JP2002539218A - 神経再生を促進する組成物 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
Ｓｌｉｔ-Ｎポリペプチドはインビトロ又はインビボで軸索分岐及び神経再生を促進するのに使用される。治療的有効量のＳｌｉｔ-Ｎポリペプチド、製薬的に許容可能な賦形剤、及び／又は向神経活性剤を含み、特にＮＧＦのようなニューロトロフィンを含有する製薬的組成物はニューロパシーの治療に使用される。
Description
【０００１】 （発明の概要） （発明の分野） この発明の分野は神経再生を促進するための組成物である。 （背景） 脊椎動物と無脊椎動物の両方において、多くの神経細胞が、１次軸索主幹から
２次軸索側枝(又は分岐)を突起させることによって複数の標的を神経支配する。
軸索分岐起始又は伸展の分子的制御因子を同定するために、我々はこれらの軸索
による広範な分岐の伸長と形成を促進する胎児脊髄及び出生後と生体の脳の摘出
物における活性を確認した。ウシ脳摘出物からの活性の生化学精製を用いて、我
々は主要活性成分としてＳｌｉｔ-２のアミノ末端断片を同定した(Wang等, 1999
, Cell 96, 771-784参照)。我々は、Ｓｌｉｔタンパク質の末端断片(Kidd等, (1
999)Cell96, 785-794; Brose等, (1999)Cell, 795-806; 及びLi等, (1999)Cell,
807-818を参照)が神経回路の確立と再構築の間軸索側枝の正の制御因子として
機能することができ、これらのタンパク質の活性がＮＧＦのような他の向神経剤
とインビトロ及びインビボで相互作用しうることを開示した。我々はＳｌｉｔ-
Ｎタンパク質が、軸索連絡の初期発達のときだけでなく、成体の神経系で起こる
神経連絡の通常の可塑的再構築の間もまた、軸索の側枝生成を調節する機能を果
たすことができることを発見した。脊髄損傷に続いて、Ｓｌｉｔ-Ｎタンパク質
は、ＣＮＳ灰白質へ線維管からの軸索の側枝生成を刺激することにより再生を誘
発し、及び／又は抑制条件での軸索再成長を誘発することができ、線維管に損傷
を伴う麻痺を軽減するのに役立つ。
２次軸索側枝(又は分岐)を突起させることによって複数の標的を神経支配する。
軸索分岐起始又は伸展の分子的制御因子を同定するために、我々はこれらの軸索
による広範な分岐の伸長と形成を促進する胎児脊髄及び出生後と生体の脳の摘出
物における活性を確認した。ウシ脳摘出物からの活性の生化学精製を用いて、我
々は主要活性成分としてＳｌｉｔ-２のアミノ末端断片を同定した(Wang等, 1999
, Cell 96, 771-784参照)。我々は、Ｓｌｉｔタンパク質の末端断片(Kidd等, (1
999)Cell96, 785-794; Brose等, (1999)Cell, 795-806; 及びLi等, (1999)Cell,
807-818を参照)が神経回路の確立と再構築の間軸索側枝の正の制御因子として
機能することができ、これらのタンパク質の活性がＮＧＦのような他の向神経剤
とインビトロ及びインビボで相互作用しうることを開示した。我々はＳｌｉｔ-
Ｎタンパク質が、軸索連絡の初期発達のときだけでなく、成体の神経系で起こる
神経連絡の通常の可塑的再構築の間もまた、軸索の側枝生成を調節する機能を果
たすことができることを発見した。脊髄損傷に続いて、Ｓｌｉｔ-Ｎタンパク質
は、ＣＮＳ灰白質へ線維管からの軸索の側枝生成を刺激することにより再生を誘
発し、及び／又は抑制条件での軸索再成長を誘発することができ、線維管に損傷
を伴う麻痺を軽減するのに役立つ。
【０００２】 （本発明の概要） 本発明は軸索分岐と神経再生を促進する方法と組成物を提供する。該組成物は
Ｓｌｉｔ-Ｎ、Ｓｌｉｔ-２-Ｎ及びＳｌｉｔ-３-Ｎポリペプチドを含むＳｌｉｔ-
Ｎポリペプチドを含んでなる。Ｓｌｉｔ-ＮポリペプチドはＳｌｉｔタンパク質
のタンパク質分解断片であり、神経細胞軸索の伸長と分岐を促進する。従って、
本発明は１又は複数のＳｌｉｔ-Ｎポリペプチドの治療的有効量を含んでなる製
薬組成物もまた提供する。また、そのような組成物は製薬的に許容可能な賦形剤
及び／又は神経活性剤、特にNGFのようなニューロトロフィンを含みうる。Ｓｌ
ｉｔ-Ｎポリペプチドは一般に、Ｓｌｉｔ-Ｎポリペプチドをコードするコード化
領域を含む組換えポリヌクレオチドを発現する細胞から調製される。対象とする
方法は、軸索分岐又は突起を促進する方法であって、Ｓｌｉｔ-Ｎポリペプチド
の有効量を含んでなる組成物に神経細胞を接触させることを含んでなる方法と、
Ｓｌｉｔ-Ｎポリペプチドの治療的有効量を含んでなる組成物を投与することを
含んでなる神経障害を治療する方法を含む。
Ｓｌｉｔ-Ｎ、Ｓｌｉｔ-２-Ｎ及びＳｌｉｔ-３-Ｎポリペプチドを含むＳｌｉｔ-
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のタンパク質分解断片であり、神経細胞軸索の伸長と分岐を促進する。従って、
本発明は１又は複数のＳｌｉｔ-Ｎポリペプチドの治療的有効量を含んでなる製
薬組成物もまた提供する。また、そのような組成物は製薬的に許容可能な賦形剤
及び／又は神経活性剤、特にNGFのようなニューロトロフィンを含みうる。Ｓｌ
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領域を含む組換えポリヌクレオチドを発現する細胞から調製される。対象とする
方法は、軸索分岐又は突起を促進する方法であって、Ｓｌｉｔ-Ｎポリペプチド
の有効量を含んでなる組成物に神経細胞を接触させることを含んでなる方法と、
Ｓｌｉｔ-Ｎポリペプチドの治療的有効量を含んでなる組成物を投与することを
含んでなる神経障害を治療する方法を含む。
【０００３】 （本発明の特定の実施態様の説明） 以下に示す特定の実施態様と実施例の説明は、例示のために提供されるもので
、発明の限定をもたらすものではない。禁忌を示すか又は他に注記しない限り、
この説明と明細書全体を通して、「ａ」及び「ａｎ」という用語は「一」もしく
は「それ以上」を意味し、「又は」という用語は「及び／又は」を意味し、ポリ
ヌクレオチド配列は逆ストランド並びにここで記載される代替のバックボーンを
含むものと理解される。 組成物は、（１）脊髄損傷のような傷害や外傷に伴う神経系の修復の手助け、
及び（２）神経細胞又は軸索投射の肥大による神経系の機能障害、又は神経細胞
集団の他の機能障害、例えば糖尿病性神経障害において生じるものの軽減への用
途が発見されている。
、発明の限定をもたらすものではない。禁忌を示すか又は他に注記しない限り、
この説明と明細書全体を通して、「ａ」及び「ａｎ」という用語は「一」もしく
は「それ以上」を意味し、「又は」という用語は「及び／又は」を意味し、ポリ
ヌクレオチド配列は逆ストランド並びにここで記載される代替のバックボーンを
含むものと理解される。 組成物は、（１）脊髄損傷のような傷害や外傷に伴う神経系の修復の手助け、
及び（２）神経細胞又は軸索投射の肥大による神経系の機能障害、又は神経細胞
集団の他の機能障害、例えば糖尿病性神経障害において生じるものの軽減への用
途が発見されている。
【０００４】 Ｓｌｉｔ-ＮポリペプチドＳｌｉｔ-Ｎタンパク質を包含し、ここに記載したよ
うな細胞内及びインビボの方法で軸索分岐を促進する。Ｓｌｉｔタンパク質は向
神経活性タンパク質の技術的に認められたクラスである。開示した方法に使用さ
れる好ましいＳｌｉｔ-Ｎタンパク質は、哺乳動物Ｓｌｉｔ配列、好ましくはヒ
トＳｌｉｔ-１、ヒトＳｌｉｔ-２又はヒトＳｌｉｔ-３配列から誘導される。一
実施態様では、Ｓｌｉｔ-Ｎポリペプチドは組換えＳｌｉｔタンパク質を発現す
る細胞から誘導され、これは次いでＳｌｉｔタンパク質をタンパク質分解処理し
て、Ｓｌｉｔ-Ｎポリペプチドを形成する。いずれの経験的な機能発現／プロセ
シングシステムも使用されうるが、好ましくはセルベースシステム、例えば哺乳
動物ＣＨＯ又はＣＯＳ細胞が使用される。
うな細胞内及びインビボの方法で軸索分岐を促進する。Ｓｌｉｔタンパク質は向
神経活性タンパク質の技術的に認められたクラスである。開示した方法に使用さ
