迅速、正確、簡便か
つ高感度にプレボテラクラスター細菌の検出、同定が可
能になることを見出し本発明を完成した。
【００１２】すなわち本発明は、配列番号1の塩基配列
又は該塩基配列に相補的な配列を有するプレボテラクラ
スター細菌に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを提
供するものである。
又は該塩基配列に相補的な配列を有するプレボテラクラ
スター細菌に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを提
供するものである。
【００１３】また本発明は、配列番号1の塩基配列又は
該塩基配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド
プローブを用いることを特徴とするプレボテラクラスタ
ー細菌の検出、同定方法を提供するものである。
該塩基配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド
プローブを用いることを特徴とするプレボテラクラスタ
ー細菌の検出、同定方法を提供するものである。
【００１４】
【発明の実施の形態】本発明のプローブは、プレボテラ
クラスター細菌、具体的にはプレボテラ・ルミニコラ
(Ｐ．ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ)、プレボテラ・ブレビス
(Ｐ．ｂｒｅｖｉｓ)、プレボテラ・ブッカエ（Ｐ. ｂｕ
ｃｃａｅ）、プレボテラ・ブカリス（Ｐ．ｂｕｃｃａｌ
ｉｓ）、プレボテラ・オリス（Ｐ. ｏｒｉｓ）、プレボ
テラ・メラニノゲニカ（Ｐ．ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉ
ｃａ）、プレボテラ・ディシエンス（Ｐ．ｄｉｓｉｅｎ
ｓ）、プレボテラ・ロシェイ（Ｐ．ｌｏｅｓｃｈｅｉ
ｉ）、プレボテラ・デンタリス（Ｐ．ｄｅｎｔａｌｉ
ｓ）、プレボテラ・エノエカ（Ｐ．ｅｎｏｅｃａ）、プ
レボテラ・オウロラ（Ｐ．ｏｕｌｏｒａ）、プレボテラ
・デンティコラ（Ｐ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、プレボテ
ラ・コーポリス（Ｐ．ｃｏｒｐｏｒｉｓ）、プレボテラ
・インターメディア（Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、プ
レボテラ・ニグレセンス（Ｐ．ｎｉｇｒｅｓｃｅｎ
ｓ）、プレボテラ・アルベンシス（Ｐ．ａｌｂｅｎｓｉ
ｓ）、プレボテラ・パレンス（Ｐ．ｐａｌｌｅｎｓ）、
プレボテラ・ビビウス（P. ｂｉｖｉｕｓ）、プレボテラ
・ベロラリス（Ｐ. ｖｅｒｏｒａｌｉｓ）、プレボテラ・
オラリス（Ｐ. ｏｒａｌｉｓ）を特異的に検出・同定で
きるものである。このようなプローブを作成するにあた
り、そのターゲットには系統分類の指標として信用性の
高い１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を用いた。
クラスター細菌、具体的にはプレボテラ・ルミニコラ
(Ｐ．ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ)、プレボテラ・ブレビス
(Ｐ．ｂｒｅｖｉｓ)、プレボテラ・ブッカエ（Ｐ. ｂｕ
ｃｃａｅ）、プレボテラ・ブカリス（Ｐ．ｂｕｃｃａｌ
ｉｓ）、プレボテラ・オリス（Ｐ. ｏｒｉｓ）、プレボ
テラ・メラニノゲニカ（Ｐ．ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉ
ｃａ）、プレボテラ・ディシエンス（Ｐ．ｄｉｓｉｅｎ
ｓ）、プレボテラ・ロシェイ（Ｐ．ｌｏｅｓｃｈｅｉ
ｉ）、プレボテラ・デンタリス（Ｐ．ｄｅｎｔａｌｉ
ｓ）、プレボテラ・エノエカ（Ｐ．ｅｎｏｅｃａ）、プ
レボテラ・オウロラ（Ｐ．ｏｕｌｏｒａ）、プレボテラ
・デンティコラ（Ｐ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、プレボテ
ラ・コーポリス（Ｐ．ｃｏｒｐｏｒｉｓ）、プレボテラ
・インターメディア（Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、プ
レボテラ・ニグレセンス（Ｐ．ｎｉｇｒｅｓｃｅｎ
ｓ）、プレボテラ・アルベンシス（Ｐ．ａｌｂｅｎｓｉ
ｓ）、プレボテラ・パレンス（Ｐ．ｐａｌｌｅｎｓ）、
プレボテラ・ビビウス（P. ｂｉｖｉｕｓ）、プレボテラ
・ベロラリス（Ｐ. ｖｅｒｏｒａｌｉｓ）、プレボテラ・
オラリス（Ｐ. ｏｒａｌｉｓ）を特異的に検出・同定で
きるものである。このようなプローブを作成するにあた
り、そのターゲットには系統分類の指標として信用性の
高い１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を用いた。
【００１５】プローブは、データベース（ＤＤＢＪ）に
登録されているプレボテラクラスター各菌種及びその近
縁種の塩基配列を比較、検討して設計した。これらの菌
種間でアライメントを行ったところ（大腸菌のナンバリ
ングで）４９４ｂから５１５ｂの領域にバリエーション
が見られたので、この領域をターゲットとしてプローブ
の設計を行った。また、プローブの全長は、ハイブリダ
イズの特異性、反応の行いやすさ等の理由から２０ｂ.
