JP2003517289A - 細胞骨格関連タンパク質 - Google Patents

細胞骨格関連タンパク質

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JP2003517289A
JP2003517289A JP2001500762A JP2001500762A JP2003517289A JP 2003517289 A JP2003517289 A JP 2003517289A JP 2001500762 A JP2001500762 A JP 2001500762A JP 2001500762 A JP2001500762 A JP 2001500762A JP 2003517289 A JP2003517289 A JP 2003517289A
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cyap
polynucleotide
polypeptide
sequence
seq
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タング、ワイ・トム
ユエ、ヘンリー
ヒルマン、ジェニファー・エル
ボーグン、マライア・アール
トラン、バオ
アジムザイ、ヤルダ
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒト細胞骨格関連タンパク質（CYAP）と、CYAPを同定しコードするポリヌクレオチドとを提供する。本発明はまた、発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニスト及びアンタゴニストを提供する。更に、本発明は、CYAPの発現に関連する疾患を診断、治療または予防する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、細胞骨格関連タンパク質の核酸配列及びアミノ酸配列に関し、神経
系障害、自己免疫／炎症疾患及び癌を含む細胞増殖異常の診断、治療並びに予防
におけるこれらの配列の利用に関する。
【０００２】 （発明の背景） タンパク質線維の細胞質系である細胞骨格は、細胞形状、構造及び運動を媒介
する。細胞骨格は、細胞膜を支持し、サイトゾル内のオルガネラ及びその他のエ
レメントがそれに沿って運動するような軌道を形成する。細胞骨格は、細胞が種
々の形状を採用しており、定方向運動の実行を可能にする動的構造である。主要
な細胞骨格線維には、ミクロフィラメント、微小管及び中間フィラメントである
。ミオシン、ダイニン及びキネシンを含む運動タンパク質は、線維運動または線
維に沿った運動の動因である。補助タンパク質または関連タンパク質は線維の構
造または活性を変更し、細胞骨格膜アンカーは線維を細胞膜に結合する。
【０００３】 直径２４nmの細胞骨格線維である微小管は、細胞内で複数の役割を有する。微
小管の束は繊毛及び鞭毛を形成する。繊毛及び鞭毛は細胞膜の鞭のような伸張部
分であり、繊毛は上皮を横切って物質を掃引するのに必要であり、鞭毛は精子の
遊泳に必要である。赤血球細胞及び血小板における微小管の辺縁バンドは、これ
らの細胞のたわみ性に重要である。オルガネラ、膜小胞及びタンパク質は、微小
管の軌跡に沿って細胞内で輸送される。例えば微小管は、細胞体と神経終末の間
で物質及び膜小胞の双方向輸送を可能にする神経細胞軸索を通り抜ける。神経終
末に小胞を供給できなかった場合には、神経信号の伝達が阻害される。微小管も
また、細胞分裂中の染色体運動にとって重大な意味を持つ。安定且つ短命である
微小管の集団が、細胞内に存在する。
【０００４】 微小管は、GTP結合チューブリンタンパク質サブユニットのポリマーである。
各サブユニットは、複数のアイソフォームが存在するαチューブリン及びβチュ
ーブリンのヘテロ二量体である。GTPの加水分解は、微小管端部で追加チューブ
リンサブユニットに結合される。サブユニットはヘッドからテイルへ相互作用し
てプロトフィラメントを形成し、プロトフィラメントは側面から側面へ相互作用
して微小管を形成する。微小管は極性化され、一端はαチューブリン、他端はβ
チューブリンで取り囲まれ、両端で構築の速度が異なる。１１または１５のプロ
トフィラメント微小管も見られるが、通常各微小管は１３のプロトフィラメント
から構成される。繊毛及び鞭毛は、２連微小管を有する。
【０００５】 直近に述べたチューブリン関連タンパク質であるミサト（misato）は、ミオシ
ン重鎖タンパク質モチーフのみならず、α、β、γ-チューブリンのモチーフの
ような構造ペプチドモチーフも有する。この異常なタンパク質は、この遺伝子座
の零対立遺伝子を保有する突然変異生物において実証されるように、ショウジョ
ウバエにおける細胞分裂中に重大な役割を演じる。このような突然変異体は、細
胞周期が欠けていることにより成虫盤（imgainal disk）が発育不全になるので
、完全な胚芽の形態形成ができない（Miklos, G.L. ら (1997) Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 94:5189-5194）。
【０００６】 細胞の移動、分化及び細胞周期の間、微小管細胞骨格は構築及び分解によって
迅速に認識しなければならない。ヘテロ二量体細胞骨格関連タンパク質であるカ
タニン（Katanin）は、微小管を可逆的に切断し、チューブリン二量体に分解す
る。このタンパク質独自の機能は、微小管のチューブリン−チューブリン結合を
切断するためにATPを必要とすることである（McNally, F.J. and R.D. Vale (19
93) Cell 75:419-429）。
【０００７】 直径７〜９nmの細胞骨格フィラメントであるミクロフィラメントは、細胞移動
、細胞形状、細胞付着、細胞分裂及び筋収縮に重要である。ミクロフィラメント
の構築及び分解は、細胞の形態を変化させ得る。ミクロフィラメントは、真核細
胞で最も豊富な細胞内タンパク質であるアクチンが重合したものである。ヒト細
胞は、アクチンの６つのアイソフォームを有する。３つのαアクチンは異なる種
類の筋肉において見られ、非筋肉βアクチン及び非筋肉γアクチンは非筋肉細胞
で見られ、別のγアクチンは腸管平滑筋細胞で見られる。単量体形のアクチンで
あるG-アクチンは、ATPからADPへの加水分解を伴って極性化した螺旋F-アクチン
フィラメントに重合する。アクチンフィラメントは、会合して束及びネットワー
クを形成し、原形質膜を支持して細胞形状を決定するようなフレームワークを提
供する。これらの束及びネットワークは、細胞膜に結合される。筋肉細胞では、
収縮する間にアクチンを含む細いフィラメントが、運動タンパク質ミオシンを含
む太いフィラメントに滑り込む。
【０００８】 アクチン関連タンパク質は、アクチンフィラメントの架橋、切断及び安定化及
びアクチン単量体の隔絶における役割を有する。幾つかのアクチン関連タンパク
質は、複数の機能を有する。アクチンフィラメントの束及びネットワークは、ア
クチン架橋タンパク質により結合される。これらのタンパク質は、各フィラメン
トに１つずつ、合計２つのアクチン結合部位を有する。短架橋タンパク質が束の
形成を促進する一方で、より長くて柔軟な架橋タンパク質はネットワークの形成
を促進する。アクチン架橋タンパク質のカルモジュリン様カルシウム結合ドメイ
ンは、架橋のカルシウム調整を可能にする。アクチン張力線維に集中しているα
アクチンは、アクチンフィラメントの疎性架橋を束へ供給する。グループIのア
クチン架橋タンパク質は、独自のアクチン結合ドメインを有し、３０Kdタンパク
質、EF-1a、ファシン（fascin）及びスクルーイン（scruin）がある。グループI
Iの架橋タンパク質は、7,000MWアクチン結合ドメインを有し、ビリン（villin）
及びデマチン（dematin）がある。グループIIIの架橋タンパク質は、１対の26,0
00MWアクチン結合ドメインを有し、フィンブリン、スペクトリン、ジストロフィ
ン、ABP 120及びフィラミンがある。
【０００９】 切断タンパク質は、アクチンフィラメントを短片に切断することまたはアクチ
ンフィラメント端を阻害することによりアクチンフィラメントの長さを調整する
。切断タンパク質には、gCAP39、セベリン(severin)（フラグミン）、ゲルゾリ
ン及びビリンがある。キャッピングタンパク質は、アクチンフィラメント端をキ
ャップし得るが、フィラメントを切断することはできない。キャッピングタンパ
ク質には、CapZ及びトロポモジュリン（tropomodulin）がある。タンパク質のサ
イモシン及びプロフィリンがサイトゾル内のアクチン単量体を隔離し、重合して
いないアクチンのプールを存在させる。アクチン関連タンパク質のトロポミオシ
ン、トロポニン及びカルデスモンは、カルシウムに応じて筋収縮を調整する。
【００１０】 中間フィラメント（IF）は、直径１０nmの細胞骨格線維であり、ミクロフィラ
メントと微小管の中間にある。IFは、細胞において構造的役割を果たし、細胞を
強化し、細胞を組織化して組織にする。IFは、特に表皮細胞及びニューロンに豊
富にある。ミクロフィラメント及び微小管とは対照的に、IFは非常に安定してお
り、細胞運動性において機能しない。
【００１１】 哺乳動物では、５つの型のIFタンパク質が既知である。I型及びII型のタンパ
ク質は、各々酸性ケラチン及び塩基性ケラチンである。酸性ケラチン及び塩基性
ケラチンのヘテロ二量体は、ケラチンIFの構成単位である。ケラチンは、皮膚や
角膜などの軟らかい上皮、爪や髪などの硬い上皮及び身体内部の空洞を満たす上
皮に豊富にある。ケラチン遺伝子の突然変異は、単純型表皮水疱症、水疱型先天
性魚鱗癬様紅皮症（表皮溶解性角質増殖）、非表皮溶解性及び表皮溶解性掌蹠角
皮症、ジーメンスの水疱性魚鱗癬、先天性爪肥厚症及び白色海綿母斑を含む上皮
の疾病の原因となる。これらの疾病には、重度の皮膚水疱形成の原因となるもの
もある（Wawersik, M. ら (1997) J. Biol. Chem. 272:32557-32565 及び Corde
n, L.D. and W.H. McLean (1996) Exp. Dermatol. 5:297-307）。
【００１２】 IFは、短い非螺旋状リンカーセグメントにより中断された中央α螺旋状杆体領
域を有する。杆体領域は、殆どの場合、非螺旋状ヘッド及びテイルドメインによ
り一まとめにされる。中間フィラメントタンパク質の杆体領域は、１つになって
多段コイル二量体を形成する。高度に規則正しい構築プロセスは、二量体からIF
へ導く。ミクロフィラメント及び微小管と異なり、IF構築にはATPもGTPも必要と
しない。
【００１３】 IF関連タンパク質（IFAP）は、IFの相互作用を相互に及び細胞構造に仲介する
。IFAPは、IFを束、ネットワークまたは原形質膜に架橋し、IFをミクロフィラメ
ント及び微小管細胞骨格に架橋し得る。微小管及びIFは、特に密接に関連してい
る。IFAPには、BPAG1、プラコグロビン、デスモプラキンI、デスモプラキンII、
プレクチン（plectin）、アンキリン、フィラグリン（filaggrin）及びラミン（
lamin）B受容体がある。
【００１４】 ミオシンは、ATPの加水分解を運動と結びつけるアクチン活性ATPアーゼであり
、真核細胞中に見られる。ミオシンは、食作用や有糸細胞分裂（細胞質分裂）中
に行われる細胞内容物の再配列などの筋収縮及び細胞内運動のための運動機能を
提供する。筋節と称される骨格筋収縮の単位は、高度に規則正しいアクチンを含
む細いフィラメント及びミオシンを含む太いフィラメントから構成される。太い
フィラメントと細いフィラメントの間に架橋が形成され、太いフィラメント内の
ミオシンヘッドのATP依存型運動が細いフィラメントを引っ張り、筋節を短縮し
、それによって筋線維を短縮する。
【００１５】 ミオシンは、１または２つの重鎖及び関連する軽鎖を有する。ミオシン重鎖は
、アミノ末端運動即ちヘッドドメインと、軽鎖結合の部位である頚部と、カルボ
キシル末端テイルドメインとを有する。テイルドメインは、α螺旋状多段コイル
の形成に関連し得る。例えば筋肉組織などに見られるような通常のミオシンは、
２つのミオシン重鎖サブユニットを有し、各々が、頚部領域を結合して制御の役
割を果たすような２つの軽鎖サブユニットに関連している。細胞内運動において
機能すると信じられている非通常のミオシンは、１または２つの重鎖及び関連す
る軽鎖を有し得る。脊椎動物の約２５ミオシン重鎖遺伝子について半分以上が非
通常であるという証拠がある。
【００１６】 キネシンは、(+)端に向けられた運動タンパク質であり、微小管において作用
する。プロトタイプのキネシン分子は、膜結合小胞及びオルガネラの輸送に関与
している。この機能は、ニューロンにおける軸索輸送に特に重要である。キネシ
ンはまた、全ての細胞タイプにおいてゴルジ体から小胞体への小胞の輸送にも重
要である。この役割は、これら分泌性オルガネラの同一性及び機能性の維持にと
って重大な意味を持つ。
【００１７】 キネシンは、１次アミノ酸配列、ドメイン構造、運動の速度及び細胞機能に基
づき少なくとも８つのサブファミリーに分類し得る５０以上のタンパク質の広範
に分布する保存されたファミリーを画定する（Moore, J.D. and S.A. Endow (19
96) Bioessays 18:207-219 及び Hoyt, A.M. (1994) Curr. Opin. Cell Biol. 6
:63-68にレビューされている）。プロトタイプのキネシン分子は、２つの重ポリ
ペプチド鎖（KHC）及び２つの軽ポリペプチド鎖（KLC）を有するヘテロ四量体で
ある。KHCサブユニットは通常「キネシン」と称される。KHCは長さが約１０００
アミノ酸であり、KLCは長さが約５５０アミノ酸である。２つのKHCは、二量体化
され、２次構造の３つの異なる領域を有する杆体形分子を形成する。分子の一端
は、ATP加水分解及び微小管結合において機能する球状運動ドメインである。キ
ネシン運動ドメインは高度に保存され、７０％を超える一致率を共有する。運動
ドメインを越えると、二量体化を仲介するα螺旋状多段コイル領域がある。分子
の他端は、分子カーゴに関連する扇形テイルである。テイルは、２つのKLCを有
するKHCのＣ末端の相互作用により形成される。
【００１８】 マウス精母細胞からクローン化され、減数分裂特異核構造タンパク質（MNS 1
）と呼ばれる６０kDaの細胞骨格タンパク質は、特に精子形成中のパキテン期に
、核または核周囲構造の組織において役立つ。MNS 1は、非螺旋状末端ドメイン
に隣接する長いα螺旋状コイルドメインを有する。ドメインは、Ｍ期（meotic）
前期中に固有の核形態の保存に寄与する（フルカワ, K. (1994) Chromosome Res
. 2:99-113）。
【００１９】 新たな細胞骨格関連タンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチドの発見
は、神経系障害、自己免疫／炎症疾患及び癌を含む細胞増殖異常の診断、治療並
びに予防とにおいて有用である新たな組成を提供することにより、当分野におけ
る要求を満たす。
【００２０】 （発明の概要） 本発明は、集合的には「CYAP」、個別には「CYAP-1」、「CYAP-2」、「CYAP-3」、「C
YAP-4」及び「CYAP-5」と呼ばれるような、実質上精製されたポリペプチドである細
胞骨格関連タンパク質に特徴がある。或る実施態様において本発明は、（ａ）配
列番号１乃至５を有する群から選択したアミノ酸配列、（ｂ）配列番号１乃至５
を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有する天然
のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号１乃至５を有する群から選択したアミノ酸配列
の生物学的活性断片、または（ｄ）配列番号１乃至５を有する群から選択したア
ミノ酸配列の免疫抗原性断片を含む、実質上単離されたポリペプチドを提供する
。一実施態様では、配列番号１乃至５を有する群から選択したアミノ酸配列を含
む実質上単離されたポリペプチドを提供する。
【００２１】 また、本発明は（ａ）配列番号１乃至５を有する群から選択したアミノ酸配列
、（ｂ）配列番号１乃至５を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９
０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号１乃至５を有する群
から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）配列番号１乃至５
を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片を含むポリペプチドをコ
ードするような実質上単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では
、ポリヌクレオチドは配列番号１乃至５を有する群から選択したポリペプチドを
コードする。別の実施態様では、ポリヌクレオチドは配列番号６乃至１０を有す
る群から選択される。
【００２２】 本発明は更に、（ａ）配列番号１乃至５を有する群から選択したアミノ酸配列
、（ｂ）配列番号１乃至５を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９
０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号１乃至５を有する群
から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）配列番号１乃至５
を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片を含むポリペプチドをコ
ードするような実質上単離されたポリヌクレオチドと機能的に結合したプロモー
ター配列を有する組換えポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、本発明
は組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞を提供する。別の実施態様
では、本発明は組換えポリヌクレオチドを含む遺伝形質転換体を提供する。
【００２３】 また、本発明は（ａ）配列番号１乃至５を有する群から選択したアミノ酸配列
、（ｂ）配列番号１乃至５を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９
０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号１乃至５を有する群
から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）配列番号１乃至５
を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片を含む実質上単離された
ポリペプチドを製造する方法を提供する。製造方法は、（ａ）組換えポリヌクレ
オチドを用いて形質転換した細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養す
る過程と、（ｂ）そのように発現したポリペプチドを受容する過程とを有し、組
換えポリヌクレオチドはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に
結合したプロモーター配列を有する。
【００２４】 本発明は更に、（ａ）配列番号１乃至５を有する群から選択したアミノ酸配列
、（ｂ）配列番号１乃至５を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９
０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号１乃至５を有する群
から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）配列番号１乃至５
を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片を含むポリペプチドに特
異結合するような実質上単離された抗体を提供する。
【００２５】 本発明は更に、（ａ）配列番号６乃至１０を有する群から選択したポリヌクレ
オチド配列、（ｂ）配列番号６乃至１０を有する群から選択したポリヌクレオチ
ド配列と少なくとも７０％の相同性を有する天然のポリヌクレオチド配列、（ｃ
）（ａ）に相補的なポリヌクレオチド配列、（ｄ）（ｂ）に相補的なポリヌクレ
オチド配列、または（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物を含む実質上単離された
ポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、ポリヌクレオチドは少なくとも
６０の連続したヌクレオチドを有する。
【００２６】 本発明は更に、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する
。ここで、標的ポリヌクレオチドは（ａ）配列番号６乃至１０を有する群から選
択したポリヌクレオチド配列、（ｂ）配列番号６乃至１０を有する群から選択し
たポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％の相同性を有する天然のポリヌクレ
オチド配列、（ｃ）（ａ）に相補的なポリヌクレオチド配列、（ｄ）（ｂ）に相
補的なポリヌクレオチド配列、または（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物を含む
実質上単離されたポリヌクレオチドを提供する。検出方法は、（ａ）サンプル中
の標的ポリヌクレオチドに相補的な配列からなる少なくとも２０の連続したヌク
レオチドを含むプローブを用いて該サンプルをハイブリダイズする過程と、（ｂ
）ハイブリダイゼーション複合体の存在・不存在を検出し、複合体が存在する場
合にはオプションでその量を検出する過程からなり、プローブと標的ポリヌクレ
オチドの間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、プロ
ーブは標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする。一実施態様では、
プローブは少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含む。
【００２７】 本発明はまた、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する
。ここで、標的ポリヌクレオチドは（ａ）配列番号６乃至１０を有する群から選
択したポリヌクレオチド配列、（ｂ）配列番号６乃至１０を有する群から選択し
たポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％の相同性を有する天然のポリヌクレ
オチド配列、（ｃ）（ａ）に相補的なポリヌクレオチド配列、（ｄ）（ｂ）に相
補的なポリヌクレオチド配列、または（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物を含む
実質上単離されたポリヌクレオチドを提供する。検出方法は、（ａ）ポリメラー
ゼ連鎖反応増幅を用いて標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と
、（ｂ）標的ポリヌクレオチドまたはその断片の存在・不存在を検出し、該標的
ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出
する過程を含む。
【００２８】 本発明は更に、有効量のポリペプチドと薬剤として許容できる賦形剤とを含む
医薬品成分を提供する。有効量のポリペプチドは、（ａ）配列番号１乃至５を有
する群から選択したアミノ酸配列、（ｂ）配列番号１乃至５を有する群から選択
したアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列、（
ｃ）配列番号１乃至５を有する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片
、または（ｄ）配列番号１乃至５を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗
原性断片を含む。一実施態様では、医薬品成分は配列番号１乃至５を有する群か
ら選択したアミノ酸配列を含む。更に本発明は、機能性CYAPの発現低下に関連す
る疾患又は病状を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に対
して医薬品成分を投与する過程を有する方法を提供する。
【００２９】 本発明はまた、（ａ）配列番号１乃至５を有する群から選択したアミノ酸配列
、（ｂ）配列番号１乃至５を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９
０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号１乃至５を有する群
から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）配列番号１乃至５
を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片を含むポリペプチドのア
ゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法を提
供する。スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドを有するサンプルを化合物
に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程とを含む。一
実施態様では、本発明は機能性CYAPの発現低下に関連する疾患又は病状を治療す
る方法であって、そのような治療を必要とする患者に対して医薬品成分を投与す
る過程を含む方法を提供する。
【００３０】 本発明は更に、（ａ）配列番号１乃至５を有する群から選択したアミノ酸配列
、（ｂ）配列番号１乃至５を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９
０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号１乃至５を有する群
から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）配列番号１乃至５
を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片を含むポリペプチドのア
ンタゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法
を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドを含むサンプルを化合
物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程とを含む。
一実施態様で本発明は、この方法によって同定したアンタゴニスト化合物と薬剤
として許容できる賦形剤とを含む医薬品成分を提供する。別の実施態様では、機
能性CYAPの過剰発現に関連する疾患又は病状を治療する方法であって、そのよう
な治療を必要とする患者に対して医薬品成分を投与する過程を含む方法を提供す
る。
【００３１】 本発明は更に、（ａ）配列番号１乃至５を有する群から選択したアミノ酸配列
、（ｂ）配列番号１乃至５を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９
０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号１乃至５を有する群
から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）配列番号１乃至５
を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片を含むポリペプチドに特
異結合する化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は
、（ａ）ポリペプチドを適切な条件下で少なくとも１つの試験化合物に結合させ
る過程と、（ｂ）試験化合物とのポリペプチドの結合を検出し、それによってポ
リペプチドに特異結合する化合物を同定する過程とを含む。
【００３２】 本発明は更に、（ａ）配列番号１乃至５を有する群から選択したアミノ酸配列
、（ｂ）配列番号１乃至５を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９
０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号１乃至５を有する群
から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）配列番号１乃至５
を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片を含むポリペプチドの活
性を調節する化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法
は、（ａ）ポリペプチドの活性が許容された条件下で、ポリペプチドを少なくと
も１つの試験化合物に結合させる過程と、（ｂ）ポリペプチドの活性を試験化合
物の存在下で算定する過程と、（ｃ）試験化合物の存在下でのポリペプチドの活
性を試験化合物の不存在下でのポリペプチドの活性と比較する過程とを含み、試
験化合物の存在下でのポリペプチドの活性の変化は、ポリペプチドの活性を調節
する化合物を標示する。
【００３３】 本発明は更に、標的ポリヌクレオチドの変異発現の有効性を確認するために化
合物をスクリーニングする方法を提供する。標的ポリヌクレオチドは、配列番号
６乃至１０を有する群から選択した配列を含む。スクリーニング方法は、（ａ）
標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝す過程と、（ｂ）標的ポリヌ
クレオチドの変異発現を検出する過程とを含む。
【００３４】 （発明を実施するための形態） 本発明のタンパク質、ヌクレオチド配列及び方法について説明するが、その前
に、説明した特定の装置、材料及び方法に本発明が限定されるものではなく、改
変し得ることを理解されたい。また、ここで使用する専門用語は特定の実施例を
説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の
範囲を限定することを意図したものではないことも併せて理解されたい。
【００３５】 請求の範囲及び明細書中で用いている単数形の「或る」及び「その（この）」
の表記は、文脈から明らかにそうでないとされる場合を除いて複数のものを指す
場合もあることに注意しなければならない。従って、例えば「或る宿主細胞」と
記されている場合にはそのような宿主細胞が複数あることもあり、「或る抗体」
と記されている場合には単数または複数の抗体、及び、当業者に公知の抗体の等
価物等についても言及しているのである。
【００３６】 本明細書中で用いる全ての専門用語及び科学用語は、特に定義されている場合
を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書で説
明するものと類似あるいは同等の任意の装置、材料及び方法を用いて本発明の実
施または試験を行うことができるが、ここでは好適な装置、材料、方法について
説明する。本発明で言及する全ての刊行物は、刊行物中で報告されていて且つ本
発明に関係があるであろう細胞、プロトコル、試薬及びベクターについて説明及
び開示する目的で引用しているものである。本明細書のいかなる開示内容も、本
発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられ
ていないことを認めるものではない。
【００３７】 定義 「CYAP」は、実質上精製されたCYAPのアミノ酸配列であって、任意の種、特に
ウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及びヒトを含む哺乳動物の種から得たもので
、任意の天然物、合成物、半合成物或いは組換え物を起源とするものを指す。
【００３８】 「アゴニスト」の語は、CYAPの生物学的活性を強化または擬態する分子を指す
。アゴニストの例として、タンパク質、核酸、糖質、小分子その他の任意の化合
物や成分を挙げることができるが、これらはCYAPと直接相互作用することによっ
て、或いはCYAPが関与する生物学的経路の構成エレメントに作用することによっ
て、CYAPの活性を調節する。
【００３９】 「対立遺伝子変異体」は、CYAPをコードする遺伝子の別の形態である。対立遺
伝子変異体は、核酸配列における少なくとも１の突然変異から作製し得る。また
、変異RNAまたはポリペプチドからも作製し得る。ポリペプチドの構造または機
能は、変異することもしないこともある。遺伝子は、天然の対立遺伝子変異体を
全く有しないか、１若しくは数個の天然の対立遺伝子変異体を有し得る。一般に
対立遺伝子変異体を生じさせる通常の突然変異性変化は、ヌクレオチドの自然欠
失、付加または置換に帰するものである。これら各変化は、単独或いは他の変化
と共に、所定の配列内で1若しくは数回生じ得る。
【００４０】 CYAPをコードする「変異(altered)」核酸配列は、種々のヌクレオチドを欠失
、挿入または置換する核酸配列を有し、CYAPと同一またはCYAPの機能的特徴を少
なくとも１つ有するポリペプチドを産出する。この定義に含まれるのは、CYAPを
コードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易
に検出可能或いは検出困難な多型現象と、CYAPをコードするポリヌクレオチド配
列のための正常な染色体遺伝子座以外の遺伝子座に占めるような、対立遺伝子変
異体に対する不適切或いは不測のハイブリダイゼーションである。コードされた
タンパク質も「変異」し得るものであり、サイレント変化を生ぜしめて結果的に
機能的に等価なCYAPとなるようなアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を含み得
る。計画的アミノ酸置換は、CYAPの生物学的または免疫学的活性が保持される限
りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒
性特性の類似性に基づき行い得る。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラ
ギン酸及びグルタミン酸があり、正に帯電したアミノ酸にはリジン及びアルギニ
ンがある。親水性値が近似している非荷電極性側鎖を有するアミノ酸には、アス
パラギンとグルタミン、セリンとスレオニンがある。親水性値が近似している非
荷電側鎖を有するアミノ酸には、ロイシンとイソロイシンとバリン、グリシンと
アラニン、フェニルアラニンとチロシンがある。
【００４１】 「アミノ酸」または「アミノ酸配列」の語は、オリゴペプチド、ペプチド、ポ
リペプチド若しくはタンパク質の配列またはその断片を指し、天然または合成分
子を指す。ここで、「アミノ酸配列」は天然のタンパク質分子のアミノ酸配列を
指すものであり、「アミノ酸配列」及び類似の語は、アミノ酸配列を、列挙した
タンパク質分子に会合する完全な本来のアミノ酸配列に限定しようとするもので
はない。
【００４２】 「増幅」は、核酸配列の追加複製に関連する。増幅は通常、当業者によく知ら
れたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を用いて行う。
【００４３】 「アンタゴニスト」の語は、CYAPの生物学的活性を阻害或いは弱める分子を指
す。アンタゴニストとしては、抗体などのタンパク質、核酸、糖質、小分子また
はその他の任意の化合物や成分を挙げることができるが、これらはCYAPと直接相
互作用することによって、或いはCYAPが関与する生物学的経路の構成エレメント
に作用することによって、CYAPの活性を調節する。
【００４４】 「抗体」の語は、無損傷免疫グロブリンやその断片、例えばFa、F(ab')2 及びF
v断片を指すが、これらはエピトープの決定基と結合することができる。CYAPポ
リペプチドを結合する抗体は、無損傷ポリペプチドを用いるか或いは免疫抗原と
して感心のある小ペプチドを含む断片を用いるかして調製することができる。動
物（マウス、ラット、ウサギ等）を免疫化するために用いるポリペプチドまたは
オリゴペプチドは、翻訳または化学合成されたRNAに由来し得るもので、好みに
応じて担体タンパク質に接合することも可能である。通常用いられる担体であっ
てペプチドと化学結合するものは、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン及び
キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）等がある。結合ペプチドは、動物を
免疫化するために用いる。
【００４５】 「抗原決定基」の語は、特定の抗体と接触している分子の領域（即ちエピトー
プ）を指す。タンパク質またはタンパク質断片を用いて宿主動物を免疫化する場
合、タンパク質の多数の領域が、抗原決定基（タンパク質の特定の領域または３
次元構造）に特異結合する抗体の産生を誘導し得る。抗原決定基は、抗体に結合
するための無損傷抗原（即ち免疫応答を誘導するために用いられる免疫原）と競
合し得る。
【００４６】 「アンチセンス」の語は、特定の核酸配列の「センス」鎖と塩基対を形成する
ことが可能な任意の成分を指す。アンチセンス成分には、DNAや、RNAや、ペプチ
ド核酸（PNA）や、ホスホロチオ酸、メチルホスホン酸またはベンジルホスホン
酸等の修飾されたバックボーン連鎖を有するオリゴヌクレオチドや、2'-メトキ
シエチル糖または2'-メトキシエトキシ糖等の修飾された糖類を有するオリゴヌ
クレオチドや、或いは5-メチルシトシン、2-デオキシウラシルまたは7-デアザ-2
'-デオキシグアノシン等の修飾された塩基を有するオリゴヌクレオチドがある。
アンチセンス分子は、化学合成または転写を含む任意の方法で製造することがで
きる。相補的アンチセンス分子は、ひとたび細胞に導入されたら、細胞が形成し
た天然の核酸配列と塩基対を形成し、転写または翻訳を妨害する二重鎖を形成す
る。「負」若しくは「マイナス（−）」の語がアンチセンス鎖を、「正」若しく
は「プラス（＋）」がセンス鎖を指すことがある。
【００４７】 「生物学的に活性」の語は、天然分子の構造的機能、調節機能または生化学的
機能を有するタンパク質を指す。同様に「免疫学的に活性」は、天然、組換えま
たは合成のCYAP、或いはその任意のオリゴペプチドの能力であって、適切な動物
または細胞において特定の免疫反応を誘導して特定の抗体と結合し得る能力を指
す。
【００４８】 「相補(的)」または「相補性」の語は、ポリヌクレオチドとポリヌクレオチド
の、塩基対形成による自然結合を指す。例えば、配列「5'A-G-T3'」は、相補配
列「3'T-C-A5'」に結合する。２つの一本鎖分子間の相補性は、幾つかの核酸が
結合しているだけの「部分的」なものであるか、或いは一本鎖分子間に完全な相
補性が存在するような「完全」なものであり得る。核酸鎖間の相補性の程度は、
核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に著しい影響を与える。この
ことは、核酸鎖間の結合に依存する増幅反応において、またペプチド核酸（PNA
）分子の設計及び使用において特に重要である。
【００４９】 「所定のポリヌクレオチド配列からなる成分」及び「所定のアミノ酸配列から
なる成分」は、概して所定のポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列からなる
任意の成分を指す。この成分には、乾燥製剤または水溶液が含まれ得る。CYAPま
たはCYAP断片をコードするポリヌクレオチドからなる成分は、ハイブリダイゼー
ションプローブとして利用することができる。このプローブは凍結乾燥状態で保
存し得るものであり、糖質等の安定化剤と会合し得る。ハイブリダイゼーション
においては、塩（例えばNaCl）、界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム；
SDS）及びその他の構成エレメント（例えばデンハート液、脱脂粉乳、サケの精
子のDNA等）を含む水溶液中にプローブを分散させることができる。
【００５０】 「コンセンサス配列」は、不必要な塩基を分離するために再配列し、XL-PCRキ
ット（Perkin-Elmer, Norwalk, CT）を用いて５'方向、３'方向のいずれか一方
向或いは両方向に伸長させ、更に再配列した核酸配列を指す。或いは、断片アセ
ンブルのコンピュータプログラムを用いて、１若しくは数個のIncyteクローンの
、場合によっては１若しくは数個のパブリックドメインESTの、オーバーラップ
した配列から組み立てた核酸配列を指す。コンピュータプログラムの例としては
、GELVIEW断片アセンブルシステム（GCG, Madison WI）が挙げられる。伸長及び
アセンブルの両方を行ってコンセンサス配列を決定する配列もある。
【００５１】 「保存的なアミノ酸置換」は、置換がなされた時に元のタンパク質の特性を殆
ど損なわないような置換、即ちタンパク質の構造と特に機能が保存され、そのよ
うな置換による大きな変化がない置換を指す。下表は、タンパク質中で元のアミ
ノ酸と置換され得るアミノ酸と、保存アミノ酸置換と認められるアミノ酸を示し
ている。 元の残基 保存的な置換 Ala Gly, Set Arg His, Lys Asn Asp, Gln, His Asp Asn, Glu Cys Ala, Ser Gln Asn, Glu, His Glu Asp, Gln, His Gly Ala His Asn, Arg, Gln, Glu Ile Leu, Val Leu Ile, Val Lys Arg, Gln, Glu Met Leu, Ile Phe His, Met, Leu, Trp, Tyr Ser Cys, Thr Thr Ser, Val Trp Phe, Tyr Tyr His, Phe, Trp Val Ile, Leu, Thr 保存アミノ酸置換では通常、（ａ）置換領域におけるポリペプチドのバックボ
ーン構造、例えばβシートやαヘリックス構造、（ｂ）置換部位における分子の
電荷または疎水性、及び／または（ｃ）側鎖の大部分を保持する。
【００５２】 「欠失」は、結果的に１若しくは数個のアミノ酸またはヌクレオチドが失われ
てなくなるようなアミノ酸またはヌクレオチド配列における変化を指す。
【００５３】 「誘導体」の語は、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の化学修飾
を指す。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による
水素の置換は、ポリヌクレオチド配列の化学修飾に含まれ得る。ポリヌクレオチ
ド誘導体は、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも１つは保持し
ているポリペプチドをコードする。ポリペプチド誘導体は、グリコシル化、ポリ
エチレングリコール化（pegylation）、或いは任意の同様なプロセスであって誘
導起源のポリペプチドから少なくとも１つの生物学的若しくは免疫学的機能を保
持しているプロセスによって、修飾されたポリペプチドである。
【００５４】 「検出可能な標識」は、測定可能な信号を生成することができ、ポリヌクレオ
チドまたはポリペプチドに共有結合または非共有結合するようなレポーター分子
または酵素を指す。
【００５５】 「断片」は、CYAPまたはCYAPをコードするポリヌクレオチドの固有部分であっ
て、親配列と同一配列であるが親配列よりも長さが短い配列を指す。断片は、画
定された配列の全長から１ヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さよりも
短い長さを有し得る。例えば或る断片は、５〜１０００の連続したヌクレオチド
またはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子とし
て、或いはその他の目的のために用いられる断片は、少なくとも５、１０、１５
、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２５０若しく
は５００の連続したヌクレオチド或いはアミノ酸残基長さであり得る。断片は、
分子の特定領域から優先的に選択し得る。例えば、ポリペプチド断片は、所定の
配列に示すような最初の２５０または５００アミノ酸（またはポリペプチドの最
初の２５％または５０％）から選択された或る長さの連続したアミノ酸を有し得
る。これらの長さは明らかに例として挙げているものであり、本発明の実施例で
は、配列表、表及び図面を含む明細書に裏付けされた任意の長さであってよい。
【００５６】 配列番号６乃至１０の断片には、固有のポリヌクレオチド配列領域が含まれる
。この領域は、配列番号６乃至１０を特異的に同定するものであり、例えば同一
ゲノム中の配列番号６乃至１０以外の配列とは異なるものである。配列番号６乃
至１０の断片は、例えば、ハイブリダイゼーション及び増幅技術において、或い
は関連するポリヌクレオチド配列から配列番号６乃至１０を区別する類似の方法
において有用である。配列番号６乃至１０の断片の正確な長さ及び断片に対応す
る配列番号６乃至１０の領域は、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣
例的に決定することが可能である。
【００５７】 配列番号１乃至５の断片は、配列番号６乃至１０の断片によってコードされる
。配列番号１乃至５の断片には、配列番号１乃至５を特異的に同定する固有のア
ミノ酸配列領域が含まれている。例えば、配列番号１乃至５の断片は、配列番号
１乃至５を特異認識する抗体を産出するための免疫抗原性ペプチドとして有用で
ある。配列番号１乃至５の断片及び断片に対応する配列番号１乃至５の領域の正
確な長さは、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定すること
が可能である。
【００５８】 「完全長」ポリヌクレオチド配列とは、少なくとも１つの翻訳開始コドン（例
えばメチオニン）、オープンリーディングフレーム及び翻訳終止コドンを有する
配列である。「完全長」ポリヌクレオチド配列は、「完全長」ポリペプチド配列
をコードする。
【００５９】 「相同性」の語は、配列類似性即ち２つ以上のポリヌクレオチド配列または２
つ以上のポリペプチド配列の配列間で互換可能な配列同一性である。
【００６０】 ポリヌクレオチド配列に適用される「一致率」または「一致％」の語は、標準
化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされた少なくとも２つ以上のポリ
ヌクレオチド配列間で一致する残基の割合を意味する。このようなアルゴリズム
は、２配列間のアラインメントを最適化するために比較する配列において、標準
化された再現性のある方法でギャップを挿入するので、２つの配列をより有意に
比較できる。
【００６１】 ポリヌクレオチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメ
ントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトパ
ラメータを用いて決定できる。このプログラムはLASERGENEソフトウェアパッケ
ージの一部であり、一式の分子生物学分析プログラム（DNASTAR, Madison WI）
である。CLUSTAL Vについては、Higgins, D.G. and P.M. Sharp (1989) CABIOS
5:151-153及びHiggins, D.G. ら (1992) CABIOS 8:189-191の文献に記載されて
いる。ポリヌクレオチド配列の対をなすアラインメントの場合、デフォルトパラ
メータは、Ktuple=2、gap penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定
する。デフォルトとして「重みづけされた」残基の重みづけ表を選択する。CLUS
TAL Vは、アラインメントされたポリヌクレオチド配列対間の「類似率」として
一致率を報告する。
【００６２】 或いは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）のBasic Local Al
ignment Search Tool（BLAST）が一般的に用いられ、且つ、無料で入手可能な配
列比較アルゴリズム一式を提供している（Altschul, S.F. ら (1990) J. Mol. B
iol. 215:403-410）。このアルゴリズムは、幾つかの情報源から入手可能であり
、メリーランド州ベセスダにあるNCBI及びインターネット（http://www.ncbi.nl
m.nih.gov/BLAST/）からも入手可能である。BLASTソフトウェア一式には様々な
配列分析プログラムが含まれており、既知のポリヌクレオチド配列を種々のデー
タベースから得た別のポリヌクレオチド配列とアラインメントする「blastn」も
その１つである。その他にも、２つのヌクレオチド配列を対で直接比較するため
に用いる「BLAST 2 Sequences」と称されるツールも利用可能である。「BLAST 2
Sequences」は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlにアクセスして
対話形式で利用することが可能である。「BLAST 2 Sequences」ツールは、blast
n と blastp（後述）の両方に用いることができる。BLASTプログラムは、一般的
には、ギャップ及びデフォルト設定に設定された他のパラメータと共に用いる。
例えば、２つのヌクレオチド配列を比較するために、デフォルトパラメータとし
て設定された「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用
いてblastnを実行してもよい。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。 Matrix: BLOSUM62 Reward for match: 1 Penalty for mismatch: −2 Open Gap: 5 及び Extension Gap: 2 penalties Gap x drop-off: 50 Expect: 10 Word Size: 11 Filter: on 一致率は、完全に画定された（例えば特定の配列番号で画定された）配列長さ
と比較して測定し得る。或いは、より短い長さ、例えばより大きな画定された配
列から得られた断片（例えば少なくとも２０、３０、４０、５０、７０、１００
または２００の連続したヌクレオチドの断片）の長さと比較して一致率を測定し
てもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列リ
ストを含めた本明細書に記載された配列に裏付けられた任意の配列長さの断片を
用いて、一致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。
【００６３】 高度の相同性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝子コードの縮重
が原因で類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸
配列内で変化を生じさせて、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコード
するような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。
【００６４】 ポリペプチド配列に適用される「一致率」または「一致％」の語は、標準化さ
れたアルゴリズムを用いてアラインメントされた少なくとも２以上のポリペプチ
ド配列間で一致する残基の割合を意味する。ポリペプチド配列アラインメントの
方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント方法もある。
既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の酸性度及び疎水性を保存
するので、ポリペプチドの構造を（従って機能も）保存する。
【００６５】 ポリペプチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメント
プログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラ
メータを用いて決定できる（既に説明したのでそれを参照されたい）。CLUSTAL
Vを用いて、ポリぺプチド配列を２つ１組でアラインメントする際のデフォルト
パラメータは、Ktuple=1、gap penalty=3、window=5、「diagonals saved」=5と
設定する。デフォルトの残基重み付け表としてPAM250マトリクスを選択する。ポ
リヌクレオチドアラインメントと同様に、CLUSTAL Vは、アラインメントされた
ポリペプチド配列対間の「類似率」として一致率を報告する。
【００６６】 或いは、NCBI BLASTソフトウェア一式を用いてもよい。例えばポリペプチド配
列を２つ１組で比較をする場合、デフォルトパラメータとして設定されたblastp
と共に「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を使用して
もよい。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。 Matrix: BLOSUM62 Open Gap: 11 及び Extension Gap: 1 penalties Gap x drop-off: 50 Expect: 10 Word Size: 3 Filter: on 一致率は、完全に画定された（例えば特定の配列番号で画定された）ポリペプ
チド配列の長さと比較して測定し得る。一致率は、配列或いは、より短い長さ、
例えばより大きな画定されたポリペプチド配列から得られた断片（例えば少なく
とも１５、２０、３０、４０、５０、７０または１５０の連続した残基の断片）
の長さと比較して一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的な
ものに過ぎず、表、図及び配列リストを含めた本明細書に記載された配列に裏付
けられた任意の配列長さの断片を用いて、或る長さであってその長さに対して一
致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。
【００６７】 「ヒト人工染色体」（HAC）は直鎖状の小染色体であり、６kb〜１０Mbのサイ
ズのDNA配列を含み、安定した有糸分裂染色体の分離及び維持に必要な全てのエ
レメントが含まれている。
【００６８】 「ヒト化抗体」の語は、非抗体結合領域におけるアミノ酸配列はヒト抗体によ
り近づくように変異させた抗体分子であって、本来の結合能力はそのまま保持し
ているような抗体分子を指す。
【００６９】 「ハイブリダイゼーション」は、所定のハイブリダイゼーション条件下で塩基
対を形成することによって、一本鎖ポリヌクレオチドが相補的鎖とアニーリング
するプロセスを指す。特異的ハイブリダイゼーションは、２つの核酸配列が高い
相同性を共有することを示すものである。特異的ハイブリダイゼーション複合体
は許容されるアニーリング条件下で形成され、「洗浄」ステップ後もハイブリダ
イズされたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのス
トリンジェンシーを決定する際に特に重要であり、更にストリンジェントな条件
では、非特異結合（即ち完全には一致しない核酸鎖間の対の結合）が減少する。
核酸配列のアニーリングに対する許容条件は、本技術分野における当業者が慣例
的に決定する。許容条件はハイブリダイゼーション実験の間は一定でよいが、洗
浄条件は所望のストリンジェンシーを得るように、従ってハイブリダイゼーショ
ン特異性も得るように実験中に変更することができる。アニーリング許容条件は
、例えば約６×SSC、約１％（w/v）のSDS及び約１００μg/mlの変性サケ精子DNA
の存在下で温度６８℃において成立する。
【００７０】 一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは或る程度、洗浄ステ
ップを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通常
、所定のイオン強度及びpHにおける特異配列の融点（Tm）より約５〜２０℃低く
なるように選択する。このTmは、所定のイオン強度及びpHの下で、完全に一致す
るプローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。Tmを計算する
式及び核酸のハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Sambrook ら (1
989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring H
arbor Press, Plainview NYに記載されており、特に2巻の9章を参照されたい。
【００７１】 本発明の、ポリヌクレオチドとポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションに
対する高ストリンジェンシー条件には、約０.２×SSC及び約１％のSDS存在下で
約６８℃において１時間の洗浄条件が含まれる。或いは、６５℃、６０℃、５５
℃または４２℃の温度で行ってもよい。SSC濃度は、約０.１％のSDS存在下で、
約０.１〜２×SSCの範囲で変化し得る。通常は、遮断剤を用いて非特異ハイブリ
ダイゼーションを阻止する。このような遮断剤には、例えば、約１００〜２００
μg/mlの変性サケ精子DNAがある。特定条件下で、例えばRNAとDNAのハイブリダ
イゼーションに有機溶剤、例えば約３５〜５０％v/vの濃度のホルムアミドを用
いることもできる。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろ
う。ハイブリダイゼーションは、特に高ストリンジェント条件下では、ヌクレオ
チド間の進化的な類似性を示唆し得る。このような類似性は、ヌクレオチド及び
ヌクレオチドにコードされるポリペプチドに対する類似の役割を強く示唆してい
る。
【００７２】 「ハイブリダイゼーション複合体」の語は、相補的塩基対間の水素結合の形成
力によって２つの核酸配列間に形成された複合体を指す。ハイブリダイゼーショ
ン複合体は、溶解状態で形成し得る（C0tまたはR0t解析等）。或いは、一方の核
酸配列が溶解状態で存在し、もう一方の核酸配列が固体支持体（例えば紙、膜、
フィルタ、チップ、ピンまたはガラススライド、或いは他の適切な基質であって
細胞若しくはその核酸が固定される基質）に固定されているような２つの核酸配
列間に形成され得る。
【００７３】 「挿入」及び「付加」の語は、１若しくは数個のアミノ酸残基またはヌクレオ
チド配列を各々付加するようなアミノ酸またはヌクレオチド配列における変化を
指す。
【００７４】 「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、伝染性疾患または遺伝性疾患に関
連する症状を指し得る。これらの症状は、細胞及び全身の防御系に作用し得る種
々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現
によって特徴づけることができる。
【００７５】 「免疫抗原性断片」とは、哺乳動物等の生命体に導入されると免疫応答を誘発
し得るようなCYAPのポリペプチドまたはオリゴペプチド断片である。「免疫抗原
性断片」の語には、本明細書中で開示したような或いは当分野で既知であるよう
な任意の抗体産出方法において有用なCYAPの任意のポリペプチドまたはオリゴペ
プチド断片も含まれる。
【００７６】 「マイクロアレイ」の語は、基質上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチド
またはその他の化合物の構成を指す。
【００７７】 「エレメント」または「アレイエレメント」の語は、マイクロアレイの環境に
おいて、基質の表面上に配置されたハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドを指
す。
【００７８】 「調節(する)」の語は、CYAPの活性の変化を指す。調節することによって例え
ば、CYAPのタンパク質活性、結合特性その他の生物学的、機能的または免疫学的
特性が増大または低下し得る。
【００７９】 「核酸」及び「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリ
ヌクレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」及び「核酸配列」の語は、ゲ
ノム起源または合成起源のDNAまたはRNAであって一本鎖または二本鎖であるか或
いはセンス鎖またはアンチセンス鎖を表し得るようなDNAまたはRNAや、ペプチド
核酸（PNA）や、任意のDNA様またはRNA様物質を指すこともある。
【００８０】 「機能的に結合した」は、第１核酸配列が第２核酸配列と機能的な関係がある
ように配置された状態を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または
発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に結
合している。同一のリーディングフレーム内で２つのタンパク質コード領域を結
合する必要がある場合、一般に、機能的に結合したDNA配列は非常に近接するか
、或いは連続し得る。
【００８１】 「ペプチド核酸」（PNA）は、アンチセンス分子または抗遺伝子物質であって
、リジンを末端とするアミノ酸残基のペプチドバックボーンに結合した、少なく
とも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドからなるものを指す。末端の
リジンは、成分に溶解性を与える。PNAは、相補的一本鎖DNAまたはRNAに優先的
に結合して転写の拡張を停止するものであり、ポリエチレングリコール化して細
胞におけるPNAの寿命を延長し得る。
【００８２】 CYAPの「翻訳後修飾」は、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラ
セミ化、タンパク分解性分割及びその他の当分野で既知の修飾を含み得る。これ
らのプロセスは、合成的または生化学的に発生し得る。生化学的修飾は、CYAPの
酵素環境に依存し、細胞タイプによって変化し得る。
【００８３】 「プローブ」は、CYAP、CYAPの相補配列またはこれらの断片をコードする核酸
配列を指し、同一核酸配列、対立遺伝子核酸配列または関連する核酸配列の検出
に用いられる。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオ
チドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に結合したものである。典
型的な標識には、放射性アイソトープ、リガンド、化学発光試薬及び酵素がある
。
【００８４】 「プライマー」は、短い核酸、通常はDNAオリゴヌクレオチドであり、相補的
塩基対を形成することで標的ポリヌクレオチドにアニーリングされ得る。プライ
マーは次に、DNAポリメラーゼ酵素によって標的DNA鎖に延在し得る。プライマー
対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による核酸配列の増幅（及び同定）
に用い得る。
