JP2002539796A - 腫瘍細胞誘導転写因子の制御の下にある毒素遺伝子を含む抗新生物ウイルス剤 - Google Patents
腫瘍細胞誘導転写因子の制御の下にある毒素遺伝子を含む抗新生物ウイルス剤Info
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Abstract
(57)【要約】
１種類またはそれ以上の野生型転写因子結合部位の代わりに１種類またはそれ以上の腫瘍特異的転写因子結合部位を、ウイルスの核酸複製を司る早期遺伝子の発現を制御するプロモーター領域に作動的に位置して有するウイルスＤＮＡ構築体、及びそれらによってコードされるウイルスが提供される。好ましい構築体は、腫瘍特異的転写因子結合部位をＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ末端タンパク質及び／又はＤＮＡ結合タンパク質に対して作動的に配置する。好ましくは治療において用いるための、組成物及びそこに含まれる構築体が提供される。新生物患者の治療方法も提供される。
Description
【０００１】 本発明は新生物、例えば腫瘍、特には結腸細胞から誘導される腫瘍、さらには
結腸細胞原発性腫瘍の転移である肝臓腫瘍の治療に用途があるウイルス剤を提供
する。特には、腫瘍細胞中に存在する転写活性化因子に応答して選択的に複製す
る複製が効率的なアデノウイルスが提供され、これらの因子は他の細胞と比較し
て腫瘍細胞中に排他的に、又は高レベルで存在し、したがって、腫瘍細胞の死及
び細胞溶解につながる。
結腸細胞原発性腫瘍の転移である肝臓腫瘍の治療に用途があるウイルス剤を提供
する。特には、腫瘍細胞中に存在する転写活性化因子に応答して選択的に複製す
る複製が効率的なアデノウイルスが提供され、これらの因子は他の細胞と比較し
て腫瘍細胞中に排他的に、又は高レベルで存在し、したがって、腫瘍細胞の死及
び細胞溶解につながる。
【０００２】 これらのウイルス剤を肝臓に局所的に注射することにより、結腸癌患者におけ
る罹患の主因である肝臓転移を治療することが可能である。これを越えて、例え
ば、他の部位及び他の腫瘍、例えば、結腸直腸癌及びメラノーマまでの適用も提
供される。
る罹患の主因である肝臓転移を治療することが可能である。これを越えて、例え
ば、他の部位及び他の腫瘍、例えば、結腸直腸癌及びメラノーマまでの適用も提
供される。
【０００３】 結腸癌はほとんどの患者において局所的に進行した、又は転移性の疾患と共に
存在する。大部分の患者は、原発性腫瘍の切除後の唯一の疾患部位として肝臓転
移を有したままである。部分的な肝臓の切除で治癒するのは患者の約１０％のみ
であり、これに対して両肝臓葉に多発性の転移を伴う患者においては切除は不可
能であり、化学療法での領域移動（loco-regional）又は全身治療が指示される
（Labiancaら、1997）。５−フルオロウラシル及びロイコボリンもしくはイリノ
テカンを用いる全身化学療法で生じる応答率は僅か２０％である（Cunninghamら
、1998；Stuppら、1998）。
存在する。大部分の患者は、原発性腫瘍の切除後の唯一の疾患部位として肝臓転
移を有したままである。部分的な肝臓の切除で治癒するのは患者の約１０％のみ
であり、これに対して両肝臓葉に多発性の転移を伴う患者においては切除は不可
能であり、化学療法での領域移動（loco-regional）又は全身治療が指示される
（Labiancaら、1997）。５−フルオロウラシル及びロイコボリンもしくはイリノ
テカンを用いる全身化学療法で生じる応答率は僅か２０％である（Cunninghamら
、1998；Stuppら、1998）。
【０００４】 肝臓の領域移動化学療法は１５年にわたって調査されている。ほとんどの肝臓
転移は肝動脈によって血液と共に供給され、したがって、動脈内肝化学療法（Ｉ
ＡＨＣ）が転移を細胞毒性薬物により多く露出することを可能にする。正常肝臓
の高い抽出率は全身の薬物濃度を減少させ、それが６０％を上回る応答率が繰り
返し示されているＩＡＨＣでの低い毒性を生じる（Kemenyら、1987；Kemenyら、
1992；Patt及びMavligit、1991）。
転移は肝動脈によって血液と共に供給され、したがって、動脈内肝化学療法（Ｉ
ＡＨＣ）が転移を細胞毒性薬物により多く露出することを可能にする。正常肝臓
の高い抽出率は全身の薬物濃度を減少させ、それが６０％を上回る応答率が繰り
返し示されているＩＡＨＣでの低い毒性を生じる（Kemenyら、1987；Kemenyら、
1992；Patt及びMavligit、1991）。
【０００５】 腫瘍細胞に特定の欠陥が正常細胞に害を及ぼすことなく腫瘍細胞を標的とする
ための合理的な方策をたてることを可能にする。抗血管形成治療を除いて、これ
は通常腫瘍細胞への外来性ＤＮＡの導入を必要とし、これを行うための最も効率
的な方法はウイルスを用いるものである。例えば、US 5,698,443 には、前立腺
癌細胞を標的とする腫瘍特異的アデノウイルスが記載されている。このウイルス
はウイルスＥ１遺伝子を駆動する前立腺特異的エンハンサー配列を利用しており
、この特許は標的細胞内での毒素の特異的な発現へのその使用を示唆している。
ための合理的な方策をたてることを可能にする。抗血管形成治療を除いて、これ
は通常腫瘍細胞への外来性ＤＮＡの導入を必要とし、これを行うための最も効率
的な方法はウイルスを用いるものである。例えば、US 5,698,443 には、前立腺
癌細胞を標的とする腫瘍特異的アデノウイルスが記載されている。このウイルス
はウイルスＥ１遺伝子を駆動する前立腺特異的エンハンサー配列を利用しており
、この特許は標的細胞内での毒素の特異的な発現へのその使用を示唆している。
【０００６】 腫瘍細胞において選択的に複製するウイルスは癌の遺伝子治療の大きな可能性
を有する。原理的には、選択的に複製する細胞毒性ウイルスは腫瘍全体にわたっ
てその細胞の全てが破壊されるまで漸次広がることができる。これは、従来の置
換遺伝子治療に対する主な制限である、ウイルスを注射したときに全ての腫瘍細
胞に感染させる必要性を克服する。なぜならば、原理的には、ウイルスは残留す
る腫瘍細胞がなくなるまで産生され続け、新たなウイルスの放出と同時に細胞を
溶解するためである。したがって、癌遺伝子治療との重要な基本的な相違は、非
複製性ウイルスを用いる単ヒットアプローチと複製性ウイルスを用いる多ヒット
アプローチとの間にある。
を有する。原理的には、選択的に複製する細胞毒性ウイルスは腫瘍全体にわたっ
てその細胞の全てが破壊されるまで漸次広がることができる。これは、従来の置
換遺伝子治療に対する主な制限である、ウイルスを注射したときに全ての腫瘍細
胞に感染させる必要性を克服する。なぜならば、原理的には、ウイルスは残留す
る腫瘍細胞がなくなるまで産生され続け、新たなウイルスの放出と同時に細胞を
溶解するためである。したがって、癌遺伝子治療との重要な基本的な相違は、非
複製性ウイルスを用いる単ヒットアプローチと複製性ウイルスを用いる多ヒット
アプローチとの間にある。
【０００７】 単ヒットアプローチは腫瘍細胞に毒性遺伝子を直接形質導入することによって
作用する；バイスタンダー効果（bystander effects）を無視すると、１つのウ
イルス粒子が１つの細胞を殺す。例には腫瘍サプレッサー遺伝子の発現の回復及
び腫瘍特異的プロモーターを用いる毒素の条件発現が含まれる。単ヒットアプロ
ーチについては、注入されるウイルスの量が重要な制限因子である。多ヒットア
プローチは、腫瘍細胞に対する免疫反応を刺激するか、又は腫瘍内で複製するウ
イルスを用いることによってこの制限を回避する。大部分の腫瘍細胞は注入され
たウイルスそれ自体では殺されないため、注入されるウイルスの量は治療応答を
制限する重要な因子ではないはずである。
作用する；バイスタンダー効果（bystander effects）を無視すると、１つのウ
イルス粒子が１つの細胞を殺す。例には腫瘍サプレッサー遺伝子の発現の回復及
び腫瘍特異的プロモーターを用いる毒素の条件発現が含まれる。単ヒットアプロ
ーチについては、注入されるウイルスの量が重要な制限因子である。多ヒットア
プローチは、腫瘍細胞に対する免疫反応を刺激するか、又は腫瘍内で複製するウ
イルスを用いることによってこの制限を回避する。大部分の腫瘍細胞は注入され
たウイルスそれ自体では殺されないため、注入されるウイルスの量は治療応答を
制限する重要な因子ではないはずである。
【０００８】 古典的な遺伝子置換治療はｐ５３を発現するレトロウイルスを用いて行われて
いる（Rothら、1996）。ｐ５３は読み取り枠の５００を越える部位での突然変異
によってその癌遺伝子形態に変換され得るため（Flamanら、1994）、レトロウイ
ルスの突然変異は少なくとも１％の形質導入ｐ５３をそのような望ましくない変
異体形態に変換する。これは、各々の患者が、約２，５００万の変異体ｐ５３を
発現するウイルスの感染性ユニットを受けていたことを意味する（Estreicher及
びIggo、1996）。
いる（Rothら、1996）。ｐ５３は読み取り枠の５００を越える部位での突然変異
によってその癌遺伝子形態に変換され得るため（Flamanら、1994）、レトロウイ
ルスの突然変異は少なくとも１％の形質導入ｐ５３をそのような望ましくない変
異体形態に変換する。これは、各々の患者が、約２，５００万の変異体ｐ５３を
発現するウイルスの感染性ユニットを受けていたことを意味する（Estreicher及
びIggo、1996）。
【０００９】 アデノウイルスＡｄ−ＣＭＶ−ｐ５３を用いて野生型ｐ５３を発現させること
により有望なアプローチが頭部及び頸部癌において臨床的に示されており、現在
は肺、結腸及び肝臓癌において研究中である（Claymanら、1998）。アデノウイ
ルスは比較的安定であり、高力価で産生させることが可能であり、かつ多くの異
なる型の静止状態細胞及び分割細胞の両者に感染することができる。全体的には
、Ａｄ−ＣＭＶ−ｐ５３は例外的に非毒性ではあるが、おそらくは単一の剤とし
ては無効であるものと思われる；したがって、より攻撃的な第２世代ウイルスの
余地がある。
により有望なアプローチが頭部及び頸部癌において臨床的に示されており、現在
は肺、結腸及び肝臓癌において研究中である（Claymanら、1998）。アデノウイ
ルスは比較的安定であり、高力価で産生させることが可能であり、かつ多くの異
なる型の静止状態細胞及び分割細胞の両者に感染することができる。全体的には
、Ａｄ−ＣＭＶ−ｐ５３は例外的に非毒性ではあるが、おそらくは単一の剤とし
ては無効であるものと思われる；したがって、より攻撃的な第２世代ウイルスの
余地がある。
【００１０】 さらなる標的特異的な欠陥は、Ｇ１／Ｓ制御の喪失を生じる網膜芽細胞腫経路
におけるｐ１６、ｃｄｋ４、サイクリンＤ又はＲｂの突然変異（Bartekら、1997
）であり、本質的に全ての腫瘍がこれらを有する。唯一の重要な例外が結腸癌で
あり、Ｒｂ経路における突然変異それ自体が希である。これらの欠陥の正味の結
果はＥ２Ｆ活性の増加であり、これはＥ２Ｆによって調節されるプロモーターか
ら毒性遺伝子を発現するウイルスがその腫瘍を選択的に標的とし得ることを意味
する。これは、そのようなプロモーターからＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子を発
現するアデノウイルスを用いて示されている（Parrら、1997）；Ｒｂ経路の突然
変異を含む細胞はｔｋを発現し、ガンシクロビルで殺すことができる。このよう
なアプローチは腫瘍細胞内での特定の転写因子の活性の増加を頼りにしている。
におけるｐ１６、ｃｄｋ４、サイクリンＤ又はＲｂの突然変異（Bartekら、1997
）であり、本質的に全ての腫瘍がこれらを有する。唯一の重要な例外が結腸癌で
あり、Ｒｂ経路における突然変異それ自体が希である。これらの欠陥の正味の結
果はＥ２Ｆ活性の増加であり、これはＥ２Ｆによって調節されるプロモーターか
ら毒性遺伝子を発現するウイルスがその腫瘍を選択的に標的とし得ることを意味
する。これは、そのようなプロモーターからＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子を発
現するアデノウイルスを用いて示されている（Parrら、1997）；Ｒｂ経路の突然
変異を含む細胞はｔｋを発現し、ガンシクロビルで殺すことができる。このよう
なアプローチは腫瘍細胞内での特定の転写因子の活性の増加を頼りにしている。
【００１１】 腫瘍ターゲッティングの合理的な基礎はｐ５３よりも非複製性Ｅ２Ｆターゲッ
ティングウイルスについてより良好に理解されるが、両者は依然として単ヒット
アプローチであり、いったい如何にしてそれらを局所疾患の治療以上のものに用
いることができるのかを理解するのは非常に困難である。後期疾患における腫瘍
負荷は約１０12細胞であり、したがって、１つの治療を有効感染効率で実施する
ことは可能ではあるが、体内分布及び受容体の問題が意味するところはさらに大
幅に高い効率を必要とするということである。
ティングウイルスについてより良好に理解されるが、両者は依然として単ヒット
アプローチであり、いったい如何にしてそれらを局所疾患の治療以上のものに用
いることができるのかを理解するのは非常に困難である。後期疾患における腫瘍
負荷は約１０12細胞であり、したがって、１つの治療を有効感染効率で実施する
ことは可能ではあるが、体内分布及び受容体の問題が意味するところはさらに大
幅に高い効率を必要とするということである。
【００１２】 この制限を回避するための洗練された方法の１つは免疫系を増強して腫瘍細胞
を殺すことである。遺伝子治療ウイルスの役割は単に免疫応答を刺激又は強化す
ることである。腫瘍は新たな抗原を発現するが、癌患者においては明らかに免疫
系が腫瘍の形成を阻止できないでいるという多くの証拠が存在する。現在試みら
れている多くの技術は単一の抗原を標的とするが（例えば、メラノーマにおける
ＭＡＧＡ抗原に対する細胞毒性Ｔ細胞の産生）、治療の目的は複数の異なる抗原
に対する同時応答を誘発することでなければならず、これは、腫瘍における遺伝
的不安定性が意味するところが、腫瘍細胞の数が突然変異率を上回るために単一
抗原のターゲッティングが持続する応答を生成することがなさそうだということ
であるためである。したがって、免疫療法に対する獲得耐性は共通である。
を殺すことである。遺伝子治療ウイルスの役割は単に免疫応答を刺激又は強化す
ることである。腫瘍は新たな抗原を発現するが、癌患者においては明らかに免疫
系が腫瘍の形成を阻止できないでいるという多くの証拠が存在する。現在試みら
れている多くの技術は単一の抗原を標的とするが（例えば、メラノーマにおける
ＭＡＧＡ抗原に対する細胞毒性Ｔ細胞の産生）、治療の目的は複数の異なる抗原
に対する同時応答を誘発することでなければならず、これは、腫瘍における遺伝
的不安定性が意味するところが、腫瘍細胞の数が突然変異率を上回るために単一
抗原のターゲッティングが持続する応答を生成することがなさそうだということ
であるためである。したがって、免疫療法に対する獲得耐性は共通である。
【００１３】 単ヒットの問題の魅力的な解決法は腫瘍内でウイルスを産生させることである
。これはレトロウイルス産生細胞系を腫瘍床に注入することによって達成するこ
とができ、これはグリア芽細胞腫の臨床試験において現在試験されている方策で
ある（Roth及びCristiano、1997によって概説されている）。これは洗練されて
はいるが、移植細胞の即時拒絶の回避をＣＮＳにおける免疫特権に頼り、かつ腫
瘍ターゲッティングがレトロウイルスは非分割性の正常脳細胞には感染しないと
いう事実に依存するため、制限されたアプローチである。これは、産生されるウ
イルスそれ自体が複製適格ではなく、かつウイルスの産生が腫瘍細胞の存在より
もパッケージング細胞の生存に依存するため、腫瘍細胞特異的ウイルス複製の目
的に及ばない。
。これはレトロウイルス産生細胞系を腫瘍床に注入することによって達成するこ
とができ、これはグリア芽細胞腫の臨床試験において現在試験されている方策で
ある（Roth及びCristiano、1997によって概説されている）。これは洗練されて
はいるが、移植細胞の即時拒絶の回避をＣＮＳにおける免疫特権に頼り、かつ腫
瘍ターゲッティングがレトロウイルスは非分割性の正常脳細胞には感染しないと
いう事実に依存するため、制限されたアプローチである。これは、産生されるウ
イルスそれ自体が複製適格ではなく、かつウイルスの産生が腫瘍細胞の存在より
もパッケージング細胞の生存に依存するため、腫瘍細胞特異的ウイルス複製の目
的に及ばない。
【００１４】 プロトタイプ腫瘍選択性ウイルスはＥ１Ｂ ５５Ｋ遺伝子を欠く欠損アデノウ
イルスである（ｄｌ １５２０／ＯＮＹＸ ０１５、Bischoffら、1996）。正常
アデノウイルスにおいては５５Ｋがｐ５３を不活性化し、したがって、ｐ５３が
変異体である細胞においてはそれは必要ないはずである。実際には、野生型ｐ５
３を含む多くの細胞がこのウイルスによって殺される（Heiseら、1997）。本発
明者らはテトラサイクリン調節プロモーターの下に野生型ｐ５３を含むＨ１２９
９ ｐ５３−ヌル肺カルチノーマにおいてこれを試験しており、ｄｌ １５２０
が野生型ｐ５３の存在下に加えてその不在下においても複製することを見出して
いる。ｐ５３のターゲッティングに加えて、Ｅ１Ｂ ５５Ｋは選択的なウイルス
ＲＮＡの移行に必要とされ（Shenk、1996）、ｐ５３の喪失が如何にしてこの機
能に置き換わるのかは直ちに明らかではない。現在、ｄｌ １５２０がｐ５３の
欠損を標的とするという納得のいく証拠はない（Goodrum 1997、Goodrum 1998
、Hall 1998、Rothman 1998、Turnell 1999）。
イルスである（ｄｌ １５２０／ＯＮＹＸ ０１５、Bischoffら、1996）。正常
アデノウイルスにおいては５５Ｋがｐ５３を不活性化し、したがって、ｐ５３が
変異体である細胞においてはそれは必要ないはずである。実際には、野生型ｐ５
３を含む多くの細胞がこのウイルスによって殺される（Heiseら、1997）。本発
明者らはテトラサイクリン調節プロモーターの下に野生型ｐ５３を含むＨ１２９
９ ｐ５３−ヌル肺カルチノーマにおいてこれを試験しており、ｄｌ １５２０
が野生型ｐ５３の存在下に加えてその不在下においても複製することを見出して
いる。ｐ５３のターゲッティングに加えて、Ｅ１Ｂ ５５Ｋは選択的なウイルス
ＲＮＡの移行に必要とされ（Shenk、1996）、ｐ５３の喪失が如何にしてこの機
能に置き換わるのかは直ちに明らかではない。現在、ｄｌ １５２０がｐ５３の
欠損を標的とするという納得のいく証拠はない（Goodrum 1997、Goodrum 1998
、Hall 1998、Rothman 1998、Turnell 1999）。
【００１５】 ｐ５３発現ウイルスと同様に、化学療法及びｄｌ １５２０を用いる組み合わ
せ療法はイン・ビトロ及び異種移植片の両者においてより良好な結果をもたらす
（Heiseら、1997）。原理的には、このウイルスは残留腫瘍細胞がなくなるまで
複数回複製され、各感染細胞が１０3ないし１０4個の新たなウイルス粒子を産生
するため、投入ウイルスの量は制限されるべきではない。実際には、注入される
ｄｌ １５２０ウイルスの必要量はＡｄ−ＣＭＶ−ｐ５３での治療に匹敵する。
これは、このウイルスが複製するウイルスに期待されるものほどには機能しない
ことを意味し、その理由もまたおそらく非常に複雑である。アデノウイルスは、
通常、表在粘膜感染を生じ、これは小滴含有感染細胞（droplets containing in
fected cells）によって広がる。感染細胞は子孫細胞を保持する。溶解細胞から
の有効ウイルスの放出がないことは、ウイルスが腫瘍の全ての部分に侵入する場
合の目的である深い伝播性感染の生成を妨げる。
せ療法はイン・ビトロ及び異種移植片の両者においてより良好な結果をもたらす
（Heiseら、1997）。原理的には、このウイルスは残留腫瘍細胞がなくなるまで
複数回複製され、各感染細胞が１０3ないし１０4個の新たなウイルス粒子を産生
するため、投入ウイルスの量は制限されるべきではない。実際には、注入される
ｄｌ １５２０ウイルスの必要量はＡｄ−ＣＭＶ−ｐ５３での治療に匹敵する。
これは、このウイルスが複製するウイルスに期待されるものほどには機能しない
ことを意味し、その理由もまたおそらく非常に複雑である。アデノウイルスは、
通常、表在粘膜感染を生じ、これは小滴含有感染細胞（droplets containing in
fected cells）によって広がる。感染細胞は子孫細胞を保持する。溶解細胞から
の有効ウイルスの放出がないことは、ウイルスが腫瘍の全ての部分に侵入する場
合の目的である深い伝播性感染の生成を妨げる。
【００１６】 Ｅ２Ｆ欠損の合理的なターゲッティングは、そのライフサイクルの一部として
アデノウイルスがＥ２Ｆを標的とするタンパク質（Ｅ１Ａ及びＥ４ ｏｒｆ６／
７）を既に産生するという事実によって複雑化している。Ｅ１Ａ及びｏｒｆ６／
７が多機能性タンパク質であるため、Ｅ１Ａ及びｏｒｆ６／７変異体の効果は複
雑で予測不能である。
アデノウイルスがＥ２Ｆを標的とするタンパク質（Ｅ１Ａ及びＥ４ ｏｒｆ６／
７）を既に産生するという事実によって複雑化している。Ｅ１Ａ及びｏｒｆ６／
７が多機能性タンパク質であるため、Ｅ１Ａ及びｏｒｆ６／７変異体の効果は複
雑で予測不能である。
【００１７】 Ｅ２Ｆ及びｐ５３に加えて、腫瘍内でその活性が増加することが知られる４つ
の転写因子が存在する。これらはＴｃｆ４、ＲＢＰＪκ及びＧｌｉ−１（これら
はｗｎｔ、ノッチ（notch）、及びヘッジホッグ（hedgehog）シグナル伝達経路
の終末点を表す（Dahmaneら、1997；Jarriaultら、1995；van de Weteringら、1
997））並びにＨＩＦ１アルファ（これは、Von Hippel Lindau腫瘍サプレッサー
遺伝子における突然変異によって安定化される（Maxwellら、1999））である。
ＡＰＣ又はβ−カテニンにおける突然変異は結腸癌における普遍的な欠陥である
（Korinekら、1997；Morinら、1997）；しかしながら、これらは他の腫瘍、例え
ば、メラノーマにおいてもより低い頻度で生じる（Rubinfeldら、1997）。この
ような突然変異は罹患細胞におけるＴｃｆ活性の増加につながる。ヘッジホッグ
経路は基底細胞癌におけるパッチ化及び平滑化タンパク質の突然変異によって活
