JPWO2010140460A1 - フロー式粒子画像解析方法及び装置 - Google Patents

Abstract

合焦点調整を精度良く効率的に行い，また，合焦点位置のずれやサンプル液の流れの厚みを精度良くチェックする。複数の異なる焦点位置において，均一の物質から構成される標準粒子画像から焦点調整用パラメータ値を得る。焦点調整用パラメータ値は，標準粒子画像の中心付近の濃度値と輪郭付近の濃度値との比又は差，又は中心付近の濃度値として求める。得られた焦点調整用パラメータ値と焦点位置との関係から合焦点位置を調整する。また，焦点調整用パラメータ値と焦点位置との関係から，パラメータ値を焦点位置に換算し，焦点位置とそのばらつきから合焦点位置のずれとサンプル液の厚みをチェックする。

Description

本発明はフローセル中の粒子画像を撮像し，粒子の静止画像を解析するフロー式粒子画像解析方法及び装置に関する。

従来の粒子画像解析においては，血液中の細胞や尿中の粒子を形態学的に検査するには，検査技師がスライドガラス上に標本を作成し直接顕微鏡観察する方法で検査を行っていた。顕微鏡検査は，技師の習熟度に結果が左右される，検査に時間を要する，等の問題があるため効率化が求められている。

近年では，検査の自動化が進み，例えば，特許文献１，２では，試料を特別な形状のフローセルに通し，試料中の粒子を幅広の撮像領域中に流し，フラッシュランプを点灯して，試料中の粒子の拡大像を静止画像として撮影し，各静止画像から粒子を分類するフロー式粒子画像解析装置が示されている。フロー式粒子画像解析装置はサンプル液を外側のシース液の流れで包み込むようにして，特殊な形状のフローセルに流すことで扁平な流れを作っている。ただし，シース液が所定量流れていない，シース液の流れにむらがある等の理由で，サンプル液の流れの形状が設定値より厚くなる場合がある。サンプル液の流れが厚くなると，粒子位置が合焦点位置からずれ，正しい画像が得られないことがある。

フロー式粒子画像解析装置において粒子の分類精度を維持するためには，粒子の静止画像を常に合焦点位置で撮像する必要がある。常に焦点の合った画像を得るためには，例えば以下の処理を行う必要がある。

（１）装置立ち上げ時に合焦点位置を正確に調整する。

（２）（１）の後も，合焦点位置とサンプル液の流れの厚みを定期的にチェックする。

（１）の焦点調整方法については，例えば，特許文献３〜５に記載されている。特許文献３では焦点を調整する際，フローセル又は対物レンズを移動させながら異なる複数の位置において，均一の物質から構成される同サイズの標準粒子（以下，標準粒子）の静止画像を得て，各位置における標準粒子の平均面積値を算出し，この値が最小になるように，フローセル又は対物レンズの位置調整を行う方法が示されている。特許文献４には，ニューラルネットワークを用いた焦点調整方法が示されている。この方法では，予め複数の焦点位置における標準粒子画像の特徴量（濃度分散，濃度コントラスト，濃度微分等）をニューラルネットワークに学習させ，結果を装置に組込み，これを元に焦点調整を行う。特許文献５では特許文献３の面積の代わりに標準粒子のＲ画像におけるレベル分散値を用いた方法が示されている。これは，合焦点位置での標準粒子は白く輝く状態と暗くなる状態の中間状態で見えるという性質から，濃度分散（レベル分散）値が最大値と最小値のほぼ中央値になるように，フローセル又は対物レンズの位置調整を行う方法が示されている。

（２）の合焦点位置のチェックとサンプル液の流れの厚みをチェックする方法については，例えば，特許文献５に記載されている。特許文献５では，前記レベル分散値とサンプル幅（静止画像の横方向）の関係図から，レベル分散値の分布を用いて合焦点からのずれとサンプル液の流れの厚みをチェックする方法が示されている。レベル分散値が合焦点位置の値とずれていた場合，焦点が合っていないと判定し，レベル分散値のばらつき（レベル分散値の分散）が大きい場合，サンプル液の流れが厚くなったと判定する方法が示されている。

特開平５−２９６９１５号公報 特開昭６３−９４１５６号公報 特開２００７−３０４０５９号公報 特開平９−３１１１０２号公報 特開２００２−６２２５１号公報

前記（１）の粒子画像の合焦点調整について，特許文献３の方法は，焦点調整のパラメータに面積値を用いている。我々が実験で確認したところ，図１に示すように，焦点調整に用いる標準粒子の粒径が１μｍと小さい場合には，合焦点位置での面積が最小になるが，粒径が大きくなる程，面積最小値を示す位置が合焦点位置からずれることが分かった。

特許文献４の方法は，焦点調整にニューラルネットワークを用いている。ニューラルネットワークを用いるには，予めあらゆる位置における標準粒子画像から得られた特徴量で学習する必要がある。また，日間差，装置間差を考慮した標準粒子画像から得られた特徴量で学習する必要があるため，データ取得に時間を要する。また，ニューラルネットワークの学習にも時間を要する。