ｐとした。これは操作上最も好適な長さであるが、使用
に際しては、各々の１６S ｒＲＮＡ遺伝子中において、
該オリゴヌクレオチドに隣接する数ｂ程度を増減させて
も良い。より具体的には、３’側に延ばす場合には２ｂ
程度延長できる。すなわち、３’側に３ｂ以上延ばすと
プレボテラ・ベロラリス、プレボテラ・インターメディア
等に対する反応性が低下するためである。一方、５’側
に延ばすとプローブのGC含量が多くなり反応温度が高く
なり、反応を行いにくい条件となるため好ましくない。
また、全長を短かくし過ぎると、具体的には(大腸菌の
ナンバリングで)503番目と511番目の部分がプローブの
末端側に近くなるほど特異性が弱くなる可能性があり好
ましくない。
登録されているプレボテラクラスター各菌種及びその近
縁種の塩基配列を比較、検討して設計した。これらの菌
種間でアライメントを行ったところ（大腸菌のナンバリ
ングで）４９４ｂから５１５ｂの領域にバリエーション
が見られたので、この領域をターゲットとしてプローブ
の設計を行った。また、プローブの全長は、ハイブリダ
イズの特異性、反応の行いやすさ等の理由から２０ｂ.
ｐとした。これは操作上最も好適な長さであるが、使用
に際しては、各々の１６S ｒＲＮＡ遺伝子中において、
該オリゴヌクレオチドに隣接する数ｂ程度を増減させて
も良い。より具体的には、３’側に延ばす場合には２ｂ
程度延長できる。すなわち、３’側に３ｂ以上延ばすと
プレボテラ・ベロラリス、プレボテラ・インターメディア
等に対する反応性が低下するためである。一方、５’側
に延ばすとプローブのGC含量が多くなり反応温度が高く
なり、反応を行いにくい条件となるため好ましくない。
また、全長を短かくし過ぎると、具体的には(大腸菌の
ナンバリングで)503番目と511番目の部分がプローブの
末端側に近くなるほど特異性が弱くなる可能性があり好
ましくない。
【００１６】上記のように設計したプローブは、その塩
基配列に従い、ＤＮＡ合成機により人工的に合成するこ
とができる。その特異性は、プレボテラクラスター細菌
８菌株、その近縁種１１菌株及びヒト腸内細菌叢の主要
菌種2菌株（ＪＣＭ，ＡＴＣＣ等から入手）を用いて、
ｒＲＮＡに対するプローブのバンド形成能を指標として
確認した。すなわち、まず、上記の菌株を各々単独で培
養した後、ホルマリン固定を行った。次いで、これに蛍
光色素標識した本発明のプローブをハイブリッドさせ、
蛍光顕微鏡によりハイブリッドの検出を行った。結果的
に、プローブの特異性に問題は無かった。
基配列に従い、ＤＮＡ合成機により人工的に合成するこ
とができる。その特異性は、プレボテラクラスター細菌
８菌株、その近縁種１１菌株及びヒト腸内細菌叢の主要
菌種2菌株（ＪＣＭ，ＡＴＣＣ等から入手）を用いて、
ｒＲＮＡに対するプローブのバンド形成能を指標として
確認した。すなわち、まず、上記の菌株を各々単独で培
養した後、ホルマリン固定を行った。次いで、これに蛍
光色素標識した本発明のプローブをハイブリッドさせ、
蛍光顕微鏡によりハイブリッドの検出を行った。結果的
に、プローブの特異性に問題は無かった。
【００１７】また、本発明においては、このプローブを
用いて糞便や歯垢、各種の培養物等の被検体からのプレ
ボテラクラスター細菌の検出、同定を簡便、迅速に行う
ことができる。このような方法に本発明のプローブを使
用する場合には、単独またはその他の特異的プローブを
複数組み合わせて、蛍光標識等の修飾を行うなどして使
用できる。ここで、標識に用いる蛍光物質としては、Fl
uorescein系(FITC,FAM等)、Rhodamine系(TRITC,TAMRA
等)、Texas Red、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7等が挙
げられ、単独で用いる場合には何れの蛍光物質でも使用
できる。しかし、複数の蛍光物質を同時に用いる場合に
は、お互いの蛍光波長が重複しないような組み合わせを
選択しなければならない。すなわち、Fluorescein系に
含まれる蛍光色素は、何れも同じような蛍光波長の特性
を有するため、1種類を選択しなければならない。同じ
ように、Rhomamine系の蛍光色素とTexas RedおよびCy3
は、同じような蛍光波長の特性を有するため、1種類を