れる好ましいＳｌｉｔ-Ｎタンパク質は、哺乳動物Ｓｌｉｔ配列、好ましくはヒ
トＳｌｉｔ-１、ヒトＳｌｉｔ-２又はヒトＳｌｉｔ-３配列から誘導される。一
実施態様では、Ｓｌｉｔ-Ｎポリペプチドは組換えＳｌｉｔタンパク質を発現す
る細胞から誘導され、これは次いでＳｌｉｔタンパク質をタンパク質分解処理し
て、Ｓｌｉｔ-Ｎポリペプチドを形成する。いずれの経験的な機能発現／プロセ
シングシステムも使用されうるが、好ましくはセルベースシステム、例えば哺乳
動物ＣＨＯ又はＣＯＳ細胞が使用される。
【０００５】 あるいは、Ｓｌｉｔ-Ｎポリペプチドは、直接組換えＳｌｉｔ-Ｎポリペプチド
を発現する細胞から得てもよい。いずれの経験的な機能発現システムも用いるこ
とができ、これは充分に確立された市販の動物細胞(例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯ
Ｓ細胞、バキュロウィルスベース系等々）及び微生物系、例えば出芽酵母及び大
腸菌系を含む。発現作成物は、天然Ｓｌｉｔ-Ｎ配列の有するＳｌｉｔ-Ｎポリペ
プチドをコードする。そのような配列は、天然に処理されたＳｌｉｔタンパク質
の配列決定をすることにより容易に確認される：例えば組換えヒトＳｌｉｔ-２
が哺乳動物(ＣＯＳ)細胞で発現されると、〜１９０ｋＤでの全長タンパク質の遊
送に加えて、アミノ末端切断産物(Ｓｌｉｔ-２-Ｎ)は、ｐ１４０と同様に、〜１
４０ｋＤでの遊送が観察され、カルボキシル末端切断産物(Ｓｌｉｔ-２-Ｃ)は〜
５５-６０ｋＤでの遊送が観察される。ほとんどの全長タンパク質及びＳｌｉｔ-
２-Ｎは細胞膜に結合しているが、１ＭのＮａＣｌで抽出することができる。Ｃ
末端断片は、主に条件媒地に分泌される。Ｓｌｉｔ-２-Ｎの末端アミノ酸配列決
定は、標準的な方法で直接実施することができる。あるいは、Ｓｌｉｔ-２-Ｎ配
列は、Arg1117とThr1118の天然プロセッシング部位を明らかにするＳｌｉｔ-２-
Ｃのアミノ末端のアミノ酸配列から推測される。更に、天然Ｓｌｉｔ-Ｎ配列は
、ｈＳｌｉｔ-２-Ｎのような相同性を有する配列アラインメントにより予測する
ことができ、この場合、天然ｈＳｌｉｔ-２-Ｎ配列はMet1及びArg1117により結
合されている；例えばｈＳｌｉｔ-２-ＮのｄＳｌｉｔ-２(ショウジョウバエ)と
のアラインメントは、一致すると予測されるｄＳｌｉｔ-２-ＮがｄＳｌｉｔ-２
、Met1-Gln1111であることを明らかにする。そのような推測又は予測から導き出
された天然Ｓｌｉｔ-Ｎ配列は、直接アミノ酸配列分析で直接確認される。
を発現する細胞から得てもよい。いずれの経験的な機能発現システムも用いるこ
とができ、これは充分に確立された市販の動物細胞(例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯ
Ｓ細胞、バキュロウィルスベース系等々）及び微生物系、例えば出芽酵母及び大
腸菌系を含む。発現作成物は、天然Ｓｌｉｔ-Ｎ配列の有するＳｌｉｔ-Ｎポリペ
プチドをコードする。そのような配列は、天然に処理されたＳｌｉｔタンパク質
の配列決定をすることにより容易に確認される：例えば組換えヒトＳｌｉｔ-２
が哺乳動物(ＣＯＳ)細胞で発現されると、〜１９０ｋＤでの全長タンパク質の遊
送に加えて、アミノ末端切断産物(Ｓｌｉｔ-２-Ｎ)は、ｐ１４０と同様に、〜１
４０ｋＤでの遊送が観察され、カルボキシル末端切断産物(Ｓｌｉｔ-２-Ｃ)は〜
５５-６０ｋＤでの遊送が観察される。ほとんどの全長タンパク質及びＳｌｉｔ-
２-Ｎは細胞膜に結合しているが、１ＭのＮａＣｌで抽出することができる。Ｃ
末端断片は、主に条件媒地に分泌される。Ｓｌｉｔ-２-Ｎの末端アミノ酸配列決
定は、標準的な方法で直接実施することができる。あるいは、Ｓｌｉｔ-２-Ｎ配
列は、Arg1117とThr1118の天然プロセッシング部位を明らかにするＳｌｉｔ-２-
Ｃのアミノ末端のアミノ酸配列から推測される。更に、天然Ｓｌｉｔ-Ｎ配列は
、ｈＳｌｉｔ-２-Ｎのような相同性を有する配列アラインメントにより予測する
ことができ、この場合、天然ｈＳｌｉｔ-２-Ｎ配列はMet1及びArg1117により結
合されている；例えばｈＳｌｉｔ-２-ＮのｄＳｌｉｔ-２(ショウジョウバエ)と
のアラインメントは、一致すると予測されるｄＳｌｉｔ-２-ＮがｄＳｌｉｔ-２
、Met1-Gln1111であることを明らかにする。そのような推測又は予測から導き出
された天然Ｓｌｉｔ-Ｎ配列は、直接アミノ酸配列分析で直接確認される。
【０００６】 また、必須の軸索分岐促進活性を保持する限りは、コードされるＳｌｉｔ-Ｎ
ポリペプチドは天然Ｓｌｉｔ-Ｎ配列の欠失突然変異を含んでもよい。またコー
ドされるＳｌｉｔ-Ｎポリペプチドは、天然Ｓｌｉｔ-Ｎ配列に加えて、更なるＳ
ｌｉｔ又は非Ｓｌｉｔ領域を含む付加突然変異、１から２０、好ましくは１から
５の残基の置換、好ましくは天然Ｓｌｉｔ-Ｎ配列からの保存的な置換を含んで
なる置換突然変異、又は欠失、付加及び／又は置換の組み合わせ突然変異であっ
てもよい。そのような欠失、付加及び置換突然変異は、ここで記載した方法で容
易にスクリーニングされる。例えば、たくさんの活性Ｓｌｉｔ-Ｎ欠失、付加及
び置換突然変異が表１と表２に示される。
ポリペプチドは天然Ｓｌｉｔ-Ｎ配列の欠失突然変異を含んでもよい。またコー
ドされるＳｌｉｔ-Ｎポリペプチドは、天然Ｓｌｉｔ-Ｎ配列に加えて、更なるＳ
ｌｉｔ又は非Ｓｌｉｔ領域を含む付加突然変異、１から２０、好ましくは１から
５の残基の置換、好ましくは天然Ｓｌｉｔ-Ｎ配列からの保存的な置換を含んで
なる置換突然変異、又は欠失、付加及び／又は置換の組み合わせ突然変異であっ
てもよい。そのような欠失、付加及び置換突然変異は、ここで記載した方法で容
易にスクリーニングされる。例えば、たくさんの活性Ｓｌｉｔ-Ｎ欠失、付加及
び置換突然変異が表１と表２に示される。
【０００７】 表１．活性なＳｌｉｔ-Ｎ欠失変異体 Slit-Nポリペプチド 軸索分岐 Slit-Nポリペプチド 軸索分岐 活性 活性 hSlit-2-N(Met1-Pro1116) +++ dSlit-2-N(Met1-Pro1110) +++ hSlit-2-N(Met1-Leu1115) +++ dSlit-2-N(Met1-Tyr1109) +++ hSlit-2-N(Met1-Val1114) +++ dSlit-2-N(Met1-Met1108) +++ hSlit-2-N(Arg2-Arg1117) +++ dSlit-2-N(Ala2-Gln1111) +++ hSlit-2-N(Arg2-Pro1116) +++ dSlit-2-N(Ala2-Pro1110) +++ hSlit-2-N(Arg2-Leu1115) +++ dSlit-2-N(Ala2-Tyr1109) +++ hSlit-2-N(Arg2-Val1114) +++ dSlit-2-N(Ala2-Met1108) +++ hSlit-2-N(Gly3-Arg1117) +++ dSlit-2-N(Ala3-Gln1111) +++ hSlit-2-N(Gly3-Pro1116) +++ dSlit-2-N(Ala3-Pro1110) +++ hSlit-2-N(Gly3-Leu1115) +++ dSlit-2-N(Ala3-Tyr1109) +++
【０００８】 表２．Ｓｌｉｔ-Ｎ付加及び置換変異体活性 Slit-Ｎポリペプチド 軸索分岐 Slit-Ｎポリペプチド 軸索分
岐 （内部置換） 活性 (N/C末端付加) 活性 hSlit-2-N(Leu-Ile1115) +++ hSlit-2-N(+N-AspArgGly) +++ hSlit-2-N(Val-Ile1114) +++ hSlit-2-N(+C-His) +++ hSlit-2-N(Ser-Thr1110) +++ hSlit-2-N(+N-AspArgGly) +++ hSlit-2-N(Phe-Try1109) +++ hSlit-1-N(+C-His) +++ hSlit-2-N(Glu-Asp1108) +++ hSlit-1-N(+N-AspArgGly) +++ dSlit-2-N(Gln-Asn1111) +++ hSlit-1-N(+C-His) +++ dSlit-2-N(Tyr-Phe1109) +++ mSlit-2-N(+N-AspArgGly) +++ dSlit-2-N(Met-Ser1108) +++ mSlit-2-N(+C-His) +++ dSlit-2-N(Met-Ser1107) +++ mSlit-1-N(+C-AspArgGly) +++ dSlit-2-N(Ser-Thr1106) +++ mSlit-1-N(+C-HisHis) +++
