JP2002533475A

JP2002533475A - イノシトールホスホグリカンアンタゴニストを使用する、ガンの治療と診断

Info

Publication number: JP2002533475A
Application number: JP2000591437A
Authority: JP
Inventors: トーマス・ウィリアム・レイドメイチャー; ヒューゴ・カロ
Original assignee: ロダリス・ファーマシューティカルズ・リミテッド
Priority date: 1998-12-23
Filing date: 1999-12-23
Publication date: 2002-10-08
Also published as: AU759918C; GB9828564D0; EP1141723A1; AU1878400A; CA2355096A1; WO2000039589A1; AU759918B2

Abstract

(57)【要約】イノシトールホスホグリカン（ＩＰＧ）、特にmyo-イノシトールを含むＡ型物質は、腫瘍自己分泌因子（ＴＡＦ）であり、該因子は、腫瘍細胞増殖を導く。ガンの治療のためのＡ型ＩＰＧアンタゴニスト、及び患者から得たサンプル中のＩＰＧの存在若しくは量に基づくガンの診断若しくは予後のための方法が開示される。本発明の主題は、ンの治療のための医薬の調製のための、腫瘍細胞の増殖を減少する特性を有するイノシトールホスホグリカン（ＩＰＧ）アンタゴニストである物質の使用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、ガンの治療及び診断のための物質及び方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】

腫瘍細胞がカルチャー中で増殖する場合、該細胞の増殖速度は、カルチャー中
の細胞密度に依存することが観察されている。細胞の数としての増殖の速度の増
大は、細胞上清中の腫瘍自己分泌因子（ＴＡＦ）の存在によるものであると仮説
付けられている。ＴＡＦは、ホルモンのような外的刺激の不存在下で、腫瘍細胞
の増殖を導く腫瘍細胞によって生産される増殖因子であると解される。

【０００３】カルチャー上清中のＴＦＡの存在をサポートするいくつかの実験的証拠が存在
する。高密度の腫瘍細胞カルチャーから得た上清を希釈したカルチャーに適用す
ると、希釈カルチャー中の細胞の増殖速度が、高密度カルチャー中の細胞に関す
るレベルに迅速に加速される。もし希釈カルチャーに添加する前に上清を加熱す
るならば、細胞の増殖速度の加速は観察されないことも観察されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】

Witter等, (1987)は、Reuber H-35若しくはFaoヘパトーマ細胞から得た調製培
地が、血清由来細胞においてＤＮＡ合成刺激し、アセチル補酵素Ａ（ＣｏＡ）カ
ルボキシダーゼを活性化する自己分泌因子を含むことを報告している。彼らはま
た、該因子が腫瘍細胞カルチャーにおける細胞数及び細胞分裂指標を増大するこ
とを見出した。研究者らは、H-35ヘパトーマ細胞から得た調製培地を分画し、Ｄ
ＮＡ合成を促進する活性を有する二つの共精製される低分子構成成分（ＭＷ＜１
０００）を見出した。放射性活性取り込み試験により、グルコサミンとがラクト
ースの取り込みが考えられるが、myo-イノシトール若しくはマンノースの取り込
みは考えられないことが示唆された。しかしながら著者は、調製培地から得られ
る自己分泌因子を精製、単離若しくは特徴付けることができず、それらの自己分
泌因子の構造若しくは活性について何の規定的な示唆も提供していない。

【０００５】

【課題を解決するための手段】

広義では、本発明は、ＴＦＡの単離及び同定に基づき、特にＴＦＡがＡ若しく
はＰ型ＩＰＧのようなイノシトールホスホグリカン（ＩＰＧ）であるという発見
に基づく。特に実験結果により、ＴＦＡがmyo-イノシトールを含み、Ａ型ＩＰＧ
の外延まで含むことが示される。

【０００６】従って、第一の特徴点として、本発明は、ガンの治療のための医薬の調製のた
めの、ＩＰＧアンタゴニストである物質の使用を提供する。好ましくは、ＩＰＧ
アンタゴニストは、腫瘍細胞増殖を抑制する特性を有する。

【０００７】本出願において、「ＩＰＧアンタゴニスト」は、以下の特性の一つ以上を有す
る物質を含む：（ａ）ＩＰＧの放出を阻害可能である物質、例えばグリコシルホスファチジルイ
ノシトール特異的ホスホリパーゼ（ＧＰＩ−ＰＬ）のような、ＩＰＧの放出を導
く酵素のインヒビター；（ｂ）例えば抗ＩＰＧ抗体といったＩＰＧに結合することによってＩＰＧの濃度
を減少し、及びとりわけ腫瘍細胞増殖を導くＩＰＧの活性といった一つ以上のＩ
ＰＧの生物学的活性を中和することが可能である物質；及び／または（ｃ）ＩＰＧの効果を抑制可能である物質、例えば使用される種において生物学
的に不活性であるＩＰＧのような競合的アンタゴニスト、例えばヒトにおけるブ
タ肝臓Ａ型ＩＰＧの使用。