性化される（Stoneら、1996；Xieら、1998）。ノッチ突然変異は幾つかの白血病
において生じる（Ellisenら、1991）。テロメラーゼ活性は癌の特徴の１つであ
り（Hanahan D.及びWeinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell. 100, 57-70
, 2000）、機構は不明ではあるが、テロメラーゼプロモーターの活性の増加から
生じる。Cong YSら（1999、HMG 8、137-42）によると、プロモーター活性を司る
要素はATGの３３０ｂｐ上流からその遺伝子の第２エクソンにまで延びる領域内
に含まれ、したがって、この配列は本発明のウイルス構築体及びウイルスにおけ
る使用にさらに適するプロモーター配列である。
の転写因子が存在する。これらはＴｃｆ４、ＲＢＰＪκ及びＧｌｉ−１（これら
はｗｎｔ、ノッチ（notch）、及びヘッジホッグ（hedgehog）シグナル伝達経路
の終末点を表す（Dahmaneら、1997；Jarriaultら、1995；van de Weteringら、1
997））並びにＨＩＦ１アルファ（これは、Von Hippel Lindau腫瘍サプレッサー
遺伝子における突然変異によって安定化される（Maxwellら、1999））である。
ＡＰＣ又はβ−カテニンにおける突然変異は結腸癌における普遍的な欠陥である
（Korinekら、1997；Morinら、1997）；しかしながら、これらは他の腫瘍、例え
ば、メラノーマにおいてもより低い頻度で生じる（Rubinfeldら、1997）。この
ような突然変異は罹患細胞におけるＴｃｆ活性の増加につながる。ヘッジホッグ
経路は基底細胞癌におけるパッチ化及び平滑化タンパク質の突然変異によって活
性化される（Stoneら、1996；Xieら、1998）。ノッチ突然変異は幾つかの白血病
において生じる（Ellisenら、1991）。テロメラーゼ活性は癌の特徴の１つであ
り（Hanahan D.及びWeinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell. 100, 57-70
, 2000）、機構は不明ではあるが、テロメラーゼプロモーターの活性の増加から
生じる。Cong YSら（1999、HMG 8、137-42）によると、プロモーター活性を司る
要素はATGの３３０ｂｐ上流からその遺伝子の第２エクソンにまで延びる領域内
に含まれ、したがって、この配列は本発明のウイルス構築体及びウイルスにおけ
る使用にさらに適するプロモーター配列である。
【００１８】 今や、本発明者らはウイルスＤＮＡ構築体及びそれらによってコードされる、
好ましくは組換えウイルス構築体及びウイルスの形態の複製性ウイルスを設計及
び産生しており、これらは腫瘍における公知の原因癌遺伝子転写酵素（ｃａｕｓ
ａｌ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｔｉｏｎ）の欠陥を、ウイルス核
酸の複製に機構的に直接関与するタンパク質をコードする１つまたはそれ以上の
早期ウイルス遺伝子の転写の制御にこれらを用いることにより、合理的に標的と
する（このような遺伝子の例については、例えば、DePamphilis, ML, Concepts
in Eukaryotic DNA Replication pp 481-484 and 488-491, 1999 Cold Spring H
arbor Laboratory Press, New Yorkを参照のこと。これは参照することにより本
明細書に組み込まれる）。好ましくは、これらのウイルス遺伝子は、ポリメラー
ゼ、プリマーゼ、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、末端タンパク質及び核
酸結合性タンパク質遺伝子からなる群より選択される。これらの遺伝子のうちの
５つの好ましい酵素産生物は以下の Enzyme Commission分類に分類される：ポリ
メラーゼ（ＥＣ２．７．７．７）、プリマーゼ（ＥＣ２．７．７．６）、ヌクレ
アーゼ（ＥＣ３．１．１１−２５）、ヘリカーゼ（ＥＣ３．６．１．３）及びリ
ガーゼ（ＥＣ６．５．１．１−２）。これらの分類は、例えば、パルボウイルス
、例えばアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（これらはＮＳ１／Ｒｅｐタンパク質を
含む）において変化することがあり、これらは複製に必須のヌクレアーゼ及びヘ
リカーゼ活性を有する。
好ましくは組換えウイルス構築体及びウイルスの形態の複製性ウイルスを設計及
び産生しており、これらは腫瘍における公知の原因癌遺伝子転写酵素（ｃａｕｓ
ａｌ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｔｉｏｎ）の欠陥を、ウイルス核
酸の複製に機構的に直接関与するタンパク質をコードする１つまたはそれ以上の
早期ウイルス遺伝子の転写の制御にこれらを用いることにより、合理的に標的と
する（このような遺伝子の例については、例えば、DePamphilis, ML, Concepts
in Eukaryotic DNA Replication pp 481-484 and 488-491, 1999 Cold Spring H
arbor Laboratory Press, New Yorkを参照のこと。これは参照することにより本
明細書に組み込まれる）。好ましくは、これらのウイルス遺伝子は、ポリメラー
ゼ、プリマーゼ、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、末端タンパク質及び核
酸結合性タンパク質遺伝子からなる群より選択される。これらの遺伝子のうちの
５つの好ましい酵素産生物は以下の Enzyme Commission分類に分類される：ポリ
メラーゼ（ＥＣ２．７．７．７）、プリマーゼ（ＥＣ２．７．７．６）、ヌクレ
アーゼ（ＥＣ３．１．１１−２５）、ヘリカーゼ（ＥＣ３．６．１．３）及びリ
ガーゼ（ＥＣ６．５．１．１−２）。これらの分類は、例えば、パルボウイルス
、例えばアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（これらはＮＳ１／Ｒｅｐタンパク質を
含む）において変化することがあり、これらは複製に必須のヌクレアーゼ及びヘ
リカーゼ活性を有する。
【００１９】 本発明によって産生される好ましい構築体及びウイルスにおいては、これらの
遺伝は、特には、ウイルスＤＮＡポリメラーゼ、ウイルスＤＮＡ末端タンパク質
及び／又はウイルスＤＮＡ結合性タンパク質遺伝子である。好ましいウイルスは
、Ｅ１、Ｅ２及びＥ３ウイルス転写ユニットを有するもの、例えば、アデノウイ
ルスである。少なくともウイルスのＥ２転写ユニットが、標的腫瘍細胞内にレベ
ルが増加するかもしくは活性が増加した状態で存在し、又はその細胞内のみに存
在する要素を司るように変更されていることが特に好ましい。Rittnerら（J. Vi
rol (1997) p 3307-3311）は、主要後期読み取り枠Ｌ４との重複のため、キャッ
プ部位に近いＥ２プロモーターを操作することが不可能であることを教示してい
る。しかしながら、本発明者らは、この操作が実際には可能であって有利な結果
が伴うことを見出している。
遺伝は、特には、ウイルスＤＮＡポリメラーゼ、ウイルスＤＮＡ末端タンパク質
及び／又はウイルスＤＮＡ結合性タンパク質遺伝子である。好ましいウイルスは
、Ｅ１、Ｅ２及びＥ３ウイルス転写ユニットを有するもの、例えば、アデノウイ
ルスである。少なくともウイルスのＥ２転写ユニットが、標的腫瘍細胞内にレベ
ルが増加するかもしくは活性が増加した状態で存在し、又はその細胞内のみに存
在する要素を司るように変更されていることが特に好ましい。Rittnerら（J. Vi
rol (1997) p 3307-3311）は、主要後期読み取り枠Ｌ４との重複のため、キャッ
プ部位に近いＥ２プロモーターを操作することが不可能であることを教示してい
る。しかしながら、本発明者らは、この操作が実際には可能であって有利な結果
が伴うことを見出している。
【００２０】 したがって、ＲＮＡ移行能力（ｅｘｐｏｒｔ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ）又は組
換え遺伝子の挿入による毒性のような因子よりもむしろ核酸複製能力を制御する
ことにより、本発明者らが腫瘍細胞に対する細胞毒性効果の選択性を提供できる
ことが決定されている。
換え遺伝子の挿入による毒性のような因子よりもむしろ核酸複製能力を制御する
ことにより、本発明者らが腫瘍細胞に対する細胞毒性効果の選択性を提供できる
ことが決定されている。
【００２１】 最も重要かつ有利なことには、本発明者らは、野生型ウイルスタンパク質のみ
をコードし、その発現が腫瘍細胞内で優先的に、又は排他的に活性化される転写
因子によって特異的に調節されるウイルスを用いて腫瘍細胞を標的とすることを
可能にしている。好ましいウイルスは野生型タンパク質のフルセットをコードす
る。このようなウイルスは、ウイルスタンパク質の突然変異又は特定の組織起源
の細胞、例えば、前立腺のターゲッティングに頼っている従来技術のウイルス剤
よりも良好な結果を得るのに用いることができる。
をコードし、その発現が腫瘍細胞内で優先的に、又は排他的に活性化される転写
因子によって特異的に調節されるウイルスを用いて腫瘍細胞を標的とすることを
可能にしている。好ましいウイルスは野生型タンパク質のフルセットをコードす
る。このようなウイルスは、ウイルスタンパク質の突然変異又は特定の組織起源
の細胞、例えば、前立腺のターゲッティングに頼っている従来技術のウイルス剤
よりも良好な結果を得るのに用いることができる。
【００２２】 したがって、本発明の第１の側面においては、ヒト又は動物の腫瘍細胞型にお
いて複製が可能であり、かつその型の腫瘍細胞を死に至らしめるウイルスをコー
ドするウイルスＤＮＡ構築体であって、１種類またはそれ以上の選択された転写
因子結合部位を、早期ウイルス性タンパク質をコードする読み取り枠と共に、か
つその発現を促進するような作動的な位置に含むことを特徴とし、その読み取り
枠のタンパク質産生物がウイルス構築体の核酸複製に機構的に直接関与し、選択
された転写因子結合部位が、同じ型の正常ヒト又は動物細胞に対してヒト又は動
物腫瘍細胞においてレベル又は活性が増加している転写因子のためのものである
ウイルスＤＮＡ構築体が提供される。
いて複製が可能であり、かつその型の腫瘍細胞を死に至らしめるウイルスをコー
ドするウイルスＤＮＡ構築体であって、１種類またはそれ以上の選択された転写
因子結合部位を、早期ウイルス性タンパク質をコードする読み取り枠と共に、か
つその発現を促進するような作動的な位置に含むことを特徴とし、その読み取り
枠のタンパク質産生物がウイルス構築体の核酸複製に機構的に直接関与し、選択
された転写因子結合部位が、同じ型の正常ヒト又は動物細胞に対してヒト又は動
物腫瘍細胞においてレベル又は活性が増加している転写因子のためのものである
ウイルスＤＮＡ構築体が提供される。
【００２３】 好ましい本発明の構築体は野生型ウイルスの配列に相当する核酸配列を有し、
この野生型ウイルスの配列は１つまたはそれ以上の選択された転写因子結合部位
で置換されている１つまたはそれ以上の野生型転写因子結合部位を有することを
特徴とし、これらの部位が早期遺伝子の発現を制御するプロモーター領域におい
てその遺伝子の読み取り枠の発現を促進するように作動的に位置し、それらの遺
伝子のタンパク質産生物がウイルスの核酸複製に機構的に直接関与し、 選択された転写因子結合部位は、同じ型の正常ヒト又は動物細胞に対してヒト
又は動物腫瘍細胞においてレベル又は活性が増加している転写因子のためのもの
である。
この野生型ウイルスの配列は１つまたはそれ以上の選択された転写因子結合部位
で置換されている１つまたはそれ以上の野生型転写因子結合部位を有することを
特徴とし、これらの部位が早期遺伝子の発現を制御するプロモーター領域におい
てその遺伝子の読み取り枠の発現を促進するように作動的に位置し、それらの遺
伝子のタンパク質産生物がウイルスの核酸複製に機構的に直接関与し、 選択された転写因子結合部位は、同じ型の正常ヒト又は動物細胞に対してヒト
又は動物腫瘍細胞においてレベル又は活性が増加している転写因子のためのもの
である。
【００２４】 好ましくは、このウイルスＤＮＡ構築体は、前記早期遺伝子の発現を制御する
野生型転写因子部位を置換する部位が原因癌遺伝子突然変異によって活性又はレ
ベルが特異的に増加する転写因子のものであることを特徴とする。
野生型転写因子部位を置換する部位が原因癌遺伝子突然変異によって活性又はレ
ベルが特異的に増加する転写因子のものであることを特徴とする。
【００２５】 制御された読み取り枠又は遺伝子はポリメラーゼ、プリマーゼ、ヌクレアーゼ
、ヘリカーゼ及びリガーゼのうちの１つまたはそれ以上であり得るが、好ましく
は、それらはＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ末端タンパク質及び／又はＤＮＡ結合
タンパク質のうちの１つまたはそれ以上である。より好ましくは、構築体又はウ
イルスは、Ｅ１、Ｅ２及びＥ３領域を有し、かつ腫瘍特異的転写因子結合部位が
野生型Ｅ２転写因子結合部位を置換しているようなものである。
、ヘリカーゼ及びリガーゼのうちの１つまたはそれ以上であり得るが、好ましく
は、それらはＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ末端タンパク質及び／又はＤＮＡ結合
タンパク質のうちの１つまたはそれ以上である。より好ましくは、構築体又はウ
イルスは、Ｅ１、Ｅ２及びＥ３領域を有し、かつ腫瘍特異的転写因子結合部位が
野生型Ｅ２転写因子結合部位を置換しているようなものである。
【００２６】 好ましくは、ウイルスＤＮＡ構築体は、機能的ウイルスＲＮＡ移行能力をコー
ドすることを特徴とする。アデノウイルスについては、これはＥ１及びＥ４領域
、特にはＥ１Ｂ ５５Ｋ及びＥ４ ｏｒｆ６遺伝子においてコードされる。した
がって、好ましくは、エンコードされたウイルスは、腫瘍細胞におけるこれらの
遺伝子の発現に関して野生型のものである。最も好ましくは、Ｅ１Ｂ ５５Ｋ及
びＥ４ ｏｒｆ６読み取り枠は、対応する野生型ウイルス内に存在する場合、機
能的及び／又は無傷（ｉｎｔａｃｔ）である。
ドすることを特徴とする。アデノウイルスについては、これはＥ１及びＥ４領域
、特にはＥ１Ｂ ５５Ｋ及びＥ４ ｏｒｆ６遺伝子においてコードされる。した
がって、好ましくは、エンコードされたウイルスは、腫瘍細胞におけるこれらの
遺伝子の発現に関して野生型のものである。最も好ましくは、Ｅ１Ｂ ５５Ｋ及
びＥ４ ｏｒｆ６読み取り枠は、対応する野生型ウイルス内に存在する場合、機
能的及び／又は無傷（ｉｎｔａｃｔ）である。
【００２７】 腫瘍細胞に対して潜在的に毒性であるあらゆるウイルスを本発明のウイルス構
築体の産生において用いることができることを当業者は理解するであろう。特に
は、その例にはアデノウイルス、レンチウイルス、ポリオーマウイルス、ワクチ
ニアウイルス、ヘルペスウイルス及びパルボウイルスが含まれ得る。好ましくは
、ウイルスはアデノウイルスであり、より好ましくは、標的腫瘍細胞型、例えば
、結腸腫瘍型に対する高い特異性を有するアデノウイルスである。
築体の産生において用いることができることを当業者は理解するであろう。特に
は、その例にはアデノウイルス、レンチウイルス、ポリオーマウイルス、ワクチ
ニアウイルス、ヘルペスウイルス及びパルボウイルスが含まれ得る。好ましくは
、ウイルスはアデノウイルスであり、より好ましくは、標的腫瘍細胞型、例えば
、結腸腫瘍型に対する高い特異性を有するアデノウイルスである。
【００２８】 好ましい結腸腫瘍特異的アデノウイルスは、Ａｄ５又は上述の通りに改変され
た腸内アデノウイルスＡｄ４０及びＡｄ４１のうちの１種類またはそれ以上のＤ
ＮＡ配列に対応するウイルスＤＮＡ構築体によってコードされる。Ａｄ４０及び
Ａｄ４１（これらはＡＴＣＣから入手可能である）は結腸細胞について選択的で
あり、Ａｄ５との重要な相違の１つはさらなる線維タンパク質が存在することで
ある。この線維タンパク質は、Ａｄ５についてはコクサッキー・アデノ受容体（
coxsackie-adeno receptor）もしくはＣＡＲと呼ばれる細胞表面受容体に結合す
る。結腸細胞はＡｄ５が感染に適合する肺細胞よりもＣＡＲが少ない。Ａｄ４０
及びＡｄ４１は２種類の線維タンパク質を有し、それらが２種類の異なる受容体
を用いることができる可能性を伴う。ウイルス療法に対する予想される耐性形態
は受容体の喪失であり、これは明らかに感染を妨げる。腫瘍における遺伝的不安
定性はこれが幾らか合理的な頻度で生じることを意味する；１億個の細胞中に約
１個、１０8中１の突然変異率。２種類の受容体を欠失させなければならない場
合、この確率を掛け合わせる；すなわち、両者の喪失は１０16個の細胞中１個で
生じる。腫瘍は１０9ないし１０12個の細胞を含む。したがって、ウイルスが２
種類以上の受容体を用いる場合、耐性が発生することはほとんどありそうもない
。Ａｄ４０及び４１における線維タンパク質の一方はＣＡＲを用いるが、他方に
よって用いられる受容体は未だに不明である。
た腸内アデノウイルスＡｄ４０及びＡｄ４１のうちの１種類またはそれ以上のＤ
ＮＡ配列に対応するウイルスＤＮＡ構築体によってコードされる。Ａｄ４０及び
Ａｄ４１（これらはＡＴＣＣから入手可能である）は結腸細胞について選択的で
あり、Ａｄ５との重要な相違の１つはさらなる線維タンパク質が存在することで
ある。この線維タンパク質は、Ａｄ５についてはコクサッキー・アデノ受容体（
coxsackie-adeno receptor）もしくはＣＡＲと呼ばれる細胞表面受容体に結合す
る。結腸細胞はＡｄ５が感染に適合する肺細胞よりもＣＡＲが少ない。Ａｄ４０
及びＡｄ４１は２種類の線維タンパク質を有し、それらが２種類の異なる受容体
を用いることができる可能性を伴う。ウイルス療法に対する予想される耐性形態
は受容体の喪失であり、これは明らかに感染を妨げる。腫瘍における遺伝的不安
定性はこれが幾らか合理的な頻度で生じることを意味する；１億個の細胞中に約
１個、１０8中１の突然変異率。２種類の受容体を欠失させなければならない場
合、この確率を掛け合わせる；すなわち、両者の喪失は１０16個の細胞中１個で
生じる。腫瘍は１０9ないし１０12個の細胞を含む。したがって、ウイルスが２
種類以上の受容体を用いる場合、耐性が発生することはほとんどありそうもない
。Ａｄ４０及び４１における線維タンパク質の一方はＣＡＲを用いるが、他方に
よって用いられる受容体は未だに不明である。
【００２９】 有利なことに、本発明の構築体の、好ましくはそれらによってコードされるウ
イルスの形態での、肝臓転移の治療への使用は、肝臓内でのウイルスの良好な伝
播が効率的な複製によって補助されるのであれば、化学療法と比較して比較的非
毒性である。
イルスの形態での、肝臓転移の治療への使用は、肝臓内でのウイルスの良好な伝
播が効率的な複製によって補助されるのであれば、化学療法と比較して比較的非
毒性である。
【００３０】 好ましい本発明のウイルス構築体はアデノウイルス又はパルボウイルスゲノム
ＤＮＡ、より好ましくはアデノウイルスゲノムＤＮＡから誘導され、Ｅ２ウイル
ス転写ユニットによってコードされる必須ウイルス遺伝子の転写が腫瘍細胞にお
ける癌遺伝子突然変異の存在に依存するように突然変異を受ける。好ましくは、
これらの癌遺伝子突然変異を含む細胞のみがウイルスＥ２遺伝子の転写を活性化
することができる。Ｅ２ユニットはウイルスＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ末端タ
ンパク質及びＤＮＡ結合タンパク質をコードするため、このウイルスは腫瘍細胞
においてのみ複製することができる。Ｅ２早期プロモーター転写因子結合部位が
腫瘍細胞特異的転写因子結合部位によって置換されていることが好ましい。
ＤＮＡ、より好ましくはアデノウイルスゲノムＤＮＡから誘導され、Ｅ２ウイル
ス転写ユニットによってコードされる必須ウイルス遺伝子の転写が腫瘍細胞にお
ける癌遺伝子突然変異の存在に依存するように突然変異を受ける。好ましくは、
これらの癌遺伝子突然変異を含む細胞のみがウイルスＥ２遺伝子の転写を活性化
することができる。Ｅ２ユニットはウイルスＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ末端タ
ンパク質及びＤＮＡ結合タンパク質をコードするため、このウイルスは腫瘍細胞
においてのみ複製することができる。Ｅ２早期プロモーター転写因子結合部位が
腫瘍細胞特異的転写因子結合部位によって置換されていることが好ましい。
【００３１】 野生型部位の代わりに用いられる好ましい腫瘍特異的転写因子結合部位は、Ｔ
ｃｆ−４、ＨＩＦ１アルファ、ＲＢＰＪκ及びＧｌｉ−１部位として上述される
もの、並びに腫瘍特異的転写を付与するテロメラーゼプロモーターの断片である
。最も好ましい転写因子結合部位は、US 5,851,775においてVogelsteinらによっ
て記載されるようにＴｃｆ−４に結合し、かつヘテロダイマーβ−カテニン／Ｔ
ｃｆ−４転写因子を司るものである。そのようなものとして、この転写因子結合
部位は、ＡＰＣ又はβ−カテニンの突然変異によって生じるβ−カテニンのレベ
ルの増加に応答して遺伝子の転写を増加させる。テロメラーゼプロモーターはWu
KJ.ら（1999, Nat Genet 21, 220-4）及びCong YS.ら（1999, HumMol Genet 8,
137-42）によって記載されている。さらに好ましい結合部位は、Maxwell PH.ら
（1999, Nature 399, 271-5）によって記載されるように、ＨＩＦ１アルファの
ものである。ＨＩＦ１アルファ調節ウイルスを、低酸素症に対する正常な生理学
的応答であるために経路に突然変異がない腫瘍の低酸素領域を標的とするのに用
いることができ、又は同じウイルスを家族性ＶＨＬ癌症候群又は散発性腎細胞カ
ルチノーマ（これもＶＨＬ突然変異を有する）のいずれかにおいてＶＨＬ突然変
異を有する細胞を標的とするのに用いることができる。虚血において低酸素症を
標的とするのにＨＩＦプロモーターを用いるレトロウイルスがBoast K.ら（1999
Hum Gene Ther 10, 2197-208）によって既に記載されている。
