JP2003135588A - 経皮経管的ドラッグデリバリーデバイス - Google Patents
経皮経管的ドラッグデリバリーデバイスInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 血管内腔を拡張した状態に維持し、再狭窄を
防ぐとともに、薬剤を非浸襲的にかつ効果的に目的部位
に配送する。 【解決手段】 屈撓性カテーテルの先端部に膨張性フィ
ルムからなるバルーンを有するバルーンカテーテルと、
該バルーン上に取り付けられ該バルーンの膨張と共に拡
張するが該バルーンの収縮と共には縮小しないステント
とからなる経皮経管的ドラッグデリバリーデバイスであ
って、前記バルーン及び／又は前記ステントの表面が液
体状物質を担持させることができる多孔質の物質で被覆
されていることを特徴とする上記経皮経管的ドラッグデ
リバリーデバイス。
防ぐとともに、薬剤を非浸襲的にかつ効果的に目的部位
に配送する。 【解決手段】 屈撓性カテーテルの先端部に膨張性フィ
ルムからなるバルーンを有するバルーンカテーテルと、
該バルーン上に取り付けられ該バルーンの膨張と共に拡
張するが該バルーンの収縮と共には縮小しないステント
とからなる経皮経管的ドラッグデリバリーデバイスであ
って、前記バルーン及び／又は前記ステントの表面が液
体状物質を担持させることができる多孔質の物質で被覆
されていることを特徴とする上記経皮経管的ドラッグデ
リバリーデバイス。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は経皮経管的ドラッグ
デリバリーデバイスに関する。より詳細には、本発明
は、バルーンカテーテルのバルーンやステント等の管内
挿デバイスに薬剤の担持機能を持たせ、非浸襲的にかつ
効果的に、薬剤を目的部位に配送するための経皮経管的
治療器具に関する。
デリバリーデバイスに関する。より詳細には、本発明
は、バルーンカテーテルのバルーンやステント等の管内
挿デバイスに薬剤の担持機能を持たせ、非浸襲的にかつ
効果的に、薬剤を目的部位に配送するための経皮経管的
治療器具に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、例えば冠動脈の一部に狭窄が生じ
た場合に、その狭窄に対してバルーンカテーテル及びス
テントを用いて、血管内腔を拡張した状態に維持すると
いう治療法が行われている。
た場合に、その狭窄に対してバルーンカテーテル及びス
テントを用いて、血管内腔を拡張した状態に維持すると
いう治療法が行われている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、このよ
うな治療法では、患者による個体差はあるものの、ある
時間が経過すると約半数の症例で再狭窄が生じてしま
う。これは、一度バルーン及びステントにより押し広げ
られ確保された内腔の内側に、再び内膜肥厚増殖が起こ
り、再度狭窄を生じるためである。このように、狭心
症、心筋梗塞の治療のために行われる経皮的冠動脈形成
術（ＰＴＣＡ）後の約４割に冠動脈の再狭窄が起こる
が、今のところこれに対する有効な薬物療法がなく、循
環器領域で大きな問題となっている。そこで本発明者ら
は血管再狭窄に対し核酸医薬を開発した。また、患部た
る血管等の狭窄部を拡張するのと同時に、オリゴヌクレ
オチド若しくはポリヌクレオチドなどの核酸又はプラス
ミド等の薬剤を、非浸襲的にかつ効果的に目的部位に配
送する適切な手段がなかった。
うな治療法では、患者による個体差はあるものの、ある
時間が経過すると約半数の症例で再狭窄が生じてしま
う。これは、一度バルーン及びステントにより押し広げ
られ確保された内腔の内側に、再び内膜肥厚増殖が起こ
り、再度狭窄を生じるためである。このように、狭心
症、心筋梗塞の治療のために行われる経皮的冠動脈形成
術（ＰＴＣＡ）後の約４割に冠動脈の再狭窄が起こる
が、今のところこれに対する有効な薬物療法がなく、循
環器領域で大きな問題となっている。そこで本発明者ら
は血管再狭窄に対し核酸医薬を開発した。また、患部た
る血管等の狭窄部を拡張するのと同時に、オリゴヌクレ
オチド若しくはポリヌクレオチドなどの核酸又はプラス
ミド等の薬剤を、非浸襲的にかつ効果的に目的部位に配
送する適切な手段がなかった。
【０００４】冠動脈の一部に狭窄を引き起こす原因とし
て血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の過剰増殖がある。我々
は高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ）由来血管平滑筋細胞
（ＶＳＭＣ）が過剰増殖を示し（Ｆｕｋｕｄａ Ｎ．
Ｊ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ． ４，６
５（１９９７））、ＴＧＦ−βの発現が亢進し（Ｆｕｋ
ｕｄａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．１３，
８３１（１９９５））、ＴＧＦ−β受容体の異常が存在
し、過剰増殖に関与していることを認めた（Ｆｕｋｕｄ
ａ ｅｔ ａｌ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ３１，６
７２（１９９８））。
て血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の過剰増殖がある。我々
は高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ）由来血管平滑筋細胞
（ＶＳＭＣ）が過剰増殖を示し（Ｆｕｋｕｄａ Ｎ．
Ｊ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ． ４，６
５（１９９７））、ＴＧＦ−βの発現が亢進し（Ｆｕｋ
ｕｄａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．１３，
８３１（１９９５））、ＴＧＦ−β受容体の異常が存在
し、過剰増殖に関与していることを認めた（Ｆｕｋｕｄ
ａ ｅｔ ａｌ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ３１，６
７２（１９９８））。
【０００５】逆遺伝学による遺伝子機能の不活性化の手
法は、ある特定の遺伝子の機能を引き出すために用いら
れるものであるが、一方でウイルス感染、癌、及び遺伝
子の異常発現に基づくその他の疾病の治療にも大きな可
能性を開いている（Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉ
ｏ．Ｄｒｕｇ．９，１−１０（１９９８））。遺伝子機
能の不活性化は相同的組換えによりＤＮＡレベルで、又
はアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドやリボザイ
ムによりＲＮＡレベルで実施することができる。
法は、ある特定の遺伝子の機能を引き出すために用いら
れるものであるが、一方でウイルス感染、癌、及び遺伝
子の異常発現に基づくその他の疾病の治療にも大きな可
能性を開いている（Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉ
ｏ．Ｄｒｕｇ．９，１−１０（１９９８））。遺伝子機
能の不活性化は相同的組換えによりＤＮＡレベルで、又
はアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドやリボザイ
ムによりＲＮＡレベルで実施することができる。
【０００６】しかし、アンチセンスオリゴデオキシヌク
レオチドの手法は遺伝子発現の抑制の特異性に欠け、一
方リボザイムの手法は遺伝子発現抑制の特異性には秀で
ているが、リボヌクレアーゼにより分解されやすいとい
う課題があった。
レオチドの手法は遺伝子発現の抑制の特異性に欠け、一
方リボザイムの手法は遺伝子発現抑制の特異性には秀で
ているが、リボヌクレアーゼにより分解されやすいとい
う課題があった。
【０００７】
【発明を解決するための手段】かかる状況の下、本発明
者らは、経皮経管的治療の１回の施術で、患部たる血管
等の狭窄部を拡張すると同時に、血管等の再狭窄を防止
できるようなドラッグデリバリーデバイスを得るべく鋭
意検討した結果、バルーン本体又はステントの表面を、
液体状物質を担持させることができる多孔質の物質で被
覆し、この被覆物質に、再狭窄の原因となる細胞増殖
（内膜肥厚）を抑制することができる薬剤を吸収させれ
ば、一時的に血管内腔を拡張した後も引き続いて再狭窄
を防止できることを見出し、本発明をなすに至った。
者らは、経皮経管的治療の１回の施術で、患部たる血管
等の狭窄部を拡張すると同時に、血管等の再狭窄を防止
できるようなドラッグデリバリーデバイスを得るべく鋭
意検討した結果、バルーン本体又はステントの表面を、
液体状物質を担持させることができる多孔質の物質で被
覆し、この被覆物質に、再狭窄の原因となる細胞増殖
（内膜肥厚）を抑制することができる薬剤を吸収させれ
ば、一時的に血管内腔を拡張した後も引き続いて再狭窄
を防止できることを見出し、本発明をなすに至った。
【０００８】また、バルーン又はステントの表面に吸収
させるべき液体状物質として、細胞増殖性疾患に関与す
るＴＧＦ−β１、ＰＤＧＦ等の増殖因子に対する核酸医
薬（アンチセンス、リボザイム、プラスミド）を用いる
ことにより、ドラッグデリバリーデバイスが得られるこ
とを見出し、本発明をなすに至った。かかる核酸医薬
（アンチセンス、リボザイム、プラスミド）として、本
発明者らの一人はヒトＴＧＦ−β１に対するＤＮＡ−Ｒ
ＮＡキメラ型リボザイムを発明するに至り、特願２００
０−３３９２５３（平成１２年１１月７日）を出願し
た。
させるべき液体状物質として、細胞増殖性疾患に関与す
るＴＧＦ−β１、ＰＤＧＦ等の増殖因子に対する核酸医
薬（アンチセンス、リボザイム、プラスミド）を用いる
ことにより、ドラッグデリバリーデバイスが得られるこ
とを見出し、本発明をなすに至った。かかる核酸医薬
（アンチセンス、リボザイム、プラスミド）として、本
発明者らの一人はヒトＴＧＦ−β１に対するＤＮＡ−Ｒ
ＮＡキメラ型リボザイムを発明するに至り、特願２００
０−３３９２５３（平成１２年１１月７日）を出願し
た。
【０００９】本発明は、薬剤を非浸襲的にかつ効果的に
目的部位に配送することのできるバルーンカテーテル及
びステントからなる経皮経管的ドラッグデリバリーデバ
イスを提供することを目的とする。本発明はまた、ヒト
細胞増殖性疾患への核酸医薬（アンチセンス、リボザイ
ム、プラスミド）を非浸襲的にかつ効果的に目的部位に
配送することのできる経皮経管的ドラッグデリバリーデ
バイスを提供することを目的とする。
目的部位に配送することのできるバルーンカテーテル及
びステントからなる経皮経管的ドラッグデリバリーデバ
イスを提供することを目的とする。本発明はまた、ヒト
細胞増殖性疾患への核酸医薬（アンチセンス、リボザイ
ム、プラスミド）を非浸襲的にかつ効果的に目的部位に
配送することのできる経皮経管的ドラッグデリバリーデ
バイスを提供することを目的とする。
【００１０】上記目的を達成すべく、本発明は以下の通
りである。 （１）屈撓性カテーテルの先端部に膨張性フィルムから
なるバルーンを有するバルーンカテーテルと、該バルー
ン上に取り付けられ該バルーンの膨張と共に拡張するが
該バルーンの収縮と共には縮小しないステントとからな
る経皮経管的ドラッグデリバリーデバイスであって、前
記バルーン及び／又は前記ステントの表面が液体状物質
を担持させることができる多孔質の物質で被覆されてい
ることを特徴とする上記経皮経管的ドラッグデリバリー
デバイス。 （２）前記多孔質の物質が、ポリアミド、ポリウレタ
ン、ポリエステル、ポリビニルアルコール、セラミック
ス、金属及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれ
るポリマーである上記（１）記載の経皮経管的ドラッグ
デリバリーデバイス。 （３）前記液体状物質が薬剤である上記（１）又は
（２）記載の経皮経管的ドラッグデリバリーデバイス。 （４）前記薬剤が細胞増殖性疾患の治療薬である上記
（１）〜（３）のいずれか一項記載の経皮経管的ドラッ
グデリバリーデバイス。 （５）前記薬剤が、細胞増殖性疾患の遺伝子治療薬とし
ての核酸又はプラスミドである上記（１）〜（４）のい
ずれか一項記載の経皮経管的ドラッグデリバリーデバイ
ス。 （６）前記薬剤が、下記のヌクレオチド配列（Ｉ）を含
むＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイム （配列中、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔはそれぞれアデニン、シトシ
ン、グアニン、チミンを塩基成分とするデオキシリボヌ
クレオチド残基であり、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕはそれぞれアデ
ニン、シトシン、グアニン、ウラシルを塩基成分とする
リボヌクレオチド残基であり、Ｎ1及びＮ3は互いに相補
的塩基対形成が可能な少なくとも１対のデオキシリボヌ
クレオチド残基を表し、Ｎ2はループ形成が可能な少な
くとも３個のデオキシリボヌクレオチド残基を表す）で
ある、上記（５）記載の経皮経管的ドラッグデリバリー
デバイス。 （７）前記ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイムが、ヒト
ＴＧＦβ１に対するリボザイムであり、下記のヌクレオ
チド配列（ＩＩ） を含む上記（６）記載の経皮経管的ドラッグデリバリー
デバイス。 （８）前記薬剤がヒトＰＤＧＦ−Ａ鎖に対するリボザイ
ムである前記（５）記載の経皮経管的ドラッグデリバリ
ーデバイス。
りである。 （１）屈撓性カテーテルの先端部に膨張性フィルムから
なるバルーンを有するバルーンカテーテルと、該バルー
ン上に取り付けられ該バルーンの膨張と共に拡張するが
該バルーンの収縮と共には縮小しないステントとからな
る経皮経管的ドラッグデリバリーデバイスであって、前
記バルーン及び／又は前記ステントの表面が液体状物質
を担持させることができる多孔質の物質で被覆されてい
ることを特徴とする上記経皮経管的ドラッグデリバリー
デバイス。 （２）前記多孔質の物質が、ポリアミド、ポリウレタ
ン、ポリエステル、ポリビニルアルコール、セラミック
ス、金属及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれ
るポリマーである上記（１）記載の経皮経管的ドラッグ
デリバリーデバイス。 （３）前記液体状物質が薬剤である上記（１）又は
（２）記載の経皮経管的ドラッグデリバリーデバイス。 （４）前記薬剤が細胞増殖性疾患の治療薬である上記
（１）〜（３）のいずれか一項記載の経皮経管的ドラッ
グデリバリーデバイス。 （５）前記薬剤が、細胞増殖性疾患の遺伝子治療薬とし
ての核酸又はプラスミドである上記（１）〜（４）のい
ずれか一項記載の経皮経管的ドラッグデリバリーデバイ
ス。 （６）前記薬剤が、下記のヌクレオチド配列（Ｉ）を含
むＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイム （配列中、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔはそれぞれアデニン、シトシ
ン、グアニン、チミンを塩基成分とするデオキシリボヌ
クレオチド残基であり、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕはそれぞれアデ
ニン、シトシン、グアニン、ウラシルを塩基成分とする
リボヌクレオチド残基であり、Ｎ1及びＮ3は互いに相補
的塩基対形成が可能な少なくとも１対のデオキシリボヌ
クレオチド残基を表し、Ｎ2はループ形成が可能な少な
くとも３個のデオキシリボヌクレオチド残基を表す）で
ある、上記（５）記載の経皮経管的ドラッグデリバリー
デバイス。 （７）前記ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイムが、ヒト
ＴＧＦβ１に対するリボザイムであり、下記のヌクレオ
チド配列（ＩＩ） を含む上記（６）記載の経皮経管的ドラッグデリバリー
デバイス。 （８）前記薬剤がヒトＰＤＧＦ−Ａ鎖に対するリボザイ
ムである前記（５）記載の経皮経管的ドラッグデリバリ
ーデバイス。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明の経皮経管的ドラッグデリ
バリーデバイスは、基本的にバルーンカテーテルとステ
ントとからなる。バルーンカテーテルは、その先端部
に、膨張性フィルムからなるバルーンを有する、屈撓性
のカテーテルである。また、上記ステントは、バルーン
上に取り付けられており、該バルーンの膨張と共に拡張
するが該バルーンの収縮と共には縮小しない性質を有し
ているものである。ステントは網状筒型の形状を有する
ことが好ましい。本発明においては、従来公知のいずれ
のバルーンカテーテルとステントをも用いることができ
る。
バリーデバイスは、基本的にバルーンカテーテルとステ
ントとからなる。バルーンカテーテルは、その先端部
