JP2002543839A - ヒト組織に発現する完全長分子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒト組織に発現する完全長分子（FLEXHT）と、FLEXHTを同定しコードするポリヌクレオチドとを提供する。本発明はまた、発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニスト及びアンタゴニストを提供する。更に、本発明は、ヒト遺伝子発現、遺伝連鎖及び遺伝変異性の分析、FLEXHTの発現に関連する疾患の診断または治療方法、予防方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 本発明は、ヒト組織に発現する完全長分子の核酸配列及びアミノ酸配列に関し
、ヒト遺伝子発現、遺伝連鎖及び遺伝変異性の分析及び診断、治療並びに予防に
おけるこれらの配列の利用に関する。

【０００２】 （発明の背景） 哺乳動物DNAの僅か２％がタンパク質をコードし、実際には常に特定の細胞で
発現するのはタンパク質をコードする遺伝子の僅かな割合しかないと推定されて
いる。多細胞生物の様々なタイプの細胞は、構造的にも機能的にも非常に異なっ
ており、遺伝子発現の独自のパターンにより特定の細胞の同一性が与えられる。
更に、異なる細胞タイプが、重複遺伝子であるが他と区別し得るような一連の遺
伝子を発達の間ずっと発現する。細胞成長及び増殖、細胞分化、免疫反応、アポ
プトシス及び生物の発達及び生存に寄与するその他のプロセスは、遺伝子発現の
調節により制御される。好適な遺伝子調節はまた、所定の時間に必要とされる遺
伝子だけを発現することにより確実に能率的に細胞を機能させる。遺伝子発現に
影響する因子には細胞外シグナルがあり、細胞外シグナルは細胞と細胞の情報交
換を仲介し、異なる細胞タイプの活性を調整する。遺伝子発現は、DNA及びRNA転
写のレベル及びmRNA転写のレベルにより調整される。

【０００３】 遺伝子の異所発現または突然変異及びこれらの産物は、癌及びその他の細胞増
殖障害等などの様々なヒトの疾病の要因となり得るか或いは罹病を容易にし得る
。遺伝子びその産物の同一性を基準として、疾病の早期発見に対する市場及びそ
の予防及び治療のターゲットを探そうとする努力が絶えず拡大している。例えば
癌は、体内の殆ど全ての組織に影響を与える一種の細胞増殖障害である。多くの
場合、異常発現または突然変異の間、癌の発達即ち腫瘍形成は正常遺伝子の発癌
性遺伝子即ち腫瘍遺伝子への転換に相関している。腫瘍遺伝子の産物であるオン
コプロテインには細胞増殖に影響を与える種々の分子を有し、例えば成長因子、
成長因子受容体、細胞内シグナル変換器、核転写因子及び細胞サイクル制御タン
パク質などがある。対照的に、腫瘍サプレッサー遺伝子は細胞増殖の阻害に関与
している。腫瘍サプレッサー遺伝子を低減または抑制する突然変異は、異所細胞
増殖及び癌を発生させる。癌などの細胞増殖障害に関連する多種多様な遺伝子及
びその産物がこのようにして見つけられてきたが、未発見のものも未だ多数存在
し得る。

【０００４】 DNAアレイ（DNA based array）は、遺伝子発現及び遺伝変異性を試験するため
の効率的、高性能な方法を提供し得る。例えばSNP即ち単一ヌクレオチド多形性
は、最も一般的なタイプのヒトの遺伝変異である。DNAアレイは、数百そして数
千もの遺伝子の中からSNPの発見を劇的に促進し得る。同様に、このようなアレ
イは、個人または集団から採取したDNAサンプルを選択したSNPの常在度に対して
アッセイするようなSNP遺伝子タイピングに用い得る。このようなアプローチは
最終的に、ヒトゲノムにおける全ての遺伝変異の系統的認識と、羅病性、薬治療
への反応性及びその他の医学的に関係する情報を有する或る種の遺伝変異との相
関をもたらすことになる（Wang, D.G. ら (1998) Science 280:1077-1082.等を
参照）。

【０００５】 DNAアレイ技術は、包括的遺伝子発現パターンの迅速な分析に特に重要である
。例えば、遺伝的素因、遺伝病または遺伝治療は、所与の組織における多数の遺
伝子の発現に直接または間接的に影響し得る。この場合、発現する全ての遺伝子
のプロフィール即ち転写イメージ及び特定の組織で遺伝子が発現するレベルを構
築することは有益である。或る疾病に罹っているか或いは特定の治療を受けてい
るような個人または集団からのプロフィールは、対照個人または集団からの同様
のプロフィールと比較し得る。このような分析は遺伝子機能の知識を必要としな
いので、各遺伝子をマーカーとして処理するような数学的分析に発現プロフィー
ルを供し得る。更に、遺伝子発現プロフィールは、例えば特定の組織の或る発達
段階において或いは疾病または治療に応じて、発現した全ての遺伝子を認識する
ことにより生物学的経路を詳細に分析することができる（Lander, E.S. ら (199
6) Science 274:536-5 39.等を参照）。

【０００６】 新たなヒト組織に発現する完全長分子及びそれをコードするポリヌクレオチド
の発見は、ヒト遺伝子発現、遺伝連鎖及び遺伝変異性の分析と、発達障害、細胞
増殖異常及び免疫異常疾患の診断、治療並びに予防とにおいて有用である新たな
組成を提供することにより、当該分野における要求を満たす。

【０００７】 （発明の概要） 本発明は、集合的には「FLEXHT」、個別には「FLEXHT-1」、「FLEXHT-2」、「FLEXH
T-3」、「FLEXHT-4」、「FLEXHT-5」、「FLEXHT-6」、「FLEXHT-7」、「FLEXHT-8」、「FLEXH
T-9」、「FLEXHT-10」、「FLEXHT-11」、「FLEXHT-12」、「FLEXHT-13」、「FLEXHT-14」、「
FLEXHT-15」、「FLEXHT-16」、「FLEXHT-17」、「FLEXHT-18」、「FLEXHT-19」、「FLEXHT-
20」、「FLEXHT-21」、「FLEXHT-22」、「FLEXHT-23」、「FLEXHT-24」、「FLEXHT-25」、「F
LEXHT-26」、「FLEXHT-27」、「FLEXHT-28」、「FLEXHT-29」、「FLEXHT-30」、「FLEXHT-3
1」、「FLEXHT-32」、「FLEXHT-33」、「FLEXHT-34」、「FLEXHT-35」、「FLEXHT-36」、「FL
EXHT-37」、「FLEXHT-38」、「FLEXHT-39」、「FLEXHT-40」、「FLEXHT-41」、「FLEXHT-42
」、「FLEXHT-43」、「FLEXHT-44」、「FLEXHT-45」、「FLEXHT-46」、「FLEXHT-47」、「FLE
XHT-48」、「FLEXHT-49」、「FLEXHT-50」、「FLEXHT-51」、「FLEXHT-52」、「FLEXHT-53」
、「FLEXHT-54」及び「FLEXHT-55」と呼ばれるような、実質上精製されたポリペプチ
ドであるヒト組織に発現する完全長分子に特徴がある。或る実施態様において本
発明は、（ａ）配列番号１乃至５５を有する群から選択したアミノ酸配列、（ｂ
）配列番号１乃至５５を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％
の相同性を有する天然のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号１乃至５５を有する群か
ら選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）配列番号１乃至５５
を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片を含む、実質上単離され
たポリペプチドを提供する。一実施態様では、配列番号１乃至５５を有する群か
ら選択したアミノ酸配列を含む実質上単離されたポリペプチドを提供する。

【０００８】 また、本発明は（ａ）配列番号１乃至５５を有する群から選択したアミノ酸配
列、（ｂ）配列番号１乃至５５を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくと
も９０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号１乃至５５を有
する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）配列番号１
乃至５５を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片を含むポリペプ
チドをコードするような実質上単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施
態様では、ポリヌクレオチドは配列番号１乃至５５を有する群から選択したポリ
ペプチドをコードする。別の実施態様では、ポリヌクレオチドは配列番号５６乃
至１１０を有する群から選択される。

【０００９】 本発明は更に、（ａ）配列番号１乃至５５を有する群から選択したアミノ酸配
列、（ｂ）配列番号１乃至５５を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくと
も９０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号１乃至５５を有
する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）配列番号１
乃至５５を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片を含むポリペプ
チドをコードするような実質上単離されたポリヌクレオチドと機能的に結合した
プロモーター配列を有する組換えポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では
、本発明は組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞を提供する。別の
実施態様では、本発明は組換えポリヌクレオチドを含む遺伝形質転換体を提供す
る。

【００１０】 また、本発明は（ａ）配列番号１乃至５５を有する群から選択したアミノ酸配
列、（ｂ）配列番号１乃至５５を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくと
も９０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号１乃至５５を有
する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）配列番号１
乃至５５を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片を含む実質上単
離されたポリペプチドを製造する方法を提供する。製造方法は、（ａ）組換えポ
リヌクレオチドを用いて形質転換した細胞をポリペプチドの発現に適した条件下
で培養する過程と、（ｂ）そのように発現したポリペプチドを受容する過程とを
有し、組換えポリヌクレオチドはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに
機能的に結合したプロモーター配列を有する。

【００１１】 本発明は更に、（ａ）配列番号１乃至５５を有する群から選択したアミノ酸配
列、（ｂ）配列番号１乃至５５を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくと
も９０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号１乃至５５を有
する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）配列番号１
乃至５５を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片を含むポリペプ
チドに特異結合するような実質上単離された抗体を提供する。

【００１２】 本発明は更に、（ａ）配列番号５６乃至１１０を有する群から選択したポリヌ
クレオチド配列、（ｂ）配列番号５６乃至１１０を有する群から選択したポリヌ
クレオチド配列と少なくとも９０％の相同性を有する天然のポリヌクレオチド配
列、（ｃ）（ａ）に相補的なポリヌクレオチド配列、（ｄ）（ｂ）に相補的なポ
リヌクレオチド配列、または（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物を含む実質上単
離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、ポリヌクレオチドは少
なくとも６０の連続したヌクレオチドを有する。

【００１３】 本発明は更に、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する
。ここで、標的ポリヌクレオチドは（ａ）配列番号５６乃至１１０を有する群か
ら選択したポリヌクレオチド配列、（ｂ）配列番号５６乃至１１０を有する群か
ら選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の相同性を有する天然のポ
リヌクレオチド配列、（ｃ）（ａ）に相補的なポリヌクレオチド配列、（ｄ）（
ｂ）に相補的なポリヌクレオチド配列、または（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価
物を含む実質上単離されたポリヌクレオチドを提供する。検出方法は、（ａ）サ
ンプル中の標的ポリヌクレオチドに相補的な配列からなる少なくとも２０の連続
したヌクレオチドを含むプローブを用いて該サンプルをハイブリダイズする過程
と、（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体の存在・不存在を検出し、複合体が存
在する場合にはオプションでその量を検出する過程からなり、プローブと標的ポ
リヌクレオチドの間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下
で、プローブは標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする。一実施態
様では、プローブは少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含む。

【００１４】 本発明はまた、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する
。ここで、標的ポリヌクレオチドは（ａ）配列番号５６乃至１１０を有する群か
ら選択したポリヌクレオチド配列、（ｂ）配列番号５６乃至１１０を有する群か
ら選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の相同性を有する天然のポ
リヌクレオチド配列、（ｃ）（ａ）に相補的なポリヌクレオチド配列、（ｄ）（
ｂ）に相補的なポリヌクレオチド配列、または（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価
物を含む実質上単離されたポリヌクレオチドを提供する。検出方法は、（ａ）ポ
リメラーゼ連鎖反応増幅を用いて標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅す
る過程と、（ｂ）標的ポリヌクレオチドまたはその断片の存在・不存在を検出し
、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその
量を検出する過程を含む。

【００１５】 本発明は更に、有効量のポリペプチドと薬剤として許容できる賦形剤とを含む
医薬品成分を提供する。有効量のポリペプチドは、（ａ）配列番号１乃至５５を
有する群から選択したアミノ酸配列、（ｂ）配列番号１乃至５５を有する群から
選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列
、（ｃ）配列番号１乃至５５を有する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活
性断片、または（ｄ）配列番号１乃至５５を有する群から選択したアミノ酸配列
の免疫抗原性断片を含む。一実施態様では、医薬品成分は配列番号１乃至５５を
有する群から選択したアミノ酸配列を含む。更に本発明は、機能性FLEXHTの発現
低下に関連する疾患又は病状を治療する方法であって、そのような治療を必要と
する患者に対して医薬品成分を投与する過程を有する方法を提供する。

【００１６】 本発明はまた、（ａ）配列番号１乃至５５を有する群から選択したアミノ酸配
列、（ｂ）配列番号１乃至５５を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくと
も９０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号１乃至５５を有
する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）配列番号１
乃至５５を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片を含むポリペプ
チドのアゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする
方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドを有するサンプル
を化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程とを
含む。一実施態様では、本発明は機能性FLEXHTの発現低下に関連する疾患又は病
状を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に対して医薬品成
分を投与する過程を含む方法を提供する。

【００１７】 本発明は更に、（ａ）配列番号１乃至５５を有する群から選択したアミノ酸配
列、（ｂ）配列番号１乃至５５を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくと
も９０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号１乃至５５を有
する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）配列番号１
乃至５５を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片を含むポリペプ
チドのアンタゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニング
する方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドを含むサンプ
ルを化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程と
を含む。一実施態様で本発明は、この方法によって同定したアンタゴニスト化合
物と薬剤として許容できる賦形剤とを含む医薬品成分を提供する。別の実施態様
では、機能性FLEXHTの過剰発現に関連する疾患又は病状を治療する方法であって
、そのような治療を必要とする患者に対して医薬品成分を投与する過程を含む方
法を提供する。

【００１８】 本発明は更に、（ａ）配列番号１乃至５５を有する群から選択したアミノ酸配
列、（ｂ）配列番号１乃至５５を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくと
も９０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号１乃至５５を有
する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）配列番号１
乃至５５を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片を含むポリペプ
チドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニン
グ方法は、（ａ）ポリペプチドを適切な条件下で少なくとも１つの試験化合物に
結合させる過程と、（ｂ）試験化合物とのポリペプチドの結合を検出し、それに
よってポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程とを含む。

【００１９】 本発明は更に、（ａ）配列番号１乃至５５を有する群から選択したアミノ酸配
列、（ｂ）配列番号１乃至５５を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくと
も９０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号１乃至５５を有
する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）配列番号１
乃至５５を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片を含むポリペプ
チドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニ
ング方法は、（ａ）ポリペプチドの活性が許容された条件下で、ポリペプチドを
少なくとも１つの試験化合物に結合させる過程と、（ｂ）ポリペプチドの活性を
試験化合物の存在下で算定する過程と、（ｃ）試験化合物の存在下でのポリペプ
チドの活性を試験化合物の不存在下でのポリペプチドの活性と比較する過程とを
含み、試験化合物の存在下でのポリペプチドの活性の変化は、ポリペプチドの活
性を調節する化合物を標示する。

【００２０】 本発明は更に、標的ポリヌクレオチドの変異発現の有効性を確認するために化
合物をスクリーニングする方法を提供する。標的ポリヌクレオチドは、配列番号
５６乃至１１０を有する群から選択した配列を含む。スクリーニング方法は、（
ａ）標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝す過程と、（ｂ）標的ポ
リヌクレオチドの変異発現を検出する過程とを含む。

【００２１】 本発明は更に、（ａ）配列番号５６乃至１１０を有する群から選択したポリヌ
クレオチド配列と相同性を有するポリヌクレオチド配列と、（ｂ）（ａ）のRNA
等価物とを有する群から選択したポリヌクレオチド配列を含む、少なくとも２０
の連続したヌクレオチドを含む実質上単離されたポリヌクレオチドを提供する。
更に本発明は、ポリヌクレオチドを少なくとも１つと、検出可能な標識を有する
ような、ヒトFLEXHTポリヌクレオチドの変異発現を検出するために有用である化
合物を提供する。

【００２２】 本発明は更に、（ａ）配列番号５６乃至１１０を有する群から選択したポリヌ
クレオチド配列と相同性を有するポリヌクレオチド配列と、（ｂ）（ａ）のRNA
等価物とを有する群から選択したポリヌクレオチド配列を含む、少なくとも２０
の連続したヌクレオチドのポリヌクレオチドを含む実質上単離されたポリヌクレ
オチドである要素を少なくとも１つは有するマイクロアレイを提供する。更に本
発明は、マイクロアレイを用いてポリヌクレオチドを有するサンプルの転写イメ
ージを生成する方法を提供する。生成方法は、（ａ）サンプルの標的ポリヌクレ
オチドを標識する過程と、（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体の形成に適した
条件下で、マイクロアレイの要素をサンプルの標識されたポリヌクレオチドに接
触させる過程と、（ｃ）サンプル中でのポリヌクレオチドの発現を定量する過程
とを含む。

【００２３】 （発明を実施するための形態） 本発明のタンパク質、ヌクレオチド配列及び方法について説明するが、その前
に、説明した特定の装置、材料及び方法に本発明が限定されるものではなく、改
変し得ることを理解されたい。また、ここで使用する専門用語は特定の実施例を
説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の
範囲を限定することを意図したものではないことも併せて理解されたい。

【００２４】 請求の範囲及び明細書中で用いている単数形の「或る」及び「その（この）」
の表記は、文脈から明らかにそうでないとされる場合を除いて複数のものを指す
場合もあることに注意しなければならない。従って、例えば「或る宿主細胞」と
記されている場合にはそのような宿主細胞が複数あることもあり、「或る抗体」
と記されている場合には単数または複数の抗体、及び、当業者に公知の抗体の等
価物等についても言及しているのである。

【００２５】 本明細書中で用いる全ての専門用語及び科学用語は、特に定義されている場合
を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書で説
明するものと類似あるいは同等の任意の装置、材料及び方法を用いて本発明の実
施または試験を行うことができるが、ここでは好適な装置、材料、方法について
説明する。本発明で言及する全ての刊行物は、刊行物中で報告されていて且つ本
発明に関係があるであろう細胞、プロトコル、試薬及びベクターについて説明及
び開示する目的で引用しているものである。本明細書のいかなる開示内容も、本
発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられ
ていないことを認めるものではない。

【００２６】 定義 「FLEXHT」は、実質上精製されたFLEXHTのアミノ酸配列であって、任意の種、
特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及びヒトを含む哺乳動物の種から得たも
ので、任意の天然物、合成物、半合成物或いは組換え物を起源とするものを指す
。

【００２７】 「アゴニスト」の語は、FLEXHTの生物学的活性を強化または擬態する分子を指
す。アゴニストの例として、タンパク質、核酸、糖質、小分子その他の任意の化
合物や成分を挙げることができるが、これらはFLEXHTと直接相互作用することに
よって、或いはFLEXHTが関与する生物学的経路の構成エレメントに作用すること
によって、FLEXHTの活性を調節する。

【００２８】 「対立遺伝子変異体」は、FLEXHTをコードする遺伝子の別の形態である。対立
遺伝子変異体は、核酸配列における少なくとも１の突然変異から作製し得る。ま
た、変異RNAまたはポリペプチドからも作製し得る。ポリペプチドの構造または
機能は、変異することもしないこともある。遺伝子は、天然の対立遺伝子変異体
を全く有しないか、１若しくは数個の天然の対立遺伝子変異体を有し得る。一般
に対立遺伝子変異体を生じさせる通常の突然変異性変化は、ヌクレオチドの自然
欠失、付加または置換に帰するものである。これら各変化は、単独或いは他の変
化と共に、所定の配列内で1若しくは数回生じ得る。

【００２９】 FLEXHTをコードする「変異(altered)」核酸配列は、種々のヌクレオチドを欠
失、挿入または置換する核酸配列を有し、FLEXHTと同一またはFLEXHTの機能的特
徴を少なくとも１つ有するポリペプチドを産出する。この定義に含まれるのは、
FLEXHTをコードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用
いて容易に検出可能或いは検出困難な多型現象と、FLEXHTをコードするポリヌク
レオチド配列のための正常な染色体遺伝子座以外の遺伝子座に占めるような、対
立遺伝子変異体に対する不適切或いは不測のハイブリダイゼーションである。コ
ードされたタンパク質も「変異」し得るものであり、サイレント変化を生ぜしめ
て結果的に機能的に等価なFLEXHTとなるようなアミノ酸残基の欠失、挿入または
置換を含み得る。計画的アミノ酸置換は、FLEXHTの生物学的または免疫学的活性
が保持される限りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び
／または両親媒性特性の類似性に基づき行い得る。例えば、負に帯電したアミノ
酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸があり、正に帯電したアミノ酸にはリジ
ン及びアルギニンがある。親水性値が近似している非荷電極性側鎖を有するアミ
ノ酸には、アスパラギンとグルタミン、セリンとスレオニンがある。親水性値が
近似している非荷電側鎖を有するアミノ酸には、ロイシンとイソロイシンとバリ
ン、グリシンとアラニン、フェニルアラニンとチロシンがある。

【００３０】 「アミノ酸」または「アミノ酸配列」の語は、オリゴペプチド、ペプチド、ポ
リペプチド若しくはタンパク質の配列またはその断片を指し、天然または合成分
子を指す。ここで、「アミノ酸配列」は天然のタンパク質分子のアミノ酸配列を
指すものであり、「アミノ酸配列」及び類似の語は、アミノ酸配列を、列挙した
タンパク質分子に会合する完全な本来のアミノ酸配列に限定しようとするもので
はない。

【００３１】 「増幅」は、核酸配列の追加複製に関連する。増幅は通常、当業者によく知ら
れたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を用いて行う。

【００３２】 「アンタゴニスト」の語は、FLEXHTの生物学的活性を阻害或いは弱める分子を
指す。アンタゴニストとしては、抗体などのタンパク質、核酸、糖質、小分子ま
たはその他の任意の化合物や成分を挙げることができるが、これらはFLEXHTと直
接相互作用することによって、或いはFLEXHTが関与する生物学的経路の構成エレ
メントに作用することによって、FLEXHTの活性を調節する。

【００３３】 「抗体」の語は、無損傷免疫グロブリンやその断片、例えばFa、F(ab')₂ 及びF
v断片を指すが、これらはエピトープの決定基と結合することができる。FLEXHT
ポリペプチドを結合する抗体は、無損傷ポリペプチドを用いるか或いは免疫抗原
として感心のある小ペプチドを含む断片を用いるかして調製することができる。
動物（マウス、ラット、ウサギ等）を免疫化するために用いるポリペプチドまた
はオリゴペプチドは、翻訳または化学合成されたRNAに由来し得るもので、好み
に応じて担体タンパク質に接合することも可能である。通常用いられる担体であ
ってペプチドと化学結合するものは、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン及
びキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）等がある。結合ペプチドは、動物
を免疫化するために用いる。

【００３４】 「抗原決定基」の語は、特定の抗体と接触している分子の領域（即ちエピトー
プ）を指す。タンパク質またはタンパク質断片を用いて宿主動物を免疫化する場
合、タンパク質の多数の領域が、抗原決定基（タンパク質の特定の領域または３
次元構造）に特異結合する抗体の産生を誘導し得る。抗原決定基は、抗体に結合
するための無損傷抗原（即ち免疫応答を誘導するために用いられる免疫原）と競
合し得る。

【００３５】 「アンチセンス」の語は、特定の核酸配列の「センス」鎖と塩基対を形成する
ことが可能な任意の成分を指す。アンチセンス成分には、DNAや、RNAや、ペプチ
ド核酸（PNA）や、ホスホロチオ酸、メチルホスホン酸またはベンジルホスホン
酸等の修飾されたバックボーン連鎖を有するオリゴヌクレオチドや、2'-メトキ
シエチル糖または2'-メトキシエトキシ糖等の修飾された糖類を有するオリゴヌ
クレオチドや、或いは5-メチルシトシン、2-デオキシウラシルまたは7-デアザ-2
'-デオキシグアノシン等の修飾された塩基を有するオリゴヌクレオチドがある。
アンチセンス分子は、化学合成または転写を含む任意の方法で製造することがで
きる。相補的アンチセンス分子は、ひとたび細胞に導入されたら、細胞が形成し
た天然の核酸配列と塩基対を形成し、転写または翻訳を妨害する二重鎖を形成す
る。「負」若しくは「マイナス（−）」の語がアンチセンス鎖を、「正」若しく
は「プラス（＋）」がセンス鎖を指すことがある。

【００３６】 「生物学的に活性」の語は、天然分子の構造的機能、調節機能または生化学的
機能を有するタンパク質を指す。同様に「免疫学的に活性」は、天然、組換えま
たは合成のFLEXHT、或いはその任意のオリゴペプチドの能力であって、適切な動
物または細胞において特定の免疫反応を誘導して特定の抗体と結合し得る能力を
指す。

【００３７】 「相補(的)」または「相補性」の語は、ポリヌクレオチドとポリヌクレオチド
の、塩基対形成による自然結合を指す。例えば、配列「5'A-G-T3'」は、相補配
列「3'T-C-A5'」に結合する。２つの一本鎖分子間の相補性は、幾つかの核酸が
結合しているだけの「部分的」なものであるか、或いは一本鎖分子間に完全な相
補性が存在するような「完全」なものであり得る。核酸鎖間の相補性の程度は、
核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に著しい影響を与える。この
ことは、核酸鎖間の結合に依存する増幅反応において、またペプチド核酸（PNA
）分子の設計及び使用において特に重要である。