特許文献５の方法は，焦点調整のパラメータにレベル分散値を用いている。レベル分散値と焦点位置との関係は図２のようになり，単調減少ではないため，焦点調整スタート時点での状態が，例えば図中の矢印Ａにあった場合，どちらの方向にフローセル又は対物レンズを動かせば良いのか判断が困難である。

前記（２）合焦点位置のチェックとサンプル液の流れの厚みをチェックする方法について，特許文献５の方法は，レベル分散値を用いている。本方法により，サンプル液の流れの厚みを判定する場合，例えば，図３に示すように，サンプルの厚みがｄ１であった場合，レベル分散値はΔ１の範囲に分布する。しかしながら，合焦点位置がずれ，ｄ１と同じ幅ｄ２の位置に流れがある場合，分布のばらつきはΔ１とは異なるΔ２となる。そのため，レベル分散値の使用では正確に流れの厚みを知ることが困難であることが分かった。

以上より，本発明では，合焦点位置を精度良く効率的に調整し，尚且つ合焦点位置調整後，合焦点位置のずれチェックとサンプル液の流れの厚みチェックを精度良く行なうための方法及び装置を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために，本発明のフロー式粒子画像解析方法は，均一の物質から構成される球状の標準粒子を含むサンプル液をフローセル中に流し，対物レンズを含む撮像部によって標準粒子を撮像し，静止画像を取得する工程と，静止画像から粒子画像特徴パラメータ値として粒子画像の中心付近の濃度値と輪郭付近の濃度値との比，又は粒子画像の中心付近の濃度値と輪郭付近の濃度値との差，又は粒子画像の中心付近の濃度値を算出する工程と，そのパラメータ値に基づき撮像部の焦点調整を行う工程と，を有する。この構成により，様々な粒径の標準粒子を用いた焦点調整を可能とし，また，装置立ち上げ時（焦点調整スタート時）の状態把握が可能となり，効率的に焦点調整が行えるようになる。

更に，本発明のフロー式粒子画像解析方法は，均一の物質から構成される球状の標準粒子を含むサンプル液をフローセル中に流し，撮像部において標準粒子を撮像し，静止画像を取得する工程と，静止画像から撮像部の焦点位置を表す粒子画像特徴パラメータ値を抽出する工程と，パラメータ値を焦点位置に換算する工程と，換算した焦点位置のばらつきに基づきサンプル液の厚み情報を得る工程と，を有する。粒子画像特徴パラメータ値としては，粒子画像の中心付近の濃度値と輪郭付近の濃度値との比，又は粒子画像の中心付近の濃度値と輪郭付近の濃度値との差，又は粒子画像の中心付近の濃度値を使用することができる。この構成により，焦点位置の値とばらつきから合焦点位置のずれチェック，サンプル液の流れの厚みチェックが行えるようになる。

また，本発明のフロー式粒子画像解析装置は，サンプル液をシース液で包んで流すフローセルと，フローセルを照射するパルス光源と，対物レンズを有する撮像部と，フローセルと対物レンズの間の距離を可変する駆動手段と，均一の物質から構成される球状の標準粒子を含むサンプル液を前記フローセル中に流し，撮像部において標準粒子を撮像し，静止画像を取得する手段と，静止画像から粒子画像特徴パラメータ値として粒子画像の中心付近の濃度値と輪郭付近の濃度値との比，又は粒子画像の中心付近の濃度値と輪郭付近の濃度値との差，又は粒子画像の中心付近の濃度値を算出する手段と，を有する。加えて，そのパラメータ値に基づき駆動手段によってフローセルと対物レンズの間の距離を可変して撮像部の焦点調整を行う手段を有する。あるいは，そのパラメータ値を撮像部の焦点位置に換算する手段，及び換算した焦点位置に基づき合焦点位置の情報を得る手段を有する。あるいは，パラメータ値を焦点位置に換算する手段，及び換算した焦点位置のばらつきに基づきサンプル液の厚み情報を得る手段を有してもよい。

本発明の合焦点調整方法によれば様々な粒径の標準粒子を用いた合焦点調整を精度良く効率的に行える。また，本発明のパラメータを用いたチェック方法によれば，合焦点位置とサンプル液の流れの厚みを精度良くチェックできる。

粒子径と各粒子径で面積最小値を示す位置と合焦点位置との差の分布図。 レベル分散値と各焦点位置との関係の一例を示す図。 レベル分散値と各焦点位置との分布の一例を示す図。 フロー式粒子画像解析装置の構成例を説明する図。 フロー式粒子画像解析装置の画像入力装置の構成例を説明する図。 フロー式粒子画像解析装置の合焦点調整時の画像処理方法を説明する図。 代表的な焦点位置における標準粒子画像例と標準粒子の中心を通るｘ方向の濃度プロファイルの模式図例を説明する図。 焦点調整用パラメータ（中心濃度比）を求める詳細な手順を説明する図。 焦点調整用パラメータを説明する図。 焦点調整用パラメータ（中心濃度差）を求める詳細な手順を説明する図。 焦点調整用パラメータ（中心濃度）を求める詳細な手順を説明する図。 焦点調整用パラメータと各焦点位置との関係の一例を示す図。 焦点調整方法の詳細な手順を説明する図。 近似式を用いた焦点調整方法の詳細な手順を説明する図。 合焦点位置のずれとサンプル液の流れの厚みをチェックする方法の詳細な手順を説明する図。 合焦点がずれた場合の焦点位置ヒストグラムの一例を示す図。 サンプル液の流れの厚みが厚くなった場合の焦点位置ヒストグラムの一例を示す図。 本発明のフロー式粒子画像解析装置の構成例を説明する図。