に、膨張性フィルムからなるバルーンを有する、屈撓性
のカテーテルである。また、上記ステントは、バルーン
上に取り付けられており、該バルーンの膨張と共に拡張
するが該バルーンの収縮と共には縮小しない性質を有し
ているものである。ステントは網状筒型の形状を有する
ことが好ましい。本発明においては、従来公知のいずれ
のバルーンカテーテルとステントをも用いることができ
る。
【００１２】カテーテルは、通常ポリウレタン系、ポリ
アミド系、ポリエチレン系等の屈撓性を有する合成樹脂
からなり、カテーテル本体の内部には案内孔及びエア通
孔がその全長に亙って縦通している。本発明において
は、当業界で用いられる従来公知のいずれのカテーテル
をも用いることができる。
アミド系、ポリエチレン系等の屈撓性を有する合成樹脂
からなり、カテーテル本体の内部には案内孔及びエア通
孔がその全長に亙って縦通している。本発明において
は、当業界で用いられる従来公知のいずれのカテーテル
をも用いることができる。
【００１３】バルーンは、膨張性のフィルム、例えば、
ポリアミド系、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）
系、シリコンゴム系の合成樹脂のフィルム、又はラテッ
クス等の気密性弾性フィルムからなり、上記カテーテル
の先端部に接合している。バルーン本体の膨張時の形状
は円筒状であることが好ましいが、後述のようにバルー
ンに取り付けたステントをバルーンの膨張時に血管等の
内壁面に当接するように設計されていれば、バルーン本
体の膨張時の形状に特に制限はない。バルーンは、カテ
ーテル本体のエア通孔を通じて空気をこのバルーンに圧
送することにより、ふくらませることができる。バルー
ンには上記カテーテル本体のエア通孔と開通するエア給
排口を設けてあり、このエア給排口を通じてバルーンを
ふくらませたり（膨張）、しぼませたり(収縮)すること
ができる。本発明においては、バルーンとしては、当業
界で用いられる従来公知のいかなるバルーンも用いるこ
とができる。
ポリアミド系、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）
系、シリコンゴム系の合成樹脂のフィルム、又はラテッ
クス等の気密性弾性フィルムからなり、上記カテーテル
の先端部に接合している。バルーン本体の膨張時の形状
は円筒状であることが好ましいが、後述のようにバルー
ンに取り付けたステントをバルーンの膨張時に血管等の
内壁面に当接するように設計されていれば、バルーン本
体の膨張時の形状に特に制限はない。バルーンは、カテ
ーテル本体のエア通孔を通じて空気をこのバルーンに圧
送することにより、ふくらませることができる。バルー
ンには上記カテーテル本体のエア通孔と開通するエア給
排口を設けてあり、このエア給排口を通じてバルーンを
ふくらませたり（膨張）、しぼませたり(収縮)すること
ができる。本発明においては、バルーンとしては、当業
界で用いられる従来公知のいかなるバルーンも用いるこ
とができる。
【００１４】カテーテル本体へのバルーンの接合は通
常、接着剤又は溶着によりなされている。本発明におい
ては、当業界で用いられる従来公知のカテーテルとバル
ーンの組み合わせであれば、いずれも用いることができ
る。
常、接着剤又は溶着によりなされている。本発明におい
ては、当業界で用いられる従来公知のカテーテルとバル
ーンの組み合わせであれば、いずれも用いることができ
る。
【００１５】ステントは、一般的には、ステンレス、タ
ングステン、ニッケルチタン合金、プラチナ、金等の生
体適合性の良い金属物質又はポリマーからなり、通常、
半径方向に拡張可能な網状筒型の形状を有している。ス
テントを大きく分類すると、セルフエキスパンダブルス
テント（外力に左右されることなく拡張する形状を記憶
する）と、バルーンエキスパンダブル（風船の拡張によ
って拡張時の形を保つ物）とがあるが、そのいずれも恒
久的に拡張力を保つので、ステントを血管等の管腔内の
特定部位に留置したまま、病態の改善を図ることができ
る。本発明において、ステント本体としては、当業界で
用いられる従来公知のいかなるステントも用いることが
できる。
ングステン、ニッケルチタン合金、プラチナ、金等の生
体適合性の良い金属物質又はポリマーからなり、通常、
半径方向に拡張可能な網状筒型の形状を有している。ス
テントを大きく分類すると、セルフエキスパンダブルス
テント（外力に左右されることなく拡張する形状を記憶
する）と、バルーンエキスパンダブル（風船の拡張によ
って拡張時の形を保つ物）とがあるが、そのいずれも恒
久的に拡張力を保つので、ステントを血管等の管腔内の
特定部位に留置したまま、病態の改善を図ることができ
る。本発明において、ステント本体としては、当業界で
用いられる従来公知のいかなるステントも用いることが
できる。
【００１６】本発明の経皮経管的ドラッグデリバリーデ
バイスは、上述のような基本的にバルーンカテーテルと
ステントとからなるデバイスにおいて、前記バルーン及
び／又は前記ステントの表面が、液体状物質を担持（吸
収）させることができる多孔質の物質で被覆されている
ことを特徴とする。
バイスは、上述のような基本的にバルーンカテーテルと
ステントとからなるデバイスにおいて、前記バルーン及
び／又は前記ステントの表面が、液体状物質を担持（吸
収）させることができる多孔質の物質で被覆されている
ことを特徴とする。
【００１７】本発明においては、バルーン及び／又はス
テントの表面を、多孔質ポリマー、多孔質セラミック
ス、多孔質金属等の多孔質の物質であらかじめ被覆して
おく。例えば多孔性ポリマーとして生体材料用ポリマー
を用いて、塗布、浸漬、その他の手法により、該表面を
あらかじめ被覆しておく。これにより、ポリマー被覆が
元来有している微細な孔において、液体状物質を吸収、
担持させることができる。ポリマー被覆に比較的大きな
孔を形成したい場合は、例えば、ポリマー溶液に食塩を
溶かしたものをバルーン及び／又はステントの表面に塗
布し、次いで水洗を行って食塩を除去する方法が採られ
る。また、バルーン及び／又はステントの表面を多孔質
の物質からなる吸収性のパッドで覆ってもよい。多孔質
セラミックスや多孔性金属は、セラミックスや金属その
ものに加工を施して多孔質にすることにより製造するこ
ともできるが、セラミックスや金属の素材が元来有して
いる微細な孔を利用してもよい。
テントの表面を、多孔質ポリマー、多孔質セラミック
ス、多孔質金属等の多孔質の物質であらかじめ被覆して
おく。例えば多孔性ポリマーとして生体材料用ポリマー
を用いて、塗布、浸漬、その他の手法により、該表面を
あらかじめ被覆しておく。これにより、ポリマー被覆が
元来有している微細な孔において、液体状物質を吸収、
担持させることができる。ポリマー被覆に比較的大きな
孔を形成したい場合は、例えば、ポリマー溶液に食塩を
溶かしたものをバルーン及び／又はステントの表面に塗
布し、次いで水洗を行って食塩を除去する方法が採られ
る。また、バルーン及び／又はステントの表面を多孔質
の物質からなる吸収性のパッドで覆ってもよい。多孔質
セラミックスや多孔性金属は、セラミックスや金属その
ものに加工を施して多孔質にすることにより製造するこ
ともできるが、セラミックスや金属の素材が元来有して
いる微細な孔を利用してもよい。
【００１８】生体材料用ポリマーとしては、ナイロン等
のポリアミド、ポリウレタン、ポリエステル、ポリビニ
ルアルコール（ポバール）などの従来使用されているも
のを単独で又は組み合わせて使用することができる。好
ましくはナイロンとポリウレタンの混合物又は共重合体
を用いる。
のポリアミド、ポリウレタン、ポリエステル、ポリビニ
ルアルコール（ポバール）などの従来使用されているも
のを単独で又は組み合わせて使用することができる。好
ましくはナイロンとポリウレタンの混合物又は共重合体
を用いる。
【００１９】これら生体材料用ポリマー等の多孔質の物
質の被覆（皮膜）は、バルーン及び／又はステントの表
面に、あらかじめ拡張時の形態を予想して設けておくこ
ともでき、この場合、バルーン及び／又はステントが膨
張及び／又は拡張したときに、被覆が破損するおそれは
ない。そしてまた、バルーン及び／又はステントが収縮
及び／又は縮小した時にも、その変態動態によって薬剤
等の吸収が妨げられることはない。もっとも適度の弾性
を有し伸張が可能な多孔質物質を用いて被覆を形成して
もよい。
質の被覆（皮膜）は、バルーン及び／又はステントの表
面に、あらかじめ拡張時の形態を予想して設けておくこ
ともでき、この場合、バルーン及び／又はステントが膨
張及び／又は拡張したときに、被覆が破損するおそれは
ない。そしてまた、バルーン及び／又はステントが収縮
及び／又は縮小した時にも、その変態動態によって薬剤
等の吸収が妨げられることはない。もっとも適度の弾性
を有し伸張が可能な多孔質物質を用いて被覆を形成して
もよい。
【００２０】多孔質の物質の被覆に担持させる液体状物
質としては、本発明の経皮経管的ドラッグデリバリーデ
バイスの使用目的に応じていかなるものでも選ぶことが
できるが、通常、医薬等の薬剤を用いる。
質としては、本発明の経皮経管的ドラッグデリバリーデ
バイスの使用目的に応じていかなるものでも選ぶことが
できるが、通常、医薬等の薬剤を用いる。
【００２１】ステントによる拡張後の血管の再狭窄を防
止するという観点からは、当該薬剤としては細胞増殖性
疾患の治療薬、例えば血管増殖性疾患の遺伝子治療薬と
しての核酸又はプラスミドなどを含むものが挙げられ
る。内膜肥厚の抑制因子以外に、目的に応じて他の任意
の薬剤（医薬）を組み合わせることもできる。かかる液
体状物質は、バルーン及び／又はステントの表面の多孔
質物質の被覆に、従来公知の適切な手段により直接コー
ティングするか吸着させることにより、担持させること
ができる。
止するという観点からは、当該薬剤としては細胞増殖性
疾患の治療薬、例えば血管増殖性疾患の遺伝子治療薬と
しての核酸又はプラスミドなどを含むものが挙げられ
る。内膜肥厚の抑制因子以外に、目的に応じて他の任意
の薬剤（医薬）を組み合わせることもできる。かかる液
体状物質は、バルーン及び／又はステントの表面の多孔
質物質の被覆に、従来公知の適切な手段により直接コー
ティングするか吸着させることにより、担持させること
ができる。
【００２２】例えば、前記薬剤たる血管増殖性疾患の遺
伝子治療薬として、下記のヌクレオチド配列（Ｉ）を含
むＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイム（１） （配列中、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔはそれぞれアデニン、シトシ
ン、グアニン、チミンを塩基成分とするデオキシリボヌ
クレオチド残基であり、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕはそれぞれアデ
ニン、シトシン、グアニン、ウラシルを塩基成分とする
リボヌクレオチド残基であり、Ｎ1及びＮ3は互いに相補
的塩基対形成が可能な少なくとも１対のデオキシリボヌ
クレオチド残基を表し、Ｎ2はループ形成が可能な少な
くとも３個のデオキシリボヌクレオチド残基を表す）が
挙げられる。
伝子治療薬として、下記のヌクレオチド配列（Ｉ）を含
むＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイム（１） （配列中、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔはそれぞれアデニン、シトシ
ン、グアニン、チミンを塩基成分とするデオキシリボヌ
クレオチド残基であり、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕはそれぞれアデ
ニン、シトシン、グアニン、ウラシルを塩基成分とする
リボヌクレオチド残基であり、Ｎ1及びＮ3は互いに相補
的塩基対形成が可能な少なくとも１対のデオキシリボヌ
クレオチド残基を表し、Ｎ2はループ形成が可能な少な
くとも３個のデオキシリボヌクレオチド残基を表す）が
挙げられる。
【００２３】より具体的には、上記ヌクレオチド配列
（Ｉ）が下記のヌクレオチド配列（ＩＩ） であるＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイム（２）が挙げ
られる。
（Ｉ）が下記のヌクレオチド配列（ＩＩ） であるＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイム（２）が挙げ
られる。
【００２４】かかるリボザイム介在遺伝子治療薬は、ヒ
トトランスフォーミング増殖因子β１に対するＤＮＡ−
ＲＮＡキメラ型リボザイムの発明として、上述のように
本発明者らの一人により、特願２０００−３３９２５３
（平成１２年１１月７日）として特許出願されており、
その内容は本明細書中に取りこまれている。
トトランスフォーミング増殖因子β１に対するＤＮＡ−
ＲＮＡキメラ型リボザイムの発明として、上述のように
本発明者らの一人により、特願２０００−３３９２５３
（平成１２年１１月７日）として特許出願されており、
その内容は本明細書中に取りこまれている。
【００２５】また、他の血管増殖性疾患の遺伝子治療薬
として、国際公開ＷＯ０１／２７２６４ Ａ１に記載さ
れているヒトＰＤＧＦに対するリボザイム等が挙げられ
る。
として、国際公開ＷＯ０１／２７２６４ Ａ１に記載さ
れているヒトＰＤＧＦに対するリボザイム等が挙げられ
る。
【００２６】以下、このヒトトランスフォーミング増殖
因子β１に対するＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイムに
ついて詳細に説明する。
因子β１に対するＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイムに
ついて詳細に説明する。
【００２７】本発明は、下記のヌクレオチド配列（I）
を含むＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイムを利用するこ
とができる。 （配列中、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔはそれぞれアデニン、シトシ
ン、グアニン、チミンを塩基成分とするデオキシリボヌ
クレオチド残基であり、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕはそれぞれアデ
ニン、シトシン、グアニン、ウラシルを塩基成分とする
リボヌクレオチド残基であり、Ｎ1及びＮ3は互いに相補
的塩基対形成が可能な少なくとも１対のデオキシリボヌ
クレオチド残基を表し、Ｎ2はループ形成が可能な少な
くとも３個のデオキシリボヌクレオチド残基を表す。）
Ｎ1及びＮ3は１〜３対のヌクレオチドであることが好ま
しく、Ｎ2は３〜４個のヌクレオチドであることが好ま
しい。
を含むＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイムを利用するこ
とができる。 （配列中、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔはそれぞれアデニン、シトシ
ン、グアニン、チミンを塩基成分とするデオキシリボヌ
クレオチド残基であり、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕはそれぞれアデ
ニン、シトシン、グアニン、ウラシルを塩基成分とする
リボヌクレオチド残基であり、Ｎ1及びＮ3は互いに相補
的塩基対形成が可能な少なくとも１対のデオキシリボヌ
クレオチド残基を表し、Ｎ2はループ形成が可能な少な
くとも３個のデオキシリボヌクレオチド残基を表す。）
Ｎ1及びＮ3は１〜３対のヌクレオチドであることが好ま
しく、Ｎ2は３〜４個のヌクレオチドであることが好ま
しい。
【００２８】また、本発明は、下記のヌクレオチド配列
（Ｉ’）（配列番号９）を含むＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型
リボザイムを利用することができる。 5'-T C C T C G G C C U G A U G A G N C G A A A C T C C T T C-3' (I') （配列中、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔはそれぞれアデニン、シトシ
ン、グアニン、チミンを塩基成分とするデオキシリボヌ
クレオチド残基であり、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕはそれぞれアデ
ニン、シトシン、グアニン、ウラシルを塩基成分とする
リボヌクレオチド残基であり、Ｎは互いに相補的塩基対
形成が可能な少なくとも２個のデオキシリボヌクレオチ
ド残基とループ形成が可能な少なくとも３個のデオキシ
リボヌクレオチド残基を含む。）ヌクレオチド配列
（Ｉ）ではこのＮがＮ1，Ｎ2，Ｎ3として表されてい
る。
（Ｉ’）（配列番号９）を含むＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型