岐 （内部置換） 活性 (N/C末端付加) 活性 hSlit-2-N(Leu-Ile1115) +++ hSlit-2-N(+N-AspArgGly) +++ hSlit-2-N(Val-Ile1114) +++ hSlit-2-N(+C-His) +++ hSlit-2-N(Ser-Thr1110) +++ hSlit-2-N(+N-AspArgGly) +++ hSlit-2-N(Phe-Try1109) +++ hSlit-1-N(+C-His) +++ hSlit-2-N(Glu-Asp1108) +++ hSlit-1-N(+N-AspArgGly) +++ dSlit-2-N(Gln-Asn1111) +++ hSlit-1-N(+C-His) +++ dSlit-2-N(Tyr-Phe1109) +++ mSlit-2-N(+N-AspArgGly) +++ dSlit-2-N(Met-Ser1108) +++ mSlit-2-N(+C-His) +++ dSlit-2-N(Met-Ser1107) +++ mSlit-1-N(+C-AspArgGly) +++ dSlit-2-N(Ser-Thr1106) +++ mSlit-1-N(+C-HisHis) +++
【０００９】 また目的のポリペプチドは、コードするポリペプチド、例えば天然コード化Ｓ
ｌｉｔ-Ｎ遺伝子及び当該分野で既知の遺伝子転写物から細胞系又は無細胞系(例
えば、Jermutus L,等, Curr Opin Biotechnol. 1998 Oct; 9(5):534-48)で発現
されるか、及び／又はコンピュータアルゴリズム(例えば、Holler等, (1993)Gen
e 136, 323-328; Martin等(1995)Gene154、150-166)により目的のポリペプチド
を逆翻訳することにより作成される選択発現システムに最適化されたポリヌクレ
オチド又はＳｌｉｔ-Ｎポリペプチド配列(「ＧＣＧ」ソフトウェア、ジェネティ
クスコンピュータグループ社、ウィスコンシン州マディソン)から作成される縮
重オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブで単離され得る。 従って、また本発明はＳｌｉｔ-Ｎポリペプチドをコードする天然及び合成の
配列ポリヌクレオチドを提供する。天然に生じるＳｌｉｔ-Ｎコード領域を有す
るそのようなポリヌクレオチドは単離される。つまり、好ましくは任意のフラク
ション中に存在する全核酸重量の少なくとも約０．５％、好ましくは少なくとも
約５％を構成する少なくともいくつか、自然状態では結合していない物質、通常
は天然染色体に結合されたもの以外のヌクレオチドに加えられた非天然配列又は
天然配列を含むことを意味する組換え体を伴わない。組換えポリヌクレオチドは
、天然染色体に結合したもの以外の配列がすぐ隣接し(つまり近接し)、または１
０ｋｂより少ない、好ましくは２ｋｂより少ない、より好ましくは５００塩基よ
り少ない、最も好ましくは１００塩基より少ない天然フランキング領域で、末端
になるか、または天然染色体に結合された以外の配列にすぐ隣接する天然フラン
キング領域が近接した状態で、末端でそのような天然配列を含む。核酸は通常Ｒ
ＮＡ又はＤＮＡであるが、ときに変更された安定性等を提供するために、他の塩
基を含んでなる核酸又はヌクレオチド類似物を使用することも有利である。
ｌｉｔ-Ｎ遺伝子及び当該分野で既知の遺伝子転写物から細胞系又は無細胞系(例
えば、Jermutus L,等, Curr Opin Biotechnol. 1998 Oct; 9(5):534-48)で発現
されるか、及び／又はコンピュータアルゴリズム(例えば、Holler等, (1993)Gen
e 136, 323-328; Martin等(1995)Gene154、150-166)により目的のポリペプチド
を逆翻訳することにより作成される選択発現システムに最適化されたポリヌクレ
オチド又はＳｌｉｔ-Ｎポリペプチド配列(「ＧＣＧ」ソフトウェア、ジェネティ
クスコンピュータグループ社、ウィスコンシン州マディソン)から作成される縮
重オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブで単離され得る。 従って、また本発明はＳｌｉｔ-Ｎポリペプチドをコードする天然及び合成の
配列ポリヌクレオチドを提供する。天然に生じるＳｌｉｔ-Ｎコード領域を有す
るそのようなポリヌクレオチドは単離される。つまり、好ましくは任意のフラク
ション中に存在する全核酸重量の少なくとも約０．５％、好ましくは少なくとも
約５％を構成する少なくともいくつか、自然状態では結合していない物質、通常
は天然染色体に結合されたもの以外のヌクレオチドに加えられた非天然配列又は
天然配列を含むことを意味する組換え体を伴わない。組換えポリヌクレオチドは
、天然染色体に結合したもの以外の配列がすぐ隣接し(つまり近接し)、または１
０ｋｂより少ない、好ましくは２ｋｂより少ない、より好ましくは５００塩基よ
り少ない、最も好ましくは１００塩基より少ない天然フランキング領域で、末端
になるか、または天然染色体に結合された以外の配列にすぐ隣接する天然フラン
キング領域が近接した状態で、末端でそのような天然配列を含む。核酸は通常Ｒ
ＮＡ又はＤＮＡであるが、ときに変更された安定性等を提供するために、他の塩
基を含んでなる核酸又はヌクレオチド類似物を使用することも有利である。
【００１０】 インサイツ用途においては、Ｓｌｉｔ-Ｎポリペプチドを含んでなる組成物が
、組成物の治療的活性と患者の耐性に適合するいくつかの効果的な経路で投与さ
れうる。ＣＮＳ投与のためには、ＣＮＳ脈管構造内皮細胞の間の接着接触を一過
性に開く薬物、及びそのような細胞を通じて転座を促進する化合物手術又は注射
による破損を含む血液脳関門を通る治療的通過の転移を促進するための様々な技
術が利用できる。投与の例示的経路は、直接注射または注入、例えば噴霧器を通
しての局所、気管内／経鼻投与、眼内に又は移植片例えばコラーゲンの様な線維
上に／内に、浸透圧ポンプ、適切に形質転換した細胞を含んでなる移植等を含む
。投与の特定の方法は、目的の治療組成物で線維、例えばコラーゲン線維、タン
パク質ポリマー等をコーティング、埋め込み、誘導体化することを含む。他の有
用な手段は、Otto等, (1989)J Neuroscience Research 22, 83-91とOtto及びUns
icker(1990)J Neuroscience 10, 1912-１921に記載されている。一般に、投与さ
れる量は、経験的に決定され、典型的には約１０から１０００μｇ/ｋｇレシピ
エントの範囲で、濃度は一般に投与される分量で約５０から５００μｇ/ｍｌの
範囲であろう。他の添加物も含んでもよく、例えば安定剤、殺菌剤等は、従来の
量で存在しうる。
、組成物の治療的活性と患者の耐性に適合するいくつかの効果的な経路で投与さ
れうる。ＣＮＳ投与のためには、ＣＮＳ脈管構造内皮細胞の間の接着接触を一過
性に開く薬物、及びそのような細胞を通じて転座を促進する化合物手術又は注射
による破損を含む血液脳関門を通る治療的通過の転移を促進するための様々な技
術が利用できる。投与の例示的経路は、直接注射または注入、例えば噴霧器を通
しての局所、気管内／経鼻投与、眼内に又は移植片例えばコラーゲンの様な線維
上に／内に、浸透圧ポンプ、適切に形質転換した細胞を含んでなる移植等を含む
。投与の特定の方法は、目的の治療組成物で線維、例えばコラーゲン線維、タン
パク質ポリマー等をコーティング、埋め込み、誘導体化することを含む。他の有