【００８５】 本発明に用いるようなプローブ及びプライマーは通常、既知の配列の少なくと
も１５の連続したヌクレオチドを含んでいる。特異性を高めるために長めのプロ
ーブ及びプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも２０、２５、３０、
４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または１５０の連続したヌクレオ
チドからなるようなプローブ及びプライマーを用いてもよい。これよりもかなり
長いプローブ及びプライマーもある。表、図面及び配列リストを含む本明細書に
裏付けされた任意の長さのヌクレオチドを用いることができるものと理解された
い。
【００８６】 プローブ及びプライマーの調製及び使用方法については、Sambrook, J. ら (1
989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring H
arbor Press, Plainview NY、Ausubel, F.M. ら, (1987) Current Protocols in Molecular Biology , Greene Pubi. Assoc. & Wiley-Intersciences, New York
NY、Innisら (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications Ac
ademic Press, San Diego CA等を参照されたい。PCRプライマー対は、その目的
のためのコンピュータプログラム、例えばPrimer（Version 0.5, 1991, Whitehe
ad Institute for Biomedical Research, Cambridge MA）を用いるなどして既知
の配列から得ることができる。
【００８７】 プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のため
に本技術分野でよく知られているソフトウェアを用いて行う。例えばOLIGO 4.06
ソフトウェアは、各１００ヌクレオチドまでのPCRプライマー対の選択に有用で
あり、オリゴヌクレオチド及び最大５,０００までの大きめのポリヌクレオチド
であって３２キロベースまでのインプットポリヌクレオチド配列から得たものを
分析するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力の
ための追加機能が組込まれている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム（
テキサス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから
一般向けに入手可能）は、メガベース配列から特定のプライマーを選択すること
が可能であり、従ってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である
。Primer3プライマー選択プログラム（マサチューセッツ州ケンブリッジのWhite
head Institute／MITゲノム研究センターから一般向けに入手可能）ではユーザ
ーが「ミスプライミング・ライブラリ」をインプットすることができ、ここでプ
ライマー結合部位として避けたい配列はユーザーが指定する。Primer3は特に、
マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である。（後二者のプ
ライマー選択プログラムのソースコードは、各自のソースから得てユーザー固有
のニーズを満たすように変更してもよい。）PrimerGenプログラム（英国ケンブ
リッジ市の英国ヒトゲノムマッピングプロジェクト-リソースセンターから一般
向けに入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し
、それによって、アラインメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存
領域の何れかとハイブリダイズするようなプライマーの選択を可能にする。従っ
て、このプログラムは、固有であって保存されたオリゴヌクレオチド及びポリヌ
クレオチドの断片の同定に有用である。上記選択方法のいずれかによって同定し
たオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片は、ハイブリダイゼーション
技術において、例えばPCRまたはシークエンシングプライマーとして、マイクロ
アレイエレメントとして、或いは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補
的ポリヌクレオチドを同定する特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオ
チドの選択方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【００８８】 「組換え核酸」は天然配列ではない配列であるか或いは人為的に組み合わせな
ければ離隔しているような配列の２以上のセグメントを人為的に組み合わせて産
出した配列を有する配列である。この人為的組合せはしばしば化学合成によって
達成するが、より一般的には核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例え
ばのSambrookらの文献（前出）に記載されているような遺伝子工学的手法によっ
て達成する。組換え核酸の語は、単に核酸の一部を付加、置換または欠失した変
異核酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモーター配列に機能的に結合した
核酸配列が含まれる。このような組換え核酸は、ベクターの不可欠なエレメント
であって例えばある細胞を形質転換するために用いられるようなものであり得る
。
【００８９】 或いはこのような組換え核酸は、ウイルスベクターの不可欠なエレメントであ
って例えばワクシニアウイルスに基づくものであり得る。ワクシニアウイルスは
組換え核酸が発現する哺乳動物のワクチン接種に用いるもので、哺乳動物の防御
免疫応答を誘導する。
【００９０】 「調節エレメント」は、通常は遺伝子の未翻訳領域に由来する核酸配列であり
、エンハンサー、プロモーター、イントロン及び５'及び３'の未翻訳領域（UTR
）を含む。調節エレメントは、転写、翻訳またはRNA安定性を調節する宿主また
はウイルスタンパク質と相互作用する。
【００９１】 「レポーター分子」とは、核酸、アミノ酸または抗体を標識するのに用いられ
る化学的または生化学的成分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、
蛍光剤、化学発光剤、発色剤、基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子及びその他
の当分野で既知の成分がある。
【００９２】 DNA配列に関する「RNA等価物」は、発生した窒素塩基チミンが全てウラシルに
置換されていることと、糖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボース
から構成されていることを除いて、参照DNA配列と同一のヌクレオチド線形配列
から構成されている。
【００９３】 「サンプル」の語は、その最も広い意味で用いられる。CYAPをコードする核酸
若しくはその断片、またはCYAP自体を含む疑いのあるサンプルは、体液や、細胞
から単離された細胞、染色体、細胞小器官または膜からの抽出物や、細胞や、溶
解しているか基質に結合しているゲノムDNA、RNAまたはcDNAや、組織や、組織プ
リント等から構成され得る。
【００９４】 「特異結合」または「特異的に結合する」の語は、タンパク質またはペプチド
と、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、任意の天然成分または合成結
合成分との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造（例
えば抗原決定基即ちエピトープ）であって結合分子が認識するものが存在するか
否かに依存していることを意味している。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対
して特異的である場合、標識された遊離したＡ及びその抗体を含む反応において
、エピトープＡ（つまり遊離し、標識されていないＡ）を含むポリヌクレオチド
の存在が、抗体に結合している標識されたＡの量を低減させる。
【００９５】 「実質上精製された」の語は、自然環境から取り除かれ、或いは単離または分
離された核酸またはアミノ酸配列であって、自然に会合するその他の構成エレメ
ントの少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましいのは
少なくとも約９０％が遊離しているものを指す。
【００９６】 「置換」は、１若しくは数個のアミノ酸またはヌクレオチドを各々別のアミノ
酸またはヌクレオチドに置換することを意味する。
【００９７】 「基質」は、任意の好適な固体または半固体の支持体を指すものであって、膜
、フィルタ、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁性非磁性ビーズ、ゲル
、管、プレート、ポリマー、微細粒子、毛管が含まれる。基質は、壁、溝、ピン
、チャネル、孔等、様々な表面形態を有することができ、基質表面にはポリヌク
レオチドやポリペプチドが結合する。
【００９８】 「転写イメージ」は、所与の時間、条件での固有の細胞タイプまたは組織によ
る遺伝子発現の集合的パターンを指す。
【００９９】 「形質転換」は、外来性のDNAが宿主細胞に入り込み、宿主細胞を変化させる
プロセスを表す。形質転換は、本技術分野で知られている種々の方法に従って自
然条件または人工条件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核または
真核宿主細胞に挿入する任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形
質転換する宿主細胞の種類によって選択する。限定するものではないが形質転換
方法には、ウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、熱ショック
、リポフェクション及び微粒子銃を用いる方法がある。「形質転換された」細胞
の語には、限られた時間内に挿入されたDNAやRNAを発現するような一時的に形質
転換された細胞のみならず、安定的に形質転換された細胞であってその中に挿入
されたDNAが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主の染色体の一部とし
て複製可能であるものも含まれる。
【０１００】 ここで用いる「遺伝形質転換体」とは任意の有機体であり、限定するものでは
ないが動植物を含み、有機体の１若しくは数個の細胞が、ヒトの関与によって、
例えば本技術分野でよく知られている形質転換技術によって導入された異種核酸
を有する。核酸の細胞への導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導入
することによって、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によって或
いは組換えウイルスの導入によって行う。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育種
或いはin vitro受精を指すものではなく、組換えDNA分子の導入を指すものであ
る。本発明に基づいて予期される遺伝形質転換体には、バクテリア、シアノバク
テリア、真菌及び動植物がある。本発明の単離されたDNAは、本技術分野で知ら
れている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合によって宿
主に導入することができる。本発明のDNAをこのような有機体に移入する技術は
よく知られており、前出のSambrook ら (1989) 等の参考文献に与えられている
。
【０１０１】 特定の核酸配列の「変異体」は、核酸配列１本全部の長さに対して特定の核酸
配列と少なくとも４０％の相同性を有する核酸配列であると定義する。その際、
デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（
1999年5月7日）を用いてblastnを実行する。このような核酸対は、所定の長さに
対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、
９５％、９８％またはそれ以上の相同性を示し得る。或る変異体は、例えば「対
立遺伝子」変異体（前述）、「スプライス」変異体、「種」変異体または「多形
性」変異体として説明し得る。スプライス変異体は参照分子とかなりの相同性を
有し得るが、mRNAプロセッシング中のエキソンの交互スプライシングによって通
常多数の或いは僅かな数のポリヌクレオチドを有することになる。対応するポリ
ペプチドは、追加機能ドメインを有するか或いは参照分子に存在するドメインが
欠落していることがある。種変異体は、種相互に異なるポリヌクレオチド配列で
ある。結果的に生じるポリペプチドは通常、相互にかなりのアミノ酸相同性を有
する。多形性変異体は、与えられた種の個体間で特定の遺伝子のポリヌクレオチ
ド配列が異なる。また、多形性変異体は、１つのヌクレオチド塩基によってポリ
ヌクレオチド配列が変化する「単一ヌクレオチド多形性」（SNP）を含み得る。S
NPの存在は、例えば特定の個体群、病状または病状性向を示し得る。
【０１０２】 特定のポリペプチド配列の「変異体」は、ポリペプチド配列の１本の長さ全体
で特定のポリペプチド配列に対して少なくとも４０％の相同性を有するポリペプ
チド配列として画定される。ここで、デフォルトパラメータに設定した「BLAST
2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastpを実行する
。このようなポリペプチド対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％
、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれ以上の
相同性を示し得る。
【０１０３】 発明 本発明は、新規なヒト細胞骨格関連タンパク質（CYAP）、CYAPをコードするポ
リヌクレオチド、及び、神経系障害、自己免疫／炎症疾患及び癌を含む細胞増殖
異常の診断、治療並びに予防にこれらの配列を利用する方法の発見に基づくもの
である。
【０１０４】 表１は、CYAPをコードする完全長のヌクレオチド配列の構築に用いたIncyteク
ローンを示す。列１及び列２は、ポリペプチド及びポリヌクレオチドの配列番号
（SEQ ID NO）を各々示している。列３はIncyteクローンのクローンIDを示して
おり、各CYAPをコードする核酸はここで同定されたものである。列４はcDNAライ
ブラリを示しており、列３のクローンはここから単離したものである。列５は、
Incyteクローン及びこれに対応するcDNAライブラリを示している。cDNAライブラ
リが示されていないIncyteクローンは、プールされているcDNAライブラリから得
られたものである。列５のIncyteクローンを用いて各CYAPのコンセンサスヌクレ
オチド配列を構築した。列５のIncyteクローンは、ハイブリダイゼーション技術
における断片として有用である。
【０１０５】 表２の列は、本発明の各ポリペプチドの様々な特性を示している。列１は配列
番号（SEQ ID NO）を、列２は各ポリペプチド中のアミノ酸残基の数を、列３は
潜在的リン酸化部位を、列４は潜在的グリコシル化部位を、列５はサイン（sign
ature）配列及びモチーフを有するアミノ酸残基を、列６はBLAST分析によって同
定された相同配列、列７は分析方法と場合によってはその分析方法が利用できる
検索可能なデータベースを示している。列７の分析方法を用いて、配列相同性及
びタンパク質モチーフから各ポリペプチドの特徴付けを行った。
【０１０６】 表３の列は、組織特異性と、CYAPをコードするヌクレオチド配列に関係がある
疾患、障害または症状とを示している。表３の列１はヌクレオチドの配列番号を
、列２は列１のヌクレオチド配列の断片を示している。これらの断片は、例えば
配列番号６乃至１０を同定し、配列番号６乃至１０と関連するポリヌクレオチド
配列を区別するためのハイブリダイゼーションまたは増幅の技術において有用で
ある。これらの断片によりコードされるポリヌクレオチドは、例えば免疫抗原性
ペプチドとして有用である。列３は、CYAPを発現する組織カテゴリーを組織全体
に対するCYAP発現割合として示している。列４は、CYAPを発現する組織に関連す
る疾患、障害または症状を、CYAPを発現する組織全体に対する割合として示して
いる。列５は、各cDNAライブラリをサブクローニングするために用いたベクター
を示している。
【０１０７】 生殖組織における配列番号８の発現は、特記事項である。
【０１０８】 表４の列では、cDNAライブラリの作製に用いた組織の説明を示している。CYAP
をコードするcDNAのクローンはcDNAライブラリから単離したものである。列１は
、ヌクレオチドの配列番号を、列２はクローン単離元であるcDNAライブラリを、
列３は列２のcDNAライブラリに関連する組織の起源その他の書誌的情報を示して
いる。
【０１０９】 配列番号１０は、６５.６０〜７２.６０センチモルガン以内の間隔で染色体１
６にマッピングする。
【０１１０】 本発明には、CYAPの変異体も含まれる。好適なCYAPの変異体のアミノ酸配列は
、CYAPアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、または約９５％もの一致
率を有し、CYAPの機能的若しくは構造的特徴を少なくとも１つ有するような変異
体である。
【０１１１】 本発明には、CYAPをコードするポリヌクレオチドも含まれる。或る例では、CY
APをコードする配列番号６乃至１０からなる群から選択された配列を有するポリ
ヌクレオチド配列が本発明に含まれている。配列番号６乃至１０のポリヌクレオ
チド配列は、配列表に示されているように等価RNA配列と同等の価値を有してい
るが、窒素塩基チミンの出現はウラシルに置換され、糖のバックボーンはデオキ
シリボースではなくシリボースから構成されている。
【０１１２】 本発明には、CYAPをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列も含まれる。
具体的には、そのようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、CYAPをコードする
ポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、或いは少なくとも約８５％、また
は少なくとも約９５％もの一致率を有する。本発明の或る実施態様では、配列番
号６乃至１０からなる群から選択されたアミノ酸配列と少なくとも約７０％、或
いは少なくとも約８５％、または少なくとも約９５％もの一致率を有するような
配列番号６乃至１０からなる群から選択された配列を有するポリヌクレオチド配
列の変異配列を含む。上記の任意のポリヌクレオチドの変異体は、CYAPの機能的
若しくは構造的特徴を少なくとも１つ有するアミノ酸配列をコードし得る。
【０１１３】 当業者であれば、遺伝暗号の縮重の結果、CYAPをコードする多数のポリヌクレ
オチド配列（既知の遺伝子または天然の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最低限
の類似性しか有しないポリヌクレオチド配列もある）を産出し得ることは理解で
きよう。したがって本発明には、可能コドン選択に基づく組合せの選択によって
産出し得るようなありとあらゆる可能性のあるポリヌクレオチド配列変異体を網
羅し得る。これらの組合せは、天然のCYAPのポリヌクレオチド配列に適用される
ような標準トリプレット遺伝暗号を基に作られるものであり、このような変異は
全て明確に開示されているものと考えられる。
【０１１４】 CYAP及びその変異体をコードするヌクレオチド配列は通常、好適に選択された
ストリンジェントな条件下で天然のCYAPのヌクレオチド配列とハイブリダイズ可
能であるが、CYAPまたはその誘導体であって実質上異なるコドンの使用法がある
もの、例えば天然に存在しないコドンの封入があるものをコードするヌクレオチ
ド配列を作り出すことは有益であろう。宿主が特定のコドンを利用する頻度に基
づいて、特定の真核又は原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようにコ
ドンを選択することが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えることなく
CYAP及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質上変更する別の理由に
は、天然の配列から作製される転写物より好ましい、例えば半減期が長いなどの
特性を有するRNA転写物の作製がある。
【０１１５】 本発明には、CYAP、CYAP誘導体及びこれらの断片をコードするDNA配列又はそ
れらの断片を完全に合成化学によって作製することも含まれる。作製後、当分野
でよく知られている試薬を用いて、この合成配列を任意の様々な入手可能な発現
ベクター及び細胞系中に挿入し得る。更に、合成化学を用いてCYAPまたはその任
意の断片をコードする配列に突然変異を誘導し得る。
【０１１６】 更に本発明には、種々のストリンジェントな条件下で、請求項に記載のポリヌ
クレオチド配列、特に配列番号６乃至１０で示される配列及びそれらの断片にハ
イブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列も含まれる（Wahl, G.M. and S.L. Be
rger (1987) Methods Enzymol. 152:399-407、Kimmel. A.R. (1987) Methods En
zymol. 152:507-511.等を参照）。
【０１１７】 DNAシークエンシングの方法は当分野でよく知られており、本発明の何れの実
施例もDNAシークエンシング方法を用いて実施可能である。DNAシークエンシング
方法には酵素を用いることができ、例えばDNAポリメラーゼIのクレノウ断片、SE
QUENASE（US Biochemical, Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（PE Biosystems,
Foster City CA）、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham, Pharmacia Biotech,
Piscataway NJ）を用いることができる。或いは、例えばELONGASE増幅システム
（Life Technologies, Gaithersburg MD）において見られるように、ポリメラー
ゼと校正エキソヌクレアーゼを併用することができる。好適には、MICROLAB2200
液体転移システム（Hamilton, Reno, NV）、PTC200サーマルサイクラー（MJ Res
earch, Watertown MA）及びABI CATALYST 800サーマルサイクラー（PE Biosyste
ms）等の装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ABI 373 或いは 377 DNA
シークエンシングシステム（PE Biosystems）、MEGABACE 1000 DNAシークエンシ
ングシステム（Molecular Dynamics, Sunnyvale CA）または当分野でよく知られ
ている他の方法を用いてシークエンシングを行う。結果として得られた配列を当
分野でよく知られている種々のアルゴリズムを用いて分析する。（Ausubel, F.M
. (1997) Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New Yo
rk NY, unit 7.7、Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnology , Wiley VCH, New York NY, pp. 856-853.等を参照）。
【０１１８】 CYAPをコードする核酸配列を、部分的ヌクレオチド配列を利用し且つ当分野で
よく知られているPCR法をベースにした種々の方法を用いて伸長させ、プロモー
ター及び調節要素等の上流配列を検出することができる。例えば、使用し得る方
法の１つである制限部位PCR法は、ユニバーサルプライマー及びネステッドプラ
イマーを用いてクローニングベクター内のゲノムDNAから未知の配列を増幅する
方法である（Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic 2:318-322等を参照）。別
の方法に逆PCR法があり、これは広範な方向に伸長させたプライマーを用いて環
状化した鋳型から未知の配列を増幅する方法である。鋳型は、既知のゲノム遺伝
子座及びその周辺の配列からなる制限断片から得る（Triglia, T.ら (1988) Nuc
leic Acids Res 16:8186等を参照）。第３の方法としてキャプチャPCR法があり
、これはヒト及び酵母菌人工染色体DNAの既知の配列に隣接するDNA断片をPCR増
幅する方法に関与している。（Lagerstrom, M.ら(1991) PCR Methods Applic 1:
111-119等を参照。）この方法では、PCRを行う前に多重制限酵素の消化及び連結
反応を用いて未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入することが可能である
。また、未知の配列を検索するために用い得る別の方法については当分野で知ら
れている。（Parker, J.D.ら (1991) Nucleic Acids Res. 19:3055-3060等を参
照）。更に、PCR、ネステッドプライマー及びPromoterFinder（商標）ライブラ
リ（Clontech, Palo Alto CA）を用いてゲノムDNAをウォーキングすることがで
きる。この手順は、ライブラリをスクリーニングする必要がなく、イントロン／
エキソン接合部を見付けるのに有用である。全てのPCRベースの方法に対して、
市販されているソフトウェア、例えばOLIGO 4.06プライマー分析ソフトウェア（
National Biosciences, Plymouth MN）或いは別の好適なプログラムを用いて、
長さが約２２〜３０ヌクレオチド、GC含有率が約５０％以上、温度約６８℃〜７
２℃で鋳型に対してアニーリングするようにプライマーを設計し得る。
【０１１９】 完全長cDNAをスクリーニングする際は、より大きなcDNAを含むようにサイズ選
択されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、ランダムに初回抗原刺激を受
けたライブラリは、しばしば遺伝子の５'領域を有する配列を含み、オリゴd(T)
ライブラリが完全長cDNAを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブ
ラリは、５'非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。
【０１２０】 市販されているキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングま
たはPCR産物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認することが
できる。具体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動による分離の
ための流動性ポリマーと、４つの異なるヌクレオチドに特異的であるような、レ
ーザで活性化される蛍光色素と、放出された波長の検出に利用するCCDカメラと
を有し得る。出力／光の強度は、適切なソフトウェア（Perkin-Elmer社のGENOTY
PER、SEQUENCE NAVIGATOR等）を用いて電気信号に変換し得る。サンプルのロー
ドからコンピュータ分析及び電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制
御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しな
いようなDNA小断片のシークエンシングに特に適している。
【０１２１】 本発明の別の実施例では、CYAPをコードするポリヌクレオチド配列またはその
断片を、適切な宿主細胞内でCYAP、CYAPの断片またはその機能的等価物を発現さ
せるような組換えDNA分子内でクローニングし得る。遺伝暗号固有の宿重に起因
して、実質的同一或いは機能的等価のアミノ酸配列をコードするような別のDNA
配列を作製してCYAPの発現に利用し得る。
【０１２２】 種々の目的でCYAPがコードする配列を変えるために、本発明のヌクレオチド配
列を当分野で通常知られている方法を用いて組み換えることができる。ここで目
的には、限定するものではないが遺伝子産物のクローニング、プロセッシング、
発現の調節がある。遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのランダムなフラグ
メンテーション及びPCR再アセンブリによるDNAシャッフリングを用い、ヌクレオ
チド配列を組み換えることが可能である。例えば、オリゴヌクレオチド仲介定方
向突然変異誘導を利用して、新規な制限部位の生成、グリコシル化パターンの変
更、コドン優先の変更、スプライス変異体の生成等を行う突然変異を導入し得る
。
【０１２３】 本発明のヌクレオチドは、MolecularBreedingTM（Maxygen Inc., Santa Clara
CA。米国特許第5,837,458号、Chang, C.-C.ら (1999) Nat. Biotechnol. 17:79
3-797、Christians, F.C.ら (1999) Nat. Biotechnol. 17:259-264、Crameri, A
. ら (1996) Nat. Biotechnol. 14:315-319に記載）等のDNAシャッフリング技術
の対象となり、CYAPの生物学的特性、例えば生物活性、酵素力、或いは他の分子
や化合物との結合力等を変更または向上させ得る。DNAシャッフリングは、遺伝
子断片のPCR仲介再組換えを用いて遺伝子変異体のライブラリを生成するプロセ
スである。ライブラリはその後、その遺伝子変異体を所望の特性に同定するよう
な選択またはスクリーニングにかける。次にこれらの好適な変異体をプールし、
更に反復してDNAシャッフリング及び選択／スクリーニングを行ってもよい。こ
のように、遺伝の多様性は「人為的」品種改良及び急速な分子の進化を経て創生
される。例えば、ランダムポイント突然変異を有する単一の遺伝子の断片を再結
合し、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化されるまでシャッフリング
することができる。或いは、所定の遺伝子を同種または異種のいずれかから得た
同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子と再結合し、それによって天然に存在する複
数の遺伝子の遺伝多様性を、指図された制御可能な方法で最大化させることがで
きる。
【０１２４】 別の実施例によれば、当分野でよく知られている化学的方法を用いて、CYAPを
コードする配列の全部或いは一部を合成し得る（Caruthers. M.H.ら (1980) Nuc
leic. Acids Symp. Ser 7:215-223、Horn, T.ら (1980) Nucleic. Acids Symp.
