JP2003135076A - コラプシン応答メディエータタンパク質１（ｃｒｍｐ−１） - Google Patents

コラプシン応答メディエータタンパク質１（ｃｒｍｐ−１）

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JP2003135076A JP2002186463A JP2002186463A JP2003135076A JP 2003135076 A JP2003135076 A JP 2003135076A JP 2002186463 A JP2002186463 A JP 2002186463A JP 2002186463 A JP2002186463 A JP 2002186463A JP 2003135076 A JP2003135076 A JP 2003135076A
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パン−チ ヤン
Jin-Yuan Shih
ジン−ゲン シー
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ジェレミー ジェイ．ダブリュ． チェン
Konan Peck
コーナン ペク
Cheng-Wen Wu
ジェン−ブン ウ
Tse-Ming Hong
ツェ−ミン ホン
Shuenn-Chen Yan
ジュン−チェン ヤン
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 【解決手段】本発明は、コラプシン応答メディエータタ
ンパク質−１（ＣＲＭＰ−１）の腫瘍転移との関連性の
発見に基づいている。ＣＲＭＰ−１タンパク質またはｍ
ＲＮＡのレベルを、細胞侵入性の指標として、および細
胞侵入性を変化させる試験化合物の能力の指標として、
使用することができる。ＣＲＭＰ−１タンパク質のレベ
ルは、例えば侵入性を減らすようにも、変化させること
ができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】（関連出願の相互基準）本願は、２００１
年６月２６日に出願された、米国特許出願出願番号第６
０／３０１，０７５に対する優先権を主張する。この出
願の内容は、引用によりすべての目的のためにその全体
が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
【従来の技術】（背景）コラプシン応答メディエータタ
ンパク質（Collapsin Response Mediator Protein, Ｃ
ＲＭＰ）は、セマフォリン／コラプシンにより誘導され
た成長円錐の崩壊を媒介でき、軸索の誘導およびニュー
ロンの分化に関与する、燐タンパク質のファミリーであ
る。例えば以下を参照されたい：Ｇｏｓｈｉｍａら（１
９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７６：５０９−１４；Ｆｕｋ
ａｄａら（２０００） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７
５：３７９５７−６５；Ｍｉｎｔｕｒｎら（１９９５）
ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ １５：６７５７−６６；Ｗａｎｇ
とＳｔｉｔｔｍａｔｔｅｒ（１９９６）Ｊ Ｎｅｒｕｏ
Ｓｃｉ １６：６１９７−２０７；Ｂｙｋら（１９９
６）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １６：６８８−７０１；お
よびＧａｅｔａｎｏら（１９９７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈ
ｅｍ ２７２：１２１９５−２０１。
【０００３】６０〜６６ｋＤａタンパク質に関連するＣ
ＲＭＰファミリーの５つのメンバー（ＣＲＭＰ−１、Ｃ
ＲＭＰ−２、ＣＲＭＰ−３、ＣＲＭＰ−４およびＣＲＭ
Ｐ−５）が、異なる目的を追求するいくつかの異なる研
究所によって、独立にクローニングされた。ＣＲＭＰフ
ァミリーのタンパク質の特徴付けられている機能の１つ
は、神経軸索の反発的誘導である。このプロセスにおけ
るＣＲＭＰの機能的な役割が研究されている（Ｑｕｉｎ
ｎら（１９９９）Ｊ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ ４１；１５
８−６４）。ＣＲＭＰは、５つのファミリー間で約５０
％〜７０％のアミノ酸配列相同性を有しており（Ｈａｍ
ａｊｉｍａら（１９９６）Ｇｅｎｅ １８０：１５７−
６３）、相互会合によってヘテロ四量体を形成すると提
唱されている（ＷａｎｇとＳｔｉｔｔｍａｔｔｅｒ（１
９９７） Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ６９：２２６１−
９）。しかしながら、各ＣＲＭＰは、神経系の発達中で
も、神経成長因子によるニューロン分化の誘導に対して
も、別個の発現パターンを示す（Ｂｙｋら（１９９３）
Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２５４：１４−２４）。
【０００４】ＣＲＭＰ−２は、アルツハイマーの患者に
おける神経原繊維のもつれに関与することが見出された
（Ｇｕら（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３
９：４２６７−７５）。ＣＲＭＰ−３およびＣＲＭＰ−
５は、神経性腫瘍随伴症候群に罹患した小細胞肺癌の患
者における自己抗体によって認められた（Ｙｕら（２０
０１）Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ４９：１４６−５４；お
よびＨｏｎｎｏｒａｔら（１９９９）Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅ
ｕｒｏｓｃｉ １１：４２２６−３２）。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、コラプシン応
答メディエータタンパク質−１（ＣＲＭＰ−１）が少な
くとも数種類の腫瘍転移に関与しているという発見に基
づいている。ＣＲＭＰ−１コード領域の代表的なヌクレ
オチド配列は以下のように記載される。
【０００６】 ATGTCGTACC AGGGCAAGAA GAGCATCCCG CACATCACGA GTGACCGACT CCTCATCAAA 60 GGTGGACGGA TCATCAACGA TGACCAATCC CTTTATGCTG ACGTCTACCT GGAGGATGGA 120 CTTATCAAAC AAATAGGAGA GAACTTAATC GTTCCTGGTG GAGTGAAGAC CATTGAAGC C 180 AACGGGCGGA TGGTTATTCC CGGAGGTATT GATGTCAACA CGTACCTGCA GAAGCCCTCC 240 CAGGGGATGA CTGCGGCTGA TGACTTCTTC CAAGGGACCA GGGCGGCACT GGTGGGCGGG 300 ACCACGATGA TCATTGACCA TGTTGTTCCT GAACCTGGGT CCAGCCTACT GACCTCTTTC 360 GAGAAGTGGC ACGAAGCAGC TGACACCAAA TCCTGCTGTG ATTACTCCCT CCACGTGGA C 420 ATCACAAGCT GGTACGATGG CGTTCGGGAG GAGCTGGAGG TGCTGGTGCA GGACAAAGGC 480 GTCAATTCCT TCCAAGTCTA CATGGCCTAT AAGGATGTCT ACCAAATGTC CGACAGCCA G 540 CTCTATGAAG CCTTTACCTT CCTTAAGGGC CTGGGAGCTG TGATCTTGGT CCATGC AGAA 600 AATGGAGATT TGATAGCTCA GGAACAAAAG CGGATCCTGG AGATGGGCAT CAC GGGTCCC 660 GAGGGCCATG CCCTGAGCAG ACCTGAAGAG CTGGAGGCCG AGGCGGTGTT CCGGGCCATC 720 ACCATTGCGG GCCGGATCAA CTGCCCTGTG TACATCACCA AGGTCATG AG CAAGAGTGCA 780 GCC GACATCA TCGCTCTGGC CAGGAAGAAA GGGCCCCTAG TTTT TGGAGA GCCCATTGCC 840 GCCAGCCTGG GGACCGATGG CACCCATTAC TGGAGCAAGA A CTGGGCCAA GGCTGCGGCG 900 TTCGTGACTT CCCCTCCCCT GAGCCCGGAC CCTACCACG C CCGACTACTT GACCTCCCTA 960 CTGGCCTGTG GGGACTTGCA GGTCACAGGC A GCGG CCACT GTCCCTACAG CACTGCCCAG 1020 AAGGCGGTGG GCAAGGACAA CTTTACCCTG ATC CCCGAGG GTGTCAACGG GATAGAGGAG 1080 CGGATGACCG TCGTCTGGGA CAAGGCGGTG G CTACTGGCA AAATGGATGA GAACCAGTTT 1140 GTCGCTGTCA CCAGCACCAA TGCAGCCAAG ATCTTTAACC TGTACCCAAG GAAAGGGCGG 1200 ATTGCCGTGG GCTCGGATGC CGACGTGG TC ATCTGGGACC CCGACAAGTT GAAGACCATA 1260 ACAGCCAAAA GTCACAAGTC GGCGGT GGAG TACAACATCT TCGAGGGTAT GGAGTGCCAC 1320 GGCTCCCCAC TAGTGGTCAT CAGC CAGGGC AAGATCGTCT TTGAAGACGG AAACATCAAC 1380 GTCAACAAGG GCATGGGCCG CT TCAT TCCG CGGAAGGCGT TCCCGGAGCA CCTGTACCAG 1440 CGCGTCAAAA TCAGGAATAA GGTTTTTGGA TTGCAAGGGG TTTCCAGGGG CATGTATGAC 1500 GGTCCTGTGT ACGAGGTA CC AGCTACACCC AAATATGCAA CTCCCGCTCC TTCAGCCAAA 1560 TCTTCGCCTT CTAAAC ACCA GCCCCCACCC ATCAGAAACC TCCACCAGTC CAACTTC AGC 1620 TTATCAGGTG CCC AGATAGA TGACAACAAT CCCAGGCGCA CCGGCCACCG CATCGTGGCG 1680 CCCCCTGGTG G CCGCTCCAA CATCACCAGC CTCGGTTGA ( 配列番号１) 1719
【０００７】 ＣＲＭＰ−１のアミノ酸配列は以下のように記載される。 MSYQGKKSIPHITSDRLLIKGGRIINDDQSLYADVYLEDGLIKQIGENLIVPGGVKTIEANGRMVIPGGIDV NTYLQKPSQGMTAADDFFQGTRAALVGGTTMIIDHVVPEPGSSLLTSFEKWHEAADTKSCCDYSLHVDITSW YDGVREELEVLVQDKGVNSFQVYMAYKDVYQMSDSQLYEAFTFLKGLGAVILVHAENGDLIAQEQKRILEMG ITGPEGHALSRPEELEAEAVFRAITIAGRINCPVYITKVMSKSAADIIALARKKGPLVFGEPIAASLGTDGT HYWSKNWAKAAAFVTSPPLSPDPTTPDYLTSLLACGDLQVTGSG HCPYSTAQKAVGKDNFTLIPEGVNGIE ERMTVVWDKAVATGKMDENQFVAVTSTNAAKIFNLYPRKGRIAVGSDADVVIWDPDKLKTITAKSHKSAVEY NIFEGMECHGSPLVVISQGKIVFEDGNINVNKGMGRFIPRKAFPEHLYQRVKIRNKVFGLQGVSRGMYDGPV YEVPATPKYATPAPSAKSSPSKHQPPPIRNLHQSNFSLSGAQIDDNNPRRTGHRIVAPPGGRSNITSLG （配列番号２）
【０００８】ＣＲＭＰ−１は、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴエ
ントリＱ１４１９４、ＧｅｎＢａｎｋ Ｄ７８０１２座
およびＧｅｎＢａｎｋ ＢＡＡ１１１９０座にも記述さ
れている。ＣＲＭＰ−１はジヒドロピリミジナーゼ関連
タンパク質−１（ＤＲＰ−１）とも称される。
【０００９】１態様では、本発明は、被験者に治療用ポ
リペプチドを供給する方法をその特徴とする。該方法
は、腫瘍転移を予防、減衰、または阻止する治療が必要
な被験者を識別する工程と、配列番号２のアミノ酸配列
を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントを
コードする外因性核酸を含む細胞を提供する工程と、ヒ
ト細胞にポリペプチドを発現させる工程と、該ポリペプ
チドを被験者に投与する工程と、から成る。細胞は、ヒ
ト繊維芽細胞等のヒト細胞であり得る。被験者は、ヒト
または実験用の哺乳動物であり得る。
【００１０】本明細書に使用する用語「機能的フラグメ
ント」とは、配列番号２によってコードされたポリペプ
チドの少なくとも１つの活性（例えば腫瘍転移の阻害）
を有する核酸またはポリペプチドのことを指す。フラグ
メントが機能的であるかどうかは、ＣＬ１−５肺癌細胞
で該フラグメントを発現させ、インビトロ再構築基底膜
侵入アッセイにおいて形質転換細胞が基底膜に侵入する
能力を評価することにより決定される。機能的フラグメ
ントは、ＣＬ１−５肺癌細胞の侵入性表現型を阻害する
だろう。
【００１１】ＣＲＭＰ−１核酸は、（１）配列番号１の
ヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一の配列を有す
る核酸；（２）配列番号１のヌクレオチド配列の少なく
とも１５０個のヌクレオチドのフラグメントを有する核
酸；（３）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチ
ドをコードする核酸；および（４）配列番号２のアミノ
酸配列を含むポリペプチドであって、配列番号２の少な
くとも５０個のアミノ酸を含むポリペプチドのフラグメ
ントをコードする核酸；から成る群より選択された配列
を有する。ＣＲＭＰ−１ポリペプチドは、（１）配列番
号２のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一な配列を含
むポリペプチド；（２）配列番号２のアミノ酸配列を含
むフラグメントであって、配列番号２の少なくとも５０
個のアミノ酸を含むフラグメント；（３）配列番号１の
ヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされたポリ
ペプチド；および（４）配列番号１のヌクレオチド配列
と少なくとも８０％同一な核酸によってコードされたポ
リペプチド；から成る群より選択された配列を有する。
いくつかの実施形態では、治療用ポリペプチドは、ＣＲ
ＭＰ−１と反応するか特異的に結合する、抗体またはそ
の抗原結合フラグメントである。
【００１２】別の態様では、本発明は、被験者の腫瘍転
移を治療する第１の方法をその特徴とする。該方法は、
腫瘍転移の治療を必要とする被験者を識別する工程と、
配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは
その機能的フラグメントをコードする外因性核酸を含む
細胞を提供する工程と、細胞に、被験者の生体内（イン
ビボ）でポリペプチドを発現させて、該被験者における
腫瘍転移を治療する工程と、から成る。
【００１３】関連する態様では、本発明は、被験者の腫
瘍転移を治療する第２の方法もその特徴とする。該方法
は、腫瘍転移の治療を必要とする被験者を識別する工程
と、被験者に、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドまたはその機能的フラグメントをコードする外
因性核酸を含む細胞であって、腫瘍転移の症状を改善す
るのに十分な量で該ポリペプチドを発現する能力を有す
る細胞を導入して、該被験者における腫瘍転移を治療す
る工程と、から成る。
【００１４】さらに別の態様では、本発明は、被験者に
おける腫瘍侵入の可能性または転移について診断する方
法をその特徴とする。該方法は、被験者から得た試料を
提供する工程と、試料中のＣＲＭＰ−１の発現レベルを
決定する工程と、該試料での発現値を基準発現値と比較
する工程と、試料での発現値が基準発現値よりも低い場
合に、腫瘍侵入の可能性または転移を有するとして被験
者を分類する工程と、から成る。試料発現値または基準
発現値の各々は、（１）ＣＲＭＰ−１核酸からの転写ｍ
ＲＮＡ、または（２）ＣＲＭＰ−１ポリペプチドの存在
量の評価である。ＣＲＰＭ−１ポリペプチドは、例えば
抗体（例えばＹ２１抗体）を使用して、検出することが
できる。該方法はまた、（１）腫瘍治療中の被験者のモ
ニタや、（２）被験者の腫瘍転移に対する治療のモニタ
にも使用できる。
【００１５】基準発現値は、恣意的なものであってもよ
いし、基準試料または基準状態に関連していてもよい。
基準試料は（１）正常被験者からの試料；（２）インビ
トロ細胞（例えば癌細胞株、例えば肺腺癌細胞株、例え
ば本明細書に記載した細胞株）からの試料；（３）転移
性疾病を有し、治療を受けている被験者からの試料；お
よび（４）評価中の被験者からの試料（例えば、同じ被
験者の初期試料または正常試料）；のうちの１または複
数であり得る。治療をモニタする場合、該方法は、治療
前か疾病の発症前に被験者から得たレベルに対して、試
料ＣＲＭＰ−１ポリペプチドレベルまたはＣＲＭＰ−１
核酸発現レベルを比較する工程をさらに含む。いくつか
の実施形態では、被験者ＣＲＭＰ−１ポリペプチドレベ
ルまたはＣＲＭＰ−１核酸発現レベルは、治療中に飛び
飛びに（例えば規則的な間隔で）決定される。
【００１６】ＣＲＭＰ−１遺伝子産物またはｍＲＮＡの
発現レベルは、少なくとも１０、５０、１００、または
１０００個の他の遺伝子または遺伝子産物の発現レベル
と共に決定することができる。例えば、２００１年６月
２６日に出願された米国特許出願出願番号第６０／３０
０，９９１号は、その発現レベルがモニタするのに有効
な、他の遺伝子について記載している。
【００１７】別の態様では、本発明は、腫瘍転移の予防