以下，本発明の実施の形態について説明する。

以下に，図を用いて本発明の実施の形態について説明する。

図４は，本発明が適用されるフロー式粒子画像解析装置の構成例を説明する図である。測定装置本体４０１では，染色液添加装置４０２により試料に染色液を添加し，一定時間後，画像入力装置４０３により試料中の粒子の拡大静止画像を撮像する。撮像された画像は画像処理装置４０６に転送され，画像パターン認識により試料中粒子の分類を行い，１検体中に含まれる試料中粒子の種類とその出現頻度がカウントされる。画像処理装置４０６としては，例えばディスプレイ４０４，キーボード４０５を備えた汎用のパーソナルコンピュータを用いる。カウントされた結果はディスプレイ４０４を通じて操作者に報告される。画像入力装置４０３により撮像された画像，画像処理装置４０６による測定結果，各対象領域の分類結果及び画像パターン認識の途中で得られた画像特徴量等のデータは画像処理装置４０６内の記憶装置に保存される。また，画像処理装置４０６はレビュー機能も兼ね備えている。レビュー機能では，操作者が任意の画像を表示し，自動分類の修正，目視による細分類を実行できる。

図５は，測定装置本体４０１を構成する画像入力装置４０３の構成図である。画像入力装置４０３では，フローセル５０１を用い，対物レンズ５０３とパルスランプ５０２との間に，幅広で厚さの薄い偏平な試料５０５の流れを作る。試料５０５は外側のシース流に包まれて光軸を横切るように流される。フローセル５０１により形成される試料５０５の流れに，パルスランプ５０２の光が瞬間的に照射され，対物レンズ５０３により拡大された試料５０５中の粒子像がカメラ５０４により静止画像として撮像される。カメラ５０４としては，例えばＣＣＤカラーカメラ，ＣＭＯＳカラーカメラ等を用いることができる。得られた画像は画像処理装置４０６に転送される。

対物レンズ５０３は，焦点機構５０６によって可動となっている。焦点機構５０６のモータ５０９の回転により，送りネジ５０８を少しずつ動かすことで，アーム５０７と連動した対物レンズ５０３が光軸上を前後方向に移動する。フローセル５０１と対物レンズ５０３との間の距離（焦点位置）を調整することによって，合焦点調整が可能となる。なお，焦点機構５０６によって可動するのは対物レンズ５０３に限らずフローセル５０１の方であっても良い。

合焦点調整の際には，試料５０５として，均一の物質から構成される同一寸法の球状の標準粒子を多数含むサンプル液を用いる。標準粒子としては，例えばポリエチレンやポリスチレン等の市販されている透明な球状粒子を用いる。焦点機構５０６により対物レンズ５０３を移動させて撮像系の焦点位置を変化させ，フローセルの流れの中に設定される複数の異なる焦点位置で標準粒子の静止画像を複数枚撮像する。得られた画像は画像処理装置４０６に転送される。

図６は，合焦点調整時の画像処理装置４０６での画像処理方法の詳細を説明する図である。

カメラ５０４により撮像された標準粒子画像はデジタルデータとして，画像処理装置４０６に転送される。

シェーディング補正処理ステップＳ６０１では，光学系の特性に由来する画像上の濃度むらを除去する。

平滑化処理ステップＳ６０２では，ノイズ除去を行う。手段としては，例えば，移動平均法やメディアンフィルタ処理等の既知の技術を使用できる。また，平滑化処理は行わなくても良い。

領域分割処理ステップＳ６０３では，標準粒子が撮像された画像を背景領域と対象領域とに分割し，背景領域を０，対象領域を１とする２値画像を作成する。

領域分割補正処理ステップＳ６０４では，対象領域の穴埋め，背景領域のノイズ除去等の２値画像の修正，整形を行う。手段としては，例えば，太め処理，細め処理等のフィルタ処理を含め，既知の技術を使用できる。

ラベリング処理ステップＳ６０５では，２値画像の連結成分毎にラベリング処理を行い，画像中の複数の対象を一意に特定するための番号を付ける。

特徴量計算処理ステップＳ６０６では，番号を付けたそれぞれの対象領域について，面積や後述する焦点調整用パラメータ等の特徴量を算出する。

ステップＳ６０７では，得られた対象領域が単一の標準粒子か否かを判定する。ｍ≦（対象領域の面積）≦Ｍを満たす場合は，単一の標準粒子と見なして，焦点調整用画像として次ステップに進む。満たさない場合は，複数の連結標準粒子画像，もしくは標準粒子以外の成分と見なして棄却する。ここで，ｍ，Ｍは予め実験的に最適値を求めておく。

