KR20030004065A - 콜랩신 반응 매개체 단백질-1 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 콜랩신 반응 매개체 단백질-1(CRMP-1)이 종양 전이와 관련이 있다는 발견에 근거한 것이다. CRMP-1 단백질 또는 mRNA의 수준을, 세포내 침입력의 지표 및 세포내 침입력을 변화시키는 시험 화합물의 능력에 대한 지표로서 사용할 수 있다. CRMP-1 단백질의 수준을 변화시켜, 예를 들면, 침입력을 저하시킬 수도 있다.

Description

콜랩신 반응 매개체 단백질-1{COLLAPSIN RESPONSE MEDIATOR PROTEIN-1}
콜랩신 반응 매개체 단백질(CRMPs)은 세마포린/콜랩신-유도 성장 원추 허탈(semaphorin/collapsin-induced growth cone collapse)을 매개할 수 있는 인단백질 계열이며, 이는 축삭 유도 및 신경원 분화와 관련이 있다[참조: 예를 들면, Goshimaet al. (1995)Nature376:509-14; Fukadaet al. (2000)J Biol Chem.275:37957-65; Minturnet al. (1995)J Neurosci15:6757-66; Wang & Stittmatter(1996)J NeuroSci16:6197-207; Byket al. (1996)J Neurosci16:688-710; and Gaetanoet al. (1997)J Biol Chem272:12195-201].
60 내지 66kDa 단백질과 관계있는 CRMP 계열의 5가지 구성원(CRMP-1, CRMP-2, CRMP-3, CRMP-4 및 CRMP-5)은 추구하는 연구 목표가 상이한 여러 다른 실험실에 의해 독립적으로 클론되었다. 이러한 CRMP 계열 단백질에 관해 성상이 확인된 한 가지 기능은 신경 축삭의 반발성 유도 기능이다. 이러한 과정에서의 CRMPs의 기능적 역할에 관해 연구 조사되었다[참조: Quinnet al. (1999)J Neurobiol41:158-64]. CRMPs는 상기 5가지 계열 구성원들 간의 아미노산 서열 상동률이 약 50 내지 70%이고[참조: Hamajimaet al. (1996)Gene180:157-63], 이들은 상호 연합을 통하여 헤테로테트라머(heterotetramer)를 형성하는 것으로 보고되었다[참조: Wang & Stittmatter (1997)J Neurochem69:2261-9]. 그러나, 각각의 CRMPs은 신경계에서의 발생 동안 및 신경원 분화의 신경 성장 인자 유도 반응시 별개의 발현 패턴을 나타낸다[참조: Byk et al. (1998)Eur. J Biochem254:14-24].
CRMP-2는 알츠하이머병 환자의 신경원섬유 엉킴(neurofibrillary tangle)과 연관이 있는 것으로 밝혀졌다[참조: Guet al. (2000)Biochemistry39:4267-75]. CRMP-3과 CRMP-5는 부신생물 신경계 증후군(paraneoplastic neurological syndrome)을 나타내는 작은 세포 폐암 환자의 자가 항체에 의해 인식되었다[참조: Yu et al. (2001)Ann Neurol49:146-54; and Honnorat et al. (1999)Eur J Neurosci11:4226-32].
본 발명은 콜랩신 반응 매개체 단백질-1(CRMP-1)이 몇 가지 종류 이상의 종양 전이와 연관되어 있다는 발견에 근거한 것이다.
CRMP-1 코딩 영역의 예시 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다(서열번호 1):
atgtcgtacc agggcaagaa gagcatcccg cacatcacga gtgaccgact cctcatcaaa 60
ggtggacgga tcatcaacga tgaccaatcc ctttatgctg acgtctacct ggaggatgga 120
cttatcaaac aaataggaga gaacttaatc gttcctggtg gagtgaagac cattgaagcc 180
aacgggcgga tggttattcc cggaggtatt gatgtcaaca cgtacctgca gaagccctcc 240
caggggatga ctgcggctga tgacttcttc caagggacca gggcggcact ggtgggcggg 300
accacgatga tcattgacca tgttgttcct gaacctgggt ccagcctact gacctctttc 360
gagaagtggc acgaagcagc tgacaccaaa tcctgctgtg attactccct ccacgtggac 420
atcacaagct ggtacgatgg cgttcgggag gagctggagg tgctggtgca ggacaaaggc 480
gtcaattcct tccaagtcta catggcctat aaggatgtct accaaatgtc cgacagccag 540
ctctatgaag cctttacctt ccttaagggc ctgggagctg tgatcttggt ccatgcagaa 600
aatggagatt tgatagctca ggaacaaaag cggatcctgg agatgggcat cacgggtccc 660
gagggccatg ccctgagcag acctgaagag ctggaggccg aggcggtgtt ccgggccatc 720
accattgcgg gccggatcaa ctgccctgtg tacatcacca aggtcatgag caagagtgca 780
gccgacatca tcgctctggc caggaagaaa gggcccctag tttttggaga gcccattgcc 840
gccagcctgg ggaccgatgg cacccattac tggagcaaga actgggccaa ggctgcggcg 900
ttcgtgactt cccctcccct gagcccggac cctaccacgc ccgactactt gacctcccta 960
ctggcctgtg gggacttgca ggtcacaggc agcggccact gtccctacag cactgcccag 1020
aaggcggtgg gcaaggacaa ctttaccctg atccccgagg gtgtcaacgg gatagaggag 1080
cggatgaccg tcgtctggga caaggcggtg gctactggca aaatggatga gaaccagttt 1140
gtcgctgtca ccagcaccaa tgcagccaag atctttaacc tgtacccaag gaaagggcgg 1200
attgccgtgg gctcggatgc cgacgtggtc atctgggacc ccgacaagtt gaagaccata 1260
acagccaaaa gtcacaagtc ggcggtggag tacaacatct tcgagggtat ggagtgccac 1320
ggctccccac tagtggtcat cagccagggc aagatcgtct ttgaagacgg aaacatcaac 1380
gtcaacaagg gcatgggccg cttcattccg cggaaggcgt tcccggagca cctgtaccag 1440
cgcgtcaaaa tcaggaataa ggtttttgga ttgcaagggg tttccagggg catgtatgac 1500
ggtcctgtgt acgaggtacc agctacaccc aaatatgcaa ctcccgctcc ttcagccaaa 1560
tcttcgcctt ctaaacacca gcccccaccc atcagaaacc tccaccagtc caacttcagc 1620
ttatcaggtg cccagataga tgacaacaat cccaggcgca ccggccaccg catcgtggcg 1680
ccccctggtg gccgctccaa catcaccagc ctcggttga 1719
CRMP-1의 아미노산 서열은 다음과 같다(서열번호 2):
또한, CRMP-1은 SWISS-PROT entry Q14194, GenBank locus D78012 및 GenBank locus BAA11190에 기재되어 있다. 이는 또한, 디하이드로피리미디나제 관련 단백질-1(DRP-1)로서 지칭된다.
본 발명의 하나의 태양은 치료학적 폴리펩티드를 피검자에게 공급하는 방법을 특징으로 한다. 이러한 방법은 종양 전이를 예방 또는 약화시키거나 이의 진행을 억제시키는 치료가 필요한 피검자를 동정하는 단계; 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산, 또는 이의 작용성 단편을 포함하는 세포를 제공하는 단계; 이러한 사람 세포가 폴리펩티드를 발현하도록 하는 단계;및 이러한 폴리펩티드를 상기 피검자에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 세포는 사람 섬유아세포 등의 사람세포일 수 있다. 상기 피검자는 사람 또는 실험용 동물일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "작용성 단편"은 서열번호 2에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 한 가지 이상의 활성, 예를 들면, 종양 전이를 억제시키는 활성을 지니는 폴리펩티드 또는 핵산을 지칭한다. 특정 단편이 작용성인지의 여부는 해당 단편을 CL1-5폐암종 세포에서 발현시킨 다음, 시험관내에서 재구성된 기저막 침입 검정법으로 상기 형질전환된 세포의 기저막 침입 능력에 대해 평가함으로써 결정할 수 있다. 작용성 단편은 CL1-5폐암종 세포의 침입성 표현형(phenotype)을 억제할 것이다.
CRMP-1 핵산은 (1) 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과 80% 이상이 동일한 서열을 함유하는 핵산; (2) 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 중의 150개 이상의 뉴클레오티드 단편을 함유하는 핵산; (3) 서열번호 2의 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산; 및 (4) 서열번호 2의 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드의 특정 단편(이러한 단편은 서열번호 2의 아미노산 50개 이상을 포함한다)을 코딩하는 핵산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 서열을 갖는다. CRMP-1 폴리펩티드는 (1) 서열번호 2의 아미노산 서열과 80% 이상이 동일한 서열을 함유하는 폴리펩티드; (2) 서열번호 2의 아미노산 50개 이상을 포함하는, 서열번호 2의 아미노산 서열을 함유하는 단편; (3) 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 함유하는 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드; 및 (4) 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과 80% 이상이 동일한 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드로 이루어진 그룹 중에서 선택된 서열을 갖는다. 몇몇 실시 태양에서는, 치료학적 폴리펩티드가 CRMP-1 폴리펩티드와 반응하거나 또는 이와 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합성 단편일 수 있다.
본 발명의 또다른 태양은 피검자의 종양 전이를 치료하는 제1 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 종양 전이를 치료할 필요가 있는 피검자를 동정하는 단계; 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산, 또는 그 작용성 단편을 포함하는 세포를 제공하는 단계; 이러한 세포가 상기 피검자 내의 생체내(in vivo)에서 폴리펩티드를 발현하도록 함으로써, 피검자의 종양 전이를 치료하는 단계를 포함한다.
본 발명의 관련 태양은 피검자의 종양 전이를 치료하는 제2 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 종양 전이를 치료할 필요가 있는 피검자를 동정하는 단계; 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산, 또는 이의 작용성 단편을 포함하고, 종양 전이 증상을 회복시키기에 충분한 양의 폴리펩티드를 발현시키기에 적합한 세포를 상기 피검자에 도입함으로써, 피검자의 종양 전이를 치료하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 태양은 피검자의 종양 침입 잠재력 또는 전이를 진단하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 피검자로부터 샘플을 얻는 단계; 이 샘플에서의 CRMP-1의 발현 수준을 결정하는 단계; 샘플 발현치를 기준(reference) 발현치와 비교하는 단계; 및 샘플 발현치가 기준 발현치 보다 낮을 경우에는 해당 피검자가 종양 침입 잠재력 또는 전이를 나타내는 것으로 분류하는 단계를 포함한다. 샘플 발현치 또는 기준 발현치 각각은 (1) CRMP-1 핵산으로부터 전사된 mRNA; 또는 (2) CRMP-1 폴리펩티드의 존재비(abundance)를 평가한 값이다. CRMP-1 폴리펩티드는, 예를 들어, 항체(예: Y21 항체)를 사용하여 탐지할 수 있다. 이 방법은 또한, (1) 종양을 치료하는 동안 피검자를 모니터하거나, 또는 (2) 피검자의 종양 전이에 대한 치료를 모니터하는데 사용할 수도 있다.
기준 발현치는 임의적이거나, 또는 기준 샘플 또는 기준 상태와 연관된 것일 수 있다. 기준 샘플은 (1) 정상 피검자로부터 얻은 샘플; (2) 시험관내(in vitro) 세포, 예를 들면, 암 세포주(예: 폐 선암종 세포주), 예를 들면, 본원에 기재된 세포주로부터의 샘플; (3) 전이성 질병이 있고 현재 치료가 진행중인 피검자로부터 djedms 샘플; 및 (4) 평가하고자 하는 피검자로부터의 샘플(예를 들면, 초기 샘플 또는 동일한 피검자의 정상 샘플) 중의 하나 이상일 수 있다. 치료를 모니터하는데 있어서, 당해 방법은 샘플 CRMP-1 폴리펩티드 수준 또는 CRMP-1 핵산 발현 수준을, 치료하기 이전 또는 발병 이전의 피검자로부터 수득된 수준과 비교하는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 실시 태양에서는, 피검자 CRMP-1 폴리펩티드 수준 또는 CRMP-1 핵산 발현 수준을 치료 동안 일정 간격(예를 들면, 규칙적인 간격)으로 결정한다.
CRMP-1 유전자 산물 또는 mRNA의 발현 수준은 10, 50, 100 또는 1000개 이상의 기타 유전자 또는 유전자 산물의 발현 수준과 함께 결정할 수 있다. 예를 들면, 2001년 6월 26일자로 출원된 미국 특허원 제60/300,991호에는 그 발현 수준을모니터하는데 유용한 기타 유전자가 기재되어 있다.
본 발명의 또 다른 태양은 종양 전이를 예방하거나 치료하는데 유용한 시험 화합물을 동정하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 세포를 특정 시험 화합물과 접촉시키는 단계; 및 이러한 시험 화합물이 상기 세포에서의 CRMP-1 핵산 또는 CRMP-1 폴리펩티드의 발현을 조절하는지를 결정하는 단계를 포함한다. 상기 시험 화합물은 CRMP-1 폴리펩티드의 작용제(agonist)일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "작용제"는 CRMP-1 폴리펩티드와 결합되는 경우에 CRMP-1의 효과 기간을 연장시키거나 증가시키는 분자를 지칭한다.
상기 시험 화합물은 거대분자 또는 작은 분자, 예를 들면, 분자량이 몰당 약 10,000g 미만인 분자, 분자량이 몰당 약 5,000g 미만인 유기 또는 무기 화합물, 분자량이 몰당 약 1,000g 미만인 유기 또는 무기 화합물, 또는 분자량이 몰당 약 500g 미만인 유기 또는 무기 화합물일 수 있다. 거대분자의 예로는 폴리펩티드, 단백질 복합체 또는 핵산(예: DNA, RNA 또는 펩티드 핵산)를 들 수 있다. 작은 분자의 예로는 펩티드, 펩티도미메틱(peptidomimetic)(예: s 펩토이드), 아미노산, 아미노산 유사체, 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 유사체, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 유기 또는 무기 화합물(예: 헤테로-유기 또는 유기 금속성 화합물)이 있다.