または治療に有効な試験化合物を同定する方法をその特
徴とする。該方法は、細胞を試験化合物と接触させる工
程と、試験化合物が細胞でのＣＲＭＰ−１核酸またはＣ
ＲＭＰ−１ポリペプチドの発現を調節するかどうかを決
定する工程と、から成る。試験化合物はＣＲＭＰ−１ポ
リペプチドのアゴニストであり得る。本明細書に使用す
る場合、用語「アゴニスト」は、ＣＲＭＰ−１ポリペプ
チドに結合した時に、ＣＲＭＰ−１の効果を増大する
か、ＣＲＭＰ−１の効果の持続期間を延長する分子のこ
とを指す。
【００１８】試験化合物は、１モル当たり約１０，００
０グラム未満の分子量を有する分子、１モル当たり約
５，０００グラム未満の分子量を有する有機的または無
機化合物、１モル当たり約１，０００グラム未満の分子
量を有する有機的または無機化合物、１モル当たり約５
００グラム未満の分子量を有する有機的または無機化合
物のような巨大分子または小分子であり得る。巨大分子
の例には、ポリペプチド、タンパク質複合体または核酸
（例えばＤＮＡ、ＲＮＡまたはペプチド核酸）が含まれ
る。小分子の例には、ペプチド、ペプチド模倣分子（例
えばｓペプトイド）、アミノ酸、アミノ酸類似体、オリ
ゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体、ヌクレオ
チド、ヌクレオチド類似体、有機または無機化合物（例
えばヘテロ有機または有機金属化合物）が含まれる。
【００１９】本発明は、腫瘍転移を治療するための医薬
組成物もその特徴とする。組成物は、有効量の作用薬
と、医薬として許容される担体とを含む。作用薬は、Ｃ
ＲＭＰ−１ポリペプチド、ＣＲＭＰ−１核酸、またはＣ
ＲＭＰ−１の発現レベルを調節する試験化合物である。
ＣＲＭＰ−１の発現は、（１）ＣＲＭＰ−１核酸から転
写されたｍＲＮＡまたは（２）ＣＲＭＰ−１ポリペプチ
ドの存在量の評価である。医薬組成物は、例えばリポソ
ームやウイルスベクター等の送達作用体を含み得る。組
成物または送達作用体は、腫瘍をターゲットとする部分
（例えば腫瘍特異的抗原に対する抗体）に取り付けるこ
とができる。本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列
を有するポリペプチドに結合する抗体をその特徴とす
る。例えば、該抗体は、本明細書に記載した抗体または
その機能的フラグメント（例えば抗原結合フラグメン
ト）である。
【００２０】別の態様では、本発明は、マーカータンパ
ク質をコードするマーカー遺伝子を含む遺伝子構築物を
その特徴とする。マーカー遺伝子は、ＣＲＭＰ−１調節
配列（例えばＣＲＭＰ−１プロモーター）に機能的に連
結される。１実施形態では、マーカー遺伝子は、ＣＲＭ
Ｐ−１コード配列の少なくとも１つのセグメントへのイ
ンフレーム融合物である。該構築物は、ＣＲＭＰ−１遺
伝子を評価する方法に使用できる。該方法は、遺伝子構
築物を含む細胞を試験化合物と接触させ、マーカータン
パク質の存在量および／または存在を評価することから
成る。本発明はまた、遺伝子構築物を含む宿主細胞（例
えば哺乳動物細胞の例えば肺癌細胞）もその特徴とす
る。
【００２１】また、腫瘍転移を治療する作用薬を製造す
るためのちょうど上述した作用薬の使用も本発明の範囲
内にある。
【００２２】本発明の１または複数の実施形態を、以下
の詳細な説明で述べる。本発明の他の特徴、目的および
効果が、詳細な説明および特許請求の範囲から明らかと
なるであろう。
【００２３】
【発明の実施の形態】ＣＲＭＰ−１：転移関連遺伝子 クローンとして関連する細胞株を含むモデル系を、ヒト
肺の腺癌細胞株より作成した。ＣＬ１−０等の細胞株な
らびにその亜系統（例えばＣＬ１−１およびＣ
Ｌ１−５）は、インビトロとインビボの両方で、異なる
侵入能力を有する。腫瘍転移に関連する遺伝子の決定基
を同定するために、９，６００個の異なる核酸プローブ
を含むｃＤＮＡマイクロアレイを使用して、遺伝子のｍ
ＲＮＡ発現レベルを特徴付け、それによって転移関連遺
伝子を同定した。同定された転移関連遺伝子の中でも、
ＣＲＭＰ−１遺伝子とその遺伝子産物の発現レベルは、
肺癌細胞株の侵入能力と逆に相関していた。ＣＲＭＰ−
１は、より侵入性の高い細胞株では、より少ない程度に
発現していた。ノーザンハイブリダイゼーションと、Ｃ
ＲＭＰ−１に対する特異的モノクローナルクローン抗体
を用いたウェスタンブロットを、この逆相関性を確認す
るために使用した。ＣＲＭＰ−１の発現と腫瘍転移の関
係を、リアルタイム定量的逆転写ＰＣＲを使用して、い
くつかの肺癌組織で更に調べた。非常に侵入性の高い細
胞株でのトランスフェクションによるＣＲＭＰ−１の過
剰発現により、糸状仮足の生成が減少し、インビトロの
侵入能力が抑制された。ＣＲＭＰ−１ポリペプチドは、
細胞内に動的に分配され、有糸分裂の軸および中心体に
関して局在され得る。肺癌組織でのＣＲＭＰ−１ ｍＲ
ＮＡの発現の低さは、腫瘍の進展（ＩＩＩまたはＩＶ段
階）、リンパ節転移、術後の早期再発、生存の短さに有
意に関連している。
【００２４】ＣＲＭＰ−１ポリペプチド、核酸、および
ＣＲＭＰ−１特異的抗体 ＣＲＭＰ−１ポリペプチドは様々なプロセスに使用する
ことができる。例えば、ＣＲＭＰ−１ポリペプチドは、
ＣＲＭＰ−１ポリペプチド基質の基質を選別したり、Ｃ
ＲＭＰ−１活性を調節する化合物を選別したり、ＣＲＭ
Ｐ−１活性の減小により特徴付けられる疾病（例えば少
なくともいくつかの腫瘍転移（例えば肺の腺癌））を治
療したりするために使用できる。
【００２５】ＣＲＭＰ−１ポリペプチドは、例えば組換
えＤＮＡ発現技術と組み合わせて、標準的なタンパク質
精製技術を使用することにより、細胞または組織源から
単離することができる。ＣＲＭＰ−１ポリペプチドは、
異種系（例えば培養細胞またはトランスジェニック動
物）で発現させることができる。異種系での発現の結
果、天然の細胞と実質的に同じ翻訳後修飾が生じ得る。
ＣＲＭＰ−１ポリペプチドの配列は、例えば少なくとも
１残基かつ、１５未満、１０未満、または５未満のアミ
ノ酸残基だけ、配列番号２と異なり得る。代わりに、Ｃ
ＲＭＰ−１ポリペプチドの配列は、配列番号２の対応す
る配列と、少なくとも１残基かつ、２０％未満、１５％
未満、１０％未満、または５％未満の残基だけ、配列番
号２と異なる。その違いは、非必須の残基や、保存的置
換であり得る。
【００２６】保存的なアミノ酸の置換とは、同様の側鎖
を有する残基の互換性のことを指す。例えば、芳香族側
鎖を有するアミノ酸のグループはグリシン、アラニン、
バリン、ロイシンおよびイソロイシンである。脂肪族ヒ
ドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループはセリンと
スレオニンである。アミドを含有する側鎖を有するアミ
ノ酸のグループはアスパラギンとグルタミンである。芳
香性の側鎖を有するアミノ酸のグループはフェニルアラ
ニン、チロシンおよびトリプトファンである。塩基性側
鎖を有するアミノ酸のグループはリジン、アルギニンお
よびヒスチジンである。酸性側鎖を有するアミノ酸のグ
ループはアスパラギン酸、グルタミン酸およびヒスチジ
ンである。また、含硫側鎖を有するアミノ酸のグループ
はシステインとメチオニンである。状況に応じて、同じ
グループ内のアミノ酸を、交換可能し得る。いくつかの
更なる保守的アミノ酸置換グループは、バリン−ロイシ
ン−イソロイシン；フェニルアラニン−チロシン；リジ
ン−アルギニン；アラニン−バリン；およびアスパラギ
ン−グルタミンである。
【００２７】ＣＲＭＰ−１核酸は、例えば、ＣＲＭＰ−
１ポリペプチドを（例えば宿主細胞中のまたは生物体の
細胞中で）発現するため、ＣＲＭＰ−１ｍＲＮＡ（例え
ば生体試料中の）またはＣＲＭＰ−１遺伝子内の遺伝子
変化を検出するため、ならびにＣＲＭＰ−１ポリペプチ
ド活性を調節するために、使用することができる。ＣＲ
ＭＰ−１核酸は、ＣＲＭＰ−１核酸またはＣＲＭＰ−１
ポリペプチドの一部分（例えばＣＲＭＰ−１ポリペプチ
ドの免疫原性部分または生物活性部分）をコードするフ
ラグメントを検出または増幅するためのプローブまたは
プライマーとして使用可能なフラグメントを含み得る。
フラグメントは、ドメイン、領域または機能的部位に対
応する配列を含んでもよい。ＣＲＭＰ−１プローブおよ
びプライマーも提供される。通常プローブ／プライマー
は、単離または精製されたオリゴヌクレオチドである。
該オリゴヌクレオチドは一般に、配列番号１のセンスま
たはアンチセンス配列の少なくとも約７，１２，または
１５個、もしくは約２０、２５、３０、３５、４０、４
５、５０、５５、６０、６５、または７５個の連続する
ヌクレオチドに本明細書に記載したストリンジェントな
条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を
有する。ＣＲＭＰ−１核酸は、配列番号１に示したヌク
レオチド配列とは異なる核酸分子を包含する。そのよう
な違いは、遺伝子コードの縮重によるものであるため、
同じＣＲＭＰ−１ポリペプチドをコードする核酸となり
得る。ＣＲＭＰ−１核酸は、配列番号２に示したアミノ
酸残基と、少なくとも１アミノ酸残基かつ、１０未満、
２０未満、または５０未満のアミノ酸残基だけ異なるア
ミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチ
ド配列を有する。
【００２８】ＣＲＭＰ−１−特異的抗体またはそのフラ
グメント（例えばその抗原結合フラグメント）は、ＣＲ
ＭＰ−１ポリペプチドを検出および単離し、ＣＲＭＰ−
１ポリペプチドのバイオアベイラビリティを調節し、Ｃ
ＲＭＰ−１活性を調節するために使用することができ
る。本明細書に使用する場合、用語「抗体」は、免疫グ
ロブリン分子またはその免疫学的に活性な部分（すなわ
ち抗源結合フラグメント）のことを指す。用語「免疫グ
ロブリン」とは、免疫グロブリン遺伝子によって実質的
にコードされた１又は複数のポリペプチドから成るタン
パク質のことを指す。確認されているヒト免疫グロブリ
ン遺伝子には、κ、λ、α（ＩｇＡ１およびＩｇＡ
２）、γ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ
４）、δ、ε、ならびにμ定常領域遺伝子と、無数の免
疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。
【００２９】ＣＲＭＰ−１−特異的抗体は、当該技術分
野でよく知られている方法を使用して作製することがで
きる。そのような抗体には、ポリクローナル抗体、モノ
クローナル抗体、キメラ抗体、単一鎖抗体、Ｆａｂフラ
グメント、およびＦａｂ発現ライブラリにより作製され
たフラグメントが含まれる。ＣＲＭＰ−１に対するモノ
クローナル抗体は、培養中の継代細胞株による抗体分子
の生産を与える任意の技術を使用して、調製することが
できる。そのような技術の例は、ハイブリドーマ技術、
ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術およびＥＢＶハイブリド
ーマ技術である（Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）Ｎａｔｕ
ｒｅ ２５６：４９５−４９７；Ｋｏｚｂｏｒら（１９
８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１：３
１−４２；Ｃｏｔｅら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２０２６−２０
３０；またはＣｏｌｅら（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ．６２：１０９−１２０）である。さらに、
「キメラ抗体」を作製するために開発された技術、つま
り、適当な抗原特異性と生理活性を備えた分子を得るた
めの、ヒト抗体遺伝子へのマウス抗体遺伝子のスプライ
シングを、使用することができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら
（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅ
ｒら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０
８；またはＴａｋｅｄａら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ
３１４：４５２−４５４）。代わりに、単一鎖抗体の生
産のために記載されている技術を、ＣＢＭＰ−１−特異
的単一鎖抗体を生産するために、当該技術分野において
周知の方法を使用して、適合してもよい。ＣＲＭＰ−１
−特異的抗体は、リンパ球集団にてインビボ生産を誘導
することによるか、または、文献に開示されているよう
な免疫グロブリンライブラリや特異性の高い結合試薬の
パネルを選別することによっても、生産することが可能
である（Ｏｒｌａｎｄｉら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：３８３３−３
８３７；またはＷｉｎｔｅｒら（１９９１）Ｎａｕｒｅ
３４９：２９３−２９９）。
【００３０】ＣＲＭＰ−１−特異的抗体の生産には、ヤ
ギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒトおよび他のものを含
む様々なホストを、ＣＲＭＰ−１ポリペプチドの注入に
よって免疫し得る。ホスト種に応じて、免疫反応を増加
させるために様々なアジュバントを使用し得る。そのよ
うなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸
化アルミニウムのような無機質ゲル、リゾレシチン、プ
ルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイ
ルエマルション、スカシガイ科のヘモシアニンおよびジ
ニトロフェノールのような界面活性物質が含まれるが、
それらに限定されるわけではない。ＣＲＭＰ−１−特異
的抗体は、完全ヒト抗体（例えばヒト免疫グロブリン配
列から抗体を生産するよう遺伝的に操作されたマウス中
で作製された抗体）であってもよいし、非ヒト抗体（例
えばげっ歯動物（マウスまたはラット）抗体、ヤギ抗
体、霊長類（例えば猿）抗体、ラクダ抗体）であっても
よい。げっ歯動物抗体を生産する方法は、当該技術分野
において周知である。例えば、Ｗｏｏｄら ＰＣＴ国際
出願第ＷＯ９１／００９０６号；Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａ
ｔｉら ＰＣＴ国際出願第第ＷＯ９１／１０７４１号；
Ｌｏｎｂｅｒｇら 国際出願第ＷＯ９２／０３９１８
号；またはＫａｙら 国際出願第９２／０３９１７号を
参照されたい。ＣＲＭＰ−１−特異的抗体は、非ヒト生
物体（例えばラットかマウス）において可変領域または
その一部分が生成されたものであり得る。非ヒト生物体
（例えばラットかマウス）で生成され、次にヒトでの抗
原性を減少させるために可変構造か定常領域を修飾され
た抗体も本発明に包含される。
【００３１】完全長ＣＲＭＰ−１ポリペプチド、また
は、ＣＲＭＰ−１ポリペプチドの抗原ペプチドフラグメ
ントは、免疫原として使用するか、または他の免疫原
（例えば細胞、膜調製物および同様のもの）によって作
製されたＣＲＭＰ−１−特異的抗体を識別するために使
用することができる。ＣＲＭＰ−１ポリペプチドの抗原
ペプチドは、配列番号２で示したアミノ酸配列の少なく
とも８つのアミノ酸残基を含むものとし、ＣＲＭＰ−１
ポリペプチドのエピトープを包含する。抗原ペプチド
は、ＣＲＭＰ−１ポリペプチドの少なくとも１０、１
５、２０、または３０個のアミノ酸残基を含み得る。
【００３２】治療論 ＣＲＭＰ−１ポリペプチドは、ＣＲＭＰ−１ポリペプチ
ドのアゴニスト型またはアンタゴニスト型の一方をコー
ドする核酸を送達するための遺伝子治療プロトコルの一
部として使用することができる。本発明は、ＣＲＭＰ−
１ポリペプチドが発現されていない細胞でＣＲＭＰ−１
ポリペプチド機能を再構成するか、代わりに該機能に拮
抗するための、特定の細胞種でのＣＲＭＰ−１ポリペプ
チドのインビボトランスフェクションおよび発現用の発
現ベクターをその特徴とする。ＣＲＭＰ−１ポリペプチ
ドの発現構築物は、任意の生理学的に有効な担体（例え
ばインビボで細胞にＣＲＭＰ−１遺伝子を有効に送達で
きる任意の製剤または組成物）に入れて投与される。発
現構築物は、異種プロモーター（例えば誘導プロモータ
ー）に機能的に連結されたＣＲＭＰ−１ポリペプチドを
コードする核酸配列を含んでよい。遺伝子治療プロトコ
ルは、被験者に誘導プロモーターの誘導物質（インデュ
ーサ）を投与することを含み得る。
【００３３】アプローチは、組換レトロウイルス、アデ
ノウイルス、アデノ関連性ウイルスおよび単純疱疹ウイ
ルスを含むウイルスベクターもしくは組換え細菌もしく
は真菌プラスミドに、被験者の遺伝子を挿入することを
含む。ウイルスベクターは細胞に直接トランスフェクト
し：プラスミドＤＮＡは例えば、カチオンリポソーム
（リポフェクチン）または誘導体化（例えば共役抗
体）、ポリリシン共役体、グラマシジンＳ、人工ウイル
スエンベロープまたは他のそのような細胞内担体の支援
によるか、遺伝子構築物の直接注入もしくはインビボで
実行されたＣａＰＯ４沈降の支援によって、送達可能で
ある。
【００３４】細胞にＣＲＭＰ−１核酸をインビボ導入す
るためのアプローチは、ＣＲＭＰ−１ポリペプチドをコ
ードする核酸（例えばｃＤＮＡ）を含むウイルスベクタ
ーの使用によるものであり得る。ウイルスベクターによ
る細胞の感染は、標的細胞の大部分が核酸を受取ること
ができるという利点を有する。さらに、ウイルスベクタ
ー内に（例えばウイルスのベクターに含まれるｃＤＮＡ
によって）コードされた分子は、ウイルスベクターの核
酸を取り込んだ細胞で効率的に発現される。
【００３５】レトロウイルスベクターおよびアデノ関連
ウイルスベクターは、インビボでの、特にヒトへの外因
性遺伝子の移入のための組換え遺伝子送達系として使用
できる。そのようなベクターは、細胞への遺伝子の効率
的な送達を提供し、移入された核酸は、宿主の染色体Ｄ
ＮＡに安定に組み込まれる。複製欠陥レトロウイルスだ
けを生産する特殊化した細胞株（「パッケージング細
胞」と称する）の創作は、レトロウイルスの遺伝子治療
に対する有用性を増大させた。また、欠陥レトロウイル
スは、遺伝子治療の目的で遺伝子移入に使用するために
特徴付けられる（概説は例えばＭｉｌｌｅｒ Ａ．Ｄ．
（１９９０）Ｂｌｏｏｄ７６：２７１）を参照のこ
と）。複製欠陥トロウイルスは、標準的な方法によりヘ
ルパーウイルスを使用して標的細胞を感染させるのに使
用可能なビリオンにパッケージされる。組換えレトロウ