用な手段は、Otto等, (1989)J Neuroscience Research 22, 83-91とOtto及びUns
icker(1990)J Neuroscience 10, 1912-１921に記載されている。一般に、投与さ
れる量は、経験的に決定され、典型的には約１０から１０００μｇ/ｋｇレシピ
エントの範囲で、濃度は一般に投与される分量で約５０から５００μｇ/ｍｌの
範囲であろう。他の添加物も含んでもよく、例えば安定剤、殺菌剤等は、従来の
量で存在しうる。
【００１１】 一実施態様では、本発明は製薬的に許容可能な賦形剤、例えば無菌生理食塩水
又は製薬的に許容可能な組成物を形成する他の媒体、ゼラチン、油などと組み合
わせて対象のＳｌｉｔ-Ｎポリペプチドを投与する。組成物及び／又は化合物は
、単独で又は任意の簡便な担体、希釈剤等と組み合わせて投与されえ、そのよう
な投与は一回又は複数の投薬量でもたらされる。利用できる担体は、水と無毒性
の有機溶媒を含む固体、半流動又は液体媒体を含む。製薬的に許容可能な投薬ユ
ニット又はバルク形態のそのような組成物は、開示された用途が適切に標識され
うる、広く様々な容器に入れられ得る。投薬ユニットはカプセル、ピル等を含む
様々な容器に含有されうる。組成物は、有利には対象とする化合物と異なる他の
治療又は予防薬と組み合わせて効果的に併用及び／又は使用されうる。多くの場
合、対象の組成物と組み合わせた投与は、そのような薬剤の効果を高める。例え
ばGoodman & Gilman's The Phermacological Basis of Therapeutics, 9th Ed.,
1996, McGraw-Hillを参照されたい。そのような他の治療薬の例は表３のような
向神経活性剤を含む。
又は製薬的に許容可能な組成物を形成する他の媒体、ゼラチン、油などと組み合
わせて対象のＳｌｉｔ-Ｎポリペプチドを投与する。組成物及び／又は化合物は
、単独で又は任意の簡便な担体、希釈剤等と組み合わせて投与されえ、そのよう
な投与は一回又は複数の投薬量でもたらされる。利用できる担体は、水と無毒性
の有機溶媒を含む固体、半流動又は液体媒体を含む。製薬的に許容可能な投薬ユ
ニット又はバルク形態のそのような組成物は、開示された用途が適切に標識され
うる、広く様々な容器に入れられ得る。投薬ユニットはカプセル、ピル等を含む
様々な容器に含有されうる。組成物は、有利には対象とする化合物と異なる他の
治療又は予防薬と組み合わせて効果的に併用及び／又は使用されうる。多くの場
合、対象の組成物と組み合わせた投与は、そのような薬剤の効果を高める。例え
ばGoodman & Gilman's The Phermacological Basis of Therapeutics, 9th Ed.,
1996, McGraw-Hillを参照されたい。そのような他の治療薬の例は表３のような
向神経活性剤を含む。
【００１２】 表３ Ｓｌｉｔ-Ｎポリペプチドと組み合わせて使用されうる向神経活性剤 略記：ＮＧＦ、神経成長因子；ＮＴ、ニューロトロフィン；ＢＤＮＦ、脳由来神
経栄養因子；ＣＮＴＦ、毛様神経栄養因子；ＧＤＮＦ、グリア誘導神経栄養因子
；ＨＧＦ、肝細胞成長因子；ＦＧＦ、線維芽細胞増殖因子；ＬＩＦ、白血病抑制
因子；ＩＧＦ、インスリン様成長因子；ＩＬ、インターロイキン；ＥＧＦ、上皮
成長因子；ＴＧＦ、トランスフォーミング成長因子；ＰＤＧＦ、血小板由来増殖
因子；ＢＭＰ、骨形成タンパク質；ＮＣＡＭ、神経細胞接着分子
経栄養因子；ＣＮＴＦ、毛様神経栄養因子；ＧＤＮＦ、グリア誘導神経栄養因子
；ＨＧＦ、肝細胞成長因子；ＦＧＦ、線維芽細胞増殖因子；ＬＩＦ、白血病抑制
因子；ＩＧＦ、インスリン様成長因子；ＩＬ、インターロイキン；ＥＧＦ、上皮
成長因子；ＴＧＦ、トランスフォーミング成長因子；ＰＤＧＦ、血小板由来増殖
因子；ＢＭＰ、骨形成タンパク質；ＮＣＡＭ、神経細胞接着分子
【００１３】 （実施例） Ｉ．Ｓｌｉｔ-２-Ｎの活性及びＮＧＦ又はＳｌｉｔ-２-Ｎ単独に対するＮＧＦ/
Ｓｌｉｔ-２-Ｎの効果向上のインビトロ(セルベース)実証。 ウシ脳抽出物での活性を有するＳｌｉｔ-２-Ｎ共通分画は、それがこれらの抽
出物中の活性成分であることを示した。従って、我々は組換えｈＳｌｉｔ-２-Ｎ
(Ｃ末端ヒスチジンタグされたｈＳｌｉｔ-２を、ＣＯＳ細胞で発現させ、１Ｍの
ＮａＣｌを用いて抽出し、ＷＧＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製
し、純粋なＳｌｉｔ-２及びＳｌｉｔ-２-Ｎを得た；次いで、これらのタンパク
質を、（製造者の説明書に従い）Ni+-ＮTAアガロース(インビトロゲン社)でニッ
ケルアフィニティークロマトグラフィーによって分離し、Ｅ１４ＤＲＧ分析(Wan
g等, 1999, Cell 96, 771-784)でそれを試験した。精製されたｈＳｌｉｔ-２-Ｎ
は、１単位体につき〜１５０ｎｇの比活性で軸索の伸長及び枝形成を有意に促進
し、ベクタープラスミド単独で核酸移入されたＣＯＳ細胞から併行して精製され
たコントロール分画では、効果はなかった。更に、またウシ脳抽出物からのＷＧ
Ａ流動分画での相互活性は、ｈＳｌｉｔ-２-Ｎの活性を増強した。全長ｈＳｌｉ
ｔ-２は分析で活性を持たなかった。同様の実験は、マウス及びショウジョウバ
エを含む他の種からのＳｌｉｔ-２、並びにヒト、マウス及びショウジョウバエ
からのＳｌｉｔ-１及びＳｌｉｔ-３のの対応するＳｌｉｔ-Ｎアミノ末端断片も
またこの活性を有することを実証している。
Ｓｌｉｔ-２-Ｎの効果向上のインビトロ(セルベース)実証。 ウシ脳抽出物での活性を有するＳｌｉｔ-２-Ｎ共通分画は、それがこれらの抽
出物中の活性成分であることを示した。従って、我々は組換えｈＳｌｉｔ-２-Ｎ
(Ｃ末端ヒスチジンタグされたｈＳｌｉｔ-２を、ＣＯＳ細胞で発現させ、１Ｍの
ＮａＣｌを用いて抽出し、ＷＧＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製
し、純粋なＳｌｉｔ-２及びＳｌｉｔ-２-Ｎを得た；次いで、これらのタンパク
質を、（製造者の説明書に従い）Ni+-ＮTAアガロース(インビトロゲン社)でニッ
ケルアフィニティークロマトグラフィーによって分離し、Ｅ１４ＤＲＧ分析(Wan
g等, 1999, Cell 96, 771-784)でそれを試験した。精製されたｈＳｌｉｔ-２-Ｎ
は、１単位体につき〜１５０ｎｇの比活性で軸索の伸長及び枝形成を有意に促進
し、ベクタープラスミド単独で核酸移入されたＣＯＳ細胞から併行して精製され
たコントロール分画では、効果はなかった。更に、またウシ脳抽出物からのＷＧ
Ａ流動分画での相互活性は、ｈＳｌｉｔ-２-Ｎの活性を増強した。全長ｈＳｌｉ
ｔ-２は分析で活性を持たなかった。同様の実験は、マウス及びショウジョウバ
エを含む他の種からのＳｌｉｔ-２、並びにヒト、マウス及びショウジョウバエ
からのＳｌｉｔ-１及びＳｌｉｔ-３のの対応するＳｌｉｔ-Ｎアミノ末端断片も
またこの活性を有することを実証している。
【００１４】 ＩＩ．ＮＧＦ又はＳｌｉｔ-２-Ｎ単独に対するＮＧＦ/Ｓｌｉｔ-２-Ｎ治療の効
果の向上のインビトロ実証：糖尿病性多発神経障害の動物モデル。 動物モデルでの併用療法の研究は、糖尿病性多発神経障害の治療においてＮＧ
Ｆ又はＳｌｉｔ-２-Ｎのどちらかの単独使用に比べてＮＧＦ/Ｓｌｉｔ-２-Ｎ併
用療法の回復効果が向上することを実証している。研究方法は、Elias等, 1998,
Diabetes 47, 1637-１642に記載されている。 雄のマウス(Ins.Ｄｄ１)は、膵臓β細胞のヒトインシュリン遺伝子により制御
されるマウスＭＨＯクラスＩ抗原Ｄｄを有する(Jakobson等, 1981, Diabetes 30
, 797-803)。６月齢の糖尿病及び非糖尿病同腹子に、この神経障害における併用
ＮＧＦ/Ｓｌｉｔ-２-Ｎ療法の効果を判定するために、１ｍｇ/ｋｇのヒト組換え
ＮＧＦ(GN0330 GI02AR)、１ｍｇ/ｋｇヒト組換えＳｌｉｔ-２-Ｎ、１ｍｇ/ｋｇ
のヒト組換えＮＧＦと１ｍｇ/ｋｇヒト組換えＳｌｉｔ-２-Ｎの併用、またはビ
ヒクル(１０ｍｍｏｌ/ｌの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０/１４２ｍｍｏｌ/ｌのＮ