【００３８】 「所定のポリヌクレオチド配列からなる成分」及び「所定のアミノ酸配列から
なる成分」は、概して所定のポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列からなる
任意の成分を指す。この成分には、乾燥製剤または水溶液が含まれ得る。FLEXHT
またはFLEXHT断片をコードするポリヌクレオチドからなる成分は、ハイブリダイ
ゼーションプローブとして利用することができる。このプローブは凍結乾燥状態
で保存し得るものであり、糖質等の安定化剤と会合し得る。ハイブリダイゼーシ
ョンにおいては、塩（例えばNaCl）、界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウ
ム；SDS）及びその他の構成エレメント（例えばデンハート液、脱脂粉乳、サケ
の精子のDNA等）を含む水溶液中にプローブを分散させることができる。

【００３９】 「コンセンサス配列」は、不必要な塩基を分離するために再配列し、XL-PCRキ
ット（Perkin-Elmer, Norwalk, CT）を用いて５'方向、３'方向のいずれか一方
向或いは両方向に伸長させ、更に再配列した核酸配列を指す。或いは、断片アセ
ンブルのコンピュータプログラムを用いて、１若しくは数個のIncyteクローンの
、場合によっては１若しくは数個のパブリックドメインESTの、オーバーラップ
した配列から組み立てた核酸配列を指す。コンピュータプログラムの例としては
、GELVIEW断片アセンブルシステム（GCG, Madison WI）が挙げられる。伸長及び
アセンブルの両方を行ってコンセンサス配列を決定する配列もある。

【００４０】 「保存的なアミノ酸置換」は、置換がなされた時に元のタンパク質の特性を殆
ど損なわないような置換、即ちタンパク質の構造と特に機能が保存され、そのよ
うな置換による大きな変化がない置換を指す。下表は、タンパク質中で元のアミ
ノ酸と置換され得るアミノ酸と、保存アミノ酸置換と認められるアミノ酸を示し
ている。 元の残基 保存的な置換 Ala Gly, Set Arg His, Lys Asn Asp, Gln, His Asp Asn, Glu Cys Ala, Ser Gln Asn, Glu, His Glu Asp, Gln, His Gly Ala His Asn, Arg, Gln, Glu Ile Leu, Val Leu Ile, Val Lys Arg, Gln, Glu Met Leu, Ile Phe His, Met, Leu, Trp, Tyr Ser Cys, Thr Thr Ser, Val Trp Phe, Tyr Tyr His, Phe, Trp Val Ile, Leu, Thr 保存アミノ酸置換では通常、（ａ）置換領域におけるポリペプチドのバックボ
ーン構造、例えばβシートやαヘリックス構造、（ｂ）置換部位における分子の
電荷または疎水性、及び／または（ｃ）側鎖の大部分を保持する。

【００４１】 「欠失」は、結果的に１若しくは数個のアミノ酸またはヌクレオチドが失われ
てなくなるようなアミノ酸またはヌクレオチド配列における変化を指す。

【００４２】 「誘導体」の語は、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の化学修飾
を指す。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による
水素の置換は、ポリヌクレオチド配列の化学修飾に含まれ得る。ポリヌクレオチ
ド誘導体は、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも１つは保持し
ているポリペプチドをコードする。ポリペプチド誘導体は、グリコシル化、ポリ
エチレングリコール化（pegylation）、或いは任意の同様なプロセスであって誘
導起源のポリペプチドから少なくとも１つの生物学的若しくは免疫学的機能を保
持しているプロセスによって、修飾されたポリペプチドである。

【００４３】 「検出可能な標識」は、測定可能な信号を生成することができ、ポリヌクレオ
チドまたはポリペプチドに共有結合または非共有結合するようなレポーター分子
または酵素を指す。

【００４４】 「断片」は、FLEXHTまたはFLEXHTをコードするポリヌクレオチドの固有部分で
あって、親配列と同一配列であるが親配列よりも長さが短い配列を指す。断片は
、画定された配列の全長から１ヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さよ
りも短い長さを有し得る。例えば或る断片は、５〜１０００の連続したヌクレオ
チドまたはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子
として、或いはその他の目的のために用いられる断片は、少なくとも５、１０、
１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２５０若
しくは５００の連続したヌクレオチド或いはアミノ酸残基長さであり得る。断片
は、分子の特定領域から優先的に選択し得る。例えば、ポリペプチド断片は、所
定の配列に示すような最初の２５０または５００アミノ酸（またはポリペプチド
の最初の２５％または５０％）から選択された或る長さの連続したアミノ酸を有
し得る。これらの長さは明らかに例として挙げているものであり、本発明の実施
例では、配列表、表及び図面を含む明細書に裏付けされた任意の長さであってよ
い。

【００４５】 配列番号５６乃至１１０の断片には、固有のポリヌクレオチド配列領域が含ま
れる。この領域は、配列番号５６乃至１１０を特異的に同定するものであり、例
えば同一ゲノム中の配列番号５６乃至１１０以外の配列とは異なるものである。
配列番号５６乃至１１０の断片は、例えば、ハイブリダイゼーション及び増幅技
術において、或いは関連するポリヌクレオチド配列から配列番号５６乃至１１０
を区別する類似の方法において有用である。配列番号５６乃至１１０の断片の正
確な長さ及び断片に対応する配列番号５６乃至１１０の領域は、断片に対する意
図した目的に基づき当業者が慣例的に決定することが可能である。

【００４６】 配列番号１乃至５５の断片は、配列番号５６乃至１１０の断片によってコード
される。配列番号１乃至５５の断片には、配列番号１乃至５５を特異的に同定す
る固有のアミノ酸配列領域が含まれている。例えば、配列番号１乃至５５の断片
は、配列番号１乃至５５を特異認識する抗体を産出するための免疫抗原性ペプチ
ドとして有用である。配列番号１乃至５５の断片及び断片に対応する配列番号１
乃至５５の領域の正確な長さは、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣
例的に決定することが可能である。

【００４７】 「完全長」ポリヌクレオチド配列とは、少なくとも１つの翻訳開始コドン（例
えばメチオニン）、オープンリーディングフレーム及び翻訳終止コドンを有する
配列である。「完全長」ポリヌクレオチド配列は、「完全長」ポリペプチド配列
をコードする。

【００４８】 「相同性」の語は、配列類似性即ち２つ以上のポリヌクレオチド配列または２
つ以上のポリペプチド配列の配列間で互換可能な配列同一性である。

【００４９】 ポリヌクレオチド配列に適用される「一致率」または「一致％」の語は、標準
化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされた少なくとも２つ以上のポリ
ヌクレオチド配列間で一致する残基の割合を意味する。このようなアルゴリズム
は、２配列間のアラインメントを最適化するために比較する配列において、標準
化された再現性のある方法でギャップを挿入するので、２つの配列をより有意に
比較できる。

【００５０】 ポリヌクレオチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメ
ントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトパ
ラメータを用いて決定できる。このプログラムはLASERGENEソフトウェアパッケ
ージの一部であり、一式の分子生物学分析プログラム（DNASTAR, Madison WI）
である。CLUSTAL Vについては、Higgins, D.G. and P.M. Sharp (1989) CABIOS
5:151-153及びHiggins, D.G. ら (1992) CABIOS 8:189-191の文献に記載されて
いる。ポリヌクレオチド配列の対をなすアラインメントの場合、デフォルトパラ
メータは、Ktuple=2、gap penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定
する。デフォルトとして「重みづけされた」残基の重みづけ表を選択する。CLUS
TAL Vは、アラインメントされたポリヌクレオチド配列対間の「類似率」として
一致率を報告する。

【００５１】 或いは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）のBasic Local Al
ignment Search Tool（BLAST）が一般的に用いられ、且つ、無料で入手可能な配
列比較アルゴリズム一式を提供している（Altschul, S.F. ら (1990) J. Mol. B
iol. 215:403-410）。このアルゴリズムは、幾つかの情報源から入手可能であり
、メリーランド州ベセスダにあるNCBI及びインターネット（http://www.ncbi.nl
m.nih.gov/BLAST/）からも入手可能である。BLASTソフトウェア一式には様々な
配列分析プログラムが含まれており、既知のポリヌクレオチド配列を種々のデー
タベースから得た別のポリヌクレオチド配列とアラインメントする「blastn」も
その１つである。その他にも、２つのヌクレオチド配列を対で直接比較するため
に用いる「BLAST 2 Sequences」と称されるツールも利用可能である。「BLAST 2
Sequences」は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlにアクセスして
対話形式で利用することが可能である。「BLAST 2 Sequences」ツールは、blast
n と blastp（後述）の両方に用いることができる。BLASTプログラムは、一般的
には、ギャップ及びデフォルト設定に設定された他のパラメータと共に用いる。
例えば、２つのヌクレオチド配列を比較するために、デフォルトパラメータとし
て設定された「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用
いてblastnを実行してもよい。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。 Matrix: BLOSUM62 Reward for match: 1 Penalty for mismatch: −2 Open Gap: 5 及び Extension Gap: 2 penalties Gap x drop-off: 50 Expect: 10 Word Size: 11 Filter: on 一致率は、完全に画定された（例えば特定の配列番号で画定された）配列長さ
と比較して測定し得る。或いは、より短い長さ、例えばより大きな画定された配
列から得られた断片（例えば少なくとも２０、３０、４０、５０、７０、１００
または２００の連続したヌクレオチドの断片）の長さと比較して一致率を測定し
てもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列リ
ストを含めた本明細書に記載された配列に裏付けられた任意の配列長さの断片を
用いて、一致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。

【００５２】 高度の相同性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝子コードの縮重
が原因で類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸
配列内で変化を生じさせて、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコード
するような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。

【００５３】 ポリペプチド配列に適用される「一致率」または「一致％」の語は、標準化さ
れたアルゴリズムを用いてアラインメントされた少なくとも２以上のポリペプチ
ド配列間で一致する残基の割合を意味する。ポリペプチド配列アラインメントの
方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント方法もある。
既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の酸性度及び疎水性を保存
するので、ポリペプチドの構造を（従って機能も）保存する。

【００５４】 ポリペプチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメント
プログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラ
メータを用いて決定できる（既に説明したのでそれを参照されたい）。CLUSTAL
Vを用いて、ポリぺプチド配列を２つ１組でアラインメントする際のデフォルト
パラメータは、Ktuple=1、gap penalty=3、window=5、「diagonals saved」=5と
設定する。デフォルトの残基重み付け表としてPAM250マトリクスを選択する。ポ
リヌクレオチドアラインメントと同様に、CLUSTAL Vは、アラインメントされた
ポリペプチド配列対間の「類似率」として一致率を報告する。

【００５５】 或いは、NCBI BLASTソフトウェア一式を用いてもよい。例えばポリペプチド配
列を２つ１組で比較をする場合、デフォルトパラメータとして設定されたblastp
と共に「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を使用して
もよい。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。 Matrix: BLOSUM62 Open Gap: 11 及び Extension Gap: 1 penalties Gap x drop-off: 50 Expect: 10 Word Size: 3 Filter: on 一致率は、完全に画定された（例えば特定の配列番号で画定された）ポリペプ
チド配列の長さと比較して測定し得る。一致率は、配列或いは、より短い長さ、
例えばより大きな画定されたポリペプチド配列から得られた断片（例えば少なく
とも１５、２０、３０、４０、５０、７０または１５０の連続した残基の断片）
の長さと比較して一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的な
ものに過ぎず、表、図及び配列リストを含めた本明細書に記載された配列に裏付
けられた任意の配列長さの断片を用いて、或る長さであってその長さに対して一
致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。

【００５６】 「ヒト人工染色体」（HAC）は直鎖状の小染色体であり、６kb〜１０Mbのサイ
ズのDNA配列を含み、安定した有糸分裂染色体の分離及び維持に必要な全てのエ
レメントが含まれている。

【００５７】 「ヒト化抗体」の語は、非抗体結合領域におけるアミノ酸配列はヒト抗体によ
り近づくように変異させた抗体分子であって、本来の結合能力はそのまま保持し
ているような抗体分子を指す。

【００５８】 「ハイブリダイゼーション」は、所定のハイブリダイゼーション条件下で塩基
対を形成することによって、一本鎖ポリヌクレオチドが相補的鎖とアニーリング
するプロセスを指す。特異的ハイブリダイゼーションは、２つの核酸配列が高い
相同性を共有することを示すものである。特異的ハイブリダイゼーション複合体
は許容されるアニーリング条件下で形成され、「洗浄」ステップ後もハイブリダ
イズされたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのス
トリンジェンシーを決定する際に特に重要であり、更にストリンジェントな条件
では、非特異結合（即ち完全には一致しない核酸鎖間の対の結合）が減少する。
核酸配列のアニーリングに対する許容条件は、当業者が慣例的に決定する。許容
条件はハイブリダイゼーション実験の間は一定でよいが、洗浄条件は所望のスト
リンジェンシーを得るように、従ってハイブリダイゼーション特異性も得るよう
に実験中に変更することができる。アニーリング許容条件は、例えば約６×SSC
、約１％（w/v）のSDS及び約１００μg/mlの変性サケ精子DNAの存在下で温度６
８℃において成立する。

【００５９】 一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは或る程度、洗浄ステ
ップを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通常
、所定のイオン強度及びpHにおける特異配列の融点（Tm）より約５〜２０℃低く
なるように選択する。このTmは、所定のイオン強度及びpHの下で、完全に一致す
るプローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。Tmを計算する
式及び核酸のハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Sambrook ら (1
989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring H
arbor Press, Plainview NYに記載されており、特に2巻の9章を参照されたい。

【００６０】 本発明の、ポリヌクレオチドとポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションに
対する高ストリンジェンシー条件には、約０.２×SSC及び約１％のSDS存在下で
約６８℃において１時間の洗浄条件が含まれる。或いは、６５℃、６０℃、５５
℃または４２℃の温度で行ってもよい。SSC濃度は、約０.１％のSDS存在下で、
約０.１〜２×SSCの範囲で変化し得る。通常は、遮断剤を用いて非特異ハイブリ
ダイゼーションを阻止する。このような遮断剤には、例えば、約１００〜２００
μg/mlの変性サケ精子DNAがある。特定条件下で、例えばRNAとDNAのハイブリダ
イゼーションに有機溶剤、例えば約３５〜５０％v/vの濃度のホルムアミドを用
いることもできる。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろ
う。ハイブリダイゼーションは、特に高ストリンジェント条件下では、ヌクレオ
チド間の進化的な類似性を示唆し得る。このような類似性は、ヌクレオチド及び
ヌクレオチドにコードされるポリペプチドに対する類似の役割を強く示唆してい
る。

【００６１】 「ハイブリダイゼーション複合体」の語は、相補的塩基対間の水素結合の形成
力によって２つの核酸配列間に形成された複合体を指す。ハイブリダイゼーショ
ン複合体は、溶解状態で形成し得る（C₀tまたはR₀t解析等）。或いは、一方の核
酸配列が溶解状態で存在し、もう一方の核酸配列が固体支持体（例えば紙、膜、
フィルタ、チップ、ピンまたはガラススライド、或いは他の適切な基質であって
細胞若しくはその核酸が固定される基質）に固定されているような２つの核酸配
列間に形成され得る。

【００６２】 「挿入」及び「付加」の語は、１若しくは数個のアミノ酸残基またはヌクレオ
チド配列を各々付加するようなアミノ酸またはヌクレオチド配列における変化を
指す。

【００６３】 「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、伝染性疾患または遺伝性疾患に関
連する症状を指し得る。これらの症状は、細胞及び全身の防御系に作用し得る種
々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現
によって特徴づけることができる。

【００６４】 「免疫抗原性断片」とは、哺乳動物等の生命体に導入されると免疫応答を誘発
し得るようなFLEXHTのポリペプチドまたはオリゴペプチド断片である。「免疫抗
原性断片」の語には、本明細書中で開示したような或いは当分野で既知であるよ
うな任意の抗体産出方法において有用なFLEXHTの任意のポリペプチドまたはオリ
ゴペプチド断片も含まれる。

【００６５】 「マイクロアレイ」の語は、基質上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチド
またはその他の化合物の構成を指す。

【００６６】 「エレメント」または「アレイエレメント」の語は、マイクロアレイの環境に
おいて、基質の表面上に配置されたハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドを指
す。

【００６７】 「調節(する)」の語は、FLEXHTの活性の変化を指す。調節することによって例
えば、FLEXHTのタンパク質活性、結合特性その他の生物学的、機能的または免疫
学的特性が増大または低下し得る。

【００６８】 「核酸」及び「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリ
ヌクレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」及び「核酸配列」の語は、ゲ
ノム起源または合成起源のDNAまたはRNAであって一本鎖または二本鎖であるか或
いはセンス鎖またはアンチセンス鎖を表し得るようなDNAまたはRNAや、ペプチド
核酸（PNA）や、任意のDNA様またはRNA様物質を指すこともある。

【００６９】 「機能的に結合した」は、第１核酸配列が第２核酸配列と機能的な関係がある
ように配置された状態を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または
発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に結
合している。同一のリーディングフレーム内で２つのタンパク質コード領域を結
合する必要がある場合、一般に、機能的に結合したDNA配列は非常に近接するか
、或いは連続し得る。

【００７０】 「ペプチド核酸」（PNA）は、アンチセンス分子または抗遺伝子物質であって
、リジンを末端とするアミノ酸残基のペプチドバックボーンに結合した、少なく
とも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドからなるものを指す。末端の
リジンは、成分に溶解性を与える。PNAは、相補的一本鎖DNAまたはRNAに優先的
に結合して転写の拡張を停止するものであり、ポリエチレングリコール化して細
胞におけるPNAの寿命を延長し得る。

【００７１】 FLEXHTの「翻訳後修飾」は、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、
ラセミ化、タンパク分解性分割及びその他の当分野で既知の修飾を含み得る。こ
れらのプロセスは、合成的または生化学的に発生し得る。生化学的修飾は、FLEX
HTの酵素環境に依存し、細胞タイプによって変化し得る。

【００７２】 「プローブ」は、FLEXHT、FLEXHTの相補配列またはこれらの断片をコードする
核酸配列を指し、同一核酸配列、対立遺伝子核酸配列または関連する核酸配列の
検出に用いられる。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌク
レオチドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に結合したものである
。典型的な標識には、放射性アイソトープ、リガンド、化学発光試薬及び酵素が
ある。

【００７３】 「プライマー」は、短い核酸、通常はDNAオリゴヌクレオチドであり、相補的
塩基対を形成することで標的ポリヌクレオチドにアニーリングされ得る。プライ
マーは次に、DNAポリメラーゼ酵素によって標的DNA鎖に延在し得る。プライマー
対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による核酸配列の増幅（及び同定）
に用い得る。

【００７４】 本発明に用いるようなプローブ及びプライマーは通常、既知の配列の少なくと
も１５の連続したヌクレオチドを含んでいる。特異性を高めるために長めのプロ
ーブ及びプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも２０、２５、３０、
４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または１５０の連続したヌクレオ
チドからなるようなプローブ及びプライマーを用いてもよい。これよりもかなり
長いプローブ及びプライマーもある。表、図面及び配列リストを含む本明細書に
裏付けされた任意の長さのヌクレオチドを用いることができるものと理解された
い。

【００７５】 プローブ及びプライマーの調製及び使用方法については、Sambrook, J. ら (1
989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring H
arbor Press, Plainview NY、Ausubel, F.M. ら, (1987) Current Protocols in Molecular Biology , Greene Pubi. Assoc. & Wiley-Intersciences, New York
NY、Innisら (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications Ac
ademic Press, San Diego CA等を参照されたい。PCRプライマー対は、その目的
のためのコンピュータプログラム、例えばPrimer（Version 0.5, 1991, Whitehe
ad Institute for Biomedical Research, Cambridge MA）を用いるなどして既知
の配列から得ることができる。

【００７６】 プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のため
に当分野でよく知られているソフトウェアを用いて行う。例えばOLIGO 4.06ソフ
トウェアは、各１００ヌクレオチドまでのPCRプライマー対の選択に有用であり
、オリゴヌクレオチド及び最大５,０００までの大きめのポリヌクレオチドであ
って３２キロベースまでのインプットポリヌクレオチド配列から得たものを分析
するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力のため
の追加機能が組込まれている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム（テキ
サス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから一般
向けに入手可能）は、メガベース配列から特定のプライマーを選択することが可
能であり、従ってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である。Pr
imer3プライマー選択プログラム（マサチューセッツ州ケンブリッジのWhitehead
Institute／MITゲノム研究センターから一般向けに入手可能）ではユーザーが
「ミスプライミング・ライブラリ」をインプットすることができ、ここでプライ
マー結合部位として避けたい配列はユーザーが指定する。Primer3は特に、マイ
クロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である。（後二者のプライ
マー選択プログラムのソースコードは、各自のソースから得てユーザー固有のニ
ーズを満たすように変更してもよい。）PrimerGenプログラム（英国ケンブリッ
ジ市の英国ヒトゲノムマッピングプロジェクト-リソースセンターから一般向け
に入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し、そ
れによって、アラインメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存領域
の何れかとハイブリダイズするようなプライマーの選択を可能にする。従って、
このプログラムは、固有であって保存されたオリゴヌクレオチド及びポリヌクレ
オチドの断片の同定に有用である。上記選択方法のいずれかによって同定したオ
リゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片は、ハイブリダイゼーション技術
において、例えばPCRまたはシークエンシングプライマーとして、マイクロアレ
イエレメントとして、或いは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポ
リヌクレオチドを同定する特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチド
の選択方法は、上記の方法に限定されるものではない。

【００７７】 「組換え核酸」は天然配列ではない配列であるか或いは人為的に組み合わせな
ければ離隔しているような配列の２以上のセグメントを人為的に組み合わせて産
出した配列を有する配列である。この人為的組合せはしばしば化学合成によって
達成するが、より一般的には核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例え
ばのSambrookらの文献（前出）に記載されているような遺伝子工学的手法によっ
て達成する。組換え核酸の語は、単に核酸の一部を付加、置換または欠失した変
異核酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモーター配列に機能的に結合した
核酸配列が含まれる。このような組換え核酸は、ベクターの不可欠なエレメント
であって例えばある細胞を形質転換するために用いられるようなものであり得る
。

【００７８】 或いはこのような組換え核酸は、ウイルスベクターの不可欠なエレメントであ
って例えばワクシニアウイルスに基づくものであり得る。ワクシニアウイルスは
組換え核酸が発現する哺乳動物のワクチン接種に用いるもので、哺乳動物の防御
免疫応答を誘導する。

【００７９】 「調節エレメント」は、通常は遺伝子の未翻訳領域に由来する核酸配列であり
、エンハンサー、プロモーター、イントロン及び５'及び３'の未翻訳領域（UTR
）を含む。調節エレメントは、転写、翻訳またはRNA安定性を調節する宿主また
はウイルスタンパク質と相互作用する。

【００８０】 「レポーター分子」とは、核酸、アミノ酸または抗体を標識するのに用いられ
る化学的または生化学的成分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、
蛍光剤、化学発光剤、発色剤、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子及びそ
の他の当分野で既知の成分がある。

【００８１】 DNA配列に関する「RNA等価物」は、発生した窒素塩基チミンが全てウラシルに
置換されていることと、糖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボース
から構成されていることを除いて、参照DNA配列と同一のヌクレオチド線形配列
から構成されている。

【００８２】 「サンプル」の語は、その最も広い意味で用いられる。FLEXHTをコードする核
酸若しくはその断片、またはFLEXHT自体を含む疑いのあるサンプルは、体液や、
細胞から単離された細胞、染色体、細胞小器官または膜からの抽出物や、細胞や
、溶解しているか基質に結合しているゲノムDNA、RNAまたはcDNAや、組織や、組
織プリント等から構成され得る。

【００８３】 「特異結合」または「特異的に結合する」の語は、タンパク質またはペプチド
と、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、任意の天然成分または合成結
合成分との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造（例
えば抗原決定基即ちエピトープ）であって結合分子が認識するものが存在するか
否かに依存していることを意味している。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対
して特異的である場合、標識された遊離したＡ及びその抗体を含む反応において
、エピトープＡ（つまり遊離し、標識されていないＡ）を含むポリヌクレオチド
の存在が、抗体に結合している標識されたＡの量を低減させる。

【００８４】 「実質上精製された」の語は、自然環境から取り除かれ、或いは単離または分
離された核酸またはアミノ酸配列であって、自然に会合するその他の構成エレメ
ントの少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましいのは
少なくとも約９０％が遊離しているものを指す。

【００８５】 「置換」は、１若しくは数個のアミノ酸またはヌクレオチドを各々別のアミノ
酸またはヌクレオチドに置換することを意味する。

【００８６】 「基質」は、任意の好適な固体または半固体の支持体を指すものであって、膜
、フィルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁性非磁性ビーズ、ゲ
ル、管、プレート、ポリマー、微細粒子、毛管が含まれる。基質は、壁、溝、ピ
ン、チャネル、孔等、様々な表面形態を有することができ、基質表面にはポリヌ
クレオチドやポリペプチドが結合する。