イルスを生産するためのプロトコルとそのようなウイル
スを用いてインビトロまたはインビボで細胞を感染する
ためのプロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａ
ｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（編）、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕ
ｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９８
９）、９．１０−９．１４節、ならびに他の標準的な実
験手引書に見出すことができる。適切なレトロウイルス
の例には、当業者に知られているｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐ
ＷＥおよびｐＥＭが含まれる。エコトロピック（同種志
向性）およびアンホトロピック（両種志向性）の両方の
レトロウイルス系の調製に適したパッケージングウイル
ス系の例には、ｙＣｒｉｐ、ｙＣｒｅ、ｙ２およびｙＡ
ｍが含まれる。レトロウイルスは、インビトロおよび／
またはインビボで、上皮細胞を含む様々な細胞種に様々
な遺伝子を導入するために使用されている（例えば、Ｅ
ｇｌｉｔｉｓら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：
１３９５−１３９８；Ｄａｎｏｓ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉ
ｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ８５：６４６０−６４６４；Ｗｉｌｓｏ
ｎら（１９２８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ３５：３０１４−３０１８；Ａｒｍｅｎｔ
ａｎｏら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：６１４１−６１４５；Ｈｕｂｅ
ｒら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ８８：８０３９−３０４３；Ｆｅｒｒｙ
ら（１９９１） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８８ ８３７７−８３８１；Ｃｈｏｗｄｈ
ｕｒｙら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１８０
２−１８０５；ｖａｎ Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍら（１９９
２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８９：７６４０−７６４４；Ｋａｙら（１９９２）Ｈｕ
ｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：６４１−６４
７；Ｄａｉら（１９９２） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０８９２−１０８９
５；Ｈｗｕら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５
０：４１０４−４１１５；米国特許第４，８６８，１１
６号；米国特許第４，９３０，２３６号：ＰＣＴ出願第
ＷＯ８９／０７１３６号；ＰＣＴ出願第ＷＯ８９／０２
４６８号；ＰＣＴ出願第ＷＯ８９／０５３４５号；なら
びにＰＣＴ出願第ＷＯ９２／０７５７３号を例えば参照
されたい）。
【００３６】別の有用なウイルス遺伝子送達系には、ア
デノウイルス由来のベクターが含まれる。アデノウイル
スのゲノムを、該ゲノムが対象の遺伝子産物をコードお
よび発現するが、正常な細胞溶解ウイルスの生活周期で
の複製能力が不活性化されるように、操作することがで
きる。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒら（１９８８）Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ
ら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３
４；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２）Ｃｅｌｌ
６８：１４３−１５５を参照されたい。アデノウイル
ス種Ａｄ タイプ５ ｄｌ３２４または他のアデノウイ
ルス種（例えばＡｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）に由来す
る適切なアデノウイルスベクターが、当業者に知られて
いる。組換えアデノウイルスは、非分裂細胞に感染する
ことができず、上皮細胞を含めた種々の細胞種に感染す
るために使用できるという点で、特定の状況では有効で
ある（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２）、前掲）。さ
らに、該ウイルス粒子は、比較的安定で精製と濃縮を受
け入れることができ、上述したように、感染力のスペク
トルに影響を及ぼすように修飾することができる。さら
に、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（ならびにそれに
含まれる外来ＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノムには組み込
まれず、エピソームのままである。このため、導入され
たＤＮＡが宿主ゲノム（例えばレトロウイルスＤＮＡ）
に組み込まれるインサイチュでの挿入突然変異の結果生
じ得る可能のある、潜在的な問題を回避することができ
る。さらに、外来ＤＮＡに対するアデノウイルスゲノム
の収容能力は、他の遺伝子送達ベクターに比べて大きい
（８キロベースまで）（Ｂｅｒｋｎｅｒら、前掲；Ｈａ
ｊ−Ａｈｍａｎｄ およびＧｒａｈａｍ（１９８６）
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７）。
【００３７】ＣＲＭＰ−１遺伝子の送達に有用なさらに
別のウイルスベクター系は、アデノ関連ウイルス（ＡＡ
Ｖ）である。アデノ関連ウイルスは、効率的な複製と生
殖生活周期のために、ヘルパーウイルスとしてアデノウ
イルスまたはヘルペスウイルスのような別のウイルスを
要求する、天然の欠陥ウイルスである。（概説は、Ｍｕ
ｚｙｃｚｋａら（１９９２） Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐｉｃ
ｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏ． ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
５８：９７−１２９を参照）。アデノ関連ウイルスはま
た、そのＤＮＡを非分裂細胞に組み込め、高い頻度の安
定した組込みを示す数少ないウイルスの１つである（例
えばＦｌｏｔｔｅら（１９９２）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉ
ｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９−３５
６；Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
６３；３８２２−３８２８； およびＭｃＬａｕｇｈｌ
ｉｎ（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６３−１
９７３）を参照）。ＡＡＶの３００の短さの塩基対を含
むベクターがパッケージされ、組み込むことができる。
外因性ＤＮＡのためのスペースは約４．５ｋｂまでに制
限されている。Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８５）Ｍｏ
ｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ ５：３２５１−３２６０
に記述されているようなＡＡＶベクターを、細胞へＤＮ
Ａを導入するために使用することができる。様々な核酸
が、ＡＡＶベクターを使用して、異なる細胞種に導入さ
れている（例えば、Ｈｅｒｍｏｎａｔら（１９８４）Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：
６４６６−４４７０；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８
５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４： ２０７２−２
０８１；Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄら（１９８８）Ｍｏｌ．
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２；３２−３９；Ｔｒａｔｓｃ
ｈｉｎら（１９８４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６１１−
６１９；およびＦｌｏｔｔｅら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１−３７９０を参照）。
【００３８】上述したようなウイルス移入法に加えて、
非ウイルス法も、動物組織にＣＲＭＰ−１ポリペプチド
の発現を引き起すために使用することができる。大半の
非ウイルス遺伝子移入法は、巨大分子の取り込みおよび
細胞内輸送のために哺乳類細胞によって使用されている
通常の機構に基づいている。いくつかの実施形態では、
本発明の非ウイルスの遺伝子送達系は、標的細胞による
ＣＲＭＰ−１核酸の取り込みのためのエンドサイトーシ
ス経路に基づいている。
【００３９】このタイプの一般的な遺伝子送達系には、
リポソーム由来の系、ポリリジン共役体、および人工ウ
イルスエンベロープが含まれる。他の実施形態には、Ｍ
ｅｕｌｉら（２００１）Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａ
ｔｏｌ．１１６（１）：１３１−１３５；Ｃｏｈｅｎら
（２０００）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ７（２２）：１８９
６−９０５；またはＴａｍら（２０００）Ｇｅｎｅ Ｔ
ｈｅｒ ７（２１）：１８６７−７４に記載されている
ようなプラスミド注入系が含まれる。
【００４０】代表的な実施形態では、ＣＲＭＰ−１ポリ
ペプチドをコードする核酸が、正電荷を有するリポソー
ムの表面（例えばリポフェクチン）でリポソームに捕獲
される。該リポソームは、任意選択で、標的組織の細胞
表面抗原に対する抗体によってタグが付けられる（Ｍｉ
ｚｕｎｏら（１９９２）Ｎｏ Ｓｈｉｎｋｅｉ Ｇｅｋ
ａ ２０： ５４７−５５１；ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９
１／０６３０９号日本国特許出願第１０４７３８１号；
および欧州特許出願第ＥＰ−Ａ−４３０７５号）。
【００４１】臨床上のセッティングでは、多くの方法
（各方法は当該技術分野においてよく知られている）の
うちの任意の方法により、治療用のＣＲＭＰ−１核酸の
ための遺伝子送達系を、患者へ導入することができる。
例えば、遺伝子送達系の医薬製剤を、例えば静脈注射に
より、全身的に導入することができる。標的細胞へのタ
ンパク質の特定の導入は、遺伝子媒体によって提供され
るトランスフェクションの特異性、受容体遺伝子の発現
を制御する転写調節配列による細胞型または組織型の発
現、またはそれらの組み合わせから主に生じる。別の実
施形態では、組換え遺伝子の初期の送達が、動物への導
入を非常に局所的にすることで、より制限される。例え
ば、遺伝子媒体は、カテーテル（米国特許第５，３２
８，４７０号を参照）または定位的注入（例えばＣｈｅ
ｎら（１９９４）ＰＮＡＳ ９１：３０５４−３０５
７）により導入することができる。
【００４２】遺伝子治療構築物の医薬製剤は、許容でき
る希釈液に溶かした遺伝子送達系から本質的に成るか、
遺伝子媒体が埋め込まれた遅延放出マトリクスから成
る。代わりに、完全な遺伝子送達系を組換え細胞（例え
ばレトロウイルスベクター）からインタクトに生成する
ことができる場合、医薬製剤は遺伝子送達系を生産する
１または複数の細胞を含む得る。
【００４３】診断 本発明は、被験者の腫瘍侵入可能性または転移を診断す
る方法も提供する。該方法は、（１）治療中に被験者を
モニタするか、（２）腫瘍障害を有する可能性があるか
腫瘍障害を有することが知られている被験者を、評価す
るためにも使用できる。
【００４４】該方法は、被験者から試料（例えば生検、
血液または他の組織試料）を得る工程と、試料中のＣＲ
ＭＰ−１の発現レベルを決定する工程と、基準発現値と
試料発現値を比較する工程と、試料発現値値が基準発現
値より低い場合に、腫瘍侵入可能性または転移を有する
として被験者を分類する工程と、から成る。試料発現値
または基準発現値の各々は、（１）ＣＲＭＰ−１核酸か
ら転写されたｍＲＮＡか、（２）ＣＲＭＰ−１ポリペプ
チドの存在量の評価である。試料には、被験者から単離
した組織、細胞、および体液のみならず、被験者内に存
在する細胞および、細胞、および体液も含まれる。試料
の一例は血清である。
【００４５】ＣＲＭＰ−１遺伝子の発現レベルは、細胞
内のＣＲＭＰ−１遺伝子に対応するｍＲＮＡレベルによ
って測定することができる。測定値は、ノーザン分析、
ポリメラーゼ連鎖反応分析およびプローブアレイを含む
がこれらに限定されないハイブリダイゼーションアッセ
イまたは増幅アッセイのような、インサイチュでもイン
ビトロアッセイでも決定できる。ｍＲＮＡレベルの検出
のための１つの診断法は、検出される遺伝子によってコ
ードされたｍＲＮＡにハイブリダイズできる核酸プロー
ブと、ｍＲＮＡを接触させることを含む。核酸プローブ
は、例えば、配列番号１の核酸のような完全長ＣＲＭＰ
−１核酸であるか、または長さが少なくとも７、１５、
３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチド
であり、ＣＲＭＰ−１ ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに
対してストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダ
イズするのに十分なオリゴヌクレオチドのような、該核
酸の一部である。プローブは、アレイのアドレス上に配
置することができる。診断アッセイに使用される他の適
切なプローブが本明細書に記載される。１つの形式（例
えばノーザン法）では、例えばアガロースゲル上で単離
ｍＲＮＡを流し、ｍＲＮＡをゲルからニトロセルロース
のようなメンブレンに移すことにより、ｍＲＮＡ（また
はｃＤＮＡ）を表面に固定し、プローブと接触させる。
代替形式では、例えば以下に説明する二次元遺伝子チッ
プアレイで、プローブを表面に固定し、ｍＲＮＡ（また
はｃＤＮＡ（例えば標識が付いたｃＤＮＡ））をプロー
ブと接触させる。当業者は、ＣＲＭＰ−１遺伝子によっ
てコードされたｍＲＮＡレベルの検出に使用するため
に、既知のｍＲＮＡ検出方法を適合させることができ
る。
【００４６】試料中のｍＲＮＡレベルは、例えば、ＲＴ
−ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ（１９８７）米国特許第４，６
８３，２０２号）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ
（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８８：１８９−１９３）、自己支持配列の複製
（Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４−１８
７８）、転写増幅系（Ｋｗｏｈら（１９８９） Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１
７３−１１７７）、Ｑ−βレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄ
ｉら（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：
１１９７）、回転円複製（Ｌｉｚａｒｄｉら米国特許第
５，８５４，０３３号）または他の核酸増幅方法のよう
な核酸増幅で評価でき、その後、当該技術分野で周知の
技術を用いて、該増幅した分子が検出される。本明細書
に使用する場合、増幅プライマーは、遺伝子の５’また
は３’領域にアニールでき、その間に短い領域を含む一
対の核酸分子（各々プラス鎖とマイナス鎖、またはその
逆）一対の核酸分子として定義される。一般に、増幅プ
ライマーは長さが約１０〜３０のヌクレオチドあり、長
さ約５０〜２００ヌクレオチドの領域と側面で接する。
適切な条件下で、かつ適切な試薬を用いて、そのような
プライマーにより、プライマーと側面が接するヌクレオ
チド配列を含む核酸分子が増幅される。
【００４７】ＣＲＭＰ−１ポリペプチドのレベルを決定
するために様々な方法を使用することができる。一般
に、そのような方法には、試料中のＣＲＭＰ−１ポリペ
プチドのレベルを評価するために、ＣＲＭＰ−１ポリペ
プチドと選択的に結合する抗体を始めとする作用薬を、
試料と接触させることを含む。抗体は検出可能な標識を
有していてもよい。プローブまたは抗体に関する用語
「標識する」とは、検出可能な物質にプローブまたは抗
体を結合（つまり物理的に連結）することによりプロー
ブまたは抗体を直接標識することだけでなく、検出可能
な物質との反応によりプローブまたは抗体を間接的に標
識することも包含するものとする。
【００４８】検出方法は試料中のＣＲＭＰ−１ポリペプ
チドをインビトロまたはインビボで検出するためにも使
用することができる。ＣＲＭＰ−１ポリペプチドを検出
するインビトロ法には、酵素連結免疫吸着剤アッセイ
（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降法、免疫蛍光法、酵素免疫ア
ッセイ（ＥＴＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、
およびウェスタンブロット分析が含まれる。ＣＲＭＰ−
１ポリペプチドを検出するインビボ法には、被験者に標