또한, 본 발명은 종양 전이를 치료하기 위한 약제학적 조성물을 특징으로 한다. 이러한 조성물은 유효량의 제제와 약제학적으로 허용되는 담체를 함유한다. 상기 제제는 CRMP-1 폴리펩티드, CRMP-1 핵산, 또는 CRMP-1의 발현 수준을 조절하는 시험 화합물일 수 있는데, 이러한 CRMP-1의 발현은 (1) CRMP-1 핵산으로부터 전사된 mRNA; 또는 (2) CRMP-1 폴리펩티드의 존재비를 평가한 것이다. 본 발명의 약제학적 조성물은 전달제, 예를 들면, 리포솜(liposome) 또는 바이러스성 벡터를 포함할 수 있다. 상기 조성물 또는 전달제를 종양 표적화 부위, 예를 들면, 종양 특이적 항원에 대한 항체에 부착시킬 수 있다. 본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 결합하는 항체를 특징으로 한다. 예를 들면, 이러한 항체는 본원에 기재된 항체, 또는 그 작용성 단편, 예를 들면, 항원 결합성 단편일 수 있다.
본 발명의 다른 태양에서는, 마커(marker) 단백질을 코딩하는 마커 유전자를 포함하는 유전 작제물을 특징으로 한다. 이 마커 유전자는 CRMP-1 조절 서열, 예를 들면, CRMP-1 프로모터에 작동적으로 연결되어 있다. 한 실시 태양에서는, 상기 마커 유전자가 적어도 CRMP-1 코딩 서열 세그먼트와 동일 프레임 내에 융합되어 있다. 이 작제물은 CRMP-1 유전자 발현을 평가하는 방법에 사용할 수 있다. 상기 방법은 이러한 유전 작제물을 포함하는 세포를 시험 화합물과 접촉시키는 단계; 및 마커 단백질의 존재비 및/또는 존재 여부를 평가하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한, 상기 유전 작제물을 포함하는 숙주 세포, 예를 들면, 포유류 세포(예: 폐암종 세포)를 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 범위 내에는, 종양 전이 치료용 약제를 제조하기 위한 상기 언급된 제제의 용도가 포함된다.
본 발명의 한 가지 이상의 실시 태양의 상세 내역이 다음에 기재되어 있다.본 발명의 기타 특징, 목적 및 이점은 본 명세서 및 청구의 범위로부터 명백해질 것이다.
CRMP-1: 전이-관련 유전자
사람 폐 선암종 세포주(human lung adenocarcinoma cell line)로부터, 클론적으로 관계된 세포주를 함유하는 모델 시스템을 개발하였다. 이러한 세포주, 예를 들면, CL1-0및 이의 아세포주(예: CL1-1및 CL1-5)는 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo) 모두에서 서로 상이한 침입 능력을 나타낸다. 종양 전이와 상관있는 유전 결정기를 동정하기 위하여, 9,600개의 상이한 핵산 프로브(probe)를 함유하는 cDNA 마이크로어레이(microarray)를 사용하여 유전자의 mRNA 발현 수준을 확인함으로써, 전이-관련 유전자를 동정하였다. 이와 같이 동정된 전이-관련 유전자 중, CRMP-1 유전자 및 유전자 산물의 발현 수준은 폐암 세포주의 침입 능력과 역 상관관계를 나타내었다. CRMP-1의 발현 수준은 더 높은 침입성을 가진 세포주에서 더 적은 정도로 나타났다. CRMP-1에 대한 특이적 모노클로날 항체를 이용한 노던 혼성화(Northern hybridization) 및 웨스턴 블로팅(Western blotting)을 사용하여 상기의 역 상관관계를 확인하였다. 실시간 정량적 역전사 PCR을 사용하여 몇몇 폐암 조직에서, CRMP-1 발현과 종양 전이의 연관성을 추가로 연구 조사하였다. 높은 침입성을 가진 세포주에서의 형질감염(transfection)에 의한 CRMP-1의 과발현으로 인해, 필라포디아(filapodia) 형성이 저하되고 시험관내 침입 능력이 억제되었다. CRMP-1 폴리펩티드는 세포 내에 기능적으로 분포되어 있고, 유사분열 방추 및 중심체와 함께 국재(localize)될 수 있다. 폐암 조직에서 CRMP-1 mRNA의 발현이 낮다는 것은, 종양이 진행되었고(III 또는 IV기), 림프절 전이되었으며, 초기 수술후 재발되었으며, 생존 기간이 더 짧아졌다는 것과 상당한 연관이 있다.
CRMP-1 폴리펩티드, 핵산 및 CRMP-1-특이적 항체
CRMP-1 폴리펩티드는 각종 과정에 사용할 수 있다. 예를 들면, CRMP-1 폴리펩티드를 사용하여 CRMP-1 폴리펩티드의 기질을 스크리닝하고, CRMP-1 활성을 조절하는 화합물을 스크리닝할 뿐만 아니라, CRMP-1 활성 저하를 특징적으로 나타내는 질병, 예를 들면, 적어도 몇몇 종양 전이(예: 폐암)를 치료할 수 있다.
CRMP-1 폴리펩티드는 표준 단백질 정제 기술을, 예를 들면, 재조합 DNA 발현 기술과 조합하여 사용하여, 세포 또는 조직 공급원으로부터 분리시킬 수 있다. CRMP-1 폴리펩티드는 이종 시스템(heterologous system), 예를 들면, 배양된 세포 또는 형질전환성(transgenic) 동물에서 발현시킬 수 있다. 이종 시스템에서의 발현으로 인해, 본래 세포에서와 실질적으로 동일한 번역후 변형이 일어날 수 있다. CRMP-1 폴리펩티드의 서열은, 예를 들면, 1개 이상 내지 15, 10 또는 5개 미만의 아미노산 잔기가 서열번호 2와 상이할 수 있다. 또 다른 한편, 이는 1개 이상의 잔기 내지 잔기의 20%, 15%, 10% 또는 5% 미만이 서열번호 2에서의 상응하는 서열과 상이하다. 이러한 상이함은 비-필수 잔기에서 이루어진 것이거나 보존적 치환일 수 있다.
보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 갖는 잔기들 간의 상호교환 능력을 지칭한다. 예를 들면, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 루이신 및 이소루이신이고; 지방족-하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 세린 및 트레오닌이며; 아미드 함유 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이며; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 리신, 아르기닌, 및 히스티딘이고; 산성 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 아스파르트산, 글루탐산 및 히스티딘이며; 황 함유 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 상황에 따라서, 동일한 그룹 내의 아미노산을 상호 교환할 수 있다. 몇몇 부가의 보존적 아미노산 치환 그룹은 발린-루이신-이소루이신; 페닐알라닌-티로신; 리신-아르기닌; 알라닌-발린; 및 아스파라긴-글루타민이다.
CRMP-1 핵산을 사용하여, 예를 들면, CRMP-1 폴리펩티드를 발현하고(예를 들면, 숙주 세포 또는 유기체 세포 내에서 발현함), CRMP-1 mRNA(예를 들면, 생물학적 샘플 중의) 또는 CRMP-1 유전자에서의 유전적 변형을 탐지하며, CRMP-1 폴리펩티드 활성을 조절할 수 있다. CRMP-1 핵산은 CRMP-1 폴리펩티드의 일정 부분, 예를 들면, CRMP-1 폴리펩티드의 면역원성 또는 생물학적 활성 부분을 코딩하는 CRMP-1 단편, 또는 CRMP-1 핵산을 탐지 또는 증폭시키기 위한 프로브 또는 프라이머로서 사용될 수 있는 단편을 포함할 수 있다. 이러한 단편은 도메인, 영역 또는 작용성 부위에 상응하는 서열을 포함할 수 있다. CRMP-1 프로브 및 프라이머가 또한 제공된다. 일반적으로, 프로브/프라이머는 분리되거나 정제된 올리고뉴클레오티드이다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 통상, 본원에 기재된 엄격한 조건 하에서, 서열번호 1의 센스 또는 안티센스 서열의 약 7, 12 또는 15개 이상, 또는 약20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 또는 75개의 연속되는 뉴클레오티드와 혼성화되는 뉴클레오티드 서열 영역을 포함한다. CRMP-1 핵산은 서열번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 상이한 핵산 분자를 포함한다. 이러한 상이함은 유전 암호의 축중(degeneracy)으로부터 비롯된 것일 수 있으며, 그 결과 동일한 CRMP-1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 생성된다. CRMP-1 핵산은 서열번호 2에 제시된 것과 1개 이상 내지 5, 10, 20 또는 50개 미만의 아미노산 잔기가 상이한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
CRMP-1-특이적 항체, 또는 그 단편(예: 항원-결합성 단편)을 사용하여, CRMP-1 폴리펩티드를 탐지 및 분리할 수 있고, CRMP-1 폴리펩티드의 생체내 이용 효율을 조절할 수 있으며 CRMP-1 활성을 조절할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 면역글로불린 분자 또는 이의 면역학적 활성 부분, 즉 항원-결합성 단편을 지칭한다. 용어 "면역글로불린"은 면역글로불린 유전자에 의해 실질적으로 코딩된 하나 이상의 폴리펩티드로 이루어진 단백질을 지칭한다. 인식된 사람 면역글로불린 유전자에는 카파, 람다, 알파(IgA1 및 IgA2), 감마(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), 델타, 엡실론 및 뮤(mu) 불변 영역 유전자 뿐만 아니라 각종 면역글로불린 가변 영역 유전자가 포함된다.
CRMP-1-특이적 항체는 당해 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 생성시킬 수 있다. 이러한 항체에는 폴리클로날, 모노클로날, 키메릭, 단일쇄, Fab 단편, 및 Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편이 포함될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. CRMP-1에 대한 모노클로날 항체는 배양물 중의 연속 세포주에 의해항체 분자 생성을 제공해주는 어떠한 기술을 사용해서도 제조할 수 있다. 이러한 기술의 예로는 하이브리도마(hybridoma) 기술, 사람 B-세포 하이브리도마 기술, 및 EBV-하이브리도마 기술이 있다[참조: Kohler et al. (1975)Nature256:495-497; Kozbor et al. (1985)J. Immunol. Methods81:31-42; Cote et al. (1983)Proc. Natl. Acad. Sci. USA80:2026-2030; or Cole et al. (1984)Mol. Cell Biol.62:109-120]. 또한, "키메릭 항체" 생산용으로 개발된 기술, 즉 적당한 항원 특이성과 생물학적 활성을 지닌 분자를 수득하기 위해 마우스 항체 유전자를 사람 항체 유전자에 스플라이싱(splicing)하는 기술을 사용할 수 있다[참조: Morrison et al. (1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA81:6851-6855; Neuberger et al. (1984)Nature312:604-608; or Takeda et al. (1985)Nature314:452-454]. 필요에 따라서, 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여, 단일쇄 항체를 생성하는 것으로 보고된 기술을 채택하여 CRMP-1-특이적 단일쇄 항체를 생성시킬 수 있다. 또한, CRMP-1-특이적 항체는 다음 문헌에 기재된 바와 같이 고도로 특이적인 결합성 시약의 면역글로불린 라이브러리 또는 패널을 스크리닝하거나 또는 림프구 집단에서 생체내 생성을 유도함으로써 생성시킬 수 있다[참조: Orlandi et al. (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:3833-3837; or Winter et al. (1991)Nature349:293-299].
CRMP-1-특이적 항체를 생성하기 위해, 염소, 토끼, 랫트, 마우스, 사람 등을 포함한 각종 숙주에 CRMP-1 폴리펩티드를 주입함으로써 이들을 면역시킬 수 있다. 숙주 종에 따라, 각종 애쥬반트(adjuvant)를 사용하여 면역학적 반응을 증진시킬 수 있다. 이러한 애쥬반트에는 프로인트(Freund) 애쥬반트, 수산화알루미늄 등의미네랄 겔, 및 리소레시틴, 다가 폴리올, 다음이온, 펩티드, 오일 에멀션, 키홀 림펫 헤모시아닌 및 디니트로페놀 등의 표면 활성 물질이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. CRMP-1-특이적 항체는 완전한 사람 항체, 예를 들면, 사람 면역글로불린 서열로부터 항체를 생성하도록 유전공학적으로 처리한 마우스에서 만들어진 항체이거나, 또는 사람이 아닌 항체, 예를 들면, 설치류(마우스 또는 랫트), 염소, 영장류(예: 원숭이), 낙타 항체일 수 있다. 설치류 항체의 생성 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다[참조: 예를 들면, Wood et al 국제공개공보 WO 91/00906; Kucherlapati et al. PCT 공개공보 WO 91/10741; Lonberg et al. 국제공개공보 WO 92/03918; 또는 Kay et al. 국제공개공보 WO 92/03917]. CRMP-1-특이적 항체는 가변 영역 또는 그 일부가 사람이 아닌 유기체, 예를 들면, 랫트 또는 마우스에서 생성되는 것일 수 있다. 사람이 아닌 유기체, 예를 들면, 랫트 또는 마우스에서 생성시킨 다음, 사람에서의 항원성을 저하시키기 위해, 예를 들면, 가변 프레임워크(framework) 또는 불면 영역 내에서 변형시킨 항체도 또한 본 발명의 범위 내에 있다.
전장 CRMP-1 폴리펩티드, 또는 CRMP-1 폴리펩티드의 항원성 펩티드 단편을 면역원으로서 사용할 수 있거나, 또는 이를 사용하여 기타 면역원, 예를 들면, 세포, 막 제제 등을 이용하여 만든 CRMP-1-특이적 항체를 동정할 수 있다. CRMP-1 폴리펩티드의 항원성 펩티드는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열 중 8개 이상의 아미노산 잔기를 포함해야 하고, 이는 CRMP-1 폴리펩티드의 에피토프를 포함한다. 항원성 펩티드는 CRMP-1 폴리펩티드의 10, 15, 20 또는 30개 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
치료제
CRMP-1 폴리펩티드는 작용제 또는 길항제(antagonist) 형태의 CRMP-1 폴리펩티드을 코딩하는 핵산을 전달하기 위한 유전자 요법 프로토콜의 한 부분으로서 사용될 수 있다. 본 발명은 CRMP-1 폴리펩티드가 잘못 발현된 세포에서 이러한 CRMP-1 폴리펩티드의 기능을 재구성하거나 또는 그 기능을 길항시키도록 하기 위해 특정 세포 유형에서 CRMP-1 폴리펩티드를 발현시키고 생체내 형질감염시키기 위한 발현 벡터를 특징으로 한다. CRMP-1 폴리펩티드의 발현 작제물은 생물학적으로 유효한 어떠한 담체 중, 예를 들면, CRMP-1 유전자를 생체내에서 세포에 효과적으로 전달할 수 있는 어떠한 제형이나 조성물에 투여할 수 있다. 이러한 발현 작제물은 이종 프로모터, 예를 들면, 유도성 프로모터에 작동적으로 연결된 CRMP-1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 유전자 요법 프로토콜은 상기 유도성 프로모터의 유도인자를 피검자에 투여하는 것을 포함할 수 있다.