リボザイムを利用することができる。 5'-T C C T C G G C C U G A U G A G N C G A A A C T C C T T C-3' (I') （配列中、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔはそれぞれアデニン、シトシ
ン、グアニン、チミンを塩基成分とするデオキシリボヌ
クレオチド残基であり、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕはそれぞれアデ
ニン、シトシン、グアニン、ウラシルを塩基成分とする
リボヌクレオチド残基であり、Ｎは互いに相補的塩基対
形成が可能な少なくとも２個のデオキシリボヌクレオチ
ド残基とループ形成が可能な少なくとも３個のデオキシ
リボヌクレオチド残基を含む。）ヌクレオチド配列
（Ｉ）ではこのＮがＮ1，Ｎ2，Ｎ3として表されてい
る。
【００２９】また本発明は、ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リ
ボザイムの一例として、下記のヌクレオチド配列（Ｉ
Ｉ）又は（ＩＩ’）（配列番号１）を含む請求項１記載
のＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイムを利用することが
できる。 （配列中、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔはそれぞれアデニン、シトシ
ン、グアニン、チミンを塩基成分とするデオキシリボヌ
クレオチド残基であり、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕはそれぞれアデ
ニン、シトシン、グアニン、ウラシルを塩基成分とする
リボヌクレオチド残基である。）
ボザイムの一例として、下記のヌクレオチド配列（Ｉ
Ｉ）又は（ＩＩ’）（配列番号１）を含む請求項１記載
のＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイムを利用することが
できる。 （配列中、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔはそれぞれアデニン、シトシ
ン、グアニン、チミンを塩基成分とするデオキシリボヌ
クレオチド残基であり、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕはそれぞれアデ
ニン、シトシン、グアニン、ウラシルを塩基成分とする
リボヌクレオチド残基である。）
【００３０】また本発明は、３’末端に二つのホスホロ
チオアート結合を有する上記ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リ
ボザイムを利用することができる。
チオアート結合を有する上記ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リ
ボザイムを利用することができる。
【００３１】また、本発明は、上記のＤＮＡ−ＲＮＡキ
メラ型リボザイムとリポソームとの複合体を利用するこ
とができる。リポソームとしては、Ｎ−［１−（２，３
−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ
−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉ
ｄｅ（ＤＯＴＭＡ）とｄｉｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈ
ｏｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＯＰＥ）の
複合体（例えば、リポフェクチン（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉ
ｎ、ＧＩＢＣＯ）、エチレンイミンの直鎖状のポリマー
の混合物（例えば、ＥｘＧｅｎ ５００、Ｅｕｒｏｍｅ
ｄｅｘ）などを挙げることができる。
メラ型リボザイムとリポソームとの複合体を利用するこ
とができる。リポソームとしては、Ｎ−［１−（２，３
−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ
−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉ
ｄｅ（ＤＯＴＭＡ）とｄｉｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈ
ｏｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＯＰＥ）の
複合体（例えば、リポフェクチン（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉ
ｎ、ＧＩＢＣＯ）、エチレンイミンの直鎖状のポリマー
の混合物（例えば、ＥｘＧｅｎ ５００、Ｅｕｒｏｍｅ
ｄｅｘ）などを挙げることができる。
【００３２】さらに、本発明は、上記のＤＮＡ−ＲＮＡ
キメラ型リボザイムを化学合成により製造する方法を提
供する。合成法としては、リン酸トリエステル法、ホス
ホロアミダイド法、ホスホン酸エステル法などを利用す
ることができる。
キメラ型リボザイムを化学合成により製造する方法を提
供する。合成法としては、リン酸トリエステル法、ホス
ホロアミダイド法、ホスホン酸エステル法などを利用す
ることができる。
【００３３】さらにまた、本発明は、上記のＤＮＡ−Ｒ
ＮＡキメラ型リボザイム又はＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リ
ボザイムとリポソームとの複合体を有効成分として含む
医薬組成物を利用することができる。この医薬組成物
は、例えば、高血圧症、ＰＴＣＡ後の冠動脈の再狭窄、
動脈硬化症等の血管増殖性疾患、又は慢性糸球体腎炎等
の腎炎を予防及び／又は治療するのに有効である。
ＮＡキメラ型リボザイム又はＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リ
ボザイムとリポソームとの複合体を有効成分として含む
医薬組成物を利用することができる。この医薬組成物
は、例えば、高血圧症、ＰＴＣＡ後の冠動脈の再狭窄、
動脈硬化症等の血管増殖性疾患、又は慢性糸球体腎炎等
の腎炎を予防及び／又は治療するのに有効である。
【００３４】本発明は、また、上記のＤＮＡ−ＲＮＡキ
メラ型リボザイムを用いて、標的ＲＮＡを特異的に切断
するのに利用することができる。標的ＲＮＡの特異的切
断はｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏのいずれで行
ってもよい。標的ＲＮＡとしては、ヒトトランスフォー
ミング増殖因子β（ヒトＴＧＦ−β）のｍＲＮＡが挙げ
られる。また、標的ＲＮＡは下記のヌクレオチド配列
（配列番号２）を含むことが好ましい。 （配列中、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕはそれぞれ、アデニン、シト
シン、グアニン、ウラシルを塩基成分とするリボヌクレ
オチドを表す。）
メラ型リボザイムを用いて、標的ＲＮＡを特異的に切断
するのに利用することができる。標的ＲＮＡの特異的切
断はｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏのいずれで行
ってもよい。標的ＲＮＡとしては、ヒトトランスフォー
ミング増殖因子β（ヒトＴＧＦ−β）のｍＲＮＡが挙げ
られる。また、標的ＲＮＡは下記のヌクレオチド配列
（配列番号２）を含むことが好ましい。 （配列中、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕはそれぞれ、アデニン、シト
シン、グアニン、ウラシルを塩基成分とするリボヌクレ
オチドを表す。）
【００３５】本発明は、リボザイムのみではなく、アン
チセンス、デコイ、プラスミドにも利用することができ
る。
チセンス、デコイ、プラスミドにも利用することができ
る。
【００３６】
【発明の実施の形態】本発明の経皮経管的ドラッグデリ
バリーデバイスを血管の病変部の治療に用いる例につい
て説明する。まず、図１（イ）のように、バルーンカテ
ーテルと同様に屈撓性を有するガイドワイヤ（Ｗ）を血
管（Ｔ）内にあらかじめ挿入しておき、次いでこのガイ
ドワイヤ（Ｗ）にバルーンカテーテル（１）内部の案内
孔（４）を嵌め込ませて、バルーン（３）を収縮させた
状態で、かつ縮小したステント（６）を取り付けてある
バルーンカテーテル（１）を血管（Ｔ）内に挿入してい
く。バルーンカテーテル（１）の先端部（２’）が血管
内壁の病変部の位置又は血管外周部の病変部（Ｄ）に対
応する位置に至ったら、ガイドワイヤ（Ｗ）を案内孔
（４）から引き抜き、次いでエア通孔（５）を通じて空
気をバルーンに圧送してバルーン（３）を膨らませて血
管内壁面に当接させ、この膨張によりステント（６）を
拡張させる。次に、エア通孔（５）を通じて空気（Ａ）
をバルーン（３）から抜き出してバルーン（３）を収縮
させ、バルーンカテーテル（１）を血管（Ｔ）から抜き
取って、上記ステント（６）を病変部対応位置に留置す
る。バルーンの血管内壁面への当接、及び／又は、ステ
ントの留置により、バルーン及び／又はステントの表面
の被覆中に担持されている薬剤が経時的に病変部に放出
され治療効果を発揮するのである。
バリーデバイスを血管の病変部の治療に用いる例につい
て説明する。まず、図１（イ）のように、バルーンカテ
ーテルと同様に屈撓性を有するガイドワイヤ（Ｗ）を血
管（Ｔ）内にあらかじめ挿入しておき、次いでこのガイ
ドワイヤ（Ｗ）にバルーンカテーテル（１）内部の案内
孔（４）を嵌め込ませて、バルーン（３）を収縮させた
状態で、かつ縮小したステント（６）を取り付けてある
バルーンカテーテル（１）を血管（Ｔ）内に挿入してい
く。バルーンカテーテル（１）の先端部（２’）が血管
内壁の病変部の位置又は血管外周部の病変部（Ｄ）に対
応する位置に至ったら、ガイドワイヤ（Ｗ）を案内孔
（４）から引き抜き、次いでエア通孔（５）を通じて空
気をバルーンに圧送してバルーン（３）を膨らませて血
管内壁面に当接させ、この膨張によりステント（６）を
拡張させる。次に、エア通孔（５）を通じて空気（Ａ）
をバルーン（３）から抜き出してバルーン（３）を収縮
させ、バルーンカテーテル（１）を血管（Ｔ）から抜き
取って、上記ステント（６）を病変部対応位置に留置す
る。バルーンの血管内壁面への当接、及び／又は、ステ
ントの留置により、バルーン及び／又はステントの表面
の被覆中に担持されている薬剤が経時的に病変部に放出
され治療効果を発揮するのである。
【００３７】本発明の経皮経管的ドラッグデリバリーデ
バイスは、気管、尿管、食道等の血管以外の管腔に対し
ても使用することができ、これらの組織における管腔癌
の治療に用いることもできる。
バイスは、気管、尿管、食道等の血管以外の管腔に対し
ても使用することができ、これらの組織における管腔癌
の治療に用いることもできる。
【００３８】我々は高血圧症の動物モデルである高血圧
自然発症ラット（ＳＨＲ）由来のＶＳＭＣの過剰増殖に
おいてＴＧＦ−βの役割を調べ、ＴＧＦ−β１ｍＲＮＡ
に相補的なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドが
ＶＳＭＣの増殖を阻害することを示した。このことは、
高血圧症における心血管系臓器の過剰増殖におけるＴＧ
Ｆ−β１の関与を示唆している。我々はヒトＴＧＦ−β
１ｍＲＮＡを切断するための３８塩基のハンマーヘッド
型リボザイムを設計し、そして血管増殖性疾患に対する
遺伝子治療に用い得るリボザイムを開発するために、ヒ
トＶＳＭＣの増殖に対するこのハンマーヘッド型リボザ
イムの効果を検討したところ、ヒトＶＳＭＣにおけるア
ンジオテンシンＩＩ刺激ＤＮＡ生合成が用量依存的に大
きく抑制され、ヒトＶＳＭＣにおいてアンジオテンシン
ＩＩによって誘導されるＴＧＦ−β１ｍＲＮＡ発現及び
ＴＧＦ−β１蛋白質発現の両方が有意に抑制されること
がわかった。
自然発症ラット（ＳＨＲ）由来のＶＳＭＣの過剰増殖に
おいてＴＧＦ−βの役割を調べ、ＴＧＦ−β１ｍＲＮＡ
に相補的なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドが
ＶＳＭＣの増殖を阻害することを示した。このことは、
高血圧症における心血管系臓器の過剰増殖におけるＴＧ
Ｆ−β１の関与を示唆している。我々はヒトＴＧＦ−β
１ｍＲＮＡを切断するための３８塩基のハンマーヘッド
型リボザイムを設計し、そして血管増殖性疾患に対する
遺伝子治療に用い得るリボザイムを開発するために、ヒ
トＶＳＭＣの増殖に対するこのハンマーヘッド型リボザ
イムの効果を検討したところ、ヒトＶＳＭＣにおけるア
ンジオテンシンＩＩ刺激ＤＮＡ生合成が用量依存的に大
きく抑制され、ヒトＶＳＭＣにおいてアンジオテンシン
ＩＩによって誘導されるＴＧＦ−β１ｍＲＮＡ発現及び
ＴＧＦ−β１蛋白質発現の両方が有意に抑制されること
がわかった。
【００３９】本発明者はヒトＴＧＦ−β１ｍＲＮＡ（図
２）のヌクレオチド１２９から１３１のＧＵＣ配列の後
で切断するために、非触媒活性残基をデオキシリボヌク
レオチド残基で置き換え、３’末端に二つのホスホロチ
オアート結合を有する３８塩基ハンマーヘッド型ＤＮＡ
−ＲＮＡキメラ型リボザイムを設計し、合成した（図３
Ａ）。ＭｇＣｌ2の存在下で、ヒトＴＧＦ−β１ｍＲＮ
Ａに対する合成ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイムは用
量依存的に合成標的ＲＮＡを、予測された大きさの２つ
のＲＮＡ断片に切断した。ヒトＴＧＦ−β１ｍＲＮＡに
０．０１から１．０μＭのＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボ
ザイムを投与すると、ヒトＶＳＭＣによるアンジオテン
シンＩＩ刺激ＤＮＡ生合成が用量依存的に有意に抑制さ
れた。
２）のヌクレオチド１２９から１３１のＧＵＣ配列の後
で切断するために、非触媒活性残基をデオキシリボヌク
レオチド残基で置き換え、３’末端に二つのホスホロチ
オアート結合を有する３８塩基ハンマーヘッド型ＤＮＡ
−ＲＮＡキメラ型リボザイムを設計し、合成した（図３
Ａ）。ＭｇＣｌ2の存在下で、ヒトＴＧＦ−β１ｍＲＮ
Ａに対する合成ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイムは用
量依存的に合成標的ＲＮＡを、予測された大きさの２つ
のＲＮＡ断片に切断した。ヒトＴＧＦ−β１ｍＲＮＡに
０．０１から１．０μＭのＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボ
ザイムを投与すると、ヒトＶＳＭＣによるアンジオテン
シンＩＩ刺激ＤＮＡ生合成が用量依存的に有意に抑制さ
れた。
【００４０】ヒトＴＧＦ−β１ｍＲＮＡに対する１．０
μＭのＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイムの投与は、ヒ
トＶＳＭＣにおいてアンジオテンシンＩＩによって誘導
されるＴＧＦ−β１ｍＲＮＡ発現及びＴＧＦ−β１蛋白
質発現の両方を有意に抑制した。これらの結果は、ヒト
ＴＧＦ−β１ｍＲＮＡを標的として設計されたＤＮＡ−
ＲＮＡキメラ型リボザイムはＴＧＦ−β１ｍＲＮＡを切
断することによって、アンジオテンシンＩＩによって刺
激されたヒトＶＳＭＣの増殖を効果的かつ特異的に抑制
し、その結果ヒトＶＳＭＣによるＴＧＦ−β１蛋白質の
発現を抑制することを示した。このことは、血管増殖性
疾患のための遺伝子治療法としてこのＤＮＡ−ＲＮＡキ
メラ型リボザイムが利用可能であることを示している。
μＭのＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイムの投与は、ヒ
トＶＳＭＣにおいてアンジオテンシンＩＩによって誘導
されるＴＧＦ−β１ｍＲＮＡ発現及びＴＧＦ−β１蛋白
質発現の両方を有意に抑制した。これらの結果は、ヒト
ＴＧＦ−β１ｍＲＮＡを標的として設計されたＤＮＡ−
ＲＮＡキメラ型リボザイムはＴＧＦ−β１ｍＲＮＡを切
断することによって、アンジオテンシンＩＩによって刺
激されたヒトＶＳＭＣの増殖を効果的かつ特異的に抑制
し、その結果ヒトＶＳＭＣによるＴＧＦ−β１蛋白質の
発現を抑制することを示した。このことは、血管増殖性
疾患のための遺伝子治療法としてこのＤＮＡ−ＲＮＡキ
メラ型リボザイムが利用可能であることを示している。
【００４１】遺伝子治療において生体内でＤＮＡ−ＲＮ
Ａキメラ型リボザイムを発現させる場合、外部から合成
リボザイムをカチオン性の脂質膜などで包んで導入する
方法（Ｍａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８６，６０７７（１
９８９））と、ウイルスベクターなどを用いて、リボザ
イムをコードするＤＮＡを含むベクターＤＮＡを細胞内
に導入して細胞内でリボザイムを発現させる方法（Ｆｒ
ｉｅｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １７
５，９４９（１９７２））の２種類がある。その代表的