ｃｆ−４、ＨＩＦ１アルファ、ＲＢＰＪκ及びＧｌｉ−１部位として上述される
もの、並びに腫瘍特異的転写を付与するテロメラーゼプロモーターの断片である
。最も好ましい転写因子結合部位は、US 5,851,775においてVogelsteinらによっ
て記載されるようにＴｃｆ−４に結合し、かつヘテロダイマーβ−カテニン／Ｔ
ｃｆ−４転写因子を司るものである。そのようなものとして、この転写因子結合
部位は、ＡＰＣ又はβ−カテニンの突然変異によって生じるβ−カテニンのレベ
ルの増加に応答して遺伝子の転写を増加させる。テロメラーゼプロモーターはWu
KJ.ら（1999, Nat Genet 21, 220-4）及びCong YS.ら（1999, HumMol Genet 8,
137-42）によって記載されている。さらに好ましい結合部位は、Maxwell PH.ら
（1999, Nature 399, 271-5）によって記載されるように、ＨＩＦ１アルファの
ものである。ＨＩＦ１アルファ調節ウイルスを、低酸素症に対する正常な生理学
的応答であるために経路に突然変異がない腫瘍の低酸素領域を標的とするのに用
いることができ、又は同じウイルスを家族性ＶＨＬ癌症候群又は散発性腎細胞カ
ルチノーマ（これもＶＨＬ突然変異を有する）のいずれかにおいてＶＨＬ突然変
異を有する細胞を標的とするのに用いることができる。虚血において低酸素症を
標的とするのにＨＩＦプロモーターを用いるレトロウイルスがBoast K.ら（1999
Hum Gene Ther 10, 2197-208）によって既に記載されている。
【００３２】 特には、本発明者らは今や、上述の早期遺伝子読み取り枠と作動上の関係（ｏ
ｐｅｒａｔｉｏｎａｌ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）にある上で言及されるＴｃ
ｆ転写因子結合部位を、特には野生型転写因子結合部位の代わりにＥ２プロモー
ターに含むウイルスＤＮＡ構築体、及びそれらによってコードされるウイルスを
提供し、これらが癌遺伝子ＡＰＣ及びβ−カテニン突然変異を含む腫瘍細胞に対
して選択的であることを示している。Ｔｃｆ−４及びそのヘテロダイマーは本明
細書でＴｃｆと呼ばれる部位に結合する。好ましいそのような置換部位は、例え
ば２ないし２０、より好ましくは２ないし６、最も好都合には２、３又は４つの
Ｔｃｆ部位を含む、単一もしくは複数のＴｃｆ結合配列である。
ｐｅｒａｔｉｏｎａｌ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）にある上で言及されるＴｃ
ｆ転写因子結合部位を、特には野生型転写因子結合部位の代わりにＥ２プロモー
ターに含むウイルスＤＮＡ構築体、及びそれらによってコードされるウイルスを
提供し、これらが癌遺伝子ＡＰＣ及びβ−カテニン突然変異を含む腫瘍細胞に対
して選択的であることを示している。Ｔｃｆ−４及びそのヘテロダイマーは本明
細書でＴｃｆと呼ばれる部位に結合する。好ましいそのような置換部位は、例え
ば２ないし２０、より好ましくは２ないし６、最も好都合には２、３又は４つの
Ｔｃｆ部位を含む、単一もしくは複数のＴｃｆ結合配列である。
【００３３】 特別なＴｃｆ部位はコンセンサス配列（A／T）（A／T）CAA（A／T）GGを有す
るもの（Roose, J., and Clevers, H. (1999 Biochim Biophys Acta 1424, M23-
37）を参照）であるが、より好ましくは本明細書で例に示される通りである。
るもの（Roose, J., and Clevers, H. (1999 Biochim Biophys Acta 1424, M23-
37）を参照）であるが、より好ましくは本明細書で例に示される通りである。
【００３４】 より好ましい本発明のウイルス構築体及びウイルスはＥ３ドメインを有するも
のであり、Ｅ３プロモーターのＮＦ１、ＮＦκＢ、ＡＰ１及び／又はＡＴＦ領域
内の１つまたはそれ以上の残基に突然変異を有し、より好ましくはＥ３プロモー
ターの活性によって生じるＥ２遺伝子の転写を減少させる突然変異を有すること
を特徴とする。本発明者らは、特には、沈黙突然変異を提供しており、これらは
あらゆるウイルス性タンパク質の推定タンパク質配列を変更せず、鍵となるウイ
ルス性タンパク質の活性を変更するようなものである。
のであり、Ｅ３プロモーターのＮＦ１、ＮＦκＢ、ＡＰ１及び／又はＡＴＦ領域
内の１つまたはそれ以上の残基に突然変異を有し、より好ましくはＥ３プロモー
ターの活性によって生じるＥ２遺伝子の転写を減少させる突然変異を有すること
を特徴とする。本発明者らは、特には、沈黙突然変異を提供しており、これらは
あらゆるウイルス性タンパク質の推定タンパク質配列を変更せず、鍵となるウイ
ルス性タンパク質の活性を変更するようなものである。
【００３５】 ＮＦκＢは再生肝細胞（regenerating liver cells）、すなわち、肝細胞（he
patocytes）において強力に誘導される（Brenner et al J. Clin. Invest. 101
p802-811）。腫瘍によって空けられた空間を充填する肝臓の再生は転移の治療の
成功に続いて生じるように思われる。加えて、正常肝細胞の分割の裏で生じる肝
臓癌を治療しようと願う場合、ＮＦκＢ部位の破壊が潜在的に有利である。
patocytes）において強力に誘導される（Brenner et al J. Clin. Invest. 101
p802-811）。腫瘍によって空けられた空間を充填する肝臓の再生は転移の治療の
成功に続いて生じるように思われる。加えて、正常肝細胞の分割の裏で生じる肝
臓癌を治療しようと願う場合、ＮＦκＢ部位の破壊が潜在的に有利である。
【００３６】 本発明の第１の側面の好ましい態様において、本発明者らは、コーディング配
列が重複していないＥ２早期プロモーターの短領域を複数のＴｃｆ結合部位、よ
り好ましくは３つもしくは４つのそのような部位、最も好ましくは４つの部位で
置換している。その結果生じる好ましいウイルス構築体の１つ及びコードされた
ウイルスを本明細書ではＡｄ−Ｔｃｆ３（３つのそのような部位を有する）と呼
び、これらのウイルスはＥ２遺伝子産生物を発現し、かつ肺腫瘍細胞よりも結腸
においてより良好に複製する（実施例を参照）。これは、記述される型の突然変
異が、ウイルスのライフサイクルの他の側面に対する都合の悪い効果なしに、Ｅ
２プロモーターの活性を望ましい方法で改変し得ることを示す。これは経験的に
は明らかなものではなく、それは、Ｅ２プロモーターをコードすることに加えて
、この領域がｐVIIIタンパク質ＲＮＡの５’−非翻訳領域においては転写されて
そこに保持され、Ｌ５後期ＲＮＡでは転写されるがスプライスで除外され、かつ
３３ｋタンパク質ＲＮＡの３’−非翻訳領域の一部を形成するためである。
列が重複していないＥ２早期プロモーターの短領域を複数のＴｃｆ結合部位、よ
り好ましくは３つもしくは４つのそのような部位、最も好ましくは４つの部位で
置換している。その結果生じる好ましいウイルス構築体の１つ及びコードされた
ウイルスを本明細書ではＡｄ−Ｔｃｆ３（３つのそのような部位を有する）と呼
び、これらのウイルスはＥ２遺伝子産生物を発現し、かつ肺腫瘍細胞よりも結腸
においてより良好に複製する（実施例を参照）。これは、記述される型の突然変
異が、ウイルスのライフサイクルの他の側面に対する都合の悪い効果なしに、Ｅ
２プロモーターの活性を望ましい方法で改変し得ることを示す。これは経験的に
は明らかなものではなく、それは、Ｅ２プロモーターをコードすることに加えて
、この領域がｐVIIIタンパク質ＲＮＡの５’−非翻訳領域においては転写されて
そこに保持され、Ｌ５後期ＲＮＡでは転写されるがスプライスで除外され、かつ
３３ｋタンパク質ＲＮＡの３’−非翻訳領域の一部を形成するためである。
【００３７】 Ａｄ−Ｔｃｆ３は肺腫瘍細胞よりも結腸においてより良好に複製するが、その
差は約１０倍だけである。Ａｄ−Ｔｃｆ３におけるＥ２突然変異をＥ１Ｂ ５５
Ｋ欠失と組み合わせた本発明のウイルスであるＬＧＣは、約１０００倍の結腸癌
細胞に対する選択性を示す。正常Ｅ２プロモーターを有する同一のウイルス（Ｌ
ＧＭ）は結腸細胞に対する特異性を示さないため、これはＥ２プロモーターの活
性をウイルスの複製のために制限できることを示す。Ｅ２プロモーターの活性を
滴定することによって結腸特異的ウイルスを作製できることを意味することから
、これは結腸ターゲッティング策のために重要な結果である、 ＬＧＣの選択性の有望な説明は、Ｅ１Ｂ ５５ｋタンパク質がＥ２ ＤＢＰ後
期ＲＮＡを含む後期ウイルスＲＮＡの核外移行に必要であり、かつＥ２プロモー
ターにおいて正常転写因子結合部位の代わりにＴｃｆ部位を挿入することによっ
てＥ２ ＲＮＡ産生物を増加させることにより、Ｅ１Ｂ ５５Ｋ不全ウイルスに
おけるＥ２ ＲＮＡ移行の欠陥を克服することができるというものである。
差は約１０倍だけである。Ａｄ−Ｔｃｆ３におけるＥ２突然変異をＥ１Ｂ ５５
Ｋ欠失と組み合わせた本発明のウイルスであるＬＧＣは、約１０００倍の結腸癌
細胞に対する選択性を示す。正常Ｅ２プロモーターを有する同一のウイルス（Ｌ
ＧＭ）は結腸細胞に対する特異性を示さないため、これはＥ２プロモーターの活
性をウイルスの複製のために制限できることを示す。Ｅ２プロモーターの活性を
滴定することによって結腸特異的ウイルスを作製できることを意味することから
、これは結腸ターゲッティング策のために重要な結果である、 ＬＧＣの選択性の有望な説明は、Ｅ１Ｂ ５５ｋタンパク質がＥ２ ＤＢＰ後
期ＲＮＡを含む後期ウイルスＲＮＡの核外移行に必要であり、かつＥ２プロモー
ターにおいて正常転写因子結合部位の代わりにＴｃｆ部位を挿入することによっ
てＥ２ ＲＮＡ産生物を増加させることにより、Ｅ１Ｂ ５５Ｋ不全ウイルスに
おけるＥ２ ＲＮＡ移行の欠陥を克服することができるというものである。
【００３８】 本発明のＡｄＴｃｆ３、及び類似の３×Ｔｃｆ誘導Ｅ２ウイルスの結腸腫瘍に
対する選択性を増加させるための方法の１つは、非結腸細胞におけるそのＥ２プ
ロモーター活性を減少させることである。これを行うための可能性のある方法の
１つは、Ｔｃｆ部位の数を変更することである。Ｔｃｆ部位の数を２つに減少さ
せることで非特異的膜透過性異常を減少させることができるが、非結腸細胞にお
いてはＴｃｆプロモーターがグルーチョ（groucho）（Fisher及びCaudy、1998）
及びアセチル化（Waltzer、1998）によって積極的に抑制されるため、おそらく
はその部位を増加させることでプロモーターのより厳密な調節がもたらされる。
これは、その部位が多ければ多いほどより多くのリプレッサーが非結腸細胞にお
いて結合するためである。
対する選択性を増加させるための方法の１つは、非結腸細胞におけるそのＥ２プ
ロモーター活性を減少させることである。これを行うための可能性のある方法の
１つは、Ｔｃｆ部位の数を変更することである。Ｔｃｆ部位の数を２つに減少さ
せることで非特異的膜透過性異常を減少させることができるが、非結腸細胞にお
いてはＴｃｆプロモーターがグルーチョ（groucho）（Fisher及びCaudy、1998）
及びアセチル化（Waltzer、1998）によって積極的に抑制されるため、おそらく
はその部位を増加させることでプロモーターのより厳密な調節がもたらされる。
これは、その部位が多ければ多いほどより多くのリプレッサーが非結腸細胞にお
いて結合するためである。
【００３９】 Ｅ１Ａは、通常、ＡＴＦ部位を介してＥ２プロモーターを活性化する。そのよ
うなターゲッティングがない状態においては、例えばｐ３００／ＣＢＰをキレー
ト化することにより、Ｅ１Ａはプロモーターを抑制する。Ｔｃｆ変異体Ｅ２プロ
モーターにおいてはこのＡＴＦ部位が欠失しているため、このウイルスによって
産生されるＥ１Ａは全ての細胞型において変異体Ｅ２プロモーターの一般的な膜
透過性異常を減少させるはずである。Ｅ３プロモーターはＥ２プロモーターと背
中合わせであり、それらの区別は定義されるが機能的には任意である。したがっ
て、Ｅ３プロモーターにおける転写因子結合部位を修飾又は欠失させることによ
り、変異体Ｅ２プロモーターの活性をさらに減少させることが可能である。Ｅ３
プロモーターはコーディング配列内にあるため、欠失させることはできない。そ
の代わりに、本発明者らは、公知ＮＦ１、ＮＦκＢ、ＡＰ１及びＡＴＦ部位（Hu
rst and Jones, 1987, Genes Dev 1, 1132-46、参考文献として本明細書中に援
用される）内の重要な残基を変更する１６までの沈黙置換をもたらしている。
うなターゲッティングがない状態においては、例えばｐ３００／ＣＢＰをキレー
ト化することにより、Ｅ１Ａはプロモーターを抑制する。Ｔｃｆ変異体Ｅ２プロ
モーターにおいてはこのＡＴＦ部位が欠失しているため、このウイルスによって
産生されるＥ１Ａは全ての細胞型において変異体Ｅ２プロモーターの一般的な膜
透過性異常を減少させるはずである。Ｅ３プロモーターはＥ２プロモーターと背
中合わせであり、それらの区別は定義されるが機能的には任意である。したがっ
て、Ｅ３プロモーターにおける転写因子結合部位を修飾又は欠失させることによ
り、変異体Ｅ２プロモーターの活性をさらに減少させることが可能である。Ｅ３
プロモーターはコーディング配列内にあるため、欠失させることはできない。そ
の代わりに、本発明者らは、公知ＮＦ１、ＮＦκＢ、ＡＰ１及びＡＴＦ部位（Hu
rst and Jones, 1987, Genes Dev 1, 1132-46、参考文献として本明細書中に援
用される）内の重要な残基を変更する１６までの沈黙置換をもたらしている。
【００４０】 本発明のさらなるウイルス構築体はアデノウイルスのＥ２後期プロモーターを
修飾することによって提供され得る。Ｅ２早期プロモーターはＤＮＡポリメラー
ゼ（ｐｏｌ）、ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）及びプレターミナル（pretermi
nal）タンパク質（ｐＴＰ）を制御する。Ｅ２後期プロモーターに突然変異を生
成させることにより、同様の効果、すなわち、少なくとも部分的には、Ｅ１Ｂ欠
失に対する同様の効果を持たせることが可能であり、これは、Ｅ１Ｂ欠失がＥ２
後期プロモーターから発現されるＤＢＰ ＲＮＡの移行を減少させるためである
。ＤＢＰはＤＮＡの複製に化学量論的に必要とされ、そのため、正常細胞におけ
るＤＢＰ産生の減少は望ましいものである。Ｅ２後期プロモーターは１００ｋタ
ンパク質コーディング配列内にあり、欠失させることはできない。その代わりに
、本発明者らは、公知転写因子結合部以内の重要な残基を変更する沈黙突然変異
でそれを不活性化できることを決定している。
修飾することによって提供され得る。Ｅ２早期プロモーターはＤＮＡポリメラー
ゼ（ｐｏｌ）、ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）及びプレターミナル（pretermi
nal）タンパク質（ｐＴＰ）を制御する。Ｅ２後期プロモーターに突然変異を生
成させることにより、同様の効果、すなわち、少なくとも部分的には、Ｅ１Ｂ欠
失に対する同様の効果を持たせることが可能であり、これは、Ｅ１Ｂ欠失がＥ２
後期プロモーターから発現されるＤＢＰ ＲＮＡの移行を減少させるためである
。ＤＢＰはＤＮＡの複製に化学量論的に必要とされ、そのため、正常細胞におけ
るＤＢＰ産生の減少は望ましいものである。Ｅ２後期プロモーターは１００ｋタ
ンパク質コーディング配列内にあり、欠失させることはできない。その代わりに
、本発明者らは、公知転写因子結合部以内の重要な残基を変更する沈黙突然変異
でそれを不活性化できることを決定している。
【００４１】 Ｅ２後期プロモーター内の転写因子結合部位はＤＮアーゼＩフットプリント法
によって同定された（本明細書の図４においてＩ−IVとマークされている；Godi
ng et al, 1987, NAR 15, 7761-7780）。最も重要なものはフットプリントIIに
存在するCCAATボックスである。このCCAATボックスの突然変異は、ＣＡＴアッセ
イにおいてＥ２後期プロモーターの活性を１００倍低下させる（Bhat et al, 19
87, EMBO J, 6, 2045-2052）。そのような突然変異の１つはマークされたCCAAT
ボックスの配列GAC CAA TCCをGAT CAG TCCに変更する（下記図４を参照）。これ
は、１００ｋタンパク質の配列を変更することなく、CCAATボックス結合因子の
結合を無効にするように設計されている。活性をさらに低下させるのに他のフッ
トプリントにおいてさらなる沈黙突然変異を用いることができる。
によって同定された（本明細書の図４においてＩ−IVとマークされている；Godi
ng et al, 1987, NAR 15, 7761-7780）。最も重要なものはフットプリントIIに
存在するCCAATボックスである。このCCAATボックスの突然変異は、ＣＡＴアッセ
イにおいてＥ２後期プロモーターの活性を１００倍低下させる（Bhat et al, 19
87, EMBO J, 6, 2045-2052）。そのような突然変異の１つはマークされたCCAAT
ボックスの配列GAC CAA TCCをGAT CAG TCCに変更する（下記図４を参照）。これ
は、１００ｋタンパク質の配列を変更することなく、CCAATボックス結合因子の
結合を無効にするように設計されている。活性をさらに低下させるのに他のフッ
トプリントにおいてさらなる沈黙突然変異を用いることができる。
【００４２】 可能性のある代わりの、又はさらなる突然変異はＥ１Ｂプロモーターに突然変
異を生成させることによってＥ１Ｂ転写の発現を調節することである。これは、
前立腺特異的プロモーターがＥ１Ｂ転写の調節に用いられているウイルスを用い
て、ウイルスの複製を減少させることが示されている（Yu, D. C., et al 1999
Cancer Research 59, 1498-504）。Ｅ１Ｂ ５５Ｋの発現を腫瘍特異的な方法で
調節するさらなる利点は正常組織に対する炎症性損傷の危険性が低下することで
ある（Ginsberg, H. S., et al 199 PNAS 96, 10409-11）。本発明者らは、この
提案を試験するため、Ｅ１ＢプロモーターＳｐ１部位を置換するＴｃｆ部位を有
するウイルスを産生している。
異を生成させることによってＥ１Ｂ転写の発現を調節することである。これは、
前立腺特異的プロモーターがＥ１Ｂ転写の調節に用いられているウイルスを用い
て、ウイルスの複製を減少させることが示されている（Yu, D. C., et al 1999
Cancer Research 59, 1498-504）。Ｅ１Ｂ ５５Ｋの発現を腫瘍特異的な方法で
調節するさらなる利点は正常組織に対する炎症性損傷の危険性が低下することで
ある（Ginsberg, H. S., et al 199 PNAS 96, 10409-11）。本発明者らは、この
提案を試験するため、Ｅ１ＢプロモーターＳｐ１部位を置換するＴｃｆ部位を有
するウイルスを産生している。
【００４３】 さらなる態様には以下の可能性のある修飾が含まれる。複製をさらに制限する
ため、Ｅ１Ａプロモーターにさらなる腫瘍特異的、例えばＴｃｆ、部位を挿入す
ることができる。短オリゴヌクレオチドを挿入することによる調節を達成するに
は、Ｅ１Ａプロモーター内の既存の調節配列を欠失させなければならない。これ
は、逆位末端反復の両者の同時突然変異及び他所での、例えばＥ４領域への、パ
ッケージ化シグナルの伝達を必要とする。例えばカリドン（Calydon）ウイルス
とは対照的に、本発明者らのウイルスの設計は、アデノウイルス遺伝子の完全な
相補性を保持するにもかかわらず予備のパッケージ化能力を利用することが可能
であることを意味し、これは条件的毒素、例えば、プロドラッグ活性化酵素ＨＳ
Ｖチミジンキナーゼ（ｔｋ）の発現に用いることができる。これは、例えば、Ｅ
３プロモーター（その活性は幾つのウイルスにおいて調節される）から発現させ
て腫瘍ターゲッティングのさらなるレベルを提供することができる。あるいは、
構成プロモーターから発現させて安全性の特徴として作用させることができる。
これは、そうすることでガンシクロビルがそのウイルスを殺すことができるため
である。Ｅ１Ｂ不全ウイルスにおける構成ｔｋの発現も、複製を犠牲にはするが
、腫瘍殺傷効果を高める（Wildner, O., et al 1999 Gene Therapy 6, 57-62）
。発現させる代わりのプロドラッグ活性化酵素はシトシンデアミナーゼ（Crysta
l, R. G., et al 1997 Hum Gene Ther 8, 985-1001）であり、これは５ＦＣを５
ＦＵに変換する。５ＦＵは目的とする治療標的である肝臓転移に対して活性であ
る数種類の薬物のうちの１つであるが、幾らかの患者においては胆汁分泌を生じ
るため、これには利点がある。
ため、Ｅ１Ａプロモーターにさらなる腫瘍特異的、例えばＴｃｆ、部位を挿入す
ることができる。短オリゴヌクレオチドを挿入することによる調節を達成するに
は、Ｅ１Ａプロモーター内の既存の調節配列を欠失させなければならない。これ
は、逆位末端反復の両者の同時突然変異及び他所での、例えばＥ４領域への、パ
ッケージ化シグナルの伝達を必要とする。例えばカリドン（Calydon）ウイルス
とは対照的に、本発明者らのウイルスの設計は、アデノウイルス遺伝子の完全な
相補性を保持するにもかかわらず予備のパッケージ化能力を利用することが可能
であることを意味し、これは条件的毒素、例えば、プロドラッグ活性化酵素ＨＳ
Ｖチミジンキナーゼ（ｔｋ）の発現に用いることができる。これは、例えば、Ｅ
３プロモーター（その活性は幾つのウイルスにおいて調節される）から発現させ
て腫瘍ターゲッティングのさらなるレベルを提供することができる。あるいは、
構成プロモーターから発現させて安全性の特徴として作用させることができる。
これは、そうすることでガンシクロビルがそのウイルスを殺すことができるため
である。Ｅ１Ｂ不全ウイルスにおける構成ｔｋの発現も、複製を犠牲にはするが
、腫瘍殺傷効果を高める（Wildner, O., et al 1999 Gene Therapy 6, 57-62）
。発現させる代わりのプロドラッグ活性化酵素はシトシンデアミナーゼ（Crysta
l, R. G., et al 1997 Hum Gene Ther 8, 985-1001）であり、これは５ＦＣを５
ＦＵに変換する。５ＦＵは目的とする治療標的である肝臓転移に対して活性であ