접근법은 재조합 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 및 단순 포진 바이러스-1, 또는 재조합 세균성 또는 진핵성 플라스미드를 포함한 바이러스성 벡터 내에 피검자 유전자를 삽입하는 것을 포함한다. 바이러스성 벡터는 세포를 직접적으로 형질감염시키는데; 플라스미드 DNA는, 예를 들면, 양이온성 리포솜(리포펙틴) 또는 유도체화된(예: 항체 접합된) 폴리리신 접합체, 그라마시딘 S, 인공 바이러스성 외막 또는 기타 세포내 담체의 보조 하에 전달할 수 있을 뿐만아니라 생체내에서 수행된 CaPO4침전법 또는 유전자 작제물의 직접적인 주사에 의해 전달할 수 있다.
CRMP-1 핵산을 세포 내로 생체내 도입하기 위한 접근법은, CRMP-1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산(예: DNA)을 함유하는 바이러스성 벡터를 사용함으로써 이루어질 수 있다. 세포를 바이러스성 벡터로 감염시키는 것은 상당 비율의 표적화 세포가 상기 핵산을 수용할 수 있다는 이점을 지니고 있다. 부가적으로, 예를 들면, 바이러스성 벡터에 함유된 cDNA에 의해 바이러스성 벡터 내에서 코딩된 분자는 바이러스성 벡터 핵산을 취한 세포에서 효율적으로 발현된다.
레트로바이러스 벡터 및 아데노-관련 바이러스 벡터를, 외인성 유전자를 생체내에서, 특히 사람에게 전이시키기 위한 재조합 유전자 전달 시스템으로서 사용할 수 있다. 이들 벡터는 유전자를 세포 내로 효율적으로 전달시켜 주며, 이와 같이 전이된 핵산은 숙주의 염색체성 DNA 내로 안정하게 통합된다. 복제 결함있는 레트로바이러스만을 생산하는 특수 세포주("패키징 세포"로 명명됨)를 개발함으로써, 유전자 요법에 대한 레트로바이러스의 활용을 증대시켰으며, 이러한 결함있는 레트로바이러스는 유전자 요법 목적을 위해 유전자 전이에 사용하도록 특징화시켰다[참조: Miller, A.D. (1990)Blood76:271]. 복제 결함있는 레트로바이러스를 비리온(virion) 내로 패키징할 수 있으며, 이를 사용하여, 표준 기술에 의해 헬퍼(helper) 바이러스의 사용을 통해 표적 세포를 감염시킬 수 있다. 재조합 레트로바이러스를 생성하고 이러한 바이러스를 사용하여 시험관내 또는 생체내에서세포를 감염시키는 프로토콜은 다음 문헌에 보고되어 있다[참조:Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al.(eds) Greene Publishing Associates, (1989), Sections 9.10-9.14 및 기타 표준 실험실용 매뉴얼]. 적합한 레트로바이러스의 예로는 당해 분야의 숙련인에게 공지되어 있는 pLJ, pZIP, pWE 및 pEM을 들 수 있다. 에코트로픽(ecotropic) 및 암포트로픽(amphotropic) 레트로바이러스성 시스템 모두를 제조하는데 적합한 패키징 바이러스 주의 예로는 yCrip, yCre, y2 및 yAm를 들 수 있다. 레트로바이러스를 사용하여 각종 유전자를 시험관내 및/또는 생체내에서, 상피 세포를 포함한 수 많은 상이한 세포 유형 내로 도입하였다[참조: Eglitis et al. (1985)Science230:1395-1398; Danos and Mulligan (1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:6460-6464; Wilson et al. (1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:3014-3018; Armentano et al. (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA87:6141-6145; Huber et al. (1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA88:8039-8043; Ferry et al. (1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA88:8377-8381; Chowdhury et al. (1991)Science254:1802-1805; van Beusechem et al.(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:7640-7644; Kay et al. (1992)Human Gene Therapy3:641-647; Dai et al. (1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:10892-10895; Hwu et al. (1993)J. Immunol.150:4104-4115; 미국 특허 제4,868,116호; 미국 특허 제4,980,286호; PCT 국제공개공보 WO 89/07136; PCT 국제공개공보 WO 89/02468; PCT 국제공개공보 WO 89/05345; 및 PCT 국제공개공보 WO 92/07573].
또 다른 유용한 바이러스성 유전자 전달 시스템으로는 아데노바이러스-유도된 벡터를 들 수 있다. 아데노바이러스가 관심있는 유전자 생성물을 코딩하고 이를 발현하지만 정상적인 용균성 바이러스 세포 주기로 복제되는 그의 능력면에서는 불활성화되도록 상기 바이러스의 게놈을 조작할 수 있다[참조: Berkner et al. (1988)BioTechniques6:616; Rosenfeld et al. (1991)Science252:431-434; and Rosenfeld et al. (1992)Cell68:143-155]. 아데노바이러스 균주 Ad 유형 5 dl324 또는 기타 아데노바이러스 균주(예: Ad2, Ad3, Ad7 등) 유래의 적합한 아데노바이러스성 벡터는 당해 분야의 숙련인에게 공지되어 있다. 재조합 아데노바이러스는 이들이 비분할 세포를 감염시킬 수 없고 상피 세포를 포함한 광범위한 세포 유형을 감염시키는데 사용할 수 있다는 점에서 특정 상황 하에서는 유리할 수 있다[Rosenfeld et al. (1992) 상기 참조]. 게다가, 이 바이러스 입자는 비교적 안정적이고 정제 및 농축시키기가 용이하며, 상술한 바와 같이, 감염도(infectivity) 스펙트럼에 영향을 미치도록 이를 변형시킬 수 있다. 부가적으로, 도입된 아데노바이러스 DNA(및 내부에 함유된 외래 DNA)는 숙주 세포의 게놈 내로 통합되지는 않지만 에피솜을 유지함으로써, 도입된 DNA가 숙주 게놈(예: 레트로바이러스성 DNA) 내로 통합되는 경우에 원위치(in situ) 내에서의 삽입 돌연변이유발 결과로서 발생할 수 있는 잠재적인 문제점을 피할 수 있다. 또한, 외래 DNA에 대한 아데노바이러스성 게놈의 운반 능력은 다른 유전자 전달 벡터에 비해 크다(8kb까지)[참조: Berkner et al. 상기 참조; Haj-Ahmand and Graham (1986)J. Virol.57:267].
CRMP-1 유전자의 전달에 유용한 또 다른 바이러스성 벡터 시스템은 아데노-관련 바이러스(AAV)이다. 아데노-관련 바이러스는 효율적인 복제와 생식 주기를 위한 헬퍼 바이러스로서 또 다른 바이러스, 예를 들면, 아데노바이러스 또는 포진 바이러스를 필요로 하는 결함있는 천연 바이러스이다[참조: Muzyczka et al. (1992)Curr. Topics in Micro. and Immunol.158:97-129]. 이는 또한, 그 DNA를 비분할 세포 내로 통합시킬 수 있고 안정적인 통합 빈도가 높은 몇개 안되는 바이러스 중의 하나이다[참조: Flotte et al.(1992)Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol.7:349-356; Samulski et al. (1989)J. Virol.63:3822-3828; and McLaughlin et al.(1989)J. Virol.62:1963-1973]. 300개 정도로 적은 염기쌍의 AAV를 함유하는 벡터를 패키징한 다음 통합시킬 수 있다. 외인성 DNA에 대한 공간은 약 4.5kb로 제한된다. 문헌[참조: Tratschin et al. (1985)Mol. Cell. Biol.5:3251-3260]에 기재된 바와 같은 AAV 벡터를 사용하여 DNA를 세포 내로 도입할 수 있다. AAV 벡터를 사용하여 각종 핵산을 상이한 세포 유형 내로 도입하였다[참조: Hermonat et al. (1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA81:6466-6470; Tratschin et al. (1985)Mol. Cell. Biol.4:2072-2081; Wondisford et al. (1988)Mol. Endocrinol.2:32-39; Tratschin et al. (1984)J. Virol.51:611-619; and Flotte et al. (1993)J. Biol. Chem.268:3781-3790].
상기 예시된 바와 같은 바이러스 전이 방법 이외에도, 비-바이러스성 방법을 이용하여 CRMP-1 폴리펩티드를 동물 조직에서 발현시킬 수도 있다. 대부분의 비-바이러스성 유전자 전이 방법은 거대 분자의 흡수 및 세포내 수송을 위해 포유류 세포에 의해 사용된 정상 기전에 의존한다. 몇몇 실시 태양에서는, 본 발명의 비-바이러스성 유전자 전달 시스템이 표적화 세포에 의한 CRMP-1 핵산의 흡수를 위한 세포내 이입 경로에 의존한다. 이러한 유형으로 예시되는 유전자 전달 시스템은 리포솜 유래 시스템, 폴리리신 접합체 및 인공 바이러스성 외막을 포함한다. 기타 실시 태양에는 다음 문헌에 기재된 바와 같은 플라스미드 주사 시스템이 포함된다[참조: Meuli et al. (2001)J Invest Dermatol.116(1):131-135; Cohen et al. (2000)Gene Ther7(22):1896-905; or Tam et al. (2000)Gene Ther7(21):1867-74].
대표적인 실시 태양에서는, CRMP-1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을, 그 표면 상에 양전하를 보유하고 있는 리포솜(예: 리포펙틴) 내에 포획시킬 수 있으며, (필요에 따라) 표적 조직의 세포 표면 항원에 대한 항체를 표지시킨다[참조: Mizuno et al. (1992)No Shinkei Geka20:547-551; PCT 국제공개공보 WO 91/06309; 일본 특허원 제1047381호; 및 유럽 공개특허공보 EP-A-43075].
임상 상황에서는, 치료학적 CRMP-1 핵산에 대한 유전자 전달 시스템을, 당해 분야에 널리 알려진 수 많은 방법 중의 어느 한 방법에 의해 환자에게 도입할 수 있다. 예를 들면, 유전자 전달 시스템의 약제학적 제제는, 예를 들면, 정맥내 주사를 통하여 전신 도입될 수 있으며, 표적 세포에서의 단백질의 특이적 형질도입은 주로, 수용체 유전자의 발현을 조절하는 전사 조절 서열로 인한 유전자 전달 비히클, 세포-유형 또는 조직-유형 발현으로써 제공된 형질감염의 특이성, 또는 이들의 조합으로부터 비롯된다. 기타 실시 태양에서는, 재조합 유전자의 초기 전달이 보다 제한되는데, 이로써 동물 내로의 도입이 다소 국한된다. 예를 들면, 유전자 전달 비히클은 카테터[미국 특허 제5,328,470호 참조] 또는 정위고정성 (stereotactic) 주사[참조: Chen et al. (1994)PNAS91:3054-3057]에 의해 도입할 수 있다.
유전자 요법 작제물의 약제학적 제제는 필수적으로, 허용되는 희석제 중의 유전자 전달 시스템으로 이루어질 수 있거나, 또는 유전자 전달 비히클이 포매(imbedy)된 서방출 매트릭스(low release matrix)를 포함할 수 있다. 필요에 따라서, 완전한 유전자 전달 시스템을 재조합 세포(예: 레트로바이러스성 벡터)로부터 그대로 생성시킬 경우에는, 약제학적 제제가 이러한 유전자 전달 시스템을 생성시키는 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다.
진단
본 발명은 또한, 피검자의 종양 침입 잠재력 또는 전이를 진단하는 방법을 제공한다. 이 방법을 사용하여 (1) 치료 동안에 피검자를 모니터할 수 있거나, 또는 (2) 종양 질병이 있는 것으로 추정되거나 종양 질병이 있는 것으로 공지된 피검자를 평가할 수 있다.
상기 방법은 피검자로부터 샘플(예: 생검, 혈액 또는 기타 조직 샘플)을 수득하는 단계; 이러한 샘플에서의 CRMP-1의 발현 수준을 결정하는 단계; 이 샘플 발현 수준을 기준 발현치와 비교하는 단계; 및 샘플 발현치가 기준 발현치 보다 낮을 경우에는 해당 피검자가 종양 침입 잠재력 또는 전이를 나타내는 것으로 분류하는 단계를 포함한다. 샘플 발현치 또는 기준 발현치 각각은 (1) CRMP-1 핵산으로부터전사된 mRNA; 또는 (2) CRMP-1 폴리펩티드의 존재비를 평가한 값이다. 상기 샘플에는 피검자로부터 분리된 조직, 세포 및 생체액 뿐만 아니라, 피검자 내에 존재하는 조직, 세포 및 체액이 포함된다. 상기 샘플의 한 예가 혈청이다.
CRMP-1 유전자의 발현 수준은 특정 세포에서의 CRMP-1 유전자에 상응하는 mRNA의 수준으로써 결정할 수 있다. 이 측정치는, 노던 분석, 폴리머라제 연쇄 반응 분석 및 프로브 검정을 포함한 혼성화 또는 증폭 검정 등의 원위치(in situ) 검정과 시험관내 검정 모두에 의해 결정될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. mRNA 수준을 탐지하기 위한 한 가지 진단 방법으로는 탐지하고자 하는 유전자에 의해 코딩된 mRNA와 혼성화할 수 있는 핵산 프로브를 상기 mRNA와 접촉시키는 것이 있다. 이러한 핵산 프로브는, 예를 들면, 전장 CRMP-1 핵산, 예를 들면, 서열번호 1의 핵산, 또는 그 일부분, 예를 들면, 엄격한 조건 하에서 CRMP-1 mRNA 또는 게놈 DNA와 특이적으로 혼성화하기에 충분한 7, 15, 30, 50, 100, 250 또는 500 이상 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 이 프로브를 특정 어레이의 어드레스(address) 상에 위치시킬 수 있다. 진단 검정에 사용하기 적합한 기타 프로브가 본원에 기재되어 있다. 한 포맷(예: 노던 블롯)에서는, 예를 들면, 분리된 mRNA을 아가로스 겔 상에서 이동시킨 다음 이러한 mRNA을 겔로부터 막(예: 니트로셀룰로즈)에 전이시킴으로써, mRNA(또는 cDNA)를 표면 상에 고정화시키고 이를 프로브와 접촉시킨다. 대체 포맷에서는, 예를 들면, 하기의 2차원 유전자 칩 어레이에서, 상기 프로브를 표면 상에 고정화시킨 다음, mRNA(또는 cDNA, 예를 들면, 표지된 cDNA)를 상기 프로브와 접촉시킨다. 당업자는 CRMP-1 유전자에 의해 코딩된mRNA의 수준을 탐지하는데 사용하기 위하여 공지된 mRNA 탐지 방법을 채택할 수 있다.