な方法としては以下のものが挙げられる。 (i) リポフェクション（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）法 細胞の表面は負に荷電している。そこで、目的のリボザ
イム又はリボザイムをコードするＤＮＡを含むベクター
（ＤＮＡ２本鎖環状プラスミド）とカチオン性の脂質
（リポフェクション試薬（リポフェクチンなど））とで
複合体をつくり、それを細胞内へ導入する。 (ii)ウイルスベクター法 ウイルスの遺伝情報のうち遺伝子発現に必要な部分のみ
を残し、そこへ治療効果をもつリボザイムをコードする
配列を組みこんだものを用意する。このベクターをウイ
ルスの力によって目的細胞のＤＮＡに組み込む。
Ａキメラ型リボザイムを発現させる場合、外部から合成
リボザイムをカチオン性の脂質膜などで包んで導入する
方法（Ｍａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８６，６０７７（１
９８９））と、ウイルスベクターなどを用いて、リボザ
イムをコードするＤＮＡを含むベクターＤＮＡを細胞内
に導入して細胞内でリボザイムを発現させる方法（Ｆｒ
ｉｅｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １７
５，９４９（１９７２））の２種類がある。その代表的
な方法としては以下のものが挙げられる。 (i) リポフェクション（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）法 細胞の表面は負に荷電している。そこで、目的のリボザ
イム又はリボザイムをコードするＤＮＡを含むベクター
（ＤＮＡ２本鎖環状プラスミド）とカチオン性の脂質
（リポフェクション試薬（リポフェクチンなど））とで
複合体をつくり、それを細胞内へ導入する。 (ii)ウイルスベクター法 ウイルスの遺伝情報のうち遺伝子発現に必要な部分のみ
を残し、そこへ治療効果をもつリボザイムをコードする
配列を組みこんだものを用意する。このベクターをウイ
ルスの力によって目的細胞のＤＮＡに組み込む。
【００４２】ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイムを用い
て、標的ＲＮＡ、特にヒトＴＧＦ−β１ｍＲＮＡを特異
的に切断することができる。ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リ
ボザイムは、医薬、特に、血管増殖性疾患を予防及び／
又は治療するための遺伝子治療薬として使用することが
できる。例えば、ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイムを
リポフェクション試薬に封入し、これを生体に投与し
て、疾患部位の細胞に取り込ませることにより、ＴＧＦ
−β１ｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。また、
ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイムをコードするＤＮＡ
をウイルスなどのベクターに組み込んで、疾患部位の細
胞内に導入することにより、ＴＧＦ−β１ｍＲＮＡの翻
訳を阻害することができる。ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リ
ボザイムの投与は、疾病の状態の重篤度や生体の応答性
などによるが、予防及び／又は治療の有効性が認められ
るまで、あるいは疾病状態の軽減が達成されるまでの期
間にわたり、適当な用量、投与方法、頻度で行えばよ
い。以下、ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイムをさらに
具体的に説明するが、本発明の範囲は何らこれらの例に
限定されるものではない。
て、標的ＲＮＡ、特にヒトＴＧＦ−β１ｍＲＮＡを特異
的に切断することができる。ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リ
ボザイムは、医薬、特に、血管増殖性疾患を予防及び／
又は治療するための遺伝子治療薬として使用することが
できる。例えば、ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイムを
リポフェクション試薬に封入し、これを生体に投与し
て、疾患部位の細胞に取り込ませることにより、ＴＧＦ
−β１ｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。また、
ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイムをコードするＤＮＡ
をウイルスなどのベクターに組み込んで、疾患部位の細
胞内に導入することにより、ＴＧＦ−β１ｍＲＮＡの翻
訳を阻害することができる。ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リ
ボザイムの投与は、疾病の状態の重篤度や生体の応答性
などによるが、予防及び／又は治療の有効性が認められ
るまで、あるいは疾病状態の軽減が達成されるまでの期
間にわたり、適当な用量、投与方法、頻度で行えばよ
い。以下、ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイムをさらに
具体的に説明するが、本発明の範囲は何らこれらの例に
限定されるものではない。
【００４３】（１）方法
１）ヒトＴＧＦ−β１ｍＲＮＡに対するハンマーヘッド
型リボザイムの設計 切断部位における２本鎖構造を避けるため、ソフトウェ
アパッケージ“ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ：Ｓｅｃｏｎｄ
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｆｒ
ｅｅ Ｅｎｅｒｇｙ”にしたがって、ヒトＴＧＦ−β１
ｍＲＮＡ配列（Ｂｅｔｓｈｏｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎ
ａｔｕｒｅ ３２０，６９５−６９９（１９８６））の
ヌクレオチド１２９〜１３１に位置するループ構造のＧ
ＵＣ配列（図２参照）を切断部位として選択し、これを
切断するための３８塩基ハンマーヘッド型リボザイム
（５’−ＴＣＣＴＣＧＧＣＣＵＧＡＵＧＡＧＵＣＣＵＵ
ＧＣＧＧＡＣＧＡＡＡＣＴＣＣＴＴＣ−３’）（配列番
号３）を設計した。
型リボザイムの設計 切断部位における２本鎖構造を避けるため、ソフトウェ
アパッケージ“ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ：Ｓｅｃｏｎｄ
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｆｒ
ｅｅ Ｅｎｅｒｇｙ”にしたがって、ヒトＴＧＦ−β１
ｍＲＮＡ配列（Ｂｅｔｓｈｏｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎ
ａｔｕｒｅ ３２０，６９５−６９９（１９８６））の
ヌクレオチド１２９〜１３１に位置するループ構造のＧ
ＵＣ配列（図２参照）を切断部位として選択し、これを
切断するための３８塩基ハンマーヘッド型リボザイム
（５’−ＴＣＣＴＣＧＧＣＣＵＧＡＵＧＡＧＵＣＣＵＵ
ＧＣＧＧＡＣＧＡＡＡＣＴＣＣＴＴＣ−３’）（配列番
号３）を設計した。
【００４４】２）Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いたハ
ンマーヘッド型リボザイム及び標的ＲＮＡの合成 Ｔ７ ＲＮＡ ポリメラーゼ及び合成ＤＮＡ鋳型を用い
て、以前に記述されたようにハンマーヘッド型リボザイ
ム及び標的ＲＮＡを合成した（Ｍｉｌｌｉｇａｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１
５，８７８３−８７９８（１９８７），Ｕｈｌｅｎｂｅ
ｃｋ，Ｎａｔｕｒｅ，３２８，５９６（１９８７））。
十分に活性な鋳型ＤＮＡ鎖として、クラスＩＩＩ Ｔ７
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの−１７から−１ま
での領域、及びこれに続く所望のＲＮＡ配列の相補体を
含む断片を作製した。標的ＤＮＡ鋳型の全長は、１７塩
基プロモーター領域、及びそれに続くヒトＴＧＦ−β１
ｍＲＮＡ配列（ヌクレオチド１０７から１９１）の８５
塩基からなる相補体を含んでいる。リボザイム鋳型ＤＮ
Ａの全長は、１７塩基プロモーター領域、及びそれに続
くリボザイム配列の３８塩基からなる相補体を含んでい
る。転写鋳型を作製するため、プロモーターの−１７か
ら−１に対応する１７ヌクレオチド断片に対応する相補
鎖を鋳型ＤＮＡ鎖のプロモーター部分にアニールさせ
た。アニールした鋳型を調製するため、これら２つの鎖
を等モル濃度で混合し、９０℃で２分間加熱し、６０℃
で３分間アニールし、次に氷上で素早く冷やした。
ンマーヘッド型リボザイム及び標的ＲＮＡの合成 Ｔ７ ＲＮＡ ポリメラーゼ及び合成ＤＮＡ鋳型を用い
て、以前に記述されたようにハンマーヘッド型リボザイ
ム及び標的ＲＮＡを合成した（Ｍｉｌｌｉｇａｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１
５，８７８３−８７９８（１９８７），Ｕｈｌｅｎｂｅ
ｃｋ，Ｎａｔｕｒｅ，３２８，５９６（１９８７））。
十分に活性な鋳型ＤＮＡ鎖として、クラスＩＩＩ Ｔ７
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの−１７から−１ま
での領域、及びこれに続く所望のＲＮＡ配列の相補体を
含む断片を作製した。標的ＤＮＡ鋳型の全長は、１７塩
基プロモーター領域、及びそれに続くヒトＴＧＦ−β１
ｍＲＮＡ配列（ヌクレオチド１０７から１９１）の８５
塩基からなる相補体を含んでいる。リボザイム鋳型ＤＮ
Ａの全長は、１７塩基プロモーター領域、及びそれに続
くリボザイム配列の３８塩基からなる相補体を含んでい
る。転写鋳型を作製するため、プロモーターの−１７か
ら−１に対応する１７ヌクレオチド断片に対応する相補
鎖を鋳型ＤＮＡ鎖のプロモーター部分にアニールさせ
た。アニールした鋳型を調製するため、これら２つの鎖
を等モル濃度で混合し、９０℃で２分間加熱し、６０℃
で３分間アニールし、次に氷上で素早く冷やした。
【００４５】ＲＮＡの合成には、３μｇのアニールした
鋳型を６μｌのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（５０ Ｕ／
μｌ，宝バイオケミカル、大阪）、５μｌのα−32Ｐ−
ＣＴＰ（比活性 ３０００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ，Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ，ＤＥ，ＵＳＡ）、５
０ ＵのＲＮａｓｅ阻害剤（宝バイオケミカル、大阪）
及び５０μｌの転写反応緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ ８．０），０．５ｍＭ ｒＮＴＰ，８ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2，５ｍＭ ジチオスライトール（ＤＴ
Ｔ），２ｍＭスペルミジン）と混合し、３７℃で４時間
インキュベートした。次に、これを１００μｌのフェノ
ール及びクロロホルム（１：１）と混合し、１６０００
ｒｐｍで３０秒間遠心した。上清を新しい試験管に移
し、等容量のクロロホルム／イソアミルアルコール（２
５：１）と混合した。１６０００ｒｐｍで３０秒間遠心
した後、上清を２００μｌの１００％エタノールと混合
し、１６０００ｒｐｍで１５分間遠心し、ＲＮＡペレッ
トを調製した。このＲＮＡを７５％エタノールで２回洗
浄し、エタノールを蒸発させ、ＲＮＡをジエチルピロカ
ルボネート（ＤＥＰＣ）で処理したＨ2Ｏ ５μｌに溶
解した。電気泳動にかける前に５μｌのＲＮＡを９０℃
で２分間加熱してから、６％ポリアクリルアミド塩基決
定用ゲルにのせた。３００Ｖで１時間電気泳動した後、
ゲルを１０分間フィルムに暴露し、ＲＮＡバンドをゲル
から切り出した。ＲＮＡを含むゲルを４００μｌのＤＥ
ＰＣ処理水中で破壊し、５０℃で２時間振とうしてＲＮ
Ａ抽出を行った。１４０００ｒｐｍで４℃で１５分間遠
心した後、上清を新しい試験管に移し、４０μｌの３Ｍ
酢酸ナトリウム及び１ｍｌの９９％エタノールと混合
し、−２０℃で１時間保持した。１４０００ｒｐｍで４
℃で１５分間遠心した後、ＲＮＡペレットを７５％エタ
ノールで２回洗浄し、エタノールを蒸発させ、ＲＮＡを
５０μｌのＤＥＰＣ処理水に溶解し、−８０℃で保存し
た。ＲＮＡ濃度は、ＵＶ−１２００分光光度計（島津製
作所、東京）を用いた紫外分光法により測定した。
鋳型を６μｌのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（５０ Ｕ／
μｌ，宝バイオケミカル、大阪）、５μｌのα−32Ｐ−
ＣＴＰ（比活性 ３０００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ，Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ，ＤＥ，ＵＳＡ）、５
０ ＵのＲＮａｓｅ阻害剤（宝バイオケミカル、大阪）
及び５０μｌの転写反応緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ ８．０），０．５ｍＭ ｒＮＴＰ，８ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2，５ｍＭ ジチオスライトール（ＤＴ
Ｔ），２ｍＭスペルミジン）と混合し、３７℃で４時間
インキュベートした。次に、これを１００μｌのフェノ
ール及びクロロホルム（１：１）と混合し、１６０００
ｒｐｍで３０秒間遠心した。上清を新しい試験管に移
し、等容量のクロロホルム／イソアミルアルコール（２
５：１）と混合した。１６０００ｒｐｍで３０秒間遠心
した後、上清を２００μｌの１００％エタノールと混合
し、１６０００ｒｐｍで１５分間遠心し、ＲＮＡペレッ
トを調製した。このＲＮＡを７５％エタノールで２回洗
浄し、エタノールを蒸発させ、ＲＮＡをジエチルピロカ
ルボネート（ＤＥＰＣ）で処理したＨ2Ｏ ５μｌに溶
解した。電気泳動にかける前に５μｌのＲＮＡを９０℃
で２分間加熱してから、６％ポリアクリルアミド塩基決
定用ゲルにのせた。３００Ｖで１時間電気泳動した後、
ゲルを１０分間フィルムに暴露し、ＲＮＡバンドをゲル
から切り出した。ＲＮＡを含むゲルを４００μｌのＤＥ
ＰＣ処理水中で破壊し、５０℃で２時間振とうしてＲＮ
Ａ抽出を行った。１４０００ｒｐｍで４℃で１５分間遠
心した後、上清を新しい試験管に移し、４０μｌの３Ｍ
酢酸ナトリウム及び１ｍｌの９９％エタノールと混合
し、−２０℃で１時間保持した。１４０００ｒｐｍで４
℃で１５分間遠心した後、ＲＮＡペレットを７５％エタ
ノールで２回洗浄し、エタノールを蒸発させ、ＲＮＡを
５０μｌのＤＥＰＣ処理水に溶解し、−８０℃で保存し
た。ＲＮＡ濃度は、ＵＶ−１２００分光光度計（島津製
作所、東京）を用いた紫外分光法により測定した。
【００４６】３）ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断反応
ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断反応を以前に記述されたように実
施した（Ｓａｘｅｎａｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃ
ｈｅｍ．２６５，１７１０６−１７１０９（１９９
０））。標的ＲＮＡへのハンマーヘッド型リボザイムの
アニーリングは、１μｌの２．４μＭリボザイム及び１
μｌの２４０ｎＭ標的ＲＮＡを２０μｌの５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に添加し、９０℃で１分
間加熱し、次いで、反応液をゆっくり（３０分かけて）
３７℃に冷やすことにより行った。切断反応は、切断反
応緩衝液中のアニールしたリボザイム及び標的ＲＮＡに
２μｌの２５０ｍＭ ＭｇＣｌ2を添加することによっ
て開始し、次に混合物を３７℃で１、５及び１５時間イ
ンキュベートした。各サンプルを９０℃で２分間加熱
し、氷上で素早く冷やした。次に５μｌの各サンプルを
電気泳動用の配列決定ゲルに適用した。ゲルを乾燥さ
せ、オートラジオグラフィー用のフィルムに暴露した。
施した（Ｓａｘｅｎａｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃ
ｈｅｍ．２６５，１７１０６−１７１０９（１９９
０））。標的ＲＮＡへのハンマーヘッド型リボザイムの
アニーリングは、１μｌの２．４μＭリボザイム及び１
μｌの２４０ｎＭ標的ＲＮＡを２０μｌの５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に添加し、９０℃で１分
間加熱し、次いで、反応液をゆっくり（３０分かけて）
３７℃に冷やすことにより行った。切断反応は、切断反