なお，図６に示す処理の全て，もしくは一部をハードウェアで処理することも可能である。

図７は，代表的な焦点位置での標準粒子の画像例と標準粒子の中心を通るｘ方向の濃度プロファイルの模式図である。図７（ａ）は図５の対物レンズ５０３とカメラ５０４を含む撮像系の焦点位置が標準粒子より遠くに位置するとき，図７（ｂ）は撮像系の焦点位置が標準粒子に一致し標準粒子にピントが合っているとき，図７（ｃ）は撮像系の焦点位置が標準粒子より手前側に位置するときを示している。

撮像系の焦点位置が標準粒子より遠い側にあるときの標準粒子画像７０１は，図７（ａ）に示すように，標準粒子の中心部分が背景領域より明るくなる。このときの濃度プロファイル７０４は，粒子の中心付近での濃度値が一番大きく，粒子の輪郭部分での濃度値が一番小さいが，背景部分では輪郭部分より大きいが粒子中心より小さな濃度値を示す。逆に，撮像系の焦点位置が標準粒子より手前側にあるときの標準粒子画像７０３は，図７（ｃ）に示すように，中心部分に目立った特徴がなくなる。このときの濃度プロファイル７０６は，図示のように粒子部分全体が小さな濃度値を示し，粒子の中心付近の濃度値と輪郭部分の濃度値に変化がみられなくなる。一方，合焦点位置での標準粒子画像７０２は，図７（ｂ）に示すように，粒子の中心部分が，明るい背景と暗い輪郭部分の中間の明るさを有する。このときの濃度プロファイル７０５は，中心付近の濃度値に特徴がみられる。すなわち，標準粒子の中心を通る濃度プロファイル７０５は，粒子中心部分で中程度の濃度値をとり，粒子輪郭部分ではそれより小さな濃度値を示し，背景領域では粒子中心部分の濃度値より大きな濃度値を示す。

図８は，特徴量計算処理ステップＳ６０６で算出する焦点調整用パラメータ（中心濃度比）を求める詳細な手順を示す図である。また，図９は標準粒子の画像から求められる標準粒子の中心を通る典型的な濃度プロファイルを示す図である。

図８のステップＳ８０１では，図９に示す濃度値Pdを求める。濃度値Pdは，各画像における背景レベルに相当する。背景レベルは，各画像において濃度ヒストグラムを作成したとき，最頻値をもつ濃度値として求められる。

ステップＳ８０２では，図９に示す濃度値blaを求める。濃度値blaは，標準粒子を表す対象領域の輪郭付近の濃度値のことで，対象領域中で最も濃度値が小さい（暗い）値を示す。濃度値blaは，対象領域全体における最小濃度値として求められる。

ステップＳ８０３では，図９に示す濃度値cenを求める。濃度値cenは，対象領域の中心付近の濃度値のことで，対象領域中心部分で最も濃度値が大きい（明るい）値を示す。濃度値cenは，対象領域の中心画素を含んだ１又は複数画素における最大濃度値として求められる。なお，中心部分の画素数は用いる標準粒子の粒径から最適な画素数を実験的に求めておく。また，濃度値cenは最大濃度値に限らず，中心画素を含んだ１又は複数画素の平均濃度値を用いても良い。

ステップＳ８０４では，濃度値Pd，cen，blaから，図９に示す値ａ（各画像における背景レベルと対象領域の輪郭付近の濃度値との差）と値ｂ（各画像における背景レベルと対象領域の中心付近の濃度値との差）を求める。具体的には，次式（１），（２）により各値を算出する。

ａ＝Pd−bla …（１）
ｂ＝Pd−cen …（２）
ステップＳ８０５では，値ａとｂから，焦点調整用パラメータ（中心濃度比）を次式（３）により算出する。

焦点調整用パラメータ＝ｂ／ａ …（３）
焦点調整用パラメータは，上述の中心濃度比以外のものを用いてもよい。ここでは，中心濃度比以外の焦点調整用パラメータの例として，中心濃度差と中心濃度値について説明する。

図１０は，特徴量計算処理ステップＳ６０６で算出する焦点調整用パラメータとして中心濃度差を用いる場合の詳細な手順を示す図である。

ステップＳ１００１では，対象領域の輪郭付近の濃度値blaを求める。求め方は，図８のステップＳ８０２に示した方法を用いれば良い。

ステップＳ１００２では，対象領域の中心付近の濃度値cenを求める。求め方は，図８のステップＳ８０３に示した方法を用いれば良い。

ステップＳ１００３では，ステップＳ１００１で求めた濃度値blaとステップＳ１００２で求めた濃度値cenから，焦点調整用パラメータ（中心濃度差）を次式（４）により算出する。

焦点調整用パラメータ＝cen−bla …（４）
図１１は，特徴量計算処理ステップＳ６０６で算出する焦点調整用パラメータとして中心濃度値用いる場合の詳細な手順を示す図である。

ステップＳ１１０１では，各画像における背景レベルを求める。求め方は，図８のステップＳ８０１に示した方法を用いれば良い。

ステップＳ１１０２では，対象領域の中心付近の濃度値cenを求める。求め方は，図８のステップＳ８０３に示した方法を用いれば良い。

ステップＳ１１０３では，ステップＳ１１０１で求めた濃度値PdとステップＳ１１０２で求めた濃度値cenから，焦点調整用パラメータ（中心濃度値）を次式（５）により算出する。