또한, 샘플 중의 mRNA의 수준은 핵산 증폭 방법, 예를 들면, rtPCR[참조: Mullis (1987) 미국 특허 제4,683,202호], 리가제 연쇄 반응[참조: Barany (1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA88:189-193], 자가 지속 서열 복제(self sustained sequence replication)[참조: Guatelli et al. (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA87:1874-1878], 전사 증폭 시스템[참조: Kwoh et al. (1989),Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:1173-1177], Q-베타 레플리카제[참조: Lizardi et al. (1988)Bio/Technology6:1197], 롤링 서클 복제(rolling circle replication)[참조: Lizardi et al. 미국 특허 제5,854,033호], 또는 기타 핵산 증폭 방법을 수행한 다음, 이와 같이 증폭시킨 분자를 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 탐지함으로써 평가할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 증폭용 프라이머는 유전자의 5' 또는 3' 영역(각각 플러스 및 마이너스 스트랜드이거나 이와 반대일 수도 있다)과 어닐링될 수 있고 이들 사이에 짧은 영역을 함유할 수 있는 한 쌍의 핵산 분자로서 정의된다. 일반적으로, 증폭용 프라이머는 길이가 약 10 내지 30 뉴클레오티드이고 약 50 내지 200 뉴클레오티드 길이 영역을 플랭킹(flanking)한다. 적당한 조건 하에 적당한 시약을 사용하면, 상기 프라이머는 이러한 프라이머에 의해 플랭킹된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 증폭시킨다.
각종 방법을 사용하여 CRMP-1 폴리펩티드의 수준을 결정할 수 있다. 일반적으로, 이들 방법은 CRMP-1 폴리펩티드와 선택적으로 결합하는 제제, 예를 들면, 항체를 샘플과 접촉시켜 이러한 샘플 중의 CRMP-1 폴리펩티드의 수준을 평가하는 것을 포함한다. 상기 항체는 탐지 가능한 표지를 보유할 수 있다. 프로브 또는 항체와 관련하여 "표지된"이란 용어는 탐지 가능한 물질을 프로브 또는 항체에 커플링(즉, 물리적 연결)시킴으로써 프로브 또는 항체를 직접적으로 표지하는 것 뿐만 아니라 탐지 가능한 물질과의 반응성에 의해 프로브 또는 항체를 간접적으로 표지시하는 것을 포괄한다.
상기 탐지 방법을 사용하여 시험관내 뿐만 아니라 생체내 샘플 중에서 CRMP-1 폴리펩티드를 탐지할 수 있다. CRMP-1 폴리펩티드를 탐지하기 위한 시험관내 기술에는 효소 결합 면역 흡착 검정(ELISAs), 면역 침전법, 면역형광법, 효소 면역검정(EIA), 방사성 면역검정(RIA) 및 웨스턴 블롯 분석이 포함된다. CRMP-1 폴리펩티드를 탐지하기 위한 생체내 기술에는 표지된 CRMP-1-특이적 항체를 피검자 내로 도입하는 것이 포함된다. 예를 들면, 항체는 피검자 내에서의 존재 여부 및 위치가 표준 영상 기술에 의해 탐지될 수 있는 방사성 마커로 표지할 수 있다. 또 다른 실시 태양에서는, 샘플을 표지(예를 들면, 바이틴 표지)한 다음, 항체와 접촉시킨다. 이 샘플은, 예를 들면, 형광성 표지와 커플링된 아비딘을 사용하여 탐지할 수 있다.
원위치 방법에서는, 세포 또는 조직 샘플을 제조/처리하고, 이를 지지체, 일반적으로 유리 슬라이드 상에 고정시킨 다음, 분석하고자 하는 CRMP-1 유전자를 코딩하는 mRNA와 혼성화할 수 있는 프로브와 접촉시킬 수 있다. 진단 및 예후 검정법은 CRMP-1 mRNA 또는 게놈 DNA를 탐지할 수 있는 화합물 또는 제제를 대조군 샘플과 접촉시키는 단계; 및 이러한 대조군 샘플에서의 CRMP-1 mRNA 또는 게놈 DNA의 존재 여부를 시험 샘플에서의 CRMP-1 mRNA 또는 게놈 DNA의 존재 여부와 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 미국 특허 제5,695,937호에 기재된 바와 같이, 일련의 유전자 발현 분석을 사용하여 CRMP-1 전사체 수준을 탐지할 수도 있다.
시험 화합물의 스크리닝
본 발명은 시험 화합물, 즉 CRMP-1 핵산 또는 CRMP-1 폴리펩티드의 발현 수준을 조절해주는 후보 화합물 또는 제제를 동정하는 방법을 제공한다.
이러한 시험 화합물은 생물학적 라이브러리; 펩토이드 라이브러리[펩티드의 작용기를 갖지만, 효소적 분해에 대해 내성인 신규한 비-펩티드 주쇄를 가짐에도 불구하고 생체활성을 유지하는 분자의 라이브러리(참조: Zuckermann et al. (1994)J. Med. Chem.37:2678-85)]; 공간상 어드레스 가능한 평행 고체 상 또는 용액 상 라이브러리; 탈회(deconvolution)를 요구하는 합성 라이브러리 방법; "원-비드 원-화합물(one-bead one compound)" 라이브러리 방법; 및 친화성 크로마토그래피 선별을 이용한 합성 라이브러리 방법을 포함한, 당해 분야에 공지된 조합 라이브러리 방법에서의 수 많은 접근법을 사용하여 수득할 수 있다. 생물학적 라이브러리 및 펩토이드 라이브러리 접근법은 펩티드 라이브러리로 제한되는 반면, 기타 4가지 접근법은 화합물의 펩티드, 비-펩티드 올리고머 또는 작은 분자 라이브러리에 적용 가능하다[참조: Lam (1997)Anticancer Drug Des.12:145].
분자상 라이브러리의 합성 방법의 예가 다음 문헌에 기재되어 있다[참조:DeWitt et al. (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6909; Erb et al. (1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA91:11422; Zuckermann et al. (1994)J. Med. Chem.37:2678; Cho et al. (1993)Science261:1303; Carrell et al. (1994)Angew. Chem. Int. Ed. Engl.33:2059; Carell et al. (1994)Angew. Chem. Int. Ed. Engl.33:2061; and Gallop et al. (1994)J. Med. Chem.37:1233].
화합물의 라이브러리는 용액 중에 존재하거나[참조: Houghton (1992)Biotechniques13:412-421], 또는 비드[참조: Lam (1991)Nature354:82-84], 칩[참조: Fodor (1993)Nature364:555-556], 세균[참조: Ladner, 미국 특허 제5,223,409호], 포자[참조: Ladner, 미국 특허 제5,223,409호], 플라스미드[참조; Cull et al. (1992)Proc Natl Acad Sci USA89:1865-1869] 또는 파아지[참조: Scott and Smith (1990)Science249:386-390; Devlin (1990)Science249:404-406; Cwirla et al. (1990)Proc. Natl. Acad. Sci.87:6378-6382; Felici (1991)J. Mol. Biol.222:301-310; Ladner 상기 참조] 상에 존재할 수 있다. 예시되는 조합 화학적 라이브러리에는 펩티드 라이브러리[참조: 미국 특허 제5,010,175호, Furka,Int. J. Pept. Prot. Res.37:487-493(1991) and Houghton et al.,Nature354:84-88(1991)]가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 화학적 다양성 라이브러리를 생성시키기 위한 기타 화학물질을 사용할 수도 있다. 이러한 화학물질에는 펩토이드[참조: PCT 국제공개공보 WO 91/19735]; 코딩된 펩티드[참조: PCT 국제공개공보 WO 93/20242]; 랜덤 바이오-올리고머[참조: PCT 국제공개공보 WO 92/00091]; 벤조디아제핀[참조: 미국 특허 제5,288,514호]; 하이단토인, 벤조디아제핀 및 디펩티드와 같은 디버소머(diversomer)[참조: Hobbs et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:6909-6913(1993)], 비닐 위치 폴리펩티드[참조: Hagihara et al.J. Amer. Chem. Soc.114:6568(1992)], 글루코즈 비계(scaffolding)를 갖는 비펩티드성 펩티도미메틱스[참조: Hirschmann et al.,J. Amer. Chem. Soc.114:9217-9218(1992)], 작은 분자 라이브러리의 유사 유기 합성물[참조: Chen et al.,J. Amer. Chem. Soc.116:2661(1994)], 올리고카바메이트[참조: Cho et al.,Science261:1303(1993)], 및/또는 펩티딜 포스포네이트[참조: Campbell et al.,J. Org. Chem.59:658(1994)], 핵산 라이브러리[Ausubel, Berger and Sambrook, 상기 참조], 펩티드 핵산 라이브러리[참조: 미국 특허 제5,539,083호], 항체 라이브러리[참조: Vaughn et al.,Nature Biotechnology, 14(3):309-314(1996) 및 PCT/US96/10287], 탄수화물 라이브러리[참조: Liang et al.,Science, 274:1520-1522(1996) 및 미국 특허 제5,593,853호], 작은 유기 분자 라이브러리[예를 들면, 벤조디아제핀(참조: Baum C&EN, Jan 18, page 33 (1993); 이소프레노이드(참조: 미국 특허 제5,569,588호); 티아졸리디논 및 메타티아자논(참조: 미국 특허 제5,549,974호); 피롤리딘(참조: 미국 특허 제5,525,735호 및 제5,519,134호; 모르폴리노 화합물(참조: 미국 특허 제5,506,337호); 벤조디아제핀(참조: 미국 특허 제5,288,514호)] 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
CRMP-1 핵산 발현을 조절하는 시험 화합물을 동정할 수 있다. 예를 들면, 세포 또는 세포 무함유 혼합물을 시험 화합물과 접촉시키고, CRMP-1 mRNA 또는 폴리펩티드의 발현 수준을 시험 화합물의 부재하에서의 CRMP-1 mRNA 또는 폴리펩티드의 발현 수준과 비교하여 평가한다. CRMP-1 mRNA 또는 폴리펩티드의 발현 수준이 시험 화합물의 부재시 보다 존재시에 더 클 경우에는, 시험 화합물이 CRMP-1 mRNA 또는 폴리펩티드 발현의 자극제로서 동정된다. 또 다른 한편, CRMP-1 mRNA 또는 폴리펩티드의 발현 수준이 시험 화합물의 부재시 보다 이의 존재시에 더 낮을 경우(예를 들면, 통계 유의적으로 낮을 경우)에는, 후보 화합물이 CRMP-1 mRNA 또는 폴리펩티드 발현의 억제제로서 동정된다. CRMP-1 mRNA 또는 폴리펩티드의 발현 수준은 상기 "진단" 항목에서 기재된 방법으로 결정할 수 있다.
CRMP-1 폴리펩티드가 특정 기질, 예를 들면, CRMP-1 기질과 결합하는 것을 조절해주는 시험 화합물의 능력을 평가할 수 있다. 이는 예를 들어, 상기 기질을 방사성 동위원소 또는 효소 표지물과 커플링시킴으로써, 복합체 중의 표지된 기질을 탐지함에 의해 CRMP-1 폴리펩티드에 대한 상기 기질의 결합을 결정할 수 있다. 필요에 따라서, CRMP-1 폴리펩티드를 방사성 동위원소 또는 효소 표지물과 커플링시켜, 복합체 중의 CRMP-1 폴리펩티드 기질에 대한 CRMP-1 폴리펩티드 결합을 조절해주는 시험 화합물의 능력을 모니터할 수 있다. 예를 들면, 기질은125I,35S,14C 또는3H로 직접 또는 간접적으로 표지할 수 있으며, 방사성 동위원소는 전파방출을 직접 계수하거나 신틸레이션(scintillation) 계수함으로써 탐지할 수 있다. 한편, 시험 화합물은, 예를 들면, 서양 고추냉이 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타제 또는 루시퍼라제로 효소적으로 표지할 수 있으며, 이러한 효소적 표지는 적당한 기질의 생성물의 전환을 결정함으로써 탐지한다.
상호작용물 중의 어느 하나로 표지하거나 표지하지 않은 CRMP-1 폴리펩티드와 상호작용하는 시험 화합물의 능력을 평가할 수 있다. 예를 들면, 시험 화합물과 CRMP-1 폴리펩티드 간의 상호작용은 형광 에너지 전이(FET)[참조: Lakowicz et al., 미국 특허 제5,631,169호; Stavrianopoulos, et al. 미국 특허 제4,868,103호]를 사용하여 탐지할 수 있다. 제1의 "공여체" 분자 상의 형광단(fluorophore) 표지물은, 이의 방출된 형광 에너지가 제2의 "수용체" 분자 상의 형광성 표지물에 의해 흡수되어 rm 흡수된 에너지로 인해 형광을 나타낼 수 있도록 선택한다. 빛의 상이한 파장을 방출하는 표지물을 선택하므로, 상기 "수용체" 분자 표지물은 "공여체" 분자 표지물과 달라도 좋다. 표지물들 간의 에너지 전이 효율은 분자들 간의 떨어진 거리와 관계가 있기 때문에, 분자들 간의 공간 관계를 평가할 수 있다. FET 결합은 당해 분야에 널리 공지된 표준 형광분석 탐지 수단을 통하여(예를 들면, 형광계를 사용함) 통상적으로 결정할 수 있다. 시험 화합물과 CRMP-1 폴리펩티드 간의 상호작용은 실시간 생분자 상호작용 분석(BIA)[참조: Sjolander, S. and Urbaniczky, C. (1991)Anal. Chem.63:2338-2345; and Szabo et al. (1995)Curr. Opin. Struct. Biol.5:699-705]를 사용하여 달성할 수 있다. "표면 플라스몬(plasmon) 공명" 또는 "BIA"는 어떠한 상호작용물(예: BIAcore)의 표지없이, 생체 특이적 상호작용을 실시간으로 탐지한다. 결합 표면에서의 질량 변화(결합 사건의 지표)로 인해, 이러한 표면 근처의 광 굴절률이 변형되어(표면 플라스몬 공명(SPR)의 광학 현상), 그 결과 생물학적 분자들 간의 실시간 반응의 지표로서 사용될 수 있는 탐지 가능한 시그널이 생성된다.