【０００８】好ましい実施態様として、ＩＰＧアンタゴニストは、ＩＰＧを特異的に結合可
能な抗体であり、好ましくは該抗体は、ＧＰＩ固定タンパク質の一般的な反応決
定因子と交差反応しない。好ましくは該抗体は、例えば以下に開示されているモ
ノクローナル抗体である。

【０００９】他の実施態様として、該アンタゴニストは、ＩＰＧの放出を阻害する。これに
より、ＩＰＧＴＦＡの放出に関与する酵素が、以前に哺乳動物組織中で同定さ
れていないＧＰＩ−ＰＬＣであることを示唆される。それ故、ＧＰＩ−ＰＬＣの
インヒビターは、ガンの治療のためのＩＰＧアンタゴニストとして使用されても
よい。

【００１０】さらなる特徴点として、本発明は、ガンの診断若しくは予後のための方法を提
供し、該方法は、患者から得たサンプル中のＩＰＧの存在若しくは量を測定する
ことを含む。次いで、所定のサンプル中のＩＰＧの存在若しくは量は典型的に、
健康な組織及びガン組織から得たスタンダードと比較される。

【００１１】好ましくは、ＩＰＧの存在若しくは量は、Ａ若しくはＰ型ＩＰＧの特徴的な活
性を測定することによって決定され、その詳細は以下に示される。別法として、
ＩＰＧの特徴的な構成成分、とりわけＩＰＧＴＡＦの存在若しくは量が、診断
マーカーとして使用できるであろう。診断マーカーとして使用できるＩＰＧの他
の構成成分は、以下に示される。

【００１２】さらなる特徴点として、本発明は、ＩＰＧの精製におけるセルロースカラムク
ロマトグラフィーの使用を提供する。

【００１３】さらなる特徴点として、本発明は、ＩＰＧを精製若しくは単離する方法を提供
し、該方法は、ＩＰＧを含むサンプルをセルロースを含むから無と接触させる工
程、及び該カラムからＩＰＧを溶出する工程を含む。カラムを調製し、ＩＰＧ含
有分画を溶出する好ましい条件は、以下に示される。

【００１４】本発明の実施態様は、添付された図面を参考にして実施例によって記載される
が、それは制限的なものではない。

【００１５】

【発明の実施の形態】ＩＰＧ研究により、Ａ型メディエーターが、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（阻
害的）、アデニレートシクラーゼ（阻害的）及びｃＡＭＰホスホジエステラーゼ
（誘導的）のような数多くのインスリン依存性酵素の活性を調節することが示さ
れている。これに対して、Ｐ型メディエーターは、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ
ホスファターゼ（誘導的）、グリコーゲンシンターゼホスファターゼ（誘導的）
、及びｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（阻害的）のようなインスリン依存性
酵素の活性を調節する。Ａ型メディエーターは、脂肪細胞のインスリンの脂質生
成活性を模倣する一方で、Ｐ型メディエーターは、金細胞上のインスリンの糖生
成活性を模倣する。Ａ及びＰ型メディエーターの両者は、血清フリー培地中の線
維芽細胞に添加された場合マイトージェン性である。該メディエーターの線維芽
細胞増殖を刺激する能力は、細胞をＥＧＦレセプターでトランスフェクトすると
増大する。Ａ型メディエーターは、ニワトリ蝸牛前庭神経節における細胞増殖を
刺激できる。

【００１６】Ａ型及びＰ型活性を有する可溶性ＩＰＧ分画は、ラット組織（肝臓、腎臓、脳
筋肉、脂肪細胞、心臓）及びウシ肝臓を含む各種の動物組織から得られている。
Ａ型及びＰ型ＩＰＧの生物学的活性はまた、ヒト肝臓及び胎盤、Plasmodium yoe
liiで感染されたＲＢＣ及びマイコバクテリアにおいても検出されている。抗イ
ノシトールグリカンの、ヒト胎盤栄養膜細胞層及びＢＣ３Ｈ１筋細胞上のインス
リン作用、またはラット横隔膜及びニワトリ蝸牛前庭神経節上のウシ由来ＩＰＧ
作用を阻害する能力は、多くの構造的特徴の種間保存を示唆する。

【００１７】Ａ型物質は、シクリトール含有炭水化物であり、Ｚｎ²⁺イオン及び任意にリン
酸を含み、脂質生成活性を調節しｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼを阻害する
特性を有する。それらはまた、アデニレートシクラーゼを阻害し、血清フリー培
地中のＥＧＦトランスフェクト線維芽細胞に加えられた場合マイトジェン性であ
り。脂肪細胞における脂質生成を刺激する。