ａＣｌ)を週３回、１ヶ月間皮下注射した。マウスを運動及び交感Ｃｖｓを測定
することにより調べる。更なる記録は、Ｃ繊維機能を判断するために腓腹神経か
ら直接作られた。
果の向上のインビトロ実証：糖尿病性多発神経障害の動物モデル。 動物モデルでの併用療法の研究は、糖尿病性多発神経障害の治療においてＮＧ
Ｆ又はＳｌｉｔ-２-Ｎのどちらかの単独使用に比べてＮＧＦ/Ｓｌｉｔ-２-Ｎ併
用療法の回復効果が向上することを実証している。研究方法は、Elias等, 1998,
Diabetes 47, 1637-１642に記載されている。 雄のマウス(Ins.Ｄｄ１)は、膵臓β細胞のヒトインシュリン遺伝子により制御
されるマウスＭＨＯクラスＩ抗原Ｄｄを有する(Jakobson等, 1981, Diabetes 30
, 797-803)。６月齢の糖尿病及び非糖尿病同腹子に、この神経障害における併用
ＮＧＦ/Ｓｌｉｔ-２-Ｎ療法の効果を判定するために、１ｍｇ/ｋｇのヒト組換え
ＮＧＦ(GN0330 GI02AR)、１ｍｇ/ｋｇヒト組換えＳｌｉｔ-２-Ｎ、１ｍｇ/ｋｇ
のヒト組換えＮＧＦと１ｍｇ/ｋｇヒト組換えＳｌｉｔ-２-Ｎの併用、またはビ
ヒクル(１０ｍｍｏｌ/ｌの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０/１４２ｍｍｏｌ/ｌのＮ
ａＣｌ)を週３回、１ヶ月間皮下注射した。マウスを運動及び交感Ｃｖｓを測定
することにより調べる。更なる記録は、Ｃ繊維機能を判断するために腓腹神経か
ら直接作られた。
【００１５】 電気生理 Ｈ-反射。Ｈ反射及び筋肉波(Ｍ-ｗａｖｅｓ)が、実質的にStanley, 1981Exp N
eurol 71, 497-505に記載されているようにして、足底屈筋から記録された。２
、４、及び７月齢で、コントロール及び糖尿病のマウスがケタミン(８０ｍｇ/ｋ
ｇ)/キシラジン(１２ｍｇ/ｋｇ)で麻酔される。それらの体温は、３６-３７℃に
維持される。単極針電極(Nicolet, Madison, WI)が複合筋電位の記録に使用され
る。一つの電極は足の足底の筋肉に刺され、他方は、基準電極としての機能を果
たすように足蹠に置かれる。第３の針電極はアースとなるように反対の臀部に刺
される。記録電極は差動ＡＣ増幅器に、次いでMacLab Data Acquisition System
(ADInstruments, Milfore, MA)のインターフェースにつながれる。足底筋への神
経は、経皮針電極を用いて２つの部位で刺激される。電極は、脛骨神経を刺激す
るために足首の内側に、また坐骨神経を刺激するために坐骨上端のレベルで置か
れる。
eurol 71, 497-505に記載されているようにして、足底屈筋から記録された。２
、４、及び７月齢で、コントロール及び糖尿病のマウスがケタミン(８０ｍｇ/ｋ
ｇ)/キシラジン(１２ｍｇ/ｋｇ)で麻酔される。それらの体温は、３６-３７℃に
維持される。単極針電極(Nicolet, Madison, WI)が複合筋電位の記録に使用され
る。一つの電極は足の足底の筋肉に刺され、他方は、基準電極としての機能を果
たすように足蹠に置かれる。第３の針電極はアースとなるように反対の臀部に刺
される。記録電極は差動ＡＣ増幅器に、次いでMacLab Data Acquisition System
(ADInstruments, Milfore, MA)のインターフェースにつながれる。足底筋への神
経は、経皮針電極を用いて２つの部位で刺激される。電極は、脛骨神経を刺激す
るために足首の内側に、また坐骨神経を刺激するために坐骨上端のレベルで置か
れる。
【００１６】 一定時間(０．１ｍｓ)の方形波が神経を刺激するのに使用される。刺激振幅は
、Ｈ反射又はＭ波のどちらかが最初に認識できるまでゆっくりと増加させる。一
般に、Ｈ反射は糖尿病に罹っていないコントロール動物ではＭ波の前に得ること
ができるが、糖尿病の動物では、いつもＨ反射の前にＭ波が生成される。次いで
、刺激はＨ反射が得られるまで増加させる。それぞれの刺激部位は、研究の最後
に消えないインクで印を付け、部位の間の距離が測定される。刺激のアーティフ
ァクトとＭ波とＨ反射の最初のネガティブ電位の間の潜時が、臀部及び足首で刺
激することにより生じた記録の尺度とされた。運動神経ＣＶは次のように計算さ
れる：運動神経ＣＶ＝(刺激部位の間の距離)／(Ｍ波(臀部)の潜時−Ｍ波(足首)
の潜時)。感覚神経の伝導速度は次のように計算される：感覚神経ＣＶ＝(刺激部
位の間の距離)／(Ｍ波(臀部)の潜時−Ｍ波(足首)の潜時)。
、Ｈ反射又はＭ波のどちらかが最初に認識できるまでゆっくりと増加させる。一
般に、Ｈ反射は糖尿病に罹っていないコントロール動物ではＭ波の前に得ること
ができるが、糖尿病の動物では、いつもＨ反射の前にＭ波が生成される。次いで
、刺激はＨ反射が得られるまで増加させる。それぞれの刺激部位は、研究の最後
に消えないインクで印を付け、部位の間の距離が測定される。刺激のアーティフ
ァクトとＭ波とＨ反射の最初のネガティブ電位の間の潜時が、臀部及び足首で刺
激することにより生じた記録の尺度とされた。運動神経ＣＶは次のように計算さ
れる：運動神経ＣＶ＝(刺激部位の間の距離)／(Ｍ波(臀部)の潜時−Ｍ波(足首)
の潜時)。感覚神経の伝導速度は次のように計算される：感覚神経ＣＶ＝(刺激部
位の間の距離)／(Ｍ波(臀部)の潜時−Ｍ波(足首)の潜時)。
【００１７】 腓腹神経の記録。Ｃ線維複合神経電位は腹極式プラチナフック電極を用いて腓
腹神経から得られる。マウスはケタミン／キシラジンで麻酔され、体温は前記し
たように維持される。腓腹神経は足首から膝まで露出させ、坐骨神経は膝から臀
部の間を分離する。腓腹以外の坐骨の全ての部分が露出され、切除される。坐骨
は臀部で分離され、切除され、末端の部分は複極式刺激電極に置かれる。腓腹神
経は、単相性複合電極を与えるために電極の間でつぶされる。アース電極は反対
の臀部に置かれる。完全に露出した神経は、温度(３５+０．５℃)に維持して鉱
物油で薄められたワセリンの層で覆い、乾燥しないようにする。記録電極はＡＣ
差動増幅器を経由してMacLab Data Acquistion Systemにつなげられる。Ｃ線維
複合電位は３０と５０Ｂの間の振幅で０．５ｍｓ方形波を用いて誘発された。１
６と３２の間のＣ線維電位が記録され、１５ｓの刺激間隔を用いて平均化する。
複合Ｃ線維の最高振幅及び積分値が計算される。最も早く伝導するＣ線維のＣＶ
は、潜時で刺激及び記録電極の間の距離を割って決定される。
腹神経から得られる。マウスはケタミン／キシラジンで麻酔され、体温は前記し
たように維持される。腓腹神経は足首から膝まで露出させ、坐骨神経は膝から臀
部の間を分離する。腓腹以外の坐骨の全ての部分が露出され、切除される。坐骨
は臀部で分離され、切除され、末端の部分は複極式刺激電極に置かれる。腓腹神
経は、単相性複合電極を与えるために電極の間でつぶされる。アース電極は反対
の臀部に置かれる。完全に露出した神経は、温度(３５+０．５℃)に維持して鉱
物油で薄められたワセリンの層で覆い、乾燥しないようにする。記録電極はＡＣ
差動増幅器を経由してMacLab Data Acquistion Systemにつなげられる。Ｃ線維
複合電位は３０と５０Ｂの間の振幅で０．５ｍｓ方形波を用いて誘発された。１
６と３２の間のＣ線維電位が記録され、１５ｓの刺激間隔を用いて平均化する。
複合Ｃ線維の最高振幅及び積分値が計算される。最も早く伝導するＣ線維のＣＶ
は、潜時で刺激及び記録電極の間の距離を割って決定される。
【００１８】 インスリン(Dako, Santa Barbara, CA, A564 lot 032)はVectastain Elite AB
C Kitを用いて検出され、ＤＡＢ(ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド、Da
ko, S3000)は組織切片においてペルオキシダーゼを局在化するのに使用される。 結果。血液グルコースは治療に関係なく糖尿病マウスで上昇する。体重は治療