본 발명의 시험 화합물을 동정하는 방법은 본원에 기재된 둘 이상의 검정법의 조합에 관한 것이며, 상기 언급된 스크리닝 방법에 의해 동정된 신규한 화합물에 관한 것이다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같이 동정된 화합물(예: CRMP-1 조절성 화합물, 안티센스 CRMP-1 핵산 분자, CRMP-1-특이적 항체, 또는 CRMP-1-결합 파트너)을 적당한 동물 모델에 추가로 사용하여, 상기 제제의 치료 효능, 독성, 부작용 또는 작용 기전을 결정하는 것도 본 발명의 범위 내이다. 또한, 상기 언급된 스크리닝 검정법에 의해 동정된 신규한 화합물을 본원에 기재된 바와 같은 치료에 사용할 수 있다.
CRMP-1 핵산, 예를 들면, CRMP-1 비-코딩 영역 또는 CRMP-1 코딩 영역(예: CRMP-1 유전자를 포함하는 유전자은행 NT_006051의 서열, 예를 들면, 뉴클레오티드 559971에서 635062까지의 서열 또는 뉴클레오티드 540000에서 640000까지의 서열)과 결합하는 키메릭 인공 아연 핑거(finger) 단백질을 동정하는 것도 가능하다. 변화된 아연 핑거 도메인을 포함하는 라이브러리를 생성시키는 것이 가능하다[참조: Rebar et al. (1996)Methods Enzymol267:129; Greisman and Pabo (1997)Science275:657; Isalan et al. (2001)Nat. Biotechnol19:656; and Wu et al. (1995)Proc. Nat. Acad. Sci. USA92:344].
예를 들면, 시험관내에서 선별하거나(예를 들면, 파아지 디스플레이를 사용함) 또는 인식 암호에 근거하여 고안함으로써(참조: WO 00/42219), 하나 이상의 키메릭 아연 핑거 DNA 결합 영역을 제조하는 것도 가능하다. 이러한 아연 핑거 단백질을 전사 활성화 도메인에 융합시켜 CRMP-1의 전사를 활성화시킬 수 있다. 상기아연 핑거 단백질은 그 자체가 세포 내로 전달되는 이종 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 아연 핑거 단백질을 코딩하는 서열을 유도성 프로모터에 작동적으로 연결시켜, 예를 들면, 세포 내의 아연 핑거 단백질의 수준을 잘 조절할 수 있다.
고 처리량 스크리닝
고-처리량 방법을 사용하여 화학물질의 큰 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 이러한 후보 화합물의 라이브러리는 예를 들어, 켐브릿지 코포레이션 (Chembridge Corp.; San Diego, CA)으로부터 구입하거나 생성시킬 수 있다. 라이브러리는 광범위한 화합물을 커버하도록 고안될 수 있다. 예를 들면, 라이브러리는 10,000, 50,000 또는 100,000 이상의 독특한 화합물을 포함할 수 있다. 단지 예로써, 라이브러리는 피리딘, 인돌, 퀴놀린, 푸란, 피리미딘, 트리아진, 피롤, 이미다졸, 나프탈렌, 벤즈이미다졸, 피페리딘, 피라졸, 벤족사졸, 피롤리딘, 티오펜, 티아졸, 벤조티아졸 및 모르폴린을 포함한 헤테로사이클로부터 작제할 수 있다. 또한, 선행 실험 및 일화 증거가 효능 증진된 특정 부류 또는 범주의 화합물을 제시할 수 있다. 라이브러리는 이러한 부류의 화학물질을 커버하도록 고안 및 합성할 수 있다.
모델 세포주(예: CL1-0및 이의 아세포주, 예를 들면, CL1-1및 CL1-5)로부터의 전이 세포, 또는 종양 전이 환자로부터 얻은 세포를 고 처리량 약물 스크리닝에 사용할 수 있다. 예를 들면, 세포를 작은 미세역가판(microtiter plate), 예를 들면, 6-웰, 32-웰, 64-웰, 96-웰, 384-웰 판에서 성장시킬 수 있다. 고밀도 미세역가판은 중합체, 예를 들면, 폴리디메틸실록산(예: 다우 코닝사제, 실가드(Sylgard) 384) 및 아크릴계 주형(mold)으로부터 만들 수 있다. 이러한 주형은 화합물이 투여될 수 있는 세포의 성장을 위한 웰을 함유한다. 예를 들면, 주형은 2㎕ 용량의 1536 웰, 또는 250nl 용량의 6144 웰을 함유할 수 있다. 다수의 시험 화합물, 또는 상기 언급된 바와 같은 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 라이브러리는 예를 들어, 미세역가판에서 로봇을 이용하여 조작할 수 있는 포맷으로 제공될 수 있다. 화합물을 미세역가판 내의 전이 세포에 가할 수 있다. 화합물을 첨가한 후, 세포를 특정 시간 동안 항온 배양한다. 이어서, 발현 수준을 모니터한다.
시험 화합물을 또한 풀링한 다음, 이 풀(pool)을 시험할 수 있다. 양성 풀을 후속 분석에 사용하기 위해 분할한다. 방법에 상관없이, CRMP-1 유전자의 발현 수준을 변화시키는 화합물은 "후보" 화합물 또는 약물로 간주한다. 후보 화합물을 대상으로 하여, 상기 언급된 바와 같이 전이 세포 상에서 재시험한다. 재시험시 양성인 후보 화합물은 "선도(lead)" 화합물로 간주한다.
일단 선도 화합물을 동정하면, 표준 의약 화학 원리를 이용하여 상기 화합물의 유도체를 제조할 수 있다. 유도체를 대상으로 하여, 개선된 약리학적 성질, 예를 들면, 효능, 약력학, 안정성, 용해도 및 클리어런스(clearance)에 대해 스크리닝할 수 있다. 상기 언급된 검정에서 화합물의 활성에 관여하는 잔기들은 당해 분야에 통상 실시되는 바와 같이 구조-활성 관계(SAR)를 검사함으로써 서술할 수 있다. 약제 화학 분야의 당업자는 선도 화합물 상의 잔기를 변형시킬 수 있고, 이러한 화합물의 효능에 대한 상기 변형 효과를 측정함으로써 효능이 증가된 유도체를 제조할 수 있다[참조: 예를 들면, Nagarajan et al. (1988)J. Antibiot.41:1430-8]. 변형에는 N-아실화, 아민화, 아미드화, 산화, 환원, 알킬화, 에스테르화, 및 하이드록시화가 포함될 수 있다. 또한, 선도 화합물의 생화학적 표적이 공지되어 있거나 결정된 경우에는, 이러한 표적 및 선도 화합물의 구조는 유도체의 고안과 최적화를 고지할 수 있다. 분자 모델링 소프트웨어가 시판되고 있다(예: Molecular Simulations, Inc.).
약제학적 조성물
본 발명은 종양 전이 위험이 있거나(또는 종양 전이되기 쉬운) 피검자를 치료하거나 또는 종양 전이된 피검자를 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "치료"는 특정 질병, 질병 증상 또는 질병에 걸리기 쉬운 체질을 치료, 치유, 완화, 경감, 변화, 구제, 회복, 개선시키거나 또는 이에 영향을 미칠 목적으로, 이러한 질병이 있거나, 질병 증상을 나타내거나 또는 이러한 질병에 걸리기 쉬운 체질의 환자에게 특정 제제를 적용 또는 투여하거나, 또는 상기 환자로부터 분리된 조직 또는 세포주에 특정 제제를 적용 또는 투여하는 것으로서 정의된다. 제제에는 CRMP-1 폴리펩티드; CRMP-1 핵산; 또는 CRMP-1 핵산 또는 CRMP-1 폴리펩티드의 발현 또는 효과를 조절하는 시험 화합물이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
약제학적 조성물은 바로 위에서 언급된 제제와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 "약제학적으로 허용되는 담체"에는 약제학적 투여와 부합되는, 용매, 분산 매질, 피복제, 항세균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등이 포함된다. 보조 활성 화합물을 당해 조성물 내로 혼입시킬 수도 있다.
제제를 이의 의도된 투여 경로와 부합되도록 제형화시킬 수 있다. 투여 경로의 예에는 비경구, 예를 들면, 정맥내, 내피, 피하, 경구(예: 흡입), 경피(국소), 경점막 및 직장 투여가 포함된다. 이들 투여 경로용 투여형으로 제형화하는 것은 통상의 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 제제를 캅셀제, 겔 실(gel seal), 또는 경구 투여용 정제로 제형화시킬 수 있다. 캅셀제는 젤라틴 또는 셀룰로스와 같은 약제학적으로 허용되는 어떠한 표준 물질도 함유할 수 있다. 정제는 제제 혼합물을 고형 담체 및 윤활제와 함께 압착시킴으로써 통상적인 과정에 따라서 제형화시킬 수 있다. 고형 담체의 예에는 전분 및 당 벤토나이트가 포함된다. 제제는 또한, 결합제, 예를 들면, 락토즈 또는 만니톨, 통상적인 충진제 및 정제화제를 함유하는 경질 쉘 정제 또는 캅셀제 형태로 투여할 수도 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구, 국소, 피하, 복강내, 근육내 및 정맥내를 포함한 비경구 경로를 통하여 투여할 수 있다. 비경구 투여형의 예로는 수성 용제, 등장성 식염수 또는 활성제의 5% 글루코즈, 또는 기타 널리 공지된 약제학적으로 허용되는 부형제를 들 수 있다. 가용화제, 예를 들면, 사이클로덱스트린, 또는 당업자에게 널리 공지된 기타 가용화제가 치료학적 제제 전달용 약제학적 부형제로서 이용될 수 있다.
제제의 독성 및 치료학적 효능은, 예를 들어, LD50(해당 집단의 50%를 치사시키는 용량) 및 ED50(해당 집단의 50%에서 치료학적으로 유효한 용량)을 결정하기 위하여, 세포 배양물 또는 실험용 동물에서 표준 약제학적 과정에 의해 결정할 수 있다. 독성 효과와 치료학적 효과 간의 용량비가 치료 지수이고 이는 LD50/ED50비로서 표현될 수 있다. 치료 지수가 높은 화합물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 제제를 사용할 수 있긴 하지만, 감염되지 않은 세포에 대한 잠재적인 손상을 최소화함으로써 부작용을 감소시키기 위해, 감염된 조직 부위로 상기 제제를 표적시키는 전달 시스템을 고안해야 한다.
세포 배양 검정과 동물 연구로부터 수득된 데이터는, 사람에게 사용하기 위한 투여량 범위를 공식화하는데 사용할 수 있다. 이러한 제제의 투여량은 독성을 거의 나타내지 않거나 전혀 나타내지 않는 ED50를 포함하는 순환 농도 범위 내에 있는 것이 바람직하다. 투여량은 이용된 투여형과 투여 경로에 따라 상기 범위 내에서 다양할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용된 모든 제제의 경우, 치료학적 유효 용량은 세포 배양 검정으로부터 초기에 평가할 수 있다. 투여량은 동물 모델에서 공식화하여 세포 배양물에서 결정된 바와 같은 IC50(즉, 증상을 최대 50% 억제시켜 주는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성할 수 있다. 이러한 정보를 이용하여, 사람에게 유용한 용량을 보다 정확하게 결정할 수 있다. 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피로, 혈장 수준을 결정할 수 있다.
본원에 정의된 바와 같이, 폴리펩티드의 치료학적 유효량(즉, 유효 투여량)은 약 0.001 내지 30mg/체중 kg, 약 0.01 내지 25mg/체중 kg, 약 0.1 내지 20mg/체중 kg 또는 약 1 내지 10mg/체중 kg, 2 내지 9mg/체중 kg, 3 내지 8mg/체중 kg, 4 내지 7mg/체중 kg, 또는 5 내지 6mg/체중 kg의 범위이다. 당업자는 해당 질병 또는 장애의 중증도, 기존의 치료, 피검자의 일반적인 건강 상태 및/또는 연령, 및 갖고 있는 기타 질병을 포함하지만 이에 제한되지 않는 특정 인자가 피검자를 효과적으로 치료하는데 요구되는 투여량과 투여 시간에 영향을 미칠 수 있다는 것을 인지할 것이다.
항체의 경우, 바람직한 투여량은 0.1mg/체중 kg(일반적으로 10 내지 20mg/체중 kg)이다. 항체가 뇌에서 작용하도록 할 경우에는, 통상 50 내지 100mg/체중 kg의 투여량이 적당하다. 일반적으로, 부분적 사람 항체 및 완전한 사람 항체는 기타 항체 보다 인체 내에서의 반감기가 더 길다. 따라서, 보다 적은 투여량을 보다 적은 횟수로 투여하는 것이 종종 가능하다. 지질화(lipidation)와 같은 변형을 이용하여 항체를 안정화시키고 흡수 및 조직 침투(예를 들면, 뇌로의 침투)를 증진시킬 수 있다. 항체를 지질화시키는 방법은 문헌[참조: Cruikshank et al. (1997)J. Acquired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology14:193]에 기재되어 있다.