【００１８】Ｐ型物質は、シクリトール含有炭水化物であり、Ｍｎ²⁺及び／またはＺｎ²⁺イ
オン並びに任意にリン酸を含み、グリコーゲン代謝を調節し、ピルビン酸デヒド
ロゲナーゼホスファターゼを活性化する特性を有する。それらはまた、グリコー
ゲンシンターゼホスファターゼの活性を刺激し、血清フリー培地中の線維芽細胞
に加えられた場合マイトジェン性であり、ピルビン酸デヒドロゲナーゼホスファ
ターゼを刺激する。

【００１９】Ａ型及びＰ型ＩＰＧを得るための方法は、Caro等, 1997、並びにWO98/11116及
びWO98/11117に示されている。要約すると、これらの出願に開示される方法は、
以下の工程を含む：（ａ）ＩＰＧソース物質の加熱及び酸処理によって、抽出物を作成する工程；（ｂ）濃縮及びチャーコール処理の後、生成した溶液をＡＧ１−Ｘ８（ギ酸形態
）のアニオン交換樹脂で一晩接触させる工程；（ｃ）５０ｍＭＨＣｌでカラムを溶出することによって得られたＡ型ＩＰＧ活性
を有する分画を回収する工程、及び／または１０ｍＭＨＣｌでカラムを溶出する
ことによって得られたＰ型ＩＰＧ活性を有する分画を回収する工程；（ｄ）ｐＨ４（ｐＨ７．８を越えない）に調節し、分画を凍結乾燥して、物質を
単離する工程；（ｅ）溶媒として４／１／１ブタノール／エタノール／水を使用して、下降ペー
パークロマトグラフィーを使用する工程；（ｆ）ピリジン／酢酸／水における高圧ペーパークロマトグラフィーを使用して
精製する工程；並びに（ｇ）Dionexアニオン交換クロマトグラフィーを使用して精製し、若しくはVyda
c ＨＰＬＣクロマトグラフィーを使用して生成及び単離し、単離されたＩＰＧを
得る工程。

【００２０】ここに開示されるように、ＩＰＧの単離若しくは精製において、セルロース、
特に微結晶性セルロースを使用するカラムクロマトグラフィーを使用することが
可能である。例示的な条件は、以下の実験のセクションに提供される。

【００２１】アンタゴニスト本発明において、「ＩＰＧアンタゴニスト」は、以下の特性の一つ以上を有す
る物質を含む：（ａ）ＩＰＧの放出を阻害可能である物質、例えばＧＰＩ−ＰＬのような、ＩＰ
Ｇの放出を導く酵素のインヒビター；（ｂ）ＩＰＧに結合することによってＩＰＧの濃度を減少し、及び好ましくはＩ
ＰＧの生物学的活性を中和することが可能である物質；及び／または（ｃ）ＩＰＧの効果を抑制可能である物質、例えば使用される種において生物学
的に不活性であるＩＰＧのような競合的アンタゴニスト、例えばヒトにおけるブ
タ肝臓から入手可能なＡ型ＩＰＧの使用。

【００２２】（ｂ）及び（ｃ）について、アンタゴニストによって影響されるＩＰＧの生物
学的活性は好ましくは、細胞カルチャーに加えられた場合、ＩＰＧによって導か
れる腫瘍細胞増殖である。これは、実施例に記載されたアッセイ、若しくは当業
者に周知の他の方法を使用して、容易に測定できる。

【００２３】（ｂ）タイプのＩＰＧアンタゴニストの例として、ＩＰＧに結合する物質につ
いて生物学的物質をスクリーニングすることによって得ることができる、例えば
天然に存在する特異的結合タンパク質といった、特異的結合タンパク質が含まれ
る。

【００２４】さらなる例として、アンタゴニストは、ＩＰＧに特異的に結合可能な抗体であ
る。ポリクローナル及びモノクローナル抗体の生産は、本分野で十分に確立され
ている。抗ＩＰＧモノクローナル抗体の例は、1998年5月12日('201)及び1998年3
月9日('212及び'901)に、登録番号98051201、98031212及び98030901の下でEurop
ean Collection of Cell Cultures (ECACC)に寄託されたハイブリドーマ細胞系2
F7、2D1及び5H6によって生産される。

【００２５】モノクローナル抗体は、それらが元となる抗体の特異性を維持する他の抗体若
しくはキメラ分子を生産するための組換えＤＮＡ法の方法にかけることができる
ため、特に有用である。上記方法は、抗体のイムノグロブリン可変領域、若しく
は相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡを、異なるイムノグロブリンの
定常領域、若しくは定常領域プラスフレームワーク領域に導入することを含んで
もよい。例えば、EP 0 184 187 A、GB 2 188 638 A若しくはEP 0 239 400 Aを参
照。モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマは、遺伝的突然変異若しくは
他の変化を受けてもよく、それらは生産される抗体の結合特異性を改変するもの
でも改変しないものでもよい。