識されたＣＲＭＰ−１−特異的抗体を導入することが含
まれる。例えば、抗体は、被験者中でその存在および位
置が標準的なイメージング技術によって検出できる放射
性マーカーにより標識することができる。別の実施形態
では、試料が、例えば、ビオチン化により標識され、次
に抗体と接触される。試料は、例えば蛍光標識に結合さ
れたアビジンにより、検出可能である。
【００４９】インサイチュ法の場合、細胞または組織試
料を調製／処理し、通常はガラススライドである支持体
上に固定し、その後、分析中のＣＲＭＰ−１遺伝子をコ
ードするｍＲＮＡにハイブリダイズできるプローブと接
触させる。診断および予測アッセイは、ＣＲＭＰ−１
ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出可能な化合物または
作用薬と対照試料中を接触させ、対照試料中のＣＲＭＰ
−１ ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を、試験試料
中のＣＲＭＰ−１ ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在
と比較する化ことをさらに含んでよい。米国特許第５，
６９５，９３７号に記述されているような遺伝子発現の
連続分析も、ＣＲＭＰ−１の転写レベルを検出するため
に使用することができる。
【００５０】試験化合物のスクリーニング 本発明は、試験化合物、すなわち、ＣＲＭＰ−１核酸ま
たはＣＲＭＰ−１ポリペプチドの発現のレベルを調整す
る候補または作用薬、を同定する方法を提供する。
【００５１】試験化合物は、生物ライブラリ；ペプトイ
ドライブラリ（酵素分解に強いが生理活性を維持するペ
プチドの機能を有するが、新規な非ペプチドバックボー
ンを備えたライブラリ。Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９
９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８−８５）
参照）；空間的にアドレス可能なパラレル固相または液
相ライブラリ；ディコンボリューションを必要とする合
成ライブラリ法；「１ビーズ１化合物」ライブラリ法；
ならびにアフィニティクロマトグラフィー選択を使用し
た合成ライブラリ法；を含む当該技術分野で周知のコン
ビナトリアルライブラリ法のうちの多数のアプローチの
任意のものを使用して得ることができる。生物ライブラ
リおよびペプトイドライブラリのアプローチはペプチド
ライブラリに制限されているが、他の４つのアプローチ
は、化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは小
分子ライブラリに適用可能である（Ｌａｍ（１９９７）
Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１２：１４
５）。
【００５２】分子ライブラリの合成方法の例は、当該技
術分野では例えば以下のように見出すことができる：Ｄ
ｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂら
（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ９１：１１４２２； Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら
（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；
Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０
３；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒ
ｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．
Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐ
ら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３
３。
【００５３】化合物のライブラリは、溶液中（例えばＨ
ｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ １３：４１２−４２１）に、またはビーズ上（Ｌａ
ｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４）、
チップ上（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６
４：５５５−５５６）、バクテリア（Ｌａｄｎｅｒ米国
特許第５，２２３，４０９号）、胞子上（Ｌａｄｎｅｒ
米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミド上
（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄ
Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１８６５−１８６９）または
ファージ上（ＳｃｏｔｔとＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ
（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０
６；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８−６３８２；Ｆｅｌ
ｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３
０１−３１０；Ｌａｄｎｅｒ 前掲）に存在し得る。一
般的なコンビナトリアル化学ライブラリには、ペプチド
ライブラリが含まれるが、それに限定されるわけではな
い（例えば米国特許第５，０１０，１７５号、Ｆｕｒｋ
ａ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．３７：
４８７−４９３（１９９１）およびＨｏｕｇｈｔｏｎ
ら、Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４−８８ （１９９１）
参照）。化学的多様性ライブラリを生成するための他の
化学物質も使用することができる。そのような化学物質
には以下のものが含まれるが、これらに限定されるわけ
ではない：ペプトイド（例えばＰＣＴ公開番号第ＷＯ９
１／１９７３５号）、コードされたペプチド（例えばＰ
ＣＴ公開番号第ＷＯ９３／２０２４２号）、ランダムバ
イオオリゴマー（例えばＰＣＴ公開番号第ＷＯ９２／０
００９１号）、ベンゾジアゼピン（例えば米国特許第
５，２３８，５１４号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼ
ピン、ジペプチドのようなダイバーソマー（Ｈｏｂｂｓ
ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９０：６９０９−６９１３（１９９３））、ビニル様ポ
リペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈ
ｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：６５６８（１９９２））、グル
コース足場材料を備えた非ペプチドのペプチド模倣分子
（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎら，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．
Ｓｏｃ．１１４：９２１７−９２１８（１９９２））、
小化合物ライブラリの類似有機合成物（Ｃｈｅｎら，
Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２６６１
（１９９４）、オリゴカルバミン酸塩（Ｃｈｏら、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３（１９９３））および／
またはペプチジルホスホン酸塩（Ｃａｍｐｂｅｌｌら，
Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：６５８（１９９４））、
核酸ライブラリ（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｂｅｒｇｅｒおよび
Ｓａｍｂｒｏｏｋ参照、すべて前掲）、ペプチド核酸ラ
イブラリ（例えば米国特許第５，５３９，０８３号を参
照）、抗体ライブラリ（例えばＶａｕｇｈｎら，Ｎａｔ
ｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４（３）：３
０９−３１４（１９９６）およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１
０２８７を参照）、炭水化物ライブラリ（例えばＬｉａ
ｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：１５２０−１５２２
（１９９６）および米特許５，５９３，８５３号を参
照）、小有機分子ライブラリ（例えばベンゾジアゼピ
ン、Ｂａｕｍ Ｃ＆ＥＮ，Ｊａｎ１８，ｐａｇｅ ３３
（１９９３）；イソプレノイド、米国特許第５，５６
９，５８８号）；チアゾリジノンとメタチアザノン（米
国特許第５，５４９，９７４号）；ピロリジン、米国特
許第５，５２５，７３５号および第５，５１９，１３４
号；モルホリノ化合物、米国特許第５，５０６，３３７
号；ベンゾジアゼピン、第５，２８８，５１４号等）。
【００５４】ＣＲＭＰ−１核酸発現を調節する試験化合
物を同定することができる。例えば、細胞または細胞が
含まれていない混合物を試験混合物と接触させて、ＣＲ
ＭＰ−１ ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現を、試験
化合物がない状態でのＣＲＭＰ−１ ｍＲＮＡまたはポ
リペプチドの発現レベルに対して評価する。ＣＲＭＰ−
１ ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が、試験化合物
がない状態よりも試験化合物がある場合で多い時、試験
化合物は、ＣＲＭＰ−１ ｍＲＮＡまたはポリペプチド
の発現の刺激物質であると同定される。代わりに、ＣＲ
ＭＰ−１ ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が、試験
化合物がない状態よりも試験化合物がある場合で少ない
（例えば統計的に有意に少ない）時、候補化合物はＣＲ
ＭＰ−１ｍＲＮＡまたはポリペプチド発現の阻害剤とし
て同定される。「診断」に上述した方法により、ＣＲＭ
Ｐ−１ ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルを決
定することができる。
【００５５】試験化合物が基質（例えばＣＲＭＰ−１基
質）に結合するＣＲＭＰ−１ポリペプチドを調節する能
力を評価することができる。これは例えば、複合体中の
標識された基質を検出することによりＣＲＭＰ−１ポリ
ペプチドに対する基質の結合を決定できるように、放射
性同位元素か酵素標識と基質を結合することにより遂行
することができる。代わりに、試験化合物が、複合体中
のＣＲＭＰ−１ポリペプチド基質に結合するＣＲＭＰ−
１ポリペプチドを調節する能力をモニタするために、Ｃ
ＲＭＰ−１ポリペプチドを放射性同位元素または酵素標
識と結合させることもできる。例えば、基質は、１２５
Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈで直接または間接のいず
れかで標識することができ、そのような放射性同位元素
は、放射線の放射を直接カウントするか、シンチレーシ
ョンカウンターにより検出される。代わりに、例えば、
ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスフ
ァターゼ、またはルシフェラーゼにより、試験化合物を
酵素標識することもでき、そのような酵素標識は、適切
な基質の変換のある生成物への変換を測定することによ
って検出される。
【００５６】試験化合物の、任意の反応体の標識を有し
ても有しなくてもよいＣＲＭＰ−１ポリペプチドと相互
作用する能力を、評価することができる。例えば、試験
化合物とＣＲＭＰ−１ポリペプチド間の相互作用は、蛍
光エネルギー移動（ＦＥＴ）を用いて検出することがで
きる（例えばＬａｋｏｗｉｃｚら、米国特許第第５，６
３１，１６９号；Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓら、
米国特許第４，８６８，１０３号参照）。第１の「供与
体（ドナー）」分子上の蛍光標識は、その発された蛍光
エネルギーが第２の「受容体（アクセプター）分子の上
で蛍光標識に吸収されるように選択される。次に第２の
受容体分子は、吸収したエネルギーにより、蛍光を発す
ることができる。「受容体」分子の標識が「供与体」分
子の標識と区別できるように、光の異なる波長を発する
標識が選択される。標識間のエネルギー移動の効率は、
分子を隔てる距離に関係するので、分子の空間的位置関
係を評価することができる。ＦＥＴ結合事象は、当該技
術分野において周知の標準的な蛍光検出手段によって
（例えば、蛍光計を使用して）、好都合に測定される。
試験化合物とＣＲＭＰ−１ポリペプチド間の相互作用
は、リアルタイム生体分子相互作用分析（Ｂｉｏｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓ
ｉｓ，ＢＩＡ）を用いて遂行することができる（例えば
Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｓ．とＵｒｂａｎｉｃｚｋｙ，
Ｃ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８
−２３４５およびＳｚａｂｏら（１９９５）Ｃｕｒｒ．
Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０
５）を参照）。「表面プラズモン共鳴」または「ＢＩ
Ａ」は、任意の反応体で標識しなくても、リアルタイム
で生体特異的相互作用を検出する（例えばＢＩＡｃｏｒ
ｅ）。
【００５７】結合表面（結合事象を示す）での質量の変
化により、表面付近の光の屈折率が変化する（表面プラ
ズモン共鳴（ＳＰＲ）の視覚現象）。その結果、生体分
子間のリアルタイムな反応の指標として使用可能な検出
シグナルが生じる。
【００５８】試験化合物を同定する方法は、本明細書に
記載したアッセイを２つ以上組み合わせることと、上述
のスクリーニング方法によって同定された新規化合物と
に関する。従って、適切な動物モデルにて、本明細書に
記載したような同定された化合物（例えばＣＲＭＰ−１
調節化合物、アンチセンスＣＲＭＰ−１核酸分子、ＣＲ
ＭＰ−１−特異的抗体またはＣＲＭＰ−１結合パートナ
ー）を、有効性、毒性、副作用または作用機序を決定す
るためにさらに使用することは、本発明の範囲内であ
る。さらに、上述のスクリーニングアッセイによって同
定された新規化合物は、上述したような治療のために使
用することができる。
【００５９】また、ＣＲＭＰ−１核酸（例えばＣＲＭＰ
−１非コード領域またはＣＲＭＰ−１コード領域）（例
えばＣＲＭＰ−１遺伝子を含むＧｅｎＢａｎｋ ＮＴ＿
００６０５１の配列、例えば、ヌクレオチド５５９９７
１〜６３５０６２の配列または５４００００〜６４００
００の配列））に結合するキメラ人工亜鉛フィンガータ
ンパク質を同定することも可能である。様々な亜鉛フィ
ンガードメインを含むライブラリを生成することが可能
である。例えば、Ｒｅｂａｒら（１９９６）Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２６７：１２９；Ｇｒｅｉｓｍ
ａｎとＰａｂｏ（１９９７） Ｓｃｉｅｎｃｅ２７５：
６５７；Ｉｓａｌａｎら（２００１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌ １９：５５６；およびＷｕら（１９９
５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９
２：３４４を参照されたい。
【００６０】また、例えばインビトロ選択（例えばファ
ージディスプレイを使用した）によるか、認識コードに
基づく設計（例えば第ＷＯ００／４２２１９号）によっ
て、１または複数のキメラ亜鉛フィンガーＤＮＡ結合領
域を作製することが可能である。亜鉛フィンガータンパ
ク質は、ＣＲＭＰ−１の転写を活性化する転写活性化ド
メインに融合することができる。亜鉛フィンガータンパ
ク質は、それ自体、細胞に送達される異種核酸によって
コードされ得る。亜鉛フィンガータンパク質をコードす
る配列は、例えば細胞内での亜鉛フィンガータンパク質
のレベルを細かく制御可能にするために、誘導プロモー
ターに機能的に連結することができる。
【００６１】ハイスループットスクリーニング ハイスループット法は、化学物質の大きなライブラリを
スクリーニングするために使用することができる。候補
化合物のそのようなライブラリは、作製するか、ケンブ
リッジ社（Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ Ｃｏｒｐ．、カリフ
ォルニア州サンディエゴ所在）より入手することができ
る。ライブラリは、種々の範囲の化合物を包含するよう
に設計することができる。例えば、ライブラリは１０，
０００、５０，０００、１００，０００またはそれより
多くの固有の化合物を含むことができる。単なる例では
あるが、ライブラリは、ピリジン、インドール、キノリ
ン、フラン、ピリミジン、トリアジン、ピロール、イミ
ダゾール、ナフタレン、ベンゾイミダゾール、ピペリジ
ン、ピラゾール、ベンズオキサゾール、ピロリジン、チ
フェン（ｔｈｉｐｈｅｎｅｓ）、チアゾール、ベンゾチ
アゾールおよびモルホリンを含めたヘテロ環から構築さ
れる。代わりに、先の実験および個々の事例に基づく証
拠によると、効力が増強された化合物のクラスまたはカ
テゴリが提唱される。ライブラリは化学物質のそのよう
なクラスを包含するように設計かつ合成することができ
る。
【００６２】モデル細胞株（例えば、ＣＬ１−０とＣＬ
１−１およびＣＬ１−５のようなＣＬ１−０とその同系
内の株）または腫瘍転移患者からの細胞を、ハイスルー
プット薬物スクリーニングのために使用することができ