【００８７】 「転写イメージ」は、所与の時間、条件での固有の細胞タイプまたは組織によ
る遺伝子発現の集合的パターンを指す。

【００８８】 「形質転換」は、外来性のDNAが宿主細胞に入り込み、宿主細胞を変化させる
プロセスを表す。形質転換は、当分野で知られている種々の方法に従って自然条
件または人工条件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核または真核
宿主細胞に挿入する任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形質転
換する宿主細胞の種類によって選択する。限定するものではないが形質転換方法
には、ウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、熱ショック、リ
ポフェクション及び微粒子銃を用いる方法がある。「形質転換された」細胞の語
には、限られた時間内に挿入されたDNAやRNAを発現するような一時的に形質転換
された細胞のみならず、安定的に形質転換された細胞であってその中に挿入され
たDNAが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主の染色体の一部として複
製可能であるものも含まれる。

【００８９】 ここで用いる「遺伝形質転換体」とは任意の有機体であり、限定するものでは
ないが動植物を含み、有機体の１若しくは数個の細胞が、ヒトの関与によって、
例えば当分野でよく知られている形質転換技術によって導入された異種核酸を有
する。核酸の細胞への導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導入する
ことによって、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によって或いは
組換えウイルスの導入によって行う。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育種或い
はin vitro受精を指すものではなく、組換えDNA分子の導入を指すものである。
本発明に基づいて予期される遺伝形質転換体には、バクテリア、シアノバクテリ
ア、真菌及び動植物がある。本発明の単離されたDNAは、当分野で知られている
方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合によって宿主に導入
することができる。本発明のDNAをこのような有機体に移入する技術はよく知ら
れており、前出のSambrook ら (1989) 等の参考文献に与えられている。

【００９０】 特定の核酸配列の「変異体」は、核酸配列１本全部の長さに対して特定の核酸
配列と少なくとも４０％の相同性を有する核酸配列であると定義する。その際、
デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（
1999年5月7日）を用いてblastnを実行する。このような核酸対は、所定の長さに
対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、
９５％、９８％またはそれ以上の相同性を示し得る。或る変異体は、例えば「対
立遺伝子」変異体（前述）、「スプライス」変異体、「種」変異体または「多形
性」変異体として説明し得る。スプライス変異体は参照分子とかなりの相同性を
有し得るが、mRNAプロセッシング中のエキソンの交互スプライシングによって通
常多数の或いは僅かな数のポリヌクレオチドを有することになる。対応するポリ
ペプチドは、追加機能ドメインを有するか或いは参照分子に存在するドメインが
欠落していることがある。種変異体は、種相互に異なるポリヌクレオチド配列で
ある。結果的に生じるポリペプチドは通常、相互にかなりのアミノ酸相同性を有
する。多形性変異体は、与えられた種の個体間で特定の遺伝子のポリヌクレオチ
ド配列が異なる。また、多形性変異体は、１つのヌクレオチド塩基によってポリ
ヌクレオチド配列が変化する「単一ヌクレオチド多形性」（SNP）を含み得る。S
NPの存在は、例えば特定の個体群、病状または病状性向を示し得る。

【００９１】 特定のポリペプチド配列の「変異体」は、ポリペプチド配列の１本の長さ全体
で特定のポリペプチド配列に対して少なくとも４０％の相同性を有するポリペプ
チド配列として画定される。ここで、デフォルトパラメータに設定した「BLAST
2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastpを実行する
。このようなポリペプチド対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％
、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれ以上の
相同性を示し得る。

【００９２】 発明 本発明は、新規なヒト組織に発現する完全長分子（FLEXHT）、FLEXHTをコード
するポリヌクレオチド、並びに、ヒト遺伝子発現、遺伝連鎖及び遺伝変異性の分
析及び診断、治療並びに予防にこれらの配列を利用する方法の発見に基づくもの
である。

【００９３】 表１は、FLEXHTをコードする完全長のヌクレオチド配列の構築に用いたIncyte
クローンを示す。列１及び列２は、ポリペプチド及びポリヌクレオチドの配列番
号（SEQ ID NO）を各々示している。列３はIncyteクローンのクローンIDを示し
ており、各FLEXHTをコードする核酸はここで同定されたものである。列４はcDNA
ライブラリを示しており、列３のクローンはここから単離したものである。列５
は、Incyteクローン及びこれに対応するcDNAライブラリを示している。cDNAライ
ブラリが示されていないIncyteクローンは、プールされているcDNAライブラリか
ら得られたものである。列５のIncyteクローンを用いて各FLEXHTのコンセンサス
ヌクレオチド配列を構築した。列５のIncyteクローンは、ハイブリダイゼーショ
ン技術における断片として有用である。

【００９４】 表２の列は、本発明の各ポリペプチドの様々な特性を示している。列１は配列
番号（SEQ ID NO）を、列２は各ポリペプチド中のアミノ酸残基の数を、列３は
潜在的リン酸化部位を、列４は潜在的グリコシル化部位をを示している。

【００９５】 表３の列は、組織特異性と、FLEXHTをコードするヌクレオチド配列に関係があ
る疾患、障害または症状とを示している。表３の列１はヌクレオチドの配列番号
を、列２は列１のヌクレオチド配列の断片を示している。これらの断片は、例え
ば配列番号５６乃至１１０を同定し、配列番号５６乃至１１０と関連するポリヌ
クレオチド配列を区別するためのハイブリダイゼーションまたは増幅の技術にお
いて有用である。配列番号５６、配列番号５８乃至６９、配列番号７１乃至７２
、配列番号７４乃至７６、配列番号７９乃至８５、配列番号８７、配列番号９０
乃至９８、配列番号１００乃至１０３及び配列番号１０５乃至１１０の指示断片
によりコードされるポリヌクレオチドは、例えば免疫抗原性ペプチドとして有用
である。列３は、FLEXHTを発現する組織カテゴリーを組織全体に対するFLEXHT発
現割合として示している。列４は、FLEXHTを発現する組織に関連する疾患、障害
または症状を、FLEXHTを発現する組織全体に対する割合として示している。列５
は、各cDNAライブラリをサブクローニングするために用いたベクターを示してい
る。

【００９６】 表４の列では、cDNAライブラリの作製に用いた組織の説明を示している。FLEX
HTをコードするcDNAのクローンはcDNAライブラリから単離したものである。列１
は、ヌクレオチドの配列番号を、列２はクローン単離元であるcDNAライブラリを
、列３は列２のcDNAライブラリに関連する組織の起源その他の書誌的情報を示し
ている。

【００９７】 表５の列では、本発明のポリペプチドの様々な特性を示している。列１は配列
番号（SEQ ID NO）を、列２はポリペプチドの同一性を関連する引用文献と共に
示している。引用文献は全て、そのまま引用を以って本発明の一部となす。列３
はサイン（signature）配列、ドメイン、モチーフ、及びBLAST分析によって同定
された相同配列を有するアミノ酸残基を、列４は分析方法と場合によってはその
分析方法が利用できる検索可能なデータベースを示している。列４の方法を用い
て、配列相同性及びタンパク質モチーフを介して各ポリペプチドの特徴付けを行
った。

【００９８】 本発明には、配列表に開示されている核酸配列と、FLEXHT遺伝子の変異発現ま
たはFLEXHTタンパク質機能の欠失に特徴付けられる疾病状態の診断及び治療にお
けるこれらの配列の使用が含まれる。本発明は更に、これらの配列をハイブリダ
イゼーション及び増幅技術に利用し、特に、特定の細胞または組織に相関する遺
伝子発現パターン及び医薬品、毒及びその他の処置に対するin vivoまたはin vi tro 反応を包括的に算出する技術に利用する。この方法では、本発明の配列を用
いて特定の細胞または組織に対する転写イメージを発生させる。

【００９９】 本発明には、FLEXHTの変異体も含まれる。好適なFLEXHTの変異体のアミノ酸配
列は、FLEXHTアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、または約９５％も
の相同性を有し、FLEXHTの機能的若しくは構造的特徴を少なくとも１つ有するよ
うな変異体である。

【０１００】 本発明には、FLEXHTをコードするポリヌクレオチドも含まれる。或る例では、
FLEXHTをコードする配列番号５６乃至１１０からなる群から選択された配列を有
するポリヌクレオチド配列が本発明に含まれている。配列番号５６乃至１１０の
ポリヌクレオチド配列は、配列表に示されているように等価RNA配列と同等の価
値を有しているが、窒素塩基チミンの出現はウラシルに置換され、糖のバックボ
ーンはデオキシリボースではなくシリボースから構成されている。

【０１０１】 本発明には、FLEXHTをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列も含まれる
。具体的には、そのようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、FLEXHTをコード
するポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、約８５％、または約９５％の
相同性を有する。本発明の或る実施態様では、配列番号５６乃至１１０からなる
群から選択されたアミノ酸配列と少なくとも約７０％、約８５％、または約９０
％の相同性を有するような配列番号５６乃至１１０からなる群から選択された配
列を有するポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。上記の任意のポリヌクレオ
チドの変異体は、FLEXHTの機能的若しくは構造的特徴を少なくとも１つ有するア
ミノ酸配列をコードし得る。

【０１０２】 当業者であれば、遺伝暗号の縮重の結果、FLEXHTをコードする多数のポリヌク
レオチド配列（既知の遺伝子または天然の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最低
限の類似性しか有しないポリヌクレオチド配列もある）を産出し得ることは理解
できよう。したがって本発明には、可能コドン選択に基づく組合せの選択によっ
て産出し得るようなありとあらゆる可能性のあるポリヌクレオチド配列変異体を
網羅し得る。これらの組合せは、天然のFLEXHTのポリヌクレオチド配列に適用さ
れるような標準トリプレット遺伝暗号を基に作られるものであり、このような変
異は全て明確に開示されているものと考えられる。

【０１０３】 FLEXHT及びその変異体をコードするヌクレオチド配列は通常、好適に選択され
たストリンジェントな条件下で天然のFLEXHTのヌクレオチド配列とハイブリダイ
ズ可能であるが、FLEXHTまたはその誘導体であって実質上異なるコドンの使用法
があるもの、例えば天然に存在しないコドンの封入があるものをコードするヌク
レオチド配列を作り出すことは有益であろう。宿主が特定のコドンを利用する頻
度に基づいて、特定の真核又は原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるよ
うにコドンを選択することが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えるこ
となくFLEXHT及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質上変更する別
の理由には、天然の配列から作製される転写物より好ましい、例えば半減期が長
いなどの特性を有するRNA転写物の作製がある。

【０１０４】 本発明には、FLEXHT、FLEXHT誘導体及びこれらの断片をコードするDNA配列又
はそれらの断片を完全に合成化学によって作製することも含まれる。作製後、当
分野でよく知られている試薬を用いて、この合成配列を任意の様々な入手可能な
発現ベクター及び細胞系中に挿入し得る。更に、合成化学を用いてFLEXHTまたは
その任意の断片をコードする配列に突然変異を誘導し得る。

【０１０５】 ハイブリダイゼーション 更に本発明には、種々のストリンジェントな条件下で、請求項に記載のポリヌ
クレオチド配列、特に配列番号５６乃至１１０で示される配列及びそれらの断片
にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列も含まれる（Wahl, G.M. and S.L
. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399-407、Kimmel. A.R. (1987) Method
s Enzymol. 152:507-511.等を参照）。例えば、ストリンジェントな塩濃度は、
通常NaCl約７５０mM以下且つクエン酸三ナトリウム約７５mM以下、好適にはNaCl
約５００mM以下且つクエン酸三ナトリウム約５０mM以下、最も好適にはNaCl約２
５０mM以下且つクエン酸三ナトリウム約２５mM以下となる。低ストリンジェンシ
ーハイブリダイゼーションは、ホルムアミド等の有機溶媒の不存在下で得ること
ができ、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、少なくとも約３５％
のホルムアミド、最も好適には約５０％のホルムアミドの存在下で得ることがで
きる。ストリンジェントな温度条件は、通常少なくとも約３０℃、より好適には
少なくとも約３７℃、最も好適には少なくとも約４２℃となる。ハイブリダイゼ
ーション時間等の追加パラメータ、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）等の洗浄剤
の濃度及びキャリアDNAの封入または排除を変化させることは、当業者に公知で
ある。必要に応じてこれら諸条件を組み合わせて種々のストリンジェンシーのレ
ベルを達成する。或る好適実施例では、温度３０℃、NaCl ７５０mM、クエン酸
三ナトリウム７５mM、SDS１％でハイブリダイゼーションが発生することになる
。より好適な実施例では、温度３７℃、NaCl ５００mM、クエン酸三ナトリウム
５０mM、SDS１％、ホルムアミド３５％、変性サケ精子DNA（ssDNA）１００μg/m
lでハイブリダイゼーションが発生することになる。最も好適な実施例では、温
度４２℃、NaCl ２５０mM、クエン酸三ナトリウム２５mM、SDS１％、ホルムアミ
ド５０％、ssDNA２００μg/mlでハイブリダイゼーションが発生することになる
。当業者であれば、これら諸条件における有用な偏差を容易に理解できよう。

【０１０６】 ハイブリダイゼーションに続く洗浄ステップもまた、ストリンジェンシーにお
いて変化し得る。洗浄ストリンジェンシー条件は、塩濃度及び温度により画定し
得る。上記のように、塩濃度の低減または温度の上昇により洗浄ストリンジェン
シーを増加させ得る。例えば、洗浄ステップに対するストリンジェントな塩濃度
は、好適にはNaCl約３０mM以下且つクエン酸三ナトリウム約３mM以下、最も好適
にはNaCl約１５mM以下且つクエン酸三ナトリウム約１.５mM以下となる。洗浄ス
テップに対するストリンジェントな温度条件は、少なくとも約２５℃、より好適
には少なくとも約４２℃、最も好適には少なくとも約６８℃となる。或る好適実
施例では、温度２５℃、NaCl ３０mM、クエン酸三ナトリウム３mM、SDS０.１％
で洗浄ステップが発生することになる。より好適な実施例では、温度４２℃、Na
Cl １５mM、クエン酸三ナトリウム１.５mM、SDS０．１％で洗浄ステップが発生
することになる。最も好適な実施例では、温度６８℃、NaCl １５mM、クエン酸
三ナトリウム１.５mM、SDS０.１％で洗浄ステップが発生することになる。当業
者であれば、これら諸条件における有用な偏差を容易に理解できよう。ハイブリ
ダイゼーション条件は、アニーリング条件及び洗浄条件を含めて「定義」に記載
した。

【０１０７】 DNAシークエンシング DNAシークエンシングの方法は当分野でよく知られており、本発明の何れの実
施例もDNAシークエンシング方法を用いて実施可能である。DNAシークエンシング
方法には酵素を用いることができ、例えばDNAポリメラーゼIのクレノウ断片、SE
QUENASE（US Biochemical, Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Perkin Elmer）
、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham, Pharmacia Biotech, Piscataway NJ）を
用いることができる。或いは、例えばELONGASE増幅システム（Life Technologie
s, Gaithersburg MD）において見られるように、ポリメラーゼと校正エキソヌク
レアーゼを併用することができる。好適には、MICROLAB2200液体転移システム（
Hamilton, Reno, NV）、PTC200サーマルサイクラー（MJ Research, Watertown M
A）及びABI CATALYST 800サーマルサイクラー（Perkin-Elmer）等の装置を用い
て配列の準備を自動化する。次に、ABI 373 或いは 377 DNAシークエンシングシ
ステム（Perkin-Elmer）、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Molec
ular Dynamics, Sunnyvale CA）または当分野でよく知られている他の方法を用
いてシークエンシングを行う。結果として得られた配列を当分野でよく知られて
いる種々のアルゴリズムを用いて分析する。（Ausubel, F.M. (1997) Short Pro tocols in Molecular Biology , John Wiley & Sons, New York NY, unit 7.7、M
eyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New Y
ork NY, pp. 856-853.等を参照）。

【０１０８】 FLEXHTをコードする核酸配列を、部分的ヌクレオチド配列を利用し且つ当分野
でよく知られているPCR法をベースにした種々の方法を用いて伸長させ、プロモ
ーター及び調節要素等の上流配列を検出することができる。例えば、使用し得る
方法の１つである制限部位PCR法は、ユニバーサルプライマー及びネステッドプ
ライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムDNAから未知の配列を増幅す
る方法である（Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic 2:318-322等を参照）。
別の方法に逆PCR法があり、これは広範な方向に伸長させたプライマーを用いて
環状化した鋳型から未知の配列を増幅する方法である。鋳型は、既知のゲノム遺
伝子座及びその周辺の配列からなる制限断片から得る（Triglia, T.ら (1988) N
ucleic Acids Res 16:8186等を参照）。第３の方法としてキャプチャPCR法があ
り、これはヒト及び酵母菌人工染色体DNAの既知の配列に隣接するDNA断片をPCR
増幅する方法に関与している。（Lagerstrom, M.ら(1991) PCR Methods Applic
1:111-119等を参照。）この方法では、PCRを行う前に多重制限酵素の消化及び連
結反応を用いて未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入することが可能であ
る。また、未知の配列を検索するために用い得る別の方法については当分野で知
られている。（Parker, J.D.ら (1991) Nucleic Acids Res. 19:3055-3060等を
参照）。更に、PCR、ネステッドプライマー及びPromoterFinderイブラリ（Clont
ech, Palo Alto CA）を用いてゲノムDNAをウォーキングすることができる。この
手順は、ライブラリをスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接
合部を見付けるのに有用である。全てのPCRベースの方法に対して、市販されて
いるソフトウェア、例えばOLIGO 4.06プライマー分析ソフトウェア（National B
iosciences, Plymouth MN）或いは別の好適なプログラムを用いて、長さが約２
２〜３０ヌクレオチド、GC含有率が約５０％以上、温度約６８℃〜７２℃で鋳型
に対してアニーリングするようにプライマーを設計し得る。

【０１０９】 完全長cDNAをスクリーニングする際は、より大きなcDNAを含むようにサイズ選
択されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、ランダムに初回抗原刺激を受
けたライブラリは、しばしば遺伝子の５'領域を有する配列を含み、オリゴd(T)
ライブラリが完全長cDNAを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブ
ラリは、５'非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。

【０１１０】 市販されているキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングま
たはPCR産物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認することが
できる。具体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動による分離の
ための流動性ポリマーと、４つの異なるヌクレオチドに特異的であるような、レ
ーザで活性化される蛍光色素と、放出された波長の検出に利用するCCDカメラと
を有し得る。出力／光の強度は、適切なソフトウェア（Perkin-Elmer社のGENOTY
PER、SEQUENCE NAVIGATOR等）を用いて電気信号に変換し得る。サンプルのロー
ドからコンピュータ分析及び電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制
御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しな
いようなDNA小断片のシークエンシングに特に適している。

【０１１１】 cDNA発現 本発明の別の実施例では、FLEXHTをコードするポリヌクレオチド配列またはそ
の断片を、適切な宿主細胞内でFLEXHT、FLEXHTの断片またはその機能的等価物を
発現させるような組換えDNA分子内でクローニングし得る。遺伝暗号固有の宿重
に起因して、実質的同一或いは機能的等価のアミノ酸配列をコードするような別
のDNA配列を作製してFLEXHTの発現に利用し得る。

【０１１２】 種々の目的でFLEXHTがコードする配列を変えるために、本発明のヌクレオチド
配列を当分野で通常知られている方法を用いて組み換えることができる。ここで
目的には、限定するものではないが遺伝子産物のクローニング、プロセッシング
、発現の調節がある。遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのランダムなフラ
グメンテーション及びPCR再アセンブリによるDNAシャッフリングを用い、ヌクレ
オチド配列を組み換えることが可能である。例えば、オリゴヌクレオチド仲介定
方向突然変異誘導を利用して、新規な制限部位の生成、グリコシル化パターンの
変更、コドン優先の変更、スプライス変異体の生成等を行う突然変異を導入し得
る。

【０１１３】 本発明のヌクレオチドは、MolecularBreeding（Maxygen Inc., Santa Clara C
A。米国特許第5,837,458号、Chang, C.-C.ら (1999) Nat. Biotechnol. 17:793-
797、Christians, F.C.ら (1999) Nat. Biotechnol. 17:259-264、Crameri, A.
ら (1996) Nat. Biotechnol. 14:315-319に記載）等のDNAシャッフリング技術の
対象となり、FLEXHTの生物学的特性、例えば生物活性、酵素力、或いは他の分子
や化合物との結合力等を変更または向上させ得る。DNAシャッフリングは、遺伝
子断片のPCR仲介再組換えを用いて遺伝子変異体のライブラリを生成するプロセ
スである。ライブラリはその後、その遺伝子変異体を所望の特性に同定するよう
な選択またはスクリーニングにかける。次にこれらの好適な変異体をプールし、
更に反復してDNAシャッフリング及び選択／スクリーニングを行ってもよい。こ
のように、遺伝の多様性は「人為的」品種改良及び急速な分子の進化を経て創生
される。例えば、ランダムポイント突然変異を有する単一の遺伝子の断片を再結
合し、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化されるまでシャッフリング
することができる。或いは、所定の遺伝子を同種または異種のいずれかから得た
同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子と再結合し、それによって天然に存在する複
数の遺伝子の遺伝多様性を、指図された制御可能な方法で最大化させることがで
きる。

【０１１４】 別の実施例によれば、当分野でよく知られている化学的方法を用いて、FLEXHT
をコードする配列の全部或いは一部を合成し得る（Caruthers. M.H.ら (1980) N
ucleic. Acids Symp. Ser 7:215-223、Horn, T.ら (1980) Nucleic. Acids Symp
. Ser. 7:225-232等を参照）。或いは、化学的方法を用いてFLEXHTそれ自体また
はその断片を合成し得る。例えば、種々の液相または固相技術を用いてペプチド
合成を行うことができる（Creighton, T. (1984) Proteins, Structures and Mo lecular Properties , WH Freeman, New York NY, pp. 55-60、Roberge, J.Y. ら
(1995) Science 269:202-204等を参照）。自動合成はABI 431Aペプチドシンセ
サイザ（Perkin Elmer）を用いて達成し得る。更にFLEXHTのアミノ酸配列または
その任意の一部は、直接合成する間、または他のタンパク質から得た配列または
その任意の一部と結合する間、或いはその両方を行っている間に変更し、変異型
ポリペプチドを生成することが可能である。

【０１１５】 ペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィーを用いて実質上精製可能であ
る（Chiez, R.M.and F.Z. Regnier (1990) Methods Enzymol. 182:392-421等を
参照）。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングによって
確認することができる（前出のCreighton, pp.28-53等を参照）。

【０１１６】 生物学的に活性なFLEXHTを発現させるために、FLEXHTをコードするヌクレオチ
ド配列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入することができる。好適な
発現ベクターとは即ち好適な宿主内で挿入されたコーディング配列の転写及び翻
訳の調節に必要な要素を含むベクターである。必要な要素には、ベクター及びFL
EXHTをコードするポリヌクレオチド配列におけるエンハンサー、構成型及び発現
誘導型プロモーター、５'及び３'の非翻訳領域などの調節配列がある。このよう
な要素は、長さ及び特異性が様々である。固有開始シグナルを用いて、FLEXHTを
コードする配列をより効果的に翻訳することが可能もある。このようなシグナル
には、ATG開始コドンと、コザック配列などの近傍の配列が含まれる。FLEXHTを
コードする配列及びその開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿
入された場合は、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるで
あろう。しかしながら、コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合
は、インフレームのATG開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベク
ターに含まれるようにすべきである。外来性の翻訳要素及び開始コドンは、様々
な天然物及び合成物を起源とし得る。発現の効率は、用いられる特定の宿主細胞
系に好適なエンハンサーを包含することによって高めることができる（Scharf,
D. ら (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162.等を参照）。

【０１１７】 当業者によく知られている方法を用いて、FLEXHTをコードする配列と、好適な
転写及び翻訳調節要素とを含む発現ベクターを構築することが可能である。この
方法には、in vitro組換えDNA技術、合成技術及びin vivo遺伝子組換え技術があ
る（Sambrook, J. ら (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Press, Plainview NYの4, 8, 16-17章、Ausubel, F.M. ら. (199
5) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York N
Yの9, 13, 16章等を参照）。