【００２６】抗体は、本分野で標準的である方法を使用して得てもよい。抗体を生産する方
法としては、例えばＩＰＧ若しくはその断片といった免疫源を使用して、動物（
例えばマウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジ若しくはサル）を免疫化す
ることが含まれる。抗体は、本分野で周知の各種の方法のいずれかを使用して免
疫化動物から得られ、好ましくは興味ある抗原に対する抗体の結合を使用してス
クリーニングしてもよい。例えばウエスタンブロット法若しくは免疫沈降を使用
してもよい(Armitage等, Nature, 357: 80-82, 1992)。動物からの抗体及び／ま
たは抗体生産細胞の単離は、動物を殺傷する工程によって達成されてもよい。

【００２７】ＩＰＧで動物を免疫化することの別法として若しくは補足法として、ＩＰＧに
特異的な抗体を、例えば表面に機能的なイムノグロブリン結合ドメインを展示す
るラムダバクテリオフォー字若しくは繊維状バクテリオファージを使用して、発
現されたイムノグロブリン可変ドメインの組換え的に生産されたライブラリーか
ら得てもよい；例えばWO92/01047参照。

【００２８】本発明に従った抗体は、数多くの方法で修飾されてもよい。実際、用語、「抗
体」は、必要とされる特性を有する結合ドメインを有するいずれかの結合物質を
包含するものとして解されるべきである。かくしてアンタゴニスト抗体には、抗
体断片、誘導体、機能的な同等物、並びに合成分子及び抗原若しくはエピトープ
を結合可能な抗体の形状を模倣した分子を含む抗体のホモローグが含まれる。

【００２９】ＩＰ若しくは他の結合パートナーを結合可能な抗体断片の例は、ＶＬ、ＶＨ、
Ｃ１及びＣＨ１ドメインより成るＦａｂ断片；ＶＨ及びＣＨ１ドメインより成る
Ｆｄ断片；抗体の一本の腕のＶＬ及びＶＨドメインより成るＦｖ断片；ＶＨドメ
インより成るＡｂ断片；単離されたＣＤＲ領域、並びにＦ（ａｂ’）２断片、ヒ
ンジ領域でジスルフィド架橋によって結合された二つのＦａｂ断片を含む二価断
片である。一本鎖Ｆｖ断片もまた含まれる。

【００３０】元となる非ヒト抗体より小さい免疫原性を有する抗体を提供するために、非ヒ
トソースから得られたＣＤＲがヒトフレームワーク領域に接合され、典型的にフ
レームワークアミノ酸残基のいくつかの改変を有するヒト化抗体もまた本発明の
範囲内に含まれ、本分野で周知の方法を使用して当業者によって生産できる。

【００３１】本発明に従ったモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマは、遺伝的突然
変異若しくは他の変化を受けてもよい。さらに、元となる抗体の特異性を維持す
る他の抗体若しくはキメラ抗体を生産するために、モノクローナル抗体は組換え
ＤＮＡ法の技術にかけられることができることは、当業者に理解できるであろう
。上記方法は、抗体のイムノグロブリン可変領域、若しくは相補性決定領域（Ｃ
ＤＲ）をコードするＤＮＡを、異なるイムノグロブリンの定常領域、若しくは定
常領域プラスフレームワーク領域に導入することを含んでもよい。例えば、EP-A
-184187、GB-A-2188638若しくはEP-A-0239400を参照。キメラ抗体のクローニン
グ及び発現は、EP-A-0120694及びEP-A-0125023に記載されている。

【００３２】所望の結合特徴を有する抗体を生産可能なハイブリドーマ、並びに抗体（抗体
断片を含む）をコードする核酸を含み、その発現が可能である、真核生物若しく
は原核生物である宿主細胞は、本発明の範囲内にある。本発明はまた、抗体を生
産し、好ましくは分泌する条件の下で、抗体を生産可能な細胞を生育させること
を含む、抗体の生産方法を提供する。

【００３３】上述の抗体は、直接若しくは間接に検出可能で、好ましくは測定可能なシグナ
ルを生産できる、ラベル若しくはレポーター分子で標識することによって、本発
明の診断での態様で使用することができる。レポーター分子の結合は、直接的若
しくは間接的、例えばプリチド結合を介するような共有結合的、若しくは非共有
結合的であってもよい。ペプチド結合を介する結合は、抗体とレポーター分子を
コードする遺伝子融合物の組換え発現の結果として実施されてもよい。

【００３４】一つの好ましい態様は、スペクトル的に単離された吸収若しくは放射特性を有
する個々の蛍光色素、燐光色素、若しくはレーザー色素と各抗体を共有結合によ
って結合することである。適切な蛍光色素には、フルオレセイン、ローダミン、
フィコエリスチン及びテキサスレッドが含まれる。適切な色素原には、ジアミノ
ベンジジンが含まれる。