選択しなければならない。その他の蛍光色素は、それぞ
れ専用の蛍光フィルターを用いることにより、分別して
検出することが可能である。
用いて糞便や歯垢、各種の培養物等の被検体からのプレ
ボテラクラスター細菌の検出、同定を簡便、迅速に行う
ことができる。このような方法に本発明のプローブを使
用する場合には、単独またはその他の特異的プローブを
複数組み合わせて、蛍光標識等の修飾を行うなどして使
用できる。ここで、標識に用いる蛍光物質としては、Fl
uorescein系(FITC,FAM等)、Rhodamine系(TRITC,TAMRA
等)、Texas Red、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7等が挙
げられ、単独で用いる場合には何れの蛍光物質でも使用
できる。しかし、複数の蛍光物質を同時に用いる場合に
は、お互いの蛍光波長が重複しないような組み合わせを
選択しなければならない。すなわち、Fluorescein系に
含まれる蛍光色素は、何れも同じような蛍光波長の特性
を有するため、1種類を選択しなければならない。同じ
ように、Rhomamine系の蛍光色素とTexas RedおよびCy3
は、同じような蛍光波長の特性を有するため、1種類を
選択しなければならない。その他の蛍光色素は、それぞ
れ専用の蛍光フィルターを用いることにより、分別して
検出することが可能である。
【００１８】本発明のプローブは、このように菌群特異
性を有するとともに、高い反応性を有する。すなわち、
糞便等夾雑物の多い検体からも、目的とする菌群を高感
度に検出することが可能であり、特に、インサイチュハ
イブリダイゼーションに適用した場合の感度、取り扱い
やすさが優れている。
性を有するとともに、高い反応性を有する。すなわち、
糞便等夾雑物の多い検体からも、目的とする菌群を高感
度に検出することが可能であり、特に、インサイチュハ
イブリダイゼーションに適用した場合の感度、取り扱い
やすさが優れている。
【００１９】また、本発明のプローブを用いた検出、同
定方法としては、例えば、インサイチュハイブリダイゼ
ーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏ
ｎ）や、ドットブロットハイブリダイゼーション（ｄｏ
ｔ ｂｌｏｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）等が挙げ
られ、中でもインサイチュハイブリダイゼーションは菌
体内の核酸を抽出する工程を必要としないため、迅速な
手法として好ましい。具体的には、検査試料をホルムア
ルデヒドあるいはホルマリンにより固定する工程、固定
した検査試料をスライドグラスまたはメンブレンフィル
ターに塗抹する工程、蛍光標識したプローブによりハイ
ブリダイゼーションを行う工程、ハイブリダイゼーショ
ン後の余分なプローブおよび非特異的に結合したプロー
ブを洗浄する工程、ハイブリダイズ後の結果について蛍
光顕微鏡を用いて肉眼的に観察、あるいはCCDカメラ等
により画像として取得する工程により行われる。また、
本発明のプローブは、公知のユニバーサルプローブやプ
ライマー等と併用することにより、ＰＣＲ用のプライマ
ーとして用いることも可能である。
定方法としては、例えば、インサイチュハイブリダイゼ
ーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏ
ｎ）や、ドットブロットハイブリダイゼーション（ｄｏ
ｔ ｂｌｏｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）等が挙げ
られ、中でもインサイチュハイブリダイゼーションは菌
体内の核酸を抽出する工程を必要としないため、迅速な
手法として好ましい。具体的には、検査試料をホルムア
ルデヒドあるいはホルマリンにより固定する工程、固定
した検査試料をスライドグラスまたはメンブレンフィル
ターに塗抹する工程、蛍光標識したプローブによりハイ
ブリダイゼーションを行う工程、ハイブリダイゼーショ
ン後の余分なプローブおよび非特異的に結合したプロー
ブを洗浄する工程、ハイブリダイズ後の結果について蛍
光顕微鏡を用いて肉眼的に観察、あるいはCCDカメラ等
により画像として取得する工程により行われる。また、