【０１１８】 種々の発現ベクター／宿主系を利用して、FLEXHTをコードする配列を保持及び
発現し得る。限定するものではないがこのような発現ベクター／宿主系には、組
換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転
換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌や、ウイルス発現
ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベ
クター（例えばカリフラワーモザイクウイルスCaMVまたはタバコモザイクウイル
スTMV）または細菌発現ベクター（例えばTiまたはpBR322プラスミド）で形質転
換させた植物細胞系、動物細胞系などの微生物等がある（前出のSambrook、前出
のAusubel、Van Heeke, G. and S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:550
3-5509、Bitter, G.A.ら (1987) Methods Enzymol. 153:516-544; Scorer、C.A.
ら (1994) Bio/Technology 12:18 1-184; Engelhard、E.K. ら (1994) Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227、Sandig, V. ら (1996) Hum. Gene Ther. 7
:1937-1945、タカマツ, N. (1987) EMBOJ. 6:307-311、Coruzzi, G. ら (1984)
EMBOJ. 3:1671-1680、Broglie, R. ら (1984) Science 224:838-843、Winter, J
. ら (1991) Results Probl. Cell Differ. 17:85-105、『マグローヒル科学技
術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGr
aw Hill New York NY, pp.191-196、Logan, J. and T. Shenk (1984) Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 81:3655-3659、Harrington, J.J. ら (1997) Nat. Genet. 1
5:345-355等を参照）。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスま
たはワクシニアウイルス由来の発現ベクターまたは種々の細菌性プラスミド由来
の発現ベクターを用いて、ポリヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集
団へ輸送することができる（Di Nicola, M. ら (1998) Cancer Gen. Ther. 5(6)
:350-356、Yu, M. ら (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(13):6340-6344、
Buller, R.M. ら (1985) Nature 317(6040):813-815; McGregor, D.P. ら (1994
) Mol. Immunol. 31(3):219-226、Verma, I.M. and N. Somia (1997) Nature 38
9:239-242等を参照）。本発明は、使用する宿主細胞によって限定されるもので
はない。

【０１１９】 細菌系では、FLEXHTをコードするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて多
数のクローニングベクター及び発現ベクターを選択し得る。例えば、FLEXHTをコ
ードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング及び
増殖には、PBLUESCRIPT（Stratagene, La Jolla CA）またはPSPORT１プラスミド
（Life Technologies）などの多機能大腸菌ベクターを用いることができる。FLE
XHTをコードする配列の、ベクターの多数のクローニング部位への連結反応によ
って、lacＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌を同定す
るための比色スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クロー
ニングされた配列におけるin vitro転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘル
パーファージによる一本鎖の救出、入れ子状態の欠失の生成にも有用であろう（
Van Heeke, G. and S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509.等を
参照）。多量のFLEXHTが必要な場合、例えば抗体を生成する場合などには、FLEX
HTの発現をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力な誘導T5
バクテリオファージプロモーターまたは誘導T7バクテリオファージプロモーター
を含むベクターが使用できる。

【０１２０】 酵母の発現系を使用してFLEXHTを生成し得る。α因子、アルコールオキシダー
ゼ、PGHプロモーター等の構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多数のベク
ターが、酵母菌サッカロミセス−セレビジエまたはPichia pastorisに使用可能
である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質を分泌或いは細胞内
への保持のいずれかに誘導し、安定した増殖のために外来配列の宿主ゲノムへの
組込みを可能にする（前出のAusubel (1995)、前出のBitter、前出のScorer等を
参照）。

【０１２１】 植物系を使用してFLEXHTを発現することも可能である。FLEXHTをコードする配
列の転写は、ウイルスプロモーター、例えば単独或いはTMV（タカマツ, N. (198
7) EMBO J 6:307-311）由来のオメガリーダー配列と組み合わせて用いられるよ
うなCaMV由来の35S及び19Sプロモーターによって促進される。或いは、RUBISCO
の小サブユニット等の植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを用いて
もよい（前出のCoruzzi、前出のBroglie、前出のWinter等を参照）。これらの構
成物は、直接DNA形質転換または病原体を媒介とする形質移入によって、植物細
胞内に導入可能である。（『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yea rbook of Science and Technology ) (1992) McGraw Hill New York NY, pp.191-
196等を参照。） 哺乳動物細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用し得る。発現
ベクターとしてアデノウイルスを用いる場合、FLEXHTをコードする配列は、後発
プロモーター及び３連リーダー配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体に
連結反応され得る。可欠E1またはE3領域へウイルスのゲノムを挿入し、宿主細胞
でFLEXHTを発現する感染ウイルスを得ることが可能である。（Logan, J.and T.
Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659等を参照。）更に、ラウス
肉腫ウイルス（RSV）エンハンサー等の転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿
主細胞における発現を増大させ得る。SV40またはEBVをベースにしたベクターを
用いてタンパク質を高レベルで発現させることもできる。

【０１２２】 ヒト人工染色体（HAC）を用いて、プラスミドに含まれ且つプラスミドから発
現するものより大きなDNAの断片を輸送することもできる。治療目的のために約
６kb〜１０MbのHACを作製し、従来の輸送方法（リポソーム、ポリカチオンアミ
ノポリマー、またはベシクル）で供給する（Harrington. J.J. ら (1997) Nat G
enet.15:345-355.等を参照）。

【０１２３】 長期にわたり哺乳動物系内で組換えタンパク質を生成するためには、細胞株内
のFLEXHTの安定発現が望ましい。例えば、発現ベクターであって複製発現因子、
内在性発現因子、或いはその両者のウイルス起源を含むものと、同一或いは別の
ベクター上の選択可能マーカー遺伝子とを用いて、FLEXHTをコードする配列を細
胞株に形質転換することが可能である。ベクターの導入後、選択培地に移す前に
強化培地で約１〜２日間細胞を増殖させることができる。選択可能マーカーの目
的は選択培地への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーが存在すること
により、導入された配列をうまく発現するような細胞の成長及び回収が可能とな
る。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培
養技術を用いて増殖可能である。

【０１２４】 任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。限定するものでは
ないがこのような選択系には、tk⁻単純細胞のために用いられるヘルペスウイル
スチミジンキナーゼ遺伝子と、apr⁻細胞のために用いられるアデニンホスホリ
ボシルトランスフェラーゼ遺伝子がある（Wigler, M. ら (1977) Cell 11:223-2
32、Lowy, I. ら (1980) Cell 22:817-823等を参照）。また、選択の基礎として
代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を用いることができる。例えばdh
frはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグリコシッドネオマイ
シン及びG-418に対する耐性を与え、alsはクロルスルフロンに対する耐性を、pa
tはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を各々与える
（Wigler, M. ら (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567-3570、Colbere-
Garapin, F. ら (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14 等を参照）。この他の選択可
能遺伝子、例えば、代謝のための細胞要求を変えるtrpB及びhisDは、文献に記載
されている（Hartman, S.C.and R.C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 85:8047-8051等を参照）。可視マーカー、例えばアニトシアニン、緑色蛍
光タンパク質（GFP；Clontech）、βグルクロニダーゼ及びその基質βグルクロ
ニド、またはルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリン等を用いてもよい。これ
らのマーカーを用いて、トランスフォーマントを特定するだけでなく、特定のベ
クター系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現を定量することが可能
である（Rhodes, C.A. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131等を参照）。

【０１２５】 マーカー遺伝子発現の存在／不存在によって目的の遺伝子の存在が示唆されて
も、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、FLEXHTをコ
ードする配列がマーカー遺伝子配列内に挿入された場合、FLEXHTをコードする配
列を含む形質転換細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により同定することが可能
である。または単一プロモーター制御下で、FLEXHTをコードする配列とタンデム
にマーカー遺伝子を配置することも可能である。誘導または選択に応答したマー
カー遺伝子の発現は通常、タンデム遺伝子の発現も示す。

【０１２６】 一般に、FLEXHTをコードする核酸配列を含み且つFLEXHTを発現する宿主細胞は
、当業者によく知られている種々の方法を用いて同定することが可能である。限
定するものではないが当業者によく知られている方法には、DNA-DNA或いはDNA-R
NAハイブリダイゼーション、PCR法、核酸或いはタンパク質の検出、定量、或い
はその両方を行うための膜系、溶液ベース或いはチップベースの技術を含むタン
パク質バイオアッセイまたはイムノアッセイ技術がある。

【０１２７】 特異的ポリクローナル抗体または特異的モノクローナル抗体を用いてFLEXHTの
発現の検出及び計測を行うための免疫学的方法は、当分野で公知である。このよ
うな技術の例としては、酵素に結合したイムノソルベントアッセイ（ELISA）、
ラジオイムノアッセイ（RIA）、蛍光活性化細胞選別（FACS）などが挙げられる
。FLEXHT上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、
２部位モノクローナルベースのイムノアッセイ（two-site, monoclonal-based i
mmunoassay）が好ましいが、競合結合アッセイも用いることもできる。これらの
アッセイ及びこれ以外のアッセイは、当分野で公知である（Hampton. R. ら (19
90) Serological Methods, a Laboratory Manual. APS Press. St Paul. MN, Se
ct. IV、Coligan, J. E. ら (1997) Current Protocols in Immunology, Greene
Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York NY、Pound, J.D. (1998)
Immunochemical Protocols, Humans Press, Totowa NJ等を参照）。

【０１２８】 多岐にわたる標識方法及び結合方法が、当業者に知られており、様々な核酸ア
ッセイおよびアミノ酸アッセイにこれらの方法を用い得る。FLEXHTをコードする
ポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼ
ーションプローブ或いはPCRプローブを産出する方法には、オリゴ標識化、ニッ
クトランスレーション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるPC
R法がある。或いは、FLEXHTをコードする配列またはその任意の断片を、mRNAプ
ローブを産出するためのベクターにクローニングすることも可能である。このよ
うなベクターは、当分野において知られており、市販もされており、T7、T3また
はSP6等の好適なRNAポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドを加えて、in vit ro でRNAプローブの合成に用いることができる。このような方法は、例えばAmers
ham Pharmacia Biotech、Promega（Madison WI）、U.S. Biochemical等から市販
されている種々のキットを用いて実行することができる。検出を容易にするため
に用い得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質、補助因子、インヒビタ
ー、磁気粒子のほか、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤等がある
。

【０１２９】 FLEXHTをコードするヌクレオチド配列を用いて形質転換した宿主細胞は、細胞
培地からのタンパク質の回収及び発現に適した条件下で培養し得る。形質転換細
胞から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配
列、ベクター、或いはその両者に依存する。当業者であれば理解し得るように、
FLEXHTをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、原核細胞膜または
真核細胞膜を透過するFLEXHTの直接分泌を誘導するシグナル配列を含むように設
計し得る。

【０１３０】 更に、宿主細胞株の選択は、挿入した配列の発現を調節する能力または発現し
たタンパク質を所望の形に処理する能力によって行い得る。限定するものではな
いがこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコ
シル化、リン酸化、脂質化及びアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」また
は「プロ」形を切断するような翻訳後処理を利用して、タンパク質のターゲティ
ング、折りたたみ及び／または活性を特定することも可能である。翻訳後の活性
のための固有の細胞装置及び特徴のある機構を有する種々の宿主細胞（例えばCH
O、HeLa、MDCK、MEK293、WI38等）は、American Type Culture Collection（ATC
C, Bethesda, VA）から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾及び処理
を確実にするように選択し得る。

【０１３１】 本発明の別の実施例では、FLEXHTをコードする天然の核酸配列、修飾核酸配列
または組換え核酸配列を、上記任意の宿主系において融合タンパク質の翻訳をも
たらす異種配列に連結反応させることができる。例えば、市販されている抗体を
用いて認識可能な異種部分を含むキメラFLEXHTタンパク質は、FLEXHT活性阻害剤
に対するペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。また、異種タンパ
ク質部分及び異種ペプチド部分も、市販されている親和性基質を用いて融合タン
パク質の精製を促進し得る。限定されるものではないがこのような部分には、グ
ルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質（MBP）、
チオレドキシン（Trx）、カルモジュリン結合ペプチド（CBP）、6-His、FLAG、c
-myc、赤血球凝集素（HA）がある。GSTは固定化グルタチオン上で、MBPはマルト
ース上で、Trxはフェニルアルシンオキシド上で、CBPはカルモジュリン上で、そ
して6-Hisは金属キレート樹脂上で、同族の融合タンパク質の精製を可能にする
。FLAG、c-myc及び赤血球凝集素（HA）は、これらのエピトープ標識を特異的に
認識する市販されているモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いて、
融合タンパク質の免疫親和性精製を可能にする。また、融合タンパク質を遺伝子
操作し、FLEXHTが精製後に異種部分から切断され得るように、FLEXHTコード配列
と異種タンパク質配列の間にタンパク質分解切断部位を含めることもできる。融
合タンパク質の発現及び精製方法は、前出のAusubel (1995) 10章に記載されて
いる。市販されている種々のキットを用いて融合タンパク質の発現及び精製を促
進することもできる。

【０１３２】 本発明の更に別の実施例では、TNTウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚
芽抽出系（Promega）を用いて、放射能標識したFLEXHTの合成がin vitroで可能
である。これらの系は、T7、T3またはSP6プロモーターと機能的に結合したタン
パク質コード配列の転写及び翻訳を結合する。翻訳は、例えば³⁵Sメチオニンの
ような放射能標識したアミノ酸前駆体の存在下で起こる。

【０１３３】 FLEXHTの断片は、組換え手法によって作製するのみならず、固相技術を用いた
直接ペプチド合成によっても作製し得る（前出のCreighton, pp.55-60.等を参照
。）タンパク質合成は、手作業で行うか自動化し得る。自動化合成は、例えば43
1Aペプチドシンセサイザ（Perkin Elmer）を用いて行うことが可能である。FLEX
HTの種々の断片は別々に合成し、後から結合させて完全長分子を形成する。

【０１３４】 スクリーニングアッセイ 本発明のFLEXHTまたはその断片を用いて、FLEXHTに特異結合する化合物をスク
リーニングし得る。少なくとも１個から複数個の試験化合物を用いて、FLEXHTへ
の特異結合をスクリーニングし得る。試験化合物の例としては、抗体、オリゴヌ
クレオチド、タンパク質（例えば受容体）または小分子が挙げられる。

【０１３５】 一実施例では、このように同定された化合物は、例えばリガンドまたはその断
片などのFLEXHTの天然リガンド、天然の基質、構造的または機能的な擬態性また
は自然結合パートナーに密接に関連している（Coligan, J.E. ら (1991) Curren t Protocols in Immunology 1(2)の5章等を参照）。同様にして化合物は、FLEXH
Tが結合する天然受容体に関連し得るか或いは例えばリガンド結合部位などの少
なくとも受容体の断片に密接に関連し得る。いずれの場合にも、化合物は既知の
技術を用いて合理的にデザインし得る。一実施例では、このような化合物に対す
るスクリーニングは、分泌タンパク質としてまたは細胞膜上のいずれかでFLEXHT
を発現する好適な細胞の生成に関与している。好適な細胞には、哺乳動物、酵母
、ショウジョウバエまたは大腸菌からの細胞がある。FLEXHTを発現する細胞また
はFLEXHTを含有する細胞膜断片を試験化合物と接触させ、FLEXHTまたは化合物の
いずれかの結合、刺激または阻害を分析する。

【０１３６】 アッセイは、単に試験化合物をポリペプチドに試験結合し得る。ここで、結合
は、フルオロフォア、放射性同位体、酵素抱合体またはその他の検出可能な標識
により検出される。例えば、アッセイは少なくとも１つの試験化合物を溶液中で
FLEXHTと結合するか固体支持体に固定するかのいずれかのステップ及びFLEXHTの
化合物への結合を検出するステップを有し得る。或いはアッセイは、標識された
競争相手の存在下で試験化合物の結合を検出または測定し得る。更にアッセイは
、細胞遊離製剤、化学ライブラリまたは天然の生成混合物を用いて実行すること
ができ、試験化合物は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固定し得る。

【０１３７】 本発明またはその断片のFLEXHTを用いて、FLEXHTの活性を調整する化合物をス
クリーニングし得る。このような化合物には、アゴニスト、アンタゴニスト、或
るいは部分的または逆アゴニスト等がある。一実施例においては、FLEXHTが少な
くとも１つの試験化合物と結合しているような、FLEXHTの活性を許容する条件下
でアッセイが実行され、試験化合物存在下でのFLEXHTの活性が試験化合物不存在
下でのFLEXHTの活性と比較される。試験化合物存在下でのFLEXHTの活性の変化は
、FLEXHTの活性を調整する化合物を示す。或いは、試験化合物はFLEXHTの活性に
適した条件下で活性に適した条件下でFLFXHTを含むin vitroまたは細胞遊離系と
結合し、アッセイが実行される。これらアッセイのいずれかにおいて、FLEXHTの
活性を調整する試験化合物は間接的にそのようにすることができ、試験化合物と
直接接触する必要がなくなる。少なくとも１個から複数個の試験化合物をスクリ
ーニングし得る。

【０１３８】 好適には、ELISAアッセイは例えばモノクローナル抗体またはポリクローナル
抗体などを用いてサンプル中のポリペプチドレベルを測定し得る。抗体は、ポリ
ペプチドとの直接結合または間接結合のいずれかにより、或いは基質に対してポ
リペプチドと競合することによりポリペプチドレベルを測定し得る。

【０１３９】 上記アッセイは全て診断時または予後の前後関係に用い得る。これらのアッセ
イを用いて発見した分子は、疾病治療に用いることができ、或いはポリペプチド
／分子を活性化または阻害することにより患者に特定の結果（例えば血管成長）
をもたらし得る。更にアッセイは、適切に処置された細胞または組織からのポリ
ペプチドの生成を阻害または強化し得る薬剤を発見することができる。

【０１４０】 転写イメージング 別の実施例は、組織または細胞タイプの転写イメージを発生させるためのFLEX
GEMをコードするポリヌクレオチド配列の使用に関連する。転写イメージは、所
与の条件下、所定時間で特定の組織または細胞タイプによる遺伝子発現の集合的
パターンである。遺伝子発現のこのようなパターンは、発現した遺伝子の数及び
その存在量により画定される。従って、本発明のポリヌクレオチド配列を用いて
、好適にはマイクロアレイフォーマットにおいて、本発明のポリヌクレオチド配
列を組織または細胞タイプの転写または逆転写の全体にハイブリダイズすること
により、組織または細胞タイプの転写イメージを発達させ得る。結果として生じ
る転写イメージは、FLEXGEM遺伝子活性のプロフィールを提供し得る。

【０１４１】 FLEXGEM遺伝子発現のプロフィールを描く転写イメージは、組織、細胞系、生
検その他の生化学的サンプルから単離された転写を用いて生成し得る。転写イメ
ージはこのようにして、組織または生検サンプルの場合のようにin vivoで、或
いは細胞系の場合のようにin vitroでFLEXGEM遺伝子発現を反映し得る。転写イ
メージを用いて、別の組織タイプでFLEXGEM遺伝子発現のプロフィールを描くこ
ともできる。このプロセスを用いて、異なる組織タイプでのこの活性に関連する
特定の組織タイプにおけるFLEXGEM遺伝子活性を決定し得る。転写イメージを用
いて、病変組織のFLEXGEM遺伝子発現特性のプロフィールを生成し得る。治療前
後の組織の転写イメージを用いて、診断し、疾病の進行をモニターし、FLEXCEM
をコードする遺伝子の活性に影響する疾病に対する薬治療の有効性をモニターし
得る。

【０１４２】 FLEXGEM遺伝子発現のプロフィールを描く転写イメージは、in vitroモデル系
及び医薬品の前臨床評価に関連して用いることもできる。細胞系の転写イメージ
を用いて、FLEXGEM活性を算定及び／またはこの活性を欠失または誤制御する細
胞系を同定し得る。それからこのような細胞系を医薬品で処置し、治療に続いて
転写イメージがこの活性の所望レベルを回復する医薬品の有効性を示し得る。同
様のアプローチを用いて、FLEXGEM活性の望ましくない変化に反映されるような
医薬品の毒性を算定し得る。候補医薬品は、その関連転写イメージを有効性既知
の医薬品のイメージと比較して算定し得る。

【０１４３】 遺伝子導入動物 別の実施例では、FLEXHTまたはその哺乳類同族体をコードするポリヌクレオチ
ドは、胚幹（ES）細胞において相同的組換えを用いて動物モデル系内で「ノック
アウト」される。このような技術は当技術分野において公知であり、ヒト疾病の
動物モデルの生成に有用である（米国特許第5,175,383号及び第5,767,337号等を
参照）。例えば129/SvJ細胞系等のマウスES細胞は、初期のマウス胚芽に由来し
、培養液中で成長する。ES細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝
子等のマーカー遺伝子により分裂させた対象遺伝子（gene of interest）を含む
ベクターを用いて形質転換される（neo: Capecchi, M.R. (1989) Science 244:1
288-1292）。ベクターは、相同的組換えにより宿主ゲノムの対応する領域に統合
される。或いは、組織特異的または発達段階特異的な様式で対象遺伝子をノック
アウトするCre-loxP系を用いて相同的組換えが発生する（Marth, J.D. (1996) C
lin. Invest. 97:1999-2002; Wagner, K.U. ら (1997) Nucleic Acids Res. 25:
4323-43 30）。形質転換されたES細胞を同定し、例えばC57BL/6マウス系統から
採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。胚盤胞を偽妊娠種雌に外科的に導入
し、結果として得られるキメラ子孫の遺伝形質を決め、これを繁殖させてヘテロ
接合性系統またはホモ接合性系統を生成する。このようにして産出した遺伝子導
入動物は、潜在的治療薬または毒性薬剤を用いて試験し得る。

【０１４４】 FLEXHTをコードするポリヌクレオチドは、ヒト胚盤胞由来のES細胞におけるin vitro でも操作し得る。ヒトES細胞は、内胚葉、中胚葉及び外胚葉の細胞タイプ
を含む少なくとも８つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。この細胞系
統は、例えば神経細胞、造血系統及び心筋細胞に分化する（Thomson, J.A. ら (
1998) Science 282:1145-1 147）。

【０１４５】 FLEXHTをコードするポリヌクレオチドは、モデルヒト疾病への「ノックイン」
ヒト化動物（ブタ）または遺伝子導入動物（マウスまたはラット）も生成し得る
。ノックイン技術を用いて、FLEXHTをコードするポリヌクレオチドの或る領域を
動物ES細胞に注入し、注入された配列は動物細胞ゲノムに統合する。形質転換さ
れた細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺伝子導入子孫または
近交系について研究し、強力な医薬品を用いて処理し、ヒトの疾病の治療に関す
る情報を得る。或いは、FLEXHTを過剰発現するべく例えばFLEXHTを乳内に分泌す
るなどして同系交配させた哺乳動物は、簡便なタンパク質の源としても役立ち得
る（Janne, J. ら (1998) Biotechnol. Annu. Rev. 4:55-74）。

【０１４６】 治療 FLEXHTのある領域とヒト組織中で発現する完全長分子のある領域との間に、例
えば配列及びモチーフの文脈における化学的及び構造的類似性が存在する。更に
、FLEXHTの発現は、細胞増殖、免疫応答と密接な関係がある。従って、FLEXHTは
、発達障害、細胞増殖異常及び免疫異常疾患においてある役割を果たすと考えら
れる。FLEXHTの発現または活性の増大に関連する疾患の治療においては、FLEXHT
の発現または活性を低下させることが望ましい。また、FLEXHTの発現または活性
の低下に関連する上記した疾患の治療においては、FLEXHTの発現または活性を増
大させることが望ましい。

【０１４７】 従って、一実施例において、FLEXHTの発現または活性の低下に関連した疾患の
治療または予防のために、患者にFLEXHTまたはその断片や誘導体を投与すること
が可能である。限定するものではないが、このような疾患の例には、発達障害が
含まれ、その中には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成
不全性小人症、デュシェンヌ‐ベッカー型筋ジストロフィ、癲癇、性腺形成異常
、WAGR症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神薄弱）、スミス
‐マジェニス症候群（Smith- Magenis syndrome）、脊髄形成異常症候群、遺伝
性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、シャルコー‐マリー‐ツース病及び神経線維
腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症、舞踏病（Syndenham's ch
orea）及び脳性小児麻痺などの発作障害、脊髄二分裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、
先天性緑内障、白内障、感覚神経性聴力損失とが含まれ、また細胞増殖異常症も
含まれ、その中には日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、
肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、
真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色
腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房
、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副
甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、子宮の癌などが含ま
れ、また免疫異常症も含まれ、その中には炎症及び日光性角化症、後天性免疫不
全症候群（AIDS）及び副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性
脊椎炎、アミロイド症、貧血、動脈硬化、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己
免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、滑液包炎、胆嚢炎、硬変、
接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、赤芽
球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、
グレーブス病、橋本甲状腺炎、発作性夜間血色素尿症、肝炎、過好酸球増加症、
過敏性大腸症候群、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、混合型結合織病（MC
TD）、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜炎症、骨髄線維症、骨関節炎
、骨粗しょう症、膵炎、真性多血症、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウ
マチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性
エリテマトーデス、全身性硬化症、原発性血小板血症、血小板減少症、潰瘍性大
腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、外傷と、リンパ腫及
び白血病、骨髄腫を含む造血性の癌が含まれる。

【０１４８】 別の実施例では、FLEXHTまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを患者
に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むFLEXHTの発現または活
性の低下に関連した疾患を治療または予防することも可能である。

【０１４９】 更に別の実施例では、実質的に精製されたFLEXHTを含む医薬品成分を好適な医
薬用担体と共に患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むFL
EXHTの発現または活性の低下に関連した疾患を治療または予防することも可能で
ある。

【０１５０】 更に別の実施例では、FLEXHTの活性を調節するアゴニストを患者に投与して、
限定するものではないが上記した疾患を含むFLEXHTの発現または活性の低下に関
連した疾患を治療または予防することも可能である。

