JPH11221082A - バクテロイデス属細菌用プローブ及びこれを用いた検出方法 - Google Patents
バクテロイデス属細菌用プローブ及びこれを用いた検出方法Info
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- JPH11221082A JPH11221082A JP10037953A JP3795398A JPH11221082A JP H11221082 A JPH11221082 A JP H11221082A JP 10037953 A JP10037953 A JP 10037953A JP 3795398 A JP3795398 A JP 3795398A JP H11221082 A JPH11221082 A JP H11221082A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 配列番号１の塩基配列又は該塩基配列に
相補的な配列を有するバクテロイデス属細菌用プロー
ブ、並びにこのプローブを使用するバクテロイデスクラ
スター細菌及びバクテロイデス・ディスタソニスの検
出、同定法 【効果】 菌を培養することなく、ヒト腸管内から高頻
度に検出されるバクテロイデス属細菌を迅速、簡便に検
出することができる
相補的な配列を有するバクテロイデス属細菌用プロー
ブ、並びにこのプローブを使用するバクテロイデスクラ
スター細菌及びバクテロイデス・ディスタソニスの検
出、同定法 【効果】 菌を培養することなく、ヒト腸管内から高頻
度に検出されるバクテロイデス属細菌を迅速、簡便に検
出することができる
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトの腸管内に生
息するバクテロイデス属細菌の中でも、特に検出頻度の
高いバクテロイデスクラスター細菌及びバクテロイデス
・ディスタソニスに特異的なプローブ及び該プローブを
使用したバクテロイデス属細菌の検出方法に関するもの
である。
息するバクテロイデス属細菌の中でも、特に検出頻度の
高いバクテロイデスクラスター細菌及びバクテロイデス
・ディスタソニスに特異的なプローブ及び該プローブを
使用したバクテロイデス属細菌の検出方法に関するもの
である。
【０００２】
【従来の技術】バクテロイデス属細菌はグラム陰性の嫌
気性細菌であり、ヒト腸管内に常在する細菌群の一種で
ある。特に大腸内においては、最優勢菌の１つである。
気性細菌であり、ヒト腸管内に常在する細菌群の一種で
ある。特に大腸内においては、最優勢菌の１つである。
【０００３】近年バクテロイデス属細菌に関しては近縁
の細菌群とあわせ、新しい分類が提唱されている（ＪＯ
ＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏ
ｌ．１７６，Ｎｏ．３ ｐ７２５−７３２，１９９
４）。すなわち、バクテロイデス属細菌にポルフィロモ
ナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）属細菌、プレボテ
ラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）属細菌等を含めバクテロイ
デスグループ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ）とし、
またそのサブグループをバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒ
ｏｉｄｅｓ）クラスター、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅ
ｌｌａ）クラスター、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙ
ｒｏｍｏｎａｓ）クラスター、ニュー１（Ｎｅｗ１）、
ニュー２（Ｎｅｗ２）の５つに大別しているのである。
の細菌群とあわせ、新しい分類が提唱されている（ＪＯ
ＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏ
ｌ．１７６，Ｎｏ．３ ｐ７２５−７３２，１９９
４）。すなわち、バクテロイデス属細菌にポルフィロモ
ナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）属細菌、プレボテ
ラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）属細菌等を含めバクテロイ
デスグループ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ）とし、
またそのサブグループをバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒ
ｏｉｄｅｓ）クラスター、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅ
ｌｌａ）クラスター、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙ
ｒｏｍｏｎａｓ）クラスター、ニュー１（Ｎｅｗ１）、
ニュー２（Ｎｅｗ２）の５つに大別しているのである。
【０００４】新分類においては、旧分類でバクテロイデ
ス属細菌とされていた菌種でもバクテロイデスクラスタ
ー以外のクラスターに属する場合もある。例えば、バク
テロイデス・スプランチニカス（Ｂ．ｓｐｌａｎｃｈｎ
ｉｃｕｓ）はニュー１クラスターに、バクテロイデス・
ディスタソニスはポルフィロモナスクラスターに分類さ
れる。このようにバクテロイデス属細菌及びその近縁の
細菌群について新しい分類がなされてはいるものの、ヒ
トや動物等の腸内細菌叢を解析し、個体の健康状態の把
握や腸管内の病理的研究等を行う場合には、旧分類にお
けるバクテロイデス属細菌の動向も非常に有用な知見と
なる。特に、バクテロイデス・ブルゲイタスやバクテロ
イデス・ディスタソニスのようにヒト腸管内において高
頻度に検出されるものは（Ｂｅｎｎｏ．Ｙ．，ａｎｄ
Ｔ．Ｍｉｔｓｕｏｋａ．１９８６．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅ
ｎｔ ｏｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｉｃｒｏｆｌｏ
ｒａ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ ａｎｄ ａｎｉｍａｌｓ．
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ Ｍｉｃｒｏｆｌｏｒ
ａ）、生態学的研究や臨床株の同定等、種々の研究を行
う場合の重要な検出対象となる。
ス属細菌とされていた菌種でもバクテロイデスクラスタ
ー以外のクラスターに属する場合もある。例えば、バク
テロイデス・スプランチニカス（Ｂ．ｓｐｌａｎｃｈｎ
ｉｃｕｓ）はニュー１クラスターに、バクテロイデス・
ディスタソニスはポルフィロモナスクラスターに分類さ
れる。このようにバクテロイデス属細菌及びその近縁の
細菌群について新しい分類がなされてはいるものの、ヒ
トや動物等の腸内細菌叢を解析し、個体の健康状態の把
握や腸管内の病理的研究等を行う場合には、旧分類にお
けるバクテロイデス属細菌の動向も非常に有用な知見と
なる。特に、バクテロイデス・ブルゲイタスやバクテロ
イデス・ディスタソニスのようにヒト腸管内において高
頻度に検出されるものは（Ｂｅｎｎｏ．Ｙ．，ａｎｄ
Ｔ．Ｍｉｔｓｕｏｋａ．１９８６．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅ
ｎｔ ｏｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｉｃｒｏｆｌｏ
ｒａ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ ａｎｄ ａｎｉｍａｌｓ．
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ Ｍｉｃｒｏｆｌｏｒ
ａ）、生態学的研究や臨床株の同定等、種々の研究を行
う場合の重要な検出対象となる。
【０００５】同定は通常、菌の表現形質を指標としてな
されている。ＢＥＲＧＥＹ’Ｓ ＭＡＮＵＡＬ ＯＦ
Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙで
は、無芽胞、非運動性の嫌気性グラム陰性桿菌で、糖を
発酵しコハク酸、酢酸、乳酸、蟻酸あるいはプロピオン
酸を産生する菌群をバクテロイデス属と同定している。
しかしながら、このような表現形質を元にした同定法で
は結果が得られるまで数日から数週間の時間を要し、ま
た手技も煩雑で熟練を要する。
されている。ＢＥＲＧＥＹ’Ｓ ＭＡＮＵＡＬ ＯＦ
Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙで
は、無芽胞、非運動性の嫌気性グラム陰性桿菌で、糖を
発酵しコハク酸、酢酸、乳酸、蟻酸あるいはプロピオン
酸を産生する菌群をバクテロイデス属と同定している。
しかしながら、このような表現形質を元にした同定法で
は結果が得られるまで数日から数週間の時間を要し、ま
た手技も煩雑で熟練を要する。
【０００６】また、近年では、ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性試
験による判定やモノクローナル抗体による検出も行われ
るようになっている。しかしながら、これらの同定法で
も時間や熟練が要求されるため、迅速な検出、同定を行
うには不向きであった。
験による判定やモノクローナル抗体による検出も行われ
るようになっている。しかしながら、これらの同定法で
も時間や熟練が要求されるため、迅速な検出、同定を行
うには不向きであった。
【０００７】一方、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９
６），１４２，１０９７−１１０６には、バクテロイデ
スとプレボテラクラスターに特異的なプローブを用い、
同定を行う方法が記載されている。しかしながら、この
プローブは新分類のバクテロイデスクラスター細菌のみ
ならずプレボテラクラスター細菌も検出してしまうた
め、バクテロイデス属細菌の検出、同定には使用できな
い。
６），１４２，１０９７−１１０６には、バクテロイデ
スとプレボテラクラスターに特異的なプローブを用い、
同定を行う方法が記載されている。しかしながら、この
プローブは新分類のバクテロイデスクラスター細菌のみ
ならずプレボテラクラスター細菌も検出してしまうた
め、バクテロイデス属細菌の検出、同定には使用できな
い。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】このように、表現形質
の違いやＤＮＡ−ＤＮＡ相同性試験からバクテロイデス
属細菌の検出、同定を行うには、長時間を要し、操作が
煩雑である等の問題があった。また、バクテロイデスク
ラスターとプレボテラクラスターに特異的なプローブは
以前から存在しているものの、ヒト腸内で高頻度に検出
されるバクテロイデス属細菌に特異的なプローブは見出
されていない。このため、これらの菌群を簡便、迅速に
検出することは困難であった。
の違いやＤＮＡ−ＤＮＡ相同性試験からバクテロイデス
属細菌の検出、同定を行うには、長時間を要し、操作が
煩雑である等の問題があった。また、バクテロイデスク
ラスターとプレボテラクラスターに特異的なプローブは
以前から存在しているものの、ヒト腸内で高頻度に検出
されるバクテロイデス属細菌に特異的なプローブは見出
されていない。このため、これらの菌群を簡便、迅速に
検出することは困難であった。
【０００９】従って、本発明は、ヒトの腸内細菌叢にお
いて高頻度に検出されるバクテロイデスクラスター細菌
及びバクテロイデス・ディスタソニスの検出、同定を迅
速且つ正確に行えるバクテロイデス属細菌特異的プロー
ブを提供することを目的としている。また、本発明は該
プローブを用いた細菌叢の解析及びバクテロイデス属細
菌の検出方法を提供することも目的としている。
いて高頻度に検出されるバクテロイデスクラスター細菌
及びバクテロイデス・ディスタソニスの検出、同定を迅
速且つ正確に行えるバクテロイデス属細菌特異的プロー
ブを提供することを目的としている。また、本発明は該
プローブを用いた細菌叢の解析及びバクテロイデス属細
