JP2002544560A - 機械的にサンプルに振動を加えながら固体粒子サスペンションの抽出されたサンプルを測定するための高い分解能のビデオ顕微鏡 - Google Patents
機械的にサンプルに振動を加えながら固体粒子サスペンションの抽出されたサンプルを測定するための高い分解能のビデオ顕微鏡Info
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- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
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Abstract
(57)【要約】
【課題】
【解決手段】固体粒子サスペンションの抽出されたサンプルを正確に測定するために、高い分解能のビデオ顕微鏡が用いられる。サンプルは攪拌流動されて、サンプルの複数の画像が極端に短い照射時間で記録される。
Description
【０００１】
僅かな量のサンプルサスペンション内の固体粒子（Partikel）の、測定技術的
な検知及び特性付けは、重要な診断方法である。例えば、イーストの製造の際に
又はビールの醸造の際に、サスペンションサンプルは醗酵容器から取り出される
。これらのサスペンションサンプルは、希釈された形で、標準化された透明の測
定室（例えばトーマ測定室）内で、実験室用顕微鏡の下で観察され、濃度の検出
のために正確にカウントされ、粒子の大きさについて、自動的画像処理によって
正確に測定される。このことは、例えば、生物工学又は化学的加工技術での粒子
によって制御されるすべての工程における標準的な方法である。これらの工程で
は、物質が微細粒子の形でリアクター内で生じ、物質の特性付けがなされなけれ
ばならない。
な検知及び特性付けは、重要な診断方法である。例えば、イーストの製造の際に
又はビールの醸造の際に、サスペンションサンプルは醗酵容器から取り出される
。これらのサスペンションサンプルは、希釈された形で、標準化された透明の測
定室（例えばトーマ測定室）内で、実験室用顕微鏡の下で観察され、濃度の検出
のために正確にカウントされ、粒子の大きさについて、自動的画像処理によって
正確に測定される。このことは、例えば、生物工学又は化学的加工技術での粒子
によって制御されるすべての工程における標準的な方法である。これらの工程で
は、物質が微細粒子の形でリアクター内で生じ、物質の特性付けがなされなけれ
ばならない。
【０００２】 医学においても、ミリリットル乃至マイクロリットルの容量の血液サンプルが
生じて、これらの血液サンプルは、同様に、染色法によって評価される。
生じて、これらの血液サンプルは、同様に、染色法によって評価される。
【０００３】
本発明は、少量のサスペンションの顕微鏡診断の場合に、２つの従来生じた問
題を解決する。
題を解決する。
【０００４】 第１には。実験室用顕微鏡の下での、標準化された血球計算板内で正確にカウ
ントするためには、視覚的又は自動的な特性付けに適切な、非常に希釈されたサ
ンプルサスペンションが、マイクロメートルの位の少量のサンプルに調製されて
いるまで、労力がかかりかつ間違いの多い複数の希釈工程が必要である。各希釈
工程と、測定室への最終的な供給は，正確な評価からのずれを生じさせる恐れが
ある。手による間違い、吸着作用、浸透作用、遠心沈降法、及び流れの加速度に
よる相分離は、粒子の調製された抜取りサンプルの代表的な特性を破壊すること
がある。
ントするためには、視覚的又は自動的な特性付けに適切な、非常に希釈されたサ
ンプルサスペンションが、マイクロメートルの位の少量のサンプルに調製されて
いるまで、労力がかかりかつ間違いの多い複数の希釈工程が必要である。各希釈
工程と、測定室への最終的な供給は，正確な評価からのずれを生じさせる恐れが
ある。手による間違い、吸着作用、浸透作用、遠心沈降法、及び流れの加速度に
よる相分離は、粒子の調製された抜取りサンプルの代表的な特性を破壊すること
がある。
【０００５】 第２には。準備された透明の測定室は正確かつ安定的に顕微鏡下で固定されね
ばならず、測定室の焦点が合わされなければならない。その理由は、残りの流れ
又は振動による攪拌によって生じるブレ又は光学的焦点外れが視覚的又は自動的
な画像評価を損なわないようにするためである。このことは顕微鏡載物台及び光
学的調節装置に多くの要求をする。
ばならず、測定室の焦点が合わされなければならない。その理由は、残りの流れ