Ser. 7:225-232等を参照）。或いは、化学的方法を用いてCYAPそれ自体またはそ
の断片を合成し得る。例えば、種々の液相または固相技術を用いてペプチド合成
を行うことができる（Creighton, T. (1984) Proteins, Structures and Molecu lar Properties , WH Freeman, New York NY, pp. 55-60、Roberge, J.Y. ら (19
95) Science 269:202-204等を参照）。自動合成はABI 431Aペプチドシンセサイ
ザ（Perkin Elmer）を用いて達成し得る。更にCYAPのアミノ酸配列またはその任
意の一部は、直接合成する間、または他のタンパク質から得た配列またはその任
意の一部と結合する間、或いはその両方を行っている間に変更し、変異型ポリペ
プチドを生成することが可能である。
【０１２５】 ペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィーを用いて実質上精製可能であ
る（Chiez, R.M.and F.Z. Regnier (1990) Methods Enzymol. 182:392-421等を
参照）。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングによって
確認することができる（前出のCreighton, pp.28-53等を参照）。
【０１２６】 生物学的に活性なCYAPを発現させるために、CYAPをコードするヌクレオチド配
列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入することができる。好適な発現
ベクターとは即ち好適な宿主内で挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の
調節に必要な要素を含むベクターである。必要な要素には、ベクター及びCYAPを
コードするポリヌクレオチド配列におけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型
プロモーター、５'及び３'の非翻訳領域などの調節配列がある。このような要素
は、長さ及び特異性が様々である。固有開始シグナルを用いて、CYAPをコードす
る配列をより効果的に翻訳することが可能もある。このようなシグナルには、AT
G開始コドンと、コザック配列などの近傍の配列が含まれる。CYAPをコードする
配列及びその開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場
合は、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであろう。し
かしながら、コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、インフ
レームのATG開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベクターに含ま
れるようにすべきである。外来性の翻訳要素及び開始コドンは、様々な天然物及
び合成物を起源とし得る。発現の効率は、用いられる特定の宿主細胞系に好適な
エンハンサーを包含することによって高めることができる（Scharf, D. ら (199
4) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162.等を参照）。
【０１２７】 当業者によく知られている方法を用いて、CYAPをコードする配列と、好適な転
写及び翻訳調節要素とを含む発現ベクターを構築することが可能である。この方
法には、in vitro組換えDNA技術、合成技術及びin vivo遺伝子組換え技術がある
（Sambrook, J. ら (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Sp
ring Harbor Press, Plainview NYの4, 8, 16-17章、Ausubel, F.M. ら. (1995)
Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY
の9, 13, 16章等を参照）。
【０１２８】 種々の発現ベクター／宿主系を利用して、CYAPをコードする配列を保持及び発
現し得る。限定するものではないがこのような発現ベクター／宿主系には、組換
えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換
させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌や、ウイルス発現ベ
クター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベク
ター（例えばカリフラワーモザイクウイルスCaMVまたはタバコモザイクウイルス
TMV）または細菌発現ベクター（例えばTiまたはpBR322プラスミド）で形質転換
させた植物細胞系、動物細胞系などの微生物等がある（前出のSambrook、前出の
Ausubel、Van Heeke, G. and S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-
5509、Bitter, G.A.ら (1987) Methods Enzymol. 153:516-544; Scorer、C.A.
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年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw
Hill New York NY, pp.191-196、Logan, J. and T. Shenk (1984) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 81:3655-3659、Harrington, J.J. ら (1997) Nat. Genet. 15:
345-355等を参照）。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまた
はワクシニアウイルス由来の発現ベクターまたは種々の細菌性プラスミド由来の
発現ベクターを用いて、ポリヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団
へ輸送することができる（Di Nicola, M. ら (1998) Cancer Gen. Ther. 5(6):3
50-356、Yu, M. ら (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(13):6340-6344、Bu
ller, R.M. ら (1985) Nature 317(6040):813-815; McGregor, D.P. ら (1994)
Mol. Immunol. 31(3):219-226、Verma, I.M. and N. Somia (1997) Nature 389:
239-242等を参照）。本発明は、使用する宿主細胞によって限定されるものでは
ない。
【０１２９】 細菌系では、CYAPをコードするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて多数
のクローニングベクター及び発現ベクターを選択し得る。例えば、CYAPをコード
するポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング及び増殖
には、PBLUESCRIPT（Stratagene, La Jolla CA）またはPSPORT１プラスミド（Li
fe Technologies）などの多機能大腸菌ベクターを用いることができる。CYAPを
コードする配列の、ベクターの多数のクローニング部位への連結反応によって、
lacＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌を同定するため
の比色スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニング
された配列におけるin vitro転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーフ
ァージによる一本鎖の救出、入れ子状態の欠失の生成にも有用であろう（Van He
eke, G. and S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509.等を参照）
。多量のCYAPが必要な場合、例えば抗体を生成する場合などには、CYAPの発現を
ハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力な誘導T5バクテリオ
ファージプロモーターまたは誘導T7バクテリオファージプロモーターを含むベク
ターが使用できる。
【０１３０】 酵母の発現系を使用してCYAPを生成し得る。α因子、アルコールオキシダーゼ
、PGHプロモーター等の構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多数のベクタ
ーが、酵母菌サッカロミセス−セレビジエまたはPichia pastorisに使用可能で
ある。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質を分泌或いは細胞内へ
の保持のいずれかに誘導し、安定した増殖のために外来配列の宿主ゲノムへの組
込みを可能にする（前出のAusubel (1995)、前出のBitter、前出のScorer等を参
照）。
【０１３１】 植物系を使用してCYAPを発現することも可能である。CYAPをコードする配列の
転写は、ウイルスプロモーター、例えば単独或いはTMV（タカマツ, N. (1987) E
MBO J 6:307-311）由来のオメガリーダー配列と組み合わせて用いられるようなC
aMV由来の35S及び19Sプロモーターによって促進される。或いは、RUBISCOの小サ
ブユニット等の植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを用いてもよい
（前出のCoruzzi、前出のBroglie、前出のWinter等を参照）。これらの構成物は
、直接DNA形質転換または病原体を媒介とする形質移入によって、植物細胞内に
導入可能である。（『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology ) (1992) McGraw Hill New York NY, pp.191-196等
を参照。） 哺乳動物細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用し得る。発現
ベクターとしてアデノウイルスを用いる場合、CYAPをコードする配列は、後発プ
ロモーター及び３連リーダー配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体に連
結反応され得る。可欠E1またはE3領域へウイルスのゲノムを挿入し、宿主細胞で
CYAPを発現する感染ウイルスを得ることが可能である。（Logan, J.and T. Shen
k (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659等を参照。）更に、ラウス肉腫
ウイルス（RSV）エンハンサー等の転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細
胞における発現を増大させ得る。SV40またはEBVをベースにしたベクターを用い
てタンパク質を高レベルで発現させることもできる。
【０１３２】 ヒト人工染色体（HAC）を用いて、プラスミドに含まれ且つプラスミドから発
現するものより大きなDNAの断片を輸送することもできる。治療目的のために約
６kb〜１０MbのHACを作製し、従来の輸送方法（リポソーム、ポリカチオンアミ
ノポリマー、またはベシクル）で供給する（Harrington. J.J. ら (1997) Nat G
enet.15:345-355.等を参照）。
【０１３３】 長期にわたり哺乳動物系内で組換えタンパク質を生成するためには、細胞株内
のCYAPの安定発現が望ましい。例えば、発現ベクターであって複製発現因子、内
在性発現因子、或いはその両者のウイルス起源を含むものと、同一或いは別のベ
クター上の選択可能マーカー遺伝子とを用いて、CYAPをコードする配列を細胞株
に形質転換することが可能である。ベクターの導入後、選択培地に移す前に強化
培地で約１〜２日間細胞を増殖させることができる。選択可能マーカーの目的は
選択培地への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーが存在することによ
り、導入された配列をうまく発現するような細胞の成長及び回収が可能となる。
安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技
術を用いて増殖可能である。
【０１３４】 任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。限定するものでは
ないがこのような選択系には、tk−単純細胞のために用いられるヘルペスウイル
スチミジンキナーゼ遺伝子と、apr−細胞のために用いられるアデニンホスホリ
ボシルトランスフェラーゼ遺伝子がある（Wigler, M. ら (1977) Cell 11:223-2
32、Lowy, I. ら (1980) Cell 22:817-823等を参照）。また、選択の基礎として
代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を用いることができる。例えばdh
frはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグリコシッドネオマイ
シン及びG-418に対する耐性を与え、alsはクロルスルフロンに対する耐性を、pa
tはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を各々与える
（Wigler, M. ら (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567-3570、Colbere-
Garapin, F. ら (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14 等を参照）。この他の選択可
能遺伝子、例えば、代謝のための細胞要求を変えるtrpB及びhisDは、文献に記載
されている（Hartman, S.C.and R.C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 85:8047-8051等を参照）。可視マーカー、例えばアニトシアニン、緑色蛍
光タンパク質（GFP；Clontech）、βグルクロニダーゼ及びその基質βグルクロ
ニド、またはルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリン等を用いてもよい。これ
らのマーカーを用いて、トランスフォーマントを特定するだけでなく、特定のベ
クター系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現を定量することが可能
である（Rhodes, C.A. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131等を参照）。
【０１３５】 マーカー遺伝子発現の存在／不存在によって目的の遺伝子の存在が示唆されて
も、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、CYAPをコー
ドする配列がマーカー遺伝子配列内に挿入された場合、CYAPをコードする配列を
含む形質転換細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により同定することが可能であ
る。または単一プロモーター制御下で、CYAPをコードする配列とタンデムにマー
カー遺伝子を配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺
伝子の発現は通常、タンデム遺伝子の発現も示す。
【０１３６】 一般に、CYAPをコードする核酸配列を含み且つCYAPを発現する宿主細胞は、当
業者によく知られている種々の方法を用いて同定することが可能である。限定す
るものではないが当業者によく知られている方法には、DNA-DNA或いはDNA-RNAハ
イブリダイゼーション、PCR法、核酸或いはタンパク質の検出、定量、或いはそ
の両方を行うための膜系、溶液ベース或いはチップベースの技術を含むタンパク
質バイオアッセイまたはイムノアッセイ技術がある。
【０１３７】 特異的ポリクローナル抗体または特異的モノクローナル抗体を用いてCYAPの発
現の検出及び計測を行うための免疫学的方法は、当分野で公知である。このよう
な技術の例としては、酵素に結合したイムノソルベントアッセイ（ELISA）、ラ
ジオイムノアッセイ（RIA）、蛍光活性化細胞選別（FACS）などが挙げられる。C
YAP上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部
位モノクローナルベースのイムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immun
oassay）が好ましいが、競合結合アッセイも用いることもできる。これらのアッ
セイ及びこれ以外のアッセイは、当分野で公知である（Hampton. R. ら (1990) Serological Methods, a Laboratory Manual. APS Press. St Paul. MN, Sect.
IV、Coligan, J. E. ら (1997) Current Protocols in Immunology, Greene Pub
. Associates and Wiley-Interscience, New York NY、Pound, J.D. (1998) Imm unochemical Protocols , Humans Press, Totowa NJ等を参照）。
【０１３８】 多岐にわたる標識方法及び結合方法が、当業者に知られており、様々な核酸ア
ッセイおよびアミノ酸アッセイにこれらの方法を用い得る。CYAPをコードするポ
リヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼー
ションプローブ或いはPCRプローブを産出する方法には、オリゴ標識化、ニック
トランスレーション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるPCR
法がある。或いは、CYAPをコードする配列またはその任意の断片を、mRNAプロー
ブを産出するためのベクターにクローニングすることも可能である。このような
ベクターは、当分野において知られており、市販もされており、T7、T3またはSP
6等の好適なRNAポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドを加えて、in vitroで
RNAプローブの合成に用いることができる。このような方法は、例えばAmersham
Pharmacia Biotech、Promega（Madison WI）、U.S. Biochemical等から市販され
ている種々のキットを用いて実行することができる。検出を容易にするために用
い得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質、補助因子、インヒビター、
磁気粒子のほか、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤等がある。
【０１３９】 CYAPをコードするヌクレオチド配列を用いて形質転換した宿主細胞は、細胞培
地からのタンパク質の回収及び発現に適した条件下で培養し得る。形質転換細胞
から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列
、ベクター、或いはその両者に依存する。当業者であれば理解し得るように、CY
APをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、原核細胞膜または真核
細胞膜を透過するCYAPの直接分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計し得
る。
【０１４０】 更に、宿主細胞株の選択は、挿入した配列の発現を調節する能力または発現し
たタンパク質を所望の形に処理する能力によって行い得る。限定するものではな
いがこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコ
シル化、リン酸化、脂質化及びアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」また
は「プロ」形を切断するような翻訳後処理を利用して、タンパク質のターゲティ
ング、折りたたみ及び／または活性を特定することも可能である。翻訳後の活性
のための固有の細胞装置及び特徴のある機構を有する種々の宿主細胞（例えばCH
O、HeLa、MDCK、MEK293、WI38等）は、American Type Culture Collection（ATC
C, Bethesda, VA）から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾及び処理
を確実にするように選択し得る。
【０１４１】 本発明の別の実施例では、CYAPをコードする天然の核酸配列、修飾核酸配列ま
たは組換え核酸配列を、上記任意の宿主系において融合タンパク質の翻訳をもた
らす異種配列に連結反応させることができる。例えば、市販されている抗体を用
いて認識可能な異種部分を含むキメラCYAPタンパク質は、CYAP活性阻害剤に対す
るペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部
分及び異種ペプチド部分も、市販されている親和性基質を用いて融合タンパク質
の精製を促進し得る。限定されるものではないがこのような部分には、グルタチ
オンＳトランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質（MBP）、チオレ
ドキシン（Trx）、カルモジュリン結合ペプチド（CBP）、6-His、FLAG、c-myc、
赤血球凝集素（HA）がある。GSTは固定化グルタチオン上で、MBPはマルトース上
で、Trxはフェニルアルシンオキシド上で、CBPはカルモジュリン上で、そして6-
Hisは金属キレート樹脂上で、同族の融合タンパク質の精製を可能にする。FLAG
、c-myc及び赤血球凝集素（HA）は、これらのエピトープ標識を特異的に認識す
る市販されているモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いて、融合タ
ンパク質の免疫親和性精製を可能にする。また、融合タンパク質を遺伝子操作し
、CYAPが精製後に異種部分から切断され得るように、CYAPコード配列と異種タン
パク質配列の間にタンパク質分解切断部位を含めることもできる。融合タンパク
質の発現及び精製方法は、前出のAusubel (1995) 10章に記載されている。市販
されている種々のキットを用いて融合タンパク質の発現及び精製を促進すること
もできる。
【０１４２】 本発明の更に別の実施例では、TNTウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚
芽抽出系（Promega）を用いて、放射能標識したCYAPの合成がin vitroで可能で
ある。これらの系は、T7、T3またはSP6プロモーターと機能的に結合したタンパ
ク質コード配列の転写及び翻訳を結合する。翻訳は、例えば35Sメチオニンのよ
うな放射能標識したアミノ酸前駆体の存在下で起こる。
【０１４３】 治療 化学的及び構造的類似性、例えば配列及びモチーフとの関連における類似性が
、CYAPの領域と細胞骨格関連タンパク質間に存在する。更にCYAPの発現は、細胞
増殖、癌及び炎症に密接に関連している。従ってCYAPは、神経系障害、自己免疫
／炎症疾患及び癌を含む細胞増殖異常において或る役割を果たすものと考えられ
る。CYAPの発現または活性の増大に関連する疾患の治療においては、CYAPの発現
または活性を低下させることが望ましい。また、CYAPの発現または活性の低下に
関連する疾患の治療においては、CYAPの発現または活性を増大させることが望ま
しい。
【０１４４】 従って、或る実施例において、CYAPの発現または活性の低下に関連した疾患の
治療または予防のために、患者にCYAPまたはその断片や誘導体を投与することが
可能である。限定するものではないがこのような疾患の例として神経系障害が含
まれ、その中には癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマ
ー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病その他の錐体外路障害、
筋萎縮性側策硬化その他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性
網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症その他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス
性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊
髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー、クロイツフェルト
‐ヤコブ病及びガストマン‐ストラウスラー‐シャインカー症候群を含むプリオ
ン病と、致死性家族性不眠症、神経系の栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節
硬化症、小脳網膜性血管芽腫症（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、
脳３叉神経血管症候群、精神薄弱その他の中枢神経系発達障害、脳性麻痺、神経
骨格異常、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄病、筋ジストロフィーその他の神
経筋疾患、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌
性及び中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分障害、不安
障害及び精神分裂病を含む精神障害と、季節型感情障害（SAD）と、静座不能、
健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジスト
ニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病が含まれ、また自
己免疫／炎症疾患も含まれ、その中には後天性免疫不全症候群（AIDS）、アジソ
ン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、
喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、
自己免疫多発性内分泌腺障害症（APECED）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、ク
ローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時
性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパ
スチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性
大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜の炎症、骨関節炎、
骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、
強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性紅斑性狼瘡、全
身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌
の合併症、血液透析、体外循環、ウイルス性感染症、細菌性感染症、真菌性感染
症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症及び外傷が含まれ、また細胞増殖
異常も含まれ、その中には日光性角化症、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症
、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間
ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症と、腺癌、白血病、リ
ンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌を含む癌、具体的には副腎、膀胱、骨、
骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、
卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状
腺、子宮の癌等が含まれる。
【０１４５】 別の実施例では、CYAPまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを患者に
投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むCYAPの発現または活性の
低下に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【０１４６】 更に別の実施例では、実質的に精製されたCYAPを含む医薬品成分を好適な医薬
用担体と共に患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むCYAP
の発現または活性の低下に関連した疾患を治療または予防することも可能である
。
【０１４７】 更に別の実施例では、CYAPの活性を調節するアゴニストを患者に投与して、限
定するものではないが上記した疾患を含むCYAPの発現または活性の低下に関連し
た疾患を治療または予防することも可能である。
【０１４８】 更に別の実施例では、患者にCYAPのアンタゴニストを投与して、CYAPの発現ま
たは活性の増大に関連した疾患を治療または予防することが可能である。限定す
るものではないがこのような疾患の例には、上記した神経系障害、自己免疫／炎
症疾患及び細胞増殖異常がある。一実施態様においては、アンタゴニストとして
直接的に、或いはCYAPを発現する細胞または組織に薬剤を輸送するターゲティン
グまたは輸送機構として間接的にCYAPと特異結合する抗体を用いることができる
。
【０１４９】 別の実施例では、CYAPをコードするポリヌクレオチドの相補体を発現するベク
ターを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むCYAPの発現
または活性の増大に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【０１５０】 別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニ
スト、相補配列、またはベクターを、別の好適な治療薬と組み合わせて投与する
こともできる。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従
ってを選択し得る。治療薬と組み合わせることにより、上記した種々の疾患の治
療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いることにより少量の各
薬剤で医薬効果をあげることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減
し得る。
【０１５１】 CYAPのアンタゴニストは、本技術分野で一般的に知られている方法を用いて製
造し得る。具体的には、精製されたCYAPを用いて抗体を作るか、治療薬のライブ
ラリをスクリーニングして、CYAPと特異結合するものを同定することが可能であ
る。CYAPの抗体も、本技術分野で一般的に知られている方法を用いて製造するこ
とが可能である。限定するものではないがこのような抗体には、ポリクローナル
抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fab断片及びFab発現ライ
ブラリによって作られた断片が含まれ得る。中和抗体（即ち二量体の形成を阻害
する抗体）は通常、治療用に好適である。
【０１５２】 抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト、その他を含む
種々の宿主は、CYAP、またはCYAPの任意の断片またはオリゴペプチドであって免
疫抗原性の特性を有するものを注入することによって免疫化することができる。
宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる
。限定するものではないがこのようなアジュバントには、フロイントアジュバン
トと、水酸化アルミニウム等のミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン、プ
ルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペッ
トヘモシニアン、ジニトロフェノール等の界面活性剤とがある。ヒトに用いられ
るアジュバントの中では、BCG（カルメット‐ゲラン杆菌）及びコリネバクテリ
ウム‐パルヴムが特に好ましい。
【０１５３】 CYAPに対する抗体を誘導するために用いるオリゴペプチド、ペプチドまたは断
片は、少なくとも約５のアミノ酸からなり、一般的には少なくとも約１０のアミ
ノ酸からなるアミノ酸配列を有するものが好ましい。これらのオリゴペプチド、
ペプチドまたは断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であり且
つ小さな天然の分子の全アミノ酸配列を含むことが望ましい。CYAPアミノ酸の短
い伸長部は、別のタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシニアンの配列
と融合し、キメラ分子に対する抗体が産生され得る。
【０１５４】 CYAPに対するモノクローナル抗体は、抗体分子を産生する任意の技術を用いて
、培地内の連続した細胞株によって作製し得る。限定するものではないがこのよ
うな技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術及びEBV-ハ
イブリドーマ技術がある（Kohler, G. ら. (1975) Nature 256:495-497、Kozbor
, D. ら (1985) .J. Immunol. Methods 81:31-42、Cote, R.J. ら (1983) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030、Cole, S.P. ら (1984) Mol. Cell Biol.