焦点調整用パラメータ＝Pd−cen …（５）
なお中心濃度値は，（Pd−cen）に限らず，cenの値そのものを用いても良い。

また，焦点調整用パラメータに，中心濃度比，中心濃度差，中心濃度値のいずれを用いるかは，装置に組み込まれている光学系の特性から焦点調整に最適なパラメータを選択すればよい。

図１２は，例えば，図５に示した標準粒子試料５０５に粒径１０μｍの標準粒子を用い，対物レンズ５０３を１μｍずつ３０ポイント移動させた場合の，フローセル中に設定される各焦点位置で撮像した画像から算出した焦点調整用パラメータ（中心濃度比）値の例を示す図である。シンボル１２０１は，各焦点位置で，得られた標準粒子画像約１００枚から算出された焦点調整用パラメータの平均値をプロットしたものである。なお，用いる標準粒子の粒径は，フロー式粒子画像解析装置で対象としている成分に合わせて最適な大きさを選択すれば良い。また，対物レンズの移動幅は，用いる標準粒子の粒径から最適な幅を予め実験的に定めておく。焦点調整用パラメータの算出にあたっては，標準粒子の色特性とカメラの分光特性から最も感度の高い色濃度値を選択して使用するとよい。各焦点位置における標準粒子画像の収集枚数は焦点調整用パラメータのばらつきやカメラの特性から最適な枚数を予め実験的に求めておく。

図１２に示すように，焦点位置と焦点調整用パラメータの関係は広範囲で単調増加となり，合焦点位置１２０２は，焦点調整用パラメータが最小値と最大値のほぼ中央の位置となる。例えば図１２の例の場合，合焦点位置における焦点調整用パラメータ値（中心濃度比）は０．２８となる。なお，合焦点位置は，用いる標準粒子の粒径と光学系の特性から最適な位置を予め実験的に定めておく。ここでは，焦点調整用パラメータとして中心濃度比を用いた場合について説明したが，焦点調整用パラメータとして中心濃度値や中心濃度値を用いた場合にも同様にして合焦点位置の焦点調整用パラメータ値を決定することができる。

図１３は，本発明による合焦点調整方法の詳細な手順の一例を示す図である。

ステップＳ１３０１では，予め定めた初期位置まで対物レンズを移動させる。これは，装置立ち上げ時に自動で移動するようにしておいても良い。

ステップＳ１３０２では，初期位置での焦点調整用パラメータ平均値を算出する。

ステップＳ１３０３では，対物レンズを，例えば１μｍ移動させる。移動幅と移動方向は，予め実験的に設定しておく。また，カウント値ｎを１だけインクリメントする。

ステップＳ１３０４では，移動後の位置での焦点調整用パラメータ平均値を算出する。

ステップＳ１３０５では，対物レンズの移動回数（ｎ）が，予め実験的に定めた回数まで到達したか否かを判定する。ｎ＝Ｎを満たす場合，対物レンズは所定の回数，移動したとしてステップＳ１３０６に進む。満たされない場合は，ステップＳ１３０３に戻り，ステップＳ１３０５を満たすまで対物レンズの移動と各焦点位置での焦点調整用パラメータの平均値の算出を繰返す。なお，Ｎは標準粒子の粒径や焦点調整用パラメータから予め最適な回数を求めておく。

ステップＳ１３０６では，求めた各焦点位置での焦点調整用パラメータがＰに最も近い値を示した焦点位置に対物レンズを移動させる。Ｐは，予め実験的に定めた値で，例えば図１２の例の場合には，０．２８である。

なお，ステップＳ１３０１は予め定めた初期位置ではなく，装置立ち上げ時の位置を初期位置としても良い。その場合，ステップＳ１３０３での対物レンズの移動は，ステップＳ１３０２で求めた焦点調整用パラメータ値が予め求めておいた関係図，例えば図１２のどの辺りに位置するかで，対物レンズの移動方向を判断する。

図１４は，近似式を用いた合焦点調整方法の詳細な手順の一例を示す図である。

ステップＳ１４０１では，予め定めた初期位置まで対物レンズを移動させる。これは，装置立ち上げ時に自動で移動するようにしておいても良い。

ステップＳ１４０２では，初期位置での焦点調整用パラメータ平均値を算出する。

ステップＳ１４０３では，対物レンズを，例えば３μｍ移動させる。移動幅と移動方向は，予め実験的に設定しておく。また，カウント値ｎを１だけインクリメントする。

ステップＳ１４０４では，移動後の位置での焦点調整用パラメータ平均値を算出する。

ステップＳ１４０５では，対物レンズの移動回数（ｎ）が，予め実験的に定めた回数まで到達したか否かを判定する。ｎ＝Ｎを満たす場合，対物レンズは所定の回数，移動したとしてステップＳ１４０６に進む。満たされない場合は，ステップＳ１４０３に戻り，ステップＳ１４０５を満たすまで対物レンズの移動と各焦点位置での焦点調整用パラメータの平均値の算出を繰返す。なお，Ｎは標準粒子の粒径や焦点調整用パラメータから予め最適な回数を求めておく。