又は振動による攪拌によって生じるブレ又は光学的焦点外れが視覚的又は自動的
な画像評価を損なわないようにするためである。このことは顕微鏡載物台及び光
学的調節装置に多くの要求をする。
【０００６】 実際の画像評価がディジタル式の画像処理によって自動化されることができる
ときでさえ、費用のかかる欠点として、労力のかかる実験室用顕微鏡の、容量の
正確な容器の、相応の綿密さによる焦点調整の必要性が残る。
ときでさえ、費用のかかる欠点として、労力のかかる実験室用顕微鏡の、容量の
正確な容器の、相応の綿密さによる焦点調整の必要性が残る。
【０００７】
２つの問題はここに記した本発明によって回避される。高い分解能の顕微鏡検
査法の必要性への見かけのパラドックスであるが、本発明では、サンプルは、電
子機械的又は磁気機械的な装置によって、常に攪拌及び迅速な運動に晒される。
この結果として、サンプルサスペンションが絶えず新たに均質混合されて、濃度
勾配が発生しない。
査法の必要性への見かけのパラドックスであるが、本発明では、サンプルは、電
子機械的又は磁気機械的な装置によって、常に攪拌及び迅速な運動に晒される。
この結果として、サンプルサスペンションが絶えず新たに均質混合されて、濃度
勾配が発生しない。
【０００８】 サスペンションからの高い分解能の顕微鏡画像を、人工的に加えられた攪拌の
故に、通常の顕微鏡によっては作成することができないので、本発明では、１マ
イクロ秒より少ない極端に短い照射時間を有する、高い分解能のビデオ顕微鏡が
用いられる。このビデオ顕微鏡はオンライン・プロセス制御の分野の従来の技術
である（ドイツ特許第40 32 002 C2号及び「In Situ Microscopy for On-line C
haracterization of Cell Population in Bioreactors」という記事、『Biotech
nology & Bioengineering 47』、106-117(1997)）。数マイクロ秒よりも少ない
、この顕微鏡の極端に短い照射時間は、機械的に揺動され、振動されているか、
又は攪拌されているサンプル容器内の動いている微細粒子を鮮鋭に撮影すること
を可能にする。
故に、通常の顕微鏡によっては作成することができないので、本発明では、１マ
イクロ秒より少ない極端に短い照射時間を有する、高い分解能のビデオ顕微鏡が
用いられる。このビデオ顕微鏡はオンライン・プロセス制御の分野の従来の技術
である（ドイツ特許第40 32 002 C2号及び「In Situ Microscopy for On-line C
haracterization of Cell Population in Bioreactors」という記事、『Biotech
nology & Bioengineering 47』、106-117(1997)）。数マイクロ秒よりも少ない
、この顕微鏡の極端に短い照射時間は、機械的に揺動され、振動されているか、
又は攪拌されているサンプル容器内の動いている微細粒子を鮮鋭に撮影すること
を可能にする。
【０００９】 更に、顕微鏡検査法のこのようなコンセプトは、機械的に制約された厳密な観
察容量を必要としない。この代わりに、対物レンズによる撮像の限定された焦点
深度によって、自らサスペンションのより大きな環境から分離される仮想の量を
用いることができる。観察された測定量は、自動画像処理のアルゴリズムにおけ
る、数字による鮮鋭度の基準を用いることによって、客観的にかつ再生可能に限
定される。この測定量は、一定の測定用サスペンションによって測定することが
できる。高速パルス形ビデオ顕微鏡は、人工的に乱流状又は流動状に保たれたサ
ンプルサスペンスからの、正確にカウント可能かつ正確に測定可能な直接撮影を
生じさせる。カウントされたオブジェクトを、測定によって、粒子の濃度の尺度
として直接解読することができる。
察容量を必要としない。この代わりに、対物レンズによる撮像の限定された焦点
深度によって、自らサスペンションのより大きな環境から分離される仮想の量を
用いることができる。観察された測定量は、自動画像処理のアルゴリズムにおけ
る、数字による鮮鋭度の基準を用いることによって、客観的にかつ再生可能に限
定される。この測定量は、一定の測定用サスペンションによって測定することが
できる。高速パルス形ビデオ顕微鏡は、人工的に乱流状又は流動状に保たれたサ
ンプルサスペンスからの、正確にカウント可能かつ正確に測定可能な直接撮影を
生じさせる。カウントされたオブジェクトを、測定によって、粒子の濃度の尺度