る数種類の薬物のうちの１つであるが、幾らかの患者においては胆汁分泌を生じ
るため、これには利点がある。
【００４４】 Ｅ１Ａのアミノ末端には、ｐ３００、一般的な転写因子として機能するヒスト
ンアセチラーゼに結合するＥ１Ａの領域が含まれる。Ｅ１Ａが遺伝子を活性化す
る方法の１つはｐ３００をプロモーターに導くことによるものである。これを行
うため、Ｅ１ＡはＡＴＦのような転写因子に結合する。したがって、Ｅ１ＡはＡ
ＴＦ部位を含むプロモーターを活性化する。本明細書におけるウイルスｖＭＢ１
３はＥ３プロモーター内にＡＴＦ部位を保持しており、これに関する利点を提供
する。プロモーターがＡＴＦ部位を有していない場合、Ｅ１Ａはｐ３００を結合
することによってそれを抑制することが問題である。これはｐ５３に関して生じ
ることである：Ｅ１ＡはＥ１Ａ内にｐ３００結合部位を必要とする方法でｐ５３
依存性転写を遮断する。Ｅ１ＡによるＴｃｆ抑制は幾つかの細胞系において起こ
り得ることであり、そのためＥ１Ａ ｐ３００結合部位の突然変異はそのような
治療に好ましいものであり得る。
ンアセチラーゼに結合するＥ１Ａの領域が含まれる。Ｅ１Ａが遺伝子を活性化す
る方法の１つはｐ３００をプロモーターに導くことによるものである。これを行
うため、Ｅ１ＡはＡＴＦのような転写因子に結合する。したがって、Ｅ１ＡはＡ
ＴＦ部位を含むプロモーターを活性化する。本明細書におけるウイルスｖＭＢ１
３はＥ３プロモーター内にＡＴＦ部位を保持しており、これに関する利点を提供
する。プロモーターがＡＴＦ部位を有していない場合、Ｅ１Ａはｐ３００を結合
することによってそれを抑制することが問題である。これはｐ５３に関して生じ
ることである：Ｅ１ＡはＥ１Ａ内にｐ３００結合部位を必要とする方法でｐ５３
依存性転写を遮断する。Ｅ１ＡによるＴｃｆ抑制は幾つかの細胞系において起こ
り得ることであり、そのためＥ１Ａ ｐ３００結合部位の突然変異はそのような
治療に好ましいものであり得る。
【００４５】 本発明者らはＨＣＴ１１６細胞においてｖＭＢ１３及びｖＭＢ１４の相違を見
出しており、これら２種類のウイルスの唯一の相違はＥ３プロモーターのＡＴＦ
部位に存在する。したがって、ｖＭＢ１４におけるＥ１Ａ ｐ３００結合部位の
突然変異は有利であり得る。あるいは、この相違はＡＴＦ部位の直接的な活性化
によるものである可能性がある。これは、Xu Lら（2000, Genes Dev 14, 585-59
5）が、機構は不明であるものの、ＡＴＦ／ＣＲＥＢ部位をｗｎｔシグナルによ
って活性化できることを報告しているためである。
出しており、これら２種類のウイルスの唯一の相違はＥ３プロモーターのＡＴＦ
部位に存在する。したがって、ｖＭＢ１４におけるＥ１Ａ ｐ３００結合部位の
突然変異は有利であり得る。あるいは、この相違はＡＴＦ部位の直接的な活性化
によるものである可能性がある。これは、Xu Lら（2000, Genes Dev 14, 585-59
5）が、機構は不明であるものの、ＡＴＦ／ＣＲＥＢ部位をｗｎｔシグナルによ
って活性化できることを報告しているためである。
【００４６】 正常細胞における複製を防止又は終止させる１つまたはそれ以上のレベルの調
節を備えるウイルスが産生されており、受容体レベルでの感染効率を改善するこ
とがさらに好ましく、かつ有利である。アデノウイルス用の正常細胞性受容体、
ＣＡＲは幾つかの結腸腫瘍細胞では発現が不十分である。幾つかの、例えば１５
ないし２５、より好ましくは約２０のリジン残基をアデノ線維タンパク質（天然
ＣＡＲリガンド）の末端に付加することでこのウイルスに硫酸ヘパリン糖タンパ
ク質を受容体として用いさせることができ、その結果、より広範囲の細胞の効率
的な感染が生じる。これは、Ｅ１Ｂ不全ウイルスの細胞変性効果及び異種移植片
治癒率を高めることが示されている（Shinoura, H., et al 1999 Cancer Res 59
, 3411-3416、参照することにより本明細書に組み込まれる）。
節を備えるウイルスが産生されており、受容体レベルでの感染効率を改善するこ
とがさらに好ましく、かつ有利である。アデノウイルス用の正常細胞性受容体、
ＣＡＲは幾つかの結腸腫瘍細胞では発現が不十分である。幾つかの、例えば１５
ないし２５、より好ましくは約２０のリジン残基をアデノ線維タンパク質（天然
ＣＡＲリガンド）の末端に付加することでこのウイルスに硫酸ヘパリン糖タンパ
ク質を受容体として用いさせることができ、その結果、より広範囲の細胞の効率
的な感染が生じる。これは、Ｅ１Ｂ不全ウイルスの細胞変性効果及び異種移植片
治癒率を高めることが示されている（Shinoura, H., et al 1999 Cancer Res 59
, 3411-3416、参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【００４７】 代わりの方策は、Ａｄ４０及び／又はＡｄ４１線維をコードするｃＤＮＡを上
述のように本発明の構築体に組み込むことである。ＥＭＢＬ及びGenbankのデー
タベースにはそのような配列が列挙されており、さらに、Kidd et al Virology
(1989) 172(1), 134-144；Pieniazek et al Nucleic Acids Res. (1989) Nov 25
; 17-20, 9474；Davison et al J. Mol. Biol (1993) 234(4) 1308-16；Kidd et
al Virology (1990) 179(1) pl39-150（これら全ては参照することにより本明
細書に組み込まれる）に記述されている。
述のように本発明の構築体に組み込むことである。ＥＭＢＬ及びGenbankのデー
タベースにはそのような配列が列挙されており、さらに、Kidd et al Virology
(1989) 172(1), 134-144；Pieniazek et al Nucleic Acids Res. (1989) Nov 25
; 17-20, 9474；Davison et al J. Mol. Biol (1993) 234(4) 1308-16；Kidd et
al Virology (1990) 179(1) pl39-150（これら全ては参照することにより本明
細書に組み込まれる）に記述されている。
【００４８】 本発明の第２の側面においては、治療、特には新生物、例えば悪性腫瘍、特に
は結腸直腸腫瘍、最も詳しくは結腸直腸転移の患者の治療において用いるための
、本発明のウイルスＤＮＡ構築体が、特にはそれらによってコードされるウイル
スの形態で提供される。最も好ましくは、この治療は結腸直腸腫瘍の転移である
肝臓腫瘍のためのものである。
は結腸直腸腫瘍、最も詳しくは結腸直腸転移の患者の治療において用いるための
、本発明のウイルスＤＮＡ構築体が、特にはそれらによってコードされるウイル
スの形態で提供される。最も好ましくは、この治療は結腸直腸腫瘍の転移である
肝臓腫瘍のためのものである。
【００４９】 第３の側面においては、新生物、例えば悪性腫瘍、特には結腸直腸腫瘍、最も
詳しくは結腸直腸転移の治療のための医薬の製造における、本発明のウイルスＤ
ＮＡ構築体の、特にはそれらによってコードされるウイルスの形態での使用が提
供される。最も好ましくは、この治療は結腸直腸腫瘍の転移である肝臓腫瘍のた
めのものである。
詳しくは結腸直腸転移の治療のための医薬の製造における、本発明のウイルスＤ
ＮＡ構築体の、特にはそれらによってコードされるウイルスの形態での使用が提
供される。最も好ましくは、この治療は結腸直腸腫瘍の転移である肝臓腫瘍のた
めのものである。
【００５０】 本発明の第４の側面においては、本発明のウイルスＤＮＡ構築体を、特にはそ
れらによってコードされるウイルスの形態で、生理学的に許容し得る担体と共に
含む組成物が提供される。このような担体は典型的には無菌で発熱物質を含まず
、したがって、この組成物は、ウイルス構築体成分又はそのコードされたウイル
スの存在を除いて、無菌で発熱物質を含まない。典型的には担体は、生理的に受
容可能な食塩水であろう。
れらによってコードされるウイルスの形態で、生理学的に許容し得る担体と共に
含む組成物が提供される。このような担体は典型的には無菌で発熱物質を含まず
、したがって、この組成物は、ウイルス構築体成分又はそのコードされたウイル
スの存在を除いて、無菌で発熱物質を含まない。典型的には担体は、生理的に受
容可能な食塩水であろう。
【００５１】 本発明の第５の側面においては、本発明のウイルスＤＮＡ構築体の、特にはそ
れらによってコードされるウイルスの形態での製造方法であって、野生型転写因
子結合部位、特には第１の側面について定義されるものを有するウイルスゲノム
ＤＮＡ、特にはアデノウイルスのものを形質転換し、そのタンパク質産生物がウ
イルス核酸の複製に直接機構的に関与する遺伝子の転写を、これらの部位が腫瘍
特異的転写因子結合部位によって作動的に置換されるように、特には、それらが
Ｔｃｆ転写因子結合部位によって置換されるように制御することを含む方法が提
供される。作動的置換には野生型部位の部分的な、又は完全な欠失が含まれ得る
。好ましくは、この形質転換は２つ以上、より好ましくは３つもしくは４つのＴ
ｃｆ−４転写因子結合部位を挿入するものである。より好ましくは、この形質転
換は、ウイルスゲノムのＥ３プロモーター領域におけるＦ１、ＮＦκＢ、ＡＰ１
及び／又はＡＴＦ結合部位の１つまたはそれ以上の残基にさらなる突然変異を導
入するものである。このような突然変異は、好ましくは、Ｅ３によるＥ２活性の
妨害を排除し、正常細胞及び非結腸細胞におけるＥ２プロモーター駆動遺伝子の
発現を減少させるものであるべきである。相反的に、これはＥ３の正常調節をＥ
２プロモーター近傍に結合したＴｃｆによる調節に好ましく置き換える。
れらによってコードされるウイルスの形態での製造方法であって、野生型転写因
子結合部位、特には第１の側面について定義されるものを有するウイルスゲノム
ＤＮＡ、特にはアデノウイルスのものを形質転換し、そのタンパク質産生物がウ
イルス核酸の複製に直接機構的に関与する遺伝子の転写を、これらの部位が腫瘍
特異的転写因子結合部位によって作動的に置換されるように、特には、それらが
Ｔｃｆ転写因子結合部位によって置換されるように制御することを含む方法が提
供される。作動的置換には野生型部位の部分的な、又は完全な欠失が含まれ得る
。好ましくは、この形質転換は２つ以上、より好ましくは３つもしくは４つのＴ
ｃｆ−４転写因子結合部位を挿入するものである。より好ましくは、この形質転
換は、ウイルスゲノムのＥ３プロモーター領域におけるＦ１、ＮＦκＢ、ＡＰ１
及び／又はＡＴＦ結合部位の１つまたはそれ以上の残基にさらなる突然変異を導
入するものである。このような突然変異は、好ましくは、Ｅ３によるＥ２活性の
妨害を排除し、正常細胞及び非結腸細胞におけるＥ２プロモーター駆動遺伝子の
発現を減少させるものであるべきである。相反的に、これはＥ３の正常調節をＥ
２プロモーター近傍に結合したＴｃｆによる調節に好ましく置き換える。
【００５２】 アデノウイルスを改変するための伝統的な方法は、相同組換えによるウイルス
ゲノムのイン・ビボ再構築、次いで複数回のプラーク精製を必要とする。この理
由は、伝統的なクローン化技術を用いる３６ｋｄアデノウイルスゲノムの操作の
困難性である。この問題を回避する、特にはＥ１置換ベクター用の、新たなアプ
ローチが開発されている。Transgene及びVogelstein群はウイルスを改変するの
に細胞におけるギャップ修復を用いる（Chartierら、1996；Heら、1998）。これ
は改変しようとする各領域に特異的である巨大ベクターの構築を必要とする。こ
れらのベクターはＥ１置換に利用可能であるため、これらのアプローチは単純な
アデノウイルス発現ベクターの構築に非常に魅力的である。Ketnerは、アデノウ
イルスゲノムをＹＡＣにおいてクローン化し、２工程遺伝子置換によって改変す
る酵母ベースのシステムを開発した（Ketnerら、1994）。このＹＡＣアプローチ
の利点は、これまで従来の組換えＤＮＡ技術を用いて操作されているウイルスＤ
ＮＡの非常に小さい断片のみが必要とされることである。都合の良いことに、改
変しようとする領域のいずれかの側の数百塩基対が提供され、一方の側には独特
の制限部位が存在するはずであるが、このプラスミドは非常に小さいため、これ
は問題にならない。Ketnerのアプローチの不利な点は、ＹＡＣ ＤＮＡの収率が
低いことである。
ゲノムのイン・ビボ再構築、次いで複数回のプラーク精製を必要とする。この理
由は、伝統的なクローン化技術を用いる３６ｋｄアデノウイルスゲノムの操作の
困難性である。この問題を回避する、特にはＥ１置換ベクター用の、新たなアプ
ローチが開発されている。Transgene及びVogelstein群はウイルスを改変するの
に細胞におけるギャップ修復を用いる（Chartierら、1996；Heら、1998）。これ
は改変しようとする各領域に特異的である巨大ベクターの構築を必要とする。こ
れらのベクターはＥ１置換に利用可能であるため、これらのアプローチは単純な
アデノウイルス発現ベクターの構築に非常に魅力的である。Ketnerは、アデノウ
イルスゲノムをＹＡＣにおいてクローン化し、２工程遺伝子置換によって改変す
る酵母ベースのシステムを開発した（Ketnerら、1994）。このＹＡＣアプローチ
の利点は、これまで従来の組換えＤＮＡ技術を用いて操作されているウイルスＤ
ＮＡの非常に小さい断片のみが必要とされることである。都合の良いことに、改
変しようとする領域のいずれかの側の数百塩基対が提供され、一方の側には独特
の制限部位が存在するはずであるが、このプラスミドは非常に小さいため、これ
は問題にならない。Ketnerのアプローチの不利な点は、ＹＡＣ ＤＮＡの収率が
低いことである。
【００５３】 本発明者らはこれらの細菌及び酵母アプローチを組み合わせている。具体的に
は、酵母における環状ＹＡＣ／ＢＡＣでのギャップ修復によってウイルスゲノム
をクローン化し、２工程遺伝子置換によってそれを改変した後、多量のウイルス
ゲノムＤＮＡを産生させるためにそれを細菌に移している。後者の工程はウイル
スに変換する前に改変ゲノムを直接配列決定することを可能にすることから有用
であり、多量のゲノムＤＮＡが利用可能であることからウイルス産生の効率が高
い。細菌におけるウイルスゲノムの再配置を回避するのにＢＡＣ起点が用いられ
ている。このアプローチにはより多くの工程があるが、純粋細菌又は酵母技術の
全ての利点を併せ持ち、不利な点は含まない。
は、酵母における環状ＹＡＣ／ＢＡＣでのギャップ修復によってウイルスゲノム
をクローン化し、２工程遺伝子置換によってそれを改変した後、多量のウイルス
ゲノムＤＮＡを産生させるためにそれを細菌に移している。後者の工程はウイル
スに変換する前に改変ゲノムを直接配列決定することを可能にすることから有用
であり、多量のゲノムＤＮＡが利用可能であることからウイルス産生の効率が高
い。細菌におけるウイルスゲノムの再配置を回避するのにＢＡＣ起点が用いられ
ている。このアプローチにはより多くの工程があるが、純粋細菌又は酵母技術の
全ての利点を併せ持ち、不利な点は含まない。
【００５４】 これをＥ１置換ウイルスの作製に用いることは可能であり、本発明者らは、酵
母切除工程における望ましい組換え体のシクロヘキシミド選択を可能にしてこの
作業を単純化するＹＡＣ／ＢＡＣを構築しているが、このアプローチの主な長所
はウイルスゲノム全体を通して意のままに突然変異を導入できることである。こ
のＹＡＣ／ＢＡＣのさらなる詳細は、本発明者らにより、Gagnebin et al (1999
) Gene Therapy 6, 1742-1750（これは、参考文献として本明細書中に援用され
る）に対する貢献として提供されている。複数の異なる部位での連続改変も、イ
ン・ビトロで巨大ＤＮＡ中間体を扱うことなしに、可能である。
母切除工程における望ましい組換え体のシクロヘキシミド選択を可能にしてこの
作業を単純化するＹＡＣ／ＢＡＣを構築しているが、このアプローチの主な長所
はウイルスゲノム全体を通して意のままに突然変異を導入できることである。こ
のＹＡＣ／ＢＡＣのさらなる詳細は、本発明者らにより、Gagnebin et al (1999
) Gene Therapy 6, 1742-1750（これは、参考文献として本明細書中に援用され
る）に対する貢献として提供されている。複数の異なる部位での連続改変も、イ
ン・ビトロで巨大ＤＮＡ中間体を扱うことなしに、可能である。
【００５５】 本発明の方法を用いて突然変異を生成させようとするアデノウイルス株は、好
ましくは、野生型アデノウイルスである。ＡＴＣＣからＶＲ５として入手可能で
あるアデノウイルス５（Ａｄ５）が都合良く用いられる。ウイルスゲノムは、好
ましくは、この方法によって改変される領域の他は完全に野生型であるが、腫瘍
特異的毒性異種遺伝子、例えばｐ５３、又はガンシクロビルによる細胞破壊を可
能にするチミジンキナーゼのようなプロドラッグ活性化酵素をコードする遺伝子
の送達に用いることができる。しかしながら、この方法はまた、改善された組織
親和性を有するアデノウイルス型（例えば、Ａｄ４０及びＡｄ４１）に由来する
ウイルスゲノムＤＮＡを用いて都合良く適用される。
ましくは、野生型アデノウイルスである。ＡＴＣＣからＶＲ５として入手可能で
あるアデノウイルス５（Ａｄ５）が都合良く用いられる。ウイルスゲノムは、好
ましくは、この方法によって改変される領域の他は完全に野生型であるが、腫瘍
特異的毒性異種遺伝子、例えばｐ５３、又はガンシクロビルによる細胞破壊を可
能にするチミジンキナーゼのようなプロドラッグ活性化酵素をコードする遺伝子
の送達に用いることができる。しかしながら、この方法はまた、改善された組織
親和性を有するアデノウイルス型（例えば、Ａｄ４０及びＡｄ４１）に由来する
ウイルスゲノムＤＮＡを用いて都合良く適用される。
【００５６】 本発明の第６の側面においては、新生物の患者の治療方法であって、本発明の
ウイルスＤＮＡ構築体を、特にはそれらによってコードされるウイルスの形態で
生じさせて新生物のものを含むかもしくはそれに限定される患者の組織に感染さ
せ、新生物細胞が殺されるように複製させる方法が提供される。
ウイルスＤＮＡ構築体を、特にはそれらによってコードされるウイルスの形態で
生じさせて新生物のものを含むかもしくはそれに限定される患者の組織に感染さ
せ、新生物細胞が殺されるように複製させる方法が提供される。
【００５７】 本発明者は、さらに、結腸ターゲッティング複製性アデノウイルスを事前投与
することによって現在の動脈内肝臓化学療法を改善することを試みている。ＤＮ
Ａ損傷及び代謝拮抗性化学療法は、動物モデルにおいて、腫瘍細胞を他の複製性
アデノウイルスに対して感受性にすることが知られている（Heiseら、1997）。
例えば、毒性及び安全性を決定するため、第１サイクルの間に本発明の組換えア
デノウイルスを単独で投与することができる。第２サイクル以降に、組換えアデ
ノウイルスを同時化学療法と共に投与することができる。好ましくは、安全性及
び効力を評価した後に第１サイクルの応答と比較するが、患者は彼もしくは彼女
自身の対照として働く。
することによって現在の動脈内肝臓化学療法を改善することを試みている。ＤＮ
Ａ損傷及び代謝拮抗性化学療法は、動物モデルにおいて、腫瘍細胞を他の複製性
アデノウイルスに対して感受性にすることが知られている（Heiseら、1997）。
例えば、毒性及び安全性を決定するため、第１サイクルの間に本発明の組換えア
デノウイルスを単独で投与することができる。第２サイクル以降に、組換えアデ
ノウイルスを同時化学療法と共に投与することができる。好ましくは、安全性及
び効力を評価した後に第１サイクルの応答と比較するが、患者は彼もしくは彼女
自身の対照として働く。
【００５８】 投与経路は患者の必要性に従って変化することがあり、US 5,698,443の第６欄
（これは参考文献として本明細書中に援用される）に記述されるもののような類
似のウイルスについて記述される経路のいずれによるものであってもよい。本発
明の複製性ウイルスに適する用量は、理論上は、非常に少ないものであり得る。
例えば、１０2ないし１０13、より好ましくは１０4ないし１０11のオーダーのも
のであり得、感染効率は一般には０．００１ないし１００の範囲である。
（これは参考文献として本明細書中に援用される）に記述されるもののような類
似のウイルスについて記述される経路のいずれによるものであってもよい。本発
明の複製性ウイルスに適する用量は、理論上は、非常に少ないものであり得る。
例えば、１０2ないし１０13、より好ましくは１０4ないし１０11のオーダーのも
のであり得、感染効率は一般には０．００１ないし１００の範囲である。
【００５９】 治療には、好ましくは、肝動脈カテーテル、例えば、port-a-cathを移植する
。この手順は十分確立されており、眼のメラノーマ及び結腸癌患者の局所肝臓化
学療法のために肝臓カテーテルが規則正しく配置される。基礎生検は術中に行う
ことができる。
。この手順は十分確立されており、眼のメラノーマ及び結腸癌患者の局所肝臓化
学療法のために肝臓カテーテルが規則正しく配置される。基礎生検は術中に行う
ことができる。
【００６０】 典型的な治療レジメは以下のものを含む： サイクル１：第１、２及び３日の、肝動脈カテーテルを介する、１００ｍｌ生
理食塩水に希釈したアデノウイルス構築体の投与。
理食塩水に希釈したアデノウイルス構築体の投与。
【００６１】 サイクル２（第２９日）：４週間毎に繰り返される、標準ポータブル輸液ポン
プ（例えば、Pharmacia又はMelody）による、１４日間の連続注入としてのＦＵ
ＤＲ ０．３ｍｇ／ｋｇ／ｄの同時投与を伴う第１、２、及び３日のアデノウイ
ルス構築体の投与。
プ（例えば、Pharmacia又はMelody）による、１４日間の連続注入としてのＦＵ
ＤＲ ０．３ｍｇ／ｋｇ／ｄの同時投与を伴う第１、２、及び３日のアデノウイ
ルス構築体の投与。
【００６２】 ウイルス剤（ｖｉｒｕｓ ａｇｅｎｔ）の毒性、したがって適切な用量は、３
名の患者の同齢集団におけるウイルス接種物の標準第Ｉ相用量増大によって決定
することができる。１名の患者においてグレードIII／IV毒性が生じる場合、現
在の用量レベルで合計６名の患者について登録を継続する。患者の≧５０％にお
けるグレードIII／IV毒性によって用量制限毒性（ＤＬＴ）を決定し、それを下
回る用量レベルが最大耐量（ＭＴＤ）とみなされ、第２相治験においてさらに調