본 발명은 CRMP-1 핵산 또는 CRMP-1 폴리펩티드의 발현 또는 활성을 조절해주는 화합물을 포함한다. 제제는, 예를 들면, 작은 분자일 수 있다. 예시 용량에는 피검자 kg 또는 샘플 중량당 작은 분자 밀리그램 또는 마이크로그램 양이 포함되는데, 예를 들면, 약 1㎍/kg 내지 약 500mg/kg, 약 100㎍/kg 내지 약 5mg/kg, 또는 약 1㎍/kg 내지 약 50㎍/kg이다. 게다가, 작은 분자의 적당한 용량은 조절시키고자 하는 발현 또는 활성에 기준한 작은 분자의 효능에 좌우된다는 것도 이해될 것이다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 핵산의 발현 또는 활성을 조절하기 위해 이들 작은 분자 중의 하나 이상을 동물(예: 사람)에 투여하는 경우, 의사, 수의사 또는 연구원은, 예를 들어, 처음에는 비교적 적은 용량을 처방한 다음, 적당한 반응이 획득될 때까지 그 용량을 증가시키도록 처방할 수 있다. 또한, 어떠한 특정 동물 피검자에 대한 구체적인 용량 수준도, 이용된 특정 화합물의 활성, 피검자의 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 배출율, 약물 조합, 및 조절하고자 하는 발현 또는 활성 정도에 좌우될 것이라는 것을 인지해야 한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 투여에 대한 지시사항과 함께 용기, 팩 또는 투약기 내에 포함될 수 있다.
다음의 구체적인 실시예는 단지 예시를 위한 것이며, 이로써 본 명세서의 기타 내용들이 어떤 방식으로든 제한되지 않는다. 추가의 설명 없이도, 당업자는 본원의 기재 내용을 근거로 하여, 본 발명을 이의 가장 완전한 수준으로 활용할 수 있을 것으로 여겨진다. 본원에 인용된 모든 공보 및 특허 공보는 전부 본원에 참조문헌으로써 삽입된다.
<실시예>
방법
세포주 및 배양 조건.사람 폐 선암종 세포주 CL1-0, CL1-1, CL1-5, 및 CL1-5-F4를 37℃, 20% O2및 5% CO2에서 10% 태아 소 혈청(GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD)과 2mM L-글루타민(GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD)이 보충된 RPMI-1640 배지(GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD)에서 성장시켰다. CL1-0이 모 세포주이고; CL1-1과 CL1-5는 트랜스웰(Transwell) 침입 챔버에서 마트리겔(Collaborative Biomedical, Becton Dickinson, Bedford, MA)로 코팅한 폴리카보네이트 막을 이용하여 시험관내에서 선별함으로써 CL1-0로부터 선별한 아세포주이다[참조: Chu et al.(1997)Am J. Respir Cell Mol Biol17:353-60]. CL1-5세포를 심각한 증상이 조합된 면역결핍성 마우스의 꼬리 정맥 내로 주사한 다음, 마우스 폐에서 형성된 종양으로부터 세포주를 분리 및 클로닝하였다. 생체내 선별을 4회 반복한 후, 상기 세포주를 CL1-5-F4로서 명명하였다. 트립신/EDTA(Sigma, Deisenhofen, Germany)를 사용하여 배양 접시로부터 부착성 세포를 박리시킨다. 작용성 검정에 앞서, 0.02% EDTA를 대체 사용하여 세포 표면 항원의 파괴를 피하였다.
마이크로어레이 분석.나일론 막 상에서 9600 형 어레이를 이용한 마이크로어레이 실험을, 비색 탐지 방법을 사용하여 문헌[참조: Chen et al. (1998)Genomics51:313-24; and Hong et al. (2000)Am J Respir Cell Mol Biol23:355-63]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간략하게 언급하면, 각 세포주는 80% 밀집도로 성장하였고, 배양된 세포를 신선한 배지로 변화시킨지 24시간 후에 mRNA를 분리하였다. 항온 배양기로부터 꺼낸 시간과 세포가 용해되는 시간 간격을 최소화시켰다. RNAzolB(Biotecx Laboratories, Houston Texas)를 이용한 변형된 구아니디늄 티오시아네이트-페놀-클로로포름 추출 방법으로, 총 세포성 RNA를 세포로부터 추출하였다. 올리고텍스-dT 수지(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 메신저 RNA를 추출하였다. 각 폐암 세포주로부터 유도된 mRNA 5㎍을 역전사시키고 이를 바이오틴으로 표지시켰다. 이중 가닥 상보성 DNA(cDNA) 표적을 수반하는 막을, 혼성화시키기 전 1시간 동안 68℃에서 7ml 혼성화 완충액(5X SSC, 0.1% N-라우로일사르코신, 0.1% SDS, Roche Molecular Biochemicals에 의해 제조된 1% 블로킹 시약 혼합물, 및 50㎍/ml 연어 정자 DNA)에서 예비혼성화시켰다. 연어 정자 DNA 대신 사람 COT-1 DNA와 cDNA 프로브를 함유하는 80㎕ 혼성화 용액을 혼성화 백 속의 마이크로어레이로 밀봉시켰다. 혼성화한 후, 상기 막을, 700X 희석된 STREP-GAL(1.38U/ml, 효소 활성)(GIBCO-BRL), 4% 폴리에틸렌 글리콜 8000(Sigma) 및 0.3% BSA의 1X TBS 완충액을 함유하는 혼합물 1ml로 처리하여 2시간 동안 항온 배양하였다. 이어서, 20mM EDTA를 함유하는 1X PBS에 의해 색 전개 반응을 중단시켰다. 아카데미아 시니카[Academia Sinica; Taipei, Taiwan]에서 시판하고 있는, 기업 내부용으로 작성된 MuCDA 프로그램을 이용하여 정량화를 수행하였다. 이 프로그램은 각 스팟의 통합 밀도를 측정하고, 그 통합 밀도 데이터 상에서 회귀 분석을 수행한 다음, 통계적 이상점(outlier)을 다르게 발현된 유전자로서 국재시킴으로써, 다르게 발현된 유전자를 분리시킨다.
분자 클로닝 및 플라스미드 작제물.SuperScript II RTase(Gibco-BRL, Rockville, Maryland)와 랜덤 헥사머성 프라이머를 사용하여 RNA를 역전사시켰다. 완전한 사람 CRMP-1(유전자 은행 기탁 번호 D78012) 코딩 영역을 코딩하는 cDNA를 PCR에 의해 CL1-0의 cDNA로부터 증폭시켰다. 프라이머 서열을 다음과 같다: 5' 프라이머: 5'-CTCCGTCCGTGTCTCTATCC-3'(서열번호 3, D78012의 뉴클레오티드 24-43); 및 3' 프라이머: 5'-CCTCCATCAGCACCAACTAAA-3'(서열번호 4, D78012의 뉴클레오티드 1955-1975). 반응 혼합물을 94℃에서 30초 동안 변성시키고, 55℃에서 30초 동안 어닐링시킨 다음, 72℃에서 3분 동안 신장시켰다. 이들 반응을 30회 반복하였다. 1952-bp CRMP-1 cDNA 단편을 제조업자의 지시(pGEM-T-Easy 클로닝 키트; Promega, Madison, Wisconsin)에 따라서 TA 벡터 내로 클로닝시켰다. 서열 분석 결과, CRMP-1 cDNA에 대한 공개된 서열[참조: Hamajima et al. (1996)Gene180:157-63)과 100% 상동율을 나타내었다.
CRMP-1 cDNA(D78012의 뉴클레오티드 24-1975)를 pCI-neo 포유류 발현 벡터(Promega, Madison, Wisconsin)의 EcoRI와 NotI 부위 사이에 삽입시킴으로써, pCIneo-CRMP-1를 생성시켰다. 부분 길이의 CRMP-1 cDNA(뉴클레오티드 376-1975)를 pRSET C 원핵성 발현 벡터(Invitrogen, Carlsbad, California)의 PstI과 EcoR I 부위 사이에 삽입하여 융합 단백질을 생성시키기 위한 pRSET-CRMP-1을 작제하였다. CRMP-1 cDNA의 코딩 영역(뉴클레오티드 151-1869)을 pCIneo-CRMP-1 플라스미드로부터 PCR에 의해 증폭시켰다. 전진 프라이머 5'-ATTGACTCGAGATGTCGTACCAGGGCAAGAA-3'(서열번호 5)는 CRMP-1 서열로부터의 뉴클레오티드 151-170을 포함하며, Xho I 부위(밑줄쳐져 있음)가 도입되어 있다. 후진 프라이머 5'-ATATCGAATTCTCAACCG AGGCTGGTGAT-3'(서열번호 6)은 뉴클레오티드 1852-1869에 상보적이고, EcoRI 부위(밑줄쳐져 있음)가 도입되어 있다. 단백질 국재화 연구를 위해, 상기와 같이 증폭된 CRMP-1 단편을 프레임 내에 CMV 프로모터-구동된 녹색 형광 단백질(GFP) 발현 벡터-pEGFP-C3(Clontech, Palo Alto, Calfornia)의 XhoI 및 EcoRI 부위 내로 삽입하여 pEGFP-CRMP-1를 생성시켰다. 이들 작제물을 플라스미드 클론으로부터 분리시키고, 자동 서열 분석기(모델 ABI 377, PE Applied Biosystems, Forster City, California)를 이용하여 이중 가닥 DNA의 양 가닥을 대상으로 하여 서열분석하였다.
모노클로날 항체 생성.pRSET-CRMP-1를 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli) 균주 BL21(DE3)pLysS 내로 형질전환시켰다. 융합 단백질[His-CRMP(아미노산 76-572)로 명명됨]을 봉입체(inclusion body)로서 수득하였다. 이러한 봉입체를 가용화시키고, 12.5% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 정제하였다. BALB/c 마우스(6주생)에게 0.1ml의 멸균성 인산염 완충 식염수(PBS)에 유화시킨 프로인트 완전 애쥬반트(Life Technologies, Grand Island, New York) 0.1ml 중의 SDS-PAGE 정제된 융합 단백질을 피하 주사하였다. 이어서, 마우스에게 3주 마다 0.1ml의 멸균성 PBS에 유화시킨 프로인트(Freund) 불완전 애쥬반트(Life Technologies, Grand Island, New York) 0.1ml 중의 융합 단백질을 피하 주사하였다. 본 발명자들은 음성 대조군으로서 예비면역 혈청을 사용하여, 웨스턴 블로팅함으로써 항체 역가를 체크하였다. 한 마우스로부터의 비장 세포를 폴리에틸렌 글리콜 1500(Roche GmnH, Mannheim, Germany)의 존재하에 마우스 골수종과 융합시켰다. 하이브리도마를, 15% NuSerum(Collaborative Research, Bedford, Massachusetts) 및 하이포크산틴-아미노프테린-티미딘 HAT(Sigma, St. Louis, Missouri)가 보충된 DMEM 및 RPMI-1640(1:1) 배지 중의 96-웰 판에 도말하였다. 상등액을 대상으로 하여, His-CRMP(아미노산 76-572) 융합 단백질에 대해 웨스턴 블롯함으로써 스크리닝하였다.
노던 혼성화 및 웨스턴 블롯 분석.0.8% 아가로스 포름알데히드 겔 상의 각 레인에 총 RNA 20㎍을 로딩하고, 1X MOPS 수행 완충액에서 전기영동한 후, 겔을 모세관 방법에 의해 하이본드(Hybond)-N+나일론 막(Amersham, Buckinghamshire, United Kingdom) 상으로 블로팅하였다. U.V. 가교결합한 후, 상기 막을 42℃에서 4시간 동안, 5X SSC, 5X 덴하르트 용액, 50mM NaPO4(pH 6.2), 100㎍/ml 연어 정자 DNA, 및 50% 탈이온화 포름아미드에서 예비혼성화시켰다. 이어서, 상기 막을, 레디프라임(Rediprime) DNA 표지화 시스템(Amersham, Buckinghamshire, United Kingdom)을 사용하여 합성된32P-표지된 DNA 프로브와 혼성화시켰다. 혼성화를 42℃에서 18시간 동안, 5X SSC, 5X 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 설페이트, 20mM NaPO4(pH 6.2), 100㎍/ml 연어 정자 DNA, 및 50% 탈이온화 포름아미드에서 수행하였다. 상기 막을 실온에서 15분 동안 2X SSC 및 0.5% SDS로 2회 세척한 다음, 52℃에서 30분 동안 0.1X SSC 및 0.1% SDS로 2회 세척하였다. 이 막을 70℃에서 밤새 X선 필름에 노출시켰다. 각 레인의 RNA 양은 이를 Gβ-형 프로브[RNA 양에 대한 내부 대조군으로서 사용된 하우스키핑(housekeeping) 유전자]의 시그널 세기와 비교함으로써 측정하였다[참조: Shan et al. (1992)Mol Cell Biol12:5620-31].
전체 세포 용해물(단백질 5㎍)을 12.5% SDS-PAGE에 의해 분리시키고, 이를 전기전이에 의해 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막(Immobilon-P membrane, Millipore, Bedfore, Massachusetts)에 전이시킨다. 5% 탈지유의 0.1% Tween-20 함유 PBS 용액으로 블로킹한 후, 막-결합 단백질을 모노클로날 항체로 프로빙(probe)시켰다. 상기 막을 세척하고, 서양 고추냉이 퍼옥시다제-접합 안티마우스 2차 항체(Amersham, Buckinghamshire, United Kingdom)를 적용하였다. 증진된 화학발광 검정 키트(Amersham, Buckinghamshire, United Kingdom) 및 X선 필름을 사용하여 단백질 밴드를 탐지하였다.
형질감염 및 선별.pCIneo-CRMP-1 플라스미드 5㎍을, 앞서 기재된 바와 같이 20U LipofectAMINE 시약(Gibco-BRL, Rockville, Maryland)을 이용하여 70% 밀집성 CL1-5세포 내로 형질감염시켰다. 이러한 CL1-5세포를, 대조군으로서의 삽입물[모의 형질감염체(mock transfectant)]을 전혀 함유하지 않는 pCI-neo 벡터로 또한 형질감염시켰다. 안정한 형질감염체를 선별하기 위하여 젠타마이신-G418(Gibco-BRL, Rockville, Maryland)을 500㎍/ml의 농도로 가하였다. 선별 배지를 3주 동안 3일 마다 변화시켰다. 내성 세포 클론을 분리하고 추가의 성상 확인을 위해 성장시켰다. 이와 같이 형질감염된 플라스미드 DNA가 염색체성 DNA 내로 통합되었는지는 노던 혼성화에 의해 확인하였다. 일시적인 형질감염을 위해, CL1-0및 CL1-5세포의 70% 밀집성 배양물을 LipofectAMINE 시약에 의해 pEGFP-CRMP-1 플라스미드로 형질감염시켰다. 48시간 후, 살아있는 세포를 직접 검사하고, MRC-1000 레이저 스캐닝 공촛점 영상 시스템이 장착된 Zeiss Axiphot 에피플루오레센스 현미경(Bio-Rad, Rockville Center, New York)을 사용하여 사진을 찍는다[참조: Hong et al. (2000)Am J Respir Cell Mol Biol23:355-63].
