JP2002538832A5 - - Google Patents
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Description
インビトロ合成：
本明細書で用いられているように、生物学的抽出物そして/あるいは厳密に定義された試薬を含む反応混合液での、例えばポリペプチドのような生物学的高分子の無細胞合成を指す。反応混合液は少なくとも、エネルギー源であるATP、例えばDNA、mRNAなどの高分子の産生のための鋳型、アミノ酸、ならびに、例えばリボソーム、tRNA、ポリメラーゼ、転写因子などの合成のために必要な補因子、酵素および他の試薬を含む。本発明の一つの態様としてエネルギー源は恒常的なエネルギー源である。例えば酢酸キナーゼやクレアチンキナーゼなどのような高エネルギー結合よりATPを再生することを触媒する酵素も含まれる。そのような酵素は翻訳のために用いられる抽出物に存在するか反応混合液に添加されるだろう。そのような合成反応系は当技術分野においてよく知られており、文献で報告されている。無細胞系の合成反応はバッチ法、連続フロー法、あるいは半連続フロー法で実行され、これは当技術分野において知られている。
本明細書で用いられているように、生物学的抽出物そして/あるいは厳密に定義された試薬を含む反応混合液での、例えばポリペプチドのような生物学的高分子の無細胞合成を指す。反応混合液は少なくとも、エネルギー源であるATP、例えばDNA、mRNAなどの高分子の産生のための鋳型、アミノ酸、ならびに、例えばリボソーム、tRNA、ポリメラーゼ、転写因子などの合成のために必要な補因子、酵素および他の試薬を含む。本発明の一つの態様としてエネルギー源は恒常的なエネルギー源である。例えば酢酸キナーゼやクレアチンキナーゼなどのような高エネルギー結合よりATPを再生することを触媒する酵素も含まれる。そのような酵素は翻訳のために用いられる抽出物に存在するか反応混合液に添加されるだろう。そのような合成反応系は当技術分野においてよく知られており、文献で報告されている。無細胞系の合成反応はバッチ法、連続フロー法、あるいは半連続フロー法で実行され、これは当技術分野において知られている。
本明細書で用いられている恒常的なエネルギー源とは、ATPを一次エネルギー源として利用してインビトロ合成反応を始動するための、エネルギー源の二次的供給源をいう。ここではATPの加水分解による遊離したリン酸が再利用される。高エネルギーリン酸結合の供給源の外部からの添加の代わりに、例えば酸化反応との共役を通して、必要な高エネルギーリン酸結合がインサイチューで生成される。恒常的なエネルギー源は一般的に、高エネルギーリン酸結合そのものを欠き、よってATP再生の間、反応混合液において存在している遊離リン酸を利用する。無機リン酸は合成における抑制性の副生成物となりうるので、インビトロで合成が持続される期間が延長され得る。恒常的なエネルギー源は、高エネルギーリン酸結合の創出を触媒する酵素と組み合わせて提供される。
再生エネルギー源を利用する方法はまた、タンパク質の折りたたみやタンパク質輸送のようなインビトロシステムにも応用可能である。関心対象の合成システムは、DNAの複製、タンパク質合成、さらにDNAの増幅、DNAあるいはRNAの鋳型からRNAの転写、RNAのポリペプチドへの翻訳、そして単純な糖からの複合糖質の合成を含む。反応は大規模あるいは小規模反応装置を利用し得る。あるいは多数の同時合成を実行するために多重処理され得る。連続反応は、試薬の流れをもたらすためにフィード機構を用いており、工程の一部として最終生産物を単離し得る。バッチシステムも関心対象である。この場合、活発な合成の期間を長引かせるため、追加の試薬が導入される。反応装置はバッチ、伸長型バッチ、半バッチ、半連続性、フェドバッチそして連続性などのどのモードでも動かせる。これは応用目的に応じて選択される。
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