ステップＳ１４０６では，ステップＳ１４０５までに得られた複数の異なる位置での焦点位置と焦点調整用パラメータ値から近似式を算出する。近似式は，例えば，シグモイド関数等の周知の関数を用いて求めれば良い。

ステップＳ１４０７では，ステップＳ１４０６で求めた近似式を用いて，焦点調整用パラメータ値Ｐを示す合焦点位置を予測し，対物レンズを移動する。Ｐは，予め実験的に定めた値で，例えば図１２の例の場合には，０．２８である。

なお，図１３及び図１４の例においては，対物レンズを移動させることによって，撮像系の焦点位置をフローセル中で移動させた。しかし，フローセル中の異なる複数の位置に撮像系の焦点位置を設定するに当たっては，対物レンズの移動に代えてフローセルを移動させてもよい。

図１５は，撮像系の焦点位置を合焦点位置に一度調整したあとで，合焦点位置のずれとサンプル液の流れの厚みをチェックする方法の詳細な手順を示す図である。図５に示したサンプル液を包み込むシース液が所定量流れていない，シース液の流れにむらがある等の理由で，サンプルの流れ形状が設定値より厚くなる場合があることから，合焦点の位置とサンプル液の流れの厚みを定期的にチェックすることが望ましい。チェック間隔は，例えば検体数や時間間隔等で定めておく。

手順としては，上述したように試料として標準粒子を流し，ステップＳ１５０１で，対物レンズを移動することなく現在位置のままで，１又は複数枚の画像から各標準粒子の焦点調整用パラメータを算出する。用いる標準粒子の粒径と焦点調整用パラメータの算出方法は，合焦点調整と同様である。

ステップＳ１５０２では，焦点調整用パラメータを焦点位置に換算する。換算には図１４に示したＳ１４０６で求めた近似式を用いる。なお，近似式は予め実験的に求めておいたものを用いても良い。

ステップＳ１５０３では，求めた焦点位置のヒストグラムを作成する。

ステップＳ１５０４では，合焦点位置がずれていないか，サンプル液の流れの厚みは正常かを判定する。ヒストグラムの最頻値を示す焦点位置＝Ｄ（Ｄは，撮像系の焦点位置を合焦点位置に調整した時の焦点位置で尚且つ，Ｋ１≦焦点位置のばらつき≦Ｋ２を満たす場合は，合焦点位置とサンプル液の流れの厚みは正常と判定しチェックを終了する。満たさない場合は，ステップＳ１５０５において警告する。警告には，合焦点のずれやサンプル液の流れの厚みが正常でないことを具体的に表示しても良いし，アラームで知らせても良い。

焦点位置のばらつきは，例えば，（ａ）ヒストグラムの最頻値の半値を示す上側の位置と下側の位置の差（幅），（ｂ）ヒストグラムを正規分布に従うと仮定して，平均値±（ｘ×シグマ）（ｘは例えば１などの予め定めた定数）の位置の上側と下側の位置の差（幅），等を用いれば良い。また，Ｋ１とＫ２は予め，サンプル液の流れの厚みが正常な場合のヒストグラムを用いて実験的に求めておいても良いし，合焦点調整後の合焦点位置でのヒストグラムから求めても良い。

図１６は，例えばサンプル液の流れの厚みは正常だが，合焦点位置がずれてしまった場合のヒストグラム例を示す。シンボル１６０１は，合焦点位置とサンプル液の流れの厚みが正常な場合のヒストグラムを示す。シンボル１６０２は，ある装置状態でのヒストグラムを示す。図より，シンボル１６０２は，最頻値を示す焦点位置がシンボル１６０１の場合のＤからずれていることが分かる。また，そのずれは＋側に表れていることから，合焦点位置が＋側にずれてしまっていると判定できる。サンプル液の流れの厚みに関しては，例えば，ヒストグラムの半値を示す焦点位置の上側と下側の差は，正常なシンボル１６０１の場合とほぼ同程度であることから，サンプル液の流れの厚みは正常であると判定できる。

図１７は，例えば，合焦点位置は正常だが，サンプル液の流れの厚みが厚くなった場合のヒストグラム例を示す。シンボル１７０１は，合焦点位置とサンプル液の流れの厚みが正常な場合のヒストグラムを示す。シンボル１７０２は，ある装置状態でのヒストグラムを示す。シンボル１７０２のヒストグラムの最頻値を示す焦点位置は，シンボル１７０１と同じくＤであることから，合焦点位置は正常と判定できる。サンプル液の流れの厚みに関しては，例えばヒストグラムの半値を示す焦点位置の上側と下側の差は，シンボル１７０１と比較して，シンボル１７０２の方が大きくなっていることから，サンプル液の流れの厚みが厚くなっていると判定できる。

本発明の焦点調整用パラメータを用いた合焦点調整方法により，様々な大きさの標準粒子を用いた合焦点調整が可能となる。また，本発明の焦点調整用パラメータを用いれば，パラメータと焦点位置との関係が広範囲で単調増加（又は減少）となるため，装置立ち上げ時の焦点状態が容易に予測でき，効率的に焦点調整が可能となる。更に，焦点位置と焦点調整用パラメータの関係から近似関数を求めることで，合焦点位置が容易に予測できるので，効率的に焦点調整が可能となる。