【００３５】他のレポーターとしては、マクロ分子コロイド状粒子、または発色性、磁性若
しくは常磁性であるラテックスビーズのような粒子状物質、並びに視覚的に観察
できる、電気的に検出できる、若しくはさもなければ記録できる検出可能なシグ
ナルを直接若しくは間接に発することが可能な、生物学的若しくは化学的に活性
な試薬が含まれる。これらの分子は、発色を形成する若しくは変化させる、また
は例えば電気的な特性の変化を生ずる反応を触媒する酵素でもよい。それらは、
エネルギー状態の間の電気的遷移が、特徴的なスペクトルの吸収若しくは放射を
生ずるように、分子的に励起可能でもよい。それらは、バイオセンサー組み合わ
せて使用される化学的分子を含んでもよい。ビオチン／アビジン若しくはビオチ
ン／ストレプタビジン及びアルカリホスファターゼ検出系が使用されてもよい。

【００３６】さらなる実施態様として、ＩＰＧアンタゴニストは、例えば腫瘍細胞の増殖を
促進するようなＴＦＡ活性を有しないＩＰＧといった、関連する性質において生
物学的に不活性であるＩＰＧ若しくは合成分子のような、競合的アンタゴニスト
である。この後者のタイプのアンタゴニストの例は、GB-A-9828560.4及び関連出
願に記載されたヒトにおけるブタ肝臓Ａ型ＩＰＧの使用である。合成化合物は、
化学的方法によって若しくはコンビナトリアルケミストリーを使用して生産され
、次いでＩＰＧアンタゴニスト活性についてスクリーニングされてもよい。これ
らの化合物はそれ自体有用であり、若しくは類似体のデザインにおいて使用され
、医薬品の開発のための候補リード化合物を提供してもよい。合成化合物は、そ
れらが比較的合成が容易である場合、若しくはそれらが医薬品として投与するの
に適したものとする特性を有する場合に望ましく、例えばペプチドであるアンタ
ゴニストが、胃腸におけるプロテアーゼによって分解されるのであれば、経口組
成物のための不適切な活性剤であろう。類似体のデザイン、合成及び試験は一般
的に、標的特性のための数多くの分子をランダムにスクリーニングすることを避
けるために使用される。

【００３７】製薬学的組成物ＩＰＧ若しくはＩＰＧアンタゴニストは、製薬学的組成物中に製剤化できる。
これらの組成物は、一つ以上のＩＰＧ若しくはアンタゴニストに加えて、製薬学
的に許容可能な賦形剤、担体、緩衝液、安定剤、若しくは当業者に周知の他の物
質を含んでもよい。上記物質は、非毒性であるべきであり、活性成分の効力を妨
げるものべきではない。担体若しくは他の物質の正確な性質は、例えば経口、静
脈内、皮膚若しくは皮下、鼻腔内、筋肉内、腹膜内経路といった、投与経路に依
存してもよい。

【００３８】経口投与のための製薬学的組成物は、錠剤、カプセル、パウダー、若しくは液
体形態であってもよい。錠剤は、ゼラチン若しくはアジュバントのような固体の
担体を含んでもよい。液体製薬学的組成物は一般的に、水、鉱油、鉱物若しくは
植物油、鉱物油、若しくは合成油のような液体の担体を含む。生理食塩水溶液、
デキストロース、若しくは他のサッカリド溶液、またはエチレングリコール、プ
ロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールのようなグリコールが含ま
れてもよい。

【００３９】静脈内、皮膚若しくは皮下注射、または苦痛部位への注射のために、活性成分
は、病原体を含まず、適切なｐＨ、等張性及び安定性を有する全身性で許容可能
な水溶液の形態で存在するであろう。当業者は、例えば塩化ナトリウム注射液、
リンガー注射液、乳酸化リンガー注射液のような等張性ビヒクルを使用して、適
切な溶液を調製することが十分に可能である。防腐剤、安定剤、緩衝液、抗酸化
剤、及び／または他の添加物は、必要なように含ませてもよい。

【００４０】個々的に示されている本発明に従ったポリペプチド、ペプチド、小分子、若し
くは他の製薬学的に有用な化合物のいずれであれ、投与は好ましくは、「予防上
の有効量」若しくは「治療上の有効量」で与えられ（この場合予防は治療として
考慮される）、これは個人に利益を示すのに十分な量である。投与される実際の
量、投与の割合とタイムコースは、治療される疾患の性質とひどさに依存するで
あろう。例えば投与量の決定等の治療の処方箋は、一般的な実施者及び他の医療
上の医者の責任の範囲内にあり、典型的には治療される疾患、個々の患者の状態
、輸送部位、投与方法、及び実施者に周知の他の因子を考慮するべきである。上
述の方法及びプロトコールの例は、Remington's Pharmaceutical Science、第１
６版、Osol, A.（編）, 1980に見出すことができる。