本発明のプローブは、公知のユニバーサルプローブやプ
ライマー等と併用することにより、ＰＣＲ用のプライマ
ーとして用いることも可能である。
【００２０】本発明のプローブでは、高頻度に検出され
るバクテロイデスグループ細菌以外の細菌を検出するこ
とは不可能であるものの、これらの菌数等がわかれば検
体の細菌叢に関する様々な情報が得られる。これらの菌
数値は、次の下式１から求められる。
るバクテロイデスグループ細菌以外の細菌を検出するこ
とは不可能であるものの、これらの菌数等がわかれば検
体の細菌叢に関する様々な情報が得られる。これらの菌
数値は、次の下式１から求められる。
【００２１】
【式１】菌数値（試料１ｇあたりの菌数）＝試料の塗抹
面積×試料の希釈倍数×（顕微鏡１視野又は１画像中に
おけるハイブリシグナル陽性の菌体数）／{（顕微鏡１
視野又は１画像の面積）×塗抹量（ｇ）}
面積×試料の希釈倍数×（顕微鏡１視野又は１画像中に
おけるハイブリシグナル陽性の菌体数）／{（顕微鏡１
視野又は１画像の面積）×塗抹量（ｇ）}
【００２２】更に、他の多岐にわたる細菌のプローブや
プライマー、例えば特開平１１−２２１０８２号に記載
されているバクテロイデス属細菌に特異的なプローブや
特開平１１−１２３９０３号に記載されているビフィド
バクテリウム属細菌に特異的なプローブ等を併用するこ
とにより、腸内細菌叢の主要な構成菌群の解析を簡便、
迅速に行うことも可能である。
プライマー、例えば特開平１１−２２１０８２号に記載
されているバクテロイデス属細菌に特異的なプローブや
特開平１１−１２３９０３号に記載されているビフィド
バクテリウム属細菌に特異的なプローブ等を併用するこ
とにより、腸内細菌叢の主要な構成菌群の解析を簡便、
迅速に行うことも可能である。
【００２３】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが本発明はこれらに限定されるものではない。
明するが本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２４】
【実施例１】プローブの作成
プローブの塩基配列の決定には、ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂ
ａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）等に登録されて
いる１６S ｒＲＮＡ塩基配列を用いた。すなわち、表1
に示すプレボテラクラスター細菌15菌種、バクテロイデ
スクラスター細菌6菌種、ポルフィロモナスクラスター
細菌9菌種、NEW1細菌1菌種、NEW2細菌3菌種の塩基配列
を用いた。
ａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）等に登録されて
いる１６S ｒＲＮＡ塩基配列を用いた。すなわち、表1
に示すプレボテラクラスター細菌15菌種、バクテロイデ
スクラスター細菌6菌種、ポルフィロモナスクラスター
細菌9菌種、NEW1細菌1菌種、NEW2細菌3菌種の塩基配列
を用いた。
【００２５】
【表１】
【００２６】また、塩基配列のアライメントには系統樹
作成用ソフトClustal W（version1.5）を用いて、プレ
ボテラクラスターに共通な塩基配列の検索を行った。ア
ライメントの結果は図１に示す。こうして設計されたDN
Aの合成は、DNA合成機を用いて行った。
作成用ソフトClustal W（version1.5）を用いて、プレ
ボテラクラスターに共通な塩基配列の検索を行った。ア
ライメントの結果は図１に示す。こうして設計されたDN
Aの合成は、DNA合成機を用いて行った。
【００２７】
【実施例２】ホールセルハイブリダイゼーションによる
プローブの特異性の確認 （１）プローブの標識 ハイブリダイゼーションによる検出には、本発明のプロ
ーブ（Ｐｒｅｖ４９６）とポジティブコントロールとし
てユニバーサルプローブであるＥＵＢ３３８（表２）を
用いることとした。オリゴヌクレオチドの５’末端側に
は、Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｉｓ
ｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（TRITC）で蛍光標識した。