応緩衝液中のアニールしたリボザイム及び標的ＲＮＡに
２μｌの２５０ｍＭ ＭｇＣｌ2を添加することによっ
て開始し、次に混合物を３７℃で１、５及び１５時間イ
ンキュベートした。各サンプルを９０℃で２分間加熱
し、氷上で素早く冷やした。次に５μｌの各サンプルを
電気泳動用の配列決定ゲルに適用した。ゲルを乾燥さ
せ、オートラジオグラフィー用のフィルムに暴露した。
【００４７】４）ＴＧＦ−β１に対するハンマーヘッド
型ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイムの設計 ヒトＴＧＦ−β１ｍＲＮＡ（図２）をヌクレオチド１３
１のＧＵＣ配列で切断するために、非触媒活性残基をデ
オキシリボヌクレオチドで置き換え、３’末端に二つの
ホスホロチオアート結合を有する３８塩基ハンマーヘッ
ド型ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイムを設計した（図
３Ａ、下段の配列、配列番号１）。また、触媒活性ルー
プ領域に一塩基置換を有するミスマッチリボザイムも対
照として使用するために設計した（図３Ｂ、下段の配
列、配列番号４）。これは上記ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型
リボザイムの塩基配列のうち５’側から３１番目のＡを
Ｃに一塩基置換したものである。下線を付した塩基の記
号はＲＮＡ構造（リボヌクレオチド）であることを示
し、他はＤＮＡ構造（デオキシリボヌクレオチド）であ
る。＊は、核酸分解酵素に対して耐性とするために、
３’側の二塩基間の構造をホスホロチオエートの形に化
学修飾してあることを意味する。ハンマーヘッド型ＤＮ
Ａ−ＲＮＡキメラ型リボザイムとミスマッチリボザイム
はＤＮＡ−ＲＮＡ合成機で合成し、高速液体クロマトグ
ラフィーにより精製した。細胞実験では活性部位のみＲ
ＮＡで他の部位を上述のようにＤＮＡ構造としたキメラ
型リボザイムを合成して用いた。リボザイムの取り込み
実験では、キメラ型リボザイムをＦＩＴＣでラベルして
リポフェクチンにてＶＳＭＣに投与し、細胞への時間的
な取り込みを調べた。
型ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイムの設計 ヒトＴＧＦ−β１ｍＲＮＡ（図２）をヌクレオチド１３
１のＧＵＣ配列で切断するために、非触媒活性残基をデ
オキシリボヌクレオチドで置き換え、３’末端に二つの
ホスホロチオアート結合を有する３８塩基ハンマーヘッ
ド型ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイムを設計した（図
３Ａ、下段の配列、配列番号１）。また、触媒活性ルー
プ領域に一塩基置換を有するミスマッチリボザイムも対
照として使用するために設計した（図３Ｂ、下段の配
列、配列番号４）。これは上記ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型
リボザイムの塩基配列のうち５’側から３１番目のＡを
Ｃに一塩基置換したものである。下線を付した塩基の記
号はＲＮＡ構造（リボヌクレオチド）であることを示
し、他はＤＮＡ構造（デオキシリボヌクレオチド）であ
る。＊は、核酸分解酵素に対して耐性とするために、
３’側の二塩基間の構造をホスホロチオエートの形に化
学修飾してあることを意味する。ハンマーヘッド型ＤＮ
Ａ−ＲＮＡキメラ型リボザイムとミスマッチリボザイム
はＤＮＡ−ＲＮＡ合成機で合成し、高速液体クロマトグ
ラフィーにより精製した。細胞実験では活性部位のみＲ
ＮＡで他の部位を上述のようにＤＮＡ構造としたキメラ
型リボザイムを合成して用いた。リボザイムの取り込み
実験では、キメラ型リボザイムをＦＩＴＣでラベルして
リポフェクチンにてＶＳＭＣに投与し、細胞への時間的
な取り込みを調べた。
【００４８】５）細胞培養及び静止状態の確立
ヒト大動脈から分離し継代培養したヒトＶＳＭＣ（Ｂｉ
ｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＭＤ，ＵＳＡ）を、
１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ，ＬｉｆｅＴｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，
ＭＤ，ＵＳＡ）及び５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン
（Ｇｉｂｃｏ）を含む平滑筋基礎培地（ＳｍＢＭ，Ｂｉ
ｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＭＤ，ＵＳＡ）中で
維持した。７−１０日で細胞が集密に達すると、細胞は
培養下の平滑筋細胞に典型的な丘と谷のパターン（ｈｉ
ｌｌ−ａｎｄ−ｖａｌｌｅｙ ｐａｔｔｅｒｎ）を示し
た。これらの細胞を、Ｃａ2+及びＭｇ2+を含まないダル
ベッコのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解した
０．０５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ）を用いたトリプシ
ン処理に付し、７５ｃｍ2の組織培養フラスコに入れて
細胞１０5個／ｍｌの密度でインキュベートした。トリ
プシン処理した細胞を２４ウエルの培養皿に細胞１０5
個／ウエルの密度で播いた。細胞はＣＯ2インキュベー
ター内で１０％ウシ胎児血清を含むＳｍＢＭ中で３７℃
で４０−６０％集密になるまで増殖させ、次に培地を無
血清ＳｍＢＭ培地に交換して４８時間インキュベート
し、静止状態を確立した。
ｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＭＤ，ＵＳＡ）を、
１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ，ＬｉｆｅＴｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，
ＭＤ，ＵＳＡ）及び５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン
（Ｇｉｂｃｏ）を含む平滑筋基礎培地（ＳｍＢＭ，Ｂｉ
ｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＭＤ，ＵＳＡ）中で
維持した。７−１０日で細胞が集密に達すると、細胞は
培養下の平滑筋細胞に典型的な丘と谷のパターン（ｈｉ
ｌｌ−ａｎｄ−ｖａｌｌｅｙ ｐａｔｔｅｒｎ）を示し
た。これらの細胞を、Ｃａ2+及びＭｇ2+を含まないダル
ベッコのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解した
０．０５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ）を用いたトリプシ
ン処理に付し、７５ｃｍ2の組織培養フラスコに入れて
細胞１０5個／ｍｌの密度でインキュベートした。トリ
プシン処理した細胞を２４ウエルの培養皿に細胞１０5
個／ウエルの密度で播いた。細胞はＣＯ2インキュベー
ター内で１０％ウシ胎児血清を含むＳｍＢＭ中で３７℃
で４０−６０％集密になるまで増殖させ、次に培地を無
血清ＳｍＢＭ培地に交換して４８時間インキュベート
し、静止状態を確立した。
【００４９】６）ＶＳＭＣ中へのリボザイムのデリバリ
ー トランスフェクション実験のため、ＲＮＡ合成機によっ
てヒトＴＧＦ−β１ｍＲＮＡに対するハンマーヘッド型
リボザイムを合成し、高速液体クロマトグラフィーによ
って精製した。各トランスフェクションごとに、１００
μｌの無血清ダルベック修飾型イーグル培養液（ＤＭＥ
Ｍ）を用いてリボザイムを０．０１−１．０μＭに希釈
し、また１００μｌの無血清ＤＭＥＭを用いて５μｌの
リポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ）を希釈し、そして室温に
４５分間放置した。両方の希釈物を混合し、室温で１５
分間インキュベートした。静止ＶＳＭＣを無血清ＤＭＥ
Ｍで２回洗浄し、次にリポフェクチン・リボザイム複合
体（２００μｌ）を細胞に添加し、ＣＯ2インキュベー
ター内で３７℃でインキュベートした。
ー トランスフェクション実験のため、ＲＮＡ合成機によっ
てヒトＴＧＦ−β１ｍＲＮＡに対するハンマーヘッド型
リボザイムを合成し、高速液体クロマトグラフィーによ
って精製した。各トランスフェクションごとに、１００
μｌの無血清ダルベック修飾型イーグル培養液（ＤＭＥ
Ｍ）を用いてリボザイムを０．０１−１．０μＭに希釈
し、また１００μｌの無血清ＤＭＥＭを用いて５μｌの
リポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ）を希釈し、そして室温に
４５分間放置した。両方の希釈物を混合し、室温で１５
分間インキュベートした。静止ＶＳＭＣを無血清ＤＭＥ
Ｍで２回洗浄し、次にリポフェクチン・リボザイム複合
体（２００μｌ）を細胞に添加し、ＣＯ2インキュベー
ター内で３７℃でインキュベートした。
【００５０】７）ＤＮＡ生合成の測定
新たに生合成されたＤＮＡへの3Ｈ−チミジンの取り込
みを以前に記述されたように測定した（Ｆｒａｎｋｓ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．１
１９，４１−４５（１９８４））。２４ウエルプレート
中のリボザイムで処理したＶＳＭＣ及び処理していない
ＶＳＭＣを、3Ｈ−チミジン（０．５μＣｉ／ｍｌ）
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｆｏｓｔ
ｅｒ，ＣＡ，ＵＳＡ）を含むＤＭＥＭと共に２時間イン
キュベートした。１ｍｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌを用い
て各ウエルを洗浄して過剰の3Ｈ−チミジンを除去した
後、細胞を１ｍｌのエタノール：酢酸（３：１）溶液中
で１０分間固定した。１ｍｌのＨ2Ｏで洗浄した後、１
ｍｌの冷過塩素酸を用いて酸不溶性物質を沈殿させ、９
０℃で２０分間加熱することによって１．５ｍｌの過塩
素酸中にＤＮＡを抽出した。可溶化ＤＮＡを含む過塩素
酸をシンチレーションバイアルに移し、１０ｍｌのシン
チレーションカクテルと混合し、液体シンチレーション
検出計を用いて放射能を測定した。
みを以前に記述されたように測定した（Ｆｒａｎｋｓ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．１
１９，４１−４５（１９８４））。２４ウエルプレート
中のリボザイムで処理したＶＳＭＣ及び処理していない
ＶＳＭＣを、3Ｈ−チミジン（０．５μＣｉ／ｍｌ）
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｆｏｓｔ
ｅｒ，ＣＡ，ＵＳＡ）を含むＤＭＥＭと共に２時間イン
キュベートした。１ｍｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌを用い
て各ウエルを洗浄して過剰の3Ｈ−チミジンを除去した
後、細胞を１ｍｌのエタノール：酢酸（３：１）溶液中
で１０分間固定した。１ｍｌのＨ2Ｏで洗浄した後、１
ｍｌの冷過塩素酸を用いて酸不溶性物質を沈殿させ、９
０℃で２０分間加熱することによって１．５ｍｌの過塩
素酸中にＤＮＡを抽出した。可溶化ＤＮＡを含む過塩素
酸をシンチレーションバイアルに移し、１０ｍｌのシン
チレーションカクテルと混合し、液体シンチレーション
検出計を用いて放射能を測定した。
【００５１】８）ＴＧＦ−β１ｍＲＮＡの発現について
のＲＴ−ＰＣＲアッセイ ２４ウエルプレート中のリボザイムで処理したＶＳＭＣ
及び処理していないＶＳＭＣをＰＢＳで１回洗浄し、各
ウエルのＶＳＭＣを８００μｌのＲＮＡｚｏｌＢ（Ｂｉ
ｏｔｅｃｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｈ
ｏｕｓｔｏｎ，ＴＥ，ＵＳＡ）中で溶解した。各サンプ
ルを１５秒間ボルテックス攪拌によって８０μｌのクロ
ロホルムと混合し、氷上に１５分間放置し、次に１２，
０００ｇで１５分間遠心して全ＲＮＡを抽出した。無色
の上部の水相を等容量のイソプロパノールと混合し、−
２０℃に４５分間維持し、次に１２，０００ｇで１５分
間４℃で遠心してＲＮＡを沈殿させた。このＲＮＡペレ
ットを５００μｌの７５％エタノールで２回洗浄し、１
２，０００ｇで８分間４℃で遠心し、乾燥させ、１０μ
ｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した。６５℃で１
５分間変性した後、ＲＮＡサンプルを０．５μｌのＤＮ
ａｓｅ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
３），５０ｍＭＫＣｌ及び２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2）に
溶解した０．５ ＵのＤＮａｓｅ（Ｇｉｂｃｏ）で室温
で４５分間処理した。次に、０．５μｌの２０ｍＭ Ｅ
ＤＴＡを添加し、９８℃で１０分間加熱することによっ
てＤＮａｓｅを失活させた。
のＲＴ−ＰＣＲアッセイ ２４ウエルプレート中のリボザイムで処理したＶＳＭＣ
及び処理していないＶＳＭＣをＰＢＳで１回洗浄し、各
ウエルのＶＳＭＣを８００μｌのＲＮＡｚｏｌＢ（Ｂｉ
ｏｔｅｃｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｈ
ｏｕｓｔｏｎ，ＴＥ，ＵＳＡ）中で溶解した。各サンプ
ルを１５秒間ボルテックス攪拌によって８０μｌのクロ
ロホルムと混合し、氷上に１５分間放置し、次に１２，
０００ｇで１５分間遠心して全ＲＮＡを抽出した。無色
の上部の水相を等容量のイソプロパノールと混合し、−
２０℃に４５分間維持し、次に１２，０００ｇで１５分
間４℃で遠心してＲＮＡを沈殿させた。このＲＮＡペレ
ットを５００μｌの７５％エタノールで２回洗浄し、１
２，０００ｇで８分間４℃で遠心し、乾燥させ、１０μ
ｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した。６５℃で１
５分間変性した後、ＲＮＡサンプルを０．５μｌのＤＮ
ａｓｅ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
３），５０ｍＭＫＣｌ及び２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2）に
溶解した０．５ ＵのＤＮａｓｅ（Ｇｉｂｃｏ）で室温
で４５分間処理した。次に、０．５μｌの２０ｍＭ Ｅ
ＤＴＡを添加し、９８℃で１０分間加熱することによっ
てＤＮａｓｅを失活させた。
【００５２】ＲＴ−ＰＣＲを以前に記述されたように実
施した（Ｍｏｃｈａｒｌａ ｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ ９
３，２７１−２７５（１９９０））。すなわち、１０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．３）に溶解した０．２
５Ｕ／μｌの鳥類骨髄芽球腫ウイルス逆転写酵素（Ｌｉ
ｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒ
ｓｂｕｒｇ，ＦＬ，ＵＳＡ）、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、５
０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭデオキシＮＴＰｓ、及び２．５
μＭランダムヘキサマーを用いて、ＲＮＡ（１μｇ／２
０μｌ）を１本鎖ｃＤＮＡに逆転写した。５μｌの希釈
したｃＤＮＡ産物を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＭｇＣｌ2
及び０．０２５ Ｕ／μｌ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラー
ゼ（宝バイオケミカル、大阪）ならびに０．２μＭ上流
センスプライマー及び下流アンチセンスプライマーと混
合し、全量を２５μｌとした。ＧＵＣ切断部位を含むセ
ンスプライマー（５’−ＡＴＣＡＧＡＧＣＴＣＣＧＡＧ
ＡＡＧＣＧＧＴＡＣＣ−３’）（配列番号５）及びアン
チセンスプライマー（５’−ＧＴＣＣＡＣＴＴＧＣＡＧ
ＴＧＴＧＴＴＡＴＣＣＣＴＧ−３’）（配列番号６）を
用いてヒトＴＧＦ−β１ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅を実施
し、４１５塩基対（ｂｐ）の産物を得た。ヒト１８Ｓリ
ボソームＲＮＡに対するセンスプライマー（５’−ＴＣ
ＡＡＧＡＡＣＧＡＡＡＧＴＣＧＧＡＧＧ−３’）（配列
番号７）及びアンチセンスプライマー（５’−ＧＧＡＣ
ＡＴＣＴＡＡＧＧＧＣＡＴＣＡＣＡ−３’）（配列番号
８）を内部対照として用いた。ＰＣＲは自動サーマルサ
イクラー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ，
ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて実施した。ＰＣＲ増幅は９６
