JP2002544292A - 自動式核酸圧縮装置 - Google Patents

自動式核酸圧縮装置

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JP2002544292A JP2000618492A JP2000618492A JP2002544292A JP 2002544292 A JP2002544292 A JP 2002544292A JP 2000618492 A JP2000618492 A JP 2000618492A JP 2000618492 A JP2000618492 A JP 2000618492A JP 2002544292 A JP2002544292 A JP 2002544292A
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Abstract

(57)【要約】 核酸複合体を分析して、単分子核酸粒子に圧縮するための自動式核酸圧縮装置。広義には、本発明の装置は、容器支持体および撹拌システム、測定および試験システム、並びに分注システム、制御システムによって制御される全てを備える。制御システムは、所定の組成または測定および試験システムが提供するフィードバックデータの分析に基づいて支持体および撹拌システム並びに分注システムを制御する。好ましい態様において、本発明の装置は、閉回路システムで作動する実時間型測定装置および混合装置である。好ましい態様はまた、制御装置にデータを提供するためにバッチ溶液中に配置される没水型プローブを有するモニタリングシステムを備える。モニタリングシステムで検出した場合、核酸の圧縮が望ましいレベルに達すると、制御装置は分注システムおよび混合撹拌システムを停止する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】技術分野 本発明は、遺伝子治療の研究および治療、さらに詳細には単分子DNAに使用す
るための再現性のある薬学的状況において圧縮された核酸を作製する装置に関す
る。
【０００２】発明の背景 広義に遺伝子工学、詳細には遺伝子治療の研究は、外来DNAなどの外因性物質
を宿主細胞に導入して、宿主細胞を変化または調節することによって、生きてい
る宿主細胞を遺伝子的に形質転換することを含む。成功すると、外来DNAによっ
て搬送される遺伝子は宿主細胞中で発現され、従って、宿主細胞は形質転換され
る。遺伝子的に形質転換した細胞または組織は研究、医学および農業においてか
なり有用である。
【０００３】 通常使用される従来の遺伝子導入技術には、細胞融合、エレクトロポレーショ
ン、リポソーム融合、リン酸カルシウム沈降、ウィルス感染、接合転移、マイク
ロピペットマイクロインジェクションおよびエアゾールビームマイクロインジェ
クションなどいくつかある。多くの研究は遺伝子導入技術をひたむきに実施して
いるが、これらの従来の導入技術は全て大型で圧縮されていない形態のDNA、DNA
/リポソームまたはDNA/タンパク質粒子を取り扱っている。血中には圧縮されて
いないDNAを破壊することができるヌクレアーゼが存在するので、圧縮されてい
ないDNA粒子は安定性が低く、かつ圧縮されていないDNA粒子は大型すぎて、受容
体を介するエンドサイトーシスにより細胞エンドソームに取り込まれないか、ま
たは有糸分裂後の細胞の核に輸送されない。従って、有効な遺伝子導入は多くの
研究分野の障害となっている。
【０００４】 圧縮された形態のDNA粒子はDNA有効搭載量を標的組織にうまく送達すると同時
に、安定性を維持し、受容体を介するエンドサイトーシスを可能にする際により
有効であることが認識されている。この認識に関して、文献は、DNAおよび濃縮
予定のタンパク質を共に添加すると同時に、一般に、各々を低濃度で混合するこ
とを教示している。これは、約10〜50分子のDNAと圧縮予定の多数のタンパク質
分子とからなるΨ型DNAと呼ばれる圧縮されたDNA粒子を作製する。Ψ-DNAを作製
するための実験室での方法は、参照として本明細書に組み入れられている、ペラ
ールズ（Perales）ら、「アジアロ糖タンパク質受容体を介した肝細胞に対して
遺伝子をターゲティングできるDNA複合体の生化学的および機能的な特徴づけ（B
iochemical and Functional Characterization of DNA Complexes Capable of T
argeting Genes to Hepatocytes via the Asialoglycoprotein Receptor）」、
J. of Biological Chemistry、vol. 272、pp.7398-7407に記載されている。これ
らのΨ-DNA粒子は、サイズが100〜200nmの次数で、圧縮されていない粒子より改
良されているが、より大型の粒子の安定性、効率および特異性の問題を完全に解
消しているわけではない。
【０００５】 DNA粒子をΨ-DNAより小さいサイズに圧縮することは、以前に、実験室におい
て高度に訓練された研究者によって手動により実施された。Ψ-DNAよりはるかに
小さく圧縮されたDNA粒子の好ましい形態は、単分子であり、一単位のDNAプラス
ミドからなるDNA複合体を示し、これらの粒子は、より典型的には、多数の分子
のDNAからなる圧縮されたDNA粒子から識別するために、圧縮DNA粒子と呼ばれる
。このような多段階の手動的手法および操作につきものの変数により、圧縮DNA
粒子の成功する作製は、反復可能な薬学的製造方法というより、ごく小数の適格
な研究者によってしか実施できない技術形態により類似している。圧縮DNAのこ
のような単分子組成物は安定で、他の組成物と比較すると、静脈内投与および他
の経路の投与により、標的組織の核にDNAを効率的に導入する。
【０００６】 従来の遺伝子導入技術の限界の1つは、標的組織に導入するDNA粒子の大きさで
ある。大型のDNA粒子の不安定さや従来の圧縮DNA粒子を用いた遺伝子導入の不満
足さにより、さらに小型の圧縮型のDNA粒子の使用に拍車がかけられた。圧縮核