시험관내 침입 검정 및 세포 성장 검정.막 침입 배양 시스템(MICS)을 사용하여, 형질감염된 클론의 침입력을 검사하였다[참조: Chu et al. (1997)Am J Respir Cell Mol Biol17:353-60]. 이러한 MICS 시스템에서는, 10㎛ 기공을 함유하는 폴리카보네이트 막(Nucleopore Corp., Pleasanton, California)을 5mg/ml 마트리겔의 혼합물로 피복시켰다. 이 막을 MICS 챔버의 상단- 및 하단-웰 판 사이에 놓아두었다. 세포를, 10% NuSerum을 함유하는 RPMI-1640에 재현탁시키고, 상기 방의 상단 웰 내로 접종하였다(2.5 x 104세포/ml). 37℃에서 48시간 동안 항온 배양한 후, 피복된 막을 통하여 침입된 세포를 PBS 중의 1mM EDTA를 이용하여 하단 웰로부터 제거하고, 이를 3㎛ 기공이 있는 폴리카보네이트 막 상으로 도트-블로팅하였다. 이와 같이 블로팅된 세포를 프로피듐 요오드(Sigma, St. Louis, Missouri)로 염색하고, 현미경(50X 배율) 하에 PC 소프트웨어(The Aanlytical Imaging Station; Imaging Research Inc., Ontario, Canada)를 사용하여 각 블롯 중의 세포수를 계수하였다. 각 실험을 3회 수행하는데, 각 샘플을 3중으로 실험하였다.
변형된 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 검정을 사용하여 세포 성장을 측정하였다[참조: 예를 들면, Denizot et al. (1986)J Immunol Methods89:271-7]. 세포를 배양 배지(100㎕) 중에서 웰당 4000개 세포로 96-웰 판 상으로 접종하였다. 상기 판을 4일 동안 항온 배양하였다. MTT 검정에서는, 10㎕의 MTT 용액(5mg/ml)을 각 웰에 가하고, 세포를 37℃에서 4시간 더 배양하였다. 이어서, 0.04N HCl의 이소프로판올 100㎕를 각 웰에 가한 다음, 격렬하게 혼합하여 세포 내에 생성된 착색 결정을 가용화시켰다. 570nm에서의 흡광도 내지 630nm에서의 흡광도를 참조 파로 하여 멀티웰 스캐닝 분광광도계(Titertek Multiskan, Flow Laboratories, McClean, Virginia)에 의해 측정하였다. 트리판 블루 염료 배타 시험에 의해 세포 생육성을 검사하였다. 각 데이터 점은 각 실험을 3회 이상 반복한 6가지 결정치의 평균을 나타낸다.
F-악틴 염색.커버슬립 상에서 성장시킨 세포를 PBS에서 3회 세척하고, 3.7% 파라포름알데히드의 PBS에서 10분 동안 고정시키며, 0.1% 트리톤 X-100의 PBS를 사용하여 침투시켰다. 5% 비-지방 우유의 PBS로 15분 동안 처리함으로써 비-특이적 결합 부위를 차단시켰다. PBS로 5분 세척한 후, 세포를 30분 동안 로다민-접합 팔로이딘 5U/ml(Molecular Probe, Eugene, Oregon)과 함께 항온 배양하였다. PBS 세척 후, 60% 글리세롤, 2% n-프로필 갈레이트 함유 PBS(pH 8.0)를 함유하는 봉입 배지를 사용하여 상기 세포를 슬라이드 상에 올려 놓는다. Zeiss Axiphot 에피플루오레센스 현미경을 사용하여 상기 세포를 검사하고 사진을 찍으며, 코닥 T-max 400 필름을 이용하여 현상하였다.
환자 및 표본.1994년 9월에서부터 1996년 12월 까지 국립 타이완 대학 병원(National Taiwan University Hospital)에서 실시된 비-작은 세포 폐암에 대한 반응을 경험한 일련의 80명 환자가 본 연구에 포함되었다. 이러한 연구 조사는 국립 타이완 대학 병원의 검열국 협회에 의해 승인된 후에 수행하였다. 모든 환자로부터 서면 동의서를 받았다. 어떠한 환자도 수술 전에 방사선 요법이나 비-애쥬반트 화학요법을 받는 적이 없기 때문에, 종양 조직 샘플 모두 치료 받은 적이 없는 샘플이다. 수술시 수득한 폐암 조직과 폐의 비-종양부의 표본을 액체 질소에서 즉시 동결시킨 다음, 사용시까지 -80℃ 하에 저장하였다. 세계 보건 기구 기준[참조: World Health Organization (1982)Am J Clin Pathol77:123-36]에 따라서 조직학적 분류를 수행하였다. 병리학적 검사를 통해 종양 크기, 침입 위치 및 림프절 전이를 결정하였다. 폐암 단계 결정용 현 종양-절-전이 시스템(current tumor-node metastasis system)에 따라서, 외과적 발견과 병리학적 발견을 조합함으로써 최종 질병 단계를 결정하였다[참조: Mountain (1997)Chest111:1710-7]. 환자는 51명의 남성과 29명의 여성으로 구성되었다(평균 연령 62.9±10.5세). 이들 환자 중에서 38명이 편평 세포 암종이고 42명이 선암종이다. 질병의 외과적-병리학적 단계는 31명 환자가 I기이고, 19명 환자가 II기이며, 24명 환자가 III기이며 6명 환자가 IV기이다. 종양 상태는 15명 환자가 T1이고, 42명 환자가 T2이며, 9명 환자가 T3이고 14명 환자가 T4였다. 42명 환자는 어떠한 림프절 전이도 나타내지 않았으며(N0), 38명은 국부적 또는 종격동 림프절 전이(19명 환자가 N1이고, 18명 환자가 N2이며 1명 환자가 N3이다)를 나타내었다. 추적 데이터를 환자의 의료 차트로부터 수득하는데, 이것이 본 발명자의 종양 등록 서비스로부터 보고받았다. 6.5개월에서부터 70개월 까지의 추적 조사가 2000년 6월까지 지속되었다. 수술일로부터 국소 재발 또는 전신 전이의 탐지일까지를 재발 시간으로 계산하였다. 수술일로부터 사망일까지를 생존 시간으로 계산하였다. 재발 시간은 2 내지 42개월(평균 11.0개월)이고, 생존 시간은 6.5 내지 53개월(평균 20.5개월)이었다. 수술 받은 후 30일 이내에 수술후 합병증으로 사망한 환자는 생존 분석에서 제외되었다.
실시간 정량적 역전사 폴리머라제 연쇄 반응.RNA 추출 키트(RNesay Mini Kit; Qiagen, Valencia, California)를 사용하여, 절제된 암 조직으로부터 총 mRNA를 추출하였다. 아가로스 겔을 통하여 전기영동시키고 에티듐 브로마이드로 염색함으로써 RNA 샘플의 양을 결정하고 18S 및 28S RNA 밴드를 UV광선 하에 가시화하였다. 250ng, 50ng, 10ng 및 2ng의 범위를 커버하기 위해 특이적 RNA 샘플을 일련으로 희석시킴으로써, 실시간 정량적 RT-PCR에 사용된 표준 곡선 샘플을 제조하였다. 이와 같이 일련으로 희석된 샘플을 등분하고 사용시까지 -80℃로 저장하였다. CRMP-1의 cDNA 서열을 기준으로 하여, CRMP-1 mRNA의 정량적 RT-PCR에 사용된 프라이머는 다음과 같다: (1) 전진 프라이머, 5'-CCACGATGATCATTGACCATGT-3'(서열번호 7, 엑손 3), 및 (2) 후진 프라이머, 5'-AGGGAGTAATCACAGCAGGATTTG-3'(서열번호 8, 엑손 4)[참조: Torres (1998)DNA Res5:393-5]. 상기 RT-PCR 생성물을 탐지 및 정량화하는데 사용된 프로브의 서열은 FAM(카복시플루오레세인) 5'-AGCCTACTGACCTCTTTCGAGAAGTGGCA-3'TAMRA(N,N,N',N'-테트라메틸-6-카복시로다민(서열번호 9)이다. CRMP-1 cDNA에 특이적인 상기 서열은 PCR 생성물의 정량화가 CRMP-1 게놈 DNA를 오염시키는 것을 피하기 위해 엑손 3-엑손 4 연결부가 확장되도록 선택하였다. TBP mRNA(내부 대조군, 유전자 은행 기탁 번호 X54993)의 정량적 RT-PCR에 사용된 프라이머 및 프로브는 문헌[참조: Bieche et al. (1999)Clin Chem45:1148-56]에 기재된 바와 같다. PCR 생성물의 실체는 DNA 서열 분석을 통하여 확인하였다. 각 검정은 표준 곡선, 비-주형 대조군, 및 3중 총 RNA 샘플을 포함하였다. 반응 조건은 앞서 기재된 바와 같다[참조: Yuan et al. (2000)Am J Respir Crit Care Med162:1957-63]. 상기 리포터 염료에 의해 방출된 형광성은 ABI 프리즘 7700 서열 탐지 시스템(PE Applied Biosystems, Foster City, California)을 사용하여 실시간으로 온라인으로 탐지하였다.
통계학적 분석.경우에 따라, 데이터는 평균±표준 편차(SD)로 나타낸다. 모든 통계학적 분석을 SPSS 버젼 8.0으로 수행하였다. 그룹들 간의 데이터 비교를 스튜던츠 시험(Student's test)으로 수행하였다. 쌍을 이룬 켄달(Kendall) W 시험을 사용하여 종양 샘플과 쌍을 이룬 정상 조직 간의 CRMP-1 mRNA 발현의 -△CT를 비교하였다. 피셔 정밀 시험(Fisher exact test)과 스튜던츠 시험을 사용하여 종양(및 환자)의 임상 병리학적 특징과 CRMP-1 mRNA 고발현 및 저발현을 비교하였다. 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 방법에 의해 생존 곡선을 수득하고, CRMP-1 고발현 그룹과 CRMP-1 저발현 그룹 간의 재발 시간 차이를 생존차로서, 로그-랭크 시험(log-lank test)으로 분석하였다. 모든 통계 시험은 양측 시험(two-sided test)이다. 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주된다.
결과
cDNA 마이크로어레이에 의한 다르게 발현된 CRMP-1 mRNA의 동정.비색 탐지를 수반한 cDNA 마이크로어레이를 사용하여, 침입도가 다양한 폐암 세포주(CL1-0, CL1-1, CL1-5및 CL1-5-F4) 중에서 다르게 발현된 유전자를 동정하였다. 이들 4가지 세포주는 침입정도가 상이하였다. 침입력 순서를 따지면, 상기 4가지 세포주는 다음과 같다: CL1-0< CL1-1< CL1-5≤ CL1-5-F4. cDNA 마이크로어레이의 모든 실험을 3회 수행하였다. 세포주를 3가지 독립적인 배양물에서 성장시키고, 전체 과정을 RNA 추출에서부터 영상 분석까지 독립적으로 수행하였다. 이들 실험의 표준 편차는 7.3%이다. cDNA 마이크로어레이 데이터를 클러스터 분석한 결과, 약 500개 유전자가 암 세포의 침입력과 양성 또는 음성 상관관계에 있는 것으로 밝혀졌다. 이들 유전자의 대부분이 혈관형성 과정, 세포 이동성, 부착, 및 증식과 관련이 있다. 이들 중에서, CRMP-1의 mRNA 발현이 세포주 침입력과 음성 상관관계에 있다.
노던 혼성화 결과, CRMP-1 발현 수준이 CL1-0및 CL1-1에 비해 CL1-5및 CL1-5-F4에서 현저하게 저하되었다는 사실을 확인하였다. mRNA 수준에서의 CRMP-1의 다른 발현이 단백질 수준에도 영향을 미친다는 사실을 확인하기 위해, CRMP-1에 대한 특이적 모노클로날 항체-Y21을 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 모노클로날 항체-Y21은 CRMP-1을 인식하였지만, 다른 CRMPs은 인식하지 못하였다. CL1-5및 CL1-5-F4에서의 CRMP-1의 발현 저하는 일관되게 관찰되었다.
CRMP-1의 과발현은 시험관내에서 암종 세포의 침입성을 억제시킬 수 있다.침입 표현형과 CRMP-1 발현 간에 인과 관계가 존재하는지를 조사하기 위하여, pCI-neo 벡터 내에 CRMP-1 cDNA를 수반하는 플라스미드 작제물을 만들고, 이를 CL1-5에 형질감염시킨 다음, CRMP-1를 안정적으로 발현하는 5개 클론을 분리하였다. 노던 혼성화를 수행하여, 모의 형질전환체 및 CRMP-1 cDNA 형질감염된 클론(B5, C6, C8, C10 및 C22)에서의 CRMP-1 발현을 분석하였다. CRMP-1 cDNA의 완전한 코딩 영역 1.95kb를 프로브로서 사용하였다. 5개 모든 CRMP-1 형질감염된 클론은 CRMP-1 mRNA 전사체를 발현하였다. 이와는 달리, 모의 형질감염체는 탐지 가능한 어떠한 CRMP-1 전사체도 발현하지 못하였다. Gβ-형 프로브를 RNA 품질에 대한 내부 대조군으로서 사용하였다. 웨스턴 블로팅을 또한 수행하여, 모의 형질감염체 및 5개 CRMP-1 형질감염된 클론에서의 CRMP-1 발현을 분석하였다. CRMP-1 모노클로날 항체-Y21을 1차 항체로서 사용하였다. CRMP-1 단백질은 CRMP-1 형질감염된 클론에서 발현되었지만, 모의 형질감염체에서는 발현되지 못하였다. 시험관내 재구성된 기저막 침입 검정을 이용하여, CRMP-1 발현이 암세포 침입에 영향을 미쳤는지를 결정하였다. CRMP-1의 발현은 CL1-5세포에서의 시험관내 침입 능력을 억제시켰다. 모의 형질감염체와 CRMP-1-형질감염된 클론(B5, C6, C8, C10 및 C22) 간의 상대적 침입력 비교를 용이하게 하기 위해, 모든 값을 모의 형질감염체(100%)와 비교한 상대 침입 능력%로 표준화하였다. 각 클론을 3중으로 3회 검정하였다. 48시간 항온 배양한 후, 침입 잠재력의 상당한 저하(40 내지 60%)가 CRMP-1 발현성 클론에서 인지되었다(P<0.01). 그러나, 어떠한 추가의 침입 억제도 일어나지 않는 CRMP-1의 한계 수준이 있었다.