℃で５分間最初の変性を行った後、９４℃で６０秒間の
変性、５８℃で２分間のアニーリング及び７２℃で１分
間のプライマー伸長を１サイクルとして３０サイクル行
い、次に７２℃で１０分間最後の伸長を行って実施し
た。得られたＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル上で
電気泳動にかけた。
施した（Ｍｏｃｈａｒｌａ ｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ ９
３，２７１−２７５（１９９０））。すなわち、１０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．３）に溶解した０．２
５Ｕ／μｌの鳥類骨髄芽球腫ウイルス逆転写酵素（Ｌｉ
ｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒ
ｓｂｕｒｇ，ＦＬ，ＵＳＡ）、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、５
０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭデオキシＮＴＰｓ、及び２．５
μＭランダムヘキサマーを用いて、ＲＮＡ（１μｇ／２
０μｌ）を１本鎖ｃＤＮＡに逆転写した。５μｌの希釈
したｃＤＮＡ産物を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＭｇＣｌ2
及び０．０２５ Ｕ／μｌ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラー
ゼ（宝バイオケミカル、大阪）ならびに０．２μＭ上流
センスプライマー及び下流アンチセンスプライマーと混
合し、全量を２５μｌとした。ＧＵＣ切断部位を含むセ
ンスプライマー（５’−ＡＴＣＡＧＡＧＣＴＣＣＧＡＧ
ＡＡＧＣＧＧＴＡＣＣ−３’）（配列番号５）及びアン
チセンスプライマー（５’−ＧＴＣＣＡＣＴＴＧＣＡＧ
ＴＧＴＧＴＴＡＴＣＣＣＴＧ−３’）（配列番号６）を
用いてヒトＴＧＦ−β１ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅を実施
し、４１５塩基対（ｂｐ）の産物を得た。ヒト１８Ｓリ
ボソームＲＮＡに対するセンスプライマー（５’−ＴＣ
ＡＡＧＡＡＣＧＡＡＡＧＴＣＧＧＡＧＧ−３’）（配列
番号７）及びアンチセンスプライマー（５’−ＧＧＡＣ
ＡＴＣＴＡＡＧＧＧＣＡＴＣＡＣＡ−３’）（配列番号
８）を内部対照として用いた。ＰＣＲは自動サーマルサ
イクラー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ，
ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて実施した。ＰＣＲ増幅は９６
℃で５分間最初の変性を行った後、９４℃で６０秒間の
変性、５８℃で２分間のアニーリング及び７２℃で１分
間のプライマー伸長を１サイクルとして３０サイクル行
い、次に７２℃で１０分間最後の伸長を行って実施し
た。得られたＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル上で
電気泳動にかけた。
【００５３】９）ＶＳＭＣ中のＴＧＦ−β１タンパク質
のウエスタンブロット分析 リボザイムで処理した及び処理していない、６ウエルプ
レート中の細胞密度が１０5個／ｃｍ2のヒトＶＳＭＣを
ＰＢＳで洗浄し、１ウエルあたり１ｍｌの溶解緩衝液
（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０
ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％アジ化ナトリウム、１００
μｇ／ｍｌフェニルメチルスルホニルフルオリド、１μ
ｇ／ｍｌアプロチニン、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１０
０）に溶解した。１００μｌのクロロホルム及び４００
μｌのメタノールを用いて全タンパク質を抽出し、精製
した。次に、Ｌｏｗｒｙらの方法（Ｌｏｗｒｙ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９３，２６５−２
７５（１９５１））によりタンパク質濃度を測定した。
ウエスタンブロット分析には５μｇのタンパク質を２０
μｌのサンプル緩衝液と共に使用した。サンプルを煮沸
し、６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。次
にタンパク質をニトロセルロース膜に転写した。１００
％ブロックエース（大日本製薬株式会社、大阪）を用い
て４℃で一晩インキュベートした後、膜を、１５％ブロ
ックエースを含むＴＢＳＴ溶液（１０ｍＭ
のウエスタンブロット分析 リボザイムで処理した及び処理していない、６ウエルプ
レート中の細胞密度が１０5個／ｃｍ2のヒトＶＳＭＣを
ＰＢＳで洗浄し、１ウエルあたり１ｍｌの溶解緩衝液
（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０
ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％アジ化ナトリウム、１００
μｇ／ｍｌフェニルメチルスルホニルフルオリド、１μ
ｇ／ｍｌアプロチニン、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１０
０）に溶解した。１００μｌのクロロホルム及び４００
μｌのメタノールを用いて全タンパク質を抽出し、精製
した。次に、Ｌｏｗｒｙらの方法（Ｌｏｗｒｙ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９３，２６５−２
７５（１９５１））によりタンパク質濃度を測定した。
ウエスタンブロット分析には５μｇのタンパク質を２０
μｌのサンプル緩衝液と共に使用した。サンプルを煮沸
し、６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。次
にタンパク質をニトロセルロース膜に転写した。１００
％ブロックエース（大日本製薬株式会社、大阪）を用い
て４℃で一晩インキュベートした後、膜を、１５％ブロ
ックエースを含むＴＢＳＴ溶液（１０ｍＭ
【００５４】Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０
ｍＭ ＮａＣｌ及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で
２００倍に希釈したＴＧＦ−β１に特異的なウサギポリ
クローナル抗体（Ａｕｓｔｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌｓ，Ｓａｎ Ｒａｍｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）と共に、室
温で３時間インキュベートした。ＴＢＳＴ溶液で１０分
間２回洗浄した後、膜を、１５％ブロックエースを含む
ＴＢＳＴ溶液で３０００倍に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗
ウサギＩｇＧ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ）と共に、室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳ
Ｔ溶液で１０分間洗浄した。ＴＧＦ−β１は電気化学ル
ミネセンスで検出した（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２５，１５３１−１５４６
（１９７９））。同じ膜をα−チュブリンに特異的なマ
ウスモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ Ｂｉｏｓｃｉｅ
ｎｃｅ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を内部対
照として用いて再度調べた。
ｍＭ ＮａＣｌ及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で
２００倍に希釈したＴＧＦ−β１に特異的なウサギポリ
クローナル抗体（Ａｕｓｔｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌｓ，Ｓａｎ Ｒａｍｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）と共に、室
温で３時間インキュベートした。ＴＢＳＴ溶液で１０分
間２回洗浄した後、膜を、１５％ブロックエースを含む
ＴＢＳＴ溶液で３０００倍に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗
ウサギＩｇＧ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ）と共に、室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳ
Ｔ溶液で１０分間洗浄した。ＴＧＦ−β１は電気化学ル
ミネセンスで検出した（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２５，１５３１−１５４６
（１９７９））。同じ膜をα−チュブリンに特異的なマ
ウスモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ Ｂｉｏｓｃｉｅ
ｎｃｅ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を内部対
照として用いて再度調べた。
【００５５】１０）統計学的分析
結果を平均±ＳＥＭで示す。平均値間の有意差は対にな
っていないデータに対するスチューデントｔ検定、及び
二方向（ｔｗｏ−ｗａｙ）分散分析（ＡＮＯＶＡ）によ
って評価し、その後Ｄｕｎｃａｎの多範囲検定を行っ
た。
っていないデータに対するスチューデントｔ検定、及び
二方向（ｔｗｏ−ｗａｙ）分散分析（ＡＮＯＶＡ）によ
って評価し、その後Ｄｕｎｃａｎの多範囲検定を行っ
た。
【００５６】（２）結果
１）ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断反応
ヒトＴＧＦ−β１ｍＲＮＡに対する合成ハンマーヘッド
型リボザイム及び標的ＲＮＡを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ
切断反応を図４に示す。ＭｇＣｌ2の存在下で、合成リ
ボザイムは標的ＲＮＡを予測されたサイズ（６０及び２
５塩基）に一致する２つのＲＮＡ断片に切断したが、ミ
スマッチリボザイムではそのような切断は見られなかっ
た。切断反応は０．５から２時間のインキュベーション
で認められた。
型リボザイム及び標的ＲＮＡを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ
切断反応を図４に示す。ＭｇＣｌ2の存在下で、合成リ
ボザイムは標的ＲＮＡを予測されたサイズ（６０及び２
５塩基）に一致する２つのＲＮＡ断片に切断したが、ミ
スマッチリボザイムではそのような切断は見られなかっ
た。切断反応は０．５から２時間のインキュベーション
で認められた。
【００５７】２）ヒトＶＳＭＣの増殖に対するキメラ型
リボザイムの効果 ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断反応の結果に基づいてヒトＴＧＦ
−β１に対するＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイム（以
下単にキメラ型リボザイムとも言う）を設計し、ヒトＶ
ＳＭＣの増殖に対する効果を調べた。ＶＳＭＣにおける
アンジオテンシンＩＩ刺激ＤＮＡ生合成に及ぼす、キメ
ラ型リボザイム（０．０１−１．０μＭ）の効果を図５
に示す。１０μＭのアンジオテンシンＩＩの投与はヒト
ＶＳＭＣによるＤＮＡ生合成を有意に増加させた。また
０．１及び１．０μＭのキメラ型リボザイムの投与はヒ
トＶＳＭＣによるアンジオテンシンＩＩ刺激ＤＮＡ生合
成を、ミスマッチリボザイムの結果と比較して有意に
（Ｐ＜０．０１）抑制した。ミスマッチリボザイムはＶ
ＳＭＣによるアンジオテンシンＩＩ刺激ＤＮＡ生合成に
影響を及ぼさなかった。アンジオテンシンＩＩの存在下
でのヒトＶＳＭＣの細胞数の増加に及ぼすキメラ型リボ
ザイムの効果を図６に示す。１０μＭのアンジオテンシ
ンＩＩの投与はヒトＶＳＭＣの細胞数を有意に増加させ
た。また１μＭのリボザイムの投与は、細胞数の増加を
用量依存的に有意に（Ｐ＜０．０１）抑制した。ミスマ
ッチリボザイムは細胞数の増加に影響を及ぼさなかっ
た。
リボザイムの効果 ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断反応の結果に基づいてヒトＴＧＦ
−β１に対するＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイム（以
下単にキメラ型リボザイムとも言う）を設計し、ヒトＶ
ＳＭＣの増殖に対する効果を調べた。ＶＳＭＣにおける
アンジオテンシンＩＩ刺激ＤＮＡ生合成に及ぼす、キメ
ラ型リボザイム（０．０１−１．０μＭ）の効果を図５
に示す。１０μＭのアンジオテンシンＩＩの投与はヒト
ＶＳＭＣによるＤＮＡ生合成を有意に増加させた。また
０．１及び１．０μＭのキメラ型リボザイムの投与はヒ
トＶＳＭＣによるアンジオテンシンＩＩ刺激ＤＮＡ生合
成を、ミスマッチリボザイムの結果と比較して有意に
（Ｐ＜０．０１）抑制した。ミスマッチリボザイムはＶ
ＳＭＣによるアンジオテンシンＩＩ刺激ＤＮＡ生合成に
影響を及ぼさなかった。アンジオテンシンＩＩの存在下
でのヒトＶＳＭＣの細胞数の増加に及ぼすキメラ型リボ
ザイムの効果を図６に示す。１０μＭのアンジオテンシ
ンＩＩの投与はヒトＶＳＭＣの細胞数を有意に増加させ
た。また１μＭのリボザイムの投与は、細胞数の増加を
用量依存的に有意に（Ｐ＜０．０１）抑制した。ミスマ
ッチリボザイムは細胞数の増加に影響を及ぼさなかっ
た。
【００５８】３）ヒトＶＳＭＣにおけるＴＧＦ−β１ｍ
ＲＮＡの発現に及ぼすキメラ型リボザイムの効果 図７はヒトＶＳＭＣにおけるアンジオテンシンＩＩ刺激
によるＴＧＦ−β１ｍＲＮＡの発現に及ぼすキメラ型リ
ボザイムの効果を示す。１０μＭのアンジオテンシンＩ
Ｉのみ、又は１０μＭのアンジオテンシンＩＩ及び１μ
Ｍのキメラ型リボザイム又はミスマッチリボザイムをヒ
トＶＳＭＣと２、６、１２及び２４時間インキュベート
した。アンジオテンシンＩＩの投与はヒトＶＳＭＣにお
けるＴＧＦ−β１ｍＲＮＡの発現を有意に増加させた。
ＴＧＦ−β１に対するキメラ型リボザイムの投与は、ミ
スマッチリボザイムと比べて６時間及び２４時間でアン
ジオテンシンＩＩ刺激ＴＧＦ−β１ｍＲＮＡを有意に
（Ｐ＜０．０５）減少させた（図７Ａ及びＢ）。
ＲＮＡの発現に及ぼすキメラ型リボザイムの効果 図７はヒトＶＳＭＣにおけるアンジオテンシンＩＩ刺激
によるＴＧＦ−β１ｍＲＮＡの発現に及ぼすキメラ型リ
ボザイムの効果を示す。１０μＭのアンジオテンシンＩ
Ｉのみ、又は１０μＭのアンジオテンシンＩＩ及び１μ
Ｍのキメラ型リボザイム又はミスマッチリボザイムをヒ
トＶＳＭＣと２、６、１２及び２４時間インキュベート
した。アンジオテンシンＩＩの投与はヒトＶＳＭＣにお
けるＴＧＦ−β１ｍＲＮＡの発現を有意に増加させた。
ＴＧＦ−β１に対するキメラ型リボザイムの投与は、ミ
スマッチリボザイムと比べて６時間及び２４時間でアン
ジオテンシンＩＩ刺激ＴＧＦ−β１ｍＲＮＡを有意に
（Ｐ＜０．０５）減少させた（図７Ａ及びＢ）。
【００５９】４）ヒトＶＳＭＣにおけるＴＧＦ−β１タ
ンパク質の発現に及ぼすキメラ型リボザイムの効果 図８はヒトＶＳＭＣにおけるＴＧＦ−β１蛋白質のアン
ジオテンシンＩＩ刺激発現に及ぼすキメラ型リボザイム
の効果を示す。１０μＭのアンジオテンシンＩＩの投与
はヒトＶＳＭＣにおけるＴＧＦ−β１タンパク質の発現
を大きく増加させた。１．０μＭのキメラ型リボザイム
の投与は、アンジオテンシンＩＩ刺激ＴＧＦ−β１タン
パク質の発現を著明に抑制した。
ンパク質の発現に及ぼすキメラ型リボザイムの効果 図８はヒトＶＳＭＣにおけるＴＧＦ−β１蛋白質のアン
ジオテンシンＩＩ刺激発現に及ぼすキメラ型リボザイム
の効果を示す。１０μＭのアンジオテンシンＩＩの投与
はヒトＶＳＭＣにおけるＴＧＦ−β１タンパク質の発現
を大きく増加させた。１．０μＭのキメラ型リボザイム
の投与は、アンジオテンシンＩＩ刺激ＴＧＦ−β１タン
パク質の発現を著明に抑制した。
【００６０】
【発明の効果】本発明の経皮経管的ドラッグデリバリー
デバイスは、バルーンカテーテルやステント等の管内挿
デバイスに吸収機能を持たせているので、非浸襲的にか
つ効果的に、オリゴヌクレオチド若しくはポリヌクレオ
チドなどの核酸又はプラスミド等の薬剤を直接目的部位
に配送することができる。また、薬剤として上記ＤＮＡ
−ＲＮＡキメラ型リボザイムを利用すれば、ＴＧＦ−β