酸およびそれらの細胞への送達についての考察、並びに圧縮DNAを使用する利点
が、その全体の開示内容が参照として本明細書に組み入れられており、共通に付
与された米国特許第5,844,107号および同第5,877,302号に開示されている。手動
式による圧縮DNAの作製は高価で、時間がかかり、一定でない場合もあるので、
制御された薬学的製造方法で圧縮された単分子DNA粒子を作製する自動式装置に
ついての必要性がある。
【０００７】発明の概要 従って、本発明の主要な目的は、凝集していない組成の単分子まで圧縮された
DNAを作製する自動式DNA圧縮装置を製造することである。
【０００８】 本発明の別の目的は、圧縮DNA粒子を一定に反復して作製する一連の自動式段
階を提供することである。
【０００９】 本発明のさらに別の目的は、自動式DNA圧縮装置の制御システムを提供するこ
とである。
【００１０】 これらの目的を達成することに指向すると、自動様式または手動様式で閉回路
システムとして作動する実時間測定および混合装置である自動式核酸圧縮装置が
提供される。広義には、本発明の装置は以下の構成要素を含む：測定および試験
システム；並びに分注システム、制御システムによって制御される全て。制御シ
ステムは、支持体および撹拌システム並びに所定の組成に基づいて、または測定
および試験システムによって提供されるフィードバックデータの分析による分注
システムを制御する。望ましいレベルの核酸圧縮が達成されると、制御システム
は、圧縮された核酸を装置から取り出すことができるように、適用可能であれば
、分注および撹拌を確実に停止する。
【００１１】 好ましい態様において、本発明の圧縮装置の支持体および撹拌システムは、混
合溶液が圧縮過程中に分注される、核酸溶液のビーカーを支持するための磁気撹
拌テーブルなどの渦動運動装置を備える。核酸および混合溶液は、米国特許第5,
844,107号および同第5,877,302号に開示されている。核酸は、DNA、RNAまたは該
特許に開示されているようなインビボにおいて分解しない誘導体などのDNA誘導
体もしくはRNA誘導体であってもよいことが理解されるべきである。
【００１２】 本発明の圧縮装置の測定および試験システムは、最初のバッチ溶液のビーカー
内に配置されるプローブ、および制御システムに読み値を反復型フィードバック
をするために制御システムに接続されたモニタリング装置を備える。
【００１３】 本発明の圧縮装置の分注システムは、添加溶液をビーカーに分注するマイクロ
リッターシリンジを動作するポンプおよびステッパーモーターを備える。分注シ
ステムはまた、添加溶液を分散させるための超音波装置の形態の分散システムを
備える。制御システムは、分散システムに命令を与える。
【００１４】 本発明の圧縮装置の制御システムは、測定および試験システムからの読み値を
受け取り、データを分析し、最初の読み値および望ましい読み値とデータを比較
し、必要がある場合には、バッチ溶液に添加溶液を分注するように分注システム
に信号を送るCPUおよびオペレーショナルソフトウェアを備える。
【００１５】 本発明の利点のこれらの特徴および他の特徴は、添付の図面を参照にして、本
発明の以下の好ましい態様の詳細な説明からより完璧に理解することができる。
【００１６】好ましい態様の詳細な説明 広義には、自動式DNA圧縮装置は、DNAの圧縮が望ましいレベルまで得られるま
で、特定の添加溶液を添加するバッチ溶液の圧縮試薬を支持し、混合または撹拌
する構成要素を備える。一つの好ましい態様において、最初のバッチ溶液はDNA
を含み、添加溶液は1種またはそれ以上の多陽イオンを含む。別の好ましい態様
において、最初のバッチ溶液は1種またはそれ以上の多陽イオンを含み、添加溶
液はDNAを含む。特定の圧縮されたDNA複合体を得るためには、バッチ溶液と添加
溶液の量および添加溶液が混合される速度を、望ましいサイズまたは形態で望ま
しい目的量の圧縮DNAが得られるように調整することができる。このような調整
が行えたら、自動式DNA圧縮装置またはより大規模の装置に、製造状況で任意の
量の圧縮DNAを作製するのに必要な溶液を提供することができると考えられる。
【００１７】 このような調整を行うためには、好ましい態様として記載されている装置のよ
うな自動式DNA圧縮装置を使用するとよい。本明細書において開示されている好
ましい態様は、核酸複合体組成物の状態を通信するフィードバックループを有す
る反復型閉ループシステムで構成要素を作動する制御システムに接続された構成
要素を備える。当然のことながら、所定の組成の溶液および添加速度が使用され
る場合には、フィードバックループは必要ない場合がある。
【００１８】 好ましい態様は特定の規模の作製に適切であるが、本発明は、任意の規模の作
製および所定の組成に構成可能であると考えられる。
【００１９】 好ましい態様の自動式圧縮装置は、閉ループシステム、図1で互いに関連する
構成要素を備える。圧縮装置10の主要な構成要素は、制御システム12、支持体お
よび撹拌システム14、測定システム16および分注システム18である。ブロック図
からわかるように、測定システムはバッチ溶液のデータを制御システムにフィー
ドバックし、制御システムは分注システムおよび撹拌システムに命令を与える。
反復型の分注動作、測定動作、分析動作は、望ましい組成が達成されるまで、制
御システムによってDNAまたは多陽イオンのバッチ溶液において実施される。そ
の時点において、得られた圧縮DNA粒子を取り出すことができるように、種々の
構成要素は機能を停止する。圧縮装置の構成要素は、好ましくは、図2に例示す
るように、支持体およびハウジング集成物上に移動可能であるように一体として
配置される。圧縮装置のハードウェア構成要素の詳細は、圧縮装置によって実施
される圧縮方法の総括および動作プロトコールの詳細な説明に従って本明細書に
記載されている。
【００２０】 制御システム12は、広義には、他の構成要素の機能を制御し、測定システムに
よって受け取られるデータを分析するための適当なソフトウェアプログラムを備