菌の検出方法を提供することも目的としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究の
結果、バクテロイデスクラスター細菌及びバクテロイデ
ス・ディスタソニスに特異的な塩基配列が１６ＳｒＲＮ
Ａ上に存在することを見出し、これを用いれば細菌の培
養を行うことなく、検体から抽出した細菌由来の核酸を
検出することにより、迅速且つ正確にバクテロイデス属
細菌の検出、同定が可能となることを見出し本発明を完
成した。
結果、バクテロイデスクラスター細菌及びバクテロイデ
ス・ディスタソニスに特異的な塩基配列が１６ＳｒＲＮ
Ａ上に存在することを見出し、これを用いれば細菌の培
養を行うことなく、検体から抽出した細菌由来の核酸を
検出することにより、迅速且つ正確にバクテロイデス属
細菌の検出、同定が可能となることを見出し本発明を完
成した。
【００１１】すなわち本発明は、配列番号１の塩基配列
又は該塩基配列に相補的な配列を有するバクテロイデス
クラスター細菌及びバクテロイデス・ディスタソニスに
特異的なオリゴヌクレオチドプローブを提供するもので
ある。
又は該塩基配列に相補的な配列を有するバクテロイデス
クラスター細菌及びバクテロイデス・ディスタソニスに
特異的なオリゴヌクレオチドプローブを提供するもので
ある。
【００１２】また本発明は、配列番号１の塩基配列又は
該塩基配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド
プローブを用いることを特徴とするバクテロイデス属細
菌の検出、同定方法を提供するものである。
該塩基配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド
プローブを用いることを特徴とするバクテロイデス属細
菌の検出、同定方法を提供するものである。
【００１３】更に本発明は、（１）検体中の核酸を抽出
する工程、（２）抽出した核酸を増幅させる増幅工程、
及び（３）増幅した核酸に配列番号１のオリゴヌクレオ
チドプローブを反応させる工程を含むことを特徴とする
バクテロイデス属細菌の検出方法を提供するものであ
る。
する工程、（２）抽出した核酸を増幅させる増幅工程、
及び（３）増幅した核酸に配列番号１のオリゴヌクレオ
チドプローブを反応させる工程を含むことを特徴とする
バクテロイデス属細菌の検出方法を提供するものであ
る。
【００１４】
【発明の実施の形態】本発明のプローブは、ヒト腸内に
おいて高頻度に検出されるバクテロイデス属細菌、具体
的にはバクテロイデス・ブルゲイタス（Ｂ．ｖｕｌｇａ
ｔｕｓ）、バクテロイデス・ディスタソニス（Ｂ．ｄｉ
ｓｔａｓｏｎｉｓ）、バクテロイデス・セタイオタオミ
クロン（Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）、バ
クテロイデス・フラギリス（Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）、
バクテロイデス・ユニフォルミス（Ｂ．ｕｎｉｆｏｒｍ
ｉｓ）、バクテロイデス・オバタス（Ｂ．ｏｖａｔｕ
ｓ）等を特異的に同定できるものである。このようなプ
ローブを作成するにあたり、そのターゲットには系統分
類の指標として信用性の高い１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を用
いた。また、ドットブロットハイブリダイゼーションや
ホールセルハイブリダイゼーションにより同定・解析を
行う際には、ＲＮＡでなくＤＮＡを用いた。
おいて高頻度に検出されるバクテロイデス属細菌、具体
的にはバクテロイデス・ブルゲイタス（Ｂ．ｖｕｌｇａ
ｔｕｓ）、バクテロイデス・ディスタソニス（Ｂ．ｄｉ
ｓｔａｓｏｎｉｓ）、バクテロイデス・セタイオタオミ
クロン（Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）、バ
クテロイデス・フラギリス（Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）、
バクテロイデス・ユニフォルミス（Ｂ．ｕｎｉｆｏｒｍ
ｉｓ）、バクテロイデス・オバタス（Ｂ．ｏｖａｔｕ
ｓ）等を特異的に同定できるものである。このようなプ
ローブを作成するにあたり、そのターゲットには系統分
類の指標として信用性の高い１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を用
いた。また、ドットブロットハイブリダイゼーションや
ホールセルハイブリダイゼーションにより同定・解析を
行う際には、ＲＮＡでなくＤＮＡを用いた。
【００１５】プローブは、データベース（ＤＤＢＪ、Ｇ
ｅｎｅ ｂａｎｋ等）に登録されているバクテロイデス
グループ各菌種の塩基配列を比較、検討して設計した。
これらの菌種間でアライメントしたところ（大腸菌のナ
ンバリングで）２８０ｂから２９９ｂの領域にバリエー
ションが見られたので、この領域をターゲットとしてプ
ローブの設計を行った。また、プローブの全長は、ハイ
ブリダイズの特異性、反応の行いやすさ等の理由から１
９ｂ．ｐとした。これは操作上最も好適な長さである
が、使用に際しては、各々の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子中に
おいて、該オリゴヌクレオチドに隣接する数ｂ程度を増
減させてもよい。より具体的には、５’側に塩基を延ば
す場合には３ｂ、３’側に延ばす場合には１ｂ程度延長
できる。すなわち、３’側に２ｂ以上延ばすとバクテロ
イデス・ディスタソニス等に対する反応性が低下し、
５’側に４ｂ以上延ばすとバクテロイデスクラスター細
菌への特異性が弱まる可能性が高いのである。また、全
長を短くし過ぎると特異性が弱くなってしまうため好ま
しくない。
ｅｎｅ ｂａｎｋ等）に登録されているバクテロイデス
グループ各菌種の塩基配列を比較、検討して設計した。
これらの菌種間でアライメントしたところ（大腸菌のナ
ンバリングで）２８０ｂから２９９ｂの領域にバリエー
ションが見られたので、この領域をターゲットとしてプ
ローブの設計を行った。また、プローブの全長は、ハイ
ブリダイズの特異性、反応の行いやすさ等の理由から１