【００４１】該組成物は、単独で若しくは他の治療と組み合わせて、治療される疾患に依存
して同時的に若しくは連続的に投与してもよい。かくして、ガンの治療において
、ＩＰＧアンタゴニストは、他の化学療法若しくは放射線用法と組み合わせて投
与できる。

【００４２】診断方法患者から得たサンプル中の分析物の濃度を測定する方法は、本分野で周知であ
り、患者が上昇したＩＰＧの濃度を有し、それ故ガンを有する若しくはガンの危
険を有するかどうかを決定するために、本発明の分脈において当業者によって容
易に採用される。上記分析の目的は、臨床医がガンのひどさ若しくは進行の様子
を測定することを補助し、及び／またはガンの治療を最適化するための診断若し
くは予後のために使用することであってもよい。診断方法の例は、以下の実験の
セクションに記載されている。

【００４３】好ましい診断方法は、血液、血清、尿若しくは組織サンプル（特に腫瘍部位の
疑いのある）のような生物学的サンプルを使用して、ＩＰＧを検出することに依
存する。

【００４４】ＩＰＧの濃度を測定するためのアッセイ方法は典型的に、他の分子よりもＩＰ
Ｇに特異的に結合可能な結合部位を有する結合剤を使用する。結合剤としては、
抗体（その例が上記提供されている）、レセプター、及びＩＰＧを特異的に結合
可能な他の分子が含まれる。簡便には結合剤は、アッセイの間の操作を容易にす
るために、例えば所定の位置で固体の支持体に固定化される。

【００４５】サンプルは一般的に、サンプル中に存在するＩＰＧが結合剤に結合できるよう
な適切な条件下で、結合剤と接触される。

【００４６】次いで結合剤の結合部位の区画の占有は、分析物を直接若しくは間接にラベル
することによって、またはサンプル中の分析物の存在若しくは量の指標を提供す
る検出剤（類）を使用することによって測定できる。典型的に検出剤は、直性若
しくは間接にラベルされ（例えば放射性活性、蛍光若しくはセイヨウワサビペル
オキシダーゼのような酵素ラベルで）、それらは本分野で周知の方法を使用して
検出できる。直接的にラベルされた検出剤は、該試薬に会合した若しくは結合し
たラベルを有する。間接的にラベルされた検出剤は、ラベルされた種に結合する
ことができ（例えば検出剤に結合可能なラベル化抗体）、若しくは検出可能な結
果を生産するさらなる種に対して作用してもよい。かくして放射性活性ラベルは
、シンチレーションカウンター若しくは他の放射線計測装置を使用して検出でき
、蛍光ラベルは、レーザー及び共焦点顕微鏡を使用して検出でき、並びに酵素ラ
ベルは、典型的に発色の変化を生産する、基質に対する酵素ラベルの作用によっ
て検出できる。さらなる実施態様として、検出剤若しくは分析物は、検出を可能
にするようにタグ化され、例えば分析物を検出するために、ＰＣＲ反応において
増幅できるヌクレオチド配列に結合される。他のラベルは、以下に記載されるよ
うに当業者に周知である。検出剤は、それが結合剤の占有された結合部位につい
て分析物と競合する競合的方法、またはラベルされた検出剤が結合剤によって結
合された分析物を結合する若しくは占有された結合部位に結合する非競合的方法
において使用できる。両者の方法は、例えば周知の濃度の分析物を含むサンプル
を使用して得られたスタンダードと比較することによって、分析物によって占有
された結合部位の数、かくしてサンプル中の分析物の濃度の指標を提供する。

【００４７】サンプルは一般的に、サンプル中の分析物を結合剤に結合させる適切な条件下
で、結合剤と接触される。

【００４８】小さな個別の配置（マイクロスポット）に固定化された結合剤（抗体若しくは
核酸配列のような）の使用、及び／または固体の支持体若しくは診断チップ上の
アレーの使用といった、上記アッセイの操作に向けた診断の分野で増大する傾向
が存在する。これらのアプローチは、それらが大きな感度を提供でき（特に蛍光
ラベルされた試薬の使用を通じて）、試験される患者から得た生物学的サンプル
を非常に少量しか必要とせず、各種の別のアッセイを同時に実施できる場合に、
特に有用であることができる。後者の利点は、単一のサンプルを使用して多数の
分析物を使用するアッセイを実施できることを提供する場合に、有用であること
ができる。この小型化方法を可能にする技術の例は、WO84/01031、WO88/1058、W
O89/01157、WO93/8472、WO95/18376、WO95/18377、WO95/24649及びEP 0 373 203
Aに提供される。かくしてさらなる特徴点として、本発明は、多数の結合剤を固
定化している支持体若しくは診断チップを含むキットを提供し、その少なくとも
一つは、アッセイを実施するために必要とされる他の試薬（ラベル化検出剤のよ
うな）と任意に組み合わせて、上述のようにＩＰＧに結合することができる。