として直接解読することができる。
【００１０】 容器の透明な壁部を通して、多数の、例えば数百の画像が記録される。これら
の画像は，粒子の形状の正確なカウント及び測定のために、自動的画像処理装置
に送られる。
の画像は，粒子の形状の正確なカウント及び測定のために、自動的画像処理装置
に送られる。
【００１１】 サスペンションの均質混合及び濃度が沈降及び吸着による相分離への傾向に
抗して保たれているように、小形化された機械的攪拌器によって、あるいは、磁
気機械的又は電気機械的振動により加えられた揺動作用によって、動いている。
例えば、振動が加えられ、容器と接触している圧電結晶は、粒子を後で均質混合
し、かつ動かすために用いられることができる。画像情報を構成している静的な
抜取りサンプルの、その大きさは、記録された画像の数に比例している。しかし
乍ら、このことは、連続する画像のシーン（すなわち、偶然に画像に含まれる粒
子集団）が完全に相互に関係づけられていないことが保証されている場合にのみ
、妥当する。評価のために用いられ鮮鋭に写し出された、サスペンション内の仮
想のサンプル容量は、その内容を、２つの画像の間で完全に変換しなければなら
ない。正にこの目的は、容器への、本発明による機械的な揺動によって同様に適
えられる。
抗して保たれているように、小形化された機械的攪拌器によって、あるいは、磁
気機械的又は電気機械的振動により加えられた揺動作用によって、動いている。
例えば、振動が加えられ、容器と接触している圧電結晶は、粒子を後で均質混合
し、かつ動かすために用いられることができる。画像情報を構成している静的な
抜取りサンプルの、その大きさは、記録された画像の数に比例している。しかし
乍ら、このことは、連続する画像のシーン（すなわち、偶然に画像に含まれる粒
子集団）が完全に相互に関係づけられていないことが保証されている場合にのみ
、妥当する。評価のために用いられ鮮鋭に写し出された、サスペンション内の仮
想のサンプル容量は、その内容を、２つの画像の間で完全に変換しなければなら
ない。正にこの目的は、容器への、本発明による機械的な揺動によって同様に適
えられる。
【００１２】 以下の３つの主要な利点は、パルス形のビデオ顕微鏡の下での、本発明により
攪拌された顕微鏡検査用容器によって生まれる。
攪拌された顕微鏡検査用容器によって生まれる。
【００１３】 １．単純なサンプル容器。容量の正確なサンプル室を省くことができる。何故
ならば、とにかく、容器の僅かな部分容量からの鮮鋭に写し出された粒子のみが
、評価のために、画像処理装置によって濾過して取り除かれ、かくて、仮想の、
しかし正確に測定可能なサンプル容量が得られるからである。自動画像処理装置
は、鮮鋭に写し出された細胞をカウントし、１つの画像につき平均的な計数率に
よって、サスペンションの数字上の濃度の、測定可能な信号を発生する。追加的
に、画像処理装置は、形状係数又は大きさの棒グラフのような形態学的な詳細を
算出することができる。
ならば、とにかく、容器の僅かな部分容量からの鮮鋭に写し出された粒子のみが
、評価のために、画像処理装置によって濾過して取り除かれ、かくて、仮想の、
しかし正確に測定可能なサンプル容量が得られるからである。自動画像処理装置
は、鮮鋭に写し出された細胞をカウントし、１つの画像につき平均的な計数率に
よって、サスペンションの数字上の濃度の、測定可能な信号を発生する。追加的
に、画像処理装置は、形状係数又は大きさの棒グラフのような形態学的な詳細を
算出することができる。
【００１４】 ２．焦合の面倒さはない。何故ならば、顕微鏡は、サスペンション中に、常に
、鮮鋭に写し出された層を見出すが、不鮮鋭に写し出された層は、自動画像処理
装置によって、評価から除外されるからである。従って、顕微鏡は、労力のかか
るサンプルの固定なしに及び振動の少ない顕微鏡載物台なしに、サスペンション
の鮮鋭な画像を記録することができる。従って、顕微鏡下でのサンプルの、従来
の顕微鏡検査に必要な、振動の少ない固定及び不動化も、省くことができる。何
故ならば、止まっていない粒子のブレは、極端に短い照射時間によって、電子的
に回避されるからである。従来の高価な調節可能な顕微鏡載物台を有しない、安
価な、簡単な機械的取付が可能となる。
、鮮鋭に写し出された層を見出すが、不鮮鋭に写し出された層は、自動画像処理
装置によって、評価から除外されるからである。従って、顕微鏡は、労力のかか
るサンプルの固定なしに及び振動の少ない顕微鏡載物台なしに、サスペンション