９ｂ．ｐとした。これは操作上最も好適な長さである
が、使用に際しては、各々の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子中に
おいて、該オリゴヌクレオチドに隣接する数ｂ程度を増
減させてもよい。より具体的には、５’側に塩基を延ば
す場合には３ｂ、３’側に延ばす場合には１ｂ程度延長
できる。すなわち、３’側に２ｂ以上延ばすとバクテロ
イデス・ディスタソニス等に対する反応性が低下し、
５’側に４ｂ以上延ばすとバクテロイデスクラスター細
菌への特異性が弱まる可能性が高いのである。また、全
長を短くし過ぎると特異性が弱くなってしまうため好ま
しくない。
【００１６】上記のように設計したプローブは、その塩
基配列に従い、ＤＮＡ合成機により人工的に合成され
る。その属特異性は、バクテロイデスグループ細菌１９
株及び代表的腸内細菌の基準株及び標準株２０株（ＪＣ
Ｍ，ＡＴＣＣ等から入手）のＤＮＡに対するプローブの
バンド形成能を指標として確認した。すなわち、まず、
上記の菌株を各々単独で培養した後ＤＮＡを抽出し、公
知のプライマーを使用して１６ＳｒＲＮＡ部分を増幅
し、電気泳動によりＰＣＲプロダクトを確認した。次い
で、これに本発明のプローブをハイブリッドさせ、ＤＩ
Ｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔによりハイブリッドの
検出を行った。結果的に、プローブの特異性に問題はな
かった。
基配列に従い、ＤＮＡ合成機により人工的に合成され
る。その属特異性は、バクテロイデスグループ細菌１９
株及び代表的腸内細菌の基準株及び標準株２０株（ＪＣ
Ｍ，ＡＴＣＣ等から入手）のＤＮＡに対するプローブの
バンド形成能を指標として確認した。すなわち、まず、
上記の菌株を各々単独で培養した後ＤＮＡを抽出し、公
知のプライマーを使用して１６ＳｒＲＮＡ部分を増幅
し、電気泳動によりＰＣＲプロダクトを確認した。次い
で、これに本発明のプローブをハイブリッドさせ、ＤＩ
Ｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔによりハイブリッドの
検出を行った。結果的に、プローブの特異性に問題はな
かった。
【００１７】本発明のプライマーは、このように属特異
性を有するため、これを用いて糞便等からのバクテロイ
デス属細菌の検出、同定を簡便、迅速に行うことができ
る。また、バクテロイデス属細菌用選択培地であるＮＢ
ＧＴ培地（光岡知足（１９８０）腸内菌の世界−嫌気性
菌の分類と同定−．東京，叢文社）等に形成されたコロ
ニーから直接に、あるいは培養した菌体からＤＮＡを抽
出し各プローブとの反応性を調べることによって高頻度
に検出される菌種であるかを簡易に同定することができ
る。
性を有するため、これを用いて糞便等からのバクテロイ
デス属細菌の検出、同定を簡便、迅速に行うことができ
る。また、バクテロイデス属細菌用選択培地であるＮＢ
ＧＴ培地（光岡知足（１９８０）腸内菌の世界−嫌気性
菌の分類と同定−．東京，叢文社）等に形成されたコロ
ニーから直接に、あるいは培養した菌体からＤＮＡを抽
出し各プローブとの反応性を調べることによって高頻度
に検出される菌種であるかを簡易に同定することができ
る。
【００１８】上記のような方法に本発明のプローブを使
用する場合には、単独または複数組み合わせ、蛍光標識
等の修飾を行うなどして使用できる。このような手段と
して例えば、ドットブロットハイブリダイゼーションや
ホールセルハイブリダイゼーション、更には共焦点レー
ザー顕微鏡を用いたインサイチュハイブリダイゼーショ
ン（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）に
よる検出等が挙げられる。また、公知のユニバーサルプ
ローブやプライマーと併用することにより、ＰＣＲ用の
プライマーとして用いることも可能である。
用する場合には、単独または複数組み合わせ、蛍光標識
等の修飾を行うなどして使用できる。このような手段と
して例えば、ドットブロットハイブリダイゼーションや
ホールセルハイブリダイゼーション、更には共焦点レー
ザー顕微鏡を用いたインサイチュハイブリダイゼーショ
ン（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）に
よる検出等が挙げられる。また、公知のユニバーサルプ
ローブやプライマーと併用することにより、ＰＣＲ用の
プライマーとして用いることも可能である。
【００１９】本発明のプローブでは、高頻度に検出され
るバクテロイデス属細菌以外の細菌を検出することは不
可能であるものの、これらの菌数等がわかれば検体の細
菌叢に関する様々な情報が得られる。更に、他の多岐に
わたる細菌のプローブやプライマー、例えば本出願人が
特願平９−２１９５６７号に記載しているビフィドバク
テリウム属細菌の菌種に特異的なプライマー等と併用す
ることにより、腸内細菌叢の主要な構成菌属の解析を簡
便、迅速に行うことも可能である。
るバクテロイデス属細菌以外の細菌を検出することは不
可能であるものの、これらの菌数等がわかれば検体の細
菌叢に関する様々な情報が得られる。更に、他の多岐に
わたる細菌のプローブやプライマー、例えば本出願人が
特願平９−２１９５６７号に記載しているビフィドバク
テリウム属細菌の菌種に特異的なプライマー等と併用す
ることにより、腸内細菌叢の主要な構成菌属の解析を簡
便、迅速に行うことも可能である。
【００２０】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが本発明はこれらに限定されるものではない。
明するが本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２１】
【実施例１】 プローブの作成 プローブの塩基配列の決定には、ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂ
ａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）等に登録されて
いる１６ＳｒＲＮＡ及びＲ．Ｗｏｏｓｅ．らの文献（Ｇ
ｈｅｒｎａ，Ｒ．ａｎｄ Ｃ．Ｒ．Ｗｏｏｓｅ． １９