【００４９】

【実施例】

物質と方法抗ＩＰＧ抗体抗ＩＰＧ抗体を、登録番号98051201、98031212及び98030901の下でEuropean C
ollection of Cell Cultures (ECACC)に寄託されたハイブリドーマ細胞系２Ｆ７
、２Ｄ１及び５Ｈ６を培養し、かくして生産された抗ＩＰＧ抗体を単離すること
によって生産した。

【００５０】ＩＰＧのセルロース精製微結晶性セルロース(Merck Avicel（登録商標）)を、二倍希釈水中に懸濁する
ことによって純粋化し、引き続き１０分間標準化し、非確立的な懸濁物をデキャ
ントした。１２回繰り返した後、確立された物質を二倍量の新鮮な水で激しく攪
拌し、トッププランジャをはずした１６ｍｍのPharmacia（登録商標）ガラスカ
ラムの上部に注いだ。水を３ｍｌ／分で重量の下で流した。溶媒濃度をパックさ
れたベッドの上部に落とした後、プランジャを配置し、水をPharmacia（登録商
標）蠕動運動ポンプを使用して５ｍｌ／分でカラムを通じて汲み上げた。カラム
を以下の溶媒で処理した：水１５０ｍｌ５０％水性メタノール５０ｍｌメタノール５０ｍｌブタノール／メタノール／水（４：１：１）１５０ｍｌ

【００５１】全ての溶媒を、真空下で簡単に回転して使用前に脱気した。最終溶媒の後、プ
ランジャをはずし、溶媒濃度を重力下でパックされたベッドの上部に落とさせ、
流れを停止させた。

【００５２】サンプル（２ｍｌの濃縮細胞培地若しくは二つのラット肝臓から得たＩＰＧ抽
出物）を、２ｍｌのセルロース懸濁物で５分間回転させ、全混合物を凍結乾燥し
た。

【００５３】乾燥セルロース物質を、２ｍｌのブタノール／エタノール／水（Ｂ：Ｗ：Ｅ）
（４：１：１）中に懸濁し、パックされたベッドの上部に穏やか且つ均一に適用
した。ザンブの物質を、さらに２ｍｌの溶媒を使用して洗浄した。溶媒濃度を、
５ｍｌ／分でＢ：Ｗ：Ｅ（４：１：１）を使用して組み上げを開始する前に、ベ
ッドのレベルまで再び落とした。以下のように分画を、フラスコ内に手で、若し
くは１分／チューブにセットされたGilsonモデル204分画回収器を使用して、ガ
ラス容器に回収した：ブタノール／メタノール／水（４：１：１）１５０ｍｌメタノール５０ｍｌ５０％水性メタノール１０×５ｍｌ分画水２０×５ｍｌ分画ＨＣｌ（水性）ｐＨ１．３１０×５ｍｌ分画ＨＣｌ（水性）ｐＨ１．３７５ｍｌ

【００５４】サンプルを、３０℃以下でロータリーエバポレーター若しくはSpeedvacを使用
して乾燥物に蒸発させた。サンプルを２００μｌの水に溶解し、−２０℃で貯蔵
した。

【００５５】Ｈ４ＩＩＥ細胞からの調製培地（ＣＭ）の調製（ａ）Ｈ４ＩＩＥ細胞を、胎児ウシ血清と加熱不活性化ウシ血清の１：１混合物
を５％で補ったＤＭＥＭ(Gibco Cat. No. 31885)を使用して、２−６×１０⁴細
胞／ｃｍ²の細胞密度に７５ｃｍ²のFalconキャップを備えた組織培養フラスコで
培養し、３７℃で５％ＣＯ₂環境下で１００％集合体まで培養した。

【００５６】（ｂ）集合体（１５−１７×１０⁶細胞／Ｔ７５フラスコ）に対して、細胞を、
１５−２０ｍｌHank's Balance Salt Solution、ｐＨ７．４（ＨＢＳＳ、Gibco
Cat No. 14174-053)を使用して二回洗浄し、５ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡ溶液
(Sigma Cat. No. T 4171)を加えた。次いで過剰なトリプシンを２ｍｌの液体の
みをフラスコに残して除去し、次いでそれを１０分間インキュベートした。

【００５７】（ｃ）細胞を分離してから、８ｍｌの増殖培地を加え、混合物を５分間１０００
ｒｐｍで遠心分離した。上清を除去し、ペレットを１０ｍｌの増殖培地を加えて
懸濁した。細胞上清を、滅菌した２５ｍｌの万能の容器に移し、１０ｍｌの同じ
培地を加え、キャップをしっかりと閉め、容器を数回混合して、均一な細胞懸濁
物を生産した。