えたコンピュータを含む。制御システムはまた、圧縮装置のハードウェア構成要
素と接続し機能する適当なディジタル入力/出力ボードおよびコネクタボードを
備える（図5）。制御システムはまた、図2に例示するように、通常の入力/出力
装置、CRTモニター、キーボードおよびマウスを備える。好ましい態様において
、制御システムは、LabVIEWと呼ばれる特注のソフトウェア制御装置プログラム
を駆動するWindows（登録商標） 95動作システムを備えたGateway 2000PCを備え る。
【００２１】 支持体および撹拌システム14は、垂直型スライド式支持体22に装着された磁気
撹拌台20を備える。撹拌台20は、バッチ溶液を含有するビーカーを支持するよう
に適合されたプラットフォームジグを備える。磁気撹拌台20は、測定システムの
プローブをビーカーに挿入することができ、分注システムがビーカーに直接分注
することができるように、垂直型スライドにそって移動可能である。より大規模
の装置では、プラットフォームが溶液を混合するために垂直に移動可能でない場
合には、プローブを移動可能であるように構成してもよい。
【００２２】 測定システム16は、バッチ溶液の特性または特徴を測定し、このような測定結
果を分析のために制御システムに提供することができるプローブ24、図3を備え
る。測定のために選択される特性または特徴は、制御システムによって比較およ
び分析に適すると分類されるものでなければならない。粒子サイズ、濃度または
吸収スペクトルなどの特性を数量化でき、分析のための制御システムに入力する
ことができる。他の特性もまた測定の目的に使用することができる。好ましい態
様において、プローブは、垂直型スライド式支持体26に装着された光ファイバー
プローブ24である。プローブ26は、チューブの光路28の先端がバッチ溶液内に到
達するまで、垂直型スライド式支持体26に沿って移動することによってバッチ溶
液内に挿入されるように適合されている。動作的に、プローブ24は、分析のため
にスペクトル読み値を制御システムに提供する分光器29に接続されている。好ま
しい態様において、Zeiss MCS501 UV-Vis分光器は、分光器と制御システムとの
通信を可能にするZeiss GPIB トランスピューターボードに接続されている。 ト
ランスピューターボードは、Zeiss MCS500 Labviewライブラリーにおいて分光器
作動のため、および分光器のパラメータを設定するためのプログラムを使用して
いる。
【００２３】 吸光度測定以外にも、トランスピューターボードに接続されている付属機器を
用いて、蛍光、光散乱、ゼータ電位、円偏光二色性および他の周知の方法を測定
およびモニタリングのために使用することができる。制御システムは、測定され
た適当な特性をモニタリングするために構成することができる。
【００２４】 分注システムは、制御システムによって作動されるステッパーモーター32およ
び34によって作動される一対のマイクロ-リッター分注シリンジ31および33、図4
、並びに分散システムを備える。圧縮装置装置の作動中に分注シリンジは、制御
システムによって命令を与えられた場合に、バッチ溶液を含有するビーカー内に
それぞれの溶液を送達する。ディスペンサーおよびモーターは、全行程あたりの
時間単位の速度および行程あたりの容量に関してプログラムすることができる。
【００２５】 一般に、マイクロ-リッター量を分注する場合に、表面張力または毛管引力に
よりマイクロ-リッターの溶液はシリンジの先端から離れない。そのような力に
うち勝ち、望ましい量の添加溶液をシリンジの先端から確実に離すために、分注
システムは、添加溶液をバッチ溶液に分散させるためのサブシステムを備える。
分散システムは、超音波発生装置、もしくは振動器またはエアゾール化装置など
の分散装置35を備える。分散装置は、分注管37および38に震動的または振動的な
運動を提供する。管37および38は、分注動作中に異なる周波数で管を振動するた
めに可変抵抗器に接続されている。この振動ならびにバッチ溶液の混合は任意の
表面張力または毛管引力を克服する助けとなり、マイクロ-リッター量の添加溶
液をバッチ溶液に正確に分注することが可能になる。
【００２６】 この好ましい態様において、ステッパーモーターは、コンピュータのシリアル
通信ポートに接続されている2つのHamilton 511Cディスペンサーである。これら
のディスペンサーは、制御システムによって命令されると、バッチ溶液への送達
を交互に行う。圧縮装置の初期化中にディスペンサーはシリンジおよび管を充填
して下処理し、気泡および漏れがないことを確実にしなければならない。この下
処理動作は、圧縮装置が作動される前に手動で実施される。
【００２７】 本発明の圧縮装置によって実施される圧縮方法は、参照データの収集から開始
する。装置の初期化後、水を入れたビーカーをプラットフォームにおき、プロー
ブを水に漬け、撹拌台を作動する。分光器は、圧縮動作中に測定される全ての吸
収スペクトルのベースラインとして使用される参照スペクトルを測定する。参照
スペクトルは、制御システムのデータログファイルに保存される。
【００２８】 参照スペクトルの収集後、水を入れたビーカーを取り出すことができるように
、垂直型スライド式支持体がプラットフォームを下げる。核酸または多陽イオン
のバッチ溶液を含有するビーカーをプラットフォームにおき、ジグで混合する。
プローブがバッチ溶液に浸漬し、撹拌テーブルが作動するように垂直型スライド
がプラットフォームを上げる。バッチ溶液が所定の位置に来ると、添加溶液の送
達およびスペクトルデータの測定が、測定システムから制御システムへのフィー
ドバックにより生じ、制御システムが分注システムに命令を与える。デフォルト
公差パラメータが提供されているが、分注動作および測定動作を開始する前にオ
ペレータが望ましい公差パラメータを設定することができる。
【００２９】 好ましい態様において、シリンジディスペンサー32は添加溶液Aと呼ばれる添
加溶液を含有し、シリンジディスペンサー34は添加溶液Bと呼ばれる添加溶液を