べることができる。
名の患者の同齢集団におけるウイルス接種物の標準第Ｉ相用量増大によって決定
することができる。１名の患者においてグレードIII／IV毒性が生じる場合、現
在の用量レベルで合計６名の患者について登録を継続する。患者の≧５０％にお
けるグレードIII／IV毒性によって用量制限毒性（ＤＬＴ）を決定し、それを下
回る用量レベルが最大耐量（ＭＴＤ）とみなされ、第２相治験においてさらに調
べることができる。
【００６３】 規制認可が必要である場合にはＧＭＰグレードのウイルスが用いられることは
理解されるであろう。 治療用アデノウイルスの投与には、例えばサイトカインの放出に関連し得る、
炎症及び／又は他の有害免疫学的現象が伴い得ることを当業者は理解するであろ
う。本発明によるウイルスの幾つかも、特にＥ１Ｂの活性が弱毒化されていない
場合、これを刺激することがある。そのようなウイルスがこの副作用を欠くもの
の少なくとも幾つかを上回る有利な抗腫瘍活性を有し得ることがさらに理解され
るであろう。この現象においては、免疫抑制性、抗炎症性又は他の方法での抗サ
イトカイン薬物療法を、例えば、ウイルス投与の前、後又はその最中に施すこと
が適切である。そのような薬物療法の典型はステロイド、例えば、プレドニゾロ
ンもしくはデキサメタゾン、又は抗ＴＮＦ剤、例えば、抗ＴＮＦ抗体もしくは可
溶性ＴＮＦ受容体であり、適切な投与レジメは自己免疫治療において用いられる
ものに類似する。例えば、関節リューマチ（WO 93／07899を参照）又は多発性硬
化症（WO 93／10817）を治療するために投与されるステロイドの用量を参照のこ
と。これらの両者は、それらがＵＳ対応出願を有する限り、参照文献として本明
細書中に援用される。
理解されるであろう。 治療用アデノウイルスの投与には、例えばサイトカインの放出に関連し得る、
炎症及び／又は他の有害免疫学的現象が伴い得ることを当業者は理解するであろ
う。本発明によるウイルスの幾つかも、特にＥ１Ｂの活性が弱毒化されていない
場合、これを刺激することがある。そのようなウイルスがこの副作用を欠くもの
の少なくとも幾つかを上回る有利な抗腫瘍活性を有し得ることがさらに理解され
るであろう。この現象においては、免疫抑制性、抗炎症性又は他の方法での抗サ
イトカイン薬物療法を、例えば、ウイルス投与の前、後又はその最中に施すこと
が適切である。そのような薬物療法の典型はステロイド、例えば、プレドニゾロ
ンもしくはデキサメタゾン、又は抗ＴＮＦ剤、例えば、抗ＴＮＦ抗体もしくは可
溶性ＴＮＦ受容体であり、適切な投与レジメは自己免疫治療において用いられる
ものに類似する。例えば、関節リューマチ（WO 93／07899を参照）又は多発性硬
化症（WO 93／10817）を治療するために投与されるステロイドの用量を参照のこ
と。これらの両者は、それらがＵＳ対応出願を有する限り、参照文献として本明
細書中に援用される。
【００６４】 以下の非限定性の配列、図面及び実施例を参照することにより、本発明を説明
のみの目的で記述する。当業者は、これらを考慮することで、請求の範囲の範囲
内にあるさらなる態様がわかるであろう。 配列表 配列番号１は、野生型Ｅ２プロモーターの代わりに４×Ｔｃｆが挿入された、
本発明に従って図２に示されるように突然変異が生成されたＥ２及びＥ３転写部
位を有するＡｄ５のＤＮＡ配列である。
のみの目的で記述する。当業者は、これらを考慮することで、請求の範囲の範囲
内にあるさらなる態様がわかるであろう。 配列表 配列番号１は、野生型Ｅ２プロモーターの代わりに４×Ｔｃｆが挿入された、
本発明に従って図２に示されるように突然変異が生成されたＥ２及びＥ３転写部
位を有するＡｄ５のＤＮＡ配列である。
【００６５】 配列番号２は、野生型Ｅ２プロモーターに代わるＴｃｆの挿入による影響を受
けていない、配列番号１にコードされる３３ｋタンパク質の部分アミノ酸配列で
ある。
けていない、配列番号１にコードされる３３ｋタンパク質の部分アミノ酸配列で
ある。
【００６６】 配列番号３は、野生型プロモーターに代わるＴｃｆの挿入による影響を受けて
いない、配列番号１にコードされるｐVIIIタンパク質の部分アミノ酸配列である
。
いない、配列番号１にコードされるｐVIIIタンパク質の部分アミノ酸配列である
。
【００６７】 配列番号４は、野生型アデノウイルスＶＲ５のＥ２／Ｅ３領域におけるもので
ある。 配列番号５は、図４に示されるように本発明の好ましいウイルスにおいて変更
されたＥ２後期プロモーターのＤＮＡ配列である。
ある。 配列番号５は、図４に示されるように本発明の好ましいウイルスにおいて変更
されたＥ２後期プロモーターのＤＮＡ配列である。
【００６８】 配列番号６は、後期プロモーターにおける突然変異の影響を受けていない配列
番号５にコードされる１００ｋタンパク質の部分アミノ酸配列である。 配列番号７は、図２０に示されるように本発明の好ましいウイルスにおいて突
然変異を受けているＥ１ＢプロモーターのＤＮＡ配列である。
番号５にコードされる１００ｋタンパク質の部分アミノ酸配列である。 配列番号７は、図２０に示されるように本発明の好ましいウイルスにおいて突
然変異を受けているＥ１ＢプロモーターのＤＮＡ配列である。
【００６９】 配列番号８は、本明細書で例示されるＴｃｆ部位の代わりに用いることができ
るテロメラーゼプロモーター部位の一部のものである。 配列番号９ないし２５は、本明細書の実施例において記載されるプライマーＧ
６１ないしＧ１０１のものである。
るテロメラーゼプロモーター部位の一部のものである。 配列番号９ないし２５は、本明細書の実施例において記載されるプライマーＧ
６１ないしＧ１０１のものである。
【００７０】 配列番号２６は、単一のＴｃｆ結合部位のものである。 配列番号２７は、本明細書に記載される好ましいウイルスにおいて見出される
、２Ｔｃｆ部位及び隣接アデノウイルスＤＮＡのものである。
、２Ｔｃｆ部位及び隣接アデノウイルスＤＮＡのものである。
【００７１】 配列番号２８は、隣接ウイルスＤＮＡ及び不活性Ｔｃｆ部位を伴う変異体３Ｔ
ｃｆ部位配列のものである。 配列番号２９は、本発明の好ましいウイルスにおいて用いられる、隣接ウイル
スＤＮＡを伴う変異体４Ｔｃｆ部位配列のものである。
ｃｆ部位配列のものである。 配列番号２９は、本発明の好ましいウイルスにおいて用いられる、隣接ウイル
スＤＮＡを伴う変異体４Ｔｃｆ部位配列のものである。
【００７２】 配列番号３０及び３１は、本発明の好ましいウイルスにおいてＥＩＢプロモー
ターに突然変異を生成させるための正及び逆プライマーである。 配列番号３２、３３及び３４は、それぞれ、TaqmanプロトコルにおけるＥ２の
発現の定量的ＰＣＲ測定のための正及び逆プライマー並びにプローブである。
ターに突然変異を生成させるための正及び逆プライマーである。 配列番号３２、３３及び３４は、それぞれ、TaqmanプロトコルにおけるＥ２の
発現の定量的ＰＣＲ測定のための正及び逆プライマー並びにプローブである。
【００７３】 配列番号３５、３６及び３７は、それぞれ、TaqmanプロトコルにおけるＥ３の
発現の定量的ＰＣＲ測定のための正及び逆プライマー並びにプローブである。 配列番号３８、３９及び４０は、それぞれ、TaqmanプロトコルにおけるＥＩＢ
の発現の定量的ＰＣＲ測定のための正及び逆プライマー並びにプローブである。
発現の定量的ＰＣＲ測定のための正及び逆プライマー並びにプローブである。 配列番号３８、３９及び４０は、それぞれ、TaqmanプロトコルにおけるＥＩＢ
の発現の定量的ＰＣＲ測定のための正及び逆プライマー並びにプローブである。
【００７４】 配列番号４１、４２及び４３は、それぞれ、TaqmanプロトコルにおけるＥ４の
発現の定量的ＰＣＲ測定のための正及び逆プライマー並びにプローブである。 配列番号４４及び４５は、線維発現測定のための正及び逆プライマーである。
発現の定量的ＰＣＲ測定のための正及び逆プライマー並びにプローブである。 配列番号４４及び４５は、線維発現測定のための正及び逆プライマーである。
【００７５】 配列は、プライマー及び最終構築ウイルスの配列並びにそれらの関心のある特
徴を示す以下の実施例及び図面にも提示されている。 実施例 本発明者らは、ＧＦＰに融合したＥ１Ｂ ５５Ｋのアミノ末端を用いて（比較
ウイルスＬＧＭ）、３つのＴｃｆ部位によるＥ２プロモーターの置換を用いて（
ウイルスＡｄ−Ｔｃｆ３）、及びこの２つを組み合わせて（ウイルスＬＧＣ）、
ウイルスを構築している。また、本発明者らは、４つのＴｃｆ部位によるＥ２プ
ロモーターの置換のみを用いて（ウイルスｖＭＢ１２）、４つのＴｃｆ部位によ
るＥ２プロモーターの置換をＥ３プロモーター、特にはＮＦ１、ＮＦκＢ、ＡＰ
１、及びＡＴＦ部位における沈黙突然変異を組み合わせて（ウイルスｖＭＢ１４
）、及び４つのＴｃｆ部位によるＥ２プロモーターの置換をＥ３プロモーター、
特にはＮＦ１、ＮＦκＢ、ＡＰ１ではあるがＡＴＦ部位ではない沈黙突然変異を
組み合わせて（ウイルスｖＭＢ１３）、ウイルスを構築している。また、本発明
者らは、Ｅ１ＢプロモーターのＳｐ１部位を野生型アデノウイルス骨格（ウイル
スｖＭＢ２３）、ｖＭＢ１２骨格（ウイルスｖＭＢ２７）、ｖＭＢ１３骨格（ウ
イルスｖＭＢ３１）及びｖＭＢ１４骨格（ウイルスｖＭＢ１９）の４つのＴｃｆ
部位で置換してウイルスを構築している。 鍵となる構築体の簡単な説明： Ａｄ Ｔｃｆ３ ＹＡＣ／ＢＡＣ（ｐＭＢ３６）の構築に用いられるギャップ
修復及び２工程遺伝子置換は図５に示されている（示される全ての工程は酵母細
胞内部で行われる）。ｐＮＫＢＡＣ３９及びｐ６８０のマップは図６及び７に示
されている。材料の入手可能性：ｐＵＣ１９（Clontech）、Bluescript（Strata
gene）、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Clontech）、ｐｈＧＦＰ−Ｓ６５Ｔ（Clontech）及
びｐＲＳ４０６（Stratagene）。
徴を示す以下の実施例及び図面にも提示されている。 実施例 本発明者らは、ＧＦＰに融合したＥ１Ｂ ５５Ｋのアミノ末端を用いて（比較
ウイルスＬＧＭ）、３つのＴｃｆ部位によるＥ２プロモーターの置換を用いて（
ウイルスＡｄ−Ｔｃｆ３）、及びこの２つを組み合わせて（ウイルスＬＧＣ）、
ウイルスを構築している。また、本発明者らは、４つのＴｃｆ部位によるＥ２プ
ロモーターの置換のみを用いて（ウイルスｖＭＢ１２）、４つのＴｃｆ部位によ
るＥ２プロモーターの置換をＥ３プロモーター、特にはＮＦ１、ＮＦκＢ、ＡＰ
１、及びＡＴＦ部位における沈黙突然変異を組み合わせて（ウイルスｖＭＢ１４
）、及び４つのＴｃｆ部位によるＥ２プロモーターの置換をＥ３プロモーター、
特にはＮＦ１、ＮＦκＢ、ＡＰ１ではあるがＡＴＦ部位ではない沈黙突然変異を
組み合わせて（ウイルスｖＭＢ１３）、ウイルスを構築している。また、本発明
者らは、Ｅ１ＢプロモーターのＳｐ１部位を野生型アデノウイルス骨格（ウイル
スｖＭＢ２３）、ｖＭＢ１２骨格（ウイルスｖＭＢ２７）、ｖＭＢ１３骨格（ウ
イルスｖＭＢ３１）及びｖＭＢ１４骨格（ウイルスｖＭＢ１９）の４つのＴｃｆ
部位で置換してウイルスを構築している。 鍵となる構築体の簡単な説明： Ａｄ Ｔｃｆ３ ＹＡＣ／ＢＡＣ（ｐＭＢ３６）の構築に用いられるギャップ
修復及び２工程遺伝子置換は図５に示されている（示される全ての工程は酵母細
胞内部で行われる）。ｐＮＫＢＡＣ３９及びｐ６８０のマップは図６及び７に示
されている。材料の入手可能性：ｐＵＣ１９（Clontech）、Bluescript（Strata
gene）、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Clontech）、ｐｈＧＦＰ−Ｓ６５Ｔ（Clontech）及
びｐＲＳ４０６（Stratagene）。
【００７６】 ＹＡＣ／ＢＡＣ（ｐＭＢ１９）：アデノウイルスゲノムを、巨大プラスミドに
おいて、細菌性人工染色体（Ｆ’）複製起点、酵母セントロメア及び複製起点、
並びに酵母及び細菌の選択可能なマーカー（ＨＩＳ３、クロラムフェニコール耐
性遺伝子）で改変した。
おいて、細菌性人工染色体（Ｆ’）複製起点、酵母セントロメア及び複製起点、
並びに酵母及び細菌の選択可能なマーカー（ＨＩＳ３、クロラムフェニコール耐
性遺伝子）で改変した。
【００７７】 Ａｄ５ ＹＡＣ／ＢＡＣ（ｐＭＢ２０）：ＡＴＣＣから入手したアデノウイル
ス５型（ＶＲ５）からゲノムＤＮＡを調製した。小さい末端断片をＰＣＲで増幅
し、ＹＡＣ／ＢＡＣにクローン化した。このベクターを２つの末端Ａｄ５断片間
の部位で直線化し、完全長Ａｄ５ゲノムＤＮＡと共に酵母に形質移入した。相同
組換え（ギャップ修復）によってプラスミドを再環化し、ＹＡＣ／ＢＡＣにクロ
ーン化された完全長Ａｄ５ゲノムＤＮＡを得た。
ス５型（ＶＲ５）からゲノムＤＮＡを調製した。小さい末端断片をＰＣＲで増幅
し、ＹＡＣ／ＢＡＣにクローン化した。このベクターを２つの末端Ａｄ５断片間
の部位で直線化し、完全長Ａｄ５ゲノムＤＮＡと共に酵母に形質移入した。相同
組換え（ギャップ修復）によってプラスミドを再環化し、ＹＡＣ／ＢＡＣにクロ
ーン化された完全長Ａｄ５ゲノムＤＮＡを得た。
【００７８】 Ｅ１Ｂ：：ＧＦＰ融合（ｐＭＢ２５）：Ｅ１Ｂ １９ｋと重複するＥ１Ｂ ５
５ｋの一部を含むＡｄ５断片をＰＣＲによって増幅し、ＥＧＦＰの５’−末端に
融合させた。次に、酵母における選択及び対抗選択のためのＬＥＵ２及びＣＹＨ
２を含むベクターにおいて、これをより大きなＡｄ５断片に埋め込むことでＥ１
Ｂ：：ＧＦＰ融合の両側にＡｄ５配列を隣接させた。
５ｋの一部を含むＡｄ５断片をＰＣＲによって増幅し、ＥＧＦＰの５’−末端に
融合させた。次に、酵母における選択及び対抗選択のためのＬＥＵ２及びＣＹＨ
２を含むベクターにおいて、これをより大きなＡｄ５断片に埋め込むことでＥ１
Ｂ：：ＧＦＰ融合の両側にＡｄ５配列を隣接させた。
【００７９】 ＬＧＭ ＹＡＣ／ＢＡＣ（ｐＭＢ２６）：ｐＭＢ２５内のＥ１Ｂ：：ＧＦＰ融
合を２工程遺伝子置換によってＡｄ５ ＹＡＣ／ＢＡＣに挿入した。生じたプラ
スミドを大腸菌に移入して配列決定及び哺乳動物細胞への形質移入に十分なＤＮ
Ａを産生させた。大腸菌からのプラスミドをＰａｃＩで切断してＡｄ５インサー
トを放出させた後、２９３細胞に形質移入してウイルスを作製した。
合を２工程遺伝子置換によってＡｄ５ ＹＡＣ／ＢＡＣに挿入した。生じたプラ
スミドを大腸菌に移入して配列決定及び哺乳動物細胞への形質移入に十分なＤＮ
Ａを産生させた。大腸菌からのプラスミドをＰａｃＩで切断してＡｄ５インサー
トを放出させた後、２９３細胞に形質移入してウイルスを作製した。
【００８０】 Ｅ２−Ｔｃｆｘ３／４突然変異（ｐＭＢ３３／６９）：Ｅ２領域を含むＡｄ５
断片を、酵母における選択及び対抗選択のためのＵＲＡ３を含むベクターにクロ
ーン化した。Ｅ２プロモーターを逆ＰＣＲによって置換した。ｐＭＢ３３は３つ
のＴｃｆ部位を含む；ｐＭＢ６９は４つのＴｃｆ部位を含む。
断片を、酵母における選択及び対抗選択のためのＵＲＡ３を含むベクターにクロ
ーン化した。Ｅ２プロモーターを逆ＰＣＲによって置換した。ｐＭＢ３３は３つ
のＴｃｆ部位を含む；ｐＭＢ６９は４つのＴｃｆ部位を含む。
【００８１】 Ａｄ−Ｔｃｆｘ３ ＹＡＣ／ＢＡＣ（ｐＭＢ３６）：ｐＭＢ３３内のＥ２−Ｔ
ｃｆｘ３置換配列を２工程遺伝子置換によってＡｄ５ ＹＡＣ／ＢＡＣに挿入し
た。次に、このＹＡＣ／ＢＡＣを大腸菌及び２９３細胞に移入してウイルスを作
製した。生じたウイルスをＡｄ−Ｔｃｆ３と呼ぶ。
ｃｆｘ３置換配列を２工程遺伝子置換によってＡｄ５ ＹＡＣ／ＢＡＣに挿入し
た。次に、このＹＡＣ／ＢＡＣを大腸菌及び２９３細胞に移入してウイルスを作
製した。生じたウイルスをＡｄ−Ｔｃｆ３と呼ぶ。
【００８２】 Ａｄ−Ｔｃｆｘ４ ＹＡＣ／ＢＡＣ（ｐＭＢ７４）：ｐＭＢ６９内のＥ２−Ｔ
ｃｆｘ４置換配列を２工程遺伝子置換によってＡｄ５ ＹＡＣ／ＢＡＣに挿入し
た。次に、このＹＡＣ／ＢＡＣを大腸菌及び２９３細胞に移入してウイルスを作
製した。生じたウイルスをｖＭＢ１２と呼ぶ。
ｃｆｘ４置換配列を２工程遺伝子置換によってＡｄ５ ＹＡＣ／ＢＡＣに挿入し
た。次に、このＹＡＣ／ＢＡＣを大腸菌及び２９３細胞に移入してウイルスを作
製した。生じたウイルスをｖＭＢ１２と呼ぶ。
【００８３】 ＬＧＣ ＹＡＣ／ＢＡＣ（ｐＭＢ３７）：ｐＭＢ３３内のＥ２−Ｔｃｆｘ３変
異体を２工程遺伝子置換によってＬＧＭ ＹＡＣ／ＢＡＣに挿入した。次に、こ
のＹＡＣ／ＢＡＣを大腸菌及び２９３細胞に移入してウイルスを作製した。
異体を２工程遺伝子置換によってＬＧＭ ＹＡＣ／ＢＡＣに挿入した。次に、こ
のＹＡＣ／ＢＡＣを大腸菌及び２９３細胞に移入してウイルスを作製した。
【００８４】 Ｅ２−Ｔｃｆｘ４／Ｅ３突然変異（ｐＭＢ６６）：３回の連続する逆ＰＣＲに
おいてＥ２及びＥ３突然変異を導入した。Ｅ２の変化はｐＭＢ３３と同様ではあ
るが４つのＴｃｆ部位を用いて作製した。２工程遺伝子置換を可能にするため、
幾つかの追加Ａｄ５配列をＥ３プロモーターの３’に付加した。
おいてＥ２及びＥ３突然変異を導入した。Ｅ２の変化はｐＭＢ３３と同様ではあ
るが４つのＴｃｆ部位を用いて作製した。２工程遺伝子置換を可能にするため、
幾つかの追加Ａｄ５配列をＥ３プロモーターの３’に付加した。
【００８５】 Ａｄ−Ｔｃｆｘ４／ｍｕｔＥ３ ＹＡＣ／ＢＡＣ（ｐＭＢ７５）：ｐＭＢ６６
内のＥ３突然変異及びＥ２−Ｔｃｆｘ４置換を２工程遺伝子置換によってＡｄ５ ＹＡＣ／ＢＡＣに挿入した。次に、このＹＡＣ／ＢＡＣを大腸菌及び２９３細
胞に移入してウイルスを作製した。生じたウイルスをｖＭＢ１４と呼ぶ。
内のＥ３突然変異及びＥ２−Ｔｃｆｘ４置換を２工程遺伝子置換によってＡｄ５ ＹＡＣ／ＢＡＣに挿入した。次に、このＹＡＣ／ＢＡＣを大腸菌及び２９３細
胞に移入してウイルスを作製した。生じたウイルスをｖＭＢ１４と呼ぶ。
【００８６】 Ａｄ−Ｔｃｆｘ４／ｍｕｔＥ３＋ＡＴＦ ＹＡＣ／ＢＡＣ（ｐＭＢ７３）：ｐ
ＭＢ６６内のＡＴＦ突然変異を除くＥ３突然変異及びＥ２−Ｔｃｆｘ４置換を２
工程遺伝子置換によってＡｄ５ ＹＡＣ／ＢＡＣに挿入した。次に、このＹＡＣ
／ＢＡＣを大腸菌及び２９３細胞に移入してウイルスを作製した。生じたウイル
スをｖＭＢ１３と呼ぶ。
ＭＢ６６内のＡＴＦ突然変異を除くＥ３突然変異及びＥ２−Ｔｃｆｘ４置換を２
工程遺伝子置換によってＡｄ５ ＹＡＣ／ＢＡＣに挿入した。次に、このＹＡＣ
／ＢＡＣを大腸菌及び２９３細胞に移入してウイルスを作製した。生じたウイル
スをｖＭＢ１３と呼ぶ。
【００８７】 注：ｐＭＢ７３及び７５の両者は２工程遺伝子置換によってＡｄ５ ＹＡＣ／
ＢＡＣにおいてｐＭＢ６６を用いて作製した。組み込み部位近傍の突然変異は２
工程遺伝子置換によっては常に移入されることはない。ＡＴＦ部位は組み込み部
位に最も近いため、ｐＭＢ７３はＡＴＦ部位の突然変異を欠いている。 詳細な手順： ｐＭＢ２０：Ａｄ５ゲノムＤＮＡをＳａｌＩで切断したｐＭＢ１９にギャップ
修復で組み込んだ。ｐＭＢ１９は、酵母複製起点（ｐＨ４ＡＲＳ由来、Bouton及
びSmith、1986）を既に末端Ａｄ５断片を含むベクター（ｐＭＢ１０）のＳａｃ
Ｉ部位に挿入することによって作製した。出発ベクター（ｐＮＫＢＡＣ３９、La
rionovら、1996）はＡＲＳを必要としないことが期待されたが、この仮定は間違
っていることが立証された。最初にＰＣＲによってＡｄ５末端断片をｐＵＣ１９
誘導ベクターにクローン化し（ｐＭＢ１及びｐＭＢ２を得る）、次にｐＮＫＢＡ
Ｃ３９のＢａｍＨＩ／Ｂｓｕ３６Ｉ部位に連続的に移入した。ＰａｃＩ部位はｐ
ＭＢ１及びｐＭＢ２の作製に用いたＧ７６プライマーに存在していた（プライマ
ーＧ７４−Ｇ７６及びＧ７５−Ｇ７６を用いるＰＣＲは３９０及び３５６ｂｐの
Ａｄ５断片をもたらす）。
ＢＡＣにおいてｐＭＢ６６を用いて作製した。組み込み部位近傍の突然変異は２
工程遺伝子置換によっては常に移入されることはない。ＡＴＦ部位は組み込み部
位に最も近いため、ｐＭＢ７３はＡＴＦ部位の突然変異を欠いている。 詳細な手順： ｐＭＢ２０：Ａｄ５ゲノムＤＮＡをＳａｌＩで切断したｐＭＢ１９にギャップ
修復で組み込んだ。ｐＭＢ１９は、酵母複製起点（ｐＨ４ＡＲＳ由来、Bouton及
びSmith、1986）を既に末端Ａｄ５断片を含むベクター（ｐＭＢ１０）のＳａｃ
Ｉ部位に挿入することによって作製した。出発ベクター（ｐＮＫＢＡＣ３９、La
rionovら、1996）はＡＲＳを必要としないことが期待されたが、この仮定は間違
っていることが立証された。最初にＰＣＲによってＡｄ５末端断片をｐＵＣ１９
誘導ベクターにクローン化し（ｐＭＢ１及びｐＭＢ２を得る）、次にｐＮＫＢＡ
Ｃ３９のＢａｍＨＩ／Ｂｓｕ３６Ｉ部位に連続的に移入した。ＰａｃＩ部位はｐ
ＭＢ１及びｐＭＢ２の作製に用いたＧ７６プライマーに存在していた（プライマ
ーＧ７４−Ｇ７６及びＧ７５−Ｇ７６を用いるＰＣＲは３９０及び３５６ｂｐの
Ａｄ５断片をもたらす）。
【００８８】 ｐＭＢ２５：ＥＧＦＰベクターはClontechからの改変ベクターである。これは
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１に由来するＧＦＰの５’末端及びｐｈＧＦＰ−Ｓ６５Ｔに由来
するＧＦＰの３’末端を有する。そのＡｄ５ ＰＣＲ断片（ｎｔ２０１９−２２
６１、プライマーＧ７７−７８）をＥＧＦＰの５’末端のＮｈｅＩ及びＡｇｅＩ
部位にクローン化し、ｐＭＢ７を得た。Ｅ１領域を含むＳｍａＩ Ａｄ５断片（
ｎｔ１００７−３９４０）をBluescriptにクローン化し、ｐＭＢ２２を得た。Ｅ
１Ｂ：：ＧＦＰ融合（ＮｏｔＩ／ＫｐｎＩ）をｐＭＢ２２（ＢｇｌＩＩ／Ｋｐｎ
Ｉ）にクローン化し、ｐＭＢ２４を得た。Ａｄ５インサートを含むｐＭＢ２４の
ＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ断片をｐ６８０（Ketnerら、1994）にクローン化し、ｐＭ
Ｂ２５を得た。
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１に由来するＧＦＰの５’末端及びｐｈＧＦＰ−Ｓ６５Ｔに由来
するＧＦＰの３’末端を有する。そのＡｄ５ ＰＣＲ断片（ｎｔ２０１９−２２
６１、プライマーＧ７７−７８）をＥＧＦＰの５’末端のＮｈｅＩ及びＡｇｅＩ
部位にクローン化し、ｐＭＢ７を得た。Ｅ１領域を含むＳｍａＩ Ａｄ５断片（
ｎｔ１００７−３９４０）をBluescriptにクローン化し、ｐＭＢ２２を得た。Ｅ
１Ｂ：：ＧＦＰ融合（ＮｏｔＩ／ＫｐｎＩ）をｐＭＢ２２（ＢｇｌＩＩ／Ｋｐｎ
Ｉ）にクローン化し、ｐＭＢ２４を得た。Ａｄ５インサートを含むｐＭＢ２４の
ＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ断片をｐ６８０（Ketnerら、1994）にクローン化し、ｐＭ
Ｂ２５を得た。
【００８９】 ｐＭＢ３３：Ａｄ５ ＰＣＲ断片（ｎｔ２６６８８−２７５９３、プライマー
Ｇ６１−Ｇ６２を用いるＰＣＲ、産生物をＳａｃＩ／ＫｐｎＩで切断）をｐＲＳ
４０６のＫｐｎＩ／ＳａｃＩ部位にクローン化し、ｐＭＢ３２を得た。これを、
プライマーＧ６３−Ｇ６４を用いてＴｃｆ部位を挿入する逆ＰＣＲによって変異
誘発した。これらのプライマーは４つのＴｃｆ部位をもたらすはずであったが、
それに続いて最初のＴｃｆ部位は突然変異を含むことが見出され、そのため最終
ベクターは３つのＴｃｆ部位のみを含む。
Ｇ６１−Ｇ６２を用いるＰＣＲ、産生物をＳａｃＩ／ＫｐｎＩで切断）をｐＲＳ
４０６のＫｐｎＩ／ＳａｃＩ部位にクローン化し、ｐＭＢ３２を得た。これを、
プライマーＧ６３−Ｇ６４を用いてＴｃｆ部位を挿入する逆ＰＣＲによって変異
誘発した。これらのプライマーは４つのＴｃｆ部位をもたらすはずであったが、
それに続いて最初のＴｃｆ部位は突然変異を含むことが見出され、そのため最終
ベクターは３つのＴｃｆ部位のみを含む。
【００９０】 ｐＭＢ６６：４つの正しいＴｃｆ部位を有するｐＭＢ３３をｐＭＢ６９と呼ぶ
。ｐＭＢ６９をプライマーＧ８９及びＧ９０を用いる逆ＰＣＲによって変異誘発
し、ｐＭＢ４６を得た。ｐＭＢ４６をプライマーＧ８７及びＧ８８を用いる逆Ｐ
ＣＲによって変異誘発し、Ｅ２に４つのＴｃｆ部位及びＥ３に全ての望ましい突
然変異を含むｐＭＢ４９を得た。２工程遺伝置換を容易にするのに用いられるＡ
ｄ５ ＰＣＲ断片（ｎｔ２７３３１−２７６８９、プライマーＧ１００−Ｇ１０
１）をＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで切断し、Bluescriptにクローン化してｐＭＢ５
８を得た。まず、この３’伸長を、Ｅ２に４つのＴｃｆ部位を有し、かつ野生型
Ｅ３プロモーターを有するベクターの創出に用い（ｐＭＢ５８に由来するＥｃｏ
ＲＩ／ＰｓｔＩ断片をｐＭＢ４９のＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩ部位に挿入した）、ｐ
ＭＢ６３を得た。次に、Ｅ３突然変異をこのベクターにクローン化して戻し（ｐ
ＭＢ４９に由来するＳａｃＩ／ＫｐｎＩ断片をｐＭＢ６３のＳａｃＩ／ＫｐｎＩ
部位にクローン化した）、ｐＭＢ６６を得た。
。ｐＭＢ６９をプライマーＧ８９及びＧ９０を用いる逆ＰＣＲによって変異誘発
し、ｐＭＢ４６を得た。ｐＭＢ４６をプライマーＧ８７及びＧ８８を用いる逆Ｐ
ＣＲによって変異誘発し、Ｅ２に４つのＴｃｆ部位及びＥ３に全ての望ましい突
然変異を含むｐＭＢ４９を得た。２工程遺伝置換を容易にするのに用いられるＡ
ｄ５ ＰＣＲ断片（ｎｔ２７３３１−２７６８９、プライマーＧ１００−Ｇ１０
１）をＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで切断し、Bluescriptにクローン化してｐＭＢ５
８を得た。まず、この３’伸長を、Ｅ２に４つのＴｃｆ部位を有し、かつ野生型
Ｅ３プロモーターを有するベクターの創出に用い（ｐＭＢ５８に由来するＥｃｏ
ＲＩ／ＰｓｔＩ断片をｐＭＢ４９のＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩ部位に挿入した）、ｐ
ＭＢ６３を得た。次に、Ｅ３突然変異をこのベクターにクローン化して戻し（ｐ
ＭＢ４９に由来するＳａｃＩ／ＫｐｎＩ断片をｐＭＢ６３のＳａｃＩ／ＫｐｎＩ
部位にクローン化した）、ｐＭＢ６６を得た。
【００９１】 ｐＭＢ６７：２つのＴｃｆ部位を有するＥ２プロモーターを、ｐＭＢ３３と同
様ではあるがプライマーＧ９１及びＧ９２を逆ＰＣＲに用いて構築し、ｐＭＢ４
５を得た。２つのＴｃｆ部位を含むＥｃｏＲＩ／Ｅｃｏ４７ＩＩＩ断片をｐＭＢ
４５からｐＭＢ６６に移入し、ｐＭＢ６７を得た。
様ではあるがプライマーＧ９１及びＧ９２を逆ＰＣＲに用いて構築し、ｐＭＢ４
５を得た。２つのＴｃｆ部位を含むＥｃｏＲＩ／Ｅｃｏ４７ＩＩＩ断片をｐＭＢ
４５からｐＭＢ６６に移入し、ｐＭＢ６７を得た。
【００９２】
【化１】
【００９３】
【００９４】
【００９５】 手順に関する以下の文献は、参考文献として本明細書中に援用される。
【００９６】
【表１】
【００９７】
【化２】
【００９８】
【００９９】 注：３ＴｃｆベクターはＰＣＲクローン化人工産物から生じる４Ｔｃｆベクタ
ーの変異体形態である（第１Ｔｃｆ部位に１つのＡ欠失が存在する）。これはＡ
ｄ−Ｔｃｆ３及びＬＧＣウイルス内に存在する配列である。 Ｅ３プロモーター結合部位 ４つの部位がＥ３プロモーター内でＤＮアーゼＩフットプリント法によってＨ
ｅｌａ細胞において同定されている（Garcia 1987、Hurst 1987）。部位１はTAT
Aボックスをカバーし、残りの部位（図１ないし３において下線が付され、Ｈ２
−Ｈ４とマークされている）にはＡＴＦ、ＡＰ１及びＮＦ１が結合している。２
つの部位がＤＮアーゼＩフットプリント法によってリンパ細胞において同定され
ており（Williams 1990）（図１ないし３において下線が付され、Ｌ１及びＬ２
とマークされている）、これらはＮＦκＢファミリーのメンバーと結合する。
ーの変異体形態である（第１Ｔｃｆ部位に１つのＡ欠失が存在する）。これはＡ
ｄ−Ｔｃｆ３及びＬＧＣウイルス内に存在する配列である。 Ｅ３プロモーター結合部位 ４つの部位がＥ３プロモーター内でＤＮアーゼＩフットプリント法によってＨ
ｅｌａ細胞において同定されている（Garcia 1987、Hurst 1987）。部位１はTAT
Aボックスをカバーし、残りの部位（図１ないし３において下線が付され、Ｈ２
−Ｈ４とマークされている）にはＡＴＦ、ＡＰ１及びＮＦ１が結合している。２
つの部位がＤＮアーゼＩフットプリント法によってリンパ細胞において同定され
ており（Williams 1990）（図１ないし３において下線が付され、Ｌ１及びＬ２
とマークされている）、これらはＮＦκＢファミリーのメンバーと結合する。
【０１００】 このプロモーターを不活性化するため、逆ＰＣＲによって突然変異を導入した
。TATAボックスを除く全ての部位が少なくとも１つの突然変異を含む。これらの
突然変異はタンパク質レベルでは沈黙している。Ｌ１、Ｌ２及びＨ２ボックスは
高度に保存された残基の複数の置換を含む。Ｈ４ボックスは、代替コドンの選択
の制限のため、比較的保存が不十分な残基に１つの突然変異を含む。Ｈ４部位の
突然変異は、この部位の欠失がＨｅｌａ細胞におけるＥ３の転写に対して何ら効
果がないため、重要なものではなかった（Garcia 1987）。公開されたＡＰ１部
位（TGAC）における最も保存された残基のあらゆる修飾がタンパク質配列を変化
させるため、Ｈ３ボックス内の比較的弱く保存された残基のみに突然変異を誘発
した。公開された部位の僅かに３’側 （依然として公開されたフットプリント
内）にＡＰ１部位とのより良好な一致が存在する；導入された突然変異はこの部
位を完全に破壊する。 Ｅ１Ｂプロモーターを制御する４Ｔｃｆ部位を含むウイルスの構築 ｐＭＢ２２（BluescriptにおけるＥ１領域）はＬＧＭウイルスの構築において
説明される。
。TATAボックスを除く全ての部位が少なくとも１つの突然変異を含む。これらの
突然変異はタンパク質レベルでは沈黙している。Ｌ１、Ｌ２及びＨ２ボックスは
高度に保存された残基の複数の置換を含む。Ｈ４ボックスは、代替コドンの選択
の制限のため、比較的保存が不十分な残基に１つの突然変異を含む。Ｈ４部位の
突然変異は、この部位の欠失がＨｅｌａ細胞におけるＥ３の転写に対して何ら効
果がないため、重要なものではなかった（Garcia 1987）。公開されたＡＰ１部
位（TGAC）における最も保存された残基のあらゆる修飾がタンパク質配列を変化
させるため、Ｈ３ボックス内の比較的弱く保存された残基のみに突然変異を誘発
した。公開された部位の僅かに３’側 （依然として公開されたフットプリント
内）にＡＰ１部位とのより良好な一致が存在する；導入された突然変異はこの部
位を完全に破壊する。 Ｅ１Ｂプロモーターを制御する４Ｔｃｆ部位を含むウイルスの構築 ｐＭＢ２２（BluescriptにおけるＥ１領域）はＬＧＭウイルスの構築において
説明される。
【０１０１】 １．ｐＲＤＩ−２３８ ＝ ｐＭＢ２２から、逆ＰＣＲにより、Ｔｃｆ部位を
挿入してＳｐ１部位を欠失させる。 プライマー：
挿入してＳｐ１部位を欠失させる。 プライマー：
【０１０２】
【化３】 tCCCTTTGATCTccaaCCCTTTGATCTAGTCCtatataatgcgccgtg 及び tccAGATCAAAGGGattaAGATCAAAGGGatttaacacgccatgcaa。 Ｔｃｆ部位とTATAボックスとの間の下線が付された配列はＥ２プロモーターにお
けるものと同一である（すなわち、Ｅ１Ｂプロモーター配列ではない）。これは
、この間隔及び配列がこのプロモーターの良好な調節に適合することを我々が知
っていたためである。
けるものと同一である（すなわち、Ｅ１Ｂプロモーター配列ではない）。これは
、この間隔及び配列がこのプロモーターの良好な調節に適合することを我々が知
っていたためである。
【０１０３】 ２．ｐＲＤＩ−２３９ ＝ Ｔｃｆ突然変異を含む小断片を酵母組み込みベク
ター（integrating vector）に移入する。ｐＲＤＩ−２３８ ＥｃｏＲＩ／Ｓａ
ｃＩ断片をｐＲＳ４０６の同じ部位にクローン化した。
ター（integrating vector）に移入する。ｐＲＤＩ−２３８ ＥｃｏＲＩ／Ｓａ
ｃＩ断片をｐＲＳ４０６の同じ部位にクローン化した。
【０１０４】 ３．ｐＲＤＩ−２４１ ＝ Ｅ１Ｂ−Ｔｃｆ酵母組み込みベクター。ｐＭＢ２
２に由来するＥ１Ｂ含有２ｋｂ ＳａｃＩ断片をｐＲＤＩ−２３９の同じ部位に
クローン化し、ＹＡＣ／ＢＡＣでの組換えのためのさらなる配列を得た。
２に由来するＥ１Ｂ含有２ｋｂ ＳａｃＩ断片をｐＲＤＩ−２３９の同じ部位に
クローン化し、ＹＡＣ／ＢＡＣでの組換えのためのさらなる配列を得た。
【０１０５】 ４．ＹＡＣ／ＢＡＣにおける２工程遺伝子置換。ｐＲＤＩ−２４１をＸｂａＩ
で切断し、アデノＹＡＣ／ＢＡＣを含む酵母（ｙＭＢ株）に移入した。組み込み
及び切除について選択するため、形質転換体をｕｒａ−、次いで５−ＦＯＡ培地
で平板培養した。その後、プラスミドをＤＨ１０Ｂに回収した： ｐＲＤＩ−２４３＝ｙＭＢ２（野生型Ａｄ５）に由来する組換え体 ｐＲＤＩ−２６８＝ｙＭＢ１５（４ｘＴｃｆ−Ｅ２、ｗｔＥ３）に由来する
組換え体 ｐＲＤＩ−２５４＝ｙＭＢ１３（４ｘＴｃｆ−Ｅ２、変異体Ｅ３＋ｗｔＡＴ
Ｆ）に由来する組換え体 ｐＲＤＩ−２６４＝ｙＭＢ１７（４ｘＴｃｆ−Ｅ２、完全変異体Ｅ３）に由
来する組換え体 ５．これらのプラスミドをＰａｃＩで切断し、活性化Ｔｃｆ（ΔＮβ−カテニ
ン、Dr H Cleversからの供給を受けた）を含む２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１
５７３）に移入して組換えアデノウイルスを産生した： ｖＭＢ１５＝ｐＲＤＩ−２４３の形質移入から誘導されるウイルスプール ｖＭＢ１６＝ｐＲＤＩ−２６８の形質移入から誘導されるウイルスプール ｖＭＢ１７＝ｐＲＤＩ−２５４の形質移入から誘導されるウイルスプール ｖＭＢ１８＝ｐＲＤＩ−２６４の形質移入から誘導されるウイルスプール ６．ウイルスをＳＷ４８０細胞でプラーク精製した。これは、これらの細胞が
活性Ｔｃｆを含み、かつウイルスゲノムが使用して組換え可能である内在性Ｅ１
Ｂ配列をもたないためである。次に、ウイルスをＳＷ４８０で増幅させ、Ｃｓ結
合によって精製し、Ｅ１Ｂ及びＥ２／Ｅ３領域における制限消化及び配列決定に
よってチェックした。プラーク精製ウイルスには以下の名称を与えた： ｖＭＢ２３＝Ｅ１Ｂプロモーター内に４ｘＴｃｆ部位を有するＡｄ５ ｖＭＢ２７＝Ｅ１Ｂ及びＥ２プロモーターの両者に４ｘＴｃｆ部位を有する
Ａｄ５ ｖＭＢ３１＝Ｅ１Ｂ及びＥ２プロモーター内に４ｘＴｃｆ部位を有し、かつ
野生型ＡＴＦ部位を有する変異体Ｅ３プロモーターを伴うＡｄ５ ｖＭＢ１９＝Ｅ１Ｂ及びＥ２プロモーター内に４ｘＴｃｆ部位を有し、かつ
完全な変異体Ｅ３プロモーターを伴うＡｄ５ 結果： Ｔｃｆレポーターを用いるルシフェラーゼアッセイでは、ｐ５３変異体肺カル
チノーマ細胞（Ｈ１２９９）がＴｃｆ活性を欠き、ｐ５３変異体結腸カルチノー
マ細胞（ＳＷ４８０）が強いＴｃｆ活性を有することが示される。したがって、
Ｔｃｆ活性を含む細胞に対して選択的なウイルスはＳＷ４８０では複製するが、
Ｈ１２９９では複製しないはずである。本発明者らは、Ｔｃｆ変異体Ｅ２プロモ
ーターを有する適合ウイルスがＥ２遺伝子産生物を優先的に発現することをウェ
スタンブロット法により；より良好に複製することをスロットブロット法及び定
量的ＰＣＲにより；並びにＨ１２９９よりもＳＷ４８０においてより高い細胞変
性効果を有することを示している。Ｅ２プロモーターの突然変異単独での比較的
穏やかな効果は、ウイルスがＥ１Ｂ ５５ｋをも欠くとき、大幅に増強される。
Ｅ１Ｂ ５５ｋの突然変異は、Ｅ２後期プロモーターから転写されるＤＢＰ ｍ
ＲＮＡの核外移行を減少させる。ＤＢＰは早期及び後期Ｅ２プロモーターの両者
から発現され得る。本発明者らは、ＤＢＰの発現におけるＥ１Ｂ ５５ｋ依存性
の減少がＥ２早期プロモーターにおけるＴｃｆ突然変異によって救われることを
示している。これと一致して、ＬＧＣから発現されるＤＢＰのレベルはＨ１２９
９において大きく低下する。このＥ１Ｂ ５５ｋの効果は、いずれの細胞系もｐ
５３を含まないという事実から明らかなように、ｐ５３とは全く無関係である。 ウェスタンブロット Ｈ１２９９及びＳＷ４８０に０．２のｍｏｉで野生型Ａｄ５、Ａｄ−Ｔｃｆ３
、ＬＧＭ及びＬＧＣを感染させた。ウェスタンブロット測定のために細胞を２４
、４８及び７２時間後に収集した。ブロットをＤＢＰに対する抗体で探索した。
野生型Ａｄ５はＳＷ４８０及びＨ１２９９において比較し得るタンパク質の発現
をもたらした。Ａｄ−Ｔｃｆ３はＨ１２９９よりもＳＷ４８０においてＤＢＰの
僅かに強い発現をもたらした。Ａｄ−Ｔｃｆ３はＳＷ４８０において２４時間後
に野生型Ａｄ５よりも高いＤＢＰの発現をもたらしたが、４８及び７２時間後に
は野生型Ａｄ５と同様であった。ＤＢＰはＨ１２２９９においてはＬＧＣよりも
ＬＧＭによってより良好に発現したが、両ウイルスはＳＷ４８０においては匹敵
するＤＢＰの発現をもたらした。
で切断し、アデノＹＡＣ／ＢＡＣを含む酵母（ｙＭＢ株）に移入した。組み込み
及び切除について選択するため、形質転換体をｕｒａ−、次いで５−ＦＯＡ培地
で平板培養した。その後、プラスミドをＤＨ１０Ｂに回収した： ｐＲＤＩ−２４３＝ｙＭＢ２（野生型Ａｄ５）に由来する組換え体 ｐＲＤＩ−２６８＝ｙＭＢ１５（４ｘＴｃｆ−Ｅ２、ｗｔＥ３）に由来する
組換え体 ｐＲＤＩ−２５４＝ｙＭＢ１３（４ｘＴｃｆ−Ｅ２、変異体Ｅ３＋ｗｔＡＴ
Ｆ）に由来する組換え体 ｐＲＤＩ−２６４＝ｙＭＢ１７（４ｘＴｃｆ−Ｅ２、完全変異体Ｅ３）に由
来する組換え体 ５．これらのプラスミドをＰａｃＩで切断し、活性化Ｔｃｆ（ΔＮβ−カテニ
ン、Dr H Cleversからの供給を受けた）を含む２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１
５７３）に移入して組換えアデノウイルスを産生した： ｖＭＢ１５＝ｐＲＤＩ−２４３の形質移入から誘導されるウイルスプール ｖＭＢ１６＝ｐＲＤＩ−２６８の形質移入から誘導されるウイルスプール ｖＭＢ１７＝ｐＲＤＩ−２５４の形質移入から誘導されるウイルスプール ｖＭＢ１８＝ｐＲＤＩ−２６４の形質移入から誘導されるウイルスプール ６．ウイルスをＳＷ４８０細胞でプラーク精製した。これは、これらの細胞が
活性Ｔｃｆを含み、かつウイルスゲノムが使用して組換え可能である内在性Ｅ１
Ｂ配列をもたないためである。次に、ウイルスをＳＷ４８０で増幅させ、Ｃｓ結
合によって精製し、Ｅ１Ｂ及びＥ２／Ｅ３領域における制限消化及び配列決定に
よってチェックした。プラーク精製ウイルスには以下の名称を与えた： ｖＭＢ２３＝Ｅ１Ｂプロモーター内に４ｘＴｃｆ部位を有するＡｄ５ ｖＭＢ２７＝Ｅ１Ｂ及びＥ２プロモーターの両者に４ｘＴｃｆ部位を有する
Ａｄ５ ｖＭＢ３１＝Ｅ１Ｂ及びＥ２プロモーター内に４ｘＴｃｆ部位を有し、かつ
野生型ＡＴＦ部位を有する変異体Ｅ３プロモーターを伴うＡｄ５ ｖＭＢ１９＝Ｅ１Ｂ及びＥ２プロモーター内に４ｘＴｃｆ部位を有し、かつ
完全な変異体Ｅ３プロモーターを伴うＡｄ５ 結果： Ｔｃｆレポーターを用いるルシフェラーゼアッセイでは、ｐ５３変異体肺カル
チノーマ細胞（Ｈ１２９９）がＴｃｆ活性を欠き、ｐ５３変異体結腸カルチノー
マ細胞（ＳＷ４８０）が強いＴｃｆ活性を有することが示される。したがって、
Ｔｃｆ活性を含む細胞に対して選択的なウイルスはＳＷ４８０では複製するが、
Ｈ１２９９では複製しないはずである。本発明者らは、Ｔｃｆ変異体Ｅ２プロモ
ーターを有する適合ウイルスがＥ２遺伝子産生物を優先的に発現することをウェ
スタンブロット法により；より良好に複製することをスロットブロット法及び定
量的ＰＣＲにより；並びにＨ１２９９よりもＳＷ４８０においてより高い細胞変
性効果を有することを示している。Ｅ２プロモーターの突然変異単独での比較的
穏やかな効果は、ウイルスがＥ１Ｂ ５５ｋをも欠くとき、大幅に増強される。
Ｅ１Ｂ ５５ｋの突然変異は、Ｅ２後期プロモーターから転写されるＤＢＰ ｍ
ＲＮＡの核外移行を減少させる。ＤＢＰは早期及び後期Ｅ２プロモーターの両者
から発現され得る。本発明者らは、ＤＢＰの発現におけるＥ１Ｂ ５５ｋ依存性
の減少がＥ２早期プロモーターにおけるＴｃｆ突然変異によって救われることを
示している。これと一致して、ＬＧＣから発現されるＤＢＰのレベルはＨ１２９
９において大きく低下する。このＥ１Ｂ ５５ｋの効果は、いずれの細胞系もｐ
５３を含まないという事実から明らかなように、ｐ５３とは全く無関係である。 ウェスタンブロット Ｈ１２９９及びＳＷ４８０に０．２のｍｏｉで野生型Ａｄ５、Ａｄ−Ｔｃｆ３
、ＬＧＭ及びＬＧＣを感染させた。ウェスタンブロット測定のために細胞を２４
、４８及び７２時間後に収集した。ブロットをＤＢＰに対する抗体で探索した。
野生型Ａｄ５はＳＷ４８０及びＨ１２９９において比較し得るタンパク質の発現
をもたらした。Ａｄ−Ｔｃｆ３はＨ１２９９よりもＳＷ４８０においてＤＢＰの
僅かに強い発現をもたらした。Ａｄ−Ｔｃｆ３はＳＷ４８０において２４時間後
に野生型Ａｄ５よりも高いＤＢＰの発現をもたらしたが、４８及び７２時間後に
は野生型Ａｄ５と同様であった。ＤＢＰはＨ１２２９９においてはＬＧＣよりも
ＬＧＭによってより良好に発現したが、両ウイルスはＳＷ４８０においては匹敵
するＤＢＰの発現をもたらした。
【０１０６】 これらの結果は、肺細胞よりも結腸細胞においてより強力に活性化されるＴｃ
ｆ変異体Ｅ２プロモーターと一致する。 ウイルスＤＮＡ複製アッセイ Ｈ１２９９及びＳＷ４８０に０．２のｍｏｉで野生型Ａｄ５、Ａｄ−Ｔｃｆ３
、ＬＧＭ及びＬＧＣを感染させた。ＤＮＡ抽出のため、細胞を０、２４、４８及
び７２時間後に収集した。全ての試料をスロットブロット処理し、32Ｐ標識アデ
ノウイルスＤＮＡ（図８Ａ）又は対照ヒトゲノムＤＮＡ（図８Ｂ）とハイブリダ
イズさせた。これによりＬＧＭの複製は両細胞系において示されたが、ＬＧＣの
複製はＳＷ４８０においてのみ示された（ホスホイメージャー（phosphorimager
）によって測定された実際の値は背景に等しい）。差をより正確に算出するため
、Ａｄ５プライマー（図９）を用いるTaqman定量ＰＣＲアッセイ（Perkin Elmer
）によって７２時間試料を試験した。これによりスロットブロットの結果が確認
された：LGCはＳＷ４８０においては野生型Ａｄ５よりも２倍劣るが、Ｈ１２９
９においては３０００倍劣る。ＬＧＭはＳＷ４８０においては野生型Ａｄ５より
も１０倍劣るが、Ｈ１２９９においては４倍劣る。Ａｄ−Ｔｃｆ３も、劇的では
ないものの、ＳＷ４８０に対する幾らかの選択性を示す：ＳＷ４８０においては
野生型Ａｄ５よりも１．３倍勝るが、Ｈ１２９９においては７．４倍劣る。
ｆ変異体Ｅ２プロモーターと一致する。 ウイルスＤＮＡ複製アッセイ Ｈ１２９９及びＳＷ４８０に０．２のｍｏｉで野生型Ａｄ５、Ａｄ−Ｔｃｆ３
、ＬＧＭ及びＬＧＣを感染させた。ＤＮＡ抽出のため、細胞を０、２４、４８及
び７２時間後に収集した。全ての試料をスロットブロット処理し、32Ｐ標識アデ
ノウイルスＤＮＡ（図８Ａ）又は対照ヒトゲノムＤＮＡ（図８Ｂ）とハイブリダ
イズさせた。これによりＬＧＭの複製は両細胞系において示されたが、ＬＧＣの
複製はＳＷ４８０においてのみ示された（ホスホイメージャー（phosphorimager
）によって測定された実際の値は背景に等しい）。差をより正確に算出するため
、Ａｄ５プライマー（図９）を用いるTaqman定量ＰＣＲアッセイ（Perkin Elmer
）によって７２時間試料を試験した。これによりスロットブロットの結果が確認
された：LGCはＳＷ４８０においては野生型Ａｄ５よりも２倍劣るが、Ｈ１２９
９においては３０００倍劣る。ＬＧＭはＳＷ４８０においては野生型Ａｄ５より
も１０倍劣るが、Ｈ１２９９においては４倍劣る。Ａｄ−Ｔｃｆ３も、劇的では
ないものの、ＳＷ４８０に対する幾らかの選択性を示す：ＳＷ４８０においては
野生型Ａｄ５よりも１．３倍勝るが、Ｈ１２９９においては７．４倍劣る。
【０１０７】 これらの結果は、より多いウイルスの複製を生じることになる、結腸細胞にお
けるＴｃｆ変異体Ｅ２プロモーターのｐｏｌ及びｐＴＰのより強い発現と一致す
る。加えて、このデータは、Ｅ２プロモーターの突然変異とＥ１Ｂ ５５ｋの欠
失との組み合わせがＴｃｆ活性を欠く細胞において例外的に少ない複製を生じる
ことを示す。 細胞変性効果（ＣＰＥ）アッセイ Ｈ１２９９及びＳＷ４８０に５倍希釈の野生型Ａｄ５、Ａｄ−Ｔｃｆ３、ＬＧ
Ｍ及びＬＧＣを感染させた（ウェル１において０．６のｍｏｉ、ウェル５におい
て０．００１のｍｏｉ）。８日後に皿をクリスタルバイオレッドで染色した。Ｈ
１２９９における野生型Ａｄ５では最高希釈でさえＣＰＥが明らかである。野生
型Ａｄ５はＳＷ４８０においてはＨ１２９９よりも活性が５倍劣る。
けるＴｃｆ変異体Ｅ２プロモーターのｐｏｌ及びｐＴＰのより強い発現と一致す
る。加えて、このデータは、Ｅ２プロモーターの突然変異とＥ１Ｂ ５５ｋの欠