62:109-120等を参照）。
【０１５５】 更に、「キメラ抗体」を作製するために開発した技術、例えば好適な抗原特異
性及び生物学的活性を有する分子を得るためのマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝
子へのスプライシングを用いることが可能である（Morrison, S.L.ら. (1984) P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855、Neuberger, M.S.ら (1984) Nature
312:604-608、タケダ, S.ら (1985) Nature 314:452-454等を参照）。或いは、
一本鎖抗体を産生するために説明された技術を適用し、本技術分野で知られてい
る方法を用いて、CYAP特異性一本鎖抗体を産生し得る。関連特異性を有するがイ
ディオタイプ組成が異なるような抗体を、ランダムな組合せの免疫グロブリンラ
イブラリからチェーンシャッフリングによって産生することもできる（Burton D
.R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10134-10137等を参照）。
【０１５６】 抗体の産生は、リンパ球集団におけるin vivo産生の誘導によって、或いは免
疫グロブリンライブラリのスクリーニングまたは文献に開示されているような高
特異結合試薬のパネルのスクリーニングによっても行い得る（Orlandi, R. ら (
1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833-3837、Winter, G. ら (1991) Nat
ure 349:293-299等を参照）。
【０１５７】 CYAPのための特異結合部位を有する抗体を産生することもできる。例えば、限
定するものではないがこのような断片には、抗体分子のペプシン消化によって作
製されるF(ab')2 断片と、F(ab')2 断片のジスルフィド架橋を減らすことによっ
て作製されるFab断片とがある。或いは、Fab発現ライブラリを作製することによ
って、モノクローナルFab断片を所望の特異性と迅速且つ容易に同定することが
可能となる（Huse, W.D. ら (1989) Science 256:1275-1281等を参照）。
【０１５８】 種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体
を同定することができる。確立された特異性を有するポリクローナル抗体または
モノクローナル抗体の何れかを用いる免疫放射線アッセイまたは競合結合アッセ
イに対する数々のプロトコルは、本技術分野において公知である。このようなイ
ムノアッセイは通常、CYAPとその特異性抗体間の複合体形成の計測に関与してい
る。２つの非干渉性CYAPエピトープに反応するモノクローナル抗体を用いるよう
な、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合
結合アッセイを利用してもよい（前出のPoundの文献）。
【０１５９】 ラジオイムノアッセイ技術と共に様々な方法、例えばスキャッチャード分析を
用いて、CYAPに対する抗体の親和性を評価する。親和性は結合定数Kaで表す。Ka
は、平衡状態においてCYAP抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃
度で除した値であると定義する。ポリクローナル抗体は多様なCYAPエピトープに
対する親和性が不均一であり、ポリクローナル抗体試薬のために決定したKaは、
CYAP抗体の平均親和性または結合活性を表す。モノクローナル抗体は特定のCYAP
エピトープに対して単一特異的であり、モノクローナル抗体試薬のために決定し
たKaは、親和性の真の測定値を表す。Ka値が約１０9〜１０12 L/molの範囲にあ
るような高親和性抗体試薬は、CYAP抗体複合体が激しい操作に耐えなければなら
ないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ka値が約１０6〜１０7 L/molの範囲
にあるような低親和性抗体試薬は、CYAPが抗体から最終的に活性化状態で解離す
る必要がある免疫精製及び類似の処理に用いるのが好ましい（Catty, D. (1988)
Antibodies, Volume I: A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC、
Liddell, J. E.and Cryer, A. (1991) A Practical Guide to Monoclonal Antib odies , John Wiley & Sons, New York NY）。
【０１６０】 ポリクローナル抗体試薬の抗体価及び結合活性を更に評価して、或る下流の適
用例に対するこのような試薬の品質及び適性を決定することができる。例えば、
少なくとも１〜２mg/ml、好ましくは５〜１０mg/mlの特異抗体を含むポリクロー
ナル抗体試薬は、CYAP抗体複合体を沈殿させる必要がある処理において通常用い
られる。抗体の特異性、抗体価、結合活性、様々な適用例における抗体の品質や
使用に対する指針については、一般に入手可能である。（前出のCattyの文献、
同Coligan らの文献等を参照）。
【０１６１】 本発明の別の実施例では、CYAPをコードするポリヌクレオチド、CYAPの任意の
断片または相補配列を治療目的で使用することができる。ある実施形態では、CY
APをコードするポリヌクレオチドの相補配列がmRNAの転写を阻止するのに好適で
ある場合にこれを使用し得る。具体的には、CYAPをコードするポリヌクレオチド
に相補的な配列で細胞を形質転換し得る。従って、相補的分子または断片は、CY
AP活性を調節するため、または遺伝子機能を調節するために使用し得る。このよ
うな技術は既に本技術分野ではよく知られており、センスまたはアンチセンスオ
リゴヌクレオチドまたは大きな断片を、CYAPをコードする配列のコード領域また
は制御領域に延在する様々な位置から設計することが可能である（Agrawal, S.,
ed. (1996) Antisense Therapeutics, Humana Press Inc., Totawa NJ等を参照
）。
【０１６２】 治療に用いる場合、アンチセンス配列を好適な標的細胞に導入するのに好適な
任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的
タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を発現する発
現プラスミドの形で細胞内に輸送することが可能である（Slater, J.E. ら (199
8) J. Allergy Clin. Immunol. 102(3):469-475 及び Scanlon, K.J. ら (1995)
9(13):1288-1296.等を参照）。アンチセンス配列はまた、例えばレトロウイルス
やアデノ関連ウイルスベクター等のウイルスベクターを用いて細胞内に導入する
こともできる（Miller, A.D. (1990) Blood 76:271、前出のAusubel、Uckert, W
. and W. Walther (1994) Pharmacol. Ther. 63(3):323-347等を参照）。その他
の遺伝輸送機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープ及び当分野
で公知のその他の系が含まれる（Rossi, J.J. (1995) Br. Med. Bull. 51(1):21
7-225; Boado、R.J.ら (1998) J. Pharm. Sci. 87(11):1308-1315、Morris, M.C
. ら (1997) Nucleic Acids Res. 25(14):2730-2736. 等を参照）。
【０１６３】 本発明の別の実施例では、CYAPをコードするポリヌクレオチドを、体細胞若し
くは生殖細胞遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療を行うことによ
り、（i）遺伝子欠損症（例えばＸ染色体鎖遺伝（Cavazzana-Calvo, M. ら (200
0) Science 288:669-672）により特徴付けられる重度の複合型免疫欠損(SCID)-X
1の場合）、先天性アデノシンデアミナーゼ（ADA）欠損症に関連する重度の複合
型免疫欠損（Blaese, R.M. ら (1995) Science 270:475-480、Bordignon, C. ら
(1995) Science 270:470-475）、嚢胞性繊維症（Zabner, J. ら (1993) Cell 7
5:207-216: Crystal、R.G. ら (1995) Hum. Gene Therapy 6:643-666、Crystal
, R.G. ら. (1995) Hum. Gene Therapy 6:667-703）、サラセミア（thalassamia
）、家族性高コレステロール血症、第VIII因子若しくは第IX因子欠損に起因する
血友病（Crystal, 35 R.G. (1995) Science 270:404-410、Verma, I.M. and So
mia. N. (1997) Nature 389:239-242）を治療し、（ii）条件的致死性遺伝子産
物を発現させ（例えば制御不能な細胞増殖に起因する癌の場合）、（iii）細胞
内の寄生虫（例えばヒト免疫不全ウイルス(HIV)（Baltimore, D. (1988) Nature
335:395-396、Poescbla, E. ら (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:1139
5-11399）、B型若しくはC型肝炎ウイルス（HBV、HCV）、Candida albicans及びP aracoccidioides brasiliensis 等の真菌寄生虫、並びにPlasmodium falciparum
及びTrypanosoma cruzi等の原虫寄生体に対する防御機能を有するタンパク質を
発現させることができる。CYAPの発現若しくは調節に必要な遺伝子の欠損が疾患
を発生させる場合、形質導入した細胞の好適な集団からCYAPを発現することによ
り、遺伝子欠損に起因する症状の発現を緩和し得る。
【０１６４】 本発明の更なる実施例では、CYAPをコードする哺乳動物発現ベクターを作製し
、これらのベクターを機械的手段によってCYAP欠損細胞に導入することによって
、CYAPの欠損による疾患や異常症を治療する。in vivo或いはex vitroの細胞に
用いる機械的導入技術には、（i）個々の細胞内への直接的なDNA微量注射法、（
ii）弾道的金粒子の打ち込み（ballistic gold particle delivery）、（iii）
リポソーム仲介形質移入、（iv）受容体仲介遺伝子導入、及び（v）DNAトランス
ポソンの使用（Morgan, R.A. and W.F. Anderson (1993) Annu. Rev. Biochem.
62:191-217、Ivics, Z. (1997) Cell 91:501-510; Boulay, J-L. and H. Recipo
n (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:445-450）がある。
【０１６５】 限定するものではないがCYAPの発現に影響を及ぼし得る発現ベクターには、PC
DNA 3.1、EPITAG、PRCCMV2、PREP、PVAXベクター（Invitrogen, Carlsbad CA）
、PCMV-SCRIPT、PCMV-TAG、PEGSH/PERV（Stratagene, La Jolla CA）及びPTET-O
FF、PTET-ON、PTRE2、PTRE2-LUC、PTK-HYG（Clontech, Palo Alto CA）がある。
CYAPは、（i）恒常的に活性なプロモーター（例えばサイトメガロウイルス（CMV
）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、SV40ウイルス、チミジンキナーゼ（TK）また
はβアクチン遺伝子）、(ii)誘導性プロモーター（例えばテトラサイクリン調節
性プロモーター（Gossen, M. and H. Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U
.S.A. 89:5547-5551、Gossen, M. ら (1995) Science 268:1766-1769、Rossi, F
.M.V. and H.M. Blau (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:451-456）、市販のIn
vitrogen社のT-REXプラスミドに含まれる）、エクジソン誘導性プロモーター（I
nvitrogen社のプラスミドPVGRXR及びPINDから得られる）、FK506／ラパマイシン
誘導性プロモーターまたはRU486／ミフェプリストーン誘導性プロモーター（前
出のRossi, F.M.V. and H.M. Blau）、または（iii）正常個体由来の、CYAPをコ
ードする内在性遺伝子の天然のプロモーター若しくは組織特異的プロモーターを
用いて、発現させることができる。
【０１６６】 市販のリポソーム形質転換キット（例えばInvitrogen社のPerFect Lipid Tran
sfection Kit）を用いれば、当業者は経験にそれほど頼らないでもポリヌクレオ
チドを培養中の標的細胞に導入することが可能になる。別法では、リン酸カルシ
ウム法（Graham. F.L. and A.J. Eb (1973) Virology 52:456-467）若しくは電
気穿孔法（Neumann, B. ら (1982) EMBO J. 1:841-845）を用いて形質転換を行
う。初代細胞にDNAを導入するためには、標準化された哺乳動物の形質移入プロ
トコルの修飾が必要である。
【０１６７】 本発明の別の実施例では、CYAPの発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾
患や異常症は、（i）レトロウイルス末端反復配列（LTR）プロモーターまたは独
立プロモーターの制御下でCYAPをコードするポリヌクレオチドと、（ii）好適な
RNAパッケージングシグナルと、（iii）追加レトロウイルス・シス作用性RNA配
列及び効率的なベクターの増殖に必要なコード配列を伴うRev応答性エレメント
（RRE）とからなるレトロウイルスベクターを作製して治療することができる。
レトロウイルスベクター（例えばPFB及びPFBNEO）はStratagene社から市販され
ており、刊行データ（Riviere, I. ら. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
92:6733-6737）に基づいている。上記データを引用することをもって本明細書
の一部とする。ベクターは、好適なベクター産生細胞系（VPCL）において増殖さ
れ、VPCLは、標的細胞上の受容体に対する向性を有するエンベロープ遺伝子また
はVSVg等の乱交雑エンベロープタンパク質を発現する（Armentano, D. ら (1987
) J. Virol. 61:1647-1650、Bender, M.A. ら (1987) J. Virol. 61:1639-1646
、Adam, M.A. and A.D. Miller (1988) J. Virol. 62:3802-3806、Dull, T. ら
(1998) J. Virol. 72:8463-8471、Zufferey, R. ら (1998) J. Virol. 72:9873-
9880）。Riggに付与された米国特許第5,910,434号（"Method for obtaining ret
rovirus packaging cell lines producing high transducing efficiency retro
viral supernatant"）は、レトロウイルスパッケージング細胞系を得るための方
法について開示しており、これを引用することをもって本明細書の一部とする。
レトロウイルスベクターの増殖、細胞集団（例えばCD4+ Ｔ細胞）の形質導入、
及び形質導入した細胞の患者への戻しは、遺伝子治療の分野では当業者に公知の
方法であり、多数の文献に記載されている（Ranga, U. ら. (1997) J. Virol. 7
1:7020-7029、Bauer, G. ら (1997) Blood 89:2259-2267、Bonyhadi, M.L. (199
7) J. Virol. 71:4707-4716、Ranga, U. ら (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.
S.A. 95:1201-1206、Su, L. (1997) Blood 89:2283-2290）。
【０１６８】 別法では、アデノウイルス系遺伝子治療の輸送系を用いて、CYAPの発現に関連
する１若しくは複数の遺伝子異常を有するような細胞にCYAPをコードするポリヌ
クレオチドを輸送する。アデノウイルス系ベクターの作製及びパッケージングに
ついては、当業者に公知である。複製欠損型アデノウイルスベクターは、免疫調
節タンパク質をコードする遺伝子を膵臓の無損傷の膵島内に導入するために可変
性であることが証明された（Csete, M.E. ら. (1995) Transplantation 27:263-
268）。使用できる可能性のあるアデノウイルスベクターは、Armentanoに付与さ
れた米国特許第5,707,618号（"Adenovirus vectors for gene therapy"）に記載
されており、引用することをもって本明細書の一部とする。アデノウイルスベク
ターについては、Antinozzi, P.A. ら (1999) Annu. Rev. Nutr. 19:511-544 及
び Verma, I.M. and N. Somia (1997) Nature 18:389:239-242も参照されたい。
両文献は、引用することをもって本明細書の一部とする。
【０１６９】 別法では、ヘルペス系遺伝子治療の輸送系を用いて、CYAPの発現に関連する１
若しくは複数の遺伝子異常を有する標的細胞にCYAPをコードするポリヌクレオチ
ドを輸送する。HSVが向性を有するような中枢神経系の細胞にCYAPを導入する際
には、単純ヘルペスウイルス（HSV）系のベクターの使用は特に役立つ。ヘルペ
ス系ベクターの作製及びパッケージングは、当業者に公知である。複製適格性単
純ヘルペスウイルス（HSV）I型系のベクターは、レポーター遺伝子を霊長類の眼
に輸送するために用いられてきた（Liu, X. ら (1999) Exp. Eye Res.169:385-3
95）。HSV-1ウイルスベクターの作製についても、DeLucaに付与された米国特許
第5,804,413号（"Herpes simplex virus swains for gene transfer"）に開示さ
れており、該特許の引用をもって本明細書の一部とする。米国特許第5,804,413
号には、ヒト遺伝子治療を含む目的のために好適なプロモーターの制御下におい
て細胞に導入される少なくとも１つの内在性遺伝子を有するゲノムを含む組換え
HSV d92についての記載がある。上記特許はまた、ICP4、ICP27及びICP22のため
に除去される組換えHSV系統の作製及び使用について開示している。HSVベクター
については、Goins, W.F. ら (1999) J. Virol. 73:519-532 及び Xu, H. ら (1
994) Dev. Biol. 163:152-161も参照されたい。両文献は、引用をもって本明細
書の一部とする。クローン化ヘルペスウイルス配列の操作、巨大ヘルペスウイル
スのゲノムの異なった部分を含む多数のプラスミドを形質移入した後の組換えウ
イルスの継代、ヘルペスウイルスの成長及び増殖、並びにヘルペスウイルスの細
胞への感染は、当業者に公知の技術である。
【０１７０】 別法では、αウイルス（正の一本鎖RNAウイルス）ベクターを用いてCYAPをコ
ードするポリヌクレオチドを標的細胞に輸送する。プロトタイプのαウイルスで
あるセムリキ森林熱ウイルス（Semliki Forest Virus, SFV）の生物学的研究が
広範に行われており、遺伝子導入ベクターがSFVゲノムに基づいていることが分
かった（Garoff, H. and K.-J. Li (1998) Cun. Opin. Biotech. 9:464-469）。
αウイルスRNAの複製中に、通常はウイルスカプシドタンパク質をコードするサ
ブゲノムRNAが作り出される。このサブゲノムRNAは、完全長のゲノムRNAより高
いレベルに複製されるため、酵素活性（例えばプロテアーゼ及びポリメラーゼ）
を有するウイルスタンパク質に比べてカプシドタンパク質が過剰産生される。同
様に、CYAPに対するコード配列をカプシドコード領域のαウイルスゲノムに導入
することにより、ベクター導入細胞において多数のCYAPコードRNAが産生され、
高レベルのCYAPが合成される。通常はαウイルスの感染が数日以内での細胞溶解
に関係する一方で、シンドビスウイルス（SIN）の変異体を有するハムスター正
常腎臓細胞（BHK-21）の持続的な感染を確立する能力は、αウイルスの溶解複製
を遺伝子治療に適用できるように好適に変更可能であることを示唆している（Dr
yga, S.A. ら. (1997) Virology 228 :74-83）。αウイルスの宿主の範囲が広い
ことにより、様々な細胞タイプへのCYAPの導入が可能になる。或る集団における
サブセットの細胞の特定形質導入は、形質導入前に細胞の選別を必要とし得る。
αウイルスの感染性cDNAクローンの処置方法、αウイルスのcDNA及びRNAの形質
移入方法及びαウイルスの感染方法は、当業者に公知である。
【０１７１】 転写開始部位由来のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害することも
可能である。転写開始部位とは例えば開始部位から数えて約−１０と約＋１０の
間である。同様に、三重らせん塩基対の形成方法を用いて阻害が可能となる。三
重らせん塩基対形成は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために
十分に開くような二重らせんの能力を阻害するので、三重らせん塩基対形成は有
用である。三重らせんDNAを用いる最近の治療の進歩については文献に記載があ
る（Gee, J.E. ら (1994) in: Huber, B.E.and B.I. Carr, Molecular and Immu nologic Approaches , Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY, pp.163-177等を
参照）。相補配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに結合す
るのを阻止することによってmRNAの翻訳を阻止するべく設計することができる。
【０１７２】 リボザイムは酵素性RNA分子であり、RNAの特異的切断を触媒するためにリボザ
イムを用いることもできる。リボザイム作用のメカニズムは、ヌクレオチド鎖切
断に先立つ相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーシ
ョンに関与している。例えば、組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子は、
CYAPをコードする配列のヌクレオチド鎖切断を特異的且つ効果的に触媒する。
【０１７３】 任意の潜在的RNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、GUA、GUU、GUC配列を
含めたリボザイム切断部位に対する標的分子をスキャンすることによって先ず同
定される。一度同定されると、オリゴヌクレオチドを機能不全にするような２次
構造の特徴に対して切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボ
ヌクレオチドの短いRNA配列を、評価することが可能になる。候補標的の適合性
の評価も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチドと
のハイブリダイゼーションの実施容易性をテストすることによって行うことがで
きる。
【０１７４】 本発明の相補リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子合成のために当分野で
よく知られている任意の方法を用いて作製し得る。任意の方法には、固相ホスホ
ラミダイト化合物等のオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。或い
は、HRIPをコードするDNA配列のin vitro及びin vivo転写によってRNA分子を産
出し得る。このようなDNA配列は、T7やSP6等の好適なRNAポリメラーゼプロモー
ターを用いて多様なベクター内に組み入れることが可能である。或いは、相補的
RNAを構成的或いは誘導的に合成するようなこれらcDNA産物を、細胞系、細胞ま
たは組織内に導入することができる。
【０１７５】 細胞内の安定性を高め、半減期を長くするためにRNA分子を修飾することがで
きる。限定するものではないが可能な修飾には、分子の５'末端、３'末端、ある
いはその両方においてフランキング配列を追加したり、分子の主鎖内においてホ
スホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネートまたは2' Oメチルを使用し
たりすることが含まれる。この概念は、PNAの産出に固有のものであり、これら
全ての分子に拡大することができる。それには、内在性エンドヌクレアーゼによ
って容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリジ
ンにアセチル−、メチル−、チオ−及び同様の修飾をしたものに加えて、非従来
型塩基、例えばイノシン、クエオシン（queosine）、ワイブトシン（wybutosine
）等を包含することによる。
【０１７６】 本発明の追加実施例は、CYAPをコードするポリヌクレオチドの変異発現に有効
な化合物をスクリーニングする方法を含む。限定するものではないが特異ポリヌ
クレオチドの変異発現に有効な化合物には、オリゴヌクレオチド、アンチセンス
オリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、転写因子その他のポ
リペプチド転写制御因子、及び特異ポリヌクレオチド配列と相互作用し得る非高
分子化学的実体がある。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビター
またはエンハンサーのいずれかとして作用することによりポリヌクレオチド発現
を変異し得る。従って、CYAPの発現または活性の増加に関連する疾病の治療にお
いては、CYAPをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が
治療上有益であり、CYAPの発現または活性の低下に関連する疾病の治療において
は、CYAPをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療
上有益であり得る。
【０１７７】 特異ポリヌクレオチドの変異発現における有効性に対して、少なくとも１個か
ら複数個の試験化合物をスクリーニングし得る。試験化合物は、当分野で通常知
られている任意の方法により得られる。このような方法には、ポリヌクレオチド
の発現を変異させる場合と、既存の、市販のまたは専売の、天然または非天然の
化合物ライブラリから選択する場合と、標的ポリヌクレオチドの化学的及び／ま
たは構造的特性に基づく化合物を合理的にデザインする場合と、組合せ的にまた
は無作為に生成した化合物のライブラリから選択する場合に有効であることが知
られているような化合物の化学修飾がある。CYAPをコードするポリヌクレオチド
を含むサンプルは、少なくとも１つの試験化合物に曝され、このように得られる
。サンプルには例えば、無傷細胞、透過化処理した細胞、細胞遊離系または再構
成生化学系があり得る。CYAPをコードするポリヌクレオチドの発現における変化
は、当分野で通常知られている任意の方法でアッセイする。通常、CYAPをコード
するポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブを用
いたハイブリダイゼーションにより、特異ヌクレオチドの発現を検出する。ハイ
ブリダイゼーション量を定量し、それによって１若しくは複数の試験化合物に曝
露される及び曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較に対する基礎を形成し
得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現における変化の検出は、
ポリヌクレオチドの発現を変異する際に試験化合物が有効であることを示してい
る。特異ポリヌクレオチドの変異発現に有効な化合物に対して、例えばSchizosa ccharomyces pombe 遺伝子発現系（Atkins, D. ら (1999) 米国特許第5,932,435
号、Arndt, G.M. ら (2000) Nucleic Acids Res. 28:E15）またはHeLa細胞等の
ヒト細胞系（Clarke, M.L. ら (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 268:8-
13）を用いてスクリーニングを実行する。本発明の特定の実施例は、特異的ポリ
ヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性のためのオリゴヌクレオチド（デオ
キシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、修飾オリゴヌクレオ
チド）の組み合わせライブラリをスクリーニングすることに関与している（Brui
ce, T.W. ら (1997) 米国特許第5,686,242号、Bruice, T.W. ら (2000) 米国特
許第6,022,691号）。
【０１７８】 ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、in vivo
、in vitro及びex vivoの使用に対して同程度に適している。ex vivo治療の場合
、ベクターを患者から採取した肝細胞内に導入し、クローニング増殖して同一患
者に自家移植で戻すことができる。トランスフェクション、リボソーム注入また
はポリカチオンアミノポリマーによる輸送は、当分野でよく知られている方法を
用いて実行することができる。（Goldman, C.K. ら (1997) Nat. Biotechnol. 1
5:462-466.等を参照。） 上記の治療方法はいずれも、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ
、サル等の哺乳動物を含めて治療が必要な全ての対象に適用できる。
【０１７９】 本発明の追加実施例は、通常薬剤として許容できる賦形剤で処方される活性成
分を有する医薬品成分の投与に関連する。賦形剤には例えば、セルロース、ゴム
及びタンパク質がある。様々な処方が通常知られており、詳細はRemington's Ph armaceutical Sciences （Maack Publishing, Easton PA）の最新版に記載されて
いる。このような医薬品成分は、CYAP、CYAPに対する抗体、擬態、アゴニスト、
アンタゴニスト、またはCYAPインヒビターから構成し得る。
【０１８０】 本発明に用いられる医薬品成分は、任意の数の経路によって投与することがで
き、限定するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内
、クモ膜下腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下
または直腸がある。
【０１８１】 肺から投与する医薬品成分は、液状または乾燥粉末状で調製し得る。このよう
な医薬品成分は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子（例えば
伝統的な低分子重量有機薬）の場合には、速効製剤のエアロゾル輸送は当分野で
公知である。高分子（例えばより大きなペプチド及びタンパク質）の場合には、
当該分野において肺の肺胞領域を介しての肺輸送が最近向上したことにより、イ
ンスリン等の薬剤を実質的に血液循環へ輸送することを可能にした（Patton, J.