含有する。広義には、溶液Aは多陽イオンであり、溶液Bは塩である。これらの溶
液の具体例は、上記に同定されている出願に記載されている。ビーカーが核酸の
バッチ溶液を所定の位置で含有する場合には、所定量の溶液Aは段階的にバッチ
溶液に送達される。溶液Aの多数回の送達段階、x、後に、吸収スペクトルを測定
システムによってとり、データをデータログファイルに追加する。溶液Aの送達
は、吸収スペクトルをx段階ごとにとりながら継続する。これらの吸収スペクト
ルのデータをデータファイルに追加する。
【００３０】 溶液Aの送達後、所定量の溶液Bを段階的にバッチ溶液に送達する。溶液Bの多
数回の送達段階、x'の後、吸収スペクトルを測定システムによってとり、データ
をデータログファイルに追加する。溶液Bの送達は、スペクトルデータをx'段階
ごとにとりながら継続する。これらの追加の吸収スペクトルのデータをデータフ
ァイルに追加する。
【００３１】 制御システムは、溶液Bの各段階の送達後に測定したスペクトルを分析するた
めに所定の式を使用する。式は反復して使用され、戻ってきた値が所定の閾値に
到達していない場合には、制御システムは、自動的に溶液Bの分注サイクルをも
う1度命令する。閾値の値に到達したら、制御システムは、分注システムを停止
させ、撹拌台を停止させ、バッチ溶液を取り出せるように垂直型スライド式支持
体にプラットフォームを下げるように命令する。
【００３２】 一例として、圧縮装置の好ましい態様の動作が本明細書の以下に提供してあり
、ペラレス（Perales）らの論文に記載されている実験室における圧縮方法を、
本発明の自動式圧縮装置に実行させる際に使用される設定、時間調整および種々
の溶液の容量を記載している。方法の一部は図6の流れ図に例示されている。こ
れは、インビトロおよびインビボにおいて細胞内に受容体を介したエンドサイト
ーシスのための、DNA-ガラクトシル化ポリ-L-リジン複合体の圧縮についてのも
のである。0.2〜1.0 mg/mlの濃度のDNAの10mlのバッチ溶液をビーカーに入れた
。5mLの容量の第1のシリンジディスペンサーに溶液A、0.05〜0.25mg/mlのガラク
トシル化ポリ-L-リジンを充填する。第1のシリンジの1回の分注段階または行程
は2.38μL容量の溶液Aに相当する。第2のシリンジディスペンサーは4mLの容量を
有し、溶液B、すなわち塩で、この例では5MのNaClを充填した。第2のシリンジの
1回の分注段階または行程は1.19μL容量の溶液Bに相当する。この圧縮は溶液Bに
高塩濃度の組成を使用した。
【００３３】 バッチ溶液がプラットフォームの所定の位置におかれたら、撹拌台を作動した
。制御システムは、50段階が送達されるまで、段階的に溶液Aを分注した。制御
システムは吸収スペクトルを収集し、データを計算し、データをログファイルに
追加した。1400段階が送達されるまで分注を継続した。これは第1のディスペン
サーから約3.3mLの溶液Aが分注されたことに相当する。ディスペンサーの容量に
より、制御システムは、再充填用管を介して液体をシリンジに再び充填するよう
にディスペンサーに指示する。再充填後、スペクトルを50段階ごとにとりながら
、溶液Aの送達を段階的に継続した。溶液Aの送達の間に合計2回の再充填動作を
実施した。4200段階が送達された場合、溶液Aの送達は完了した。
【００３４】 次いで、DNAのバッチ溶液と添加溶液Aを含有するビーカーに、添加溶液Bを一
度に1段階で分注した。溶液Bの全ての段階の添加後に吸収スペクトルをとり、デ
ータをログファイルに保存した。制御システムは以下のようにθを計算した：
【式１】 （式中、tolは公差パラメータ（デフォルト値が0.0001の場合）であり、A260(0)
は時間=0におけるスペクトルであり、A260(t)は時間=tにおけるスペクトルであ
る）。θ<0の場合には、制御システムは溶液Bの別の段階のバッチ溶液への送達
を命令する。溶液Bのこの反復型送達、吸収スペクトルの測定並びに計算および
比較は、θ≧0の閾値レベルが達成されるまで計測した。その時点において、溶
液Bの添加を停止する停止条件に適合し、制御システムは終了プロトコールを開
始した。終了プロトコールはディスペンサーの停止、撹拌台の停止、垂直型スラ
イド式支持体上のプラットフォームの下降、スペクトル分析の停止およびデータ
のコンピュータのファイルへの記録を含む。
【００３５】 分注速度は以下である：添加溶液Aは10秒あたり2.38μLの速度で分注され、添
加溶液Bは10秒あたり1.19μLの速度で分注される。
【００３６】 この圧縮動作後、得られた圧縮DNAは、最初のバッチ溶液中のDNAより100倍以
上小さい直線寸法に圧縮されていた。
【００３７】 2種類の添加溶液を使用する態様では、溶液Bは塩および/または賦形剤を含ん
でもよい。賦形剤は高濃度の圧縮DNAを可溶性の状態に維持する、すなわち、沈
殿することなく生理食塩水中でDNAを維持することを可能にする。溶液Bは、バッ
チ溶液を安定化すると思われる任意の化合物を含んでもよい。塩、塩と賦形剤ま
たは賦形剤単独がバッチ溶液を安定化するのに有用であると見いだされているが
、他の化合物も同様に有効であると思われる。
【００３８】 核酸の最初のバッチ溶液および1つだけの多陽イオンの添加溶液から開始して
圧縮DNA粒子を調製することも可能である。
【００３９】 1つだけの添加溶液を使用する別の好ましい態様では、最初のバッチ溶液は、1
種またはそれ以上の多陽イオンからなり、シリンジディスペンサー31または33は
DNAの添加溶液を含有する。ビーカーが多陽イオンのバッチ溶液を所定の位置で
含有する場合には、所定量のDNAが段階的にバッチ溶液に送達される。多数回の
送達段階、xの後、吸収スペクトルを測定システムでとり、データをデータログ
ファイルに追加する。DNAの送達は、吸収スペクトルをx段階ごとにとりながら、
継続する。これらの追加の吸収スペクトルのデータをデータファイルに追加する
。
【００４０】 これらの好ましい態様では段階的な分注を使用するが、他の定流速または変流