【０１５１】 更に別の実施例では、患者にFLEXHTのアンタゴニストを投与して、FLEXHTの発
現または活性の増大に関連した疾患を治療または予防することが可能である。限
定するものではないがこのような疾患の例には、上記した発達障害、細胞増殖異
常及び免疫異常疾患がある。一実施態様においては、アンタゴニストとして直接
的に、或いはFLEXHTを発現する細胞または組織に薬剤を輸送するターゲティング
または輸送機構として間接的にFLEXHTと特異結合する抗体を用いることができる
。

【０１５２】 別の実施例では、FLEXHTをコードするポリヌクレオチドの相補体を発現するベ
クターを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むFLEXHTの
発現または活性の増大に関連した疾患を治療または予防することも可能である。

【０１５３】 別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニ
スト、相補配列、またはベクターを、別の好適な治療薬と組み合わせて投与する
こともできる。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従
ってを選択し得る。治療薬と組み合わせることにより、上記した種々の疾患の治
療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いることにより少量の各
薬剤で医薬効果をあげることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減
し得る。

【０１５４】 FLEXHTのアンタゴニストは、当分野で一般的に知られている方法を用いて製造
し得る。具体的には、精製されたFLEXHTを用いて抗体を作るか、治療薬のライブ
ラリをスクリーニングして、FLEXHTと特異結合するものを同定することが可能で
ある。FLEXHTの抗体も、当分野で一般的に知られている方法を用いて製造するこ
とが可能である。限定するものではないがこのような抗体には、ポリクローナル
抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fab断片及びFab発現ライ
ブラリによって作られた断片が含まれ得る。中和抗体（即ち二量体の形成を阻害
する抗体）は通常、治療用に好適である。

【０１５５】 抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト、その他を含む
種々の宿主は、FLEXHT、またはFLEXHTの任意の断片またはオリゴペプチドであっ
て免疫抗原性の特性を有するものを注入することによって免疫化することができ
る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもで
きる。限定するものではないがこのようなアジュバントには、フロイントアジュ
バントと、水酸化アルミニウム等のミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン
、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリン
ペットヘモシニアン、ジニトロフェノール等の界面活性剤とがある。ヒトに用い
られるアジュバントの中では、BCG（カルメット‐ゲラン杆菌）及びコリネバク
テリウム‐パルヴムが特に好ましい。

【０１５６】 FLEXHTに対する抗体を誘導するために用いるオリゴペプチド、ペプチドまたは
断片は、少なくとも約５のアミノ酸からなり、一般的には少なくとも約１０のア
ミノ酸からなるアミノ酸配列を有するものが好ましい。これらのオリゴペプチド
、ペプチドまたは断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であり
且つ小さな天然の分子の全アミノ酸配列を含むことが望ましい。FLEXHTアミノ酸
の短い伸長部は、別のタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシニアンの
配列と融合し、キメラ分子に対する抗体が産生され得る。

【０１５７】 FLEXHTに対するモノクローナル抗体は、抗体分子を産生する任意の技術を用い
て、培地内の連続した細胞株によって作製し得る。限定するものではないがこの
ような技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術及びEBV-
ハイブリドーマ技術がある（Kohler, G. ら. (1975) Nature 256:495-497、Kozb
or, D. ら (1985) .J. Immunol. Methods 81:31-42、Cote, R.J. ら (1983) Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030、Cole, S.P. ら (1984) Mol. Cell Bio
l. 62:109-120等を参照）。

【０１５８】 更に、「キメラ抗体」を作製するために開発した技術、例えば好適な抗原特異
性及び生物学的活性を有する分子を得るためのマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝
子へのスプライシングを用いることが可能である（Morrison, S.L.ら. (1984) P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855、Neuberger, M.S.ら (1984) Nature
312:604-608、タケダ, S.ら (1985) Nature 314:452-454等を参照）。或いは、
一本鎖抗体を産生するために説明された技術を適用し、当分野で知られている方
法を用いて、FLEXHT特異性一本鎖抗体を産生し得る。関連特異性を有するがイデ
ィオタイプ組成が異なるような抗体を、ランダムな組合せの免疫グロブリンライ
ブラリからチェーンシャッフリングによって産生することもできる（Burton D.R
. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10134-10137等を参照）。

【０１５９】 抗体の産生は、リンパ球集団におけるin vivo産生の誘導によって、或いは免
疫グロブリンライブラリのスクリーニングまたは文献に開示されているような高
特異結合試薬のパネルのスクリーニングによっても行い得る（Orlandi, R. ら (
1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833-3837、Winter, G. ら (1991) Nat
ure 349:293-299等を参照）。

【０１６０】 FLEXHTのための特異結合部位を有する抗体を産生することもできる。例えば、
限定するものではないがこのような断片には、抗体分子のペプシン消化によって
作製されるF(ab')₂ 断片と、F(ab')₂ 断片のジスルフィド架橋を減らすことによ
って作製されるFab断片とがある。或いは、Fab発現ライブラリを作製することに
よって、モノクローナルFab断片を所望の特異性と迅速且つ容易に同定すること
が可能となる（Huse, W.D. ら (1989) Science 256:1275-1281等を参照）。

【０１６１】 種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体
を同定することができる。確立された特異性を有するポリクローナル抗体または
モノクローナル抗体の何れかを用いる免疫放射線アッセイまたは競合結合アッセ
イに対する数々のプロトコルは、当分野において公知である。このようなイムノ
アッセイは通常、FLEXHTとその特異性抗体間の複合体形成の計測に関与している
。２つの非干渉性FLEXHTエピトープに反応するモノクローナル抗体を用いるよう
な、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合
結合アッセイを利用してもよい（前出のPoundの文献）。

【０１６２】 ラジオイムノアッセイ技術と共に様々な方法、例えばスキャッチャード分析を
用いて、FLEXHTに対する抗体の親和性を評価する。親和性は結合定数Kaで表す。
Kaは、平衡状態においてFLEXHT抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモ
ル濃度で除した値であると定義する。ポリクローナル抗体は多様なFLEXHTエピト
ープに対する親和性が不均一であり、ポリクローナル抗体試薬のために決定した
Kaは、FLEXHT抗体の平均親和性または結合活性を表す。モノクローナル抗体は特
定のFLEXHTエピトープに対して単一特異的であり、モノクローナル抗体試薬のた
めに決定したKaは、親和性の真の測定値を表す。Ka値が約１０⁹〜１０¹² L/mol
の範囲にあるような高親和性抗体試薬は、FLEXHT抗体複合体が激しい操作に耐え
なければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ka値が約１０⁶〜１０⁷ L/molの範囲にあるような低親和性抗体試薬は、FLEXHTが抗体から最終的に活性
化状態で解離する必要がある免疫精製及び類似の処理に用いるのが好ましい（Ca
tty, D. (1988) Antibodies, Volume I: A Practical Approach, IRL Press, Wa
shington, DC、Liddell, J. E.and Cryer, A. (1991) A Practical Guide to Mo noclonal Antibodies , John Wiley & Sons, New York NY）。

【０１６３】 ポリクローナル抗体試薬の抗体価及び結合活性を更に評価して、或る下流の適
用例に対するこのような試薬の品質及び適性を決定することができる。例えば、
少なくとも１〜２mg/ml、好ましくは５〜１０mg/mlの特異抗体を含むポリクロー
ナル抗体試薬は、FLEXHT抗体複合体を沈殿させる必要がある処理において通常用
いられる。抗体の特異性、抗体価、結合活性、様々な適用例における抗体の品質
や使用に対する指針については、一般に入手可能である。（前出のCattyの文献
、同Coligan らの文献等を参照）。

【０１６４】 本発明の別の実施例では、FLEXHTをコードするポリヌクレオチド、FLEXHTの任
意の断片または相補配列を治療目的で使用することができる。ある実施形態では
、FLEXHTをコードするポリヌクレオチドの相補配列がmRNAの転写を阻止するのに
好適である場合にこれを使用し得る。具体的には、FLEXHTをコードするポリヌク
レオチドに相補的な配列で細胞を形質転換し得る。従って、相補的分子または断
片は、FLEXHT活性を調節するため、または遺伝子機能を調節するために使用し得
る。このような技術は既に当分野ではよく知られており、センスまたはアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片を、FLEXHTをコードする配列のコード
領域または制御領域に延在する様々な位置から設計することが可能である（Agra
wal, S., ed. (1996) Antisense Therapeutics, Humana Press Inc., Totawa NJ
等を参照）。

【０１６５】 治療に用いる場合、アンチセンス配列を好適な標的細胞に導入するのに好適な
任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的
タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を発現する発
現プラスミドの形で細胞内に輸送することが可能である（Slater, J.E. ら (199
8) J. Allergy Clin. Immunol. 102(3):469-475 及び Scanlon, K.J. ら (1995)
9(13):1288-1296.等を参照）。アンチセンス配列はまた、例えばレトロウイルス
やアデノ関連ウイルスベクター等のウイルスベクターを用いて細胞内に導入する
こともできる（Miller, A.D. (1990) Blood 76:271、前出のAusubel、Uckert, W
. and W. Walther (1994) Pharmacol. Ther. 63(3):323-347等を参照）。その他
の遺伝輸送機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープ及び当分野
で公知のその他の系が含まれる（Rossi, J.J. (1995) Br. Med. Bull. 51(1):21
7-225; Boado、R.J.ら (1998) J. Pharm. Sci. 87(11):1308-1315、Morris, M.C
. ら (1997) Nucleic Acids Res. 25(14):2730-2736. 等を参照）。

【０１６６】 本発明の別の実施例では、FLEXHTをコードするポリヌクレオチドを、体細胞若
しくは生殖細胞遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療を行うことに
より、（i）遺伝子欠損症（例えばＸ染色体連鎖遺伝（Cavazzana-Calvo, M. ら
(2000) Science 288:669-672）により特徴付けられる重度の複合型免疫欠損(SCI
D)-X1の場合）、先天性アデノシンデアミナーゼ（ADA）欠損症に関連する重度の
複合型免疫欠損（Blaese, R.M. ら (1995) Science 270:475-480、Bordignon, C
. ら (1995) Science 270:470-475）、嚢胞性繊維症（Zabner, J. ら (1993) Ce
ll 75:207-216: Crystal、R.G. ら (1995) Hum. Gene Therapy 6:643-666、Cry
stal, R.G. ら. (1995) Hum. Gene Therapy 6:667-703）、サラセミア（thalass
amia）、家族性高コレステロール血症、第VIII因子若しくは第IX因子欠損に起因
する血友病（Crystal, 35 R.G. (1995) Science 270:404-410、Verma, I.M. an
d Somia. N. (1997) Nature 389:239-242）を治療し、（ii）条件的致死性遺伝
子産物を発現させ（例えば制御不能な細胞増殖に起因する癌の場合）、（iii）
細胞内の寄生虫（例えばヒト免疫不全ウイルス(HIV)（Baltimore, D. (1988) Na
ture 335:395-396、Poescbla, E. ら (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:
11395-11399）、B型若しくはC型肝炎ウイルス（HBV、HCV）、Candida albicans
及びParacoccidioides brasiliensis等の真菌寄生虫、並びにPlasmodium falcip arum 及びTrypanosoma cruzi等の原虫寄生体に対する防御機能を有するタンパク
質を発現させることができる。FLEXHTの発現若しくは調節に必要な遺伝子の欠損
が疾患を発生させる場合、形質導入した細胞の好適な集団からFLEXHTを発現する
ことにより、遺伝子欠損に起因する症状の発現を緩和し得る。

【０１６７】 本発明の更なる実施例では、FLEXHTをコードする哺乳動物発現ベクターを作製
し、これらのベクターを機械的手段によってFLEXHT欠損細胞に導入することによ
って、FLEXHTの欠損による疾患や異常症を治療する。in vivo或いはex vitroの
細胞に用いる機械的導入技術には、（i）個々の細胞内への直接的なDNA微量注射
法、（ii）弾道的金粒子の打ち込み（ballistic gold particle delivery）、（
iii）リポソーム仲介形質移入、（iv）受容体仲介遺伝子導入、及び（v）DNAト
ランスポソンの使用（Morgan, R.A. and W.F. Anderson (1993) Annu. Rev. Bio
chem. 62:191-217、Ivics, Z. (1997) Cell 91:501-510; Boulay, J-L. and H.
Recipon (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:445-450）がある。

【０１６８】 限定するものではないがFLEXHTの発現に影響を及ぼし得る発現ベクターには、
PCDNA 3.1、EPITAG、PRCCMV2、PREP、PVAXベクター（Invitrogen, Carlsbad CA
）、PCMV-SCRIPT、PCMV-TAG、PEGSH/PERV（Stratagene, La Jolla CA）及びPTET
-OFF、PTET-ON、PTRE2、PTRE2-LUC、PTK-HYG（Clontech, Palo Alto CA）がある
。FLEXHTは、（i）恒常的に活性なプロモーター（例えばサイトメガロウイルス
（CMV）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、SV40ウイルス、チミジンキナーゼ（TK）
またはβアクチン遺伝子）、(ii)誘導性プロモーター（例えばテトラサイクリン
調節性プロモーター（Gossen, M. and H. Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sc
i. U.S.A. 89:5547-5551、Gossen, M. ら (1995) Science 268:1766-1769、Ross
i, F.M.V. and H.M. Blau (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:451-456）、市販
のInvitrogen社のT-REXプラスミドに含まれる）、エクジソン誘導性プロモータ
ー（Invitrogen社のプラスミドPVGRXR及びPINDから得られる）、FK506／ラパマ
イシン誘導性プロモーターまたはRU486／ミフェプリストーン誘導性プロモータ
ー（前出のRossi, F.M.V. and H.M. Blau）、または（iii）正常個体由来の、FL
EXHTをコードする内在性遺伝子の天然のプロモーター若しくは組織特異的プロモ
ーターを用いて、発現させることができる。

【０１６９】 市販のリポソーム形質転換キット（例えばInvitrogen社のPerFect Lipid Tran
sfection Kit）を用いれば、当業者は経験にそれほど頼らないでもポリヌクレオ
チドを培養中の標的細胞に導入することが可能になる。別法では、リン酸カルシ
ウム法（Graham. F.L. and A.J. Eb (1973) Virology 52:456-467）若しくは電
気穿孔法（Neumann, B. ら (1982) EMBO J. 1:841-845）を用いて形質転換を行
う。初代細胞にDNAを導入するためには、標準化された哺乳動物の形質移入プロ
トコルの修飾が必要である。

【０１７０】 本発明の別の実施例では、FLEXHTの発現に関連する遺伝子欠損によって起こる
疾患や異常症は、（i）レトロウイルス末端反復配列（LTR）プロモーターまたは
独立プロモーターの制御下でFLEXHTをコードするポリヌクレオチドと、（ii）好
適なRNAパッケージングシグナルと、（iii）追加レトロウイルス・シス作用性RN
A配列及び効率的なベクターの増殖に必要なコード配列を伴うRev応答性エレメン
ト（RRE）とからなるレトロウイルスベクターを作製して治療することができる
。レトロウイルスベクター（例えばPFB及びPFBNEO）はStratagene社から市販さ
れており、刊行データ（Riviere, I. ら. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.
A. 92:6733-6737）に基づいている。上記データを引用することをもって本明細
書の一部とする。ベクターは、好適なベクター産生細胞系（VPCL）において増殖
され、VPCLは、標的細胞上の受容体に対する向性を有するエンベロープ遺伝子ま
たはVSVg等の乱交雑エンベロープタンパク質を発現する（Armentano, D. ら (19
87) J. Virol. 61:1647-1650、Bender, M.A. ら (1987) J. Virol. 61:1639-164
6、Adam, M.A. and A.D. Miller (1988) J. Virol. 62:3802-3806、Dull, T. ら
(1998) J. Virol. 72:8463-8471、Zufferey, R. ら (1998) J. Virol. 72:9873
-9880）。Riggに付与された米国特許第5,910,434号（"Method for obtaining re
trovirus packaging cell lines producing high transducing efficiency retr
oviral supernatant"）は、レトロウイルスパッケージング細胞系を得るための
方法について開示しており、これを引用することをもって本明細書の一部とする
。レトロウイルスベクターの増殖、細胞集団（例えばCD4⁺ Ｔ細胞）の形質導入
、及び形質導入した細胞の患者への戻しは、遺伝子治療の分野では当業者に公知
の方法であり、多数の文献に記載されている（Ranga, U. ら. (1997) J. Virol.
71:7020-7029、Bauer, G. ら (1997) Blood 89:2259-2267、Bonyhadi, M.L. (1
997) J. Virol. 71:4707-4716、Ranga, U. ら (1998) Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 95:1201-1206、Su, L. (1997) Blood 89:2283-2290）。

【０１７１】 別法では、アデノウイルス系遺伝子治療の輸送系を用いて、FLEXHTの発現に関
連する１若しくは複数の遺伝子異常を有するような細胞にFLEXHTをコードするポ
リヌクレオチドを輸送する。アデノウイルス系ベクターの作製及びパッケージン
グについては、当業者に公知である。複製欠損型アデノウイルスベクターは、免
疫調節タンパク質をコードする遺伝子を膵臓の無損傷の膵島内に導入するために
可変性であることが証明された（Csete, M.E. ら. (1995) Transplantation 27:
263-268）。使用できる可能性のあるアデノウイルスベクターは、Armentanoに付
与された米国特許第5,707,618号（"Adenovirus vectors for gene therapy"）に
記載されており、引用することをもって本明細書の一部とする。アデノウイルス
ベクターについては、Antinozzi, P.A. ら (1999) Annu. Rev. Nutr. 19:511-54
4 及び Verma, I.M. and N. Somia (1997) Nature 18:389:239-242も参照された
い。両文献は、引用することをもって本明細書の一部とする。

【０１７２】 別法では、ヘルペス系遺伝子治療の輸送系を用いて、FLEXHTの発現に関連する
１若しくは複数の遺伝子異常を有する標的細胞にFLEXHTをコードするポリヌクレ
オチドを輸送する。HSVが向性を有するような中枢神経系の細胞にFLEXHTを導入
する際には、単純ヘルペスウイルス（HSV）系のベクターの使用は特に役立つ。
ヘルペス系ベクターの作製及びパッケージングは、当業者に公知である。複製適
格性単純ヘルペスウイルス（HSV）I型系のベクターは、レポーター遺伝子を霊長
類の眼に輸送するために用いられてきた（Liu, X. ら (1999) Exp. Eye Res.169
:385-395）。HSV-1ウイルスベクターの作製についても、DeLucaに付与された米
国特許第5,804,413号（"Herpes simplex virus swains for gene transfer"）に
開示されており、該特許の引用をもって本明細書の一部とする。米国特許第5,80
4,413号には、ヒト遺伝子治療を含む目的のために好適なプロモーターの制御下
において細胞に導入される少なくとも１つの内在性遺伝子を有するゲノムを含む
組換えHSV d92についての記載がある。上記特許はまた、ICP4、ICP27及びICP22
のために除去される組換えHSV系統の作製及び使用について開示している。HSVベ
クターについては、Goins, W.F. ら (1999) J. Virol. 73:519-532 及び Xu, H.
ら (1994) Dev. Biol. 163:152-161も参照されたい。両文献は、引用をもって
本明細書の一部とする。クローン化ヘルペスウイルス配列の操作、巨大ヘルペス
ウイルスのゲノムの異なった部分を含む多数のプラスミドを形質移入した後の組
換えウイルスの継代、ヘルペスウイルスの成長及び増殖、並びにヘルペスウイル
スの細胞への感染は、当業者に公知の技術である。

【０１７３】 別法では、αウイルス（正の一本鎖RNAウイルス）ベクターを用いてFLEXHTを
コードするポリヌクレオチドを標的細胞に輸送する。プロトタイプのαウイルス
であるセムリキ森林熱ウイルス（Semliki Forest Virus, SFV）の生物学的研究
が広範に行われており、遺伝子導入ベクターがSFVゲノムに基づいていることが
分かった（Garoff, H. and K.-J. Li (1998) Cun. Opin. Biotech. 9:464-469）
。αウイルスRNAの複製中に、通常はウイルスカプシドタンパク質をコードする
サブゲノムRNAが作り出される。このサブゲノムRNAは、完全長のゲノムRNAより
高いレベルに複製されるため、酵素活性（例えばプロテアーゼ及びポリメラーゼ
）を有するウイルスタンパク質に比べてカプシドタンパク質が過剰産生される。
同様に、FLEXHTに対するコード配列をカプシドコード領域のαウイルスゲノムに
導入することにより、ベクター導入細胞において多数のFLEXHTコードRNAが産生
され、高レベルのFLEXHTが合成される。通常はαウイルスの感染が数日以内での
細胞溶解に関係する一方で、シンドビスウイルス（SIN）の変異体を有するハム
スター正常腎臓細胞（BHK-21）の持続的な感染を確立する能力は、αウイルスの
溶解複製を遺伝子治療に適用できるように好適に変更可能であることを示唆して
いる（Dryga, S.A. ら. (1997) Virology 228 :74-83）。αウイルスの宿主の範
囲が広いことにより、様々な細胞タイプへのFLEXHTの導入が可能になる。或る集
団におけるサブセットの細胞の特定形質導入は、形質導入前に細胞の選別を必要
とし得る。αウイルスの感染性cDNAクローンの処置方法、αウイルスのcDNA及び
RNAの形質移入方法及びαウイルスの感染方法は、当業者に公知である。

【０１７４】 転写開始部位由来のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害することも
可能である。転写開始部位とは例えば開始部位から数えて約−１０と約＋１０の
間である。同様に、三重らせん塩基対の形成方法を用いて阻害が可能となる。三
重らせん塩基対形成は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために
十分に開くような二重らせんの能力を阻害するので、三重らせん塩基対形成は有
用である。三重らせんDNAを用いる最近の治療の進歩については文献に記載があ
る（Gee, J.E. ら (1994) in: Huber, B.E.and B.I. Carr, Molecular and Immu nologic Approaches , Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY, pp.163-177等を
参照）。相補配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに結合す
るのを阻止することによってmRNAの翻訳を阻止するべく設計することができる。

【０１７５】 リボザイムは酵素性RNA分子であり、RNAの特異的切断を触媒するためにリボザ
イムを用いることもできる。リボザイム作用のメカニズムは、ヌクレオチド鎖切
断に先立つ相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーシ
ョンに関与している。例えば、組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子は、
FLEXHTをコードする配列のヌクレオチド鎖切断を特異的且つ効果的に触媒する。

【０１７６】 任意の潜在的RNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、GUA、GUU、GUC配列を
含めたリボザイム切断部位に対する標的分子をスキャンすることによって先ず同
定される。一度同定されると、オリゴヌクレオチドを機能不全にするような２次
構造の特徴に対して切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボ
ヌクレオチドの短いRNA配列を、評価することが可能になる。候補標的の適合性
の評価も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチドと
のハイブリダイゼーションの実施容易性をテストすることによって行うことがで
きる。

【０１７７】 本発明の相補リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子合成のために当分野で
よく知られている任意の方法を用いて作製し得る。任意の方法には、固相ホスホ
ラミダイト化合物等のオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。或い
は、HRIPをコードするDNA配列のin vitro及びin vivo転写によってRNA分子を産
出し得る。このようなDNA配列は、T7やSP6等の好適なRNAポリメラーゼプロモー
ターを用いて多様なベクター内に組み入れることが可能である。或いは、相補的
RNAを構成的或いは誘導的に合成するようなこれらcDNA産物を、細胞系、細胞ま
たは組織内に導入することができる。

【０１７８】 細胞内の安定性を高め、半減期を長くするためにRNA分子を修飾することがで
きる。限定するものではないが可能な修飾には、分子の５'末端、３'末端、ある
いはその両方においてフランキング配列を追加したり、分子の主鎖内においてホ
スホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネートまたは2' Oメチルを使用し
たりすることが含まれる。この概念は、PNAの産出に固有のものであり、これら
全ての分子に拡大することができる。それには、内在性エンドヌクレアーゼによ
って容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリジ
ンにアセチル−、メチル−、チオ−及び同様の修飾をしたものに加えて、非従来
型塩基、例えばイノシン、クエオシン（queosine）、ワイブトシン（wybutosine
）等を包含することによる。

【０１７９】 本発明の追加実施例は、FLEXHTをコードするポリヌクレオチドの変異発現に有
効な化合物をスクリーニングする方法を含む。限定するものではないが特異ポリ
ヌクレオチドの変異発現に有効な化合物には、オリゴヌクレオチド、アンチセン
スオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、転写因子その他の
ポリペプチド転写制御因子、及び特異ポリヌクレオチド配列と相互作用し得る非
高分子化学的実体がある。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビタ
ーまたはエンハンサーのいずれかとして作用することによりポリヌクレオチド発
現を変異し得る。従って、FLEXHTの発現または活性の増加に関連する疾病の治療
においては、FLEXHTをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化
合物が治療上有益であり、FLEXHTの発現または活性の低下に関連する疾病の治療
においては、FLEXHTをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化
合物が治療上有益であり得る。