９２．Ａ ｐａｒｔｉａｌ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ “Ｆｌａｖｏｂａ
ｃｔｅｒ−Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ” ｐｈｙｌｕｍ：
ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｒｅｓｔｒ
ｕｃｔｕｒｉｎｇ． Ｓｙｓｔ．Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ． １５：５１３−５２１．）に記載された
系統樹に含まれる４菌種の１６ＳｒＲＮＡを用いた。す
なわち、前者より表１に示すバクテロイデス属細菌１０
菌種、ポルフィロモナス属細菌９菌種、プレボテラ属細
菌１６菌種の塩基配列を、後者より系統樹中のバクテロ
イデス属細菌に近縁な４菌種（ＮＥＷ２クラスター）の
塩基配列を用いた。
ａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）等に登録されて
いる１６ＳｒＲＮＡ及びＲ．Ｗｏｏｓｅ．らの文献（Ｇ
ｈｅｒｎａ，Ｒ．ａｎｄ Ｃ．Ｒ．Ｗｏｏｓｅ． １９
９２．Ａ ｐａｒｔｉａｌ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ “Ｆｌａｖｏｂａ
ｃｔｅｒ−Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ” ｐｈｙｌｕｍ：
ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｒｅｓｔｒ
ｕｃｔｕｒｉｎｇ． Ｓｙｓｔ．Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ． １５：５１３−５２１．）に記載された
系統樹に含まれる４菌種の１６ＳｒＲＮＡを用いた。す
なわち、前者より表１に示すバクテロイデス属細菌１０
菌種、ポルフィロモナス属細菌９菌種、プレボテラ属細
菌１６菌種の塩基配列を、後者より系統樹中のバクテロ
イデス属細菌に近縁な４菌種（ＮＥＷ２クラスター）の
塩基配列を用いた。
【００２２】
【表１】
【００２３】また、塩基配列のアライメントには系統樹
作成用ソフトＣｌｕｓｔａｌ Ｗ（ｖｅｒｓｉｏｎ１．
５）を用いて、まずバクテロイデスクラスターに共通な
塩基配列を検索し、さらに見出された共通配列とバクテ
ロイデス・ディスタソニスが一致する配列の検索を行っ
た。アライメントの結果は図１に示す。こうして設計さ
れたＤＮＡの合成は、ＤＮＡ合成機を用いて行った。
作成用ソフトＣｌｕｓｔａｌ Ｗ（ｖｅｒｓｉｏｎ１．
５）を用いて、まずバクテロイデスクラスターに共通な
塩基配列を検索し、さらに見出された共通配列とバクテ
ロイデス・ディスタソニスが一致する配列の検索を行っ
た。アライメントの結果は図１に示す。こうして設計さ
れたＤＮＡの合成は、ＤＮＡ合成機を用いて行った。
【００２４】
【図１】
【００２５】
【実施例２】 ドットブロットハイブリダイゼーション
によるプローブの特異性の確認 （１） プローブの標識 ハイブリダイゼーションによる検出には、本発明のプロ
ーブ（Ｂａｃｔ２８１）とポジティブコントロールとし
てのユニバーサルプライマーであるＰＰＲ（表２）を用
いることとした。合成したオリゴヌクレオチドはＤＩＧ
Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ３’Ｅｎｄ Ｌａ
ｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ）を用いて３’末端をＤｉｇ−ｄｄＵＴＰで
標識した。
によるプローブの特異性の確認 （１） プローブの標識 ハイブリダイゼーションによる検出には、本発明のプロ
ーブ（Ｂａｃｔ２８１）とポジティブコントロールとし
てのユニバーサルプライマーであるＰＰＲ（表２）を用
いることとした。合成したオリゴヌクレオチドはＤＩＧ
Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ３’Ｅｎｄ Ｌａ
ｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ）を用いて３’末端をＤｉｇ−ｄｄＵＴＰで
標識した。
【００２６】
【表２】
【００２７】（２） 菌株の培養及びＤＮＡの抽出 菌株は表３に示すバクテロイデス属８菌種、プレボテラ
属８菌種、ポルフィロモナス属２菌種、リケネラ属１菌
種とヒト腸内細菌叢の主要構成菌である９菌属２０菌種
の計３９菌株を用いた。これらの菌株はＪＣＭ、ＡＴＣ
Ｃ等から入手した基準株及び標準株である。
属８菌種、ポルフィロモナス属２菌種、リケネラ属１菌
種とヒト腸内細菌叢の主要構成菌である９菌属２０菌種
の計３９菌株を用いた。これらの菌株はＪＣＭ、ＡＴＣ
Ｃ等から入手した基準株及び標準株である。
【００２８】
【表３】
【００２９】これらの菌株を１０ｍｌのＧＡＭブロス液
体培地で２４時間嫌気培養後、菌体をＴＥバッファー
（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．
０）で２回洗浄後、ＯＤ５９５＝０．８〜０．９になる
ように再懸濁した。更に菌液の５ｍｌを遠心し集菌後、
２００μｌのＴＥバッファーに懸濁した。菌液に１．７
ｇの滅菌済ガラスビーズと０．８ｍｌのフェノールを加
え４℃、３０分間のシェイキングを行った。１５，００
０ｒｐｍで５分間遠心後水層のみを別のチューブに移
し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール
（２５：２４：１）を等量加え５分間攪拌した。１５，
０００ｒｐｍで５分間遠心後、上清に１／１０量の３Ｍ
酢酸ナトリウム溶液と２倍量の冷エタノールを加え、エ
タノール沈殿を行い、得られた核酸は真空乾燥後適当量
のＴＥバッファーに溶解しテンプレートとした。
体培地で２４時間嫌気培養後、菌体をＴＥバッファー
（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．
０）で２回洗浄後、ＯＤ５９５＝０．８〜０．９になる
ように再懸濁した。更に菌液の５ｍｌを遠心し集菌後、