の後と有意な違いはない。坐骨神経から誘発された複合運動感覚ＳＶは、糖尿病
マウスで減少し、ＮＧＦ、Ｓｌｉｔ-２-Ｎ又は併用療法のどれかで治療された動
物では変化しない。腓腹神経から直接記録された場合、糖尿病マウスでＣ線維振
幅及び積分値の減少があり、少数の線維を表示、非同期的に発火するのに対し、
ＣＶはコントロールのＣＶと同じである。コントロール糖尿病マウスの減少した
Ｃ線維振幅と積分値はＮＧＦ又は併用療法の１ヶ月後に正常になる。結果は、Ｎ
ＧＦ及びＳｌｉｔ-２-ＮでＣ線維機能の回復が向上することと併用療法での相乗
効果が実証される。
C Kitを用いて検出され、ＤＡＢ(ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド、Da
ko, S3000)は組織切片においてペルオキシダーゼを局在化するのに使用される。 結果。血液グルコースは治療に関係なく糖尿病マウスで上昇する。体重は治療
の後と有意な違いはない。坐骨神経から誘発された複合運動感覚ＳＶは、糖尿病
マウスで減少し、ＮＧＦ、Ｓｌｉｔ-２-Ｎ又は併用療法のどれかで治療された動
物では変化しない。腓腹神経から直接記録された場合、糖尿病マウスでＣ線維振
幅及び積分値の減少があり、少数の線維を表示、非同期的に発火するのに対し、
ＣＶはコントロールのＣＶと同じである。コントロール糖尿病マウスの減少した
Ｃ線維振幅と積分値はＮＧＦ又は併用療法の１ヶ月後に正常になる。結果は、Ｎ
ＧＦ及びＳｌｉｔ-２-ＮでＣ線維機能の回復が向上することと併用療法での相乗
効果が実証される。
【００１９】 III．ＮＧＦ又はＳｌｉｔ-２-Ｎ単独に対するＮＧＦ/Ｓｌｉｔ-２-Ｎ治療の効果
の向上のインビボ実証：糖尿病多発神経障害。 ヒトにおける併用療法の研究はまた、糖尿病多発神経障害の治療においてＮＧ
Ｆ単独に比べて併用治療で回復効果を向上させることを実証する。研究の方法は
Apfel SC; Kessler JA; Adornato BT; Litchy WJ; Sanders C; Rask CA.,糖尿病
多発神経障害の治療における組換えヒト神経成長因子. NGF Study Group, Neuro
logy, 1998 Sep, 1(3):695-702に記載され、以下に要約する。 症候性多発神経障害を持つ患者が、６ヶ月間、プラセボ、ＮＧＦ、Ｓｌｉｔ-
２-Ｎ又は併用ＮＧＦ/Ｓｌｉｔ-２-Ｎ療法のいずれかを無作為に受けた。研究の
被験者は、Dyck等, 1985, Brain 108, 861-880＆Dyck等, 1992, Neurology 42,
1164-１170により定義されたところのステージ２の神経障害を有し、少なくとも
１の細線維神経障害の症状、２又はそれ以上の神経における少なくとも１の以上
神経伝達特性、及び冷却及び／又は痛覚閾値の量的官能検査異常を有し、糖尿簿
油以外の全身性疾患、活性新生物疾患、不安定増殖網膜症、又は神経障害の非糖
尿病危険因子を有する場合には除外される。
の向上のインビボ実証：糖尿病多発神経障害。 ヒトにおける併用療法の研究はまた、糖尿病多発神経障害の治療においてＮＧ
Ｆ単独に比べて併用治療で回復効果を向上させることを実証する。研究の方法は
Apfel SC; Kessler JA; Adornato BT; Litchy WJ; Sanders C; Rask CA.,糖尿病
多発神経障害の治療における組換えヒト神経成長因子. NGF Study Group, Neuro
logy, 1998 Sep, 1(3):695-702に記載され、以下に要約する。 症候性多発神経障害を持つ患者が、６ヶ月間、プラセボ、ＮＧＦ、Ｓｌｉｔ-
２-Ｎ又は併用ＮＧＦ/Ｓｌｉｔ-２-Ｎ療法のいずれかを無作為に受けた。研究の
被験者は、Dyck等, 1985, Brain 108, 861-880＆Dyck等, 1992, Neurology 42,
1164-１170により定義されたところのステージ２の神経障害を有し、少なくとも
１の細線維神経障害の症状、２又はそれ以上の神経における少なくとも１の以上
神経伝達特性、及び冷却及び／又は痛覚閾値の量的官能検査異常を有し、糖尿簿
油以外の全身性疾患、活性新生物疾患、不安定増殖網膜症、又は神経障害の非糖
尿病危険因子を有する場合には除外される。
【００２０】 適格対象は、１：１：１：１の形で４つの治療グループの１つに無作為に割り
当てられる。１のグループはプラセボ(ビヒクル緩衝液)を受け、第２のグループ
はｒｈＮＧＦ(Genentech社, South San Francisco)を１５０μＬに０．１μｇ/
ｋｇの用量で受け、第３のグループはrｈＳｌｉｔ-２-Ｎを１５０μＬに０．１
μｇ/ｋｇの用量で受け、第４のグループはｒｈＮＧＦ及びrｈＳｌｉｔ-２-Ｎを
それぞれ１５０μＬに０．１μｇ/ｋｇの用量で受ける。被験者は６ヶ月連続で
週に３回皮下投与を受ける。被験者及び検査員には彼らがプラセボ、ｒｈＮＧＦ
、rｈＳｌｉｔ-２-Ｎ又は併用を受けたかどうかはわからないようにする。 全体として、神経学的検査により判定された全体的神経障害は、Neuropathy I
mpairment Score (NIS)(Dyck等, 1995, Neurology 45, 1115-１121)を用いて評
価される。ＮＩＳのサブスコア、下肢障害(ＮＩＳＬＬ)は、糖尿病神経障害に最
も影響される部位を反映するように別々に計算される。 ３つの異なる症状評価が用いられる：神経障害症状特性(Neuropathy Symptom
Profile)(ＮＳＰ)(Dyck等, 1986, Neurology 36, 1300-１380)、神経障害症状及
び変化(Neuropathy Symptom Profile and Change)(ＮＳＣ)、及び全体的症状評
価。
当てられる。１のグループはプラセボ(ビヒクル緩衝液)を受け、第２のグループ
はｒｈＮＧＦ(Genentech社, South San Francisco)を１５０μＬに０．１μｇ/
ｋｇの用量で受け、第３のグループはrｈＳｌｉｔ-２-Ｎを１５０μＬに０．１
μｇ/ｋｇの用量で受け、第４のグループはｒｈＮＧＦ及びrｈＳｌｉｔ-２-Ｎを
それぞれ１５０μＬに０．１μｇ/ｋｇの用量で受ける。被験者は６ヶ月連続で
週に３回皮下投与を受ける。被験者及び検査員には彼らがプラセボ、ｒｈＮＧＦ
、rｈＳｌｉｔ-２-Ｎ又は併用を受けたかどうかはわからないようにする。 全体として、神経学的検査により判定された全体的神経障害は、Neuropathy I
mpairment Score (NIS)(Dyck等, 1995, Neurology 45, 1115-１121)を用いて評
価される。ＮＩＳのサブスコア、下肢障害(ＮＩＳＬＬ)は、糖尿病神経障害に最
も影響される部位を反映するように別々に計算される。 ３つの異なる症状評価が用いられる：神経障害症状特性(Neuropathy Symptom
Profile)(ＮＳＰ)(Dyck等, 1986, Neurology 36, 1300-１380)、神経障害症状及
び変化(Neuropathy Symptom Profile and Change)(ＮＳＣ)、及び全体的症状評
価。
【００２１】 知覚はＣＡＳＥ ＩＶシステム(WR Medical Electronics Co., Stillwater, MN
)を用いて定量される。３つの異なる感覚様式が計測され、これは冷覚検知閾値(
ＣＤＴ)、段階的加熱パルス(ＨＰ：５．０)からの痛覚の中間応答及び振動検知
閾値(ＶＤＴ)を含み、Dyck等, 1987, Diabetes Care 10, 432-440; Dyck等, 199
3, Neurology 43, 1500-１508; Gruener等, 1994, J Clin Neurophysiol 11, 56
8-588; Dyck等, 1993, Neurology 43, 1508-１512; Dyck等, 1996, J Neurol Sc
i 136, 54-63に記載されているような技術及びアルゴリズムを使用する。４、２
及び１のステップ式アルゴリズムは、ＣＤＴ及びＶＤＴ試験(Dyck等, 1993, Neu
rology 43, 1508-１512)に使用される。閾値は偏位(ＶＤＴ)及び℃の変化(ＣＶ