の鮮鋭な画像を記録することができる。従って、顕微鏡下でのサンプルの、従来
の顕微鏡検査に必要な、振動の少ない固定及び不動化も、省くことができる。何
故ならば、止まっていない粒子のブレは、極端に短い照射時間によって、電子的
に回避されるからである。従来の高価な調節可能な顕微鏡載物台を有しない、安
価な、簡単な機械的取付が可能となる。
【００１５】 ３．簡略化されたサンプルの準備。非常な希釈の必要性は省かれるか、緩和さ
れる。何故ならば、現場の顕微鏡は、１立方メートルにおいて４マイクロメート
ルの直径のある例えば１０９より多い粒子の、その非常に高い濃度範囲でさえ、
評価可能かつ測定可能な画像を記録することができるからである。サンプル量が
ミリリットルのサイズにある場合、数マイクロリットルという、代表的な、僅か
な（及び従って間違いの起こり易い）サンプル容量の、それの注意深い準備は最
早不要である。何故ならば、より大きなサンプルは、サンプルに動きが加えられ
たことで、十分に均質混合されていて、これらのサンプルから直接に代表的な画
像が、パルス形のビデオ顕微鏡内で作られるからである。
れる。何故ならば、現場の顕微鏡は、１立方メートルにおいて４マイクロメート
ルの直径のある例えば１０９より多い粒子の、その非常に高い濃度範囲でさえ、
評価可能かつ測定可能な画像を記録することができるからである。サンプル量が
ミリリットルのサイズにある場合、数マイクロリットルという、代表的な、僅か
な（及び従って間違いの起こり易い）サンプル容量の、それの注意深い準備は最
早不要である。何故ならば、より大きなサンプルは、サンプルに動きが加えられ
たことで、十分に均質混合されていて、これらのサンプルから直接に代表的な画
像が、パルス形のビデオ顕微鏡内で作られるからである。
【００１６】 全体としては、かくして、顕微鏡による粒子パラメータの特性付けが、僅かな
サンプル容量で、著しく簡略化され、より安価になされることが、達成される。
サンプル容量で、著しく簡略化され、より安価になされることが、達成される。
【００１７】
図１は本発明に係わる装置の実施の形態を例示している。この図は、イメージ
センサ２（例えばＣＣＤフレーム）と、対物レンズ３と、観察窓４とを有する顕
微鏡本体１が、正方形に構成された透明なサンプル容器５の上にあること、を示
している。この容器は圧電リング６の上に載っている。圧電リングには、電極（
Elektrodenbeschichtung）によって，従来の方法で機械的振動が起こされること
ができる。適切な電気的交流電圧８が電極に印加されると、低周波数の振動から
超音波までの任意の同期的な運動がサンプル容器になされ、サスペンションの均
質混合を引き起こす。
センサ２（例えばＣＣＤフレーム）と、対物レンズ３と、観察窓４とを有する顕
微鏡本体１が、正方形に構成された透明なサンプル容器５の上にあること、を示
している。この容器は圧電リング６の上に載っている。圧電リングには、電極（
Elektrodenbeschichtung）によって，従来の方法で機械的振動が起こされること
ができる。適切な電気的交流電圧８が電極に印加されると、低周波数の振動から
超音波までの任意の同期的な運動がサンプル容器になされ、サスペンションの均
質混合を引き起こす。
【００１８】 容器の下には、圧電リングの中心には、小形化されたフラッシュバルブ７が、
必要な場合には集光レンズ系と共に、位置決めされている。フラッシュバルブは
動いているサンプルに透過光を照射する。パルス状の光を発するダイオードの使
用は、安価であるので、好都合である。
必要な場合には集光レンズ系と共に、位置決めされている。フラッシュバルブは
動いているサンプルに透過光を照射する。パルス状の光を発するダイオードの使
用は、安価であるので、好都合である。
【図１】 本発明に係わる装置の第１の実施の形態を示している。
【図２】 本発明に係わる装置の第２の実施の形態を示している。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年２月２３日（２００１．２．２３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
Claims (5)
- 【請求項１】 サスペンションサンプル中の固体粒子例えば生物細胞又はエ
マルジョンサンプル中の液体粒子を顕微鏡で写し出すためのビデオ顕微鏡を具備
する装置において、 前記ビデオ顕微鏡は、素早く動いている微細粒子を、極端に短い照射パルス（