【０１８０】 特異ポリヌクレオチドの変異発現における有効性に対して、少なくとも１個か
ら複数個の試験化合物をスクリーニングし得る。試験化合物は、当分野で通常知
られている任意の方法により得られる。このような方法には、ポリヌクレオチド
の発現を変異させる場合と、既存の、市販のまたは専売の、天然または非天然の
化合物ライブラリから選択する場合と、標的ポリヌクレオチドの化学的及び／ま
たは構造的特性に基づく化合物を合理的にデザインする場合と、組合せ的にまた
は無作為に生成した化合物のライブラリから選択する場合に有効であることが知
られているような化合物の化学修飾がある。FLEXHTをコードするポリヌクレオチ
ドを含むサンプルは、少なくとも１つの試験化合物に曝され、このように得られ
る。サンプルには例えば、無傷細胞、透過化処理した細胞、細胞遊離系または再
構成生化学系があり得る。FLEXHTをコードするポリヌクレオチドの発現における
変化は、当分野で通常知られている任意の方法でアッセイする。通常、FLEXHTを
コードするポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプロー
ブを用いたハイブリダイゼーションにより、特異ヌクレオチドの発現を検出する
。ハイブリダイゼーション量を定量し、それによって１若しくは複数の試験化合
物に曝露される及び曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較に対する基礎を
形成し得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現における変化の検
出は、ポリヌクレオチドの発現を変異する際に試験化合物が有効であることを示
している。特異ポリヌクレオチドの変異発現に有効な化合物に対して、例えばSc hizosaccharomyces pombe 遺伝子発現系（Atkins, D. ら (1999) 米国特許第5,93
2,435号、Arndt, G.M. ら (2000) Nucleic Acids Res. 28:E15）またはHeLa細胞
等のヒト細胞系（Clarke, M.L. ら (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 26
8:8-13）を用いてスクリーニングを実行する。本発明の特定の実施例は、特異的
ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性のためのオリゴヌクレオチド（
デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、修飾オリゴヌク
レオチド）の組み合わせライブラリをスクリーニングすることに関与している（
Bruice, T.W. ら (1997) 米国特許第5,686,242号、Bruice, T.W. ら (2000) 米
国特許第6,022,691号）。

【０１８１】 ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、in vivo
、in vitro及びex vivoの使用に対して同程度に適している。ex vivo治療の場合
、ベクターを患者から採取した肝細胞内に導入し、クローニング増殖して同一患
者に自家移植で戻すことができる。トランスフェクション、リボソーム注入また
はポリカチオンアミノポリマーによる輸送は、当分野でよく知られている方法を
用いて実行することができる。（Goldman, C.K. ら (1997) Nat. Biotechnol. 1
5:462-466.等を参照。） 上記の治療方法はいずれも、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ
、サル等の哺乳動物を含めて治療が必要な全ての対象に適用できる。

【０１８２】 本発明の追加実施例は、通常薬剤として許容できる賦形剤で処方される活性成
分を有する医薬品成分の投与に関連する。賦形剤には例えば、セルロース、ゴム
及びタンパク質がある。様々な処方が通常知られており、詳細はRemington's Ph armaceutical Sciences （Maack Publishing, Easton PA）の最新版に記載されて
いる。このような医薬品成分は、FLEXHT、FLEXHTに対する抗体、擬態、アゴニス
ト、アンタゴニスト、またはFLEXHTインヒビターから構成し得る。

【０１８３】 本発明に用いられる医薬品成分は、任意の数の経路によって投与することがで
き、限定するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内
、クモ膜下腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下
または直腸がある。

【０１８４】 肺から投与する医薬品成分は、液状または乾燥粉末状で調製し得る。このよう
な医薬品成分は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子（例えば
伝統的な低分子重量有機薬）の場合には、速効製剤のエアロゾル輸送は当分野で
公知である。高分子（例えばより大きなペプチド及びタンパク質）の場合には、
当該分野において肺の肺胞領域を介しての肺輸送が最近向上したことにより、イ
ンスリン等の薬剤を実質的に血液循環へ輸送することを可能にした（Patton, J.
S. ら, 米国特許第5,997,848号等を参照）。肺輸送は、針注射なしに投与する点
で優れており、潜在的に有毒な浸透エンハンサーの必要性をなくす。

【０１８５】 本発明での使用に適した医薬品成分には、所定の目的を達成するために必要な
だけの量の活性成分を含有する成分が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の
能力の範囲内で行う。

【０１８６】 医薬品成分の特殊形状は、FLEXHTまたはその断片を含む高分子を直接細胞内輸
送するために調製される。例えば、細胞不透過性高分子を含むリポソーム製剤は
、細胞融合及び高分子の細胞内輸送を促進し得る。或いは、FLEXHTまたはその断
片をHIV Tat-1タンパク質から陽イオンN末端部に結合することもできる。このよ
うにして生成された融合タンパク質は、マウスモデル系の脳を含む全ての組織の
細胞に形質導入することがわかっている（Schwarze, S.R. ら (1999) Science 2
85:1569-1572）。

【０１８７】 任意の化合物に対して、細胞培養アッセイ、例えば新生物性細胞の細胞培養ア
ッセイにおいて、或いは、動物モデル、例えばマウス、ウサギ、イヌまたはブタ
等において、先ず治療の有効投与量を推定することができる。動物モデルはまた
、好適な濃度範囲及び投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を
用いて、次にヒトに対する有益な投与量及び投与経路を決定することができる。

【０１８８】 治療上の有効投与量は、症状や容態を回復させるような活性成分量を参考にす
る。そのような活性成分の例としては、FLEXHTまたはその断片、FLEXHTの抗体、
FLEXHTのアゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビターがある。薬用有効度及
び毒性は、細胞培養または動物実験における標準的な薬剤手法によって、例えば
ED₅₀（集団の５０％の医薬的有効量）またはLD₅₀（集団の５０％の致死量）を測
定するなどして決定することができる。毒性効果の治療効果に対する投与量の比
は、治療指数であり、LD₅₀／ED₅₀比として表すことができる。高い治療指数を示
すような医薬品成分が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデ
ータは、ヒトに用いるための投与量の範囲を調剤するのに用いられる。このよう
な組成物が含まれる投与量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、ED₅₀を含むような
血中濃度の範囲にあることが好ましい。用いられる投与形態、患者の感受性及び
投与の経路によって、投与量はこの範囲内で様々に変わる。

【０１８９】 正確な投与量は、治療が必要な被験者に関する要素を考慮して、現場の医者が
決定することになる。効果的なレベルの活性成分を与え、或いは所望の効果を維
持するべく、投与量及び投与を調節する。被験者に関する要素としては、疾患の
重症度、患者の通常の健康状態、患者の年齢、体重及び性別、投与の時間及び頻
度、薬剤の配合、反応感受性及び治療に対する応答等を考慮する。作用期間が長
い医薬品成分は、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって３〜４日毎に
１度、１週間に１度、或いは２週間に１度の間隔で投与し得る。

【０１９０】 通常の投与量は、投与の経路にもよるが約０.１〜１００,０００μgであり、
合計で約１gまでとする。特定の投与量及び輸送方法に関するガイダンスは文献
に記載されており、現場の医者は通常それを利用することができる。当業者は、
タンパク質またはインヒビターに対する処方とは異なる、ヌクレオチドに対する
処方を利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの輸
送は、特定の細胞、状態、位置等に特異的なものとなる。

【０１９１】 診断 別の実施例では、FLEXHTの発現によって特徴付けられる疾患の診断のために、
或いはFLEXHTやFLEXHTのアゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビターで治療
を受けている患者をモニターするためのアッセイにおいて、FLEXHTを特異的に結
合する抗体が用いられることがある。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇
所で記載した方法と同じ方法で調合される。FLEXHTの診断アッセイには、抗体及
び標識を利用してヒトの体液において或いは細胞や組織のエキスにおいてFLEXHT
を検出する方法が含まれる。抗体は、修飾して或いは修飾しないで使用し、レポ
ーター分子の共有結合性或いは非共有結合性の接着によって標識化し得る。多様
なレポーター分子が当分野で知られており、それらを用いることができる。幾つ
かのレポーター分子については上記した。

【０１９２】 FLEXHTを測定するための様々なプロトコル、例えばELISA、RIA、FACS等が当分
野において知られており、FLEXHT発現の修正レベル或いは異常レベルを診断する
基準を提供する。複合体の形成に適した条件下でヒト対象等の正常な哺乳動物対
象から採取した体液または細胞とFLEXHTに対する抗体とを結合させることにより
、FLEXHT発現の正常値または標準値が決定される。標準複合体形成量は、種々の
方法、例えば測光法で定量できる。対象内で発現したFLEXHTの量、制御、検体か
らの病変サンプルを標準値と比較する。標準値と対象との偏差が疾患を診断する
パラメータとなる。

【０１９３】 別の実施例によれば、FLEXHTをコードするポリヌクレオチドを診断目的に用い
ることもできる。用いられることができるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレ
オチド配列、相補的RNA及びDNA分子、そしてPNAが含まれる。ポリヌクレオチド
は、検体におけるFLEXHTの発現が疾患と相関し得るような該検体における遺伝子
発現の検出及び定量に用いることができる。診断アッセイは、FLEXHTの不在、存
在及び過剰発現を測定するために、そして治療インターベンション中にFLEXHTレ
ベルの調製をモニターするために用いることができる。

【０１９４】 ある実施形態では、FLEXHTをコードする核酸配列を同定するために、FLEXHTま
たは近縁の分子をコードする、ゲノム配列を含むポリヌクレオチド配列を検出可
能なPCRプローブとのハイブリダイゼーションを用いることができる。プローブ
が同定するのはFLEXHT、突然変異体または関連配列をコードするような、天然に
存在する配列のみであるか否かは、プローブの特異性及びハイブリダイゼーショ
ン或いは増幅のストリンジェンシーによって決定されることになる。ここで、プ
ローブの特異性とは、プローブが高特異領域（例えば５'調節領域）からなるの
か、低特異領域（例えば保存されたモチーフ）からなるのかということである。

【０１９５】 プローブはまた、関連する配列の検出にも用いることができ、その配列はFLEX
HTをコードする任意の配列と少なくとも５０％の相同性を有し得る。本発明のハ
イブリダイゼーションプローブはDNAまたはRNAとすることができ、配列番号５６
乃至１１０の配列、或いはFLEXHT遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イント
ロンを含むゲノム配列に由来し得る。

【０１９６】 FLEXHTをコードするDNAに対する特異的ハイブリダイゼーションプローブを作
製する方法には、FLEXHTまたはFLEXHT誘導体をコードするポリヌクレオチド配列
を、mRNAプローブを作製するためのベクターにクローニングする方法が含まれる
。mRNAプローブ作製のためのベクターは、当業者に知られており、市販されてお
り、好適なRNAポリメラーゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることに
よって、in vitroでRNAプローブを合成するために用いられ得る。ハイブリダイ
ゼーションプローブは、種々のレポーターの集団によって標識され得る。レポー
ター集団の例としては、³²Pまたは³⁵S等の放射性核種、或いはアビジン／ビオチ
ン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼ等の酵素標識な
どが挙げられる。

【０１９７】 FLEXHTをコードするポリヌクレオチド配列は、FLEXHTの発現に関係する疾患の
診断の為に用い得る。限定するものではないが、このような疾患の例には、発達
障害が含まれ、その中には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟
骨形成不全性小人症、デュシェンヌ‐ベッカー型筋ジストロフィ、癲癇、性腺形
成異常、WAGR症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神薄弱）、
スミス‐マジェニス症候群（Smith-Magenis syndrome）、脊髄形成異常症候群、
遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、シャルコー‐マリー‐ツース病及び神経
線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症、舞踏病（Syndenham'
s chorea）及び脳性小児麻痺などの発作障害、脊髄二分裂、無脳症、頭蓋脊椎披
裂、先天性緑内障、白内障、感覚神経性聴力損失とが含まれ、また細胞増殖異常
症も含まれ、その中には日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬
変、肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿
症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、
黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、
乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓
、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、子宮の癌などが
含まれ、また免疫異常症も含まれ、その中には炎症及び日光性角化症、後天性免
疫不全症候群（AIDS）及び副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強
直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、動脈硬化、喘息、アテローム性動脈硬化症、
自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、滑液包炎、胆嚢炎、硬
変、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、
赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛
風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、発作性夜間血色素尿症、肝炎、過好酸球増加
症、過敏性大腸症候群、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、混合型結合織病
（MCTD）、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜炎症、骨髄線維症、骨関
節炎、骨粗しょう症、膵炎、真性多血症、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、
リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全
身性エリテマトーデス、全身性硬化症、原発性血小板血症、血小板減少症、潰瘍
性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、外傷と、リンパ
腫及び白血病、骨髄腫を含む造血性の癌が含まれる。FLEXHTをコードするポリヌ
クレオチド配列は、サザン法、ノーザン法、ドットブロット法やその他の膜ベー
スの技術と、PCR法と、ディップスティック（dipstick）法、ピン及びマルチフ
ォーマットELISA様アッセイと、変異FLEXHTの発現を検出するために患者から採
取した体液または組織を利用するマイクロアレイとにおいて使用し得る。このよ
うな定性方法または定量方法は、当分野で公知である。

【０１９８】 或る形態では、関連する疾患、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて
、FLEXHTをコードするヌクレオチド配列が有用であり得る。FLEXHTをコードする
ヌクレオチド配列は標準法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合体の形成
に好適な条件下で、患者から採取した体液または組織のサンプルに添加すること
ができる。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプルを洗浄し、シグ
ナルを定量して標準値と比較する。患者サンプルのシグナル量が制御サンプルと
比べて著しく変化している場合は、サンプル内のFLEXHTをコードするヌクレオチ
ド配列の変異レベルは関連する疾患の存在を示している。このようなアッセイは
、動物実験、臨床試験における特定の治療効果を推定するため、或いは個々の患
者の治療をモニターするために用いることもできる。

【０１９９】 FLEXHTの発現に関連する疾患の診断基準を提供するために、発現のための正常
あるいは標準概要を確立する。これは、ハイブリダイゼーション或いは増幅に好
適な条件下で、動物或いはヒトの正常な対象から抽出した体液或いは細胞を、FL
EXHTをコードする配列またはその断片と結合させることにより達成され得る。実
質的に精製されたポリヌクレオチドを既知量用いて行った実験から得た値を正常
な対象から得た値と比較することにより、標準ハイブリダイゼーションを定量す
ることができる。このようにして得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得た
サンプルから得た値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾患の
存在を確定する。

【０２００】 疾患の存在が確定されて治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが
正常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイ
ブリダイゼーションアッセイを通常ベースで繰り返し得る。連続アッセイから得
られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示し得る。

【０２０１】 癌に関しては、個体からの生体組織における異常な量の転写物（過少発現また
は過剰発現）の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床的症状が現れる
前に疾患を検出する方法を提供したりし得る。この種のより明確な診断により、
医療の専門家が予防方法または積極的な治療法を早くから利用し、それによって
癌の発生または更なる進行を防止することが可能となる。

【０２０２】 FLEXHTをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドを追加的に診断上
利用することは、PCRの利用に関与し得る。これらのオリゴマーは、化学的に合
成するか、酵素により生産するか、或いはin vitroで産出し得る。オリゴマーは
、好ましくはFLEXHTをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはFLEXHTをコー
ドするポリヌクレオチドと相補的ポリヌクレオチドの断片を含み、最適条件下で
特定の遺伝子や条件を識別するべく利用される。また、オリゴマーは、やや緩い
ストリンジェント条件下で、近縁のDNA或いはRNA配列の検出、定量、或いはその
両方のため用いることが可能である。

【０２０３】 或る態様において、FLEXHTをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌ
クレオチドプライマーを用いて単一ヌクレオチド多形性（SNP）を検出し得る。S
NPは、多くの場合にヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となるような置換、
挿入及び欠失である。限定するものではないがSNPの検出方法には、制限酵素切
断法（SSCP）及び蛍光SSCP（fSSCP）がある。SSCPでは、FLEXHTをコードするポ
リヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラー
ゼ連鎖反応法（PCR）を用いたDNAの増幅を行う。DNAは例えば、病変組織または
正常組織、生検サンプル、体液その他に由来し得る。DNA内のSNPは、一本鎖形状
のPCR産物の２次及び３次構造に差異を生じさせる。差異は非変性ゲル中でのゲ
ル電気泳動法を用いて検出可能である。fSCCPでは、オリゴヌクレオチドプライ
マーを蛍光性に標識する。それによってDNAシークエンシング機などのハイスル
ープット機器でアンプリマー（amplimer）の検出が可能になる。更に、インシリ
コSNP（in silico SNP, isSNP）と呼ばれる配列データベース分析法は、一般的
なコンセンサス配列に配列されるような個々の重畳するDNA断片の配列を比較す
ることにより、多形性を同定し得る。これらのコンピュータベースの方法は、DN
Aの実験室での調整及び統計モデル及びDNA配列クロマトグラムの自動分析を用い
たシークエンシングのエラーに起因する配列の変異をフィルタリングして除去す
る。別の態様では、例えばハイスループットMASSARRAYシステム（Sequenom, Inc
., San Diego CA）を用いた質量分析によりSNPを検出し、特徴付ける。

【０２０４】 FLEXHTの発現を定量するために用い得る方法には、ヌクレオチドの放射標識ま
たはビオチン標識、調節核酸の相互増幅（coamplification）及び標準曲線から
得た結果の補間もある（Melby, P.C.ら (1993) J. Immunol. Methods, 159:235-
244、Duplaa, C.ら (1993) Anal. Biochem. 212:229-236等を参照）。目的のオ
リゴマーが種々の希釈液中に存在し、分光光度法または非色応答によって定量が
迅速になるようなハイスループットフォーマットのアッセイを行うことによって
、複数のサンプルの定量速度を加速することができる。

【０２０５】 ポリヌクレオチドはまた、例えばサンプルのDNAの制限断片長多型（RFLP）パ
ターンを個々のDNAのRFLPパターンに一致させることにより、微小生物サンプル
に基づき個々を同定するのに有用である。本発明のポリヌクレオチドを用いて、
個々のゲノムの選択された部分の実際の塩基毎（base-by-base）DNA配列を決定
することもできる。そのように選択され、次にシークエンシングされ得るような
DNAを増幅及び単離するために、このDNA配列を用いてPCRプライマーを調製する
ことができる。この技術を用いて、独特のDNA配列の組を介して個体を同定し得
る。ひとたび個体に独特のIDデータベースが確立されると、個体の陽性同定は非
常に小さな組織サンプルからなし得る。

【０２０６】 DNAベースの同定技術は、法医学技術において重大な意味を持つ。髪、皮膚な
どの組織または体液（例えば血液、唾液、精液など）などの非常に小さな生物学
的サンプルから採取したDNA配列を例えばPCRを用いて増幅して、個体を同定する
ことができる（Erlich, H. (1992) PCR Technology, Freeman and Co., New Yor
k NY等を参照）。同様に、本発明のポリヌクレオチドを多形性マーカーとしても
用いることができる。

【０２０７】 特定の組織の源を同定可能な試薬に対する需要もある。適切な試薬は、例えば
特定の組織に特異的である本発明の配列から調製したDNAプローブまたはプライ
マーを有し得る。このような試薬のパネルは、種及び／または器官タイプにより
組織を同定し得る。同様の方法で、これらの試薬を用いて、組織培養液を汚染に
対してスクリーニングし得る。

【０２０８】 本発明のポリヌクレオチドはまた、核酸ゲルまたはサザンブロットにおける分
子量マーカーとしても用いることができ、サブトラクションしたcDNAライブラリ
の生成時における特定の細胞タイプでの特定mRNAの存在に対する診断プローブと
しても用いることができ、免疫反応を誘発する抗原としても用いることができる
。サブトラクションしたcDNAライブラリは、新規なポリヌクレオチドの発見に役
立ち、アレイまたはその他の担体に固定するためのオリゴマーの選択及び合成に
役立つ。

【０２０９】 更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来の
オリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、マイクロアレイにおける標的として
用いることができる。多数の遺伝子の関連発現レベルを同時にモニターする転写
イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。これについては
、米国特許第5,840,484号のSeilhamer, J.J. らの"Comparative Gene Transcrip
t Analysis"に記載されており、この引用を以って本明細書の一部となす。マイ
クロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異及び多形性の同定に用いることができ
る。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し
、疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病の進行／後退をモニターし、疾
病治療における薬剤の活性を開発及びモニターすることができる。特に、患者に
とって最もふさわしく、有効的な治療法を選択するために、この情報を用いて患
者の薬理ゲノムプロフィールを開発することができる。例えば、患者の薬理ゲノ
ムプロフィールに基づき、患者に対して高度に有効的で副作用を殆ど示さない治
療薬を選択することができる。

【０２１０】 別の実施例では、FLEXHTに特異的な抗体、FLEXHTまたはその断片をマイクロア
レイ上で要素として用いることができる。マイクロアレイを用いて、上記のよう
なタンパク質−タンパク質相互作用、薬剤−標的相互作用及び遺伝子発現プロフ
ィールをモニターまたは測定することが可能である。

【０２１１】 マイクロアレイは、当分野でよく知られている方法を用いて調製し、使用し、
そして分析する（Brennan, T.M. ら (1995) の米国特許第5,474,796号、Schena,
M. ら (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619、Baldeschweiler
らの (1995) PCT出願第WO95/251116号、Shalon, D.らの (1995) PCT出願第WO95/
35505号、Heller, R.A. ら (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2155
、Heller, M.J. らの (1997) 米国特許第5,605,662号等を参照）。様々なタイプ
のマイクロアレイが公知であり、詳細については、DNA Microarrays: A Practic al Approach , M. Schena, ed. (1999) Oxford University Press, Londonに記載
されている。該文献は、特別に引用することを以って本明細書の一部となす。

【０２１２】 本発明の別の実施例では、天然のゲノム配列をマッピングする際に有効なハイ
ブリダイゼーションプローブを産出するため、FLEXHTをコードする核酸配列を用
いることが可能である。コード配列または非コード配列のいずれかを用いること
ができ、或る例では、コード配列全体で非コード配列が好ましい。例えば、多重
遺伝子ファミリーのメンバー内でのコード配列の保存により、染色体マッピング
中に望ましくないクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。核酸配
列は、特定の染色体、染色体の特定領域または人工形成の染色体、例えば、ヒト
人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、細菌P1
産物、或いは単一染色体cDNAライブラリに対してマッピングされる（Harrington
, J.J. ら (1997) Nat Genet. 15:345-355、Price, C.M. (1993) Blood Rev. 7:
127-134、Trask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:149-154等を参照）。一度マッ
ピングすると、本発明の核酸配列を用いて例えば病状の遺伝を特定の染色体領域
の遺伝または制限断片長多型（RFLP）と相関させるような遺伝子連鎖地図を発生
させ得る。

【０２１３】 蛍光原位置ハイブリッド形成法（FISH）は、他の物理的及び遺伝地図データと
相関し得る（前出のHeinz-Ulrich, ら (1995) in Meyers, pp. 965-968.等を参
照）。遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはOnline Mendelian Inher
itance in Man（OMIM）のウェブサイトに見ることができる。物理的染色体地図
上のFLEXHTをコードする遺伝子の位置と特定の疾患との相関性或いは特定の疾患
に対する素因は、その疾患に関係するDNAの領域を画定するのに役立ち得るもの
であり、従って更に位置クローニングする試みとなり得る。

【０２１４】 確定した染色体マーカーを用いた結合分析等の物理的マッピング技術及び染色
体標本原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。
例えばマウスなどの別の哺乳動物の染色体上に遺伝子を配置することにより、特
定のヒト染色体の数或いはアームが分かっていない場合でも関連するマーカーを
明らかにし得る。この情報は、位置クローニングその他の遺伝子発見技術を用い
て遺伝的疾患を調査する研究者にとって価値がある。疾患または症候群が、血管
拡張性失調症の11q22-23領域等、特定の遺伝子領域への遺伝的結合によって大ま
かに位置決めがなされると、該領域に対するいかなるマッピングも、更なる調査
のための関連遺伝子或いは調節遺伝子を表すことができる（Gatti, R.A.ら (198
8) Nature 336:577-580等を参照）。転座、反転等に起因する、健常者、保有者
、感染者の三者間における染色体位置の相違を発見するために本発明のヌクレオ
チド配列を用いてもよい。

【０２１５】 本発明の別の実施例では、種々の薬剤スクリーニング技術を以って化合物のラ
イブラリをスクリーニングするために、FLEXHT、FLEXHTの触媒作用断片、免疫原
断片、またはそのオリゴペプチドを用いることができる。薬剤スクリーニングに
用いる断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持物に固定されるか、細胞表面
上に保持されるか、細胞内に位置することになろう。FLEXHTとテストされる薬剤
との結合複合の形成は計測できる。

【０２１６】 別の薬剤スクリーニング方法は、目的のタンパク質に対して好適な結合親和性
を有する化合物を高い処理能力でスクリーニングするために用いられる（Geysen
,らの (1984) PCT出願番号 WO84/03564等を参照）。この方法においては、多数
の異なる小さな試験用化合物を固体基質上で合成する。試験用化合物は、FLEXHT
或いはその断片と反応させ、洗浄する。次に、当分野でよく知られている方法で
、結合したFLEXHTを検出する。精製したFLEXHTはまた、上記した薬剤のスクリー
ニング技術において用いるプレート上で直接コーティングすることもできる。別
法では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物に固定す
ることもできる。