失との組み合わせがＴｃｆ活性を欠く細胞において例外的に少ない複製を生じる
ことを示す。 細胞変性効果（ＣＰＥ）アッセイ Ｈ１２９９及びＳＷ４８０に５倍希釈の野生型Ａｄ５、Ａｄ−Ｔｃｆ３、ＬＧ
Ｍ及びＬＧＣを感染させた（ウェル１において０．６のｍｏｉ、ウェル５におい
て０．００１のｍｏｉ）。８日後に皿をクリスタルバイオレッドで染色した。Ｈ
１２９９における野生型Ａｄ５では最高希釈でさえＣＰＥが明らかである。野生
型Ａｄ５はＳＷ４８０においてはＨ１２９９よりも活性が５倍劣る。
【０１０８】 Ａｄ−Ｔｃｆ３はＨ１２９９においては野生型Ａｄ５よりも活性が５倍劣る。
ＬＧＭはＨ１２９９においては野生型Ａｄ５よりも活性が１２５倍劣る。ＬＧＣ
はＨ１２９９においては野生型Ａｄ５よりも活性が６２５倍劣る。したがって、
Ｅ２プロモーターにおけるＴｃｆ３突然変異は、Ｈ１２９９において、ＣＰＥの
５倍の減少を生じる。Ａｄ−Ｔｃｆ３はＳＷ４８０においては野生型Ａｄ５に類
似し、Ｔｃｆ活性を含む細胞においては活性が５倍増加することが示される。Ｌ
ＧＣは、ＳＷ４８０においては、ＬＧＭよりも５倍活性である。
ＬＧＭはＨ１２９９においては野生型Ａｄ５よりも活性が１２５倍劣る。ＬＧＣ
はＨ１２９９においては野生型Ａｄ５よりも活性が６２５倍劣る。したがって、
Ｅ２プロモーターにおけるＴｃｆ３突然変異は、Ｈ１２９９において、ＣＰＥの
５倍の減少を生じる。Ａｄ−Ｔｃｆ３はＳＷ４８０においては野生型Ａｄ５に類
似し、Ｔｃｆ活性を含む細胞においては活性が５倍増加することが示される。Ｌ
ＧＣは、ＳＷ４８０においては、ＬＧＭよりも５倍活性である。
【０１０９】 ＬＧＣはＴｃｆ活性を欠く細胞においては野生型Ａｄ５よりも活性が６２５倍
劣るが、Ｔｃｆ活性を含む細胞においては活性が５倍劣るだけである。これは、
結腸細胞に対する１２５倍の選択性、及び単純Ｅ１Ｂ ５５ｋ不全ウイルスより
も５倍高い活性を表す。
劣るが、Ｔｃｆ活性を含む細胞においては活性が５倍劣るだけである。これは、
結腸細胞に対する１２５倍の選択性、及び単純Ｅ１Ｂ ５５ｋ不全ウイルスより
も５倍高い活性を表す。
【０１１０】 さらなるＣＰＥアッセイを、上述のウイルスＡｄ−Ｔｃｆ３、ＬＧＭ及びＬＧ
Ｃを用いて、ＳＷ４８０細胞及び正常肺線維芽細胞で行った。Ａｄ−Ｔｃｆ３は
ＳＷ４８０では野生型の活性をもたらしたが、正常線維芽細胞では活性が５倍劣
っていた。この実験においては、ＬＧＭ及びＬＧＣの両者は、ＳＷ４８０では野
生型Ａｄ５よりも約１２５倍劣る活性をもたらしたが、正常線維芽細胞ではそれ
ぞれ５倍及び＞１２５倍劣る活性をもたらした。
Ｃを用いて、ＳＷ４８０細胞及び正常肺線維芽細胞で行った。Ａｄ−Ｔｃｆ３は
ＳＷ４８０では野生型の活性をもたらしたが、正常線維芽細胞では活性が５倍劣
っていた。この実験においては、ＬＧＭ及びＬＧＣの両者は、ＳＷ４８０では野
生型Ａｄ５よりも約１２５倍劣る活性をもたらしたが、正常線維芽細胞ではそれ
ぞれ５倍及び＞１２５倍劣る活性をもたらした。
【０１１１】 Ａｄ−Ｔｃｆ３の選択性及び効力は、それ自体ＯＮＹＸ−０１５ウイルスと同
じ特性を本質的に有するＬＧＭよりも大きいことが示される。 ４ｘＴｃｆウイルスｖＭＢ１２、１３、１４及び１９ 方法：細胞系：ＳＷ４８０及びＣｏｌ１５結腸直腸カルチノーマ細胞はDr B Sor
datによる供給を受けた。ＷＩ３８細胞はＡＴＣＣによる供給を受けた。Ｈ１２
９９細胞はDr C Privesによる供給を受けたものであり、ｔｅｔ−ＶＰ１６トラ
ンス活性化因子が組み込まれている（Chen, X., et al. 1996. Genes Dev 10, 2
438-51）。 Taqmanアッセイ ＤＭＥＭ１０％ＦＣＳ中において、３００（ＳＷ４８０及びＨ１２９９）又は
１０００（ＷＩ３８）ウイルス粒子／細胞で細胞を感染させた。感染の２時間後
、培地を除去し、１０ｍＭヒドロキシ尿素を含む２ｍｌの新鮮なＤＭＥＭ１０％
ＦＣＳで置き換えた。感染の２４時間後、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、ＲＮＡ抽
出用のバッファＲＬＴ（Qiagen RNeasy Mini Kit、Ref. 74104から）又はＤＮＡ
抽出用の、１×ＰＢＳ、バッファＡＬ及びプロテイナーゼＫ溶液を含む混合液（
Qiagen DNeasy Tissue Kit、Ref. 69504から）のいずれかで溶解する。ＲＮＡ及
びＤＮＡの抽出は製造者の指示に従って行った。１μｇの全ＲＮＡ及びMMLV Sup
erscript Core Reagents（LifeTechnologies、Ref. 18064022）を用いて２０μ
ｌの反応容積で逆転写（ＲＴ）を行った。TaqMan Universal PCR Master Mix Ki
t（Perkin Elmer、Ref. 4304447）、９００ｎＭのプライマー（Microsynth and
Eurogentec）及び５００ｎＭのTaqManプローブ（Eurogentec）を用いてTaqMan
ＰＣＲ反応を行った。Sybr green Universal PCR Master Mix Kit（Perkin Elme
r、Ref. 4309155）及び９００ｎＭの線維遺伝子プライマー（fibre gene primer
s）（Eurogentec）を用いてSybr green ＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ反応に
用いられるテンプレートの量は１μｇのゲノムＤＮＡ又は５μｌのＲＴ反応容積
であった。ＤＮＡの結果はＯＤ260に対して正規化し、ＲＮＡの結果はリボソー
ムＲＮＡ（Ribosomal RNA Control、Perkin Elmer、ref 4310893E）に対して正
規化した。定量ＰＣＲ用のプライマー及びプローブは以下の通りであった。
じ特性を本質的に有するＬＧＭよりも大きいことが示される。 ４ｘＴｃｆウイルスｖＭＢ１２、１３、１４及び１９ 方法：細胞系：ＳＷ４８０及びＣｏｌ１５結腸直腸カルチノーマ細胞はDr B Sor
datによる供給を受けた。ＷＩ３８細胞はＡＴＣＣによる供給を受けた。Ｈ１２
９９細胞はDr C Privesによる供給を受けたものであり、ｔｅｔ−ＶＰ１６トラ
ンス活性化因子が組み込まれている（Chen, X., et al. 1996. Genes Dev 10, 2
438-51）。 Taqmanアッセイ ＤＭＥＭ１０％ＦＣＳ中において、３００（ＳＷ４８０及びＨ１２９９）又は
１０００（ＷＩ３８）ウイルス粒子／細胞で細胞を感染させた。感染の２時間後
、培地を除去し、１０ｍＭヒドロキシ尿素を含む２ｍｌの新鮮なＤＭＥＭ１０％
ＦＣＳで置き換えた。感染の２４時間後、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、ＲＮＡ抽
出用のバッファＲＬＴ（Qiagen RNeasy Mini Kit、Ref. 74104から）又はＤＮＡ
抽出用の、１×ＰＢＳ、バッファＡＬ及びプロテイナーゼＫ溶液を含む混合液（
Qiagen DNeasy Tissue Kit、Ref. 69504から）のいずれかで溶解する。ＲＮＡ及
びＤＮＡの抽出は製造者の指示に従って行った。１μｇの全ＲＮＡ及びMMLV Sup
erscript Core Reagents（LifeTechnologies、Ref. 18064022）を用いて２０μ
ｌの反応容積で逆転写（ＲＴ）を行った。TaqMan Universal PCR Master Mix Ki
t（Perkin Elmer、Ref. 4304447）、９００ｎＭのプライマー（Microsynth and
Eurogentec）及び５００ｎＭのTaqManプローブ（Eurogentec）を用いてTaqMan
ＰＣＲ反応を行った。Sybr green Universal PCR Master Mix Kit（Perkin Elme
r、Ref. 4309155）及び９００ｎＭの線維遺伝子プライマー（fibre gene primer
s）（Eurogentec）を用いてSybr green ＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ反応に
用いられるテンプレートの量は１μｇのゲノムＤＮＡ又は５μｌのＲＴ反応容積
であった。ＤＮＡの結果はＯＤ260に対して正規化し、ＲＮＡの結果はリボソー
ムＲＮＡ（Ribosomal RNA Control、Perkin Elmer、ref 4310893E）に対して正
規化した。定量ＰＣＲ用のプライマー及びプローブは以下の通りであった。
【０１１２】
【化４】 Ｅ２早期正プライマー：TTCGCTTTTGTGATACAGGCA Ｅ２早期逆プライマー：GTCTTGGACGCGACGAGAAG Ｅ２プローブ：CGGAGCGTTTGCCGCGC Ｅ３正プライマー：AGCTCGGAGAGGTTCTCTCGTAG Ｅ３逆プライマー：AACACCTGGTCCACTGTCGC Ｅ３プローブ：CCGCGACTCCGTTTCAACCCAGA Ｅ１Ｂ−５５ｋ正プライマー：TGCTTCCATCAAACGAGTTGG Ｅ１Ｂ−５５ｋ逆プライマー：GCGCTGAGTTTGGCTCTAGC Ｅ１Ｂ−５５ｋプローブ：CGGCGGCTGCTCAATCTGTATCTTCA Ｅ４正プライマー：GGTTGATTCATCGGTCAGTGC Ｅ４逆プライマー：ACGCCTGCGGGTATGTATTC Ｅ４プローブ：AAAAGCGACCGAAATAGCCCG 線維正プライマー：TGATGTTTGACGCTACAGCCATA 線維逆プライマー：GGGATTTGTGTTTGGTGCATTAG
【０１１３】 ウェスタンブロット分析 ＤＭＥＭ１０％ＦＣＳ中において、３００（ＳＷ４８０及びＨ１２９９）又は
１０００（ＷＩ３８）ウイルス粒子／細胞のいずれかで細胞を感染させた。感染
の２時間後、培地を除去し、２ｍｌの新鮮なＤＭＥＭ１０％ＦＣＳで置き換えた
。感染の２４時間後に細胞を収集した。免疫ブロットをHarlow及びLaneによって
記述される通りに行った（Antibodies: A laboratory manual, New York: Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1988、参照することにより本明細書に組み込
まれる）。２Ａ６抗Ｅ１Ｂ５５Ｋ抗体（Sarnow P. et al. Virology, 1982, 120
: 510-517）及びＢ６抗ＤＢＦ抗体（Reich N. et al. Virology, 1983, 128: 48
0-484）の両者はDr. A. Levineが提供した。検出はＨＲＰ結合ウサギ抗マウスＩ
ｇＧ（DAKO A/S、デンマーク）及び化学発光（Amersham、Little Chalfont、Ｕ
Ｋ）で行った。 プラークアッセイ ＤＭＥＭ１０％ＦＣＳ中において、３００（ＳＷ４８０及びＨ１２９９）又は
１０００（ＷＩ３８）ウイルス粒子／細胞のいずれかで細胞を２回感染させた。
３７℃で２時間インキュベートした後、培地を除去し、２ｍｌの新鮮なＤＭＥＭ
１０％ＦＣＳで置き換えた。さらに４８時間後、細胞を培養培地内に擦り落とし
、３サイクルの凍結−解凍によって溶解した。複製された時点の各々の上清を、
プラークアッセイを半固体アガロースの下で８−１０日間、ＳＷ４８０細胞で３
回行うことにより、ウイルスの産生について試験した。 細胞変性効果アッセイ 細胞変性効果アッセイのため、ＳＷ４８０及びＨ１２９９細胞を９６ウェルプ
レートに３通りに塗布し、１０００ないし０．０６ウイルス粒子／細胞の５倍希
釈のウイルスで感染させた。３７℃で２時間インキュベートした後、さらに１０
０μｌのＤＭＥＭ１０％ＦＣＳを各ウェルに添加した。６日後、アッセイを終了
し、BCA Protein Assay Kit（Pierce、Rockford、ＩＬ、ＵＳＡ）を製造者の指
示に従って用いて各ウェル内のタンパク質含量を測定した。
１０００（ＷＩ３８）ウイルス粒子／細胞のいずれかで細胞を感染させた。感染
の２時間後、培地を除去し、２ｍｌの新鮮なＤＭＥＭ１０％ＦＣＳで置き換えた
。感染の２４時間後に細胞を収集した。免疫ブロットをHarlow及びLaneによって
記述される通りに行った（Antibodies: A laboratory manual, New York: Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1988、参照することにより本明細書に組み込
まれる）。２Ａ６抗Ｅ１Ｂ５５Ｋ抗体（Sarnow P. et al. Virology, 1982, 120
: 510-517）及びＢ６抗ＤＢＦ抗体（Reich N. et al. Virology, 1983, 128: 48
0-484）の両者はDr. A. Levineが提供した。検出はＨＲＰ結合ウサギ抗マウスＩ
ｇＧ（DAKO A/S、デンマーク）及び化学発光（Amersham、Little Chalfont、Ｕ
Ｋ）で行った。 プラークアッセイ ＤＭＥＭ１０％ＦＣＳ中において、３００（ＳＷ４８０及びＨ１２９９）又は
１０００（ＷＩ３８）ウイルス粒子／細胞のいずれかで細胞を２回感染させた。
３７℃で２時間インキュベートした後、培地を除去し、２ｍｌの新鮮なＤＭＥＭ
１０％ＦＣＳで置き換えた。さらに４８時間後、細胞を培養培地内に擦り落とし
、３サイクルの凍結−解凍によって溶解した。複製された時点の各々の上清を、
プラークアッセイを半固体アガロースの下で８−１０日間、ＳＷ４８０細胞で３
回行うことにより、ウイルスの産生について試験した。 細胞変性効果アッセイ 細胞変性効果アッセイのため、ＳＷ４８０及びＨ１２９９細胞を９６ウェルプ
レートに３通りに塗布し、１０００ないし０．０６ウイルス粒子／細胞の５倍希
釈のウイルスで感染させた。３７℃で２時間インキュベートした後、さらに１０
０μｌのＤＭＥＭ１０％ＦＣＳを各ウェルに添加した。６日後、アッセイを終了
し、BCA Protein Assay Kit（Pierce、Rockford、ＩＬ、ＵＳＡ）を製造者の指
示に従って用いて各ウェル内のタンパク質含量を測定した。
【０１１４】 異種移植片 １００万個のＣｏ１１５細胞をヌードマウスの横腹に皮下注射した。注射後４
−８日に、３×１０10粒子のウイルス又はバッファを腫瘍に直接注射した。腫瘍
サイズをカリパスを用いて２次元で測定し、式：容積＝０．４×長さ×幅2を用
いて腫瘍容積を算出した。 コットンラット（cotton rat）の肺 バッファ５０μｌ中に３×１０10粒子のウイルスを用いて、コットンラットの
鼻腔内に感染させた。３日後、これらの動物をイソフルランで殺し、肺の４つの
断片（左及び右上及び下葉から）を各動物から採取した。Qiagen DNeasy Tissue
Kitを用いてＤＮＡを抽出し、各動物からの試料をプールした。ウイルスＤＮＡ
含量を、上述のように、Ｅ４プライマー及びプローブを用いるTaqman ＰＣＲに
より１００ｎｇの入力ＤＮＡを用いて決定した。
−８日に、３×１０10粒子のウイルス又はバッファを腫瘍に直接注射した。腫瘍
サイズをカリパスを用いて２次元で測定し、式：容積＝０．４×長さ×幅2を用
いて腫瘍容積を算出した。 コットンラット（cotton rat）の肺 バッファ５０μｌ中に３×１０10粒子のウイルスを用いて、コットンラットの
鼻腔内に感染させた。３日後、これらの動物をイソフルランで殺し、肺の４つの
断片（左及び右上及び下葉から）を各動物から採取した。Qiagen DNeasy Tissue
Kitを用いてＤＮＡを抽出し、各動物からの試料をプールした。ウイルスＤＮＡ
含量を、上述のように、Ｅ４プライマー及びプローブを用いるTaqman ＰＣＲに
より１００ｎｇの入力ＤＮＡを用いて決定した。
【０１１５】 結果：ｖＭＢ１２、１３、１４及び１９ Ｅ２プロモーターに４つのＴｃｆ部位を有するウイルスをＳＷ４８０、Ｈ１２
９９及びＷＩ３８細胞において試験した。感染の２４時間後に細胞を収集した。
ＤＢＰのウェスタンブロットは、ＳＷ４８０においては少なくとも野生型による
ものと同程度に変異体ウイルスによってＤＢＰが発現するが、Ｈ１２９９及びＷ
Ｉ３８細胞においてはかなり劣ることを示した： Taqman ＲＴ−ＰＣＲ転写アッセイ（図１０を参照）は、変異体ウイルスがＳ
Ｗ４８０細胞においては野生型レベルのＥ２ ｍＲＮＡを有するものの、Ｈ１２
９９細胞においてはレベルが減少することを示す： Taqmanアッセイは、さらに、ｖＭＢ１４におけるＥ３プロモーターの突然変異
がＥ２（図１０）及びＥ３ ｍＲＮＡ（図１１）の両者のレベルを低下させるこ
とを示す： ＤＮＡの複製がプロモーターの突然変異によって影響を受けるかどうかを決定
するため、ＳＷ４８０及びＨ１２９９細胞に野生型、ｖＭＢ１２、１３及び１４
を感染させ、２４時間で収集した。線維領域に由来するプライマーを用いるSybr
green ＰＣＲアッセイは、ＤＮＡの複製がＳＷ４８０においては正常であるが
、Ｈ１２９９細胞においては減少することを示す（図１２）： ウイルスの複製がプロモーターの突然変異によって影響を受けるかどうかを決
定するため、ＳＷ４８０及びＨ１２９９細胞に野生型、ｖＭＢ１２、１３及び１
４を感染させ、４８時間で収集した。凍結−乾燥によって細胞を溶解し、ＳＷ４
８０細胞でのプラーク形成アッセイによってウイルスの産生を測定した。これは
、変異体ウイルスがＳＷ４８０においては野生型に匹敵するか、又はそれを上回
るが、Ｈ１２９９及びＷＩ３８細胞においては不完全であることを示した（図１
３を参照）： ウイルスが結腸細胞に対する選択的毒性を示すかどうかを決定するため、細胞
変性効果アッセイをＳＷ４８０及びＨ１２９９細胞に対して行った。これは、変
異体ウイルスがＳＷ４８０細胞においては野生型に匹敵する（図１４）ことを示
したが、Ｈ１２９９細胞においては細胞変性効果の低下を示した（図１５）： ウイルスがイン・ビボで治療効果を示すかどうかを決定するため、それらをヌ
ードマウスにおけるＣｏ１１５結腸カルチノーマ異種移植片に注入した。これは
、全てのウイルスの腫瘍内注入が異種移植された結腸腫瘍の成長を遅延させ、ヌ
ードマウスの生存を長期化することを示した。ｖＭＢ１２及び１３はｖＭＢ１４
よりも有効であった（図１６）： Ｅ１Ｂの発現は、コットンラットの肺において、アデノウイルスによる炎症性
損傷の誘発に必要である（Ginsberg, H. S., et al 1999. PNAS 96, 10409-11）
。炎症反応の危険性を低下させるため、Ｔｃｆ部位をＥ１Ｂプロモーターにクロ
ーン化した。生じるウイルスはＥ１Ｂ遺伝子産生物を結腸腫瘍細胞において発現
し、正常細胞においては発現しないはずである。炎症反応の危険性を低下させる
ことに加えて、これは、Ｅ１Ｂ ５５ｋがＥ２後期ｍＲＮＡの外部移行に必要で
あることが報告されているため、Ｅ２後期ｍＲＮＡからのＥ２遺伝子産生物の発
現を減少させることも可能である。ｖＭＢ１４骨格にクローン化された変異体Ｅ
１Ｂプロモーターを有するウイルスはｖＭＢ１９と呼ばれる。野生型、ｖＭＢ１
４及びｖＭＢ１９をＳＷ４８０及びＨ１２９９細胞において試験した。感染の２
４時間後に細胞を収集した。Ｅ１Ｂ及びＤＢＰのウェスタンブロットは、Ｅ１Ｂ
５５ｋがＳＷ４８０においては発現するが、Ｈ１２９９においては発現しない
ことを示した。ｖＭＢ１４及び１９はＨ１２９９細胞において同様のＤＢＰ発現
をもたらし、この細胞系において少なくとも２４時間の時点ではＤＢＰ後期ｍＲ
ＮＡの外部移行に対するＥ１Ｂの高い効果は存在しないことが示唆される： 感染の２４時間後のTaqman ＲＴ−ＰＣＲ転写アッセイでは、ｖＭＢ１９がＳ
Ｗ４８０細胞においては野生型レベルのＥ１Ｂ、Ｅ２及びＥ３ ｍＲＮＡを有す
るが、Ｈ１２９９細胞においてはレベルが低下していることが確認された（図１
７、１８及び１９）： 感染の２４時間後に、線維プライマーを用いるSybr green 定量ＰＣＲによっ
てウイルスＤＮＡの複製を試験した。これは、両変異体ウイルスの複製がＳＷ４
８０細胞においては正常であるが、Ｈ１２９９細胞においては不完全であること
を示した。両変異体ウイルスは匹敵するものであり、ここでもやはり、この実験
においては、Ｅ１Ｂ ５５ｋの発現の証明された減少（ｄｏｃｕｍｅｎｔｅｄ
ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）には顕著な効果がないことが示唆される（図２０）： ｖＭＢ１９がイン・ビボの設定において正常細胞におけるＤＮＡの複製の減少
を示すかどうかを決定するため、コットンラットの鼻腔内にウイルスを感染させ
、３日後に肺からＤＮＡを抽出した。ラットは各ウイルスについて５匹の群で処
理した。Ｅ４プライマーを用いるTaqman 定量ＰＣＲは、野生型と比較して、ｖ
ＭＢ１９でウイルスＤＮＡ濃度の中央値５０倍の減少を示した。 結論：ｖＭＢ１２、１３、１４及び１９ これらのデータは以下のことを示す。
９９及びＷＩ３８細胞において試験した。感染の２４時間後に細胞を収集した。
ＤＢＰのウェスタンブロットは、ＳＷ４８０においては少なくとも野生型による
ものと同程度に変異体ウイルスによってＤＢＰが発現するが、Ｈ１２９９及びＷ
Ｉ３８細胞においてはかなり劣ることを示した： Taqman ＲＴ−ＰＣＲ転写アッセイ（図１０を参照）は、変異体ウイルスがＳ
Ｗ４８０細胞においては野生型レベルのＥ２ ｍＲＮＡを有するものの、Ｈ１２
９９細胞においてはレベルが減少することを示す： Taqmanアッセイは、さらに、ｖＭＢ１４におけるＥ３プロモーターの突然変異
がＥ２（図１０）及びＥ３ ｍＲＮＡ（図１１）の両者のレベルを低下させるこ
とを示す： ＤＮＡの複製がプロモーターの突然変異によって影響を受けるかどうかを決定
するため、ＳＷ４８０及びＨ１２９９細胞に野生型、ｖＭＢ１２、１３及び１４
を感染させ、２４時間で収集した。線維領域に由来するプライマーを用いるSybr
green ＰＣＲアッセイは、ＤＮＡの複製がＳＷ４８０においては正常であるが
、Ｈ１２９９細胞においては減少することを示す（図１２）： ウイルスの複製がプロモーターの突然変異によって影響を受けるかどうかを決
定するため、ＳＷ４８０及びＨ１２９９細胞に野生型、ｖＭＢ１２、１３及び１
４を感染させ、４８時間で収集した。凍結−乾燥によって細胞を溶解し、ＳＷ４
８０細胞でのプラーク形成アッセイによってウイルスの産生を測定した。これは
、変異体ウイルスがＳＷ４８０においては野生型に匹敵するか、又はそれを上回
るが、Ｈ１２９９及びＷＩ３８細胞においては不完全であることを示した（図１
３を参照）： ウイルスが結腸細胞に対する選択的毒性を示すかどうかを決定するため、細胞