종양 세포는 침입하여 전이되는 일련의 복잡한 단계를 거쳐야만 하고; 가장 기본적인 단계 중의 하나가 세포 성장이다. 변형된 MTT 검정을 이용하여, CRMP-1 형질감염체 및 모의 형질감염체의 시험관내 세포 성장율을 측정하였다. 시험관내 증식이 CRMP-1 발현 변형에 의해서도 거의 변하지 않았다는 사실은, CRMP-1이 세포 증식 제어 이외의 기전에 의해 세포 침입을 조절할 수 있다는 것을 나타낸다.
CRMP-1 과발현된 세포에서 F-악틴 중합의 변형.F-악틴을 운동성 세포에서 연속적으로 중합 및 탈중합시킨다[참조: Symons & Mitchison (1991)J Cell Biol114:503-13]. 악틴 중합은 운동성 세포에서 라멜라성 돌출과 시간적 및 공간적으로 상관관계에 있으며, 세포 운동성 과정에 중요한 역할을 함으로써[참조: Cooper (1991)Ann Rev Physol53:585-605], 종양 침입에 영향을 미친다. 팔로이딘은 필라멘트 중의 악틴 서브유니트와 단단하게 결합하지만, 단량체와는 결합하지 못한다. CL1-0, CL1-1, CL1-5및 CL1-5-F4을 로다민-접합 팔로이딘으로 염색하고, 세포를 형광 현미경으로 관찰하였다. 필로포디아의 양은 CL1-5또는 CL1-5-F4보다 CL1-0에서 훨씬 적다. 이와 같이 형질감염된 세포 클론의 F-악틴을 또한 염색하였다. CRMP-1 형질감염된 세포는 침입성이 낮은 세포주에서의 발현 수준이 더 높고 활발하다는 사실이 관찰되었다. 수 많은 필로포디아가 모 CL1-5에서와 동일한 모의 형질감염체에서 탐지되었다. 흥미롭게도, CRMP-1 형질감염된 CL1-5은 CL1-0과 유사한, 이들의필로포디아 투영에 있어서 현저한 저하를 나타내었다.
세포 내에서의 CRMP-1의 동적 분포 및 CRMP-1과 유사분열 방추의 연관성.상이한 세포 주기 단계 동안 CRMP-1의 세포내 국재화를 결정하기 위해, CRMP-1 cDNA의 완전한 코딩 영역을 포유류 형질감염 벡터에서 클로닝시켜 CL1-0및 CL1-5에서 증강 녹색 형광 단백질(EGFP) 표지시킨 CRMP-1를 발현시켰다. 레이저 스캐닝 공촛점 현미경을 이용하여 수득된 형광 영상은, CL1-0및 CL1-5에서의 EGFP-표지된 CRMP-1의 분포도가 동일함으로 나타냈다. 분열간기(interphase)에서, CRMP-1는 세포질에 확산 분포되었다. 이러한 분포는 미세소관 및 F-악틴의 것과는 별개이다. 그러나, 몇몇 EGFP-CRMP-1 형질감염된 세포에서는, CRMP-1이 세포질 뿐만 아니라 핵에 국재되었다. 전기(prophase)에서는, 특정의 CRMP-1 단백질이 중심체에 축적되었다. 중기(metaphase) 동안에는, 대다수의 CRMP-1이 유사분열 방추와 강력하게 연합되며, 또한 중심체에 집중되었다. 후기(anaphase) 동안에는, CRMP-1이 이와 유사분열 방추와의 연합을 유지하였다. 최종 말기(late telophase) 동안에는, 이것이 중심체에 응축되었다.
폐암 조직에서의 CRMP-1 mRNA 발현이 폐암 환자에서의 수술후 재발 및 생존과 상관이 있다.실시간 정량적 RT-PCR을 사용하여 CRMP-1의 전사체 복사(copy) 수를 정량화하였다. 한계 주기(CT)는 프로브의 절단에 의해 발생된 형광치가 기선 위의 고정된 한계치를 초과하는 분획 주기 수로서 정의된다. 선택된 한계치의 경우, 출발 복사 수가 더 작을 수록 CT값이 더 커진다. 본 연구에서는, TATA-박스결합성 단백질(TBP) mRNA를 내부 대조군으로서 사용하였다[참조: Bieche et al. (1999)Clin Chem45:1148-56]. TBP mRNA의 양에 대해 표준화시킨, 조직 CRMP-1 mRNA의 상대량은 -△CT = -[CTCRMP-1- CTTBP]로서 표현된다. 이어서, CRMP-1 mRNA 복사/TBP mRNA 복사 비를 2-△CTx K(K: 상수)로서 계산하였다[참조: Yuan et al. (2000)Am J Respir Crit Care Med162:1957-63]. 80개 모든 종양 샘플에서 측정된 CRMP-1 mRNA 발현은 인접한 정상 조직에서 보다 상당히 더 낮다(P < 0.001, 쌍을 이룬 켄달 W 시험; 양측). 80개 종양 샘플의 -△CT는 -5.67 내지 3.73이고, 평균 -1.94±2.11(평균±SD)이며, 중앙 값(median)은 -1.95이다. 이러한 중앙 값을 사용하여 환자를 고 발현 그룹 또는 저 발현 그룹으로서 분류하였다(표 1). 저 발현 그룹의 구성원은 고 발현 그룹의 구성원 보다 진행성(III 또는 IV기) 질병(P = 0.010) 및 림프절 전이(N1, N2 및 N3)(P = 0.043)를 나타낼 확률이 더 높다(표 1). 또한, 수술후 평균 재발 기간은 저 발현 그룹(15.9개월; 95% 신뢰 간격[CI] = 8.3-23.5개월)에서 보다 고 발현 그룹(30.5 개월; 95% CI = 5.6-55.5개월)에서 더 길다(로그-랭크 시험, P = 0.030). 고 발현 그룹(생존 확률은 0.52이다)은 저 발현 그룹(평균 생존 기간 17.9개월; 95% CI = 20.83-35.0개월)에서 보다 생존 기간이 훨씬 더 길다(로그-랭크 시험, P = 0.016)[참조: 2001년 6월 26일자로 출원된 미국 특허원 제60/301,075호의 도 1].
[표 1]
CRMP-1 mRNA 고 발현 및 저 발현을 나타내는 종양의 임상 병리학적 특징
CRMP-1 mRNA-△CT < -1.95환자 번호 CRMP-1 mRNA-△CT > -1.95환자 번호 P 값
평균 연령(세) 62±10 63±11 0.627*
성별남성여성 2416 2713 0.642
단계I-II기III-IV기 1921 319 0.010
종양 상태T1-2T3-4 2515 328 0.137
노달 상태N0N1-3 1624 2614 0.043
조직학편평 세포 CA선암종 1624 2218 0.263
*스튜던츠 시험을 사용하여 유도됨; 피셔 추출 시험을 사용하여 유도된 기타 P 값.CA = 암종
기타 태양
본 명세서에 기재된 모든 태양는 어떠한 조합으로든 사용할 수 있다. 본 명세서에 기재된 각 태양는 동일하거나, 등가의 유사한 목적을 제공해주는 대체 태양로써 대체될 수 있다.
상기 기재 내용으로부터, 당업자는 본 발명의 본질적인 특징을 용이하게 확인할 수 있고, 본 발명의 요지 및 범위를 벗어나지 않고서도, 이를 각종 용도와 조건에 적응하도록 본 발명의 각종 변화 및 변형을 만들 수 있다. 따라서, 기타 태양가 또한 다음 청구의 범위 내에 있다.
본 발명은 콜랩신 반응 매개체 단백질-1(CRMP-1)이 종양 전이와 관련이 있다는 발견에 근거한 것으로서, CRMP-1 단백질 또는 mRNA의 수준을, 세포내 침입력의 지표 및 세포내 침입력을 변화시키는 시험 화합물의 능력에 대한 지표로서 사용할 수 있다. CRMP-1 단백질의 수준을 변화시켜, 예를 들면, 침입력을 저하시킬 수도 있다.

Claims (32)

  1. 세포를 포함하는 제1 샘플 중의 CRMP-1 단백질 또는 mRNA의 수준을 결정하는 단계;
    정상 세포를 포함하는 제2 샘플 중의 CRMP-1 단백질 또는 mRNA의 수준을 결정하는 단계;
    제1 샘플과 제2 샘플 중의 CRMP-1의 수준을 비교하는 단계; 및
    제1 샘플의 수준이 제2 샘플의 수준 보다 낮을 경우, 피검자가 종양 침입 잠재력 또는 전이 잠재력을 지니는 것으로 분류시키는 단계
    를 포함하는, 샘플의 평가 방법.
  2. 제1항에 있어서, 제1 샘플의 세포를 시험 화합물과 접촉시키고, 상기 정상 세포를 시험 화합물과 접촉시키지 않는 샘플의 평가 방법.
  3. 제1항에 있어서, 제1 샘플이 피검자로부터의 얻은 생검(biopsy)인 샘플의 평가 방법.
  4. 제3항에 있어서, 생검이 종양 또는 림프절로부터 유래된 것인 샘플의 평가 방법.
  5. 제3항에 있어서, 피검자가 사람인 샘플의 평가 방법.
  6. 특정 피검자로부터 세포를 수득하는 단계;
    상기 세포 중의 CRMP-1 단백질 또는 mRNA 발현 수준을 결정하는 단계; 및
    이와 같이 결정된 상기 세포 중의 CRMP-1 수준과 기준 세포 중의 기준 발현 수준 간의 유사도를 나타내는 특징적인 값을 결정하는 단계
    를 포함하는, 피검자 평가 방법.
  7. 제1항 또는 제6항에 있어서, CRMP-1 단백질 수준을 결정하는 평가 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 결정 단계가 항체 또는 항원 결합성 단편을 각각의 샘플과 접촉시키는 것을 포함하는 평가 방법.
  9. 제8항에 있어서, 항체 또는 항원 결합성 단편이 서열번호 2를 포함하는 단백질과 결합하는 평가 방법.
  10. 제1항 또는 제6항에 있어서, CRMP-1 mRNA 수준을 결정하는 평가 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 결정 단계가, 엄격한 조건 하에서 서열번호 1과 혼성화하는 프로브를 상기 샘플과 접촉시키는 것을 포함하는 평가 방법.
  12. 제1항 또는 제6항에 있어서, 많아야 50개의 기타 유전자 또는 유전자 산물 수준을 결정하는 평가 방법.
  13. 제6항에 있어서, 기준 세포가 배양된 폐 선암종 세포인 피검자 평가 방법.
  14. 제6항에 있어서, 상기 특징적인 값이, 하우스키핑 유전자의 발현 수준을 이용하여 표준화시키는 것을 포함하는 방법에 의해 결정되는 피검자 평가 방법.
  15. 포유류 세포를 시험 화합물과 접촉시키는 단계; 및
    상기 시험 화합물이 상기 포유류 세포 중의 CRMP-1 mRNA 또는 단백질의 수준을 변화시키는지를 결정하는 단계
    를 포함하는 시험 화합물 평가 방법.
  16. 제15항에 있어서, 시험 화합물이 아연 핑거 도메인을 포함하는 시험 화합물 평가 방법.
  17. 제15항에 있어서, 시험 화합물이 면역글로불린 가변 도메인을 포함하는 시험 화합물 평가 방법.
  18. 제15항에 있어서, 시험 화합물이 핵산을 포함하는 시험 화합물 평가 방법.
  19. 제15항에 있어서, 시험 화합물이 마이셀 또는 바이러스에 의해 세포에 전달되는 시험 화합물 평가 방법.
  20. 제15항에 있어서, 시험 화합물의 분자량이 2킬로달톤 미만인 시험 화합물 평가 방법.
  21. 제15항에 있어서, 포유류 세포를 시험관내에서 시험 화합물과 접촉시키는 시험 화합물 평가 방법.
  22. 제15항에 있어서, 상기 결정 단계 전, 동안 또는 후에, 시험 화합물과 접촉된 포유류 세포의 침입력을 평가하는 단계를 추가로 포함하는 시험 화합물 평가 방법.
  23. 제15항에 있어서, 상기 세포가 CRMP-1 조절 서열에 작동적으로 연결되는 리포터(reporter) 유전자를 포함하는 시험 화합물 평가 방법.
  24. 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 이종 핵산을, 이 핵산이 번역되고 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 생성되는 조건 하에서, 포유류 세포에서 발현시키는 단계를 포함하는, 포유류 세포의 침입 특성을 변화시키는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 세포가 발현 동안 시험관내에 있는 포유류 세포의 침입 특성을 변화시키는 방법.
  26. 제24항에 있어서, 상기 발현 단계 이전에, 이종 핵산을 포함하는 바이러스를 상기 세포와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 포유류 세포의 침입 특성을 변화시키는 방법.
  27. 제24항에 있어서, 상기 세포가 폐 세포인 포유류 세포의 침입 특성을 변화시키는 방법.
  28. 제24항에 있어서, 상기 세포가 종양 세포인 포유류 세포의 침입 특성을 변화시키는 방법.
  29. 제24항에 있어서, 상기 세포가 사람 세포인 포유류 세포의 침입 특성을 변화시키는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 세포가 전이 종양을 갖는 피검자의 세포인 포유류 세포의 침입 특성을 변화시키는 방법.
  31. (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 이의 작용성 단편; (b) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산, 또는 이의 작용성 단편; 및 (c) CRMP-1의 발현을 조절하는 시험 화합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 제제의 유효량; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  32. 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 결합되는, Y21 항체.
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