２００μｌのＴＥバッファーに懸濁した。菌液に１．７
ｇの滅菌済ガラスビーズと０．８ｍｌのフェノールを加
え４℃、３０分間のシェイキングを行った。１５，００
０ｒｐｍで５分間遠心後水層のみを別のチューブに移
し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール
（２５：２４：１）を等量加え５分間攪拌した。１５，
０００ｒｐｍで５分間遠心後、上清に１／１０量の３Ｍ
酢酸ナトリウム溶液と２倍量の冷エタノールを加え、エ
タノール沈殿を行い、得られた核酸は真空乾燥後適当量
のＴＥバッファーに溶解しテンプレートとした。
【００３０】（３） ＰＣＲ反応 ＰＣＲはＴａＫａＲａ Ｔａｑ（宝酒造株式会社製）を
用いて、以下に示す組成で行った。
用いて、以下に示す組成で行った。
【００３１】 （組成） Recombinant Taq DNA polymerase(5U/μl) ０．５μｌ １０×（１０倍濃度の）ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ５．０μｌ ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ） ５．０μｌ テンプレート（１００ｎｇ／μｌ） １．０μｌ プライマー１（２０μｇ／ｍｌ） ５．０μｌ プライマー２（２０μｇ／ｍｌ） ５．０μｌ 滅菌水 ２８．５μｌ 計 ５０．０μｌ
【００３２】テンプレートは（２）で抽出したＤＮＡ溶
液を用い、プライマーとして表４に示す塩基配列のオリ
ゴヌクレオチドを用いた。反応はＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣ
ＲＳｙｓｔｅｍ９６００（ＰＥＲＫＩＮＥＬＭＥＲ）を
用い、９４℃、３０秒、５５℃、３０秒、７２℃、１分
を３０サイクル、７２℃、１０分を１サイクル行った。
ＰＣＲ産物はＭｕｐｉｄ（ＡＤＶＡＮＣＥ社製）を用い
て１．５％アガロースゲル電気泳動を行い約１５００ｂ
ｐ付近にバンドを確認した。
液を用い、プライマーとして表４に示す塩基配列のオリ
ゴヌクレオチドを用いた。反応はＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣ
ＲＳｙｓｔｅｍ９６００（ＰＥＲＫＩＮＥＬＭＥＲ）を
用い、９４℃、３０秒、５５℃、３０秒、７２℃、１分
を３０サイクル、７２℃、１０分を１サイクル行った。
ＰＣＲ産物はＭｕｐｉｄ（ＡＤＶＡＮＣＥ社製）を用い
て１．５％アガロースゲル電気泳動を行い約１５００ｂ
ｐ付近にバンドを確認した。
【００３３】
【表４】
【００３４】（４） ＰＣＲ産物のナイロンメンブレン
へのブロッティング ＰＣＲ産物は、沸騰水中で１０分間加熱後急冷して２０
×ＳＳＣを等量加えた。ナイロンメンブレン（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋）を２０×ＳＳＣ（ＳＳ
Ｃ＝０．１５ｍＭクエン酸ナトリウム）に１５分以上浸
してから、Ｄｏｔ Ｂｌｏｔｔｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
にセットし、３００μｌの１０×ＳＳＣで２回洗浄して
おいた。上記ＰＣＲ産物２μｌを１０×ＳＳＣ２００μ
ｌで希釈後Ｄｏｔ Ｂｌｏｔｔｅｒを用いてメンブレン
上にブロットし、更に１０×ＳＳＣで２回洗浄した。
へのブロッティング ＰＣＲ産物は、沸騰水中で１０分間加熱後急冷して２０
×ＳＳＣを等量加えた。ナイロンメンブレン（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋）を２０×ＳＳＣ（ＳＳ
Ｃ＝０．１５ｍＭクエン酸ナトリウム）に１５分以上浸
してから、Ｄｏｔ Ｂｌｏｔｔｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
にセットし、３００μｌの１０×ＳＳＣで２回洗浄して
おいた。上記ＰＣＲ産物２μｌを１０×ＳＳＣ２００μ
ｌで希釈後Ｄｏｔ Ｂｌｏｔｔｅｒを用いてメンブレン
上にブロットし、更に１０×ＳＳＣで２回洗浄した。
【００３５】変性溶液（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ
ＮａＯＨ）をしみ込ませた濾紙上に、メンブレンにＤ
ＮＡをスポットした面が上になる状態で５分間静置し、
次に、中和溶液（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．２、１ｍＭ ＥＤＴＡ）をしみ
込ませた濾紙上に移して１分間静置した。メンブレンは
室温で乾燥させてから、ＵＶ Ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉ
ｎａｔｏｒに固定し使用するまで−２０℃で保存した。
ＮａＯＨ）をしみ込ませた濾紙上に、メンブレンにＤ
ＮＡをスポットした面が上になる状態で５分間静置し、
次に、中和溶液（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．２、１ｍＭ ＥＤＴＡ）をしみ
込ませた濾紙上に移して１分間静置した。メンブレンは
室温で乾燥させてから、ＵＶ Ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉ
ｎａｔｏｒに固定し使用するまで−２０℃で保存した。
【００３６】（５） ハイブリダイゼーション ＰＣＲ産物を固定したナイロンメンブレンを０．１×Ｓ
ＳＣ／０．５％ＳＤＳに浸して、室温で１時間静かに振
とうした後、ハイブリバッグ（日本ジェネティクス社
製）に移して、プレハイブリダイゼーション溶液を加
え、３７℃で１時間反応させた。つづいて、プレハイブ
リダイゼーション溶液を捨ててハイブリダイゼーション
溶液に置き換え５０℃で一夜振とうした。ナイロンメン
ブレンをハイブリバッグから取り出し、２×ＳＳＣ/
０．１％ＳＤＳで５分間室温で２回洗浄し、更に６０で
１５分間洗浄した。なお、使用した溶液の組成を以下に
示す。
ＳＣ／０．５％ＳＤＳに浸して、室温で１時間静かに振
とうした後、ハイブリバッグ（日本ジェネティクス社
製）に移して、プレハイブリダイゼーション溶液を加