１ｍＲＮＡを特異的に切断してＴＧＦ−β１蛋白質の発
現を抑制することができるので、内膜肥厚による血管の
再狭窄を防ぐことができ、また血管増殖性疾患、又は腎
炎等の遺伝子治療薬にも役立つ。
デバイスは、バルーンカテーテルやステント等の管内挿
デバイスに吸収機能を持たせているので、非浸襲的にか
つ効果的に、オリゴヌクレオチド若しくはポリヌクレオ
チドなどの核酸又はプラスミド等の薬剤を直接目的部位
に配送することができる。また、薬剤として上記ＤＮＡ
−ＲＮＡキメラ型リボザイムを利用すれば、ＴＧＦ−β
１ｍＲＮＡを特異的に切断してＴＧＦ−β１蛋白質の発
現を抑制することができるので、内膜肥厚による血管の
再狭窄を防ぐことができ、また血管増殖性疾患、又は腎
炎等の遺伝子治療薬にも役立つ。
【００６１】
SEQUENCE LISTING
<110> Nihon University
<120> DNA-RNA chimeric ribozyme to human transform
ing growth factor beta <130> DA-3008 <140> <141> <160> 8 <170> Microsoft Word 98 <210> 1 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of DNA-RNA chimeric ribozyme <400> 1 tcctcggccu gaugagtcct tgcggacgaa actccttc 38 <210> 2 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <223> Sequence which DNA-RNA chimeric or RNA riboz
yme targets. <400> 2 gaaggagucg ccgagga 17 <210> 3 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of RNA ribozyme <400> 3 tcctcggccu gaugaguccu ugcggacgaa actccttc 38 <210> 4 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of DNA-RNA chimeric mismatch ribozy
me <400> 4 tcctcggccu gaugagtcct tgcggacgaa cctccttc 38 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of a sense primer encompassing a GU
C cleavage site <400> 5 atcagagctc cgagaagcgg tacc 24 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of an antisense primer encompassing
a GUC cleavage site <400> 6 gtccacttgc agtgtgttat ccctg 25 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of a sense primer for human 18S rib
osomal RNA <400> 7 tcaagaacga aagtcggagg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of an antisense primer for human 18
S ribosomal RNA <400> 8 ggacatctaa gggcatcaca 20 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> stem loop <222> (17) <223> Sequence of DNA-RNA chimeric ribozyme; n com
prises at least two deoxyribonucleotide residues c
apable of forming a complementary base pairand at
least three deoxynucleotide residues capable of fo
rming a loop. <400> 9 tcctcggccu gaugagncga aactccttc 29
ing growth factor beta <130> DA-3008 <140> <141> <160> 8 <170> Microsoft Word 98 <210> 1 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of DNA-RNA chimeric ribozyme <400> 1 tcctcggccu gaugagtcct tgcggacgaa actccttc 38 <210> 2 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <223> Sequence which DNA-RNA chimeric or RNA riboz
yme targets. <400> 2 gaaggagucg ccgagga 17 <210> 3 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of RNA ribozyme <400> 3 tcctcggccu gaugaguccu ugcggacgaa actccttc 38 <210> 4 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of DNA-RNA chimeric mismatch ribozy
me <400> 4 tcctcggccu gaugagtcct tgcggacgaa cctccttc 38 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of a sense primer encompassing a GU
C cleavage site <400> 5 atcagagctc cgagaagcgg tacc 24 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of an antisense primer encompassing
a GUC cleavage site <400> 6 gtccacttgc agtgtgttat ccctg 25 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of a sense primer for human 18S rib
osomal RNA <400> 7 tcaagaacga aagtcggagg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of an antisense primer for human 18
S ribosomal RNA <400> 8 ggacatctaa gggcatcaca 20 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> stem loop <222> (17) <223> Sequence of DNA-RNA chimeric ribozyme; n com
prises at least two deoxyribonucleotide residues c
apable of forming a complementary base pairand at
least three deoxynucleotide residues capable of fo
rming a loop. <400> 9 tcctcggccu gaugagncga aactccttc 29
【００６２】
配列番号１
ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイムの塩基配列。
配列番号２
ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型又はＲＮＡ型リボザイムが標的
とする塩基配列。 配列番号３ ＲＮＡ型リボザイムの塩基配列。 配列番号４ ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型ミスマッチリボザイムの塩基配
列。 配列番号５ ＧＵＣ切断部位を含むセンスプライマーの塩基配列。 配列番号６ ＧＵＣ切断部位を含むアンチセンスプライマーの塩基配
列。 配列番号７ ヒト１８ＳリボソームＲＮＡに対するセンスプライマー
の塩基配列。 配列番号８ ヒト１８ＳリボソームＲＮＡに対するアンチセンスプラ
イマーの塩基配列。 配列番号９ ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイムの塩基配列。ｎは相
補的塩基対形成が可能な少なくとも２個のデオキシリボ
ヌクレオチド残基とループ形成が可能な少なくとも３個
のデオキシリボヌクレオチド残基を含む。
とする塩基配列。 配列番号３ ＲＮＡ型リボザイムの塩基配列。 配列番号４ ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型ミスマッチリボザイムの塩基配
列。 配列番号５ ＧＵＣ切断部位を含むセンスプライマーの塩基配列。 配列番号６ ＧＵＣ切断部位を含むアンチセンスプライマーの塩基配
列。 配列番号７ ヒト１８ＳリボソームＲＮＡに対するセンスプライマー
の塩基配列。 配列番号８ ヒト１８ＳリボソームＲＮＡに対するアンチセンスプラ
イマーの塩基配列。 配列番号９ ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイムの塩基配列。ｎは相
補的塩基対形成が可能な少なくとも２個のデオキシリボ
ヌクレオチド残基とループ形成が可能な少なくとも３個
のデオキシリボヌクレオチド残基を含む。
【図１】（イ）バルーンをしぼませた状態でバルーンカ
テーテルを血管内に挿入した状態の略線図である。 （ロ）バルーンを膨らませてステントを拡張させた状態
の略線図である。
テーテルを血管内に挿入した状態の略線図である。 （ロ）バルーンを膨らませてステントを拡張させた状態
の略線図である。
【図２】ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣによるヒトＴＧＦ−β
１ｍＲＮＡ（ヌクレオチド１０１から４００）の二次構
造、及びヌクレオチド１３１から１３３の矢印によって
示した切断部位ＧＵＣ配列を示す。
１ｍＲＮＡ（ヌクレオチド１０１から４００）の二次構
造、及びヌクレオチド１３１から１３３の矢印によって
示した切断部位ＧＵＣ配列を示す。
【図３】ヒトＴＧＦ−β１ｍＲＮＡに対するハンマーヘ
ッド型ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイムと触媒ループ
領域で一塩基だけ異なるミスマッチリボザイムの配列を
示す。リボザイム（下部）はＴＧＦ−β１ｍＲＮＡ（上
部）のＧＵＣコドンを矢印で示すように切断する。リボ
ザイムのリボヌクレオチドには下線が付してある。＊マ
ークは、核酸分解酵素に対して耐性とするために、３’
側の二塩基間の構造をホスホロチオエートの形に化学修
飾してあることを意味する。
ッド型ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイムと触媒ループ
領域で一塩基だけ異なるミスマッチリボザイムの配列を
示す。リボザイム（下部）はＴＧＦ−β１ｍＲＮＡ（上
部）のＧＵＣコドンを矢印で示すように切断する。リボ
ザイムのリボヌクレオチドには下線が付してある。＊マ
ークは、核酸分解酵素に対して耐性とするために、３’
側の二塩基間の構造をホスホロチオエートの形に化学修
飾してあることを意味する。
【図４】ヒトＴＧＦ−β１ｍＲＮＡに対する合成リボザ
イムと標的ＲＮＡのインビトロ切断反応。標的ＲＮＡ
（１０ｎＭ）は２５ｍＭ ＭｇＣｌ2の存在下で０．
５、１又は２時間、リボザイム又はミスマッチリボザイ
ム（１００ｎＭ）とインキュベートした。
イムと標的ＲＮＡのインビトロ切断反応。標的ＲＮＡ
（１０ｎＭ）は２５ｍＭ ＭｇＣｌ2の存在下で０．
５、１又は２時間、リボザイム又はミスマッチリボザイ
ム（１００ｎＭ）とインキュベートした。
【図５】ヒトＶＳＭＣにおいて、ヒトＴＧＦ−β１ｍＲ
ＮＡに対するハンマーヘッド型ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型
リボザイムがアンジオテンシンＩＩ刺激ＤＮＡ生合成に
及ぼす効果を示す。静止期のＶＳＭＣを、１０μＭのア
ンジオテンシンＩＩの存在下で０．０１から１．０μＭ
のキメラ型リボザイム又はミスマッチリボザイムと共に
２０時間インキュベートした。データは平均±ＳＥＭで
示す（ｎ＝４）。＊：ミスマッチリボザイムと比較して
Ｐ＜０．０１。
ＮＡに対するハンマーヘッド型ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型
リボザイムがアンジオテンシンＩＩ刺激ＤＮＡ生合成に
及ぼす効果を示す。静止期のＶＳＭＣを、１０μＭのア
ンジオテンシンＩＩの存在下で０．０１から１．０μＭ
のキメラ型リボザイム又はミスマッチリボザイムと共に
２０時間インキュベートした。データは平均±ＳＥＭで
示す（ｎ＝４）。＊：ミスマッチリボザイムと比較して
Ｐ＜０．０１。
【図６】ヒトＴＧＦ−β１ｍＲＮＡに対するハンマーヘ
ッド型ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイムが、ヒトＶＳ
ＭＣのアンジオテンシンＩＩ刺激増殖に及ぼす効果を示
す。静止期のＶＳＭＣを、１０μＭのアンジオテンシン
ＩＩの存在下で０．０１から１．０μＭのキメラ型リボ
ザイム又はミスマッチリボザイムと共に２０時間インキ
ュベートした。データは平均±ＳＥＭで示す（ｎ＝
４）。＊：アンジオテンシンＩＩのみと比較してＰ＜
０．０１。
ッド型ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイムが、ヒトＶＳ
ＭＣのアンジオテンシンＩＩ刺激増殖に及ぼす効果を示
す。静止期のＶＳＭＣを、１０μＭのアンジオテンシン
ＩＩの存在下で０．０１から１．０μＭのキメラ型リボ
ザイム又はミスマッチリボザイムと共に２０時間インキ
ュベートした。データは平均±ＳＥＭで示す（ｎ＝
４）。＊：アンジオテンシンＩＩのみと比較してＰ＜
０．０１。
【図７】ヒトＶＳＭＣにおけるＴＧＦ−β１ｍＲＮＡの
アンジオテンシンＩＩ刺激発現に及ぼす、ＴＧＦ−β１
ｍＲＮＡに対するハンマーヘッド型ＤＮＡ−ＲＮＡキメ
ラ型リボザイムの効果を示す。１０μＭのアンジオテン
シンＩＩのみ、又は１０μＭのアンジオテンシンＩＩ及
び１μＭのキメラ型リボザイム又は１μＭのミスマッチ
リボザイムをヒトＶＳＭＣと２、６、１２及び２４時間
インキュベートした。ＴＧＦ−β１ｍＲＮＡ及び１８Ｓ
ｒＲＮＡの量をＲＴ−ＰＣＲアッセイによって測定し
た。図７のＡはアンジオテンシンＩＩの存在下で２４時
間でヒトＴＧＦ−β１ｍＲＮＡの発現に及ぼすキメラ型
リボザイム及びミスマッチリボザイムの効果の典型的な
結果を示す。分子量標準の位置（ｂｐ）をレーンＭに示
す。図７のＢはアンジオテンシンＩＩの存在下でヒトＴ
ＧＦ−β１ｍＲＮＡの発現に及ぼすキメラリボザイム及
びミスマッチリボザイムの効果の時間的な変化を示す。
ＴＧＦ−β１ｍＲＮＡの１８Ｓ ｒＲＮＡに対する比を
デンシトメトリー分析によって評価した。データは平均
±ＳＥＭで示す（ｎ＝４）。＊：ミスマッチリボザイム
と比較してＰ＜０．０５の有意差を認める。
アンジオテンシンＩＩ刺激発現に及ぼす、ＴＧＦ−β１
ｍＲＮＡに対するハンマーヘッド型ＤＮＡ−ＲＮＡキメ
ラ型リボザイムの効果を示す。１０μＭのアンジオテン
シンＩＩのみ、又は１０μＭのアンジオテンシンＩＩ及
び１μＭのキメラ型リボザイム又は１μＭのミスマッチ
リボザイムをヒトＶＳＭＣと２、６、１２及び２４時間
インキュベートした。ＴＧＦ−β１ｍＲＮＡ及び１８Ｓ
ｒＲＮＡの量をＲＴ−ＰＣＲアッセイによって測定し
た。図７のＡはアンジオテンシンＩＩの存在下で２４時
間でヒトＴＧＦ−β１ｍＲＮＡの発現に及ぼすキメラ型
リボザイム及びミスマッチリボザイムの効果の典型的な
結果を示す。分子量標準の位置（ｂｐ）をレーンＭに示
す。図７のＢはアンジオテンシンＩＩの存在下でヒトＴ
ＧＦ−β１ｍＲＮＡの発現に及ぼすキメラリボザイム及
びミスマッチリボザイムの効果の時間的な変化を示す。
ＴＧＦ−β１ｍＲＮＡの１８Ｓ ｒＲＮＡに対する比を
デンシトメトリー分析によって評価した。データは平均
±ＳＥＭで示す（ｎ＝４）。＊：ミスマッチリボザイム
と比較してＰ＜０．０５の有意差を認める。
【図８】ヒトＶＳＭＣにおいて、ＴＧＦ−β１ｍＲＮＡ
に対するハンマーヘッド型ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボ
ザイムがヒトＴＧＦ−β１蛋白質のアンジオテンシンＩ
Ｉ刺激発現に及ぼす効果を示す。静止期のＶＳＭＣを、