S. ら, 米国特許第5,997,848号等を参照）。肺輸送は、針注射なしに投与する点
で優れており、潜在的に有毒な浸透エンハンサーの必要性をなくす。
【０１８２】 本発明での使用に適した医薬品成分には、所定の目的を達成するために必要な
だけの量の活性成分を含有する成分が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の
能力の範囲内で行う。
【０１８３】 医薬品成分の特殊形状は、CYAPまたはその断片を含む高分子を直接細胞内輸送
するために調製される。例えば、細胞不透過性高分子を含むリポソーム製剤は、
細胞融合及び高分子の細胞内輸送を促進し得る。或いは、CYAPまたはその断片を
HIV Tat-1タンパク質から陽イオンN末端部に結合することもできる。このように
して生成された融合タンパク質は、マウスモデル系の脳を含む全ての組織の細胞
に形質導入することがわかっている（Schwarze, S.R. ら (1999) Science 285:1
569-1572）。
【０１８４】 任意の化合物に対して、細胞培養アッセイ、例えば新生物性細胞の細胞培養ア
ッセイにおいて、或いは、動物モデル、例えばマウス、ウサギ、イヌまたはブタ
等において、先ず治療の有効投与量を推定することができる。動物モデルはまた
、好適な濃度範囲及び投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を
用いて、次にヒトに対する有益な投与量及び投与経路を決定することができる。
【０１８５】 治療上の有効投与量は、症状や容態を回復させるような活性成分量を参考にす
る。そのような活性成分の例としては、CYAPまたはその断片、CYAPの抗体、CYAP
のアゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビターがある。薬用有効度及び毒性
は、細胞培養または動物実験における標準的な薬剤手法によって、例えばED50（
集団の５０％の医薬的有効量）またはLD50（集団の５０％の致死量）を測定する
などして決定することができる。毒性効果の治療効果に対する投与量の比は、治
療指数であり、LD50／ED50比として表すことができる。高い治療指数を示すよう
な医薬品成分が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは
、ヒトに用いるための投与量の範囲を調剤するのに用いられる。このような組成
物が含まれる投与量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、ED50を含むような血中濃
度の範囲にあることが好ましい。用いられる投与形態、患者の感受性及び投与の
経路によって、投与量はこの範囲内で様々に変わる。
【０１８６】 正確な投与量は、治療が必要な被験者に関する要素を考慮して、現場の医者が
決定することになる。効果的なレベルの活性成分を与え、或いは所望の効果を維
持するべく、投与量及び投与を調節する。被験者に関する要素としては、疾患の
重症度、患者の通常の健康状態、患者の年齢、体重及び性別、投与の時間及び頻
度、薬剤の配合、反応感受性及び治療に対する応答等を考慮する。作用期間が長
い医薬品成分は、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって３〜４日毎に
１度、１週間に１度、或いは２週間に１度の間隔で投与し得る。
【０１８７】 通常の投与量は、投与の経路にもよるが約０.１〜１００,０００μgであり、
合計で約１gまでとする。特定の投与量及び輸送方法に関するガイダンスは文献
に記載されており、現場の医者は通常それを利用することができる。当業者は、
タンパク質またはインヒビターに対する処方とは異なる、ヌクレオチドに対する
処方を利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの輸
送は、特定の細胞、状態、位置等に特異的なものとなる。
【０１８８】 診断 別の実施例では、CYAPの発現によって特徴付けられる疾患の診断のために、或
いはCYAPやCYAPのアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤で治療を受けている
患者をモニターするためのアッセイにおいて、CYAPを特異的に結合する抗体が用
いられることがある。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇所で記載した方
法と同じ方法で調合される。CYAPの診断アッセイには、抗体及び標識を利用して
ヒトの体液において或いは細胞や組織のエキスにおいてCYAPを検出する方法が含
まれる。抗体は、修飾して或いは修飾しないで使用し、レポーター分子の共有結
合性或いは非共有結合性の接着によって標識化し得る。多様なレポーター分子が
本技術分野で知られており、それらを用いることができる。幾つかのレポーター
分子については上記した。
【０１８９】 CYAPを測定するための様々なプロトコル、例えばELISA、RIA、FACS等が本技術
分野において知られており、CYAP発現の修正レベル或いは異常レベルを診断する
基準を提供する。複合体の形成に適した条件下でヒト対象等の正常な哺乳動物対
象から採取した体液または細胞とCYAPに対する抗体とを結合させることにより、
CYAP発現の正常値または標準値が決定される。標準複合体形成量は、種々の方法
、例えば測光法で定量できる。対象内で発現したCYAPの量、制御、検体からの病
変サンプルを標準値と比較する。標準値と対象との偏差が疾患を診断するパラメ
ータとなる。
【０１９０】 別の実施例によれば、CYAPをコードするポリヌクレオチドを診断目的に用いる
こともできる。用いられることができるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオ
チド配列、相補的RNA及びDNA分子、そしてPNAが含まれる。ポリヌクレオチドは
、検体におけるCYAPの発現が疾患と相関し得るような該検体における遺伝子発現
の検出及び定量に用いることができる。診断アッセイは、CYAPの不在、存在及び
過剰発現を測定するために、そして治療インターベンション中にCYAPレベルの調
製をモニターするために用いることができる。
【０１９１】 ある実施形態では、CYAPをコードする核酸配列を同定するために、CYAPまたは
近縁の分子をコードする、ゲノム配列を含むポリヌクレオチド配列を検出可能な
PCRプローブとのハイブリダイゼーションを用いることができる。プローブが同
定するのはCYAP、突然変異体または関連配列をコードするような、天然に存在す
る配列のみであるか否かは、プローブの特異性及びハイブリダイゼーション或い
は増幅のストリンジェンシーによって決定されることになる。ここで、プローブ
の特異性とは、プローブが高特異領域（例えば５'調節領域）からなるのか、低
特異領域（例えば保存されたモチーフ）からなるのかということである。
【０１９２】 プローブはまた、関連する配列の検出にも用いることができ、その配列はCYAP
をコードする任意の配列と少なくとも５０％の相同性を有し得る。本発明のハイ
ブリダイゼーションプローブはDNAまたはRNAとすることができ、配列番号５６乃
至１１０の配列、或いはCYAP遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロン
を含むゲノム配列に由来し得る。
【０１９３】 CYAPをコードするDNAに対する特異的ハイブリダイゼーションプローブを作製
する方法には、CYAPまたはCYAP誘導体をコードするポリヌクレオチド配列を、mR
NAプローブを作製するためのベクターにクローニングする方法が含まれる。mRNA
プローブ作製のためのベクターは、当業者に知られており、市販されており、好
適なRNAポリメラーゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって
、in vitroでRNAプローブを合成するために用いられ得る。ハイブリダイゼーシ
ョンプローブは、種々のレポーターの集団によって標識され得る。レポーター集
団の例としては、32Pまたは35S等の放射性核種、或いはアビジン／ビオチン結合
系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼ等の酵素標識などが挙
げられる。
【０１９４】 CYAPをコードするポリヌクレオチド配列は、CYAPの発現に関係する疾患の診断
の為に用い得る。限定するものではないがこのような疾患の例として神経系障害
が含まれ、その中には癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハ
イマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病その他の錐体外路障
害、筋萎縮性側策硬化その他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色
素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症その他の脱髄疾患、細菌性及びウイ
ルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎
、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー、クロイツフェ
ルト‐ヤコブ病及びガストマン‐ストラウスラー‐シャインカー症候群を含むプ
リオン病と、致死性家族性不眠症、神経系の栄養病及び代謝病、神経線維腫症、
結節硬化症、小脳網膜性血管芽腫症（cerebelloretinal hemangioblastomatosis
）、脳３叉神経血管症候群、精神薄弱その他の中枢神経系発達障害、脳性麻痺、
神経骨格異常、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄病、筋ジストロフィーその他
の神経筋疾患、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内
分泌性及び中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分障害、
不安障害及び精神分裂病を含む精神障害と、季節型感情障害（SAD）と、静座不
能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジ
ストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病が含まれ、ま
た自己免疫／炎症疾患も含まれ、その中には後天性免疫不全症候群（AIDS）、ア
ジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧
血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺
炎、自己免疫多発性内分泌腺障害症（APECED）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎
、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性
一時性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッ
ドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過
敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜の炎症、骨関節
炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節
炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性紅斑性狼瘡
、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群
、癌の合併症、血液透析、体外循環、ウイルス性感染症、細菌性感染症、真菌性
感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症及び外傷が含まれ、また細胞
増殖異常も含まれ、その中には日光性角化症、動脈硬化症、アテローム性動脈硬
化症、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性
夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症と、腺癌、白血病
、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌を含む癌、具体的には副腎、膀胱、
骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋
肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、
甲状腺、子宮の癌等が含まれる。CYAPをコードするポリヌクレオチド配列は、サ
ザン法、ノーザン法、ドットブロット法やその他の膜ベースの技術と、PCR法と
、ディップスティック（dipstick）法、ピン及びマルチフォーマットELISA様ア
ッセイと、変異CYAPの発現を検出するために患者から採取した体液または組織を
利用するマイクロアレイとにおいて使用し得る。このような定性方法または定量
方法は、当分野で公知である。
【０１９５】 或る形態では、関連する疾患、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて
、CYAPをコードするヌクレオチド配列が有用であり得る。CYAPをコードするヌク
レオチド配列は標準法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好
適な条件下で、患者から採取した体液または組織のサンプルに添加することがで
きる。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプルを洗浄し、シグナル
を定量して標準値と比較する。患者サンプルのシグナル量が制御サンプルと比べ
て著しく変化している場合は、サンプル内のCYAPをコードするヌクレオチド配列
の変異レベルは関連する疾患の存在を示している。このようなアッセイは、動物
実験、臨床試験における特定の治療効果を推定するため、或いは個々の患者の治
療をモニターするために用いることもできる。
【０１９６】 CYAPの発現に関連する疾患の診断基準を提供するために、発現のための正常あ
るいは標準概要を確立する。これは、ハイブリダイゼーション或いは増幅に好適
な条件下で、動物或いはヒトの正常な対象から抽出した体液或いは細胞を、CYAP
をコードする配列またはその断片と結合させることにより達成され得る。実質的
に精製されたポリヌクレオチドを既知量用いて行った実験から得た値を正常な対
象から得た値と比較することにより、標準ハイブリダイゼーションを定量するこ
とができる。このようにして得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得たサン
プルから得た値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾患の存在
を確定する。
【０１９７】 疾患の存在が確定されて治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが
正常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイ
ブリダイゼーションアッセイを通常ベースで繰り返し得る。連続アッセイから得
られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示し得る。
【０１９８】 癌に関しては、個体からの生体組織における異常な量の転写物（過少発現また
は過剰発現）の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床的症状が現れる
前に疾患を検出する方法を提供したりし得る。この種のより明確な診断により、
医療の専門家が予防方法または積極的な治療法を早くから利用し、それによって
癌の発生または更なる進行を防止することが可能となる。
【０１９９】 CYAPをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドを追加的に診断上利
用することは、PCRの利用に関与し得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成
するか、酵素により生産するか、或いはin vitroで産出し得る。オリゴマーは、
好ましくはCYAPをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはCYAPをコードする
ポリヌクレオチドと相補的ポリヌクレオチドの断片を含み、最適条件下で特定の
遺伝子や条件を識別するべく利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリ
ンジェント条件下で、近縁のDNA或いはRNA配列の検出、定量、或いはその両方の
ため用いることが可能である。
【０２００】 或る態様において、CYAPをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌク
レオチドプライマーを用いて単一ヌクレオチド多形性（SNP）を検出し得る。SNP
は、多くの場合にヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となるような置換、挿
入及び欠失である。限定するものではないがSNPの検出方法には、制限酵素切断
法（SSCP）及び蛍光SSCP（fSSCP）がある。SSCPでは、CYAPをコードするポリヌ
クレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連
鎖反応法（PCR）を用いたDNAの増幅を行う。DNAは例えば、病変組織または正常
組織、生検サンプル、体液その他に由来し得る。DNA内のSNPは、一本鎖形状のPC
R生成物の２次及び３次構造に差異を生じさせる。差異は非変性ゲル中でのゲル
電気泳動法を用いて検出可能である。fSCCPでは、オリゴヌクレオチドプライマ
ーを蛍光性に標識する。それによってDNAシークエンシング機などのハイスルー
プット機器でアンプリマー（amplimer）の検出が可能になる。更に、インシリコ
SNP（in silico SNP, isSNP）と呼ばれる配列データベース分析法は、一般的な
コンセンサス配列に配列されるような個々の重畳するDNA断片の配列を比較する
ことにより、多形性を同定し得る。これらのコンピュータベースの方法は、DNA
の実験室での調整及び統計モデル及びDNA配列クロマトグラムの自動分析を用い
たシークエンシングのエラーに起因する配列の変異をフィルタリングして除去す
る。別の態様では、例えばハイスループットMASSARRAYシステム（Sequenom, Inc
., San Diego CA）を用いた質量分析によりSNPを検出し、特徴付ける。
【０２０１】 CYAPの発現を定量するために用い得る方法には、ヌクレオチドの放射標識また
はビオチン標識、調節核酸の相互増幅（coamplification）及び標準曲線から得
た結果の補間もある（Melby, P.C.ら (1993) J. Immunol. Methods, 159:235-24
4、Duplaa, C.ら (1993) Anal. Biochem. 212:229-236等を参照）。目的のオリ
ゴマーが種々の希釈液中に存在し、分光光度法または非色応答によって定量が迅
速になるようなハイスループットフォーマットのアッセイを行うことによって、
複数のサンプルの定量速度を加速することができる。
【０２０２】 更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来の
オリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、マイクロアレイにおける標的として
用いることができる。多数の遺伝子の関連発現レベルを同時にモニターする転写
イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。これについては
、米国特許第5,840,484号のSeilhamer, J.J. らの"Comparative Gene Transcrip
t Analysis"に記載されており、この引用を以って本明細書の一部となす。マイ
クロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異及び多形性の同定に用いることができ
る。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し
、疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病の進行／後退をモニターし、疾
病治療における薬剤の活性を開発及びモニターすることができる。特に、患者に
とって最もふさわしく、有効的な治療法を選択するために、この情報を用いて患
者の薬理ゲノムプロフィールを開発することができる。例えば、患者の薬理ゲノ
ムプロフィールに基づき、患者に対して高度に有効的で副作用を殆ど示さない治
療薬を選択することができる。
【０２０３】 別の実施例では、CYAPに特異的な抗体、CYAPまたはその断片をマイクロアレイ
上で要素として用いることができる。マイクロアレイを用いて、上記のようなタ
ンパク質−タンパク質相互作用、薬剤−標的相互作用及び遺伝子発現プロフィー
ルをモニターまたは測定することが可能である。
【０２０４】 マイクロアレイは、本技術分野でよく知られている方法を用いて調製し、使用
し、そして分析する（Brennan, T.M. ら (1995) の米国特許第5,474,796号、Sch
ena, M. ら (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619、Baldeschwei
ler らの (1995) PCT出願第WO95/251116号、Shalon, D.らの (1995) PCT出願第W
O95/35505号、Heller, R.A. ら (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2
155、Heller, M.J. らの (1997) 米国特許第5,605,662号等を参照）。様々なタ
イプのマイクロアレイが公知であり、詳細については、DNA Microarrays: A Pra ctical Approach , M. Schena, ed. (1999) Oxford University Press, Londonに
記載されている。該文献は、特別に引用することを以って本明細書の一部となす
。
【０２０５】 本発明の別の実施例では、天然のゲノム配列をマッピングする際に有効なハイ
ブリダイゼーションプローブを産出するため、CYAPをコードする核酸配列を用い
ることが可能である。コード配列または非コード配列のいずれかを用いることが
でき、或る例では、コード配列全体で非コード配列が好ましい。例えば、多重遺
伝子ファミリーのメンバー内でのコード配列の保存により、染色体マッピング中
に望ましくないクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。核酸配列
は、特定の染色体、染色体の特定領域または人工形成の染色体、例えば、ヒト人
工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、細菌P1産
物、或いは単一染色体cDNAライブラリに対してマッピングされる（Harrington,
J.J. ら (1997) Nat Genet. 15:345-355、Price, C.M. (1993) Blood Rev. 7:12
7-134、Trask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:149-154等を参照）。一度マッピ
ングすると、本発明の核酸配列を用いて例えば病状の遺伝を特定の染色体領域の
遺伝または制限断片長多型（RFLP）と相関させるような遺伝子連鎖地図を発生さ
せ得る。
【０２０６】 蛍光原位置ハイブリッド形成法（FISH）は、他の物理的及び遺伝地図データと
相関し得る（前出のHeinz-Ulrich, ら (1995) in Meyers, pp. 965-968.等を参
照）。遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはOnline Mendelian Inher
itance in Man（OMIM）のウェブサイトに見ることができる。物理的染色体地図
上のCYAPをコードする遺伝子の位置と特定の疾患との相関性或いは特定の疾患に
対する素因は、その疾患に関係するDNAの領域を画定するのに役立ち得るもので
あり、従って更に位置クローニングする試みとなり得る。
【０２０７】 確定した染色体マーカーを用いた結合分析等の物理的マッピング技術及び染色
体標本原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。
例えばマウスなどの別の哺乳動物の染色体上に遺伝子を配置することにより、特
定のヒト染色体の数或いはアームが分かっていない場合でも関連するマーカーを
明らかにし得る。この情報は、位置クローニングその他の遺伝子発見技術を用い
て遺伝的疾患を調査する研究者にとって価値がある。疾患または症候群が、血管
拡張性失調症の11q22-23領域等、特定の遺伝子領域への遺伝的結合によって大ま
かに位置決めがなされると、該領域に対するいかなるマッピングも、更なる調査
のための関連遺伝子或いは調節遺伝子を表すことができる（Gatti, R.A.ら (198
8) Nature 336:577-580等を参照）。転座、反転等に起因する、健常者、保有者
、感染者の三者間における染色体位置の相違を発見するために本発明のヌクレオ
チド配列を用いてもよい。
【０２０８】 本発明の別の実施例では、種々の薬剤スクリーニング技術を以って化合物のラ
イブラリをスクリーニングするために、CYAP、CYAPの触媒作用断片、免疫原断片
、またはそのオリゴペプチドを用いることができる。薬剤スクリーニングに用い
る断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持物に固定されるか、細胞表面上に
保持されるか、細胞内に位置することになろう。CYAPとテストされる薬剤との結
合複合の形成は計測できる。
【０２０９】 別の薬剤スクリーニング方法は、目的のタンパク質に対して好適な結合親和性
を有する化合物を高い処理能力でスクリーニングするために用いられる（Geysen
,らの (1984) PCT出願番号 WO84/03564等を参照）。この方法においては、多数
の異なる小さな試験用化合物を固体基質上で合成する。試験用化合物は、CYAP或
いはその断片と反応させ、洗浄する。次に、本技術分野でよく知られている方法
で、結合したCYAPを検出する。精製したCYAPはまた、上記した薬剤のスクリーニ
ング技術において用いるプレート上で直接コーティングすることもできる。別法
では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物に固定する
こともできる。
【０２１０】 別の実施例では、競合薬スクリーニングアッセイを用いることができる。この
アッセイでは、CYAPを結合することができる中和抗体が、CYAPを結合するための
試験化合物と特異的に競合する。この方法では、抗体が、１若しくは数個の抗原
決定因子をCYAPと共有するペプチドの存在を検出する。
【０２１１】 別の実施例では、新規技術が現在知られているヌクレオチド配列の特性（限定
するものではないがトリプレット遺伝暗号及び特異的塩基対の相互作用等を含む
）に依存するのであれば、依然として発展すべきいかなる分子生物学技術におい
ても、CYAPをコードするヌクレオチド配列を用いることができる。
【０２１２】 更に詳細説明をしなくとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大
限に利用できるであろう。従って、これ以下に記載する実施例は単なる例示目的
にすぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。
【０２１３】 本明細書において開示した全ての特許、特許出願及び刊行物、特に米国特許第
60/136,652号は、言及することをもって本明細書の一部となす。
【０２１４】 （実施例） １ cDNAライブラリの作製 RNAは、Clontech社から購入し、或いは表４に列記した組織から単離した。ホ
モジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解した組織もあり、
また、ホモジナイズしてフェノールまたは好適な変性剤の混合液に溶解した組織
もある。変性剤の混合液は、例えばフェノールとグアニジニウムイソチオシアネ
ートの単相溶液であるTRIZOL（Life Technologies）等である。結果として得ら
れた溶解物は、塩化セシウムにおいて遠心分離するかクロロホルムで抽出した。
イソプロパノールか、酢酸ナトリウムとエタノールか、いずれか一方、或いは別
の方法を用いて、溶解物からRNAを沈殿させた。
【０２１５】 RNAの純度を高めるため、RNAのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰
り返した。場合によっては、DNアーゼでRNAを処理した。殆どのライブラリでは
、オリゴd(T)連結常磁性粒子（Promega）、OLIGOTEXラテックス粒子（QIAGEN, V
alencia CA）またはOLIGOTEX mRNA精製キット（QIAGEN）を用いて、ポリ(A+) RN
Aを単離した。別法では、別のRNA単離キット、例えばPOLY(A)PURE mRNA精製キッ
ト（Ambion, Austin TX）を用いて組織溶解物からRNAを直接単離した。
【０２１６】 場合によってはStratagene社へのRNA提供を行い、対応するcDNAライブラリをS
tratagene社が作製することもあった。そうでない場合は、本技術分野で公知の
推奨方法または類似の方法を用いて、UNIZAPベクターシステム（Stratagene）ま
たはSUPERSCRIPTプラスミドシステム（Life Technologies）を用いてcDNAを合成
し、cDNAライブラリを作製した。（前出のAusubel, 1997, unit 5.1-6.6等を参
照。）逆転写は、オリゴd(T)またはランダムプライマーを用いて開始した。合成
オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖cDNAに連結反応させ、好適な制限酵素で
cDNAを消化した。殆どのライブラリに対して、cDNAのサイズ（３００〜１０００
bp）選択は、SEPHACRYL S1000、SEPHAROSE CL2BまたはSEPHAROSE CL4Bカラムク
ロマトグラフィー（Amersham Pharmacia Biotech）、或いは調製用アガロースゲ
ル電気泳動法を用いて行った。cDNAは、好適なプラスミドのポリリンカーの適合
性制限酵素部位に連結反応させた。好適なプラスミドは、例えばPBLUESCRIPTプ
ラスミド（Stratagene）、pSPORT1プラスミド（Life Technologies）またはplNC
Y（Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto CA）等である。組換えプラスミドは、S
tratagene社のXL1-Blue、XL1-BIueMRFまたはSOLR、或いはLife Technologies社
のDH5α、DH10BまたはELECTROMAX DH10Bを含むコンピテント大腸菌細胞に形質転
換した。
【０２１７】 ２ cDNAクローンの単離 UNIZAPベクターシステム（Stratagene）を用いたin vivo切除によって、或い
は細胞溶解によって、プラスミドを宿主細胞から回収した。MagicまたはWIZARD
Minipreps DNA精製システム（Promega）、AGTC Miniprep精製キット（Edge Bios
ystems, Gaithersburg MD）、QIAGEN社のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus P
lasmid及びQIAWELL 8 Ultra Plasmid 精製システム、R.E.A.L. Prep 96プラスミ
ドキットの中から少なくとも１つを用いて、プラスミドを精製した。沈殿させた
後、０.１mlの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥せずに、４℃
で保管した。
【０２１８】 別法では、ハイスループットフォーマットにおいて直接結合PCR法を用いて宿
主細胞溶解物からプラスミドDNAを増幅した（Rao, V.B. (1994) Anal. Biochem.