変性効果アッセイをＳＷ４８０及びＨ１２９９細胞に対して行った。これは、変
異体ウイルスがＳＷ４８０細胞においては野生型に匹敵する（図１４）ことを示
したが、Ｈ１２９９細胞においては細胞変性効果の低下を示した（図１５）： ウイルスがイン・ビボで治療効果を示すかどうかを決定するため、それらをヌ
ードマウスにおけるＣｏ１１５結腸カルチノーマ異種移植片に注入した。これは
、全てのウイルスの腫瘍内注入が異種移植された結腸腫瘍の成長を遅延させ、ヌ
ードマウスの生存を長期化することを示した。ｖＭＢ１２及び１３はｖＭＢ１４
よりも有効であった（図１６）： Ｅ１Ｂの発現は、コットンラットの肺において、アデノウイルスによる炎症性
損傷の誘発に必要である（Ginsberg, H. S., et al 1999. PNAS 96, 10409-11）
。炎症反応の危険性を低下させるため、Ｔｃｆ部位をＥ１Ｂプロモーターにクロ
ーン化した。生じるウイルスはＥ１Ｂ遺伝子産生物を結腸腫瘍細胞において発現
し、正常細胞においては発現しないはずである。炎症反応の危険性を低下させる
ことに加えて、これは、Ｅ１Ｂ ５５ｋがＥ２後期ｍＲＮＡの外部移行に必要で
あることが報告されているため、Ｅ２後期ｍＲＮＡからのＥ２遺伝子産生物の発
現を減少させることも可能である。ｖＭＢ１４骨格にクローン化された変異体Ｅ
１Ｂプロモーターを有するウイルスはｖＭＢ１９と呼ばれる。野生型、ｖＭＢ１
４及びｖＭＢ１９をＳＷ４８０及びＨ１２９９細胞において試験した。感染の２
４時間後に細胞を収集した。Ｅ１Ｂ及びＤＢＰのウェスタンブロットは、Ｅ１Ｂ
５５ｋがＳＷ４８０においては発現するが、Ｈ１２９９においては発現しない
ことを示した。ｖＭＢ１４及び１９はＨ１２９９細胞において同様のＤＢＰ発現
をもたらし、この細胞系において少なくとも２４時間の時点ではＤＢＰ後期ｍＲ
ＮＡの外部移行に対するＥ１Ｂの高い効果は存在しないことが示唆される： 感染の２４時間後のTaqman ＲＴ−ＰＣＲ転写アッセイでは、ｖＭＢ１９がＳ
Ｗ４８０細胞においては野生型レベルのＥ１Ｂ、Ｅ２及びＥ３ ｍＲＮＡを有す
るが、Ｈ１２９９細胞においてはレベルが低下していることが確認された（図１
７、１８及び１９）： 感染の２４時間後に、線維プライマーを用いるSybr green 定量ＰＣＲによっ
てウイルスＤＮＡの複製を試験した。これは、両変異体ウイルスの複製がＳＷ４
８０細胞においては正常であるが、Ｈ１２９９細胞においては不完全であること
を示した。両変異体ウイルスは匹敵するものであり、ここでもやはり、この実験
においては、Ｅ１Ｂ ５５ｋの発現の証明された減少（ｄｏｃｕｍｅｎｔｅｄ
ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）には顕著な効果がないことが示唆される（図２０）： ｖＭＢ１９がイン・ビボの設定において正常細胞におけるＤＮＡの複製の減少
を示すかどうかを決定するため、コットンラットの鼻腔内にウイルスを感染させ
、３日後に肺からＤＮＡを抽出した。ラットは各ウイルスについて５匹の群で処
理した。Ｅ４プライマーを用いるTaqman 定量ＰＣＲは、野生型と比較して、ｖ
ＭＢ１９でウイルスＤＮＡ濃度の中央値５０倍の減少を示した。 結論：ｖＭＢ１２、１３、１４及び１９ これらのデータは以下のことを示す。
【０１１６】 １．Ｅ２プロモーターでのＴｃｆの挿入は生存可能なアデノウイルスの産生に
適合する ２．変異体Ｅ２プロモーターは非結腸腫瘍細胞よりも結腸腫瘍細胞において活
性である ３．Ｅ３プロモーターの突然変異は非結腸腫瘍細胞におけるＥ２活性をさらに
低下させる ４．これらの突然変異は非結腸腫瘍細胞におけるウイルスＤＮＡの複製、ウイ
ルスの複製及び細胞変性効果を減少させる ５．変異体ウイルスはヌードマウスにおける異種移植片の成長を損なう ６．Ｅ１ＢプロモーターでのＴｃｆ部位の挿入は生存可能なアデノウイルスの
産生に適合する ７．変異体Ｅ１Ｂプロモーターは非結腸腫瘍細胞よりも結腸腫瘍細胞において
活性である ８．これまで試験されたモデルにおいて、Ｅ１Ｂプロモーターの突然変異はウ
イルスの複製に影響を及ばさない ９．Ｅ１Ｂ及びＥ２／Ｅ３プロモーターの突然変異を組み合わせて有するウイ
ルスはコットンラットの肺における複製の減少を示し、Ｅ２／Ｅ３突然変異のみ
を有するウイルスよりも生成する炎症性損傷が少ないものと期待される。
適合する ２．変異体Ｅ２プロモーターは非結腸腫瘍細胞よりも結腸腫瘍細胞において活
性である ３．Ｅ３プロモーターの突然変異は非結腸腫瘍細胞におけるＥ２活性をさらに
低下させる ４．これらの突然変異は非結腸腫瘍細胞におけるウイルスＤＮＡの複製、ウイ
ルスの複製及び細胞変性効果を減少させる ５．変異体ウイルスはヌードマウスにおける異種移植片の成長を損なう ６．Ｅ１ＢプロモーターでのＴｃｆ部位の挿入は生存可能なアデノウイルスの
産生に適合する ７．変異体Ｅ１Ｂプロモーターは非結腸腫瘍細胞よりも結腸腫瘍細胞において
活性である ８．これまで試験されたモデルにおいて、Ｅ１Ｂプロモーターの突然変異はウ
イルスの複製に影響を及ばさない ９．Ｅ１Ｂ及びＥ２／Ｅ３プロモーターの突然変異を組み合わせて有するウイ
ルスはコットンラットの肺における複製の減少を示し、Ｅ２／Ｅ３突然変異のみ
を有するウイルスよりも生成する炎症性損傷が少ないものと期待される。
【０１１７】 参考文献
【０１１８】
【表２】
【０１１９】
【０１２０】
【０１２１】
【０１２２】
【０１２３】
【０１２４】
【配列表】
【図１】 図１は、本発明の好ましいアデノウイルスにおいて転写因子部位が挿入されて
いる野生型Ｅ２領域の位置を示す。
いる野生型Ｅ２領域の位置を示す。
【図２】 図２は、好ましいウイルスにおけるＥ３領域の野生型ウイルスへの変化を示す
。
。
【図３】 図３は、野生型ウイルスのＥ２／Ｅ３領域を示す。
【図４】 図４は、さらに好ましいウイルスにおけるＥ２後期プロモーターの野生型への
変化を示す。
変化を示す。
【図５】 図５は、本発明のウイルスの産生において行われる工程を説明する図を示す。
【図６】 図６は、プラスミドｐＮＫＢＡＣ３９の図示である。
【図７】 図７は、プラスミドｐ６８０の図示である。
【図８】 図８は、アデノウイルスＤＮＡ（Ａ）又はヒトゲノムＤＮＡ（負荷対照Ｂ）で
探索したウイルス感染細胞のスロット・ブロットである。
探索したウイルス感染細胞のスロット・ブロットである。
【図９】 図９は、ウイルス感染細胞に由来するウイルスＤＮＡの定量的ＰＣＲの結果の
グラフ図である。
グラフ図である。
【図１０】 図１０は、Taqman ＲＴ−ＰＣＲによって測定した、野生型Ａｄ５、並びに本
発明のｖＭＢ１２、ｖＭＢ１３及びｖＭＢ１４に感染したＳＷ４８０及びＨ１２
９９細胞系におけるＥ２発現を示すヒストグラムである。
発明のｖＭＢ１２、ｖＭＢ１３及びｖＭＢ１４に感染したＳＷ４８０及びＨ１２
９９細胞系におけるＥ２発現を示すヒストグラムである。
【図１１】 図１１は、Taqman ＲＴ−ＰＣＲによって測定した、野生型Ａｄ５、並びに本
発明のｖＭＢ１２、ｖＭＢ１３及びｖＭＢ１４に感染したＳＷ４８０及びＨ１２
９９細胞系におけるＥ３発現を示すヒストグラムである。
発明のｖＭＢ１２、ｖＭＢ１３及びｖＭＢ１４に感染したＳＷ４８０及びＨ１２
９９細胞系におけるＥ３発現を示すヒストグラムである。
【図１２】 図１２は、Taqman ＲＴ−ＰＣＲによって測定した、ＳＷ４８０及びＨ１２９
９細胞系における野生型Ａｄ５、並びに本発明のｖＭＢ１２、ｖＭＢ１３及びｖ
ＭＢ１４のＤＮＡ複製を示すヒストグラムである。
９細胞系における野生型Ａｄ５、並びに本発明のｖＭＢ１２、ｖＭＢ１３及びｖ
ＭＢ１４のＤＮＡ複製を示すヒストグラムである。
【図１３】 図１３は、ＳＷ４８０、Ｈ１２９９及びＷＩ３８（線維芽細胞）細胞系におけ
る野生型Ａｄ５、並びに本発明のｖＭＢ１２、ｖＭＢ１３及びｖＭＢ１４でのバ
ーストサイズ（任意単位）を示すヒストグラムである。
る野生型Ａｄ５、並びに本発明のｖＭＢ１２、ｖＭＢ１３及びｖＭＢ１４でのバ
ーストサイズ（任意単位）を示すヒストグラムである。
【図１４】 図１４は、ＳＷ４８０における野生型Ａｄ５、並びに本発明のｖＭＢ１２、ｖ
ＭＢ１３及びｖＭＢ１４のＣＰＥの結果％ｖ粒子／細胞を示すグラフである。
ＭＢ１３及びｖＭＢ１４のＣＰＥの結果％ｖ粒子／細胞を示すグラフである。
【図１５】 図１５は、Ｈ１２９９における野生型Ａｄ５、並びに本発明のｖＭＢ１２、ｖ
ＭＢ１３及びｖＭＢ１４のＣＰＥの結果％ｖ粒子／細胞を示すグラフである。
ＭＢ１３及びｖＭＢ１４のＣＰＥの結果％ｖ粒子／細胞を示すグラフである。
【図１６】 図１６は、Ｃｏ１１５異種移植片におけるバッファ、ｖＭＢ１２、ｖＭＢ１３
及びｖＭＢ１４の投与後の腫瘍容積ｖ日数のプロットである。
及びｖＭＢ１４の投与後の腫瘍容積ｖ日数のプロットである。
【図１７】 図１７は、ｗｔ Ａｄ５、本発明のｖＭＢ１４及びｖＭＢ１９が感染したＳＷ
４８０及びＨ１２９９細胞系におけるＥ１Ｂ−５５ｋの発現を示すヒストグラム
である。
４８０及びＨ１２９９細胞系におけるＥ１Ｂ−５５ｋの発現を示すヒストグラム
である。
【図１８】 図１８、１９及び２０は、それぞれ、ＳＷ４８０及びＨ１２９９細胞における
Ｅ２及びＥ３の早期発現並びにＤＮＡ複製のヒストグラムである。
Ｅ２及びＥ３の早期発現並びにＤＮＡ複製のヒストグラムである。
【図１９】 図１８、１９及び２０は、それぞれ、ＳＷ４８０及びＨ１２９９細胞における
Ｅ２及びＥ３の早期発現並びにＤＮＡ複製のヒストグラムである。
Ｅ２及びＥ３の早期発現並びにＤＮＡ複製のヒストグラムである。
【図２０】 図１８、１９及び２０は、それぞれ、ＳＷ４８０及びＨ１２９９細胞における
Ｅ２及びＥ３の早期発現並びにＤＮＡ複製のヒストグラムである。
Ｅ２及びＥ３の早期発現並びにＤＮＡ複製のヒストグラムである。
【図２１】 図２１は、本発明の好ましい構築体又はウイルスにおけるＡｄ５と比較したＥ
ＩＢプロモーターの変化のものである。
ＩＢプロモーターの変化のものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA32 CA04 DA02 HA17 4B065 AA93X AA95Y AB01 CA29 CA44 4C084 AA02 AA03 AA13 AA17 BA44 CA01 CA53 MA17 MA66 NA14 ZB262 ZC412 4C087 AA01 AA02 BC83 CA09 CA12 MA17 MA66 NA14 ZB26 ZC41
Claims (36)
- 【請求項１】 ヒト又は動物の腫瘍細胞において複製が可能であり、かつそのような腫瘍細胞
を死に至らしめるウイルスをコードするウイルスＤＮＡ構築体であって、１種類
またはそれ以上の選択された転写因子結合部位を、１種類またはそれ以上の早期
ウイルス性タンパク質遺伝子読み取り枠と共に、該選択された転写因子の存在下
でこれらの読み取り枠の発現を促進するような作動的な位置に含むことを特徴と
し、それらの読み取り枠のタンパク質産生物がウイルス構築体の核酸複製に機構
的に直接関与し、選択された転写因子結合部位が、同じ型の正常ヒト又は動物細
胞に対してヒト又は動物腫瘍細胞においてレベル又は活性が増加している転写因
子のためのものである、前記ウイルスＤＮＡ構築体。 - 【請求項２】 野生型ウイルスの配列に相当する核酸配列を有する請求項１に記載のウイルス
ＤＮＡ構築体であって、１つまたはそれ以上の選択された転写因子結合部位で置
換されている１つまたはそれ以上の野生型転写因子結合部位を有することを特徴
とし、これらの選択された部位は早期遺伝子の発現を制御する１つまたはそれ以
上のプロモーター領域において該選択された転写因子の存在下での発現を促進す
るように作動的に位置し、それらの遺伝子のタンパク質産生物はウイルスの核酸
複製に機構的に直接関与し、及び選択された転写因子結合部位は、同じ型の正常
ヒト又は動物細胞に対してヒト又は動物腫瘍細胞においてレベル又は活性が増加
している転写因子のためのものである、前記ウイルスＤＮＡ構築体。 - 【請求項３】 選択された転写因子結合部位が原因癌遺伝子突然変異によって活性又はレベル
が特異的に増加する転写因子のものであることを特徴とする、請求項１又は２に
記載のウイルスＤＮＡ構築体。 - 【請求項４】 核酸配列が、早期ウイルス遺伝子の発現を制御するように作動的に位置する選
択された転写因子結合部位を有する、アデノウイルス、レンチウイルス、ポリオ
ーマウイルス、ワクチニアウイルス、ヘルペスウイルス又はパルボウイルスのゲ
ノムのものに相当することを特徴とする、請求項２又は３に記載の構築体。 - 【請求項５】 核酸配列が、選択された部位を除いて、アデノウイルスＡｄ５、Ａｄ４０もし
くはＡｄ４１のゲノムのものに相当するか、又は１５ないし２５個のリジンが末
端に付加されていてもよい、Ａｄ５、Ａｄ４０もしくはＡｄ４１に由来する線維
タンパク質をコードするＤＮＡを組み込むことを特徴とする、請求項１ないし４
のいずれか１つに記載の構築体。 - 【請求項６】 腫瘍特異的転写因子結合部位によって制御される遺伝子がＤＮＡポリメラーゼ
、ＤＮＡ末端タンパク質及び／又はＤＮＡ結合タンパク質であることを特徴とす
る、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の構築体。 - 【請求項７】 核酸配列が、腫瘍細胞特異的転写因子結合部位で置換されている野生型Ｅ２早
期プロモーター転写因子結合部位を有するアデノウイルスのものに相当すること
を特徴とする、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の構築体。 - 【請求項８】 機能的ウイルスＲＮＡ移行能力をコードすることを特徴とする、請求項１ない
し７のいずれか１項に記載の構築体。 - 【請求項９】 Ｅ１Ｂ ５５Ｋ遺伝子が機能的及び／又は無傷であるＥ１領域を有する、請求
項１ないし８のいずれか１項に記載の構築体。 - 【請求項１０】 野生型部位の代わりに用いられる腫瘍特異的転写因子結合部位がＴｃｆ−４、
ＲＢＰＪκ、Ｇｌｉ−１、ＨＩＦ１アルファ及びテロメラーゼプロモーター結合
部位から選択されることを特徴とする、請求項１ないし９に記載の構築体。 - 【請求項１１】 置換された転写因子結合部位が癌遺伝子ＡＰＣ及びβ−カテニン変異体を含む
腫瘍細胞において選択的に活性化されることを特徴とする、請求項１ないし１０
のいずれか１項に記載の構築体。 - 【請求項１２】 置換部位が単一又は複数のＴｃｆ−４結合部位配列であることを特徴とする、
請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の構築体。 - 【請求項１３】 置換プロモーター部位の各々に２ないし１２のＴｃｆ−４結合部位配列を含む
ことを特徴とする請求項１２に記載の構築体。 - 【請求項１４】 その配列が、Ｅ３プロモーターのＮＦ１、ＮＦκＢ、ＡＰ１及びＡＴＦ領域に
おける１つまたはそれ以上の残基に突然変異を有するアデノウイルスゲノムのも
のに相当することを特徴とする、請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の構
築体。 - 【請求項１５】 突然変異がＥ３プロモーターの活性によって生じるＥ２遺伝子転写を減少させ
ることを特徴とする、請求項１４に記載の構築体。 - 【請求項１６】 突然変異が、いかなるウイルス性タンパク質の推定タンパク質配列も変更はし
ないが、１種類またはそれ以上のウイルスプロモーターの活性を変更する沈黙突
然変異であることを特徴とする、請求項１４又は１５に記載の構築体。 - 【請求項１７】 その配列が、コーディング配列が重複していないＥ２早期プロモーター内の領
域が複数のＴｃｆ−４結合部位配列で置換されているアデノウイルスゲノムのも
のに相当することを特徴とする、請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の構
築体。 - 【請求項１８】 その配列が、Ｅ３プロモーター内の転写因子結合部位が改変又は欠失されてい
るアデノウイルスゲノムのものに相当することを特徴とする、請求項１ないし１
７のいずれか１項に記載の構築体。 - 【請求項１９】 その配列が、Ｅ２後期プロモーターが沈黙突然変異で不活性化されているアデ
ノウイルスゲノムのものに相当することを特徴とする、請求項１ないし１８項の
いずれか１項に記載の構築体 - 【請求項２０】 請求項１ないし１９のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築体を含むか、又はそれ
によってコードされるウイルス。 - 【請求項２１】 治療において用いるための、１種類またはそれ以上の任意の非野生型非細胞毒
性マーカータンパク質以外には野生型タンパク質のみをコードするウイルス。 - 【請求項２２】 治療において用いるための、請求項１ないし２０のいずれか１項に記載のウイ
ルスＤＮＡ構築体、又はウイルス。 - 【請求項２３】 治療が新生物を有する患者のものであることを特徴とする、請求項２１又は２
２に記載のウイルスＤＮＡ構築体、又はウイルス。 - 【請求項２４】 １種類またはそれ以上の任意の非野生型非細胞毒性マーカータンパク質以外に
は野生型タンパク質のみをコードするウイルスＤＮＡ構築体、又はウイルスの、
新生物を治療するための医薬の製造における使用。 - 【請求項２５】 請求項１ないし２２のいずれか１項に記載のウイルス構築体、又はウイルスの
、新生物を治療するための医薬の製造における使用。 - 【請求項２６】 １種類またはそれ以上の任意の非野生型非細胞毒性マーカータンパク質以外に
は野生型タンパク質のみをコードするウイルスＤＮＡ構築体、又はそれらによっ
てコードされるウイルスを生理学的に許容し得る担体と共に含む医薬組成物であ
って、該ＤＮＡ又はそれらによってコードされるウイルスの存在を除いて、無菌
で発熱物質を含まない医薬組成物。 - 【請求項２７】 請求項１ないし２１のいずれか１項に記載のウイルス構築体、又はウイルスを
生理学的に許容し得る担体と共に含む組成物。 - 【請求項２８】 ウイルス構築体又はそれらによってコードされるウイルスの存在を除いて、無
菌で発熱物質を含まないことを特徴とする、請求項２７に記載の組成物。 - 【請求項２９】 担体が生理学的に許容し得る生理食塩水であることを特徴とする、請求項２７
ないし２９のいずれか１項に記載の組成物。 - 【請求項３０】 請求項１ないし１９のいずれか１項に記載のウイルスＤＮＡ構築体又はそれら
によってコードされるウイルスの製造方法であって、遺伝子の転写を制御する１
つまたはそれ以上の野生型転写因子結合部位を有し、該遺伝子がウイルス核酸の
複製に直接機構的に関与するタンパク質産生物を有するゲノムを、これらのうち
の１つまたはそれ以上が腫瘍特異的転写因子結合部位によって置換されるように
形質転換することを含むことを特徴とする、前記方法。 - 【請求項３１】 ウイルスゲノムがギャップ修復により、環状ＹＡＣ／ＢＡＣにおいて、酵母内
でクローン化されることを特徴とする、請求項３０に記載の方法。 - 【請求項３２】 ゲノムが２工程遺伝子置換によって改変されることを特徴とする、請求項３０
又は３１に記載の方法。 - 【請求項３３】 ウイルス構築体ＤＮＡを産生するために改変ゲノムを原核生物に移入すること
を特徴とする、請求項３０、３１又は３２に記載の方法。 - 【請求項３４】 ウイルスの製造方法であって、請求項３０ないし３３のいずれか１項に記載の
方法によって産生されたウイルス構築体ＤＮＡを、ウイルスを産生させるために
哺乳動物細胞に移入することを特徴とする、前記方法。 - 【請求項３５】 新生物の患者を治療するための方法であって、１種類またはそれ以上の任意の
非野生型非毒性マーカータンパク質以外は野生型タンパク質のみをコードするウ
イルスを、新生物を含むか、もしくはそれに限定される患者の組織に感染させ、
及び新生物細胞が殺されるように複製させる、前記方法。 - 【請求項３６】 新生物の患者を治療するための方法であって、請求項１ないし２２のいずれか
１項に記載のウイルスＤＮＡ構築体又はウイルスを、新生物を含むか、もしくは
それに限定される患者の組織に感染させ、及び新生物細胞が殺されるように複製
させる、前記方法。
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| US5998205A (en) * | 1994-11-28 | 1999-12-07 | Genetic Therapy, Inc. | Vectors for tissue-specific replication |
| US20030026789A1 (en) * | 1995-05-03 | 2003-02-06 | Richard J. Gregory | Gene therapy using replication competent targeted adenoviral vectors |
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| WO1998013508A1 (en) * | 1996-09-24 | 1998-04-02 | Dana-Farber Cancer Institute | Method of targeting malignant cells using an e2f responsive promoter |
| US6403370B1 (en) * | 1997-02-10 | 2002-06-11 | Genstar Therapeutics Corporation | Oncolytic/immunogenic complementary-adenoviral vector system |
| AU744725B2 (en) * | 1997-03-03 | 2002-02-28 | Cold Genesys, Inc. | Adenovirus vectors containing heterologous transcription regulatory elements and methods of using same |
| US5851775A (en) * | 1997-03-20 | 1998-12-22 | Johns Hopkins University | β-catenin, Tcf-4, and APC interact to prevent cancer |
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