１０μＭのアンジオテンシンＩＩの存在下で１．０μＭ
のキメラ型リボザイム又はミスマッチリボザイムと共に
インキュベートした。ＴＧＦ−β１蛋白質及びαチュブ
リン蛋白質の量をウエスタンブロット分析によって測定
した。
に対するハンマーヘッド型ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボ
ザイムがヒトＴＧＦ−β１蛋白質のアンジオテンシンＩ
Ｉ刺激発現に及ぼす効果を示す。静止期のＶＳＭＣを、
１０μＭのアンジオテンシンＩＩの存在下で１．０μＭ
のキメラ型リボザイム又はミスマッチリボザイムと共に
インキュベートした。ＴＧＦ−β１蛋白質及びαチュブ
リン蛋白質の量をウエスタンブロット分析によって測定
した。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１４年１１月２８日（２００２．１１．
２８）
２８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５７】２）ヒトＶＳＭＣの増殖に対するキメラ型
リボザイムの効果 ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断反応の結果に基づいてヒトＴＧＦ
−β１に対するＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイム（以
下単にキメラ型リボザイムとも言う）を設計し、ヒトＶ
ＳＭＣの増殖に対する効果を調べた。ＶＳＭＣにおける
アンジオテンシンＩＩ刺激ＤＮＡ生合成に及ぼす、キメ
ラ型リボザイム（０．０１−１．０μＭ）の効果を図５
に示す。１０μＭのアンジオテンシンＩＩの投与はヒト
ＶＳＭＣによるＤＮＡ生合成を有意に増加させた。また
０．１及び１．０μＭのキメラ型リボザイムの投与はヒ
トＶＳＭＣによるアンジオテンシンＩＩ刺激ＤＮＡ生合
成を、ミスマッチリボザイムの結果と比較して有意に
（Ｐ＜０．０１）抑制した。ミスマッチリボザイムはＶ
ＳＭＣによるアンジオテンシンＩＩ刺激ＤＮＡ生合成に
影響を及ぼさなかった。アンジオテンシンＩＩの存在下
でのヒトＶＳＭＣの細胞数の増加に及ぼすキメラ型リボ
ザイムの効果を図７に示す。１０μＭのアンジオテンシ
ンＩＩの投与はヒトＶＳＭＣの細胞数を有意に増加させ
た。また１μＭのリボザイムの投与は、細胞数の増加を
用量依存的に有意に（Ｐ＜０．０１）抑制した。ミスマ
ッチリボザイムは細胞数の増加に影響を及ぼさなかっ
た。
リボザイムの効果 ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断反応の結果に基づいてヒトＴＧＦ
−β１に対するＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイム（以
下単にキメラ型リボザイムとも言う）を設計し、ヒトＶ
ＳＭＣの増殖に対する効果を調べた。ＶＳＭＣにおける
アンジオテンシンＩＩ刺激ＤＮＡ生合成に及ぼす、キメ
ラ型リボザイム（０．０１−１．０μＭ）の効果を図５
に示す。１０μＭのアンジオテンシンＩＩの投与はヒト
ＶＳＭＣによるＤＮＡ生合成を有意に増加させた。また
０．１及び１．０μＭのキメラ型リボザイムの投与はヒ
トＶＳＭＣによるアンジオテンシンＩＩ刺激ＤＮＡ生合
成を、ミスマッチリボザイムの結果と比較して有意に
（Ｐ＜０．０１）抑制した。ミスマッチリボザイムはＶ
ＳＭＣによるアンジオテンシンＩＩ刺激ＤＮＡ生合成に
影響を及ぼさなかった。アンジオテンシンＩＩの存在下
でのヒトＶＳＭＣの細胞数の増加に及ぼすキメラ型リボ
ザイムの効果を図７に示す。１０μＭのアンジオテンシ
ンＩＩの投与はヒトＶＳＭＣの細胞数を有意に増加させ
た。また１μＭのリボザイムの投与は、細胞数の増加を
用量依存的に有意に（Ｐ＜０．０１）抑制した。ミスマ
ッチリボザイムは細胞数の増加に影響を及ぼさなかっ
た。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５８】３）ヒトＶＳＭＣにおけるＴＧＦ−β１ｍ
ＲＮＡの発現に及ぼすキメラ型リボザイムの効果 図６はヒトＶＳＭＣにおけるアンジオテンシンＩＩ刺激
によるＴＧＦ−β１ｍＲＮＡの発現に及ぼすキメラ型リ
ボザイムの効果を示す。１０μＭのアンジオテンシンＩ
Ｉのみ、又は１０μＭのアンジオテンシンＩＩ及び１μ
Ｍのキメラ型リボザイム又はミスマッチリボザイムをヒ
トＶＳＭＣと２、６、１２及び２４時間インキュベート
した。アンジオテンシンＩＩの投与はヒトＶＳＭＣにお
けるＴＧＦ−β１ｍＲＮＡの発現を有意に増加させた。
ＴＧＦ−β１に対するキメラ型リボザイムの投与は、ミ
スマッチリボザイムと比べて６時間及び２４時間でアン
ジオテンシンＩＩ刺激ＴＧＦ−β１ｍＲＮＡを有意に
（Ｐ＜０．０５）減少させた（図６Ａ及びＢ）。
ＲＮＡの発現に及ぼすキメラ型リボザイムの効果 図６はヒトＶＳＭＣにおけるアンジオテンシンＩＩ刺激
によるＴＧＦ−β１ｍＲＮＡの発現に及ぼすキメラ型リ
ボザイムの効果を示す。１０μＭのアンジオテンシンＩ
Ｉのみ、又は１０μＭのアンジオテンシンＩＩ及び１μ
Ｍのキメラ型リボザイム又はミスマッチリボザイムをヒ
トＶＳＭＣと２、６、１２及び２４時間インキュベート
した。アンジオテンシンＩＩの投与はヒトＶＳＭＣにお
けるＴＧＦ−β１ｍＲＮＡの発現を有意に増加させた。
ＴＧＦ−β１に対するキメラ型リボザイムの投与は、ミ
スマッチリボザイムと比べて６時間及び２４時間でアン
ジオテンシンＩＩ刺激ＴＧＦ−β１ｍＲＮＡを有意に
（Ｐ＜０．０５）減少させた（図６Ａ及びＢ）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正内容】
【図６】ヒトＶＳＭＣにおけるＴＧＦ−β１ｍＲＮＡの
アンジオテンシンＩＩ刺激発現に及ぼす、ＴＧＦ−β１
ｍＲＮＡに対するハンマーヘッド型ＤＮＡ−ＲＮＡキメ
ラ型リボザイムの効果を示す。１０μＭのアンジオテン
シンＩＩのみ、又は１０μＭのアンジオテンシンＩＩ及
び１μＭのキメラ型リボザイム又は１μＭのミスマッチ
リボザイムをヒトＶＳＭＣと２、６、１２及び２４時間
インキュベートした。ＴＧＦ−β１ｍＲＮＡ及び１８Ｓ
ｒＲＮＡの量をＲＴ−ＰＣＲアッセイによって測定し
た。図６のＡはアンジオテンシンＩＩの存在下で２４時
間でヒトＴＧＦ−β１ｍＲＮＡの発現に及ぼすキメラ型
リボザイム及びミスマッチリボザイムの効果の典型的な
結果を示す。分子量標準の位置（ｂｐ）をレーンＭに示
す。図６のＢはアンジオテンシンＩＩの存在下でヒトＴ
ＧＦ−β１ｍＲＮＡの発現に及ぼすキメラリボザイム及
びミスマッチリボザイムの効果の時間的な変化を示す。
ＴＧＦ−β１ｍＲＮＡの１８Ｓ ｒＲＮＡに対する比を
デンシトメトリー分析によって評価した。データは平均
±ＳＥＭで示す（ｎ＝４）。＊：ミスマッチリボザイム
と比較してＰ＜０．０５の有意差を認める。
アンジオテンシンＩＩ刺激発現に及ぼす、ＴＧＦ−β１
ｍＲＮＡに対するハンマーヘッド型ＤＮＡ−ＲＮＡキメ
ラ型リボザイムの効果を示す。１０μＭのアンジオテン
シンＩＩのみ、又は１０μＭのアンジオテンシンＩＩ及
び１μＭのキメラ型リボザイム又は１μＭのミスマッチ
リボザイムをヒトＶＳＭＣと２、６、１２及び２４時間
インキュベートした。ＴＧＦ−β１ｍＲＮＡ及び１８Ｓ
ｒＲＮＡの量をＲＴ−ＰＣＲアッセイによって測定し
た。図６のＡはアンジオテンシンＩＩの存在下で２４時
間でヒトＴＧＦ−β１ｍＲＮＡの発現に及ぼすキメラ型
リボザイム及びミスマッチリボザイムの効果の典型的な
結果を示す。分子量標準の位置（ｂｐ）をレーンＭに示
す。図６のＢはアンジオテンシンＩＩの存在下でヒトＴ
ＧＦ−β１ｍＲＮＡの発現に及ぼすキメラリボザイム及
びミスマッチリボザイムの効果の時間的な変化を示す。
ＴＧＦ−β１ｍＲＮＡの１８Ｓ ｒＲＮＡに対する比を
デンシトメトリー分析によって評価した。データは平均
±ＳＥＭで示す（ｎ＝４）。＊：ミスマッチリボザイム
と比較してＰ＜０．０５の有意差を認める。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正内容】
【図７】ヒトＴＧＦ−β１ｍＲＮＡに対するハンマーヘ
ッド型ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイムが、ヒトＶＳ
ＭＣのアンジオテンシンＩＩ刺激増殖に及ぼす効果を示
す。静止期のＶＳＭＣを、１０μＭのアンジオテンシン
ＩＩの存在下で０．０１から１．０μＭのキメラ型リボ
ザイム又はミスマッチリボザイムと共に２０時間インキ
ュベートした。データは平均±ＳＥＭで示す（ｎ＝
４）。＊：アンジオテンシンＩＩのみと比較してＰ＜
０．０１。
ッド型ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイムが、ヒトＶＳ
ＭＣのアンジオテンシンＩＩ刺激増殖に及ぼす効果を示
す。静止期のＶＳＭＣを、１０μＭのアンジオテンシン
ＩＩの存在下で０．０１から１．０μＭのキメラ型リボ
ザイム又はミスマッチリボザイムと共に２０時間インキ
ュベートした。データは平均±ＳＥＭで示す（ｎ＝
４）。＊：アンジオテンシンＩＩのみと比較してＰ＜
０．０１。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 9/10 Ａ６１Ｍ 25/00 ４１０Ｚ
// Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
(72)発明者 斎藤 穎
東京都千代田区九段南四丁目８番24号 学
校法人 日本大学内
(72)発明者 河邊 大輔
埼玉県越谷市大字大泊574番地３
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA07 CA04 EA04 GA11
HA19
4C081 AC08 AC09 AC10 BA02 BA17
BB06 BC02 CA16 CA21 CA23
DB03 DC03 EA06
4C084 AA13 AA16 NA13 ZA36 ZA40
4C086 AA01 EA16 MA01 MA67 MA70
ZA36 ZA40
4C167 AA07 AA44 AA56 BB02 BB05
BB06 BB09 BB12 BB26 BB27
CC09 DD01 DD07 GG05 GG07
GG08 GG16 GG26 GG36 GG46
HH14 HH17
Claims (8)
- 【請求項１】 屈撓性カテーテルの先端部に膨張性フィ
ルムからなるバルーンを有するバルーンカテーテルと、
該バルーン上に取り付けられ該バルーンの膨張と共に拡
張するが該バルーンの収縮と共には縮小しないステント
とからなる経皮経管的ドラッグデリバリーデバイスであ
って、前記バルーン及び／又は前記ステントの表面が液
体状物質を担持させることができる多孔質の物質で被覆
されていることを特徴とする上記経皮経管的ドラッグデ
リバリーデバイス。 - 【請求項２】 前記多孔質の物質が、ポリアミド、ポリ
ウレタン、ポリエステル、ポリビニルアルコール、セラ
ミックス、金属及びこれらの組み合わせからなる群から
選ばれる生体材料用ポリマーである請求項１記載の経皮
経管的ドラッグデリバリーデバイス。 - 【請求項３】 前記液体状物質が薬剤である請求項１又
は２記載の経皮経管的ドラッグデリバリーデバイス。 - 【請求項４】 前記薬剤が細胞増殖性疾患の治療薬であ
る請求項１〜３のいずれか一項記載の経皮経管的ドラッ
グデリバリーデバイス。 - 【請求項５】 前記薬剤が、血管増殖性疾患の遺伝子治
療薬としての核酸又はプラスミドである請求項１〜４の
いずれか一項記載の経皮経管的ドラッグデリバリーデバ
イス。 - 【請求項６】 前記薬剤が、下記のヌクレオチド配列
（Ｉ）を含むＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイム （配列中、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔはそれぞれアデニン、シトシ
ン、グアニン、チミンを塩基成分とするデオキシリボヌ
クレオチド残基であり、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕはそれぞれアデ
ニン、シトシン、グアニン、ウラシルを塩基成分とする
リボヌクレオチド残基であり、Ｎ1及びＮ3は互いに相補
的塩基対形成が可能な少なくとも１対のデオキシリボヌ
クレオチド残基を表し、Ｎ2はループ形成が可能な少な
くとも３個のデオキシリボヌクレオチド残基を表す）で
ある、請求項５記載の経皮経管的ドラッグデリバリーデ
バイス。 - 【請求項７】 前記ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型リボザイム
が、ヒトトランスフォーミング増殖因子β１（ヒトＴＧ
Ｆβ１）に対するリボザイムであり、下記のヌクレオチ
ド配列（ＩＩ） を含む請求項６記載の経皮経管的ドラッグデリバリーデ
バイス。 - 【請求項８】 前記薬剤がヒト血小板由来成長因子（ヒ
トＰＤＧＦ−Ａ鎖）に対するリボザイムである請求項５
記載の経皮管的ドラッグデリバリーデバイス。
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| JP2001343345A JP2003135588A (ja) | 2001-11-08 | 2001-11-08 | 経皮経管的ドラッグデリバリーデバイス |
| PCT/JP2002/011616 WO2003039616A1 (fr) | 2001-11-08 | 2002-11-07 | Dispositif d'administration de medicaments transluminale percutanee |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001343345A JP2003135588A (ja) | 2001-11-08 | 2001-11-08 | 経皮経管的ドラッグデリバリーデバイス |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003135588A true JP2003135588A (ja) | 2003-05-13 |
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ID=19157053
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP2001343345A Withdrawn JP2003135588A (ja) | 2001-11-08 | 2001-11-08 | 経皮経管的ドラッグデリバリーデバイス |
Country Status (2)
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| WO (1) | WO2003039616A1 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006513732A (ja) * | 2002-07-12 | 2006-04-27 | クック インコーポレイティド | コーティングされた医療装置 |
| JP2008502373A (ja) * | 2004-03-23 | 2008-01-31 | イソフラックス・インコーポレイテッド | バイオメディカル装置用の放射線不透過性コーティング |
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| US6652581B1 (en) * | 1998-07-07 | 2003-11-25 | Boston Scientific Scimed, Inc. | Medical device with porous surface for controlled drug release and method of making the same |
| WO2001027264A1 (fr) * | 1999-10-15 | 2001-04-19 | Nihon University, School Juridical Person | Ribozymes agissant sur un facteur de croissance provenant des plaquettes humaines |
-
2001
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-
2002
- 2002-11-07 WO PCT/JP2002/011616 patent/WO2003039616A1/ja active Application Filing
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Also Published As
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|---|---|
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Legal Events
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