本発明の焦点調整用パラメータを用いれば，パラメータを焦点位置に換算することができるので，装置の合焦点位置を正確に把握できる。また，合焦点位置がすれていた場合，どちらの方向にずれたかを正確に把握できる。更に，本発明の焦点調整用パラメータを用いたサンプル液の流れの厚みチェック方法を用いれば，パラメータを焦点位置に換算することができるので，サンプル液の流れの厚みを精度良くチェックできる。

図１８は，本発明のフロー式粒子画像解析装置の合焦点調整，及び合焦点位置とサンプル液の流れの厚みチェックを行う装置の構成例を説明する図である。

合焦点調整を行う場合は，複数の焦点位置において，カメラ等の画像入力手段１８０２により撮像された標準粒子画像がメモリ１８０１に転送される。

標準粒子画像は画像処理手段１８０３に転送され，領域分割と特徴量（面積，焦点調整用パラメータ等）算出が行われる。領域分割方法，特徴量算出方法は実施例１に示した方法を用いれば良い。領域分割された対象領域画像と特徴量はメモリ１８０１に転送される。

特徴量の一つである面積から単一の標準粒子と判定された領域の焦点調整用パラメータは，焦点位置ごとに焦点調整用パラメータ平均値算出手段１８０４に転送され，平均値が算出される。算出された各焦点位置における焦点調整用パラメータ平均値は，メモリ１８０１に転送される。焦点調整用パラメータとしては，実施例１で説明した中心濃度比，中心濃度差，中心濃度値などを用いることができる。

各焦点位置において算出した焦点調整用パラメータの平均値は，合焦点判定手段１８０５に転送され，どの焦点位置が合焦点なのか判定される。判定方法は実施例１に示した方法を用いれば良い。判定された合焦点位置はメモリ１８０１に転送される。

各焦点位置における焦点調整用パラメータの平均値は，近似式算出手段１８０６に転送され，焦点調整用パラメータと焦点位置との関係の近似式が算出される。算出された近似式は，メモリ１８０１に転送される。近似式の求め方は実施例１に示した方法を用いれば良い。

合焦点調整が完了した状態で，合焦点位置のずれとサンプル液の流れの厚みをチェックする場合は，カメラ等の画像入力手段１８０２により撮像された標準粒子画像がメモリ１８０１に転送される。

標準粒子画像は画像処理手段１８０３に転送され，領域分割と特徴量（面積，焦点調整用パラメータ等）算出が行われる。領域分割方法，特徴量算出方法は実施例１に示した方法を用いれば良い。領域分割された対象領域画像と特徴量はメモリ１８０１に転送される。

特徴量の一つである面積から単一の標準粒子と判定された領域の焦点調整用パラメータは，焦点位置への換算手段１８０７に転送される。換算方法は実施例１に示した方法を用いれば良い。換算された焦点位置はメモリ１８０１に転送される。

換算された焦点位置は合焦点判定手段１８０５と，サンプル液の流れの厚み判定手段１８０８に転送され，合焦点位置は正常か，サンプル液の流れの厚みは正常か，判定される。判定方法は実施例１に示した方法を用いれば良い。判定結果はメモリ１８０１に転送される。

本発明の装置構成により，様々な粒径の標準粒子を用いた合焦点調整を精度良く効率的に行える。また，合焦点のずれとサンプル液の流れの厚みを精度良くチェックできる。

４０１ 測定装置本体
４０２ 染色液添加装置
４０３ 画像入力装置
４０４ ディスプレイ
４０５ キーボード
４０６ 画像処理装置
５０１ フローセル
５０２ パルスランプ
５０３ 対物レンズ
５０４ カメラ
５０５ 試料
５０６ 焦点機構
５０７ アーム
５０８ 送りネジ
５０９ モータ

Claims (12)