Ｄ)の単位として示される。痛覚として知覚される熱もまた、℃で示される。 神経伝導の研究は、標準画一的プロトコルによるAmerican Board of Electrom
yography公認医師により実施される。記録は、各患者の腕の尺骨運動及び感覚及
び正中感覚神経と同様に、足の腓腹神経及び腓骨運動神経で実施される。電位が
得られなければ振幅測定の値は０、潜時測定は９９％値に等しい値とする。
)を用いて定量される。３つの異なる感覚様式が計測され、これは冷覚検知閾値(
ＣＤＴ)、段階的加熱パルス(ＨＰ：５．０)からの痛覚の中間応答及び振動検知
閾値(ＶＤＴ)を含み、Dyck等, 1987, Diabetes Care 10, 432-440; Dyck等, 199
3, Neurology 43, 1500-１508; Gruener等, 1994, J Clin Neurophysiol 11, 56
8-588; Dyck等, 1993, Neurology 43, 1508-１512; Dyck等, 1996, J Neurol Sc
i 136, 54-63に記載されているような技術及びアルゴリズムを使用する。４、２
及び１のステップ式アルゴリズムは、ＣＤＴ及びＶＤＴ試験(Dyck等, 1993, Neu
rology 43, 1508-１512)に使用される。閾値は偏位(ＶＤＴ)及び℃の変化(ＣＶ
Ｄ)の単位として示される。痛覚として知覚される熱もまた、℃で示される。 神経伝導の研究は、標準画一的プロトコルによるAmerican Board of Electrom
yography公認医師により実施される。記録は、各患者の腕の尺骨運動及び感覚及
び正中感覚神経と同様に、足の腓腹神経及び腓骨運動神経で実施される。電位が
得られなければ振幅測定の値は０、潜時測定は９９％値に等しい値とする。
【００２２】 次の測定は、効果の独立した指標として判断される：量的神経学的検査(ＮＩ
ＳＬＬ)、感覚機能の定量的測定(ＣＤＴ、ＶＤＴ及びＨＰ：５．０)、及び症状
アンケート(ＮＳＰ、ＮＳＣ及び全体的な症状評価)。 ｒｈＮＧＦ、rｈＳｌｉｔ-２-Ｎ及び併用療法の効果は、治療前又は後に指標
と比較することにより判断される。全体的な症状評価は、彼らの神経障害症状の
被験者の全体的な知覚としてｒｈＮＧＦ及びrｈＳｌｉｔ-２-Ｎそれぞれの強い
有益な効果、及び併用療法の更に強い有益な効果を示す(表４)。 表４ 全体的な症状評価 治療 悪化 変化なし 改善 プラセボ ４５％ ４５％ １０％ rhNGF １％ ２６％ ７３％ rhSlit-2-N １％ ２５％ ７４％ 併用 １％ １７％ ８２％ ＣＤＴ及びＨＰ：５．０は、ｒｈＮＧＦ及びrｈＳｌｉｔ-２-Ｎグループの両
方で改善及び併用治療グループのさらに大きな改善が実証されるが、プラセボグ
ループでは改善はない(表５)。ＶＤＴではグループ間のたいした違いは示されな
い。
ＳＬＬ)、感覚機能の定量的測定(ＣＤＴ、ＶＤＴ及びＨＰ：５．０)、及び症状
アンケート(ＮＳＰ、ＮＳＣ及び全体的な症状評価)。 ｒｈＮＧＦ、rｈＳｌｉｔ-２-Ｎ及び併用療法の効果は、治療前又は後に指標
と比較することにより判断される。全体的な症状評価は、彼らの神経障害症状の
被験者の全体的な知覚としてｒｈＮＧＦ及びrｈＳｌｉｔ-２-Ｎそれぞれの強い
有益な効果、及び併用療法の更に強い有益な効果を示す(表４)。 表４ 全体的な症状評価 治療 悪化 変化なし 改善 プラセボ ４５％ ４５％ １０％ rhNGF １％ ２６％ ７３％ rhSlit-2-N １％ ２５％ ７４％ 併用 １％ １７％ ８２％ ＣＤＴ及びＨＰ：５．０は、ｒｈＮＧＦ及びrｈＳｌｉｔ-２-Ｎグループの両
方で改善及び併用治療グループのさらに大きな改善が実証されるが、プラセボグ
ループでは改善はない(表５)。ＶＤＴではグループ間のたいした違いは示されな
い。
【００２３】 表５ 治療 ＣＤＴ(通常偏差) ＨＰ５．０(通常偏差) プラセボ −０．０１ −０．０２ rhNGF −０．１６ −０．４５ rhSlit-2-N −０．１８ −０．４６ 併用 −０．２４ −０．６０ ｒｈＮＧＦ又はrｈＳｌｉｔ-２-Ｎを受けた被験者は、プラセボグループに比べ
て彼らの量的神経学的検査(ＮＩＳＬＬ)で改善が示され、併用両方を受けた者は
、さらに顕著に改善する(表６)。ＮＳＰの症状の蔓延には、有意な違いは無いが
、ｒｈＮＧＦ及びｒｈｐ４０で治療したグループでは、ＮＳＣで測定された様に
重症度では改善があり、併用療法グループではなおさらそうである。予期して測
定された複合指標分析では、ｒｈＮＧＦ、ｒｈｐ４０及び併用は有効であること
が示される。
て彼らの量的神経学的検査(ＮＩＳＬＬ)で改善が示され、併用両方を受けた者は
、さらに顕著に改善する(表６)。ＮＳＰの症状の蔓延には、有意な違いは無いが
、ｒｈＮＧＦ及びｒｈｐ４０で治療したグループでは、ＮＳＣで測定された様に
重症度では改善があり、併用療法グループではなおさらそうである。予期して測
定された複合指標分析では、ｒｈＮＧＦ、ｒｈｐ４０及び併用は有効であること
が示される。
【００２４】 表６ 治療 ＣＤＴ(通常偏差) ＨＰ５．０(通常偏差) プラセボ −０．０１ −０．０２ rhNGF −０．１６ −０．４５ rhSlit-2-N −０．１８ −０．４６ 併用 −０．２４ −０．６０ この明細書中で引用した全ての出版物及び特許出願及びその中に引用されてい
る全ての刊行物は、それぞれ個々の出版物及び特許出願又は刊行物が特にかつ個
々に出展明示により取り込まれることが明示されているように、ここに出典明示
して取り入れる。上記の発明は、理解を明確にする目的で、例示及び実施例によ
って幾分詳細に記述したが、当業者であれば、本発明の教示に照らして、添付す
る特許請求の範囲の精神又は範囲から逸脱することなく、それらにある種の変更
及び修正がなし得ることがはすぐに明らかであろう。
る全ての刊行物は、それぞれ個々の出版物及び特許出願又は刊行物が特にかつ個
々に出展明示により取り込まれることが明示されているように、ここに出典明示
して取り入れる。上記の発明は、理解を明確にする目的で、例示及び実施例によ
って幾分詳細に記述したが、当業者であれば、本発明の教示に照らして、添付す
る特許請求の範囲の精神又は範囲から逸脱することなく、それらにある種の変更
及び修正がなし得ることがはすぐに明らかであろう。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年４月２４日（２００１．４．２４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項５】 請求項１に記載のＳｌｉｔ-Ｎポリペプチドの治療的有効量
と製薬的に許容可能な賦形剤とを含んでなる製薬的組成物。
と製薬的に許容可能な賦形剤とを含んでなる製薬的組成物。
【請求項６】 請求項１に記載のＳｌｉｔ-Ｎポリペプチドの治療的有効量
と製薬的に許容可能な賦形剤とを含んでなり、Ｓｌｉｔ-ＮポリペプチドがｈＳ
ｌｉｔ-１-Ｎ、ｈＳｌｉｔ-２-Ｎ及びｈＳｌｉｔ-３-Ｎポリペプチドからなる群 より 選択される製薬的組成物。
と製薬的に許容可能な賦形剤とを含んでなり、Ｓｌｉｔ-ＮポリペプチドがｈＳ
ｌｉｔ-１-Ｎ、ｈＳｌｉｔ-２-Ｎ及びｈＳｌｉｔ-３-Ｎポリペプチドからなる群 より 選択される製薬的組成物。
【請求項７】 請求項１に記載のＳｌｉｔ-Ｎポリペプチドの治療的有効量
と製薬的に許容可能な賦形剤とを含んでなり、更に治療的有効量のＳｌｉｔ-Ｎ
ポリペプチド以外の向神経活性剤を含んでなる製薬的組成物。
と製薬的に許容可能な賦形剤とを含んでなり、更に治療的有効量のＳｌｉｔ-Ｎ
ポリペプチド以外の向神経活性剤を含んでなる製薬的組成物。
【請求項８】 請求項１に記載のＳｌｉｔ-Ｎポリペプチドの治療的有効量
と製薬的に許容可能な賦形剤を含み、更に治療的有効量のＳｌｉｔ-Ｎポリペプ
チド以外の向神経活性剤を含んでなり、該活性剤がＮＧＦである製薬的組成物。
と製薬的に許容可能な賦形剤を含み、更に治療的有効量のＳｌｉｔ-Ｎポリペプ
チド以外の向神経活性剤を含んでなり、該活性剤がＮＧＦである製薬的組成物。