速分注方法を使用することも本発明の範囲内である。フィードバックデータの分
析によって制御されるモニター式動作を実行する代わりに、所定の組成を使用す
る場合には、異なる分注方法が特に有利である場合がある。
【００４１】 圧縮装置、特に制御システムは、オペレータが残りの段階を手動で実施するた
めまたは任意の構成要素を調整するために、方法の任意の時点において仲介でき
るように設計することができる。測定および計算機能は制御システムによってさ
らに実施されるが、制御システムは方法の自動式制御をオペレータに移すように
、スペクトルの測定およびデータの分析は手動で作動することができる。
【００４２】 圧縮方法を実施する前に、圧縮装置を初期化しなければならない。初期化の最
初の要件は、分注システムが清潔であり、開始されたら実験を妨害すると思われ
るものがないことを確実にすることである。CPU、ディジタル入力/出力ボード、
分光器およびトランスピューターボードなどのコンピュータの構成要素は全て標
準的な初期化および診断プロセスを受ける。コンピュータの電源を入れ、初期化
する場合は、ボードのチャンネルは全て0Vに設定する。手動式初期化段階には、
溶液AおよびBによるディスペンサーの下処理が含まれる。コンピュータはオペレ
ータにディスペンサーを下処理することを促し、進行の前にこのタスクの終了に
関するオペレータ入力を待つ。制御システムはシリンジに溶液Aを再充填し、溶
液Aを同時に1段階で分注することを開始し、オペレータが停止コマンドを入力す
る。次いで、第2のディスペンサーのシリンジを溶液Bで下処理し、これもまた一
度に1段階で分注し、オペレータが停止コマンドを入力する。このように、シリ
ンジに溶液AおよびBを充填して、オペレータは、気泡またはもれがないことを確
実にするためにシステムを調査する。シリンジの先端に残っている溶液の液滴は
全て除去する。
【００４３】 初期化後、オペレータは、プラットフォームに脱イオン水を含有するビーカー
をおくためにCRTを介して制御システムによって指示されてもよい。水を入れた
ビーカーが所定の位置にあれば、オペレータは圧縮装置に進行するように命令す
る。制御システムは垂直型スライド式支持体制御にパルスを送り、垂直型スライ
ド式支持体制御は、水にプローブを浸漬するのに適当な高さにプラットフォーム
を上昇させる。撹拌台はビーカー中の水を撹拌するように作動し、プローブは、
水が撹拌されている間浸漬されている。参照スペクトルをとり、上記のようにデ
ータをログファイルに保存する。
【００４４】 以下の実施例はDNAの圧縮に関するが、米国特許第5,844,107号および同第5,87
7,302号に開示されているように、主張されている装置および方法はまた他の種
類の核酸を圧縮し、このような圧縮は特許請求されている発明の範囲内であると
思われることが理解されるべきである。
【００４５】 制御システムはまた、いかなるフィードバックデータを使用することなく、所
定の形式の溶液量および添加速度に基づいた圧縮ルーチンを作動してもよい。当
然のことであるが、制御システムは、所定の形式が作動している場合に、目的物
をモニターするためにこのようなデータを収集することができる。
【００４６】 上記の詳細な説明から、当業者の分野内の本発明の多数の変更、適応および改
良が存在することは明らかである。しかし、本発明の精神から逸脱することのな
いこのような変更は全て、添付の請求の範囲によってのみ限定されると同時に本
発明の範囲内であると考えられるべきであることが意図されている。
【００４７】 実施例1 本実施例では、カオトロピック塩が存在しない場合にDNAを圧縮する。バッチ
溶液は、0.1mg/ml濃度のDNA 10ml(0.30μmolの負電荷/ml)からなり、添加溶液A
は0.08mg/ml濃度のCK8多陽イオン（0.33μmolの正電荷/ml)からなり、両溶液の
希釈液は高純度HPLC級の水である。第1のシリンジディスペンサーは5 mlの容量
で、多陽イオンを充填する。第1のシリンジの1回の分注段階または行程は2.38μ
L容量のCK8に相当する。バッチ溶液がプラットフォームの所定の位置におかれた
ら、撹拌台を作動する。制御システムは、50段階が送達されるまで、段階的に溶
液Aを分注する。制御システムは吸収スペクトルを収集し、データを計算し、デ
ータをログファイルに追加する。1400段階が送達されるまで分注を継続する。こ
れは第1のディスペンサーから約3.3mLのDNAが分注されたことに相当する。ディ
スペンサーの容量により、制御システムは、再充填用管を介して液体をシリンジ
に充填するようにディスペンサーに指示する。再充填後、スペクトルを50段階ご
とにとりながら、溶液Aの送達を段階的に継続する。この特定の実施例では、DNA
の送達の間に合計2回の再充填動作を実施する。7mlの溶液Aを添加した後、ディ
スペンサーを手動で停止する。チャンバー内で混合された正電荷:陰電荷の比は
約0.77である。
【００４８】 図7は、この実施例に概略するパラメータを使用した圧縮DNAの自動式調製中に
観察されるスペクトルプローブデータを示す。A260(左の軸)はおおよそのDNA濃
度（DNAの立体配座および凝集の状態に一部依存する値）をモニターし、A400(右
の軸)は圧縮DNA粒子による光散乱をモニターしている。図7の矢印は、図8に示す
電子顕微鏡を使用して、バッチ溶液試料を圧縮DNAについて分析した場合を示す
。圧縮DNAの電子密度粒子は直径が約29nmであり、わずかにそれより大きい粒子
も観察される。図8のスケールバーは100 nmである。
【００４９】 実施例2 本実施例では、バッチ溶液は多陽イオンからなり、添加溶液はDNAからなる。
好ましい態様において、正電荷ペプチド:陰電荷DNAリン酸基の電荷比は1:1から2
:1、4:1、10:1、20:1、50:1の範囲である。正電荷:陰電荷の正確な比は、DNAお
よび多陽イオンの相対的な容量、相対的な添加速度、溶液の混合速度、温度、pH
並びに、DNAおよび多陽イオンのイオン強度および塩組成を含む種々の他のパラ