プローブの特異性の確認 （１）プローブの標識 ハイブリダイゼーションによる検出には、本発明のプロ
ーブ（Ｐｒｅｖ４９６）とポジティブコントロールとし
てユニバーサルプローブであるＥＵＢ３３８（表２）を
用いることとした。オリゴヌクレオチドの５’末端側に
は、Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｉｓ
ｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（TRITC）で蛍光標識した。
【００２８】
【表２】
【００２９】（２）供試菌株
菌株は、表３に示すプレボテラ属8菌種、バクテロイデ
ス属10菌種、リケネラ属1菌種とヒト腸内細菌叢の主要
構成菌である2菌属2菌種の計21菌株を用いた。これらの
菌株はJCM、ATCC等から入手した基準株及び標準株であ
る。
ス属10菌種、リケネラ属1菌種とヒト腸内細菌叢の主要
構成菌である2菌属2菌種の計21菌株を用いた。これらの
菌株はJCM、ATCC等から入手した基準株及び標準株であ
る。
【００３０】
【表３】
【００３１】（３）供試菌液の調製
各菌株を１０mlのGAMブロス液体培地で３７℃、１０時
間嫌気培養した。培養後の菌体１ｍｌを遠心により集菌
後、PBS緩衝液で２回洗浄した。更に、１ｍｌの１％ホ
ルマリン溶液で再懸濁し、氷中にて３０分間静置して固
定した。固定後の菌体をPBS緩衝液で２回洗浄し、１ｍ
ｌの５０％エタノールPBS溶液に再懸濁して、−２０℃
に３０分間静置したものを供試菌液とした。
間嫌気培養した。培養後の菌体１ｍｌを遠心により集菌
後、PBS緩衝液で２回洗浄した。更に、１ｍｌの１％ホ
ルマリン溶液で再懸濁し、氷中にて３０分間静置して固
定した。固定後の菌体をPBS緩衝液で２回洗浄し、１ｍ
ｌの５０％エタノールPBS溶液に再懸濁して、−２０℃
に３０分間静置したものを供試菌液とした。
【００３２】（４）ホールセルハイブリダイゼーション
法 ゼラチンコートしたスライドグラス上に、４２の区画
（１区画は３ｍｍ四方）を作製し、その１区画ごとに供
試菌液１μｌずつ塗抹し、風乾させた。このスライドグ
ラスを９６％エタノール中に１０分間浸した。１００μ
ｌのハイブリダイゼーション溶液（750 mM NaCl, 100
mM Tris-HCl(pH 7.8), 5mM EDTA, 0.01% BSA,
0.2% Poly-A, 10% dextran sulfate）中に、５００
ngのDNAプローブを加え、スライドグラス上の菌液塗抹
面上に塗布し、カバーグラスをかけた。このスライドグ
ラスをSET溶液(750mM NaCl、100mM Tris-HCl、5mM E
DTA)で湿潤化した40℃の暗箱中に一晩静置した。
法 ゼラチンコートしたスライドグラス上に、４２の区画
（１区画は３ｍｍ四方）を作製し、その１区画ごとに供
試菌液１μｌずつ塗抹し、風乾させた。このスライドグ
ラスを９６％エタノール中に１０分間浸した。１００μ
ｌのハイブリダイゼーション溶液（750 mM NaCl, 100
mM Tris-HCl(pH 7.8), 5mM EDTA, 0.01% BSA,
0.2% Poly-A, 10% dextran sulfate）中に、５００
ngのDNAプローブを加え、スライドグラス上の菌液塗抹
面上に塗布し、カバーグラスをかけた。このスライドグ
ラスをSET溶液(750mM NaCl、100mM Tris-HCl、5mM E
DTA)で湿潤化した40℃の暗箱中に一晩静置した。
【００３３】反応後のスライドグラスを45℃のWash溶液
(50mM NaCl、4mM Tris-HCl、0.02mM EDTA)中に20分間
静置した後、滅菌蒸留水にて1回洗浄した。風乾後、封
入剤(VECTASHIELD（登録商標）（Vector Laboratorie
s）)で封入し、蛍光顕微鏡（OLYMPUS BX-FLA）下でシグ
ナルの有無を観察した。
(50mM NaCl、4mM Tris-HCl、0.02mM EDTA)中に20分間
静置した後、滅菌蒸留水にて1回洗浄した。風乾後、封
入剤(VECTASHIELD（登録商標）（Vector Laboratorie