【請求項９】 請求項１に記載のＳｌｉｔ-Ｎポリペプチドの治療的有効量
を含んでなる組成物に神経細胞を接触させることを含んでなる、軸索分岐又は突
起を促進する方法。
を含んでなる組成物に神経細胞を接触させることを含んでなる、軸索分岐又は突
起を促進する方法。
【請求項１０】 請求項１に記載のＳｌｉｔ-Ｎポリペプチドの治療的有効
量を含んでなる組成物を投与することを含んでなる、ニューロパシーを治療する
方法。
量を含んでなる組成物を投与することを含んでなる、ニューロパシーを治療する
方法。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ワン，クアン，ホン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94143 −0452，サンフランシスコ，パーナッサス アヴェニュー 513，ユニバーシティ オブ カリフォルニア，サンフランシス コ，アールエム．エス−1479 Ｆターム(参考） 4C084 AA02 BA44 DB59 MA01 NA14 ZA012 ZA202 ZB222 4H045 AA10 AA30 BA10 CA45 EA21 FA74
Claims (11)
- 【請求項１】 単離されたＳｌｉｔ-Ｎポリペプチド。
- 【請求項２】 Ｓｌｉｔ-ＮポリペプチドがｈＳｌｉｔ-１-Ｎ、ｈＳｌｉｔ-
２-Ｎ及びｈＳｌｉｔ-３-Ｎポリペプチドから選択される、請求項１に記載のＳ
ｌｉｔ-Ｎポリペプチド。 - 【請求項３】 製薬的組成物に含まれる、請求項１に記載のＳｌｉｔ-Ｎポ
リペプチド。 - 【請求項４】 細胞内でＳｌｉｔタンパク質を発現させて、Ｓｌｉｔタンパ
ク質をタンパク質分解処理して生成された、請求項１に記載のＳｌｉｔ-Ｎポリ
ペプチド。 - 【請求項５】 請求項１に記載のＳｌｉｔ-Ｎポリペプチドをコードするコ
ード領域を含んでなり、該コード領域に５００より少ない天然フランキング配列
のヌクレオチドが隣接している組換えポリヌクレオチド。 - 【請求項６】 請求項１に記載のＳｌｉｔ-Ｎポリペプチドの治療的有効量
と製薬的に許容可能な賦形剤とを含んでなる製薬的組成物。 - 【請求項７】 請求項１に記載のＳｌｉｔ-Ｎポリペプチドの治療的有効量
と製薬的に許容可能な賦形剤とを含んでなり、Ｓｌｉｔ-ＮポリペプチドがｈＳ
ｌｉｔ-１-Ｎ、ｈＳｌｉｔ-２-Ｎ及びｈＳｌｉｔ-３-Ｎポリペプチドから選択さ
れる製薬的組成物。 - 【請求項８】 請求項１に記載のＳｌｉｔ-Ｎポリペプチドの治療的有効量
と製薬的に許容可能な賦形剤とを含んでなり、更に治療的有効量のＳｌｉｔ-Ｎ
ポリペプチド以外の向神経活性剤を含んでなる製薬的組成物。 - 【請求項９】 請求項１に記載のＳｌｉｔ-Ｎポリペプチドの治療的有効量
と製薬的に許容可能な賦形剤を含み、更に治療的有効量のＳｌｉｔ-Ｎポリペプ
チド以外の向神経活性剤を含んでなり、該活性剤がＮＧＦである製薬的組成物。 - 【請求項１０】 請求項１に記載のＳｌｉｔ-Ｎポリペプチドの治療的有効
量を含んでなる組成物に神経細胞を接触させることを含んでなる、軸索分岐又は
突起を促進する方法。 - 【請求項１１】 請求項１に記載のＳｌｉｔ-Ｎポリペプチドの治療的有効
量を含んでなる組成物を投与することを含んでなる、ニューロパシーを治療する
方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US12559199P | 1999-03-18 | 1999-03-18 | |
| US60/125,591 | 1999-03-18 | ||
| US27309899A | 1999-03-19 | 1999-03-19 | |
| US09/273,098 | 1999-03-19 | ||
| PCT/US2000/007134 WO2000055195A1 (en) | 1999-03-18 | 2000-03-17 | Compositions for promoting nerve regeneration |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family
ID=26823721
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000605621A Pending JP2002539218A (ja) | 1999-03-18 | 2000-03-17 | 神経再生を促進する組成物 |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20040082516A1 (ja) |
| EP (1) | EP1161441A4 (ja) |
| JP (1) | JP2002539218A (ja) |
| AU (1) | AU754982B2 (ja) |
| CA (1) | CA2361289A1 (ja) |
| WO (1) | WO2000055195A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US7390482B2 (en) | 2002-10-02 | 2008-06-24 | Anges Mg, Inc. | Drug for auditory dysfunction |
| CA2501514A1 (en) * | 2002-11-01 | 2004-05-21 | Decode Genetics Ehf. | Human type ii diabetes gene-slit-3 located on chromosome 5q35 |
| US8447409B2 (en) * | 2008-10-15 | 2013-05-21 | Cochlear Limited | Electroneural interface for a medical implant |
| CA2739107C (en) | 2010-06-15 | 2022-12-06 | The Hospital For Sick Children | Methods and uses for inhibiting platelet coagulation comprising slit protein |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992010518A1 (en) * | 1990-12-07 | 1992-06-25 | Yale University | Purified slit protein and sequence elements thereof |
| IE20030749A1 (en) * | 1991-05-03 | 2003-11-12 | Indiana University Foundation | Human notch and delta binding domains in torporythmic proteins, and methods based thereon |
| AU1203999A (en) * | 1997-10-31 | 1999-05-24 | Osiris Therapeutics, Inc. | Human slit polypeptide and polynucleotides encoding same |
| WO1999025831A2 (en) * | 1997-11-14 | 1999-05-27 | The Regents Of The University Of California | Slit polypeptide and method of modulation of robo with ligands |
| CA2365214A1 (en) * | 1999-03-17 | 2000-09-21 | Washington University | Vertebrate protein slit, dna sequence encoding it and uses thereof |
-
2000
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