【０２１７】 別の実施例では、競合薬スクリーニングアッセイを用いることができる。この
アッセイでは、FLEXHTを結合することができる中和抗体が、FLEXHTを結合するた
めの試験化合物と特異的に競合する。この方法では、抗体が、１若しくは数個の
抗原決定因子をFLEXHTと共有するペプチドの存在を検出する。

【０２１８】 別の実施例では、新規技術が現在知られているヌクレオチド配列の特性（限定
するものではないがトリプレット遺伝暗号及び特異的塩基対の相互作用等を含む
）に依存するのであれば、依然として発展すべきいかなる分子生物学技術におい
ても、FLEXHTをコードするヌクレオチド配列を用いることができる。

【０２１９】 更に詳細説明をしなくとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大
限に利用できるであろう。従って、これ以下に記載する実施例は単なる例示目的
にすぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。

【０２２０】 本明細書において開示した全ての特許、特許出願及び刊行物、特に米国特許第
09/311,894号、同第09/311,940号、同第09/311,937号は、言及することをもって
本明細書の一部となす。

【０２２１】 （実施例） １ cDNAライブラリの作製 RNAは、Clontech社から購入し、或いは表４に列記した組織から単離した。ホ
モジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解した組織もあり、
また、ホモジナイズしてフェノールまたは好適な変性剤の混合液に溶解した組織
もある。変性剤の混合液は、例えばフェノールとグアニジニウムイソチオシアネ
ートの単相溶液であるTRIZOL（Life Technologies）等である。結果として得ら
れた溶解物は、塩化セシウムにおいて遠心分離するかクロロホルムで抽出した。
イソプロパノールか、酢酸ナトリウムとエタノールか、いずれか一方、或いは別
の方法を用いて、溶解物からRNAを沈殿させた。

【０２２２】 RNAの純度を高めるため、RNAのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰
り返した。場合によっては、DNアーゼでRNAを処理した。殆どのライブラリでは
、オリゴd(T)連結常磁性粒子（Promega）、OLIGOTEXラテックス粒子（QIAGEN, V
alencia CA）またはOLIGOTEX mRNA精製キット（QIAGEN）を用いて、ポリ(A+) RN
Aを単離した。別法では、別のRNA単離キット、例えばPOLY(A)PURE mRNA精製キッ
ト（Ambion, Austin TX）を用いて組織溶解物からRNAを直接単離した。

【０２２３】 場合によってはStratagene社へのRNA提供を行い、対応するcDNAライブラリをS
tratagene社が作製することもあった。そうでない場合は、当分野で公知の推奨
方法または類似の方法を用いて、UNIZAPベクターシステム（Stratagene）または
SUPERSCRIPTプラスミドシステム（Life Technologies）を用いてcDNAを合成し、
cDNAライブラリを作製した。（前出のAusubel, 1997, unit 5.1-6.6等を参照。
）逆転写は、オリゴd(T)またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリ
ゴヌクレオチドアダプターを二本鎖cDNAに連結反応させ、好適な制限酵素でcDNA
を消化した。殆どのライブラリに対して、cDNAのサイズ（３００〜１０００bp）
選択は、SEPHACRYL S1000、SEPHAROSE CL2BまたはSEPHAROSE CL4Bカラムクロマ
トグラフィー（Amersham Pharmacia Biotech）、或いは調製用アガロースゲル電
気泳動法を用いて行った。cDNAは、好適なプラスミドのポリリンカーの適合性制
限酵素部位に連結反応させた。好適なプラスミドは、例えばPBLUESCRIPTプラス
ミド（Stratagene）、pSPORT1プラスミド（Life Technologies）またはplNCY（I
ncyte Pharmaceuticals, Palo Alto CA）等である。組換えプラスミドは、Strat
agene社のXL1-Blue、XL1-BIueMRFまたはSOLR、或いはLife Technologies社のDH5
α、DH10BまたはELECTROMAX DH10Bを含むコンピテント大腸菌細胞に形質転換し
た。

【０２２４】 ２ cDNAクローンの単離 UNIZAPベクターシステム（Stratagene）を用いたin vivo切除によって、或い
は細胞溶解によって、プラスミドを宿主細胞から回収した。MagicまたはWIZARD
Minipreps DNA精製システム（Promega）、AGTC Miniprep精製キット（Edge Bios
ystems, Gaithersburg MD）、QIAGEN社のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus P
lasmid及びQIAWELL 8 Ultra Plasmid 精製システム、R.E.A.L. Prep 96プラスミ
ドキットの中から少なくとも１つを用いて、プラスミドを精製した。沈殿させた
後、０.１mlの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥せずに、４℃
で保管した。

【０２２５】 別法では、ハイスループットフォーマットにおいて直接結合PCR法を用いて宿
主細胞溶解物からプラスミドDNAを増幅した（Rao, V.B. (1994) Anal. Biochem.
216:1-14）。宿主細胞の溶解及び熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で
行った。サンプルを処理し、それを384穴プレート内で保管し、増幅したプラス
ミドDNAの濃度をPICOGREEN色素（Molecular Probes, Eugene OR）及びFluoroska
n II蛍光スキャナ（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）を用いて蛍光分析的に
定量した。

【０２２６】 ３ シークエンシング及び分析 cDNAのシークエンス反応は、標準的方法或いはハイスループット装置、例えば
ABI CATALYST 800 サーマルサイクラー（Perkin-Elmer）またはPTC-200 サーマ
ルサイクラー（MJ Research）をHYDRAマイクロディスペンサー（Robbins Scient
ific）またはMICROLAB 2200（Hamilton）液体転移システムと併用して処理した
。cDNAのシークエンス反応は、Amersham Pharmacia Biotech社が提供する試薬ま
たはABIシークエンシングキット、例えばABI PRISM BIGDYE Terminator cycle s
equencing ready reaction kit（Perkin-Elmer）に与えられた試薬を用いて準備
した。cDNAのシークエンス反応の電気泳動的分離及び標識したポリヌクレオチド
の検出には、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Molecular Dynamic
s）か、標準ABIプロトコル及び塩基対呼び出しソフトウェアを用いるABI PRISM
373または377シークエンシングシステム（Perkin-Elmer）か、或いはその他の当
分野でよく知られている配列解析システムを用いた。cDNA配列内のリーディング
フレームは、標準的方法（前出のAusubel, 1997, unit 7.7に概説）を用いて決
定した。cDNA配列の幾つかを選択して、実施例５に記載した方法で配列を伸長さ
せた。

【０２２７】 cDNA配列に由来するポリヌクレオチド配列は、当業者によく知られたアルゴリ
ズムを利用するソフトウェアの組合せを用いて構築し、解析した。利用したツー
ル、プログラム及びアルゴリズムの概略、適用可能な説明、引用文献、閾値パラ
メータを表６に示す。用いたツール、プログラム及びアルゴリズムを表６の列１
に、それらの簡単な説明を列２に示す。列３は好適な引用文献であり、全ての文
献はそっくりそのまま引用を以って本明細書の一部となす。適用可能な場合には
、列４は２つの配列が一致する強さを評価するために用いたスコア、確率値その
他のパラメータを示す（スコアが高ければ高いほど２配列間の相同性が高くなる
）。配列の解析は、MACDNASIS PROソフトウェア（日立ソフトウェアエンジニア
リング, South San Francisco CA）及びLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用
いて行った。

【０２２８】 ポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカー及びポリA配列を除去すること
により、またあいまいな塩基対をマスクすることによって有効性を確認した。そ
の際、BLAST、動的プログラミング、及び隣接ジヌクレオチド頻度分析に基づく
アルゴリズム及びプログラムを用いた。次に、BLAST、FASTA及びBLIMPSに基づく
プログラムを用いて、プログラム中の注釈を得るべく、公共のデータベース、例
えばGenBankの霊長類及びげっ歯類、哺乳動物、脊椎動物、真核生物のデータベ
ースと、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM及びPFAMの選択に対する配列を問い合わ
せした。配列はPhred、Phrap及びConsedに基づくプログラムを用いて完全長のポ
リヌクレオチド配列に構築し、GenMark、BLAST及びFASTAに基づくプログラムを
用いてオープンリーディングフレームに対してスクリーニングした。対応する完
全長アミノ酸配列を誘導するべく完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳し、その後
、GenBankデータベース（上記）、SwissProt、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM及
びProsite等のデータベース、PFAM等のHidden Markov Model（HMM）ベースのタ
ンパク質ファミリーデータベースに対する問合せによって完全長配列を分析した
。HMMは、遺伝子ファミリーのコンセンサス１次構造を解析する確率的アプロー
チである（Eddy, S.R. (1996) Curr. Opin. Struct. Biol. 6:361-365等を参照
）。

【０２２９】 完全長ポリヌクレオチド及びアミノ酸配列の構築及び分析に用いる上記のプロ
グラムは、配列番号５６乃至１１０からのポリヌクレオチド配列の断片を同定す
るためにも使用できる。ハイブリダイゼーション及び増幅に有用な約２０〜約４
０００のヌクレオチドの断片は、上記「発明」の項で説明した。

【０２３０】 ４ ポリヌクレオチド発現の分析 ノーザン分析は、転写された遺伝情報の存在を検出するために用いられる実験
技術であり、標識されたヌクレオチド配列の、特定の細胞種または組織からのRN
Aが結合される膜へのハイブリダイゼーションに関与している。（前出のSambroo
k, 7章、同Ausubel. F.M. ら, 4章及び16章等を参照。） BLASTに適用する類似のコンピュータ技術を用いて、GenBankやLifeSeq（Incyt
e Pharmaceuticals）等のヌクレオチドデータベースにおいて同一または関連分
子を検索する。ノーザン分析は、多数の膜系ハイブリダイゼーションよりも断然
速い。更に、特定の同一を厳密な或いは相同的なものとして分類するか否かを決
定するため、コンピュータ検索の感度を変更することができる。検索の基準はプ
ロダクトスコアであり、次式で定義される。

【０２３１】

【数１】

【０２３２】 プロダクトスコアは、２つの配列間の類似度及び配列が一致する長さの両方を考
慮している。プロダクトスコアは、０〜１００の規準化された値であり、次のよ
うにして求める。BLASTスコアにヌクレオチドの配列一致率を乗じ、その積を２
つの配列の短い方の長さの５倍で除する。高スコアリングセグメント対（HSP）
に一致する各塩基に＋５のスコアを割り当て、各不適性塩基対に−４を割り当て
ることにより、BLASTスコアを計算する。２つの配列は、２以上のHSPを共有し得
る（ギャップにより離隔され得る）。２以上のHSPがある場合には、最高BLASTス
コアの塩基対を用いてプロダクトスコアを計算する。プロダクトスコアは、断片
的重畳とBLASTアラインメントの質とのバランスを表す。例えばプロダクトスコ
ア１００は、比較した２つの配列の短い方の長さ全体にわたって１００％一致す
る場合のみ得られる。プロダクトスコア７０は、一端が１００％一致し、７０％
重畳しているか、他端が８８％一致し、１００％重畳しているかのいずれかの場
合に得られる。プロダクトスコア５０は、一端が１００％一致し、５０％重畳し
ているか、他端が７９％一致し、１００％重畳しているかのいずれかの場合に得
られる。

【０２３３】 ノーザン分析の結果は、FLEXHTをコードする転写物が作出されたライブラリの
分布パーセンテージとして報告される。分析は、器官／組織及び疾患によるcDNA
ライブラリのカテゴリー分類に関与している。器官／組織のカテゴリーには、心
血管、皮膚、発生、内分泌、胃腸、造血／免疫、筋骨格、神経、生殖及び泌尿器
がある。疾患／病状のカテゴリーには、癌、炎症、外傷、細胞増殖、神経、貯留
（pooled）が含まれる。カテゴリー毎に目的の配列を発現するライブラリ数を数
え、それを全カテゴリーのライブラリ数で除した。組織特異発現及び疾患／病状
特異発現のパーセント値を表３に示す。

【０２３４】 ５ ポリヌクレオチドをコードするFLEXHTの伸長 配列番号５６乃至１１０の完全長の核酸配列は、完全長分子の適切な断片から
設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて該断片を伸長させて生成した。
一方のプライマーは既知の断片の５'伸長を開始するべく合成し、他方のプライ
マーは既知の断片の３'伸長を開始するべく合成した。開始プライマーの設計は
、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、GC含有率が５０％以上となり、約６８〜７
２℃の温度で標的配列にアニーリングするように、OLIGO 4.06ソフトウェア（Na
tional Biosciences）或いは別の適切なプログラムを用いて、cDNAから設計した
。ヘアピン構造及びプライマー-プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチド
の伸長は全て回避した。

【０２３５】 配列を伸長するために、選択されたヒトcDNAライブラリを用いた。２段階以上
の伸長が必要または望ましい場合には、付加的プライマー或いはプライマーのネ
ステッドセットを設計した。

【０２３６】 高忠実度の増幅が、当業者によく知られている方法を利用したPCR法によって
得られた。PCRは、PTC-200 サーマルサイクラー（MJ Research, Inc.）を用いて
96穴プレート内で行った。反応混合液には、DNA鋳型、各プライマー２００nmol
と、Mg²⁺、(NH₄)₂SO₄ 及びβ-メルカプトエタノールを含む反応バッファと、Taq
DNAポリメラーゼ（Amersham Pharmacia Biotech）と、ELONGASE酵素（Life Tec
hnologies）と、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）が含まれていた。プライマ
ー対PCI A、PCI Bに対して用いたパラメータは次の通りである。 ステップ１： ９４℃で３分間 ステップ２： ９４℃で１５秒 ステップ３： ６０℃で１分間 ステップ４： ６８℃で２分間 ステップ５： ステップ２、３、４を２０回繰り返す ステップ６： ６８℃で５分間 ステップ７： ４℃で保存 プライマー対T7、SK+に対しては、上記パラメータに代えて以下のパラメータを
用いた。 ステップ１： ９４℃で３分間 ステップ２： ９４℃で１５秒 ステップ３： ５７℃で１分間 ステップ４： ６８℃で２分間 ステップ５： ステップ２、３、４を２０回繰り返す ステップ６： ６８℃で５分間 ステップ７： ４℃で保存 1X TEに溶解したPICOGREEN定量試薬（０.２５％(v/v) PICOGREEN、Molecular
Probes, Eugene OR）１００μlと、希釈していないPCR産物０.５μlとを不透明
な蛍光光度計プレート（Coming Costar, Acton MA）の各穴に分配し、DNAを試薬
と結合可能なようにさせることによって各穴内のDNA濃度の測定を行った。サン
プルの蛍光を計測してDNAの濃度を定量するべくプレートをFluoroskan II （Lab
systems Oy, Helsinki, Finland）でスキャンした。反応混合物のアリコート５
〜１０μlを１％アガロースミニゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応
が配列の伸長に成功したかを決定した。

【０２３７】 伸長させたヌクレオチドは、脱塩及び濃縮して384穴プレートに移し、CviJIコ
レラウイルスエンドヌクレアーゼ（Molecular Biology Research, Madison WI）
を用いて消化し、pUC 18ベクター（Amersham Pharmacia Biotech）への再連結反
応前に音波処理またはせん断した。ショットガン・シークエンシングのために、
消化したヌクレオチドを低濃度（０.６〜０.８％）のアガロースゲル上で分離し
、断片を切除し、寒天をAgar ACE（Promega）で消化した。伸長させたクローン
をT4リガーゼ（New England Biolabs, Beverly MA）を用いてpUC 18ベクター（A
mersham Pharmacia Biotech）に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）
で処理して制限部位の張出部（overhang）を満たし、コンピテント大腸菌細胞に
形質移入した。形質移入した細胞を抗生物質含有培地上で選択し、個々のコロニ
ーを選択してLB/2x carb液体培地の384穴プレート内において３７℃で一晩培養
した。

【０２３８】 細胞を溶解し、Taq DNAポリメラーゼ（Amersham Pharmacia Biotech）及びPfu
DNAポリメラーゼ（Stratagene）を用いてPCRによってDNAを増幅した。その際用
いたパラメータは次の通りである。 ステップ１： ９４℃で３分間 ステップ２： ９４℃で１５秒 ステップ３： ６０℃で１分間 ステップ４： ７２℃で２分間 ステップ５： ステップ２、３、４を２９回繰り返す ステップ６： ７２℃で５分間 ステップ７： ４℃で保存 DNAは、上記のPICOGREEN試薬（Molecular Probes）によって定量した。DNAの回
収率が低いサンプルは、上記と同一の条件を用いて再増幅した。サンプルは２０
％ジメチルスルホキシド（１：２, v/v）で希釈し、DYENAMIC energy transfer
sequencing primer及びDYENAMIC DIRECT kit（Amersham Pharmacia Biotech）ま
たはABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit（Per
kin-Elmer）を用いてシークエンシングした。

【０２３９】 同様に、上記手順と、伸長のために設計されたオリゴヌクレオチドと、適切な
ゲノムライブラリを用いて、５'調節配列を得るべく、配列番号５６乃至１１０
のヌクレオチド配列が用いられる。

【０２４０】 ６ 個々のハイブリダイゼーションの標識及び使用 配列番号５６乃至１１０から得たハイブリダイゼーションプローブを利用して
、cDNA、ゲノムDNAまたはmRNAをスクリーニングする。約２０塩基対からなるオ
リゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片
に対しても事実上同一の手順が用いられる。オリゴヌクレオチドは、OLIGO 4.06
ソフトウェア（National Biosciences）等の最新ソフトウェアを用いて設計し、
各オリゴマー５０pmolと、[γ-³²P]アデノシン３リン酸 （Amersham Pharmacia
Biotech）２５０μCiと、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN, Boston MA
）を結合することにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、SEPHADEX G
-25超細繊分子サイズ排除デキストランビードカラム（Amersham Pharmacia Biot
ech）を用いて実質的に精製する。 Ase I、Bgl II、Eco RI、Pst I、Xba1またはPvu II（DuPont NEN）のいずれか１
つのエンドヌクレアーゼで消化されたヒトゲノムDNAの典型的な膜ベースのハイ
ブリダイゼーション解析において、毎分１０⁷カウントの標識されたプローブを
含むアリコットを用いる。

【０２４１】 各消化物から得たDNAは、０.７％アガロースゲル上で分画してナイロン膜（Ny
tran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に移す。ハイブリダイゼーショ
ンは、４０℃で１６時間行う。非特異的シグナルを除去するため、例えば０.１x
クエン酸ナトリウム食塩水及び０.５％ドデシル硫酸ナトリウムに一致する条件
下で、ブロットを室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに代
わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、比
較する。

【０２４２】 ７ 転写イメージ分析 転写イメージの作成は、Seilhamer, J.J. らの米国特許第5,840,484号"Compar
ative Gene Transcript Analysis"に記載されているように行う。該特許の引用
を以って本明細書の一部となす。

【０２４３】 ８ マイクロアレイ マイクロアレイの表面上でアレイエレメントの連鎖または合成は、フォトリソ
グラフィ、圧電印刷（インクジェット印刷、前出のBaldeschweiler等を参照）、
機械的マイクロスポッティング技術及びこれらから派生したものを用いて達成す
ることが可能である。上記各技術において基質は、均一且つ非多孔性の固体とす
るべきである（Schena (1999).前出）。推奨する基質には、シリコン、シリカ、
スライドガラス、ガラスチップ及びシリコンウエハがある。或いは、ドットブロ
ット法またはスロットブロット法に類似のアレイを利用して、熱的、紫外線的、
化学的または機械的結合手順を用いて基質の表面にエレメントを配置及び結合さ
せてもよい。通常のアレイは、手作業で、または利用可能な方法や機械を用いて
作製でき、任意の適正数のエレメントを有し得る（Schena, M. ら (1995) Scien
ce 270:467-470、Shalon. D. ら (1996) Genome Res. 6:639-645、Marshall, A.
and J. Hodgson (1998) Nat. Biotechnol. 16:27-31.を参照）。

【０２４４】 完全長cDNA、発現遺伝子配列断片（EST）、またはその断片またはオリゴマー
は、マイクロアレイのエレメントを構成し得る。ハイブリダイゼーションに好適
な断片またはオリゴマーを、LASERGENEソフトウェア（DNASTAR）等の当分野で公
知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。アレイエレメントは、生
物学的サンプル中でポリヌクレオチドを用いてハイブリダイズされる。生物学的
サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識またはその
他の分子タグに接合される。ハイブリダイゼーション後、生物学的サンプルから
ハイブリダイズされていないヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各ア
レイエレメントにおいてハイブリダイゼーションを検出する。或いは、レーザ脱
着及び質量スペクトロメトリを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。
マイクロアレイ上のエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの相補
性の度合及び相対存在度は、算定し得る。一実施例におけるマイクロアレイの調
整及び使用について、以下に詳述する。

【０２４５】 組織または細胞サンプルの準備 グアニジウムチオシアネート法を用いて組織サンプルから全RNAを単離し、オ
リゴ(dT)セルロース法を用いてポリ(A)⁺RNAを精製する。各ポリ(A)⁺RNAサンプル
は、MMLV逆転写酵素、０.０５ pg/μlのオリゴ(dT)プライマー（21mer）、１×
第１鎖バッファ、０.０３unit/μlのRNアーゼインヒビター、５００μMのdATP、
５００μMのdGTP、５００μMのdTTP、４０μMのdCTP、４０μMのdCTP-Cy3（BDS
）またはdCTP-Cy5（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて逆転写する。逆転写
反応は、GEMBRIGHTキット（Incyte）を用いてポリ(A)⁺RNA含有の25体積ml内で行
う。特異制御ポリ(A)⁺RNAは、３７０℃で２時間インキュベートした後、in vitr o 転写により非コード酵母ゲノムDNAから合成する。各反応サンプル（１つはCy3
、もう１つはCy5標識）は、２.５mlの０.５M水酸化ナトリウムで処理し、８５０
℃で２０分間インキュベートし、反応を停止させてRNAを減成する。サンプルは
、２つの連続するCHROMA SPIN 30ゲル濾過スピンカラム（CLONTECH Laboratorie
s, Inc. (CLONTECH), Palo Alto CA）を用いて精製する。結合後、２つの反応サ
ンプルは、１mlのグリコーゲン（１mg/ml）を用いて析出させたエタノール、６
０mlの酢酸ナトリウム及び３００mlの１００％エタノールである。サンプルは次
に、SpeedVAC（Savant Instruments Inc., Holbrook NY）を用いて乾燥して仕上
げ、１４μlの５×SSC／０.２％SDS中で再懸濁する。

【０２４６】 マイクロアレイの準備 本発明の配列を用いて、アレイエレメントを生成する。各アレイエレメントは
、クローン化cDNAインサートによりベクター含有細菌性細胞から増幅する。PCR
増幅は、cDNAインサートの側面に位置するベクター配列に相補的なプライマーを
用いる。３０サイクルのPCRで１〜２ngの初期量から５μgより大きい最終量まで
アレイエレメントを増幅する。増幅されたアレイエレメントは、SEPHACRYL-400
（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて精製される。

【０２４７】 精製したアレイエレメントは、ポリマーコートされたスライドガラス上に固定
する。顕微鏡スライドガラス（Corning）は、処理中及び処理後に大量の蒸留水
洗液を用いて０.１％のSDS及びアセトン中で超音波により洗浄する。スライドガ
ラスは、４％フッ化水素酸（VWR Scientific Products Corporation (VWR), Wes
t Chester PA）中でエッチングし、蒸留水中で広範囲にわたって洗浄し、９５％
エタノール中で０.０５％アミノプロピルシラン（Sigma）を用いてコーティング
する。コーティングしたスライドガラスは、１１０℃の天火で硬化させる。

【０２４８】 米国特許第5,807,522号で説明されている方法を用いて、コーティングしたガ
ラス基板にアレイエレメントを付加する。該特許は、引用を以って本明細書の一
部となす。平均濃度が１００ng/μlのアレイエレメントDNA１μlを高速ロボット
装置により開口キャピラリープリントエレメントに充填する。装置はここで、ス
ライド毎に約５nlのアレイエレメントサンプルをデポジットする。

【０２４９】 マイクロアレイには、STRATALINKER ＵＶ架橋剤（Stratagene）を用いてＵＶ
架橋する。マイクロアレイは、室温において０.２％SDSで１度洗浄し、蒸留水で
３度洗浄する。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)（Tropix, Inc., Bedford MA）中の
０.２％カゼイン中において６０℃で３０分間マイクロアレイをインキュベート
した後、前に行ったように０.２％SDS及び蒸留水で洗浄することにより、非特異
結合部位をブロックする。

【０２５０】 ハイブリダイゼーション ハイブリダイゼーション反応は、５×SSC,０.２％SDSハイブリダイゼーション
緩衝液中のCy3及びCy5標識したcDNA合成産物を各０.２μg含む９μlのサンプル
混合体を有する。サンプル混合体は、６５℃まで５分間加熱し、マイクロアレイ
表面上で等分して１.８cm² のカバーガラスで覆う。アレイは、顕微鏡スライド
より僅かに大きいキャビティを有する防水チェンバーに移行させる。チェンバー
のコーナーに１４０μlの５×SSCを加えることにより、チェンバー内部を湿度10
0%に保持する。アレイを含むチェンバーは、６０℃で約６．５時間インキュベー
トする。アレイは、第１洗浄緩衝液中（１×SSC,０.１％SDS）において４５℃で
１０分間洗浄し、第２洗浄緩衝液中（０.１×SSC）において４５℃で１０分間各
々３度洗浄して乾燥させる。