約１マイクロ秒）で、例えばパルス状の光を発するダイオードによって高い分解
能で写し出すための顕微鏡であること、 サスペンションのサンプル容器は、光透過性の窓を通して顕微鏡によって見ら
れること、 対物レンズによる撮像の限定された焦点深度の故に鮮鋭に写し出されたサスペ
ンション層は、サスペンションサンプル全体の僅かな部分容量を形成すること、 サスペンションは磁気機械的又は電気機械的な装置、例えば磁気攪拌器又は圧
電発振器によって攪拌流動されること、 機械的に引き起こされたサスペンションの攪拌は、サスペンションの連続的な
均質混合を発生して、前記サンプル容器内の粒子の濃度勾配の形成を阻止するこ
と、 サブマイクロ秒のフラッシュによる照射は、サブマイクロ秒の範囲までの極小
粒子の、高い分解能の撮像を可能にすること、 前記顕微鏡に設けられた電子カメラによって同一のサンプルサスペンションの
複数の画像が記録され、十分に鮮鋭に写し出されたオブジェクトをカウントしか
つ特性付けるために自動画像処理装置に送られること、 機械的に引き起こされたサスペンションの攪拌は、前記サンプル容器内の鮮鋭
に写し出された容量層と、残りのサスペンションとの間の粒子の迅速な完全な交
換を引き起こすこと、及び 個々の画像は、機械的に引き起こされた流れの交換によって、サスペンション
からの代表的な、非相関の、静的な画像データを含み、各画像は、比例的に、評
価可能な画像データセットに寄与すること、を特徴とする装置。 - 【請求項２】 サスペンションの入った平坦な、透明な容器（５）は、顕微
鏡用対物レンズ（５）の直下で、圧電リング（６）上に保たれ、この圧電リング
は外部の交流電流（８）によって機械的な振動に晒されること、 圧電結晶の振動は、機械的な接触によって、前記容器に連結して、粒子の常な
る迅速な動き及びサスペンション内での粒子の均質混合をもたらすこと、及び 前記容器の下方には、透過光を照射するための高速パルス（＜１マイクロ秒）
の発光ダイオード（７）があること、を特徴とする請求項１に記載の装置の好都
合な実施の形態。 - 【請求項３】 サンプル容器（９）として、例えば１０ミリリットルまで入
る容器が用いられ、この容器へは、パルス状の光を発するＬＥＤ照射ユニット（
１１）を有する密閉された顕微鏡本体（１０）が浸かっていること、 本体端部には観察窓（１２）があって、この観察窓を通って前記顕微鏡がサス
ペンション（９）の中を覗くこと、 前記本体端部の脇には、前記顕微鏡に斜めに透過光を照射するパルス状の光を
発する発光ダイオード（１１）があること、 サスペンションの均質混合は小型化された磁気攪拌器（１３）によって行なわ
れること、を特徴とする請求項１又は２に記載の装置の好都合な実施の形態。 - 【請求項４】 サンプルを攪拌し、短時間の照射によってサンプルの顕微鏡
画像のシーケンスを記録すること、を特徴とするサンプル検査法。 - 【請求項５】 請求項４に記載の方法を実行する装置。
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| DE1999123074 DE19923074A1 (de) | 1999-05-13 | 1999-05-13 | Hochauflösendes Videomikroskop zur Ausmessung extrahierter Proben von Partikelsuspensionen mit eingeprägter mechanischer Probenschwingung |
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| PCT/DE2000/001466 WO2000070385A2 (de) | 1999-05-13 | 2000-05-11 | Hochauflösendes videomikroskop zur ausmessung extrahierter proben von partikelsuspensionen mit eingeprägter mechanischer probenschwingung |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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|---|---|---|---|---|
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