メータに依存する。多陽イオンへのDNAの添加速度は、DNAが凝集かつ/または沈
殿しないように選択される。圧縮チャンバー内の可溶性の圧縮DNAの最大濃度は
、多陽イオンの正確な内訳、多陽イオンと共有結合すると思われる標的部分の使
用および圧縮過程の最中または終了後での賦形剤の使用を含む数多くの因子に依
存する。
【００５０】 図9〜12において分析した圧縮操作において、最初のバッチ溶液は2.25mg/mlの
濃度のCK30ポリマー水溶液2.4mlからなり（9.3μmol/mlの正電荷）、溶液Aは0.3
2mg/mlの濃度のDNAの水溶液からなる（0.9μmol/mlの陰電荷）。第1のシリンジ
ディスペンサーは5mlの容量で、DNAを充填する。第1のシリンジの1回の分注段階
または行程は2.38μL容量のDNAに相当する。
【００５１】 バッチ溶液がプラットフォームの所定の位置におかれたら、撹拌台を作動し、
制御システムは、50段階が送達されるまで、段階的に溶液Aを分注する。制御シ
ステムは吸収スペクトルを収集し、データを計算し、データをログファイルに追
加する。1400段階が送達されるまで分注を継続する。これは第1のディスペンサ
ーから約3.3mLのDNAが分注されたことに相当する。ディスペンサーの容量により
、制御システムは、再充填用管を介して液体をシリンジに再充填するようにディ
スペンサーに指示する。再充填後、スペクトルを50段階ごとにとりながら、溶液
Aの送達を段階的に継続する。この特定の実施例では、DNAの送達の間に合計2回
の再充填動作を実施する。合計10mlの溶液Aを添加に添加する。
【００５２】 図9は、圧縮操作中に収集したスペクトルプローブデータを示す。A260(左の軸
)はおおよそのDNA濃度（DNAの立体配座および凝集の状態に一部依存する値）を
モニターし、A400(右の軸)は圧縮DNA粒子による光散乱をモニターしている。A26 0 プロフィールは、圧縮操作中のDNAの希釈によって本質的に予測され、光散乱プ
ロフィールは滴定中のほぼ比例した増加を示すことに注目。実施例2の調製方法
により、添加したDNAの量に直接比例して、単分子まで圧縮され、凝集していな
いDNA粒子が形成され、単分子まで圧縮されたDNAの相対的な凝集および解離の状
態はスペクトルプローブ測定でも、連続的な電子顕微鏡写真によっても明らかで
はない。図9の矢印は、図10および図11に見られるように、電子顕微鏡および動
的光散乱法を使用してバッチ溶液試料を圧縮DNAについて分析した場合を示す。
【００５３】 図10は、圧縮DNAの電子顕微鏡写真を示す。DNA複合体の大半は直径が約20〜25 nmであり、わずかにそれより大きい複合体も観察されることに注意すること。
写真中のスケールバーは100nmである。この調製物についてのアガロース電気泳
動は、DNAの本質的に全てが圧縮されており、遊離のDNAは観察されないことを示
している（データは示していない）。
【００５４】 図11は、同じDNA試料の動的光散乱分析を示す。DNA試料は、Particle Sizing
動的光散乱装置を使用して評価した。データは複峰性Nicomp分布に一致し、適合
誤差(fit error)は1.541である。主要なピーク（数値重みづけヒストグラム(num
erical weighted histogram)の99.2%）は平均サイズが17.3 nmである。シグナル
の0.8%を含む小さい方のピークは平均サイズが75.5 nmである。このように、電
子顕微鏡または動的光散乱法のどちらかを使用して測定したサイズ間には良好な
相関がある。表1は、図11に相当する概要を含む。
【００５５】
【表１】
【００５６】 この実施例では、単分子まで圧縮されたDNAの凝集および解離状態は観察され
ていないので、多陽イオンへのDNAの添加を制御するフィードバック機序は必ず
しも必要ない。しかし、モニタリングシステムからの入力データに基づいてディ
スペンサーを制御するための制御システムを使用することによって、DNAおよび
多陽イオンの他の組成および/または濃度を使用する組成物を最適化することが
できる。
【００５７】 適当に調製し、圧縮したDNA複合体は可溶性で、溶液中で解離せず、レイリー
の法則に従って光を散乱することが予測される。この原理は、入射光の波長より
有意に小さい直径を有する粒子は、波長の4乗に逆比例して光を散乱することを
予測する。この実施例で調製したDNA複合体は、330〜420nmの間の入射波長で光
学密度を評価した。この範囲では、DNAまたは多陽イオンの特定の結合により光
線の吸収はなく、むしろ、観察される吸光度は全て、圧縮されたDNA粒子による
光線の散乱による。図12に示すように、吸光度の対数に対する入射光線の波長の
対数のプロットは、傾きが-4.42+/-0.037(SE)の直線を示す。濁度パラメータは
、このプロットの傾きと規定される。表2は、図12に相当するデータを含む。
【００５８】
【表２】
【００５９】 他の実験において、本発明の圧縮装置を使用した42の重複しない圧縮物の平均
濁度パラメータ値は-4.13+/-0.24(SD)であった。これらの結果は、圧縮したDNA
複合体は、レイリーの法則に示されるように、理論的な予測に従って、光を散乱
することを実証している。（特定の溶媒効果のために）凝集している圧縮DNA作
製物は、小さい傾き値、典型的には-3.0〜-3.4の範囲で光を散乱することが観察
されている。本発明の圧縮装置の一態様において、この濁度プロット分析はDNA
を圧縮する実際の過程中に実時間で実施される。この分析は、作製過程全体にわ
たって圧縮DNAの品質管理を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の好ましい態様による自動式DNA圧縮装置の閉回路システ
ムのブロック図である。
【図２】 支持体、分散システム、分注システム、撹拌システム、モニタリ
ングシステムおよび制御システムを示す、自動式DNA圧縮装置の好ましい態様の
立面図である。
【図３】 図2の圧縮装置の分散システムおよび分注システム並びにモニタ