s）)で封入し、蛍光顕微鏡（OLYMPUS BX-FLA）下でシグ
ナルの有無を観察した。
【００３４】このようにして、本発明のプローブを用い
て検出した結果、分譲機関より入手した株名に相当する
反応が特異的に見られた（表４）。
て検出した結果、分譲機関より入手した株名に相当する
反応が特異的に見られた（表４）。
【００３５】
【表４】
【００３６】
【実施例３】大便中におけるプレボテラクラスターの定
量 （１）プローブの標識 ハイブリダイゼーションによる検出には、本発明のプロ
ーブ(Ｐｒｅｖ４９６)とポジティブコントロールとして
ユニバーサルプローブであるＥＵＢ３３８を用いること
とした。オリゴヌクレオチドの５’末端側には、Ｔｅｔ
ｒａｍｅｔｈｙｌ ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｉｓｏｔｈｉｏ
ｃｙａｎａｔｅ(ＴＲＩＴＣ)で蛍光標識した。
量 （１）プローブの標識 ハイブリダイゼーションによる検出には、本発明のプロ
ーブ(Ｐｒｅｖ４９６)とポジティブコントロールとして
ユニバーサルプローブであるＥＵＢ３３８を用いること
とした。オリゴヌクレオチドの５’末端側には、Ｔｅｔ
ｒａｍｅｔｈｙｌ ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｉｓｏｔｈｉｏ
ｃｙａｎａｔｅ(ＴＲＩＴＣ)で蛍光標識した。
【００３７】（２）大便試料の処理方法
健常成人の新鮮排泄便を冷PBS緩衝液で10倍希釈し、そ
の一部に3倍量の4%パラホルムアルデヒド−PBS溶液を加
えて、一晩4℃に静置して固定した。この固定済み大便
は、使用時まで-80℃にて保存した。
の一部に3倍量の4%パラホルムアルデヒド−PBS溶液を加
えて、一晩4℃に静置して固定した。この固定済み大便
は、使用時まで-80℃にて保存した。
【００３８】（３）固定済み大便試料のハイブリダイゼ
ーション法 ゼラチンコートしたスライドグラス上の1cm四方の区画
に100から400倍に希釈した固定済み大便試料を１０μｌ
ずつ塗抹し、風乾させた。このスライドグラスを９６％
エタノール中に１０分間浸した。１００μｌのハイブリ
ダイゼーション溶液（750mM NaCl, 100mM Tris-HCl
(pH 7.8), 5mM EDTA, 0.01% BSA, 0.2% Poly-A,
10% dextran sulfate）中に、５００ngの上記DNAプ
ローブを加え、スライドグラス上の大便塗抹面上に塗布
し、カバーグラスをかけた。このスライドグラスをSET
溶液(750mM NaCl、100mM Tris-HCl、5mM EDTA)で湿
潤化した40℃の暗箱中に一晩静置した。
ーション法 ゼラチンコートしたスライドグラス上の1cm四方の区画
に100から400倍に希釈した固定済み大便試料を１０μｌ
ずつ塗抹し、風乾させた。このスライドグラスを９６％
エタノール中に１０分間浸した。１００μｌのハイブリ
ダイゼーション溶液（750mM NaCl, 100mM Tris-HCl
(pH 7.8), 5mM EDTA, 0.01% BSA, 0.2% Poly-A,
10% dextran sulfate）中に、５００ngの上記DNAプ
ローブを加え、スライドグラス上の大便塗抹面上に塗布
し、カバーグラスをかけた。このスライドグラスをSET
溶液(750mM NaCl、100mM Tris-HCl、5mM EDTA)で湿
潤化した40℃の暗箱中に一晩静置した。
【００３９】反応後のスライドグラスを45℃のWash溶液
(50mM NaCl、4mM Tris-HCl、0.02mM EDTA)中に20分
間静置した後、滅菌蒸留水にて1回洗浄した。風乾後、
封入剤(VECTASHIELD（登録商標）（Vector Laboratori
es）)で封入し、蛍光顕微鏡（OLYMPUS BX-FLA）下で肉
眼的またはCCDカメラを用いて画像を取得してシグナル
陽性の菌体数を測定した。
(50mM NaCl、4mM Tris-HCl、0.02mM EDTA)中に20分
間静置した後、滅菌蒸留水にて1回洗浄した。風乾後、
封入剤(VECTASHIELD（登録商標）（Vector Laboratori
es）)で封入し、蛍光顕微鏡（OLYMPUS BX-FLA）下で肉