る。例えば、細胞は、小型のマイクロタイタープレート
（例えば６ウェル、３２ウェル、６４ウェル、９６ウェ
ル、３８４ウェルプレート）で成長される。高密度マイ
クロタイタープレートを、ポリマー（例えばポリジメチ
ルシロキサン）（例えばダウコーニング（Ｄｏｗ−Ｃｏ
ｒｎｉｎｇ）社製のＳｙｌｇａｒｄ ３８４）およびア
クリル型枠から作成することができる。型枠は、化合物
を中に分配できる、細胞成長用のウェルを有する。例え
ば、型枠は、容量が２μＬの１５３６ウェルか、容量が
２５０ｎＬの６１４４ウェルを有し得る。複数の試験化
合物または上述のようなライブラリを、スルリーニング
することができる。ライブラリは、ロボット操作に従う
ことができる形式（例えばマイクロタイタープレート）
で提供することができる。化合物は、マイクロタイター
プレート中の腫瘍転移細胞に添加することができる。化
合物の添加に続いて、細胞を一定期間インキュベートす
る。その後、発現レベルをモニタする。
【００６３】試験化合物をプールして、そのプールを試
験することもできる。陽性プールは後の分析用に分割さ
れる。そのような方法にかかわらず、ＣＲＭＰ−１遺伝
子の発現レベルを変える化合物は「候補」化合物または
薬物と考えられる。候補化合物は上述したように腫瘍転
移細胞に関して再び試験される。再試験で陽性の候補化
合物は、「リード」化合物と考えられる。
【００６４】一旦リード化合物が同定されると、薬化学
の一般原理を使用して、化合物の誘導体を生産すること
ができる。誘導体を、薬学的特性（例えば有効性、薬物
動態、安定性、溶解度、クリアランス）の改良のため
に、スクリーニングすることができる。上記アッセイに
おける化合物の活性の原因となっているある部分を、当
該技術分野において一般に行われているように、構造−
活性の関係（ＳＡＲ）を調べることにより、図で表すこ
とができる。薬化学における当業者は、リード化合物上
の部分を改変し、その改変が化合物の効力に対して及ぼ
す影響を測定し、それによって効力が増加した誘導体を
生産することができる。例えば、Ｎａｇａｒａｊａｎら
（１９８８）Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４１：１４３０−
８．を参照された。改変には、Ｎ−アシル化、アミノ
化、アミド化、酸化、還元、アルキル化、エステル化お
よびヒドロキシル化が含まれ得る。さらに、リード化合
物の生化学標的が既に知られているか決定されている場
合、標的とリード化合物の構造を、誘導体の設計および
最適化に与えることができる。分子モデリングソフトウ
ェアが市販されている（例えばモレキュラーシミュレー
ション（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ
ｓ）社）。
【００６５】医薬組成物 本発明は、腫瘍転移の危険性がある（かまたそれに罹患
しやすい）被験者を治療するか、腫瘍転移を有する被験
者を治療するための、医薬組成物を提供する。本明細書
に使用する場合、用語「治療」は、患者への作用薬の適
用または投与として定義されるか、疾病、疾病の徴候、
または疾病への素質を有する患者から単離した組織また
は細胞株に対して、該疾病、該疾病の徴候、または該疾
病への素質を治癒、治癒、緩和、軽減、変更、矯正、改
善、または、影響を及ぼすための、作用薬の適用または
投与として定義される。作用薬には、ＣＲＭＰ−１ポリ
ペプチド、ＣＲＭＰ−１核酸、またはＣＲＭＰ−１核酸
またはＣＲＭＰ−１ポリペプチドの発現または効力を調
節する試験化合物が含まれるが、それらに限定されるわ
けではない。
【００６６】医薬組成物は、今述べた作用薬と、医薬と
して許容される担体とを含んでいる。本明細書に使用す
る場合、用語「医薬として許容される担体」には、医薬
の投与と化学反応を起こさない（適合性の）溶媒、分散
媒、コーティング、抗細菌物質および抗真菌物質、等張
および吸収遅延物質、ならびその同等物が含まれる。補
助活性化合物も組成物に組み込むことができる。
【００６７】作用薬は、その意図した投与経路と適合す
るように調剤することができる。投与経路の例には、非
経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば吸
入）、経皮（局所）、経粘膜、および直腸内投与が含ま
れる。これらの投与経路のための剤形の調剤には、従来
の方法を使用することができる。例えば、作用薬は、カ
プセル、ゲルシールまたは経口投与用の錠剤の形に調剤
することができる。カプセルはゼラチンまたはセルロー
スのような任意の標準的な医薬として許容される物質を
含んでもよい。
【００６８】錠剤は、固体担体および潤滑剤との作用薬
の混合物の圧縮により、従来の手順に従って調剤するこ
とができる。固体担体の例には、デンプンおよび糖ベン
トナイトが含まれる。作用薬は、結合剤（例えばラクト
ースまたはマンニトール）、従来の充填剤、錠剤化物質
を含む硬い外殻の錠剤またはカプセルの形式でも投与す
ることができる。
【００６９】該医薬組成物は、経口、局所、皮下、腹腔
内、筋内、および静脈内を含めた非経口経路で投与され
得る。非経口剤形の例には、活性作用薬または他の周知
の医薬として許容される賦形剤を含む、水溶液、等張食
塩水または５％のグルコースが含まれる。シクロデキス
トリンのような可溶化剤や当業者に周知の他の可溶化剤
を、治療薬の送達用の医薬賦形剤として使用することが
できる。
【００７０】薬物の毒性および治療有効性は、例えばＬ
Ｄ５０（集団の５０％までの致死用量）およびＥＤ５０
（集団の５０％での治療有効用量）を決定するための、
細胞培養または実験動物における標準的な製薬学的方法
により決定することができる。毒性効果と治療効果の間
の用量比は治療指標であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０として
表わすことができる。高い治療指標を示す化合物が好ま
れる。毒性の副作用を示す作用薬を使用してもよいが、
非感染細胞に対する損害の可能性を最小限にし、かつそ
れによって副作用を低減するために、罹患した組織部位
へのそのような作用薬を向ける送達系を設計する際には
注意すべきである。
【００７１】細胞培養アッセイから得られたデータと動
物実験を使用して、ヒトに使用される一連の用量の範囲
を調剤することができる。作用薬の用量は、好ましく
は、毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を有する一
連の循環濃度内にある。投薬は、使用する剤形および使
用する投与経路に依存してこの範囲内で変更し得る。本
発明の方法で使用される任意の作用薬に対して、治療に
有効な用量を、細胞培養アッセイから最初に推測するこ
とができる。細胞培養で決定されるようなＩＣ５ ０（つ
まり症状の最大の半分の阻害を達成する試験化合物の濃
度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために、用量
は、動物モデルにて調剤することができる。そのような
情報は、ヒトでの有用な用量をより正確に決定するため
に使用することができる。血漿中のレベルは、例えば高
性能液体クロマトグラフィーによって測定することがで
きる。
【００７２】本明細書で定義するように、治療上有効量
のポリペプチド（つまり有効用量）は、約０．００１〜
３０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ体
重、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、約１〜１０ｍｋ／
ｋｇ、２〜９ｍｇ／ｋｇ、３〜８ｍｇ／ｋｇ、４〜７ｍ
ｇ／ｋｇまたは５〜６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲に及ぶ。当
業者は、ある要因が、疾病または障害の重度、過去の治
療、健康状態および／または被験者の年齢、および他の
存在疾病を含むがこれらに限定されない、被験者を治療
するのに必要な用量およびタイミングに影響を及ぼし得
ることが認識されるだろう。
【００７３】抗体の場合、好ましい用量は、０．１ｍｇ
／ｋｇ体重（一般に１０ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ）
である。抗体が脳で作用する場合、５０ｍｇ／ｋｇ〜１
００ｍｇ／ｋｇの用量が、通常適切である。一般に、部
分ヒト抗体および完全ヒト抗体は、人体中で他の抗体よ
りも長い半減期を有している。従って、より用量でより
少ない回数の投与が多くの場合可能である。脂質化のよ
うな改変を、抗体を安定化し、取り込みと組織の貫通
（例えば脳内への）を増強するために使用することがで
きる。抗体の脂質化のための方法が、Ｃｒｕｉｋｓｈａ
ｎｋら（（１９９７）Ｊ． Ａｃｑｕｉｒｅｄ Ｉｍｍ
ｕｎｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ
ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ １
４：１９３）に記載されている。
【００７４】本発明は、ＣＲＭＰ−１核酸またはＣＲＭ
Ｐ−１ポリペプチドの発現または活性を調整する化合物
を包含する。作用薬は、例えば小分子である。例証的な
用量には、被験者または試料の重量１ｋｇ当たりの小分
子のｍｇまたはμｇである（例えば約１μｇ／ｋｇ〜約
５００ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋ
ｇ、または約１μｇ／ｋｇ〜約５０μｇ／ｋｇ）。小分
子の適用量は、調節すべき発現または活性に関する小さ
な分子の効力に基づいて更に理解される。本発明のポリ
ペプチドまたは核酸の発現または活性を調節するために
１または複数の上記小分子が動物（例えばヒト）に投与
する場合、医者、獣医または研究者は、例えば最初は比
較的低用量を処方して、続いて適切な応答が得られるま
で用量を増加させることができる。さらに、任意の特定
の動物被験者に対する特定の用量レベルは、使用する特
定の化合物、年齢、体重、健康状態、性別および被験者
の食事、投与時間、投与経路、排泄速度、任意の薬物の
組み合わせ、および調節すべき発現または活性の程度を
含めた様々な要因に基づいて決まることが理解される。
【００７５】医薬組成物は投与のための説明書と一緒
に、容器、パックまたはディスペンサに入れることがで
きる。以下の特定の実施例は、単に例示であって、如何
様にも本開示の残りを制限するものではない解釈すべき
である。これ以上詳述しなくとも、当業者は、本明細書
の記載に基づいて、最大限に本発明を使用することがで
きると考えられる。ここに引用した特許を含めた刊行物
は、すべて引用によりその全体が本明細書に組み込まれ
る。
【００７６】（実施例）方法 細胞株および培養条件 ヒト肺腺癌細胞株ＣＬ１−０、
ＣＬ１−１、ＣＬ１− ５およびＣＬ１−５−Ｆ４を、１
０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、メリーランド
州ゲーサーズバーグ）と２ｍＭ Ｌ−グルタミン（ＧＩ
ＢＣＯ−ＢＲＬ、メリーランド州ゲーサーズバーグ）を
含んだＲＰＭＩ−１６４０培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、
メリーランド州ゲーサーズバーグ）において３７℃、２
０％Ｏ２、５％ＣＯ２にて成長させた。ＣＬ１−０は親
細胞株であり、ＣＬ１−１とＣＬ １−５は、Ｔｒａｎｓ
ｗｅｌｌ侵入チャンバ内でＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｌｌ
ａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｂｅｃｔ
ｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、マサチューセッツ州ベッド
フォールド）を備えたポリカーボネート膜コーティング
によるインビトロ選択によってＣＬ１−０から選択され
た亜株である（Ｃｈｕら（１９９７）Ａｍ Ｊ Ｒｅｓ
ｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １７：３５３−
６０）。ＣＬ１−５細胞を、重度の複合免疫不全マウス
の尾静脈に注入し、その後、細胞株をマウスの肺で形成
された腫瘍から分離し、クローニングした。インビトロ
選択を４回繰返した後、細胞株をＣＬ１−５−Ｆ４と名
付けた。付着細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ
社、ドイツダイゼンホーフェン）を使用して、培養皿か
ら分離した。機能アッセイに先立って、０．０２％ＥＤ
ＴＡを細胞表面抗原の破壊を回避するために他の選択肢
として使用された。
【００７７】マイクロアレイ分析 ナイロン膜での９６
００個の特徴アレイを用いたマイクロアレイ実験を、Ｃ
ｈｅｎらによって記載されたように熱量計の検出方法を
使用して行った。Ｃｈｅｎら（１９９８）Ｇｅｎｏｍｉ
ｃｓ ５１：３１３−２４およびＨｏｎｇら（２００
０）Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉ
ｏｌ ２３：３５５−６３を参照されたい。簡単に説明
すると、各細胞株を８０％コンフルエントまで成長さ
せ、培養細胞を新鮮な培地に変えた２４時間後に、ｍＲ
ＮＡを単離した。細胞のインキュベータからの除去と溶
解との間の時間は最小限にした。細胞全ＲＮＡを、ＲＮ
Ａｚｏｌ Ｂ（Ｂｉｏｔｅｃｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ，テキサス州ヒューストン）を使用して、変性グア
ニジニウムチオしアネート−フェノール−クロロホルム
抽出法を用いて細胞から抽出した。伝令ＲＮＡを、ｏｌ
ｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツヒル
デン）を使用して抽出した。各肺癌細胞株に由来する５
μｇのｍＲＮＡを逆転写し、ビオチンで標識した。二本
鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ターゲットを担持した膜
を、ハイブリダイゼーションの前に、６８℃で１時間、
７ｍＬのハイブリダイゼーション緩衝液（５×ＳＳＣ、
０．１％ Ｎ−カウロイルサルコシン、０．１％ＳＤ
Ｓ、Ｒａｄｉｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌｓ製の１％のブロック試薬混合物、および５０
ｐｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ）でプレハイブリダイズし
た。サケ精子ＤＮＡの代わりにヒトＣＯＴ−１ ＤＮＡ
を含む８０μＬのハイブリダイゼーション溶液と、ｃＤ
ＮＡプローブを、ハイブリダイゼーションバッグ中でマ
イクロアレイにより密閉した。ハイブリダイゼーション
後に、膜を、７００Ｘ希釈ＳＴＲＥＰ−ＧＡＬ（１．３
８Ｕ／ｍＬ、酵素活性）（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）、４％
ポリエチレングリコール８０００（Ｓｉｇｍａ）およ
び１×ＴＢＳ緩衝液中の３％ＢＳＡを含む１ｍＬ混合物
で２時間インキュベートした。その後、発色進展反応
を、２０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１ＸＰＢＳによって停止
した。定量化は、社内で書かれＡｃａｄｅｍｉａ Ｓｉ
ｎｉｃａ（台湾、台北）より入手可能なＭｕＣＤＡプロ
グラムを用いて行った。プログラムは、各スポットの積
分密度を測定し、積分密度データに関する回帰分析を行
い、差分的に発現された遺伝子として統計アウトライア
ーを定めることにより、差分的に発現された遺伝子を分
離する。
【００７８】分子クローニングとプラスミド構築物 Ｒ
ＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ ＲＴａｓｅ（Ｇ
ＩＢＣＯ−ＢＲＡ メリーランド州ロックヴィル）およ
び任意のランダムプライマーを使用して逆転写した。完
全ヒトＣＲＭＰ−１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番
号Ｄ７８０１２）コード領域をコードするｃＤＮＡを、
ＣＬ１−０のｃＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。プラ
イマー配列は以下の通りだった：５’プライマー：５’
−ＣＴＣＣＧＴＣＣＧＴＧＴＣＴＣＴＡＴＣＣ−３’
（配列番号３、Ｄ７８０１２の２４−４３ヌクレオチ
ド）；３’プライマー：５’−ＣＣＴＣＣＡＴＣＡＧＣ
ＡＣＣＡＡＣＴＡＡＡ（配列番号４、Ｄ７８０１２のヌ
クレオチド１９５５−１９７５）。反応混合物を、９４
℃で３０秒間変性し、５５℃で３０秒間アニールし、７
２℃で３分間伸長させた。これらの反応を、３のサイク
ル繰り返した。１９５２ｂｐのＣＲＭＰ−１ ｃＤＮＡ
フラグメントを、製造業者の説明書（ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅ
ａｓｙクローニングキット；Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィス
コンシン州マディソン）によりＴＡベクターに入れてク
ローニングした。シーケンス解析により、ＣＲＭＰ−１
ｃＤＮＡについて公表された配列に対する１００％の
相同性が示された（（Ｈａｍａｊｉｍａら、（１９９
６）Ｇｅｎｅ １８０：１５７−６３。
【００７９】ｐＣＩｎｅｏ−ＣＲＭＰ−１を、ｐＣＩ−
ｎｅｏ哺乳類発現ベクターのＥｃｏＲＩとＮｏｔＩ部位
の間にＣＲＭＰ−１ ｃＤＮＡ（Ｄ７８０１２の２４−
１９７５ヌクレオチド）を挿入することにより作成し
た。（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソ
ン）。融合タンパク質の生産のためのｐＲＳＥＴ−ＣＲ
ＭＰ−１を構築するために、部分長ＣＲＭＰ−１ ｃＤ
ＮＡ（ヌクレオチド３７６−１９７５）を、ｐＲＳＥＴ
Ｃ原核生物発現ベクター（Ｉｎｖｉｒｏｇｅｎ、カリ
フォルニア州カールスバッド）のＰｓＩとＥｃｏＲ Ｉ
部位に挿入した。 ＣＲＭＰ−１ ｃＤＮＡ（ヌクレオ
チド１５１−１８６９）のコード領域を、ｐＣＩｎｅｏ
−ＣＲＭＰ−１プラスミドからＰＣＲにより増幅した。
順方向プライマー５’−ＡＴＴＧＡＣＴＣＧＡＧＡＴＧ
ＴＣＧＴＡＣＣＡＧＧＧＣＡＡＧＡＡ（配列番号５）は
ＣＲＭＰ−１配列からのヌクレオチド１５１−１７０を
含み、Ｘｈｏ Ｉ部位（下線）を導入した。逆方向プラ