1. シース液で包んで流されるサンプル液を撮像して得た粒子画像を解析するフロー式粒子画像解析方法において，
   均一の物質から構成される球状の標準粒子を含むサンプル液をフローセル中に流し，対物レンズを含む撮像部によって前記標準粒子を撮像し，静止画像を取得する工程と，
   前記静止画像から粒子画像特徴パラメータ値として粒子画像の中心付近の濃度値と輪郭付近の濃度値との比，又は粒子画像の中心付近の濃度値と輪郭付近の濃度値との差，又は粒子画像の中心付近の濃度値を算出する工程と，
   前記パラメータ値に基づき前記撮像部の焦点調整を行う工程と，
   を有することを特徴とするフロー式粒子画像解析方法。
2. 請求項１記載のフロー式粒子画像解析方法において，
   前記対物レンズ又は前記フローセルを移動させることにより前記フローセル中に設定される異なる複数の焦点位置において複数の静止画像を取得する工程と，
   前記異なる複数の焦点位置毎に，当該焦点位置で取得した静止画像から平均パラメータ値を算出する工程と，
   を有し，前記焦点調整は前記平均パラメータ値に基づいて行うことを特徴とするフロー式粒子画像解析方法。
3. 請求項２記載のフロー式粒子画像解析方法において，前記複数の焦点位置と前記平均パラメータ値との関係を関数によって近似し，当該関数を用いて前記焦点調整を行うことを特徴とするフロー式粒子画像解析方法。
4. シース液で包んで流されるサンプル液を撮像して得た粒子画像を解析するフロー式粒子画像解析方法において，
   均一の物質から構成される球状の標準粒子を含むサンプル液をフローセル中に流し，撮像部において前記標準粒子を撮像し，静止画像を取得する工程と，
   前記静止画像から粒子画像特徴パラメータ値として粒子画像の中心付近の濃度値と輪郭付近の濃度値との比，又は粒子画像の中心付近の濃度値と輪郭付近の濃度値との差，又は粒子画像の中心付近の濃度値を算出する工程と，
   前記パラメータ値を前記撮像部の焦点位置に換算する工程と，
   前記焦点位値に基づき合焦点位置の情報を得る工程と，
   を有することを特徴とするフロー式粒子画像解析方法。
5. 請求項４記載のフロー式粒子画像解析方法において，前記焦点位置と前記パラメータ値との関係を近似した関数に基づいて前記焦点位置情報を得ることを特徴とするフロー式粒子画像解析方法。
6. シース液で包んで流されるサンプル液を撮像して得た粒子画像を解析するフロー式粒子画像解析方法において，
   均一の物質から構成される球状の標準粒子を含むサンプル液をフローセル中に流し，撮像部において前記標準粒子を撮像し，静止画像を取得する工程と，
   前記静止画像から前記撮像部の焦点位置を表す粒子画像特徴パラメータ値を抽出する工程と，
   前記パラメータ値を焦点位置に換算する工程と，
   前記換算した焦点位置のばらつきに基づきサンプル液の厚み情報を得る工程と，
   を有することを特徴とするフロー式粒子画像解析方法。
7. 請求項６記載のフロー式粒子画像解析方法において，前記粒子画像特徴パラメータ値として，粒子画像の中心付近の濃度値と輪郭付近の濃度値との比，又は粒子画像の中心付近の濃度値と輪郭付近の濃度値との差，又は粒子画像の中心付近の濃度値を使用することを特徴とするフロー式粒子画像解析方法。
8. 請求項６記載のフロー式粒子画像解析方法において，前記焦点位置と前記パラメータ値との関係を関数によって近似し，前記関数に基づいて前記パラメータ値を前記焦点位置に換算することを特徴とするフロー式粒子画像解析方法。
9. サンプル液をシース液で包んで流すフローセルと，
   前記フローセルを照射するパルス光源と，
   対物レンズを有する撮像部と，
   前記フローセルと前記対物レンズの間の距離を可変する駆動手段と，
   均一の物質から構成される球状の標準粒子を含むサンプル液を前記フローセル中に流し，前記撮像部において前記標準粒子を撮像し，静止画像を取得する手段と，
   前記静止画像から粒子画像特徴パラメータ値として粒子画像の中心付近の濃度値と輪郭付近の濃度値との比，又は粒子画像の中心付近の濃度値と輪郭付近の濃度値との差，又は粒子画像の中心付近の濃度値を算出する手段と，
   前記パラメータ値に基づき前記駆動手段によって前記フローセルと前記対物レンズの間の距離を可変して前記撮像部の焦点調整を行う手段と，
   を有することを特徴とするフロー式粒子画像解析装置。
10. サンプル液をシース液で包んで流すフローセルと，
    前記フローセルを照射するパルス光源と，
    対物レンズを有する撮像部と，
    前記フローセルと前記対物レンズの間の距離を可変する駆動手段と，
    均一の物質から構成される球状の標準粒子を含むサンプル液を前記フローセル中に流し，前記撮像部において前記標準粒子を撮像し，静止画像を取得する手段と，
    前記静止画像から粒子画像特徴パラメータ値として粒子画像の中心付近の濃度値と輪郭付近の濃度値との比，又は粒子画像の中心付近の濃度値と輪郭付近の濃度値との差，又は粒子画像の中心付近の濃度値を算出する手段と，
    前記パラメータ値を前記撮像部の焦点位置に換算する手段と，
    前記焦点位置に基づき合焦点位置の情報を得る手段と，
    を有することを特徴とするフロー式粒子画像解析装置。
11. サンプル液をシース液で包んで流すフローセルと，
    前記フローセルを照射するパルス光源と，
    対物レンズを有する撮像部と，
    前記フローセルと前記対物レンズの間の距離を可変する駆動手段と，
    均一の物質から構成される球状の標準粒子を含むサンプル液を前記フローセル中に流し，前記撮像部において前記標準粒子を撮像し，静止画像を取得する手段と，
    前記静止画像から前記撮像部の焦点位置を表す粒子画像特徴パラメータ値を抽出する手段と，
    前記パラメータ値を焦点位置に換算する手段と，
    前記焦点位置のばらつきに基づきサンプル液の厚み情報を得る手段と，
    を有することを特徴とするフロー式粒子画像解析装置。
12. 請求項１１記載のフロー式粒子画像解析装置において，前記粒子画像特徴パラメータ値として粒子画像の中心付近の濃度値と輪郭付近の濃度値との比，又は粒子画像の中心付近の濃度値と輪郭付近の濃度値との差，又は粒子画像の中心付近の濃度値を使用することを特徴とするフロー式粒子画像解析装置。

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