眼的またはCCDカメラを用いて画像を取得してシグナル
陽性の菌体数を測定した。
【００４０】（４）菌数の算出法および菌数測定結果
これらの菌数値は、次式から求めた。すなわち、試料１
ｇあたりの菌数=試料の塗抹面積／顕微鏡１視野あるい
は１画像の面積×試料の希釈倍数×１／塗抹量(ｇ)×顕
微鏡１視野あるいは１画像中におけるハイブリシグナル
陽性の菌体数である。なお、同一サンプルに対して最低
１０視野の測定を行い、その平均値を菌数の代表値とし
た。また、菌数測定結果を表５に示した。
ｇあたりの菌数=試料の塗抹面積／顕微鏡１視野あるい
は１画像の面積×試料の希釈倍数×１／塗抹量(ｇ)×顕
微鏡１視野あるいは１画像中におけるハイブリシグナル
陽性の菌体数である。なお、同一サンプルに対して最低
１０視野の測定を行い、その平均値を菌数の代表値とし
た。また、菌数測定結果を表５に示した。
【００４１】
【表５】
【００４２】
【発明の効果】本発明のプローブを使用すれば、ヒト腸
内で高頻度に検出されるプレボテラクラスター細菌の検
出、同定を迅速、簡便、正確且つ高感度に行うことがで
きる。また、他の細菌類等に特異的なプローブ、プライ
マーなどと組み合わせれば、腸内細菌叢の解析も迅速、
簡便に行え、細菌叢の状態から個体の消化管の状態を把
握することも可能である。
内で高頻度に検出されるプレボテラクラスター細菌の検
出、同定を迅速、簡便、正確且つ高感度に行うことがで
きる。また、他の細菌類等に特異的なプローブ、プライ
マーなどと組み合わせれば、腸内細菌叢の解析も迅速、
簡便に行え、細菌叢の状態から個体の消化管の状態を把
握することも可能である。
【００４３】
【配列表】
<110>株式会社ヤクルト本社（KABUSHIKIKAISHA YAKULT HONSHA）
<120>Probe for Prevotella cluster
<130>YPA01002
<160>1
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>1
CGGAATTAGC CGGTCCTTAT 20
【図１】プレボテラクラスター細菌とその近縁種におけ
る１６S ｒＲＮＡ塩基配列のアライメントの結果を示す
図である。
る１６S ｒＲＮＡ塩基配列のアライメントの結果を示す
図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
// Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
Ｆターム(参考） 2G045 AA28 CB21 DA12 DA13 DA14
FB02 FB07 FB12 GC15
4B024 AA11 BA80 CA01 CA11 HA12
4B063 QA01 QA18 QQ06 QQ42 QQ52
QR55 QS34 QS36 QX02
Claims (4)
- 【請求項１】 配列番号１で表される塩基配列又は該塩
基配列に相補的な配列を有するプレボテラクラスター細
菌に特異的なDNAプローブ - 【請求項２】 請求項１記載のDNAプローブを用いるこ
とを特徴とするプレボテラクラスター細菌の検出方法。 - 【請求項３】 プレボテラクラスター細菌が、プレボテ
ラ・ルミニコラ(Ｐ．ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ)、プレボテ
ラ・ブレビス(Ｐ．ｂｒｅｖｉｓ)、プレボテラ・ブッカ
エ（Ｐ. ｂｕｃｃａｅ）、プレボテラ・ブカリス（Ｐ．
ｂｕｃｃａｌｉｓ）、プレボテラ・オリス（Ｐ. ｏｒｉ
ｓ）、プレボテラ・メラニノゲニカ（Ｐ．ｍｅｌａｎｉ
ｎｏｇｅｎｉｃａ）、プレボテラ・ディシエンス（Ｐ．
ｄｉｓｉｅｎｓ）、プレボテラ・ロシェイ（Ｐ．ｌｏｅ
ｓｃｈｅｉｉ）、プレボテラ・デンタリス（Ｐ．ｄｅｎ
ｔａｌｉｓ）、プレボテラ・エノエカ（Ｐ．ｅｎｏｅｃ
ａ）、プレボテラ・オウロラ（Ｐ．ｏｕｌｏｒａ）、プ
レボテラ・デンティコラ（Ｐ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、
プレボテラ・コーポリス（Ｐ．ｃｏｒｐｏｒｉｓ）、プ
レボテラ・インターメディア（Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉ
ａ）、プレボテラ・ニグレセンス（Ｐ．ｎｉｇｒｅｓｃ
ｅｎｓ）、プレボテラ・アルベンシス（Ｐ．ａｌｂｅｎ
ｓｉｓ）、プレボテラ・パレンス（Ｐ．ｐａｌｌｅｎ
ｓ）、プレボテラ・ビビウス（P. ｂｉｖｉｕｓ）、プレ
ボテラ・ベロラリス（Ｐ. ｖｅｒｏｒａｌｉｓ）、プレ
ボテラ・オラリス（Ｐ. ｏｒａｌｉｓ）から選ばれる１
ないし２以上のプレボテラクラスター細菌である、請求
項２記載のプレボテラクラスター細菌の検出方法。 - 【請求項4】 次の(a)及び(b)工程 (a)被検体と蛍光色素で標識したプローブとを反応させ
る工程 (b)反応後の被検体の蛍光を検出する工程 を含むことを特徴とする請求項２記載のプレボテラクラ
スター細菌の検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001341559A JP3902941B2 (ja) | 2001-11-07 | 2001-11-07 | プレボテラクラスター細菌用プローブおよびこれを用いた検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001341559A JP3902941B2 (ja) | 2001-11-07 | 2001-11-07 | プレボテラクラスター細菌用プローブおよびこれを用いた検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003144199A true JP2003144199A (ja) | 2003-05-20 |
| JP3902941B2 JP3902941B2 (ja) | 2007-04-11 |
Family
ID=19155568
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001341559A Expired - Fee Related JP3902941B2 (ja) | 2001-11-07 | 2001-11-07 | プレボテラクラスター細菌用プローブおよびこれを用いた検出方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3902941B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008118911A (ja) * | 2006-11-10 | 2008-05-29 | Canon Inc | プローブ、プローブセット、プローブ固定担体及び遺伝子検査方法 |
| US11529380B2 (en) | 2016-12-23 | 2022-12-20 | MURDOCH CHILDREN'S RESEARCH INSTITUTE Parkville | Methods and compositions for determining, and for minimizing, the likelihood of development of allergy in infants |
-
2001
- 2001-11-07 JP JP2001341559A patent/JP3902941B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008118911A (ja) * | 2006-11-10 | 2008-05-29 | Canon Inc | プローブ、プローブセット、プローブ固定担体及び遺伝子検査方法 |
| US11529380B2 (en) | 2016-12-23 | 2022-12-20 | MURDOCH CHILDREN'S RESEARCH INSTITUTE Parkville | Methods and compositions for determining, and for minimizing, the likelihood of development of allergy in infants |
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|---|---|
| JP3902941B2 (ja) | 2007-04-11 |
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