イマー５’−ＡＴＡＴＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＣＣＧＡ
ＧＧＣＴＧＧＴＧＡＴ（配列番号３）はヌクレオチド１
８５２−１８６９に相補的であり、ＥｃｏＲＩ部位（下
線）を導入した。タンパク質局在化研究では、増幅した
ＣＲＭＰ−１フラグメントを、ＣＭＶプロモーター駆動
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現ベクター−ｐＥＧＦ
Ｐ−Ｃ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロア
ルト）のＸｈｏおよびＥｃｏＲ Ｉ部位にインフレーム
で挿入し、ｐＥＧＦＰ−ＣＲＭＰ−１を生成した。これ
らの構築物をプラスミドクローンから分離し、自動配列
決定装置（ＡＢＩ３７７型、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシテ
ィ）を用いて二本鎖ＤＮＡの両方の鎖に関して配列決定
した。
【００８０】モノクローナル抗体の生産 ｐＲＳＥＴ−
ＣＲＭＰ−１をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株Ｂ
Ｌ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに入れて形質転換した。融
合タンパク質（Ｈｉｓ−ＣＲＭＰ（アミノ酸７６−５７
２）と称する）が封入体として得られた。封入体を可溶
化し、１２．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動で精製した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢）に、０．
１ｍＬの滅菌リン酸緩衝塩類液（ＰＢＳ）に乳化した
０．１ｍＬフロイント完全アジュバント（Ｌｉｆｅ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニューヨーク州グランド島）
に溶かしたＳＤＳ−ＰＡＧＥ精製融合タンパク質を皮下
注射した。その後、３週間ごとに、マウスに、０．１ｍ
Ｌの滅菌ＰＢＳに乳化した０．１ｍＬのフロイント完全
アジュバント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、
ニューヨーク州グランド島）の融合タンパク質を皮下注
射した。本願発明者らは、ネガティブコントロールとし
て免疫前血清を使用して、ウェスタンブロットによって
抗体力価をチェックした。１匹のマウスからの脾細胞
を、ポリエチレングリコール１５００（Ｒｏｃｈｅ社、
ドイツ国マンハイム）の存在下でマウスミエローマと融
合した。ハイブリドーマを、１５％ＮｕＳｅｒｕｍ（Ｃ
ｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，マサチ
ューセッツ州ベッドフォード）とヒポキサンチン−アミ
ノプテリン−チミジン ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ
州セントルイス）を補給したＤＭＥＭおよびＲＰＭＩ−
１６４０（１：１）培地中で、９５ウェルプレートにて
培養した。上清を、Ｈｉｓ−ＣＲＭＰ（アミノ酸７６−
５７２）融合タンパク質に対するウェスタンブロットに
よってスクリーニングした。
【００８１】ノーザンハイブリダイゼーションおよびウ
ェスタンブロット分析 ０．８％アガロースホルムアル
デヒドゲル上の各レーンに、２０μｇの全ＲＮＡを載
せ、１ＸＭＯＰＳランニングバッファーでの電気泳動
後、ゲルをキャピラリ法によりＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイ
ロンメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ、イギリスバッキン
ガムシアー）にブロットした。ＵＶ架橋形成後に、メン
ブレンを、５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、５
０ｍＭ ＮａＰＯ４（ｐＨ６．２）、１００μｇ／ｍＬ
サケ精子ＤＮＡおよび５０％脱イオン化ホルムアミド中
で４２℃で４時間、プレハイブリダイズした。その後、
メンブレンを、Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ ＤＮＡ標識システ
ム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、イギリスバッキンガムシアー）
を使用して合成した３２Ｐ標識ＤＮＡプローブでハイブ
リダイズした。ハイブリダイゼーションは、５×ＳＳ
Ｃ、５×Ｄｅｒｎｈａｒｄｔ溶液、１０％硫酸デキスト
ラン、２０ｍＭ ＮａＰＯ４（ｐＨ６．２）、１００ｐ
ｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡおよび５０％脱イオン化ホルム
アミド中で４２℃で１８時間行った。メンブレンを、２
ＸＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中で室温にて１５分間、
２回洗浄し、０．１ＸＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で
５２℃にて３０分間、２回洗浄した。メンブレンを−７
０℃で一晩Ｘ線フィルムに露出した。各レーンのＲＮＡ
の量を、Ｇβ様プローブ（ＲＮＡ量の内部コントロール
として使用されるハウスキーピング遺伝子）のシグナル
強度との比較によって比較した。シャンら、（１９９
２）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２：５６２０−３
１を参照のこと。
【００８２】全細胞溶菌液（５μｇタンパク質）を１
２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。また、そ
の細胞溶菌液を、電気泳動装置によりポリビニリデンジ
フルオリドメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐメンブ
レン、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、マサチューセッツ州ベッ
ドフォード）に移した。０．１％Ｔｗｅｅｎ２Ｏ中５％
スキムミルクとしたＰＢＳ溶液でブロッキング後、メン
ブレンに結合したタンパク質を、モノクローナル抗体で
プローブした。メンブレンは洗浄し、ホースラディッシ
ュペルオキシダーゼ共役抗マウス２次抗体（Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ社、イギリスバーミングシアー）を加えた。タン
パク質バンドは、増強化学発光アッセイキット（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ社、イギリスバーミングシアー）およびＸ線
フィルムで検出した。
【００８３】トランスフェクションと選択 ５μｇのｐ
ＣＩｎｅｏ−ＣＲＭＰ−１プラスミドを、以前に記載さ
れたように、２０Ｕ リポフェクトアミン試薬（Ｇｉｂ
ｃｏ−ＢＲＬ、メリーランド州ロックヴィル）を用いて
７０％コンフルエントなＣＬ １−５細胞にトランスフェ
クトした。ＣＬ１−５細胞は、コントロール（偽形質移
入体）としてインサートを含まないｐＣＩ−ｎｅｃベク
ターでもトランスフェクとした。ゲンタマイシンＧ４１
８（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、メリーランド州ロックヴィ
ル）を、安定した形質移入体の選択のために５００μｇ
／ｍＬの濃度まで加えた。選択培地は３日ごとに３週間
交換した。耐性細胞クローンを、さらなるキャラクタリ
ゼーションのために分離し、拡張した。染色体ＤＮＡへ
のトランスフェクトされたプラスミドＤＮＡの組込み
は、ノーザンハイブリダイゼーションにより確認した。
一時的なトランスフェクションの場合、ＣＬ１−０およ
びＣＬ １−５細胞の７０％コンフルエント培養物をリポ
フェクトアミン試薬によりｐＥＧＦＰ−ＣＲＭＰ−１プ
ラスミドを用いてトランスフェクションした。４８時間
後に、生細胞を直接検査し、ＭＲＣー１０００レーザ走
査共焦イメージングシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、ニュ
ーヨーク州ロックヴィルセンター）を装備した落射蛍光
顕微鏡を使用して写真撮影した。Ｈｏｎｇら（２００
０）Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉ
ｏｌ ２３：３５５−６３を参照のこと。
【００８４】インビトロ侵入分析および細胞増殖アッセ
イ トランスフェクトしたクローンの侵入性を、膜侵入
培養システム（ＭＩＣＳ）（Ｃｈｕら（１９９７）Ａｍ
ＪＲｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２
３： ３５５−６３）を使用して検査した。ＭＩＣＳシ
ステムでは、１０μｍ孔を含むポリカーボネート膜（Ｎ
ｕｃｌｅｏｐｏｒｅ社、カリフォルニア州プレザント
ン）を、５ ｍｇ／ｍＬＭａｔｒｉｇｅｌの混合物でコ
ートした。膜を、ＭＩＣＳチャンバプレートの上部と下
部の間に置いた。細胞を１０％ＮｕＳｅｒｕｍを含むＲ
ＰＭＩ−１６４０に懸濁し、チャンバの上部ウェルに撒
いた（２．５×１０４細胞／ウェル）。３７Ｃで４８時
間インキュベートした後、コートした膜に侵入した細胞
を、１ｍＭ ＥＤＴＡ ＰＢＳ溶液を用いて下部ウェル
から除去し、３μｍ孔を備えたポリカーボネート膜上に
ブロットした。ブロットした細胞を、ヨウ化ピロピジウ
ム（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）で染色し、
各ブロットにおける細胞数を、顕微鏡（５０倍）下でＰ
Ｃソフトウェア（Ｔｈｅ ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＩｍａ
ｇｉｎｇ Ｓｔａｔｉｏｎ社、カナダオンタリオ州）を
使用して計数した。各実験は、三連にした各試料につい
て３回行った。
【００８５】細胞増殖を、修飾３−（４，５−ジメチル
チアゾール−２−イル）臭化ジフェニルテトラゾリウム
（ＭＴＴ）アッセイを使用して測定した。例えば、Ｄｅ
ｎｉｚｏｔら（１９８６）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ８９：２７１−７参照。細胞を培養培地（１０
０μＬ）中で１つのウェル当たり４０００個の細胞にし
て９６ウェルプレート上に接種した。プレートを４日間
までインキュベートした。ＭＴＴでは、１０μＬのＭＴ
Ｔ溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに加え、細胞を４時
間、３７度で培養した。その後、１００μＬの０．０４
Ｎ ＨＣｌイソプロパノール溶液を各ウェルに加え、細
胞内に生じた有色の結晶を溶解するために激しく混合し
た。５７０ｎｍにおける吸光度と参照波としての６３０
ｎｍにおける吸光度を、多重ウェル走査分光光度計（Ｔ
ｉｔｅｒｔｅｋ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ、Ｆｌｏｗ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バージニア州マクリーン）によ
って測定した。細胞の生存能力を、トリパンブルー染料
排除試験により検査した。各データの点は、各実験の少
なくとも３つのレプリカからの６つの決定の平均を示
す。
【００８６】Ｆ−アクチン染色 カバーグラス上で生育
した細胞を、ＰＢＳ で３回洗浄し、３．７％パラホル
ムアミド ＰＢＳ溶液で１０分間固定し、０．１％Ｔｒ
ｉｔｏｎＸ−１００ ＰＢＳ溶液を使用して浸透化し
た。非特異結合部位を、５％無脂肪乳のＰＢＳ溶液で１
５分間処理することによりブロックした。ＰＢＳでの５
分間の洗浄後、細胞を、ローダミン共役ファロイジン
５Ｕ／ｍＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ，オレゴ
ン州ユージーン）と共に３０分間でインキュベートし
た。ＰＢＳを洗浄した後、細胞を、２％ｎ−没食子プロ
ピル、６０％グリセリンのＰＢＳ溶液（ｐＨ８．０）を
含む封入剤を使用して、スライドに載置した。細胞をＺ
ｅｉｓｓ Ａｘｉｐｈｏｔ落射蛍光顕微鏡を使用して、
検査し、写真撮影した。また、Ｋｏｄａｋ Ｔ−ｍａｘ
４００を使用してイメージを撮った。
【００８７】患者と標本 １９９４年９月〜１９９６年
１２月の間の国立台湾大学病院で、非小細胞の肺癌に対
する切除を行った８０人の連続する患者が、研究に含ま
れていた。この調査は、全国台湾大学病院の施設内倫理
委員会による承認後に行った。インフォームドコンセン
トの文書を、すべての患者から得た。どの患者も、外科
手術前に、ネオアジュバント化学療法または放射線療法
を受けていなかったので、腫瘍組織試料は初めて処理さ
れたものであった。肺癌組織の標本、および外科手術で
得られた肺の非腫瘍部分を、液体窒素に入れて直ちに急
速凍結し、使用するまで−８０℃で保存した。組織学的
分類は、世界保健機構の基準（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔ
ｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（１９８２）Ａｍ Ｊ
ＣｌｉｎＰａｔｈｏｌ ７７ １２３−３６）により行
った。腫瘍サイズ、局所的侵入およびリンパ節転移を病
理学的検査で決定した。最終の疾病段階は、肺癌用の現
行の腫瘍−節−転移系に従って、外科学的および病理学
的知見を組み合わせることにより決定した（Ｍｏｕｎｔ
ａｉｎ（１９９７）Ｃｈｅｓｔ１１１：１７１０−
７）。患者は、５１人の男性と２９人の女性（平均年齢
６２．９±１０．５才）から成った。これらの患者の３
８人が扁平上皮癌を有し、４２人が腺がんを有してい
た。疾病の外科−病理学段階は、３１人の患者ではＩ、
１９人の患者ではＩＩ、２４人の患者ではＩＩＩ、およ
び６人の患者ではＩＶの段階であった。腫瘍の状態は１
５人の患者でＴ１であり、４２人の患者でＴ２であり、
９人の患者でＴ３であり、１４人の患者でＴ４であっ
た。４２人の患者はリンパ節転移（ＮＯ）を有しておら
ず、３８人は部分的転移または縦隔リンパ節転移（１９
人の患者でＮ１、１８人の患者でＮ２、１人の患者でＮ
３）を有していた。フォローアップデータを、患者の医
療カルテから手に入れ、本願発明者らの腫瘍登録サービ
スから報告した。６．５〜７０か月に及ぶフォローアッ
プを、２０００年６月まで続けた。再発時間を、手術の
日から局所再発または全身転移の検出の日までで計算し
た。生存時間は、手術の日から死亡の日までで計算し
た。再発時間は２〜４２か月（中間：１１．０か月）に
及び、生存時間は６．５〜５３か月（中間：２０．５か
月）に及んだ。外科手術後３０日以内に合併症で死亡し
た患者は、生存分析から排除した。
【００８８】リアルタイム定量的逆転写ポリメラーゼ連
鎖反応 全ｍＲＮＡを、ＤＮＡ抽出キット（ＲＮｅａｓ
ｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア
州バレンシア）を使用して、切除した癌組織から抽出し
た。ＲＮＡ試料の質は、アガロースゲル電気泳動により
決定し、臭化エチジウム染色し、１８Ｓおよび２８ＳＲ
ＮＡバンドをＵＶ光線下で視覚化した。リアルタイム定
量的ＲＴ−ＰＣＲに使用する標準カーブ試料は、２５０
ｎｇ、５０ｎｇ、１０ｎｇおよび２ｎｇの範囲をカバー
する特定のＲＮＡ試料の連続希釈によって調製した。連
続希釈試料を等量に分け、使用するまで−８０℃で保存
した。ＣＲＭＰ−１のｃＤＮＡ配列に基づき、ＣＲＭＰ
−１ ｍＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲに使用するプライ
マーを以下の通りにした：（１）正方向プライマー
（５’−ＣＣＡＣＧＡＴＧＡＴＣＡＴＴＧＡＣＣＡＴＧ
Ｔ−３’（配列番号７、エクソン３）および（２）逆方
向プライマー（５’−ＡＧＧＧＡＧＴＡＡＴＣＡＣＡＣ
ＡＧＣＡＧＧＡＴＴＴＧ−３’（配列番号８、エクソン
４）（Ｔｏｒｒｅｓ（１９９８）ＤＮＡ Ｒｅｓ ５：
３９３−５）。ＲＴ−ＰＣＲ産物を検出および定量化す
るために使用されたプローブの配列は、ＦＡＭ（カルボ
キシフルオロセイン）５’−ＡＧＣＣＴＡＣＴＧＡＣＣ
ＴＣＴＴＴＣＧＡＧＡＡＧＴＧＧＣＡ−３’（Ｎ，Ｎ，
Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミ
ン）（配列番号９であった）。この配列は、ＣＲＭＰ−
１ ｃＤＮＡに特異的であり、ＣＲＭＰ−１のゲノムＤ
ＮＡの汚染からＰＣＲ産物の定量化を回避するために、
エクソン３−エクソン４接合にまたがるように選択し
た。ＴＢＰｍＲＮＡ（内部コントロール、ＧｅｎＢａｎ
ｋアクセッション番号Ｘ５４９９３）定量的ＲＴ−ＰＣ
Ｒのために使用されたプライマーおよびプローブは、Ｂ
ｉｅｃｈｅら（１９９９）Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ４５：
１１４８−５６によって記述された通りであった。ＰＣ
Ｒ産物の同一性を、ＤＮＡ塩基配列決定により確認し
た。各アッセイは、標準曲線、テンプレートを含まない
コントロール、三連にした全ＲＮＡ試料を含んでいた。
反応条件は、先に記述した通りとした（ユアンら（２０
００）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ ＣｒｉｔＣａｒｅ
Ｍｅｄ １６２：１９５７−６３）。リポーター染料に
よって発された蛍光を、ＡＢＩプリズム７７００配列決
定システム（カリフォルニア州フォスターシティ）を使
用して、オンラインでリアルタイムで検出した。
【００８９】統計解析 適当な場合、データは平均±標
準偏差（ＳＤ）として示される。統計解析はすべてＳＰ
ＳＳバージョン８．０で行った。群間のデータの比較
は、スチューデントｔ検定で行った。腫瘍試料とペアの
正常組織との間のＣＲＭＰ−１ｍＲＮＡ発現の−ΔＣＴ
を比較するためには、ペアードケンドールＷ検定を使用
した。ＣＲＭＰ−１ ｍＲＮＡ発現が高いかまたは低い
腫瘍（および患者）の臨床病理学的特性と比較するため
には、フィッシャーの正確検定およびスチューデントｔ
検定を使用した。生存曲線をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ
法によって得、低いＣＲＭＰ−１発現群と高いＣＲＭＰ
−１発現群間の再発時間の差は、生存の差と同様に、ｌ
ｏｇランク試験で分析した。すべての統計試験は両側で
行った。０．０５より小さいＰ値を統計的に有意である
とみなした。
【００９０】結果 ｃＤＮＡμアレイによる差分的に発現したＣＲＭＰ−１
ｍＲＮＡの同定 比色検出によるｃＤＮＡマイクロア
レイを用いて、種々の程度の侵入特性を有する肺癌細胞
株（ＣＬ１−０、ＣＬ１−１、ＣＬ１−５およびＣＬ
１−５−Ｆ４）の差分的に発現した遺伝子を度と同定し
た。それらの４つの細胞株は異なる程度に侵入性であ
る。侵入性により順序付けると、その４つの細胞株は以
下の傾向に従う：ＣＬ１−０＜ＣＬ１−１＜ＣＬ１−５
＜ＣＬ１−５−Ｆ４。ｃＤＮＡマイクロアレイのすべて
の実験は、３回行った。細胞株を３回の独立した培養液
で生育し、全プロセスを、ＲＮＡ抽出からイメージ分析
まで独立して行った。実験の標準偏差は７．３％であっ
た。ｃＤＮＡマイクロアレイデータのクラスター分析
は、約５００個の遺伝子が癌細胞の侵入性と陽性または
陰性に関連することを明らかにした。これらの遺伝子の
大半は、血管形成、細胞運動、接着および増殖に関与し
ていた。その中でも、ＣＲＭＰ−１ ｍＲＮＡ発現は細
胞株の侵入性と陰性に関連していた。
【００９１】ノーザンハイブリダイゼーションにより、
ＣＲＭＰ−１のＣＬ１−５およびＣＬ１−５−Ｆ４での
発現レベルが、ＣＬ１−０およびＣＬ１−１に比べて劇
的に減小することが確認された。ｍＲＮＡレベルでのＣ
ＲＭＰ−１の差分的発現がタンパク質レベルでも反映さ
れていることを確認するために、ウェスタンブロット分
析を、ＣＲＭＰ−１に対する特異的なモノクローナル抗
体−Ｙ２１を使用して行った。モノクローナル抗体−Ｙ
２１は、ＣＲＭＰ−１は認識するが、他のＣＲＭＰは認
識しなかった。ＣＬ１−５およびＣＬ１−５−Ｆ４での
ＣＲＭＰ−１の発現の減小が、一貫して観察された。
【００９２】ＣＥＭＰ−１の過剰発現はインビトロで癌
細胞の侵入を阻害することができる。侵入の表現型とＣ
ＲＭＰ−１発現間に因果関係が存在するかどうかを調べ
るために、ｐＣＩ−ｎｅｏベクター中にＣＲＭＰ−１
ｃＤＮＡを宿したプラスミド構築物を作成し、ＣＬ
１−５にトランスフェクトし、ＣＲＭＰ−１を安定に発
現した５個のクローンを単離した。偽形質移入体および
ＣＲＭＰ−１ ｃＤＮＡをトランスフェクトしたクロー
ン（Ｂ５、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１０およびＣ２２）中のＣＲ
ＭＰ−１発現を分析するために、ノーザンハイブリダイ
ゼーションを行った。ＣＲＭＰ−１ ｃＤＮＡの完全長
コード領域（１．９５ｋｂ）をプローブとして使用し
た。ＣＲＭＰ−１をトランスフェクトした５個のクロー
ンはすべて、ＣＲＭＰ−１ ｍＲＮＡ転写物を発現して
いた。対照的に、偽形質移入ＴＩＡはいかなる検出可能
なＣＲＭＰ−１も有していなかった。ＲＮＡの質に対す
る内部コントロールとして、Ｇβプローブを使用した。
偽形質移入体中およびＣＲＭＰ−１をトランスフェクト
した５個のクローンのＣＲＭＰ−１発現を分析するため
に、ウェスタンブロットも行った。ＣＲＭＰ−１モノモ
ノクローナル抗体−Ｙ２１を一次抗体として使用した。
ＣＲＭＰ−１タンパク質は、ＣＲＭＰをトランスフェク
トしたクローンでは発現していたが、偽形質移入体では
発現していなかった。インビトロ再構築基底膜侵入アッ
セイを使用して、ＣＲＭＰ−１発現が癌細胞侵入に影響
を及ぼすかどうかを測定した。ＣＲＭＰ−１の発現は、
ＣＬ１−５細胞でのインビトロ侵入能力を抑制した。偽
形質移入体とＣＲＭＰ−１−トランスフェクトクローン
（Ｂ５、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１０およびＣ２２）の間の相対
的な侵入性の比較を容易にするために、すべての値を、
偽形質移入体（１００％）に対する相対的な侵入能力の
パーセントに正規化した。各クローンを、三連で３回測
定した。４８時間のインキュベーション後、侵入可能性
の有意な減小（４０％〜６０％）が、ＣＲＭＰ−１を発
現しているクローンに見出された（ｐ＜０．０１）。し
かしながら、それを超えるとさらなる侵入の抑制は生じ
ないという、ＣＲＭＰ−１の閾値があった。
【００９３】腫瘍細胞は、侵入および転移するためには
複雑な一連のステップを終えなければならず、その最も
基本的なステップの１つが細胞増殖である。修飾ＭＴＴ
アッセイを使用して、ＣＲＭＰ−１形質移入体および偽
形質移入体のインビトロ細胞増殖速度を測定した。イン
ビトロ増殖は、ＣＲＭＰ−１の発現の変化によっては有
意に変化しなかった。これは、ＣＲＭＰ−１が、細胞増
殖の制御以外の機構で、細胞侵入を調節している可能性
があることを示した。
【００９４】ＣＲＭＰ−１過剰発現細胞でのＦ−アクチ
ンポリマー重合の変化 Ｆ−アクチンは、運動型細胞に
おいて、連続的に重合および解重合する（Ｓｙｍｏｎｓ
＆Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ（１９９１）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉ
ｏｌ １１４：５０３−１３）。アクチンポリマー重合
は、運動型細胞の層状突起と一時的かつ空間的に関連
し、細胞運動（Ｃｏｐｅｒ（１９９１）Ａｎｎ Ｒｅｖ
Ｐｈｙｓｏｌ ５３：５８５−６０５）の過程に重要
な役割を果たす。そのため、腫瘍侵入に影響を及ぼす。
ファロイジンは、フィラメント中のサブユニットにはし
っかり結合するが、モノマーには結合しない。ＣＬ
１−０、ＣＬ１−１、ＣＬ１−５およびＣＬ１ −５−Ｆ
４を、ローダミン共役ファロイジンで染色し、細胞を、
蛍光顕微鏡下で観察した。糸状仮足の量は、ＣＬ１−０
ではＣＬ1-5 またはＣＬ１−５−Ｆ４よりもはるかによ
り少なかった。トランスフェクトした細胞クローンのＦ
−アクチンも染色した。ＣＲＭＰ−１トランスフェクト
細胞は、侵入性がより低い細胞株ではより高い発現レベ
ルを有しており、円形であることが観察された。親ＣＬ
１ −５と同じく、多数の糸状仮足が偽形質移入体で検出
された。興味深いことに、ＣＲＭＰ−１でトランスフェ
クトしたＣＬ１−５では、糸状仮足の突起の著しい減少
を示した。
【００９５】細胞内のＣＲＭＰ−１の動的分布およびＣ
ＲＭＰ−１の有糸分裂紡錘体との会合 細胞周期の異な
る段階中でのＣＲＭＰ−１の細胞内局在化を決定するた
めに、ＣＬ１−０およびＣＬ１−５における増強した緑
色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）でタグ付けしたＣＲＭＰ
−１を発現するよう、ＣＲＭＰ−１ ｃＤＮＡの完全長
コード領域を哺乳類の形質移入ベクターに入れてクロー
ニングした。レーザ走査共焦顕微鏡によって得られた蛍
光イメージにより、ＣＬ１−０とＣＬ１−５におけるＥ
ＧＦＰでタグ付けしたＣＲＭＰ−１の分布が同じである
ことが明らかとなった。分裂期では、ＣＲＭＰ−１が、
細胞質に広がって分配された。この分布は微小管および
Ｆ−アクチンの分布とは異なっていた。しかしながら、
約ＥＧＦＰ−ＣＲＭＰ−１トランスフェクト細胞の一部
では、ＣＲＭＰ−１は、細胞質にも核にも位置してい
た。前期では、一定のＣＲＭＰ−１タンパク質が中心体
に蓄積した。中期では、ＣＲＭＰ−１の大多数が有糸分
裂紡錘体に強く会合しており、執心対にも集中してい
た。有糸分裂後期では、ＣＲＭＰ−１は、有糸分裂紡錘
体との会合を維持した。非常に遅い終期では、ＣＲＭＰ
−１は中央体で凝縮した。
【００９６】肺癌組織でのＣＲＭＰ−１ ｍＲＮＡの発
現は、肺癌患者での術後の再発および生存と関連する
リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＣＲＭＰ
−１の転写物コピー数を定量化した。閾値サイクル（Ｃ
Ｔ）を、プローブの断裂によって生じ蛍光がベースライ
ンより上の一定の閾値を越えるフラグメント的なサイク
ル数として定義した。選択した閾値では、スタートコピ
ー数が少ないほど、Ｃ Ｔの値がより高くなる。この研究
では、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）ｍＲ
ＮＡを内部コントロールとして使用した（Ｂｉｅｃｈｅ
ら（１９９９）Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ４５：１１４８−
５６）。ＴＢＰ ｍＲＮＡの量に対して標準化された組
織ＣＲＭＰ−１ ｍＲＮＡの相対量を、−ΔＣＴ＝−
［ＣＴＣＲ ＭＰ−１−ＣＴＴＢＰ］として表した。その
後、ＣＲＭＰ−１ ｍＲＮＡコピー／ＴＢＰｍＲＮＡコ
ピーの比を、２−ΔＣＴ×Ｋ（Ｋ：定数）として計算し
た（Ｙｕａｎら（２０００）Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉ
ｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ１６２：１９５７−６３）。８０
個の腫瘍試料すべてにおいて測定されたＣＲＭＰ−１ｍ
ＲＮＡ発現は、隣接する正常組織よりも有意に低かった
（Ｐ＜０．００１、ペアードケンドールＷ検定；両
側）。８０個の腫瘍試料の−ΔＣＴは、−５．６７〜
３．７３に及び、平均は−１．９４±２．１１（平均±
ＳＤ）であり．中央値は−１．９５であった。中央値を
使用して、高発現群と低発現群（表１）として患者を分
類した。低発現群のメンバーは、高発現群より、進展し
た（段階ＩＩＩまたはＩＶ）疾病（Ｐ＜０．０１０）お
よびリンパ節転移（Ｎ１、Ｎ２およびＮ３）（Ｐ＝０．
０４３）（表１）を有する可能性が高かった。また、術
後の再発に対する中央値の時間は、低発現群（１５．９
か月、９５％信頼区間ＣＩ＝８．３−２３．５月）より
も高発現群（３０．５か月、９５％信頼区間ＣＩ＝５．
６−５５．５月）で長かった（ｌｏｇランク検定、Ｐ＝
０．０３０）。高発現群（平均０．５２の生存率）は、
低発現群（生存率の中央値１７．９か月；９５％ＣＩ＝
２０．８３−３５．０月）より有意に長い生存を有して
いた。（ｌｏｇランク検定、Ｐ＝０．０１６）。米国出
願出願番号第６０／３０１，０７５号（２００１年６月
２６日出願）の図１も参照されたい。
【００９７】
【表１】 （その他の実施形態）本明細書に開示されたすべての特
徴は、任意に組み合わせて使用することができる。本明
細書に開示された各々特徴は、同一か、均等か、または
同様な目的に叶う代わりの特徴によって置き換えること
ができる。
【００９８】上記の記述から、当業者は本発明の本質的
特徴を容易に確認することができ、本発明の趣旨および
範囲から逸脱することなく、本発明の種々の変更および
改変を行い、それを様々な使用法および条件に適応させ
ることができる。従って、他の実施形態も、特許請求の
範囲にある。
【００９９】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Yang, Pan-Chyr Shih, Jin-Yuan Chen, Jeremy J. W. Peck, Konan Hong, Tse-Ming Yang, Shuenn-Chen Wu, Cheng-Wen <120> COLLAPSIN RESPONSE MEDIATOR PROTEIN-1 <130> 13098-004001 <140> JP 2002-186463 <141> 2002-06-26 <150> 60/301,075 <151> 2001-06-26 <160> 9 <170> FastSEQ for Windows（登録商標） Version 4.0 <210> 1 <211> 1719 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgtcgtacc agggcaagaa gagcatcccg cacatcacga gtgaccgact cctcatcaaa 60 ggtggacgga tcatcaacga tgaccaatcc ctttatgctg acgtctacct ggaggatgga 120 cttatcaaac aaataggaga gaacttaatc gttcctggtg gagtgaagac cattgaagcc 180 aacgggcgga tggttattcc cggaggtatt gatgtcaaca cgtacctgca gaagccctcc 240 caggggatga ctgcggctga tgacttcttc caagggacca gggcggcact ggtgggcggg 300 accacgatga tcattgacca tgttgttcct gaacctgggt ccagcctact gacctctttc 360 gagaagtggc acgaagcagc tgacaccaaa tcctgctgtg attactccct ccacgtggac 420 atcacaagct ggtacgatgg cgttcgggag gagctggagg tgctggtgca ggacaaaggc 480 gtcaattcct tccaagtcta catggcctat aaggatgtct accaaatgtc cgacagccag 540 ctctatgaag cctttacctt ccttaagggc ctgggagctg tgatcttggt ccatgcagaa 600 aatggagatt tgatagctca ggaacaaaag cggatcctgg agatgggcat cacgggtccc 660 gagggccatg ccctgagcag acctgaagag ctggaggccg aggcggtgtt ccgggccatc 720 accattgcgg gccggatcaa ctgccctgtg tacatcacca aggtcatgag caagagtgca 780 gccgacatca tcgctctggc caggaagaaa gggcccctag tttttggaga gcccattgcc 840 gccagcctgg ggaccgatgg cacccattac tggagcaaga actgggccaa ggctgcggcg 900 ttcgtgactt cccctcccct gagcccggac cctaccacgc ccgactactt gacctcccta 960 ctggcctgtg gggacttgca ggtcacaggc agcggccact gtccctacag cactgcccag 1020 aaggcggtgg gcaaggacaa ctttaccctg atccccgagg gtgtcaacgg gatagaggag 1080 cggatgaccg tcgtctggga caaggcggtg gctactggca aaatggatga gaaccagttt 1140 gtcgctgtca ccagcaccaa tgcagccaag atctttaacc tgtacccaag gaaagggcgg 1200 attgccgtgg gctcggatgc cgacgtggtc atctgggacc ccgacaagtt gaagaccata 1260 acagccaaaa gtcacaagtc ggcggtggag tacaacatct tcgagggtat ggagtgccac 1320 ggctccccac tagtggtcat cagccagggc aagatcgtct ttgaagacgg aaacatcaac 1380 gtcaacaagg gcatgggccg cttcattccg cggaaggcgt tcccggagca cctgtaccag 1440 cgcgtcaaaa tcaggaataa ggtttttgga ttgcaagggg tttccagggg catgtatgac 1500 ggtcctgtgt acgaggtacc agctacaccc aaatatgcaa ctcccgctcc ttcagccaaa 1560 tcttcgcctt ctaaacacca gcccccaccc atcagaaacc tccaccagtc caacttcagc 1620 ttatcaggtg cccagataga tgacaacaat cccaggcgca ccggccaccg catcgtggcg 1680 ccccctggtg gccgctccaa catcaccagc ctcggttga 1719 <210> 2 <211> 572 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ser Tyr Gln Gly Lys Lys Ser Ile Pro His Ile Thr Ser Asp Arg 1 5 10 15 Leu Leu Ile Lys Gly Gly Arg Ile Ile Asn Asp Asp Gln Ser Leu Tyr 20 25 30 Ala Asp Val Tyr Leu Glu Asp Gly Leu Ile Lys Gln Ile Gly Glu Asn 35 40 45 Leu Ile Val Pro Gly Gly Val Lys Thr Ile Glu Ala Asn Gly Arg Met 50 55 60 Val Ile Pro Gly Gly Ile Asp Val Asn Thr Tyr Leu Gln Lys Pro Ser 65 70 75 80 Gln Gly Met Thr Ala Ala Asp Asp Phe Phe Gln Gly Thr Arg Ala Ala 85 90 95 Leu Val Gly Gly Thr Thr Met Ile Ile Asp His Val Val Pro Glu Pro 100 105 110 Gly Ser Ser Leu Leu Thr Ser Phe Glu Lys Trp His Glu Ala Ala Asp 115 120 125 Thr Lys Ser Cys Cys Asp Tyr Ser Leu His Val Asp Ile Thr Ser Trp 130 135 140 Tyr Asp Gly Val Arg Glu Glu Leu Glu Val Leu Val Gln Asp Lys Gly 145 150 155 160 Val Asn Ser Phe Gln Val Tyr Met Ala Tyr Lys Asp Val Tyr Gln Met 165 170 175 Ser Asp Ser Gln Leu Tyr Glu Ala Phe Thr Phe Leu Lys Gly Leu Gly 180 185 190 Ala Val Ile Leu Val His Ala Glu Asn Gly Asp Leu Ile Ala Gln Glu 195 200 