【０２５１】 検出 レポーター標識ハイブリダイゼーション複合体は、Cy3の励起のためには４８
８nm、Cy3の励起のためには６３２nmでスペクトル線を生成し得るInnova 70混合
ガス10 Wレーザ（Coherent, Inc., Santa Clara CA）を備えた顕微鏡で検出する
。２０×顕微鏡対物レンズ（Nikon, Inc., Melville NY）を用いて、アレイ上に
励起レーザ光を集中させる。アレイを含むスライドを顕微鏡のコンピュータ制御
X-Yステージに置き、対物レンズを通過してラスタスキャンする。本実施例で用
いた１.８cm×１.８cmのアレイは、２０μmの解像度でスキャンした。

【０２５２】 ２つの異なるスキャンのうち、混合ガスマルチラインレーザは２つの蛍光体を
連続的に励起する。放射された光は、２つの蛍光体に応じて波長に基づき２つの
光電子増倍管検出器（PMT R1477, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater
NJ）に分割される。アレイと光電子増倍管間に設置された好適なフィルターを用
いて、シグナルをフィルタリングする。用いる蛍光体の最大発光は、Cy3では５
６５nm、Cy5では６５０nmである。装置は両方の蛍光体からのスペクトルを同時
に記録し得るが、レーザ源において好適なフィルターを用いて各アレイを通常２
度スキャンし、蛍光体１つにつき１度スキャンする。

【０２５３】 スキャンの感度は通常、既知濃度のサンプル混合体に添加されるcDNA制御種に
より生成されるシグナル強度を用いて較正する。アレイ上の特定の位置には相補
的DNA配列が含まれ、その位置におけるシグナルの強度をハイブリダイジング種
の重量比1：100,000に相関させる。異なる源（例えば試験及び制御細胞を表す）
からの２つのサンプルを、各々異なる蛍光体で標識し、他と異なって発現した遺
伝子を同定するために単一のアレイにハイブリダイズする場合には、２つの蛍光
体を有する較正cDNAの標識サンプルにより較正し、ハイブリダイゼーション混合
体に各々等量を加える。

【０２５４】 光電子増倍管の出力は、IBMコンパチブルPCコンピュータにインストールされ
た１２ビットRTI-835Hアナログ−ディジタル（AID）変換ボード（Analog Device
s, Inc., Norwood MA）を用いてディジタル化される。ディジタル化されたデー
タは、青色（低シグナル）から赤色（高シグナル）までの擬似カラー範囲へのリ
ニア２０色変換を用いてシグナル強度がマッピングされたようなイメージとして
表示される。データは、定量的にも分析される。２つの異なる蛍光体を同時に励
起及び測定する場合には、各蛍光体の発光スペクトルを用いて、データは先ず蛍
光体と蛍光体の間の光学磁気プリンティング（発光スペクトルの重畳に起因する
）に集められる。

【０２５５】 グリッドは蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットから
のシグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグ
ナルは統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に
用いるソフトウェアは、GEMTOOLS遺伝子発現分析プログラム（Incyte）である。

【０２５６】 ９ 相補的ポリヌクレオチド FLEXHTをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的配列は、天然の
FLEXHTの発現を検出し、低下させ、または阻害するために用いられる。約１５〜
３０塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さな或
いは大きな配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いることができる。Olig
o4.06ソフトウェア（National Biosciences）、及びFLEXHTをコードする配列を
用いて、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も
独特な５' 配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモー
ターがコーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、FL
EXHTをコードする転写物にリボソームが結合しないように相補的オリゴヌクレオ
チドをデザインする。

【０２５７】 １０ FLEXHTの発現 FLEXHTの発現及び精製は、細菌またはウイルスをベースにした発現系を用いて
行うことができる。細菌でFLEXHTを発現するために、抗生物質耐性及びcDNAの転
写レベルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにcDNAをサブクロ
ーニングする。このようなプロモーターには、lacオペレーター調節エレメント
に関連するT5またはT7バクテリオファージプロモーター及びtrp-lac(tac)ハイブ
リッドプロモーターが含まれるが、これらに限定するものではない。組換えベク
ターを、BL21(DE3)等の好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性をもつ細
菌が、イソプロピルβ-Dチオガラクトピラノシド（IPTG）で誘導されるとFLEXHT
を発現する。真核細胞でのFLEXHTの発現は、一般にバキュロウイルスとして知ら
れているAutographica californica核多面性ウイルス（AcMNPV）を昆虫細胞株ま
たは哺乳動物細胞株に感染させて行う。バキュロウイルスの可欠ポリヘドリン遺
伝子を、相同的組換え、或いは転移プラスミドの仲介に関与する細菌仲介遺伝子
転移のどちらかによって、FLEXHTをコードするcDNAと置換する。ウイルスの感染
力は維持され、強いポリヘドリンプロモーターによって高いレベルのcDNAの転写
が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合はSpodoptera frugiperda
（Sf9）昆虫細胞に感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも用いられること
もある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスの更なる遺伝的変更が必要にな
る。（Engelhard. E. K.ら (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227
、Sandig, V. ら (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945.等を参照）。

【０２５８】 殆どの発現系では、融合タンパク質としてFLEXHTを合成するのに例えばグルタ
チオンSトランスフェラーゼ（GST）またはペプチドエピトープ標識、例えばFLAG
や6-Hisを用いる。これらを用いることにより、未精製細胞溶解物から組換え融
合タンパク質の親和性ベースの精製を迅速に１ステップで行うことができる。GS
Tは日本住血吸虫からの26kDaの酵素であり、タンパク質の活性及び抗原性を維持
した状態で、固定化グルタチオン上で融合タンパク質の精製を可能とする（Amer
sham Pharmacia Biotech）。精製後、GSTの部分を特定の開発部位においてFLEXH
Tからタンパク分解的に切断することが可能である。FLAGは８アミノ酸のペプチ
ドであり、市販されているモノクローナル及びポリクローナル抗FLAG抗体（East
man Kodak）を用いて免疫親和性精製を可能にする。６ヒスチジン残基が連続し
て伸長した6-Hisは、金属キレート樹脂（QIAGEN）上での精製を可能にする。タ
ンパク質の発現及び精製の方法は、前出のAusubel（1995）10章、16章に記載さ
れている。これらの方法で精製したFLEXHTを直接用いて実施例１１及び１２のア
ッセイを行うことができる。

【０２５９】 １１ 機能的アッセイ FLEXHT機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでの
FLEXHTをコードする配列の発現によって評価する。cDNAを、cDNAを高いレベルで
発現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにサブクローニングする
。選り抜きのベクターには、pCMV SPORTプラスミド（Life Technologies）及びp
CR 3.1プラスミド（Invitrogen）が含まれ、どちらもサイトメガロウイルスプロ
モーターを有する。リポソーム製剤或いは電気穿孔法を用いて、５〜１０μgの
組換えベクターをヒト細胞株、例えば内皮由来または造血由来の細胞株に一時的
に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む１〜２μgのプ
ラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入細胞と
非形質移入細胞を区別する手段が与えられる。また、標識タンパク質の発現によ
って、cDNAの組換えベクターからの発現を正確に予想できる。標識タンパク質は
、例えば緑色蛍光タンパク質（GFP；Clontech）、CD64またはCD64-GFP融合タン
パク質から選択できる。自動化された、レーザ光学に基づく技術であるフローサ
イトメトリー（FCM）を用いて、GFPまたはCD64-GFPを発現する形質移入された細
胞を同定し、その細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。FCMは、
細胞死に先行するか或いは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出
して計量する。このような現象として挙げられるのは、プロピジウムヨウ化物に
よるDNA染色によって計測される核DNA内容物の変化、ブロモデオキシウリジンの
取込量の低下によって計測されるDNA合成の下方調節、特異抗体との反応性によ
って計測される細胞表面及び細胞内におけるタンパンク質の発現の変化、及び蛍
光複合アネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜
組成の変化とがある。フローサイトメトリー法については、Ormerod, M. G. (19
94) Flow Cytometry Oxford, New York, NY.に記述がある。

【０２６０】 遺伝子発現におけるFLEXHTの影響は、FLEXHTをコードする配列とCD64またはCD
64-GFPのいずれかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価する
ことができる。CD64またはCD64-GFPは、形質転換された細胞表面で発現し、ヒト
免疫グロブリンG（IgG）の保存領域と結合する。形質転換細胞と非形質転換細胞
は、ヒトIgGまたはCD64に対する抗体（DYNAL, Lake Success. NY）で覆われた磁
気ビーズを用いて有効に分離することができる。mRNAは、当分野で公知の方法で
細胞から精製することができる。FLEXHTその他の目的の遺伝子をコードするmRNA
の発現は、ノーザン分析或いはマイクロアレイ技術で分析することができる。

【０２６１】 １２ FLEXHT特異抗体の産生 ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（PAGE；Harrington, M.G. (1990) Method
s Enzymol. 182:488-495等を参照）または他の精製技術を用いて実質上精製され
たFLEXHTを用いて、標準プロトコルでウサギを免疫化して抗体を産出する。

【０２６２】 或いは、LASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いてFLEXHTアミノ酸配列を解
析し、免疫抗原性の高い領域を決定する。そして対応するオリゴペプチドを合成
し、このオリゴペプチドを用いて当業者によく知られている方法で抗体を生成す
る。適切なエピトープ、例えばＣ末端付近或いは隣接する親水性領域にあるエピ
トープの選択については、当分野で公知である（前出のAusubel, 1995, 11章等
を参照）。

【０２６３】 通常は、長さ約１５残基のオリゴペプチドを、Fmocケミストリを用いるABI 43
1A ペプチドシンセサイザ（Perkin-Elmer）を用いて合成し、N-マレイミドベン
ゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）を用いた反応によってKLH
（Sigma-Aldrich, St. Louis MO）に結合させて、免疫抗原性を高める（前出のA
usubel, 1995 等を参照）。完全フロイントアジュバントにおいてオリゴペプチ
ド-KLM複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性及
び抗FLEXHT活性を検査するには、ペプチドまたはFLEXHTを基質に結合し、１％BS
Aを用いてブロックし、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素
で標識したヤギ抗ウサギIgGと反応させる。

【０２６４】 １３ 特異抗体を用いた天然のFLEXHTの精製 天然または組換えFLEXHTを、FLEXHT特異抗体を用いたイムノアフィニティーク
ロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、抗FL
EXHT抗体を活性化クロマトグラフィー用樹脂、例えばCNBr活性化セファロース（
Amersham Pharmacia Biotech）と共有結合させることにより構築する。結合後に
、製造者の使用説明書に従って樹脂をブロックし、洗浄する。

【０２６５】 FLEXHTを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、FLEXHTを優先的に
吸着する条件下（例えば洗浄剤が存在する高イオン強度バッファ）でカラムを洗
浄する。抗体とFLEXHTの結合を破壊する条件（例えばpH２〜３のバッファ、或い
は尿素またはチオシアン酸塩イオン等の高濃度のカオトロープ剤）でカラムを溶
出させ、FLEXHTを回収する。

【０２６６】 １４ FLEXHTと相互作用する分子の同定 FLEXHTまたは生物学的に活性であるFLEXHT断片を、¹²⁵Iボルトンハンター試薬
で標識する。（Bolton A.E.and W.M. Hunter (1973) Biochem. J. 133:529-539
等を参照。）マルチウェルプレートの穴の中に予め配列しておいた候補分子を、
標識したFLEXHTと共にインキュベートして洗浄し、標識したFLEXHT複合体を有す
る全ての穴をアッセイする。FLEXHT濃度を変えて得たデータを用いて、候補分子
とのFLEXHTの数、親和性及び会合の値を計算する。

【０２６７】 或いは、FLEXHTと相互作用する分子は、Fields, S. 及び O. Song（1989, Nat
ure 340:245-246）に記載されているような酵母２ハイブリッドシステムを用い
て分析するか、またはMATCHMAKERシステム（Clontech）等の２ハイブリッドシス
テムに基づく市販のキットを用いて分析する。

【０２６８】 FLEXHTはまた、ハイスループット方法で酵母２ハイブリッドシステムを使用す
るPATHCALLINGプロセス（CuraGen Corp., New Haven CT）に用いて、遺伝子の２
大ライブラリにコードされる遺伝子間の全ての相互作用を決定することができる
（Nandabalan, K. ら (2000) 米国特許第6,057,101号）。

【０２６９】 当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法
及びシステムの種々の改変を行い得る。本発明について説明するにあたり特定の
好適実施例に関連して説明を行ったが、本発明の範囲が、そのような特定の実施
例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学ま
たは関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載されている本発明の実施方
法の様々な改変は、特許請求の範囲内にあるものとする。

【０２７０】 （表の簡単な説明） 表１は、FLEXHTをコードする完全長の配列をアセンブルするために用いた、ポ
リペプチド配列及びヌクレオチド配列の配列番号（SEQ ID NO）、クローン識別
番号（クローンID）、cDNAライブラリ及びcDNA断片を示す。

【０２７１】 表２は、タンパク質リン酸化及びグリコシル化部位を含む各ポリペプチド配列
の特徴を示す。

【０２７２】 表３は、各核酸配列の選択された断片と、ノーザン分析によって決定された各
核酸配列の組織特異的発現パターンと、これらの組織に関連した疾患、異常症ま
たは症状と、各DNAのクローニング先のベクターとを示す。

【０２７３】 表４は、cDNAライブラリの作製に用いた組織を示す。FLEXHTをコードするcDNA
クローンはここから単離した。

【０２７４】 表５は、ポリペプチドの同一性、潜在モチーフと、相同配列と、FLEXHTの解析
に用いた方法とを含む選択されたポリペプチド配列の特徴を示す。

【０２７５】 表６は、FLEXHTの分析に用いたツール、プログラム、アルゴリズムを、適用可
能な説明、引用文献及び閾値パラメータと共に示す。

【表１】

【表２】

【表３】

【表４】

【表５】

【表６】

【表７】

【表８】

【表９】

【表１０】

【表１１】

【表１２】

【表１３】

【表１４】

【表１５】

【表１６】

【表１７】

【表１８】

【表１９】

【表２０】

【表２１】

【表２２】

【配列表】

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年８月１４日（２００１．８．１４）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 48/00 ４Ｃ０８４ Ａ６１Ｐ 1/16 ４Ｃ０８５ 45/00 3/10 ４Ｃ０８６ 48/00 7/06 ４Ｃ０８７ Ａ６１Ｐ 1/16 9/10 ４Ｈ０４５ 3/10 11/00 7/06 13/00 9/10 17/06 11/00 19/02 13/00 19/06 17/06 19/10 19/02 21/04 19/06 25/00 19/10 25/08 21/04 25/14 25/00 27/06 25/08 27/16 25/14 29/00 １０１ 27/06 31/18 27/16 35/00 29/00 １０１ 35/02 31/18 37/00 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 35/02 16/18 37/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 14/47 1/19 16/18 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 5/10 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/53 Ｍ Ｃ１２Ｑ 1/68 37/00 １０２ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ａ 33/53 15/00 Ｆ 37/00 １０２ Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ０９／３１１，９３７ (32)優先日 平成11年５月14日(1999．5．14) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ラル、プリーティ アメリカ合衆国カリフォルニア州95054・ サンタクララ・ラスドライブ 2382 (72)発明者 レディ、ルーパ アメリカ合衆国カリフォルニア州94086・ サニーベイル・ウェストマッキンレードラ イブ 1233 (72)発明者 バトラ、サジィーブ アメリカ合衆国カリフォルニア州94087・ サニーベイル・＃709・エルカミーノリア ル 555 (72)発明者 ボーグン、マライア・アール アメリカ合衆国カリフォルニア州94577・ サンレアンドロ・サンティアゴロード 14244 (72)発明者 ヤング、ジュンミング アメリカ合衆国カリフォルニア州95129・ サンノゼ・バークレーン 7125 (72)発明者 アジムザイ、ヤルダ アメリカ合衆国カリフォルニア州94545・ ヘイワード・ロックスプリングスドライブ 2045 (72)発明者 リュ、デュング・アイナ・エム アメリカ合衆国カリフォルニア州95136・ サンノゼ・パークベルモントプレイス 55 (72)発明者 オウ−ヤング、ジャニス・エル アメリカ合衆国カリフォルニア州94005・ ブリスベーン・ゴールデンイーグルレーン 233 (72)発明者 シー、レオ・エル アメリカ合衆国カリフォルニア州94303・ パロアルト・タンランドドライブ 1081・ アパートメント ビー Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 CB01 DA13 DA14 DA36 FA16 FB01 FB02 FB05 FB12 4B024 AA01 AA11 AA19 BA80 CA04 DA02 DA05 DA12 EA02 EA04 GA11 HA12 HA17 4B063 QA19 QA20 QQ43 QR08 QR33 QR42 QR56 QS25 QS34 QX02 4B064 AG01 CA02 CA06 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA57X AA72X AA90X AB01 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA03 AA06 AA07 AA13 AA17 BA01 BA02 BA21 BA22 CA53 NA14 ZA022 ZA062 ZA332 ZA342 ZA362 ZA452 ZA552 ZA592 ZA662 ZA812 ZA892 ZA962 ZA972 ZB132 ZB152 ZB262 ZB272 ZB332 ZC352 ZC552 4C085 AA13 AA14 DD62 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA02 ZA06 ZA33 ZA34 ZA36 ZA45 ZA55 ZA59 ZA66 ZA81 ZA89 ZA96 ZA97 ZB13 ZB15 ZB26 ZB27 ZB33 ZC35 ZC55 4C087 AA01 AA02 AA03 BC83 CA12 NA14 ZA02 ZA06 ZA33 ZA34 ZA36 ZA45 ZA55 ZA59 ZA66 ZA81 ZA89 ZA96 ZA97 ZB13 ZB15 ZB26 ZB27 ZB33 ZC35 ZC55 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA75 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の（ａ）乃至（ｄ）を有する群から選択したアミノ酸
   配列を含む実質上単離されたポリペプチド。 （ａ）配列番号１乃至５５を有する群から選択したアミノ酸配列 （ｂ）配列番号１乃至５５を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも
   ９０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列 （ｃ）配列番号１乃至５５を有する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活
   性断片 （ｄ）配列番号１乃至５５を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性
   断片
2. 【請求項２】 配列番号１乃至５５を有する群から選択した請求項１に記
   載の単離されたポリペプチド。
3. 【請求項３】 請求項１のポリペプチドをコードする単離されたポリヌク
   レオチド。
4. 【請求項４】 請求項２のポリペプチドをコードする単離されたポリヌク
   レオチド。
5. 【請求項５】 配列番号５６乃至１１０を有する群から選択した請求項４
   に記載の単離されたポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 請求項３に記載のポリヌクレオチドに機能的に結合したプ
   ロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチド。
7. 【請求項７】 請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを用いて形質転
   換した細胞。
8. 【請求項８】 請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを含む遺伝形質
   転換体。
9. 【請求項９】 請求項１に記載のポリペプチドを製造する方法であって、 （ａ）組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞を前記ポリペプチド
   の発現に適した条件下で培養する過程と、 （ｂ）そのように発現した前記ポリペプチドを受容する過程とからなり、 前記組換えポリヌクレオチドが、請求項１に記載の前記ポリペプチドをコード
   するポリヌクレオチドに機能的に結合したプロモーター配列を有することを特徴
   とする方法。
10. 【請求項１０】 請求項１に記載のポリペプチドと特異結合するような単
    離された抗体。
11. 【請求項１１】 以下の（ａ）乃至（ｄ）を有する群から選択したポリヌ
    クレオチド配列を含む実質上単離されたポリヌクレオチド。 （ａ）配列番号５６乃至１１０を有する群から選択したポリヌクレオチド配列 （ｂ）配列番号５６乃至１１０を有する群から選択したポリヌクレオチド配列
    と少なくとも９０％の相同性を有する天然のポリヌクレオチド配列 （ｃ）（ａ）に相補的なポリヌクレオチド配列 （ｄ）（ｂ）に相補的なポリヌクレオチド配列 （ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物
12. 【請求項１２】 請求項１１に記載のポリヌクレオチドの少なくとも６０
    の連続したヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。
13. 【請求項１３】 請求項１１に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標
    的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、 （ａ）前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドに相補的な配列を有する少
    なくとも２０の連続したヌクレオチドを含むプローブを用いて前記サンプルをハ
    イブリダイズする過程と、 （ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体の存在・不存在を検出し、該複合体
    が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程からなり、 前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドの間でハイブリダイゼーション複合
    体が形成されるような条件下で、前記プローブが前記標的ポリヌクレオチドに特
    異的にハイブリダイズすることを特徴とする方法。
14. 【請求項１４】 前記プローブが少なくとも６０の連続したヌクレオチド
    を含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
15. 【請求項１５】 請求項１１に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標
    的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、 （ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて前記標的ポリヌクレオチドまたはそ
    の断片を増幅する過程と、 （ｂ）前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片の存在・不存在を検出し、該
    標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を
    検出する過程を含むことを特徴とする方法。
16. 【請求項１６】 有効量の請求項１のポリペプチドと、薬剤として許容で
    きる賦形剤とを有することを特徴とする医薬品成分。
17. 【請求項１７】 前記ポリペプチドが、配列番号１乃至５５を有する群か
    ら選択したアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１６に記載の医薬品成分
    。
18. 【請求項１８】 機能性FLEXHTの発現低下に関連する疾患又は病状を治療
    する方法であって、そのような治療を必要とする患者に対して請求項１６に記載
    の医薬品成分を投与する過程を含むことを特徴とする方法。
19. 【請求項１９】 請求項１に記載のポリペプチドのアゴニストとして有効
    性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、 （ａ）請求項１に記載のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝す過程と、 （ｂ）前記サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程とを含むことを特徴と
    する方法。
20. 【請求項２０】 請求項１９に記載の方法によって同定したアゴニスト化
    合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする医薬品成分。
21. 【請求項２１】 機能性FLEXHTの発現低下に関連する疾患又は病状を治療
    する方法であって、そのような治療を必要とする患者に対して請求項２０に記載
    の医薬品成分を投与する過程を含むことを特徴とする方法。
22. 【請求項２２】 請求項１に記載のポリペプチドのアンタゴニストとして
    有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、 （ａ）請求項１に記載のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝す過程と、 （ｂ）前記サンプル中のアンタゴニスト活性を検出する過程とを含むことを特
    徴とする方法。
23. 【請求項２３】 請求項２２に記載の方法によって同定したアンタゴニス
    ト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする医薬品成分
    。
24. 【請求項２４】 機能性FLEXHTの過剰発現に関連する疾患又は病状の治療
    方法であって、そのような治療を必要とする患者に対して請求項２３に記載の医
    薬品成分を投与する過程を含むことを特徴とする方法。
25. 【請求項２５】 請求項１に記載のポリペプチドに特異結合する化合物を
    スクリーニングする方法であって、 （ａ）適切な条件下で請求項１に記載のポリペプチドを少なくとも１つの試験
    化合物に結合させる過程と、 （ｂ）請求項１に記載のポリペプチドの試験化合物との結合を検出し、それに
    よって請求項１に記載のポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程とを
    含むことを特徴とする方法。
26. 【請求項２６】 請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物
    をスクリーニングする方法であって、 （ａ）請求項１に記載のポリペプチドの活性が許容された条件下で、請求項１
    に記載のポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物に結合させる過程と、 （ｂ）請求項１に記載のポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する
    過程と、 （ｃ）試験化合物の存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性を、試験
    化合物の不存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性と比較する過程とを
    含み、 試験化合物の存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性の変化が、請求
    項１に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物を標示することを特徴とする
    方法。
27. 【請求項２７】 請求項５に記載の配列を有する標的ポリヌクレオチドの
    変異発現の有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、 （ａ）前記標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝す過程と、 （ｂ）前記標的ポリヌクレオチドの変異発現を検出する過程とを含むことを特
    徴とする方法。
28. 【請求項２８】 以下の（ａ）及び（ｂ）を有する群から選択したポリヌ
    クレオチド配列を含む、少なくとも２０の連続したヌクレオチドを含む実質上単
    離されたポリヌクレオチド。 （ａ）配列番号５６乃至１１０を有する群から選択したポリヌクレオチド配列
    と相同性を有するポリヌクレオチド配列 （ｂ）（ａ）のRNA等価物
29. 【請求項２９】 請求項２８に記載のポリヌクレオチドを少なくとも１つ
    と、検出可能な標識を有するような、ヒトFLEXHTポリヌクレオチドの変異発現を
    検出するための化合物。
30. 【請求項３０】 自身の少なくとも１つの要素が請求項２８に記載のポリ
    ヌクレオチドであるマイクロアレイ。
31. 【請求項３１】 ポリヌクレオチドを有するサンプルの転写イメージを生
    成する方法であって、 （ａ）前記サンプルの前記標的ポリヌクレオチドを標識する過程と、 （ｂ）ハイブリダイゼーション複合体の形成に適した条件下で、請求項３０に
    記載のマイクロアレイの前記要素を前記サンプルの標識されたポリヌクレオチド
    に接触させる過程と、 （ｃ）前記サンプル中での前記ポリヌクレオチドの発現を定量する過程とを含
    むことを特徴とする方法。