リングプローブの詳細な立面図である。
【図４】 図2の圧縮装置の支持体、分散、分注、撹拌およびモニタリング
システムからなる分注要素の詳細な立面図である。
【図５】 図2の圧縮装置の構成要素の一例の略図である。
【図６】 自動式圧縮装置の反復圧縮方法の流れ図である。
【図７】 実施例1に概略するパラメーターを使用して、圧縮されたDNAの自
動調製の際に観察されたスペクトルプローブデータのプロットである。
【図８】 実施例1の作製方法を使用して圧縮したDNAの自動調製品の電子顕
微鏡写真である。
【図９】 実施例2に概略するパラメーターを使用して、圧縮されたDNAの自
動調製の際に観察された分光プローブデータのプロットである。
【図１０】 実施例2の調製方法を使用して圧縮したDNAの自動調製品の電子
顕微鏡写真である。
【図１１】 実施例2の作製方法を使用して圧縮したDNAの自動調製品の動的
光散乱プロフィールである。
【図１２】 実施例2の作製方法を使用して圧縮したDNAの濁度パラメーター
解析の吸光度の対数に対する波長の対数プロットである。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年４月２６日（２００２．４．２６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 コワルシジク トマス エイチ． アメリカ合衆国 オハイオ州 ユニバーシ ティ ヘイツ イートン ロード 2437 (72)発明者 パシュマルティ ムラリ クリシュナ アメリカ合衆国 オハイオ州 ウィロビー ヒルズ ビショップ パーク ドライブ ＃ダブリュ418 27500 (72)発明者 ペラレス ホセ シー． スペイン国 バルセロナ 140．20．２エ イ グラン ド グラシア 内 (72)発明者 トロンタリ スティーブン ジェイ． アメリカ合衆国 オハイオ州 モアランド ヒル ウィルトシャー ロード 3889 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA19 AA20 CA01 HA20 4B029 AA23 AA27 BB20 CC01 4C057 BB02 CC01 DD01 MM04 MM08

Claims (60)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 望ましい状態または大きさに核酸複合体を圧縮するための装
    置であって、 バッチ溶液を支持する支持体と、 バッチ溶液に添加溶液を分注するディスペンサーであって、添加溶液またはバッ
    チ溶液が核酸を含有し、添加溶液の添加後に、バッチ溶液が核酸複合体を含有す
    るディスペンサーと、 バッチ溶液中の核酸複合体が望ましい状態または大きさに到達したかどうかを判
    定するためにバッチ溶液をモニタリングするためのモニターと、 添加溶液の分注を制御するために該ディスペンサーに接続されている制御装置と
    を備える装置。
  2. 【請求項２】 モニターおよび制御装置がフィードバック構成で機能的に接
    続されている、請求項1に記載の装置。
  3. 【請求項３】 支持体がバッチ溶液に運動を提供する、請求項1に記載の装
    置。
  4. 【請求項４】 運動が渦動運動である、請求項3に記載の装置。
  5. 【請求項５】 支持体が磁気撹拌台を備える、請求項1に記載の装置。
  6. 【請求項６】 ディスペンサーが定流速の分注機序を有する、請求項1に記
    載の装置。
  7. 【請求項７】 ディスペンサーが変流速分注機序を有する、請求項1に記載
    の装置。
  8. 【請求項８】 ディスペンサーがマイクロリッター量を分注するように適合
    されている、請求項1に記載の装置。
  9. 【請求項９】 ディスペンサーが、マイクロリッター量の添加溶液をバッチ
    溶液に分散させる分散装置を備える、請求項8に記載の装置。
  10. 【請求項１０】 ディスペンサーが複数の分注要素を備える、請求項1に記
    載の装置。
  11. 【請求項１１】 モニターがバッチ溶液に没水可能なプローブを備える、請
    求項1に記載の装置。
  12. 【請求項１２】 モニターが、吸光度を測定するための分光器を備える、請
    求項1に記載の装置。
  13. 【請求項１３】 モニターが、光散乱を測定するための分光器を備える、請
    求項1に記載の装置。
  14. 【請求項１４】 モニターが、ゼータ電位を測定するための分光器を備える
    、請求項1に記載の装置。
  15. 【請求項１５】 モニターが、円偏光二色性を測定するための分光器を備え
    る、請求項1に記載の装置。
  16. 【請求項１６】 モニターが、蛍光を測定するための蛍光計を備える、請求
    項1に記載の装置。
  17. 【請求項１７】 ディスペンサーが添加溶液を分注する場合に運動がバッチ
    溶液に提供される、請求項3に記載の装置。
  18. 【請求項１８】 核酸のバッチ溶液をさらに含む、請求項1に記載の装置。
  19. 【請求項１９】 多陽イオンのバッチ溶液をさらに含む、請求項1に記載の
    装置。
  20. 【請求項２０】 望ましい状態または大きさに核酸複合体を圧縮するための
    装置であって、 バッチ溶液容器と、 バッチ溶液に添加溶液を送達するように適合されている分注システムであって、 添加溶液またはバッチ溶液が核酸を含有し、添加溶液の添加後に、バッチ溶液が
    核酸複合体を含有する分注システムと、 添加溶液の分注を調節するために前記分注システムに接続されている制御装置と
    を備える装置。
  21. 【請求項２１】 核酸複合体の状態または大きさをモニタリングするための
    モニターをさらに備える、請求項20に記載の装置。
  22. 【請求項２２】 モニターが、バッチ溶液容器内に配置することができる没
    水型プローブを備える、請求項21に記載の装置。
  23. 【請求項２３】 モニターが、吸光度を測定するための分光器を備える、請