え、３７℃で１時間反応させた。つづいて、プレハイブ
リダイゼーション溶液を捨ててハイブリダイゼーション
溶液に置き換え５０℃で一夜振とうした。ナイロンメン
ブレンをハイブリバッグから取り出し、２×ＳＳＣ/
０．１％ＳＤＳで５分間室温で２回洗浄し、更に６０で
１５分間洗浄した。なお、使用した溶液の組成を以下に
示す。
【００３７】プレハイブリダイゼーション溶液 ６×ＳＳＣ ０．１％ＳＤＳ ０．５％ Ｎ−ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ ５×Ｄｅｎｈａｒｄ’ｓ溶液
【００３８】ハイブリダイゼーション溶液 ６×ＳＳＣ ０．１％ＳＤＳ ０．５％ Ｎ−ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ ５×Ｄｅｎｈａｒｄ’ｓ溶液 ５ｐｍｏｌ／ｍｌ標識プローブ
【００３９】Ｄｅｎｈａｒｄ’ｓ溶液 １％ Ｆｉｃｏｌｌ（Ｔｙｐｅ４００、ファルマシア社
製） １％ ポリビニルピロリジン １％ 牛血清アルブミン（Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ、シグ
マ社製）
製） １％ ポリビニルピロリジン １％ 牛血清アルブミン（Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ、シグ
マ社製）
【００４０】このようにして、本発明のプローブを用い
て同定を行った結果は、分譲機関より入手した株名と同
じであった（表５、６）。
て同定を行った結果は、分譲機関より入手した株名と同
じであった（表５、６）。
【００４１】
【表５】
【００４２】
【表６】
【００４３】
【実施例３】 ホールセルハイブリダイゼーションによ
るプローブの特異性の確認 プローブ及び菌株は実施例２と同一のものを使用した。
るプローブの特異性の確認 プローブ及び菌株は実施例２と同一のものを使用した。
【００４４】（１） 供試菌液の調製 菌株を１０ｍｌのＧＡＭブロス液体培地で３７℃、一晩
嫌気培養した。培養後の菌体１ｍｌを遠心により集菌
後、ＰＢＳで２回洗浄した。更に、新鮮調製された１ｍ
ｌの４％パラホルムアルデヒド溶液で再懸濁し、４℃で
一晩静置し、菌体を固定した。固定後の菌体をＰＢＳで
３回洗浄し、最終的に１ｍｌのＰＢＳに懸濁し、供試菌
液とした。
嫌気培養した。培養後の菌体１ｍｌを遠心により集菌
後、ＰＢＳで２回洗浄した。更に、新鮮調製された１ｍ
ｌの４％パラホルムアルデヒド溶液で再懸濁し、４℃で
一晩静置し、菌体を固定した。固定後の菌体をＰＢＳで
３回洗浄し、最終的に１ｍｌのＰＢＳに懸濁し、供試菌
液とした。
【００４５】（２） ホールセルハイブリダイゼーショ
ン及び検出 ＰＬＬコートされたスライドグラス上に、４２の区間
（１区間は３ｍｍ四方）を作製し、その１区間ごとに供
試菌液１μｌずつ塗抹し、風乾させた。このスライドグ
ラスを５０％、８０％、９９％に順次それぞれ３分間浸
した。更に風乾後、キシレンに３分間浸した後風乾し
た。１００μｌのハイブリダイゼーション溶液（７５０
ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、０．０１％ＢＳＡ、０．２％ｐｏｌｙ
Ａ、１０％Ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ）中に、５
００ｎｇのＤＮＡプローブを加え、スライドグラス上の
菌液塗沫面上に塗布し、カバーグラスをかけた。このス
ライドグラスをＳＥＴ溶液（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、１
００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）で湿
潤化した４０℃の暗箱中に一晩静置した。反応後のスラ
イドグラスを４５℃の洗浄液（５０ｍＭ ＮａＣｌ、４
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０２ｍＭ ＥＤＴＡ）中
で軽く洗浄した後、同温度の同液５０ｍｌ中で１５分間
軽く振とうしながら、３回洗浄操作を行った。風乾後、
０．１％ｐ−フェニレンジアミンを含むグリセロール−
ＰＢＳ（９０％グリセロール）で封入し、蛍光顕微鏡下
でシグナルの有無を観察した。
ン及び検出 ＰＬＬコートされたスライドグラス上に、４２の区間
（１区間は３ｍｍ四方）を作製し、その１区間ごとに供
試菌液１μｌずつ塗抹し、風乾させた。このスライドグ
ラスを５０％、８０％、９９％に順次それぞれ３分間浸
した。更に風乾後、キシレンに３分間浸した後風乾し
た。１００μｌのハイブリダイゼーション溶液（７５０
ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、０．０１％ＢＳＡ、０．２％ｐｏｌｙ
Ａ、１０％Ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ）中に、５
００ｎｇのＤＮＡプローブを加え、スライドグラス上の
菌液塗沫面上に塗布し、カバーグラスをかけた。このス
ライドグラスをＳＥＴ溶液（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、１
００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）で湿
潤化した４０℃の暗箱中に一晩静置した。反応後のスラ
イドグラスを４５℃の洗浄液（５０ｍＭ ＮａＣｌ、４
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０２ｍＭ ＥＤＴＡ）中
で軽く洗浄した後、同温度の同液５０ｍｌ中で１５分間
軽く振とうしながら、３回洗浄操作を行った。風乾後、
０．１％ｐ−フェニレンジアミンを含むグリセロール−
ＰＢＳ（９０％グリセロール）で封入し、蛍光顕微鏡下
でシグナルの有無を観察した。
【００４６】実施例２と同様に、本発明のプローブの検
出結果と分譲機関より入手した株名を比較したところ、
両者は一致していた（表５、６）。
出結果と分譲機関より入手した株名を比較したところ、
両者は一致していた（表５、６）。
【００４７】
【発明の効果】本発明のプローブを使用すれば、ヒト腸