216:1-14）。宿主細胞の溶解及び熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で
行った。サンプルを処理し、それを３８４穴プレート内で保管し、増幅したプラ
スミドDNAの濃度をPICOGREEN色素（Molecular Probes, Eugene OR）及びFluoros
kan II蛍光スキャナー（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）を用いて蛍光分析
的に定量した。
【０２１９】 ３ シークエンシング及び分析 cDNAのシークエンス反応は、標準的方法或いはハイスループット装置、例えば
ABI CATALYST 800 サーマルサイクラー（PE Biosystems）またはPTC-200 サーマ
ルサイクラー（MJ Research）をHYDRAマイクロディスペンサー（Robbins Scient
ific）またはMICROLAB 2200（Hamilton）液体転移システムと併用して処理した
。cDNAのシークエンス反応は、Amersham Pharmacia Biotech社が提供する試薬ま
たはABIシークエンシングキット、例えばABI PRISM BIGDYE Terminator cycle s
equencing ready reaction kit（PE Biosystems）に与えられた試薬を用いて準
備した。cDNAのシークエンス反応の電気泳動的分離及び標識したポリヌクレオチ
ドの検出には、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Molecular Dynam
ics）か、標準ABIプロトコル及び塩基対呼び出しソフトウェアを用いるABI PRIS
M 373または377シークエンシングシステム（PE Biosystems）か、或いはその他
の本技術分野でよく知られている配列解析システムを用いた。cDNA配列内のリー
ディングフレームは、標準的方法（前出のAusubel, 1997, unit 7.7に概説）を
用いて決定した。cDNA配列の幾つかを選択して、実施例６に記載した方法で配列
を伸長させた。
【０２２０】 cDNA配列に由来するポリヌクレオチド配列は、当業者によく知られたアルゴリ
ズムを利用するソフトウェアの組合せを用いて構築し、解析した。利用したツー
ル、プログラム及びアルゴリズムの概略、適用可能な説明、引用文献、閾値パラ
メータを表５に示す。用いたツール、プログラム及びアルゴリズムを表５の列１
に、それらの簡単な説明を列２に示す。列３は好適な引用文献であり、全ての文
献はそっくりそのまま引用を以って本明細書の一部となす。適用可能な場合には
、列４は２つの配列が一致する強さを評価するために用いたスコア、確率値その
他のパラメータを示す（スコアが高ければ高いほど２配列間の相同性が高くなる
）。配列の解析は、MACDNASIS PROソフトウェア（日立ソフトウェアエンジニア
リング, South San Francisco CA）及びLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用
いて行った。
【０２２１】 ポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカー及びポリA配列を除去すること
により、またあいまいな塩基対をマスクすることによって有効性を確認した。そ
の際、BLAST、動的プログラミング、及び隣接ジヌクレオチド頻度分析に基づく
アルゴリズム及びプログラムを用いた。次に、BLAST、FASTA及びBLIMPSに基づく
プログラムを用いて、プログラム中の注釈を得るべく、公共のデータベース、例
えばGenBankの霊長類及びげっ歯類、哺乳動物、脊椎動物、真核生物のデータベ
ースと、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM及びPFAMの選択に対する配列を問い合わ
せした。配列はPhred、Phrap及びConsedに基づくプログラムを用いて完全長のポ
リヌクレオチド配列に構築し、GenMark、BLAST及びFASTAに基づくプログラムを
用いてオープンリーディングフレームに対してスクリーニングした。対応する完
全長アミノ酸配列を誘導するべく完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳し、その後
、GenBankデータベース（上記）、SwissProt、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM及
びProsite等のデータベース、PFAM等のHidden Markov Model（HMM）ベースのタ
ンパク質ファミリーデータベースに対する問合せによって完全長配列を分析した
。HMMは、遺伝子ファミリーのコンセンサス１次構造を解析する確率的アプロー
チである（Eddy, S.R. (1996) Curr. Opin. Struct. Biol. 6:361-365等を参照
）。
【０２２２】 完全長ポリヌクレオチド及びアミノ酸配列の構築及び分析に用いる上記のプロ
グラムは、配列番号６乃至１０からのポリヌクレオチド配列の断片を同定するた
めにも使用できる。ハイブリダイゼーション及び増幅に有用な約２０〜約４００
０のヌクレオチドの断片は、上記「発明」の項で説明した。
【０２２３】 ４ ポリヌクレオチド発現の分析 ノーザン分析は、転写された遺伝情報の存在を検出するために用いられる実験
技術であり、標識されたヌクレオチド配列の、特定の細胞種または組織からのRN
Aが結合される膜へのハイブリダイゼーションに関与している。（前出のSambroo
k, 7章、同Ausubel. F.M. ら, 4章及び16章等を参照。） BLASTに適用する類似のコンピュータ技術を用いて、GenBankやLifeSeq（Incyt
e Pharmaceuticals）等のヌクレオチドデータベースにおいて同一または関連分
子を検索する。ノーザン分析は、多数の膜系ハイブリダイゼーションよりも断然
速い。更に、特定の同一を厳密な或いは相同的なものとして分類するか否かを決
定するため、コンピュータ検索の感度を変更することができる。検索の基準はプ
ロダクトスコアであり、次式で定義される。
【０２２４】
【数１】
【０２２５】 プロダクトスコアは、２つの配列間の類似度及び配列が一致する長さの両方を考
慮している。プロダクトスコアは、０〜１００の規準化された値であり、次のよ
うにして求める。BLASTスコアにヌクレオチドの配列一致率を乗じ、その積を２
つの配列の短い方の長さの５倍で除する。高スコアリングセグメント対（HSP）
に一致する各塩基に＋５のスコアを割り当て、各不適性塩基対に−４を割り当て
ることにより、BLASTスコアを計算する。２つの配列は、２以上のHSPを共有し得
る（ギャップにより離隔され得る）。２以上のHSPがある場合には、最高BLASTス
コアの塩基対を用いてプロダクトスコアを計算する。プロダクトスコアは、断片
的重畳とBLASTアラインメントの質とのバランスを表す。例えばプロダクトスコ
ア１００は、比較した２つの配列の短い方の長さ全体にわたって１００％一致す
る場合のみ得られる。プロダクトスコア７０は、一端が１００％一致し、７０％
重畳しているか、他端が８８％一致し、１００％重畳しているかのいずれかの場
合に得られる。プロダクトスコア５０は、一端が１００％一致し、５０％重畳し
ているか、他端が７９％一致し、１００％重畳しているかのいずれかの場合に得
られる。
【０２２６】 ノーザン分析の結果は、CYAPをコードする転写物が作出されたライブラリの分
布パーセンテージとして報告される。分析は、器官／組織及び疾患によるcDNAラ
イブラリのカテゴリー分類に関与している。器官／組織のカテゴリーには、心血
管、皮膚、発生、内分泌、胃腸、造血／免疫、筋骨格、神経、生殖及び泌尿器が
ある。疾患／病状のカテゴリーには、癌、炎症、外傷、細胞増殖、神経、貯留（
pooled）が含まれる。カテゴリー毎に目的の配列を発現するライブラリ数を数え
、それを全カテゴリーのライブラリ数で除した。組織特異発現及び疾患／病状特
異発現のパーセント値を表３に示す。
【０２２７】 ５ ポリヌクレオチドをコードするCYAPの染色体マッピング 配列番号６乃至１０を配列するために用いたcDNA配列は、BLAST及びその他の
スミス‐ウォーターマンアルゴリズムのインプリメンテーションを用いて、Incy
te LIFESEQのデータベース及びパブリックドメインのデータベースから得た配列
と比較した。配列番号６乃至１０に適合するデータベースから得た配列は、Phra
p（表５）等のアセンブリアルゴリズムを用いて隣接する配列及びオーバーラッ
プする配列のクラスタに配列した。スタンフォード・ヒトゲノムセンター（SHGC
）、ホワイトヘッド・ゲノム研究所（WIGR）、Genethon等の公的な情報源から入
手可能な放射線ハイブリッド及び遺伝地図データを用いて、クラスタ化された配
列が前もってマッピングされたかを測定した。マッピングされた配列がクラスタ
に含まれている結果、個々の配列番号を含めてそのクラスタの全配列が地図上の
位置に割り当てられた。
【０２２８】 配列番号１０の遺伝地図上の位置は、ヒト染色体の範囲または間隔として発明
の項に記載されている。センチモルガン間隔の地図上の位置は、染色体のpアー
ムの末端に関連して測定する。（センチモルガン（cM）は、染色体マーカー間の
組換え頻度に基づく計測単位である。平均して、１cMは、ヒト中のDNAの１メガ
ベース（Mb）にほぼ等しい。尤も、この値は、組換えのホットスポット及びコー
ルドスポットに起因して広範囲に変化する。）cM距離は、配列が各クラスタ内に
含まれるような放射線ハイブリッドマーカーに対して境界を提供するようなGene
thonによってマッピングされた遺伝マーカーに基づく。
【０２２９】 ６ ポリヌクレオチドをコードするCYAPの伸長 配列番号６乃至１０の完全長の核酸配列は、完全長分子の適切な断片から設計
したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて該断片を伸長させて生成した。一方
のプライマーは既知の断片の５'伸長を開始するべく合成し、他方のプライマー
は既知の断片の３'伸長を開始するべく合成した。開始プライマーの設計は、長
さが約２２〜３０ヌクレオチド、GC含有率が５０％以上となり、約６８〜７２℃
の温度で標的配列にアニーリングするように、OLIGO 4.06ソフトウェア（Nation
al Biosciences）或いは別の適切なプログラムを用いて、cDNAから設計した。ヘ
アピン構造及びプライマー-プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチドの伸
長は全て回避した。
【０２３０】 配列を伸長するために、選択されたヒトcDNAライブラリを用いた。２段階以上
の伸長が必要または望ましい場合には、付加的プライマー或いはプライマーのネ
ステッドセットを設計した。
【０２３１】 高忠実度の増幅が、当業者によく知られている方法を利用したPCR法によって
得られた。PCRは、PTC-200 サーマルサイクラー（MJ Research, Inc.）を用いて
９６穴プレート内で行った。反応混合液には、DNA鋳型、各プライマー２００nmo
lと、Mg2+、(NH4)2SO4 及びβ-メルカプトエタノールを含む反応バッファと、Ta
q DNAポリメラーゼ（Amersham Pharmacia Biotech）と、ELONGASE酵素（Life Te
chnologies）と、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）が含まれていた。プライ
マー対PCI A、PCI Bに対して用いたパラメータは次の通りである。 ステップ１： ９４℃で３分間 ステップ２： ９４℃で１５秒 ステップ３： ６０℃で１分間 ステップ４： ６８℃で２分間 ステップ５： ステップ２、３、４を２０回繰り返す ステップ６： ６８℃で５分間 ステップ７： ４℃で保存 プライマー対T7、SK+に対しては、上記パラメータに代えて以下のパラメータを
用いた。 ステップ１： ９４℃で３分間 ステップ２： ９４℃で１５秒 ステップ３： ５７℃で１分間 ステップ４： ６８℃で２分間 ステップ５： ステップ２、３、４を２０回繰り返す ステップ６： ６８℃で５分間 ステップ７： ４℃で保存 1X TEに溶解したPICOGREEN定量試薬（０.２５％(v/v) PICOGREEN、Molecular
Probes, Eugene OR）１００μlと、希釈していないPCR産物０.５μlとを不透明
な蛍光光度計プレート（Coming Costar, Acton MA）の各穴に分配し、DNAを試薬
と結合可能なようにさせることによって各穴内のDNA濃度の測定を行った。サン
プルの蛍光を計測してDNAの濃度を定量するべくプレートをFluoroskan II （Lab
systems Oy, Helsinki, Finland）でスキャンした。反応混合物のアリコート５
〜１０μlを１％アガロースミニゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応
が配列の伸長に成功したかを決定した。
【０２３２】 伸長させたヌクレオチドは、脱塩及び濃縮して３８４穴プレートに移し、CviJ
Iコレラウイルスエンドヌクレアーゼ（Molecular Biology Research, Madison W
I）を用いて消化し、pUC 18ベクター（Amersham Pharmacia Biotech）への再連
結反応前に音波処理またはせん断した。ショットガン・シークエンシングのため
に、消化したヌクレオチドを低濃度（０.６〜０.８％）のアガロースゲル上で分
離し、断片を切除し、寒天をAgar ACE（Promega）で消化した。伸長させたクロ
ーンをT4リガーゼ（New England Biolabs, Beverly MA）を用いてpUC 18ベクタ
ー（Amersham Pharmacia Biotech）に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratag
ene）で処理して制限部位の張出部（overhang）を満たし、コンピテント大腸菌
細胞に形質移入した。形質移入した細胞を抗生物質含有培地上で選択し、個々の
コロニーを選択してLB/2x carb液体培地の３８４穴プレート内において３７℃で
一晩培養した。
【０２３３】 細胞を溶解し、Taq DNAポリメラーゼ（Amersham Pharmacia Biotech）及びPfu
DNAポリメラーゼ（Stratagene）を用いてPCRによってDNAを増幅した。その際用
いたパラメータは次の通りである。 ステップ１： ９４℃で３分間 ステップ２： ９４℃で１５秒 ステップ３： ６０℃で１分間 ステップ４： ７２℃で２分間 ステップ５： ステップ２、３、４を２９回繰り返す ステップ６： ７２℃で５分間 ステップ７： ４℃で保存 DNAは、上記のPICOGREEN試薬（Molecular Probes）によって定量した。DNAの回
収率が低いサンプルは、上記と同一の条件を用いて再増幅した。サンプルは２０
％ジメチルスルホキシド（１：２, v/v）で希釈し、DYENAMIC energy transfer
sequencing primer及びDYENAMIC DIRECT kit（Amersham Pharmacia Biotech）ま
たはABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit（PE
Biosystems）を用いてシークエンシングした。
【０２３４】 同様に、上記手順と、伸長のために設計されたオリゴヌクレオチドと、適切な
ゲノムライブラリを用いて、５'調節配列を得るべく、配列番号６乃至１０のヌ
クレオチド配列が用いられる。
【０２３５】 ７ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用 配列番号６乃至１０から得たハイブリダイゼーションプローブを利用して、cD
NA、ゲノムDNAまたはmRNAをスクリーニングする。約２０塩基対からなるオリゴ
ヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片に対
しても事実上同一の手順が用いられる。オリゴヌクレオチドは、OLIGO 4.06ソフ
トウェア（National Biosciences）等の最新ソフトウェアを用いて設計し、各オ
リゴマー５０pmolと、[γ-32P]アデノシン３リン酸 （Amersham Pharmacia Biot
ech）２５０μCiと、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN, Boston MA）を
結合することにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、SEPHADEX G-25
超細繊分子サイズ排除デキストランビードカラム（Amersham Pharmacia Biotech
）を用いて実質的に精製する。 Ase I、Bgl II、Eco RI、Pst I、Xba1またはPvu II（DuPont NEN）のいずれか１
つのエンドヌクレアーゼで消化されたヒトゲノムDNAの典型的な膜ベースのハイ
ブリダイゼーション解析において、毎分１０7カウントの標識されたプローブを
含むアリコットを用いる。
【０２３６】 各消化物から得たDNAは、０.７％アガロースゲル上で分画してナイロン膜（Ny
tran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に移す。ハイブリダイゼーショ
ンは、４０℃で１６時間行う。非特異的シグナルを除去するため、例えば０.１
×クエン酸ナトリウム食塩水及び０.５％ドデシル硫酸ナトリウムに一致する条
件下で、ブロットを室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに
代わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、
比較する。
【０２３７】 ８ マイクロアレイ マイクロアレイの表面上でアレイエレメントの連鎖または合成は、フォトリソ
グラフィ、圧電印刷（インクジェット印刷、前出のBaldeschweiler等を参照）、
機械的マイクロスポッティング技術及びこれらから派生したものを用いて達成す
ることが可能である。上記各技術において基質は、均一且つ非多孔性の固体とす
るべきである（Schena (1999).前出）。推奨する基質には、シリコン、シリカ、
スライドガラス、ガラスチップ及びシリコンウエハがある。或いは、ドットブロ
ット法またはスロットブロット法に類似のアレイを利用して、熱的、紫外線的、
化学的または機械的結合手順を用いて基質の表面にエレメントを配置及び結合さ
せてもよい。通常のアレイは、手作業で、または利用可能な方法や機械を用いて
作製でき、任意の適正数のエレメントを有し得る（Schena, M. ら (1995) Scien
ce 270:467-470、Shalon. D. ら (1996) Genome Res. 6:639-645、Marshall, A.