    求項21に記載の装置。
  24. 【請求項２４】 モニターが、光散乱を測定するための分光器を備える、請
    求項21に記載の装置。
  25. 【請求項２５】 モニターが、ゼータ電位を測定するための分光器を備える
    、請求項21に記載の装置。
  26. 【請求項２６】 モニターが、円偏光二色性を測定するための分光器を備え
    る、請求項21に記載の装置。
  27. 【請求項２７】 モニターが、蛍光を測定するための蛍光計を備える、請求
    項21に記載の装置。
  28. 【請求項２８】 モニターおよび制御装置がフィードバック構成で機能的に
    接続されている、請求項21に記載の装置。
  29. 【請求項２９】 バッチ溶液容器がバッチ溶液に混合運動を提供する、請求
    項20に記載の装置。
  30. 【請求項３０】 運動が渦動運動である、請求項29に記載の装置。
  31. 【請求項３１】 バッチ溶液容器を支持するための磁気撹拌台をさらに備え
    る、請求項20に記載の装置。
  32. 【請求項３２】 ディスペンサーが添加溶液を分注する場合に、運動がバッ
    チ溶液に提供される、請求項31に記載の装置。
  33. 【請求項３３】 ディスペンサーが定流速分注機序を有する、請求項20に記
    載の装置。
  34. 【請求項３４】 ディスペンサーが変流速分注機序を有する、請求項20に記
    載の装置。
  35. 【請求項３５】 ディスペンサーがマイクロリッター量を分注するように適
    合されている、請求項20に記載の装置。
  36. 【請求項３６】 ディスペンサーが、マイクロリッター量の添加溶液をバッ
    チ溶液に分注するための分注装置を備える、請求項20に記載の装置。
  37. 【請求項３７】 分注システムが複数のディスペンサーを備える、請求項20
    に記載の装置。
  38. 【請求項３８】 核酸のバッチ溶液をさらに含む、請求項20に記載の装置。
  39. 【請求項３９】 多陽イオンのバッチ溶液をさらに含む、請求項20に記載の
    装置。
  40. 【請求項４０】 核酸を望ましい状態または大きさに圧縮するための核酸圧
    縮装置であって、 添加溶液ディスペンサーと、 バッチ溶液容器とを備える装置。
  41. 【請求項４１】 バッチ溶液容器と連絡しており、容器に含有されるバッチ
    溶液に混合運動を提供するように適合されているミキサーをさらに備える、請求
    項40に記載の核酸圧縮装置。
  42. 【請求項４２】 ミキサーが、バッチ溶液容器を支持する磁気撹拌台を備え
    る、請求項41に記載の核酸圧縮装置。
  43. 【請求項４３】 ミキサーが、容器に含有されるバッチ溶液に添加溶液を分
    散させることができる添加溶液ディスペンサーに接続されている分散装置を含む
    、請求項41に記載の核酸圧縮装置。
  44. 【請求項４４】 バッチ溶液への添加溶液の送達を調節するように適合され
    ているディスペンサーに接続されている制御装置をさらに備える、請求項40に記
    載の核酸圧縮装置。
  45. 【請求項４５】 容器に含有されるバッチ溶液の核酸の状態または大きさを
    分析するように適合されているモニターをさらに備える、請求項40に記載の核酸
    圧縮装置。
  46. 【請求項４６】 容器に含有されるバッチ溶液の核酸の状態または大きさを
    分析するように適合されているモニターをさらに備える、請求項44に記載の核酸
    圧縮装置。
  47. 【請求項４７】 バッチ溶液の核酸の状態またはサイズに応じて、添加溶液
    の送達を調節するために、モニターがフィードバック構成で制御装置に機能的に
    接続され、バッチ溶液中の核酸が望ましい状態または大きさに到達した場合に添
    加溶液の送達を停止する、請求項46に記載の核酸圧縮装置。
  48. 【請求項４８】 核酸を望ましい状態または大きさに圧縮する方法であって
    、 核酸圧縮装置に、核酸または多陽イオンを含有する最初のバッチ溶液を提供する
    段階と、 核酸圧縮装置を使用して、核酸を望ましい状態または大きさに圧縮する段階と を含む方法。
  49. 【請求項４９】 核酸の所与の状態または大きさを得るために反復可能であ
    る、請求項48に記載の方法。
  50. 【請求項５０】 圧縮する段階が圧縮された単分子核酸粒子を生ずる、請求
    項48に記載の方法。
  51. 【請求項５１】 圧縮する段階が、直径90 nm未満の球形の圧縮された核酸
    粒子を生ずる、請求項48に記載の方法。
  52. 【請求項５２】 圧縮する段階が、直径50 nm未満の球形の圧縮された核酸
    粒子を生ずる、請求項51に記載の方法。
  53. 【請求項５３】 圧縮する段階が、直径25 nm未満の球形の圧縮された核酸
    粒子を生ずる、請求項52に記載の方法。
  54. 【請求項５４】 圧縮する段階が、円柱形の圧縮された核酸粒子を生ずる、
    請求項48に記載の方法。
  55. 【請求項５５】 圧縮する段階が、環状の形態である圧縮された核酸粒子を
    生ずる、請求項48に記載の方法。
  56. 【請求項５６】 圧縮する段階が、直径90 nm未満の球形の圧縮された核酸
    粒子を生ずる、請求項50に記載の方法。
  57. 【請求項５７】 圧縮する段階が、直径50 nm未満の球形の圧縮された核酸
    粒子を生ずる、請求項56に記載の方法。
  58. 【請求項５８】 圧縮する段階が、直径25 nm未満の球形の圧縮された核酸
    粒子を生ずる、請求項57に記載の方法。
  59. 【請求項５９】 圧縮する段階が、円柱形の圧縮された核酸粒子を生ずる、
    請求項50に記載の方法。
  60. 【請求項６０】 圧縮する段階が、環状の形態である圧縮された核酸粒子を
    生ずる、請求項50に記載の方法。
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