205 Gln Lys Arg Ile Leu Glu Met Gly Ile Thr Gly Pro Glu Gly His Ala 210 215 220 Leu Ser Arg Pro Glu Glu Leu Glu Ala Glu Ala Val Phe Arg Ala Ile 225 230 235 240 Thr Ile Ala Gly Arg Ile Asn Cys Pro Val Tyr Ile Thr Lys Val Met 245 250 255 Ser Lys Ser Ala Ala Asp Ile Ile Ala Leu Ala Arg Lys Lys Gly Pro 260 265 270 Leu Val Phe Gly Glu Pro Ile Ala Ala Ser Leu Gly Thr Asp Gly Thr 275 280 285 His Tyr Trp Ser Lys Asn Trp Ala Lys Ala Ala Ala Phe Val Thr Ser 290 295 300 Pro Pro Leu Ser Pro Asp Pro Thr Thr Pro Asp Tyr Leu Thr Ser Leu 305 310 315 320 Leu Ala Cys Gly Asp Leu Gln Val Thr Gly Ser Gly His Cys Pro Tyr 325 330 335 Ser Thr Ala Gln Lys Ala Val Gly Lys Asp Asn Phe Thr Leu Ile Pro 340 345 350 Glu Gly Val Asn Gly Ile Glu Glu Arg Met Thr Val Val Trp Asp Lys 355 360 365 Ala Val Ala Thr Gly Lys Met Asp Glu Asn Gln Phe Val Ala Val Thr 370 375 380 Ser Thr Asn Ala Ala Lys Ile Phe Asn Leu Tyr Pro Arg Lys Gly Arg 385 390 395 400 Ile Ala Val Gly Ser Asp Ala Asp Val Val Ile Trp Asp Pro Asp Lys 405 410 415 Leu Lys Thr Ile Thr Ala Lys Ser His Lys Ser Ala Val Glu Tyr Asn 420 425 430 Ile Phe Glu Gly Met Glu Cys His Gly Ser Pro Leu Val Val Ile Ser 435 440 445 Gln Gly Lys Ile Val Phe Glu Asp Gly Asn Ile Asn Val Asn Lys Gly 450 455 460 Met Gly Arg Phe Ile Pro Arg Lys Ala Phe Pro Glu His Leu Tyr Gln 465 470 475 480 Arg Val Lys Ile Arg Asn Lys Val Phe Gly Leu Gln Gly Val Ser Arg 485 490 495 Gly Met Tyr Asp Gly Pro Val Tyr Glu Val Pro Ala Thr Pro Lys Tyr 500 505 510 Ala Thr Pro Ala Pro Ser Ala Lys Ser Ser Pro Ser Lys His Gln Pro 515 520 525 Pro Pro Ile Arg Asn Leu His Gln Ser Asn Phe Ser Leu Ser Gly Ala 530 535 540 Gln Ile Asp Asp Asn Asn Pro Arg Arg Thr Gly His Arg Ile Val Ala 545 550 555 560 Pro Pro Gly Gly Arg Ser Asn Ile Thr Ser Leu Gly 565 570 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 ctccgtccgt gtctctatcc 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 cctccatcag caccaactaa a 21 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 attgactcga gatgtcgtac cagggcaaga a 31 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 atatcgaatt ctcaaccgag gctggtgat 29 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 ccacgatgat cattgaccat gt 22 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 agggagtaat cacagcagga tttg 24 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 9 agcctactga cctctttcga gaagtggca 29
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ０７Ｋ 16/18 1/68 Ａ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/02 5/00 Ｂ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 シー ジン−ゲン 台湾 チア−イー タ−トウ ストリート ナンバー159−４ (72)発明者 チェン ジェレミー ジェイ．ダブリュ. 台湾 タイジョン シェン フェン−ゲン フォン−ツン ロード レーン 220 ナンバー65 (72)発明者 ペク コーナン 台湾 タイペイ フ−シン エス．ロード セクション ２ レーン 78 アレー 30 ナンバー８ シックスス フロア (72)発明者 ウ ジェン−ブン 台湾 タイペイ ネイ−フ ミン−チャン イー ロード セクション ６ ナンバ ー109 サード フロア (72)発明者 ホン ツェ−ミン 台湾 タイペイ ジョン−シャオ イー ロード セクション ６ ナンバー156 シックスス フロア (72)発明者 ヤン ジュン−チェン 台湾 タイペイ ナン−カン アカデミア シニカ ロード セクション ２ レー ン 61 アレー ２ ナンバー９−１ サ ード フロア Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 CA09 CA12 DA03 EA02 EA04 GA11 GA18 HA14 HA17 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ03 QQ20 QQ53 QR32 QR39 QR41 QR55 QR69 QR77 QR80 QR82 QS12 QS25 QS28 QS34 QS39 QX01 QX10 4B065 AA93X AA93Y AB01 AC14 BA01 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 AA13 AA17 DC50 MA02 ZA161 ZB261 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA40 DA75 EA20 EA50 FA71

Claims (32)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】試料を評価する方法であって、 細胞を含む第１試料中のＣＲＭＰ−１タンパク質または
    ｍＲＮＡのレベルを決定する工程と、 正常細胞を含む第２試料中のＣＲＭＰ−１タンパク質ま
    たはｍＲＮＡのレベルを決定する工程と、 第１試料と第２試料中のＣＲＭＰ−１レベルを比較する
    工程と、 第１試料の前記レベルが第２試料の前記レベルより低い
    場合に、被験者を腫瘍侵入の可能性または腫瘍転移の可
    能性を有するとして分類する工程と、から成る方法。
  2. 【請求項２】第１試料の細胞を試験化合物と接触させ、
    正常細胞は試験化合物と接触さえない細胞である、請求
    項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】第１試料は被験者から得た生検材料であ
    る、請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】前記生検材料は腫瘍またはリンパ節由来の
    ものである、請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】前記被験者はヒトである、請求項３に記載
    の方法。
  6. 【請求項６】被験者を評価する方法であって、 被験者から細胞を得る工程と、 前記細胞のＣＲＭＰ−１タンパク質またはｍＲＮＡの発
    現レベルを決定する工程と、 細胞のＣＲＭＰ−１の前記決定したレベルと、参照細胞
    の発現の参照レベルとの間の類似性の程度を示す特性値
    を決定する工程と、から成る方法。
  7. 【請求項７】ＣＲＭＰ−１タンパク質のレベルが決定さ
    れる、請求項１または６に記載の方法。
  8. 【請求項８】前記決定は、抗体または抗原結合性フラグ
    メントをそれぞれの試料に接触させることから成る、請
    求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】抗体または抗原結合性フラグメントは、配
    列番号２を含むタンパク質に結合する、請求項８に記載
    の方法。
  10. 【請求項１０】ＣＲＭＰ−１ ｍＲＮＡのレベルが決定
    される、請求項１または６に記載の方法。
  11. 【請求項１１】前記決定は、配列番号１にハイブリダイ
    ズするプローブを、ストリンジェントな条件下で前記試
    料と接触させることから成る、請求項１０に記載の方
    法。
  12. 【請求項１２】５０個以下の他の遺伝子または遺伝子産
    物のレベルが決定される、請求項１または６に記載の方
    法。
  13. 【請求項１３】前記参照細胞は、培養された肺腺癌細胞
    である、請求項６に記載の方法。
  14. 【請求項１４】前記特性値は、ハウスキーピング遺伝子
    の発現レベルを使用して正規化することから成る方法に
    よって決定される、請求項６に記載の方法。
  15. 【請求項１５】試験化合物を評価する方法であって、 哺乳動物細胞を試験化合物と接触させる工程と、 試験化合物が該哺乳動物細胞中のＣＲＭＰ−１ ｍＲＮ
    Ａまたはタンパク質のレベルを変化させるかどうか決定
    する工程と、から成る方法。
  16. 【請求項１６】試験化合物は亜鉛フィンガードメインを
    有する、請求項１５に記載の方法。
  17. 【請求項１７】試験化合物は免疫グロブリン可変ドメイ
    ンを有する、請求項１５に記載の方法。
  18. 【請求項１８】試験化合物は核酸を含む、請求項１５に
    記載の方法。
  19. 【請求項１９】試験化合物はミセルかウイルスにより細
    胞に運ばれる、請求項１５に記載の方法。
  20. 【請求項２０】試験化合物は２キロダルトン未満の分子
    量を有している、請求項１５に記載の方法。
  21. 【請求項２１】前記哺乳類細胞を生体外（インビトロ）
    で試験化合物と接触させる、請求項１５に記載の方法。
  22. 【請求項２２】決定する工程の前か、最中か、後に、試
    験化合物と接触させた哺乳動物細胞の侵入性を評価する
    工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
  23. 【請求項２３】前記細胞はＣＲＭＰ−１調節配列に機能
    的にリンクされたレポーター遺伝子有する、請求項１５
    に記載の方法。
  24. 【請求項２４】哺乳動物細胞の侵入性の特性を変化させ
    る方法であって、 配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード
    する異種核酸を、該核酸が翻訳されて配列番号２のアミ
    ノ酸配列を含むポリペプチドが生産される条件下で、哺
    乳動物細胞にて発現させる工程、から成る方法。
  25. 【請求項２５】細胞は発現中、生体外（インビトロ）に
    ある、請求項２４に記載の方法。
  26. 【請求項２６】発現させる工程の前に、該細胞を、前記
    異種核酸を含むウイルスと接触させる工程をさらに含
    む、請求項２４に記載の方法。
  27. 【請求項２７】前記細胞は肺細胞である、請求項２４に
    記載の方法。
  28. 【請求項２８】前記細胞は腫瘍細胞である、請求項２４
    に記載の方法。
  29. 【請求項２９】前記細胞はヒト細胞である、請求項２４
    に記載の方法。
  30. 【請求項３０】前記細胞は転移性腫瘍を有する被験者の
    細胞である、請求項２９に記載の方法。
  31. 【請求項３１】有効量の作用薬と、医薬として許容され
    る担体とを含み、前記作用薬が、（ａ）配列番号２のア
    ミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラ
    グメント、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポ
    リペプチドまたはその機能的フラグメントをコードする
    配列を有する核酸、および（ｃ）ＣＲＭＰ−１の発現を
    調節する試験化合物から成る群より選択される、医薬組
    成物。
  32. 【請求項３２】配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペ
    プチドに結合する抗体であって、Ｙ２１抗体である抗
    体。
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002341090A1 (en) * 2001-09-07 2003-03-24 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Use of a protein of the crmp family for treating diseases related to the immune system
WO2004010106A2 (en) * 2002-07-24 2004-01-29 Ptc Therapeutics, Inc. METHODS FOR IDENTIFYING SMALL MOLEDULES THAT MODULATE PREMATURE TRANSLATION TERMINATION AND NONSENSE MEDIATED mRNA DECAY
WO2004016154A2 (en) * 2002-08-16 2004-02-26 John Wayne Cancer Institute Molecular lymphatic mapping of sentinel lymph nodes
FR2853909A1 (fr) * 2003-04-16 2004-10-22 Galderma Res & Dev Genes du psoriasis
ATE485398T1 (de) * 2006-06-02 2010-11-15 Fraunhofer Ges Forschung Verfahren zu der identifizierung von genetischen markern für sekundärtumore und mittel zur identifizierung, markierung und zur gezielten behandlung von sekundären tumoren
CN101466390B (zh) * 2006-06-15 2014-03-12 优时比制药有限公司 用于治疗难治性癫痫持续状态的肽类化合物
WO2008118350A1 (en) * 2007-03-23 2008-10-02 Advpharma, Inc. Compositions and methods of using crmp-1 and its fragments for treating cancer
US20140199404A1 (en) * 2013-01-11 2014-07-17 Abraxis Bioscience, Llc Method for treating cancer based on level of a nucleoside transporter

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2759701B1 (fr) * 1997-02-19 1999-06-04 Inst Nat Sante Rech Med Utilisation des proteines ulip dans le diagnostic et la therapie des cancers et des syndromes neurologiques paraneoplasiques
US6504010B1 (en) * 1999-06-30 2003-01-07 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US20020172952A1 (en) * 1999-06-30 2002-11-21 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
AU2002218770A1 (en) * 2000-07-11 2002-01-21 Corixa Corporaton Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US7655397B2 (en) * 2002-04-25 2010-02-02 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Selections of genes and methods of using the same for diagnosis and for targeting the therapy of select cancers

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