and J. Hodgson (1998) Nat. Biotechnol. 16:27-31.を参照）。
【０２３８】 完全長cDNA、発現遺伝子配列断片（EST）、またはその断片またはオリゴマー
は、マイクロアレイのエレメントを構成し得る。ハイブリダイゼーションに好適
な断片またはオリゴマーを、レーザGENEソフトウェア（DNASTAR）等の本技術分
野で公知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。アレイエレメント
は、生物学的サンプル中でポリヌクレオチドを用いてハイブリダイズされる。生
物学的サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識また
はその他の分子タグに接合される。ハイブリダイゼーション後、生物学的サンプ
ルからハイブリダイズされていないヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用い
て各アレイエレメントにおいてハイブリダイゼーションを検出する。或いは、レ
ーザ脱着及び質量スペクトロメトリを用いてもハイブリダイゼーションを検出し
得る。マイクロアレイ上のエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチド
の相補性の度合及び相対存在度は、算定し得る。一実施例におけるマイクロアレ
イの調整及び使用について、以下に詳述する。
【０２３９】 組織または細胞サンプルの準備 グアニジウムチオシアネート法を用いて組織サンプルから全RNAを単離し、オ
リゴ(dT)セルロース法を用いてポリ(A)+RNAを精製する。各ポリ(A)+RNAサンプル
は、MMLV逆転写酵素、０.０５ pg/μlのオリゴ(dT)プライマー（21mer）、１×
第１鎖バッファ、０.０３unit/μlのRNアーゼ阻害因子、５００μMのdATP、５０
０μMのdGTP、５００μMのdTTP、４０μMのdCTP、４０μMのdCTP-Cy3（BDS）ま
たはdCTP-Cy5（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて逆転写する。逆転写反応
は、GEMBRIGHTキット（Incyte）を用いてポリ(A)+RNA含有の25体積ml内で行う。
特異制御ポリ(A)+RNAは、３７０℃で２時間インキュベートした後、in vitro転
写により非コード酵母ゲノムDNAから合成する。各反応サンプル（１つはCy3、も
う１つはCy5標識）は、２.５mlの０.５M水酸化ナトリウムで処理し、８５０℃で
２０分間インキュベートし、反応を停止させてRNAを減成する。サンプルは、２
つの連続するCHROMA SPIN 30ゲル濾過スピンカラム（CLONTECH Laboratories, I
nc. (CLONTECH), Palo Alto CA）を用いて精製する。結合後、２つの反応サンプ
ルは、１mlのグリコーゲン（１mg/ml）を用いて析出させたエタノール、６０ml
の酢酸ナトリウム及び３００mlの１００％エタノールである。サンプルは次に、
SpeedVAC（Savant Instruments Inc., Holbrook NY）を用いて乾燥して仕上げ、
１４μlの５×SSC／０.２％SDS中で再懸濁する。
【０２４０】 マイクロアレイの準備 本発明の配列を用いて、アレイエレメントを生成する。各アレイエレメントは
、クローン化cDNAインサートによりベクター含有細菌性細胞から増幅する。PCR
増幅は、cDNAインサートの側面に位置するベクター配列に相補的なプライマーを
用いる。３０サイクルのPCRで１〜２ngの初期量から５μgより大きい最終量まで
アレイエレメントを増幅する。増幅されたアレイエレメントは、SEPHACRYL-400
（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて精製される。
【０２４１】 精製したアレイエレメントは、ポリマーコートされたスライドガラス上に固定
する。顕微鏡スライドガラス（Corning）は、処理中及び処理後に大量の蒸留水
洗液を用いて０.１％のSDS及びアセトン中で超音波により洗浄する。スライドガ
ラスは、４％フッ化水素酸（VWR Scientific Products Corporation (VWR), Wes
t Chester PA）中でエッチングし、蒸留水中で広範囲にわたって洗浄し、９５％
エタノール中で０.０５％アミノプロピルシラン（Sigma）を用いてコーティング
する。コーティングしたスライドガラスは、１１０℃の天火で硬化させる。
【０２４２】 米国特許第5,807,522号で説明されている方法を用いて、コーティングしたガ
ラス基板にアレイエレメントを付加する。該特許は、引用を以って本明細書の一
部となす。平均濃度が１００ng/μlのアレイエレメントDNA１μlを高速ロボット
装置により開口キャピラリープリントエレメントに充填する。装置はここで、ス
ライド毎に約５nlのアレイエレメントサンプルをデポジットする。
【０２４３】 マイクロアレイには、STRATALINKER ＵＶ架橋剤（Stratagene）を用いてＵＶ
架橋する。マイクロアレイは、室温において０.２％SDSで１度洗浄し、蒸留水で
３度洗浄する。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)（Tropix, Inc., Bedford MA）中の
０.２％カゼイン中において６０℃で３０分間マイクロアレイをインキュベート
した後、前に行ったように０.２％SDS及び蒸留水で洗浄することにより、非特異
結合部位をブロックする。
【０２４４】 ハイブリダイゼーション ハイブリダイゼーション反応は、５×SSC,０.２％SDSハイブリダイゼーション
緩衝液中のCy3及びCy5標識したcDNA合成生成物を各０.２μg含む９μlのサンプ
ル混合体を有する。サンプル混合体は、６５℃まで５分間加熱し、マイクロアレ
イ表面上で等分して１.８cm2 のカバーガラスで覆う。アレイは、顕微鏡スライ
ドより僅かに大きいキャビティを有する防水チェンバーに移行させる。チェンバ
ーのコーナーに１４０μlの５×SSCを加えることにより、チェンバー内部を湿度
100%に保持する。アレイを含むチェンバーは、６０℃で約６．５時間インキュベ
ートする。アレイは、第１洗浄緩衝液中（１×SSC,０.１％SDS）において４５℃
で１０分間洗浄し、第２洗浄緩衝液中（０.１×SSC）において４５℃で１０分間
各々３度洗浄して乾燥させる。
【０２４５】 検出 レポーター標識ハイブリダイゼーション複合体は、Cy3の励起のためには４８
８nm、Cy3の励起のためには６３２nmでスペクトル線を生成し得るInnova 70混合
ガス10 Wレーザ（Coherent, Inc., Santa Clara CA）を備えた顕微鏡で検出する
。２０×顕微鏡対物レンズ（Nikon, Inc., Melville NY）を用いて、アレイ上に
励起レーザ光を集中させる。アレイを含むスライドを顕微鏡のコンピュータ制御
X-Yステージに置き、対物レンズを通過してラスタスキャンする。本実施例で用
いた１.８cm×１.８cmのアレイは、２０μmの解像度でスキャンした。
【０２４６】 ２つの異なるスキャンのうち、混合ガスマルチラインレーザは２つの蛍光体を
連続的に励起する。放射された光は、２つの蛍光体に応じて波長に基づき２つの
光電子増倍管検出器（PMT R1477, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater
NJ）に分割される。アレイと光電子増倍管間に設置された好適なフィルターを用
いて、シグナルをフィルタリングする。用いる蛍光体の最大発光は、Cy3では５
６５nm、Cy5では６５０nmである。装置は両方の蛍光体からのスペクトルを同時
に記録し得るが、レーザ源において好適なフィルターを用いて各アレイを通常２
度スキャンし、蛍光体１つにつき１度スキャンする。
【０２４７】 スキャンの感度は通常、既知濃度のサンプル混合体に添加されるcDNA制御種に
より生成されるシグナル強度を用いて較正する。アレイ上の特定の位置には相補
的DNA配列が含まれ、その位置におけるシグナルの強度をハイブリダイジング種
の重量比1：100,000に相関させる。異なる源（例えば試験及び制御細胞を表す）
からの２つのサンプルを、各々異なる蛍光体で標識し、他と異なって発現した遺
伝子を同定するために単一のアレイにハイブリダイズする場合には、２つの蛍光
体を有する較正cDNAの標識サンプルにより較正し、ハイブリダイゼーション混合
体に各々等量を加える。
【０２４８】 光電子増倍管の出力は、IBMコンパチブルPCコンピュータにインストールされ
た１２ビットRTI-835Hアナログ−ディジタル（AID）変換ボード（Analog Device
s, Inc., Norwood MA）を用いてディジタル化される。ディジタル化されたデー
タは、青色（低シグナル）から赤色（高シグナル）までの擬似カラー範囲へのリ
ニア２０色変換を用いてシグナル強度がマッピングされたようなイメージとして
表示される。データは、定量的にも分析される。２つの異なる蛍光体を同時に励
起及び測定する場合には、各蛍光体の発光スペクトルを用いて、データは先ず蛍
光体と蛍光体の間の光学磁気プリンティング（発光スペクトルの重畳に起因する
）に集められる。
【０２４９】 グリッドは蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットから
のシグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグ
ナルは統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に
用いるソフトウェアは、GEMTOOLS遺伝子発現分析プログラム（Incyte）である。
【０２５０】 ９ 相補的ポリヌクレオチド CYAPをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的配列は、天然のCY
APの発現を検出し、低下させ、または阻害するために用いられる。約１５〜３０
塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さな或いは
大きな配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いることができる。Oligo4.0
6ソフトウェア（National Biosciences）、及びCYAPをコードする配列を用いて
、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な
５' 配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモーターが
コーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、CYAPをコ
ードする転写物にリボソームが結合しないように相補的オリゴヌクレオチドをデ
ザインする。
【０２５１】 １０ CYAPの発現 CYAPの発現及び精製は、細菌またはウイルスをベースにした発現系を用いて行
うことができる。細菌でCYAPを発現するために、抗生物質耐性及びcDNAの転写レ
ベルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにcDNAをサブクローニ
ングする。このようなプロモーターには、lacオペレーター調節エレメントに関
連するT5またはT7バクテリオファージプロモーター及びtrp-lac(tac)ハイブリッ
ドプロモーターが含まれるが、これらに限定するものではない。組換えベクター
を、BL21（DE3）等の好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性をもつ細菌
が、イソプロピルβ-Dチオガラクトピラノシド（IPTG）で誘導されるとCYAPを発
現する。真核細胞でのCYAPの発現は、一般にバキュロウイルスとして知られてい
るAutographica californica核多面性ウイルス（AcMNPV）を昆虫細胞株または哺
乳動物細胞株に感染させて行う。バキュロウイルスの可欠ポリヘドリン遺伝子を
、相同的組換え、或いは転移プラスミドの仲介に関与する細菌仲介遺伝子転移の
どちらかによって、CYAPをコードするcDNAと置換する。ウイルスの感染力は維持
され、強いポリヘドリンプロモーターによって高いレベルのcDNAの転写が行われ
る。組換えバキュロウイルスは、多くの場合はSpodoptera frugiperda（Sf9）昆
虫細胞に感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも用いられることもある。後
者の感染の場合は、バキュロウイルスの更なる遺伝的変更が必要になる。（Enge
lhard. E. K.ら (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227、Sandig, V
. ら (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945.等を参照）。
【０２５２】 殆どの発現系では、融合タンパク質としてCYAPを合成するのに例えばグルタチ
オンSトランスフェラーゼ（GST）またはペプチドエピトープ標識、例えばFLAGや
6-Hisを用いる。これらを用いることにより、未精製細胞溶解物から組換え融合
タンパク質の親和性ベースの精製を迅速に１ステップで行うことができる。GST
は日本住血吸虫からの26kDaの酵素であり、タンパク質の活性及び抗原性を維持
した状態で、固定化グルタチオン上で融合タンパク質の精製を可能とする（Amer
sham Pharmacia Biotech）。精製後、GSTの部分を特定の開発部位においてCYAP
からタンパク分解的に切断することが可能である。FLAGは８アミノ酸のペプチド
であり、市販されているモノクローナル及びポリクローナル抗FLAG抗体（Eastma
n Kodak）を用いて免疫親和性精製を可能にする。６ヒスチジン残基が連続して
伸長した6-Hisは、金属キレート樹脂（QIAGEN）上での精製を可能にする。タン
パク質の発現及び精製の方法は、前出のAusubel（1995）10章、16章に記載され
ている。これらの方法で精製したCYAPを直接用いて実施例１１及び１５のアッセ
イを行うことができる。
【０２５３】 １１ CYAP活性の実証 確立された細胞骨格成分と比較されるようなCYAPに対する免疫局在性アッセイ
は、CYAP分子が細胞骨格関連タンパク質であることを実証する。分化または細胞
周期の様々な段階の細胞を用い、ケラチン、ビメンチンまたはデスミンなどのフ
ィラメント成分、チューブリンなどの微小管成分またはアクチンなどのマイクロ
フィラメント成分を仲介するための蛍光性結合抗体で免疫蛍光顕微鏡検査を行う
ことにより、CYAP特異蛍光性結合抗体の局在化と各細胞骨格成分の間に相関性が
生まれる。既知の細胞骨格成分とCYAPの両方に対する細胞の同時染色は、抗体標
識として差動的興奮性蛍光種を用いることにより達成される。或るいは、アクチ
ンフィラメントのためにファロイジンなどの蛍光染色で確立された細胞骨格成分
を直接染色することができる。
【０２５４】 或いは、CYAPに対するアッセイは、in vitroでのタンパク質フィラメントの形
成を測定する。ポリマー配列のために「臨界濃度」以上の濃度でCYAPを溶解する
ことは、炭素披覆格子に適用される。溶液中には適切な核形成部位を供給し得る
。格子は、０.７％(w/v) の水性ウラニルアセテートでネガティブ染色し、電子
顕微鏡検査により検査する。直径が約２５nm（微小管）、８nm（アクチン）また
は１０nm（中間フィラメント）であるフィラメントの外観は、タンパク質活性の
実証である。
【０２５５】 １２ 機能的アッセイ CYAP機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでのCY
APをコードする配列の発現によって評価する。cDNAを、cDNAを高いレベルで発現
する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにサブクローニングする。選
り抜きのベクターには、pCMV SPORTプラスミド（Life Technologies）及びpCR 3
.1プラスミド（Invitrogen）が含まれ、どちらもサイトメガロウイルスプロモー
ターを有する。リポソーム製剤或いは電気穿孔法を用いて、５〜１０μgの組換
えベクターをヒト細胞株、例えば内皮由来または造血由来の細胞株に一時的に形
質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む１〜２μgのプラス
ミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入細胞と非形
質移入細胞を区別する手段が与えられる。また、標識タンパク質の発現によって
、cDNAの組換えベクターからの発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、例
えば緑色蛍光タンパク質（GFP；Clontech）、CD64またはCD64-GFP融合タンパク
質から選択できる。自動化された、レーザー光学に基づく技術であるフローサイ
トメトリー（FCM）を用いて、GFPまたはCD64-GFPを発現する形質移入された細胞
を同定し、その細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。FCMは、細
胞死に先行するか或いは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出し
て計量する。このような現象として挙げられるのは、プロピジウムヨウ化物によ
るDNA染色によって計測される核DNA内容物の変化、ブロモデオキシウリジンの取
込量の低下によって計測されるDNA合成の下方調節、特異抗体との反応性によっ
て計測される細胞表面及び細胞内におけるタンパンク質の発現の変化、及び蛍光
複合アネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組
成の変化とがある。フローサイトメトリー法については、Ormerod, M. G. (1994
) Flow Cytometry Oxford, New York, NY.に記述がある。
【０２５６】 遺伝子発現におけるCYAPの影響は、CYAPをコードする配列とCD64またはCD64-G
FPのいずれかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価すること
ができる。CD64またはCD64-GFPは、形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫
グロブリンG（IgG）の保存領域と結合する。形質転換細胞と非形質転換細胞は、
ヒトIgGまたはCD64に対する抗体（DYNAL, Lake Success. NY）で覆われた磁気ビ
ーズを用いて有効に分離することができる。mRNAは、本技術分野で公知の方法で
細胞から精製することができる。CYAPその他の目的の遺伝子をコードするmRNAの
発現は、ノーザン分析或いはマイクロアレイ技術で分析することができる。
【０２５７】 １３ CYAP特異抗体の産生 ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（PAGE；Harrington, M.G. (1990) Method
s Enzymol. 182:488-495等を参照）または他の精製技術を用いて実質上精製され
たCYAPを用いて、標準プロトコルでウサギを免疫化して抗体を産出する。
【０２５８】 或いは、レーザGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いてCYAPアミノ酸配列を解
析し、免疫抗原性の高い領域を決定する。そして対応するオリゴペプチドを合成
し、このオリゴペプチドを用いて当業者によく知られている方法で抗体を生成す
る。適切なエピトープ、例えばＣ末端付近或いは隣接する親水性領域にあるエピ
トープの選択については、当分野で公知である（前出のAusubel, 1995, 11章等
を参照）。
【０２５９】 通常は、長さ約１５残基のオリゴペプチドを、Fmocケミストリを用いるABI 43
1A ペプチドシンセサイザ（PE Biosystems）を用いて合成し、N-マレイミドベン
ゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）を用いた反応によってKLH
（Sigma-Aldrich, St. Louis MO）に結合させて、免疫抗原性を高める（前出のA
usubel, 1995 等を参照）。完全フロイントアジュバントにおいてオリゴペプチ
ド-KLM複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性及
び抗CYAP活性を検査するには、ペプチドまたはCYAPを基質に結合し、１％BSAを
用いてブロックし、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素で標
識したヤギ抗ウサギIgGと反応させる。
【０２６０】 １４ 特異抗体を用いた天然のCYAPの精製 天然または組換えCYAPを、CYAP特異抗体を用いたイムノアフィニティークロマ
トグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、抗CYAP抗
体を活性化クロマトグラフィー用樹脂、例えばCNBr活性化セファロース（Amersh
am Pharmacia Biotech）と共有結合させることにより構築する。結合後に、製造
者の使用説明書に従って樹脂をブロックし、洗浄する。
【０２６１】 CYAPを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、CYAPを優先的に吸着
する条件下（例えば洗浄剤が存在する高イオン強度バッファ）でカラムを洗浄す
る。抗体とCYAPの結合を破壊する条件（例えばpH２〜３のバッファ、或いは尿素
またはチオシアン酸塩イオン等の高濃度のカオトロープ剤）でカラムを溶出させ
、CYAPを回収する。
【０２６２】 １５ CYAPと相互作用する分子の同定 CYAPまたは生物学的に活性であるCYAP断片を、125Iボルトンハンター試薬で標
識する。（Bolton A.E.and W.M. Hunter (1973) Biochem. J. 133:529-539等を
参照。）マルチウェルプレートの穴の中に予め配列しておいた候補分子を、標識
したCYAPと共にインキュベートして洗浄し、標識したCYAP複合体を有する全ての
穴をアッセイする。CYAP濃度を変えて得たデータを用いて、候補分子とのCYAPの
数、親和性及び会合の値を計算する。
【０２６３】 或いは、CYAPと相互作用する分子は、Fields, S. 及び O. Song（1989, Natur
e 340:245-246）に記載されているような酵母２ハイブリッドシステムを用いて
分析するか、またはMATCHMAKERシステム（Clontech）等の２ハイブリッドシステ
ムに基づく市販のキットを用いて分析する。
【０２６４】 CYAPはまた、ハイスループット方法で酵母２ハイブリッドシステムを使用する
PATHCALLINGプロセス（CuraGen Corp., New Haven CT）に用いて、遺伝子の２大
ライブラリにコードされる遺伝子間の全ての相互作用を決定することができる（
Nandabalan, K. ら (2000) 米国特許第6,057,101号）。
【０２６５】 当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法
及びシステムの種々の改変を行い得る。本発明について説明するにあたり特定の
好適実施例に関連して説明を行ったが、本発明の範囲が、そのような特定の実施
例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学ま
たは関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載されている本発明の実施方
法の様々な改変は、特許請求の範囲内にあるものとする。
【０２６６】 （表の簡単な説明） 表１は、CYAPをコードする完全長の配列をアセンブルするために用いた、ポリ
ペプチド配列及びヌクレオチド配列の配列番号（SEQ ID NO）、クローン識別番
号（クローンID）、cDNAライブラリ及びcDNA断片を示す。
【０２６７】 表２は、潜在モチーフと、相同配列と、CYAPの解析に用いた方法、アルゴリズ
ム及び検索可能なデータベースとを含む各ポリペプチド配列の特徴を示す。
【０２６８】 表３は、各核酸配列の選択された断片と、ノーザン分析によって決定された各
核酸配列の組織特異的発現パターンと、これらの組織に関連した疾患、異常症ま
たは症状と、各DNAのクローニング先のベクターとを示す。
【０２６９】 表４は、cDNAライブラリの作製に用いた組織を示す。CYAPをコードするcDNAク
ローンはここから単離した。
【０２７０】 表５は、CYAPの分析に用いたツール、プログラム、アルゴリズムを、適用可能
な説明、引用文献及び閾値パラメータと共に示す。
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】平成１４年４月１８日（２００２．４．１８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/04 Ａ６１Ｐ 1/18 ４Ｃ０８４ 1/16 3/00 ４Ｃ０８５ 1/18 3/10 ４Ｈ０４５ 3/00 5/00 3/10 5/14 5/00 7/00 5/14 7/04 7/00 7/06 7/04 7/08 7/06 9/00 7/08 9/10 9/00 １０１ 9/10 11/00 １０１ 11/06 11/00 13/02 11/06 13/12 13/02 17/00 13/12 17/06 17/00 19/02 17/06 19/06 19/02 19/10 19/06 21/00 19/10 21/04 21/00 25/00 21/04 25/02 25/00 １０１ 25/02 １０３ １０１ 25/04 １０３ 25/08 25/04 25/14 25/08 25/16 25/14 25/18 25/16 25/20 25/18 27/02 25/20 29/00 27/02 １０１ 29/00 31/00 １０１ 31/04 31/00 31/10 31/04 31/12 31/10 31/18 31/12 33/00 31/18 33/02 33/00 33/10 33/02 35/00 33/10 35/02 35/00 37/06 35/02 37/08 37/06 43/00 １１１ 37/08 Ｃ０７Ｋ 14/47 43/00 １１１ 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/53 Ｍ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/53 5/00 Ａ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ， ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｃ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，Ｔ Ｊ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ヒルマン、ジェニファー・エル アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・ マウンテンビュー・＃12・モンロードライ ブ 230 (72)発明者 ボーグン、マライア・アール アメリカ合衆国カリフォルニア州94577・ サンレアンドロ・サンティアゴロード 14244 (72)発明者 トラン、バオ アメリカ合衆国カリフォルニア州95051・ サンタクララ・キーリーブールバード 744 (72)発明者 アジムザイ、ヤルダ アメリカ合衆国カリフォルニア州94545・ ヘイワード・ロックスプリングスドライブ 2045 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA40 BB03 BB20 CA25 CA26 CB01 CB03 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 FB02 FB03 FB07 4B024 AA01 AA11 CA04 FA02 HA01 HA14 4B063 QA18 QQ43 QR08 QR56 QS25 QS34 4B064 AG01 CA19 CC24 DA03 DA13 4B065 AB01 BA01 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA17 BA01 BA02 BA08 BA22 CA17 CA18 CA20 CA21 CA22 CA23 CA53 DA40 NA14 ZA01 ZA02 ZA05 ZA06 ZA12 ZA15 ZA16 ZA18 ZA20 ZA21 ZA22 ZA24 ZA33 ZA36 ZA45 ZA51 ZA53 ZA55 ZA59 ZA66 ZA75 ZA81 ZA89 ZA94 ZA96 ZA97 ZB08 ZB11 ZB13 ZB15 ZB26 ZB27 ZB31 ZB32 ZB33 ZB35 ZB37 ZB38 ZB39 ZC21 ZC41 ZC55 4C085 AA06 BB11 CC21 CC32 DD62 EE01 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA09 CA40 DA75 EA21 EA22 EA28 EA50

Claims (27)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下の（ａ）乃至（ｄ）を有する群から選択したアミノ酸
    配列を含む実質上単離されたポリペプチド。 （ａ）配列番号１乃至５を有する群から選択したアミノ酸配列 （ｂ）配列番号１乃至５を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９
    ０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列 （ｃ）配列番号１乃至５を有する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性
    断片 （ｄ）配列番号１乃至５を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断
    片
  2. 【請求項２】 配列番号１乃至５を有する群から選択した請求項１に記載
    の単離されたポリペプチド。
  3. 【請求項３】 請求項１のポリペプチドをコードする単離されたポリヌク
    レオチド。
  4. 【請求項４】 請求項２のポリペプチドをコードする単離されたポリヌク
    レオチド。
  5. 【請求項５】 配列番号６乃至１０を有する群から選択した請求項４に記
    載の単離されたポリヌクレオチド。
  6. 【請求項６】 請求項３に記載のポリヌクレオチドに機能的に結合したプ
    ロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチド。
  7. 【請求項７】 請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを用いて形質転
    換した細胞。
  8. 【請求項８】 請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを含む遺伝形質
    転換体。
  9. 【請求項９】 請求項１に記載のポリペプチドを製造する方法であって、 （ａ）組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞を前記ポリペプチド
    の発現に適した条件下で培養する過程と、 （ｂ）そのように発現した前記ポリペプチドを受容する過程とからなり、 前記組換えポリヌクレオチドが、請求項１に記載の前記ポリペプチドをコード
    するポリヌクレオチドに機能的に結合したプロモーター配列を有することを特徴
    とする方法。
  10. 【請求項１０】 請求項１に記載のポリペプチドと特異結合するような単
    離された抗体。
  11. 【請求項１１】 以下の（ａ）乃至（ｄ）を有する群から選択したポリヌ
    クレオチド配列を含む実質上単離されたポリヌクレオチド。 （ａ）配列番号６乃至１０を有する群から選択したポリヌクレオチド配列 （ｂ）配列番号６乃至１０を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少
    なくとも７０％の相同性を有する天然のポリヌクレオチド配列 （ｃ）（ａ）に相補的なポリヌクレオチド配列 （ｄ）（ｂ）に相補的なポリヌクレオチド配列 （ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物
  12. 【請求項１２】 請求項１１に記載のポリヌクレオチドの少なくとも６０
    の連続したヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。
  13. 【請求項１３】 請求項１１に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標
    的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、 （ａ）前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドに相補的な配列を有する少
    なくとも２０の連続したヌクレオチドを含むプローブを用いて前記サンプルをハ
    イブリダイズする過程と、 （ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体の存在・不存在を検出し、該複合体
    が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程からなり、 前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドの間でハイブリダイゼーション複合
    体が形成されるような条件下で、前記プローブが前記標的ポリヌクレオチドに特
    異的にハイブリダイズすることを特徴とする方法。
  14. 【請求項１４】 前記プローブが少なくとも６０の連続したヌクレオチド
    を含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 請求項１１に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標
    的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、 （ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて前記標的ポリヌクレオチドまたはそ
    の断片を増幅する過程と、 （ｂ）前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片の存在・不存在を検出し、該
    標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を
    検出する過程を含むことを特徴とする方法。
  16. 【請求項１６】 有効量の請求項１のポリペプチドと、薬剤として許容で
    きる賦形剤とを有することを特徴とする医薬品成分。
  17. 【請求項１７】 前記ポリペプチドが、配列番号１乃至５を有する群から
    選択したアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１６に記載の医薬品成分。
  18. 【請求項１８】 機能性CYAPの発現低下に関連する疾患又は病状を治療す
    る方法であって、そのような治療を必要とする患者に対して請求項１６に記載の
    医薬品成分を投与する過程を含むことを特徴とする方法。
  19. 【請求項１９】 請求項１に記載のポリペプチドのアゴニストとして有効
    性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、 （ａ）請求項１に記載のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝す過程と、 （ｂ）前記サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程とを含むことを特徴と
    する方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１９に記載の方法によって同定したアゴニスト化
    合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする医薬品成分。
  21. 【請求項２１】 機能性CYAPの発現低下に関連する疾患又は病状を治療す
    る方法であって、そのような治療を必要とする患者に対して請求項２０に記載の
    医薬品成分を投与する過程を含むことを特徴とする方法。
  22. 【請求項２２】 請求項１に記載のポリペプチドのアンタゴニストとして
    有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、 （ａ）請求項１に記載のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝す過程と、 （ｂ）前記サンプル中のアンタゴニスト活性を検出する過程とを含むことを特
    徴とする方法。
  23. 【請求項２３】 請求項２２に記載の方法によって同定したアンタゴニス
    ト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする医薬品成分
    。
  24. 【請求項２４】 機能性CYAPの過剰発現に関連する疾患又は病状の治療方
    法であって、そのような治療を必要とする患者に対して請求項２３に記載の医薬
    品成分を投与する過程を含むことを特徴とする方法。
  25. 【請求項２５】 請求項１に記載のポリペプチドに特異結合する化合物を
    スクリーニングする方法であって、 （ａ）適切な条件下で請求項１に記載のポリペプチドを少なくとも１つの試験
    化合物に結合させる過程と、 （ｂ）請求項１に記載のポリペプチドの試験化合物との結合を検出し、それに
    よって請求項１に記載のポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程とを
    含むことを特徴とする方法。
  26. 【請求項２６】 請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物
    をスクリーニングする方法であって、 （ａ）請求項１に記載のポリペプチドの活性が許容された条件下で、請求項１
    に記載のポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物に結合させる過程と、 （ｂ）請求項１に記載のポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する
    過程と、 （ｃ）試験化合物の存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性を、試験
    化合物の不存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性と比較する過程とを
    含み、 試験化合物の存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性の変化が、請求
    項１に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物を標示することを特徴とする
    方法。
  27. 【請求項２７】 請求項５に記載の配列を有する標的ポリヌクレオチドの
    変異発現の有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、 （ａ）前記標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝す過程と、 （ｂ）前記標的ポリヌクレオチドの変異発現を検出する過程とを含むことを特
    徴とする方法。
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