内で高頻度に検出されるバクテロイデス属細菌の検出、
同定を迅速、簡便且つ高精度に行うことができる。ま
た、他の菌類等に特異的なプローブ、プライマーなどと
組み合わせれば、腸内細菌叢の解析も迅速、簡便に行
え、細菌叢の状態から個体や消化管の状態を把握するこ
とも可能である。
内で高頻度に検出されるバクテロイデス属細菌の検出、
同定を迅速、簡便且つ高精度に行うことができる。ま
た、他の菌類等に特異的なプローブ、プライマーなどと
組み合わせれば、腸内細菌叢の解析も迅速、簡便に行
え、細菌叢の状態から個体や消化管の状態を把握するこ
とも可能である。
【００４８】
配列番号：１ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 CTCAGAACCC CTATCCATC 19
【図１】バクテロイデスグループ細菌における１６Ｓｒ
ＲＮＡ塩基配列のアライメントの結果を示す図である。
ＲＮＡ塩基配列のアライメントの結果を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:01）
Claims (4)
- 【請求項１】 配列番号１で表わされる塩基配列又は該
塩基配列に相補的な配列を有するバクテロイデスクラス
ター細菌及びバクテロイデス・ディスタソニスに特異的
なオリゴヌクレオチドプローブ - 【請求項２】 請求項１記載のオリゴヌクレオチドプロ
ーブを用いることを特徴とするバクテロイデスクラスタ
ー細菌及びバクテロイデス・ディスタソニスの検出方法 - 【請求項３】 （１）検体中の核酸を抽出する工程、
（２）抽出した核酸を増幅させる増幅工程、及び（３）
増幅した核酸に請求項１のオリゴヌクレオチドプローブ
を反応させる工程を含む請求項２記載のバクテロイデス
クラスター細菌及びバクテロイデス・ディスタソニスの
検出方法 - 【請求項４】 バクテロイデスクラスター細菌がバクテ
ロイデス・ブルゲイタス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｖ
ｕｌｇａｔｕｓ）、バクテロイデス・セタイオタオミク
ロン（Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）、バク
テロイデス・フラギリス（Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）、バ
クテロイデス・ユニフォルミス（Ｂ．ｕｎｉｆｏｒｍｉ
ｓ）、バクテロイデス・オバタス（Ｂ．ｏｖａｔｕｓ）
である請求項２又は３に記載のバクテロイデスクラスタ
ー細菌及びバクテロイデス・ディスタソニスの検出方法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10037953A JPH11221082A (ja) | 1998-02-05 | 1998-02-05 | バクテロイデス属細菌用プローブ及びこれを用いた検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10037953A JPH11221082A (ja) | 1998-02-05 | 1998-02-05 | バクテロイデス属細菌用プローブ及びこれを用いた検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11221082A true JPH11221082A (ja) | 1999-08-17 |
Family
ID=12511925
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10037953A Pending JPH11221082A (ja) | 1998-02-05 | 1998-02-05 | バクテロイデス属細菌用プローブ及びこれを用いた検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11221082A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001036673A3 (de) * | 1999-11-17 | 2002-05-10 | Creatogen Ag | Test von mikroorganismen |
| EP1921160A1 (en) * | 2006-11-10 | 2008-05-14 | Canon Kabushiki Kaisha | Probe, probe set, probe-immobilized carrier, and genetic testing method |
-
1998
- 1998-02-05 JP JP10037953A patent/JPH11221082A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001036673A3 (de) * | 1999-11-17 | 2002-05-10 | Creatogen Ag | Test von mikroorganismen |
| EP1921160A1 (en) * | 2006-11-10 | 2008-05-14 | Canon Kabushiki Kaisha | Probe, probe set, probe-immobilized carrier, and genetic testing method |
| JP2008118913A (ja) * | 2006-11-10 | 2008-05-29 | Canon Inc | プローブ、プローブセット、プローブ固定担体及び遺伝子検査方法 |
| US7879549B2 (en) | 2006-11-10 | 2011-02-01 | Canon Kabushiki Kaisha | Probe, probe set, probe-immobilized carrier, and genetic testing method |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20041207 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050405 |