【００５８】（ｄ）工程（ａ）と同じ培地とインキュベーション条件を使用して、細胞を１／
１０若しくは１／２０（１−２．５×１０⁴細胞／ｃｍ²⁾の細胞密度に７５ｃｍ² のFalconキャップを備えたフラスコでサブクローン化した。１−１０で蒔かれた
細胞が７０％の集合体に到達してから（１１．５−１２．０×１０⁶細胞／Ｔ７
５フラスコ、通常３日後）、培養物を２０ｍｌの血清フリーＤＭＥＭで三回洗浄
し、次いで３時間インキュベートした。この方法を二回繰り返した。

【００５９】（ｅ）培養物を３７℃で４８時間、５％ＣＯ₂環境でインキュベートし、次いで
調製培地を遠心チューブに移し、４℃で１０００ｇで１０分、次いで４℃で１０
５，０００ｇで６０分で遠心分離することによって細胞破片を除去した。上清を
濾過によって滅菌し、−８０℃で貯蔵した。

【００６０】調製培地の生合成ラベリング及び抽出（ａ）５％胎児ウシ血清と５％加熱不活性化ウシ血清を補ったＤＭＥＭ培地中の
Ｔ７５キャップを備えたフラスコFalcon(Falcon Cat. No. F3111)ちゅうの５０
−６０％集合体に生育したＨ４ＩＩＥ細胞（８−９×１０⁶細胞／Ｔ７５フラス
コ）を、３７℃でＨＢＳＳを使用して二回洗浄した。１０ｍｌの新鮮な増殖培地
を加え、次いで２５０ｍＣｉの³Ｈラベル前駆体（グルコサミン、ガラクトース
、マンノース及びmyo-イノシトール）を加えた。培養物を３７℃で２４時間５％
ＣＯ₂環境でインキュベートした。

【００６１】（ｂ）２４時間後、細胞を上述の工程（ｄ）に記載されたように三回洗浄し、細
胞をインキュベートして、工程（ｅ）のように培地を回収した。

【００６２】（ｃ）得られた上清をＨＣｌ（ｃ）でｐＨ３．０に調節し、予備洗浄された活性
化チャーコール（２５ｍｇ／ｍｌ）を加え、４℃で３０分攪拌した。上清を遠心
チューブに移し、４℃で３０分２０，０００ｇの遠心分離によってチャーコール
をスピンダウンさせた。

【００６３】（ｄ）２．０μｍの孔サイズのフィルターを使用して上清を滅菌し、４℃で貯蔵
した。もし迅速な使用の必要がなければ、それを凍結乾燥し、必要とされるまで
−８０℃で維持した。

【００６４】ＦａＯ細胞の増殖を測定することによる、Ｈ４ＩＩＥ調製培地の生活性アッセイ
（ａ）胎児ウシ血清と加熱不活性化ウシ血清の１：１混合物を５％で補ったＲＰ
ＭＩ−１６４０(Gibco Cat. No. 21875)で、Ｔ７５Falconキャップ装備組織培養
フラスコGibco Cat. No. F3111中の６０−７０％集合体で生育したＦａＯ細胞を
、２０ｍｌのＨＢＳＳ、ｐＨ７．４(Gibco Cat. No. 14174)で二回洗浄した。上
記示された「Ｈ４ＩＩＥからの調製培地の調製」のプロトコールの工程（ｂ）及
び（ｃ）に記載されたように、細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ溶液(Sigma Cat. No
. T4171)で分離した。

【００６５】（ｂ）細胞懸濁物を二回カウントし、２．５−３．０×１０³細胞／ｍｌの密度
に懸濁液を希釈するために必要とされる容量を計算した。計算された容量の増殖
培地を加え、細胞を滅菌２５ｍｌ万能容器に移した。溶液を数回穏やかに攪拌し
、均質な細胞懸濁物を生産した。

【００６６】（ｃ）ウェル当たり１００ｍｌの細胞懸濁物を加えることによって、細胞を９６
穴Falcon U底型マイクロウェルプレートに配置し、３７℃で５％ＣＯ₂環境のイ
ンキュベーターでインキュベートした。２４時間後、各ウェルを１００ｍｌの血
清フリー培地で三回洗浄し、さらに２４時間インキュベートした。

【００６７】（ｄ）培地を血清フリー培地を加えることによって置換し、細胞をさらに３時間
インキュベートした。その間、異なる濃度（１％から２０．０％の範囲）のＨ４
ＩＩＥ調製培地でＩＰＧサンプル若しくは培地補足物を調製した。１００μｌの
血清フリー培地をコントロールに加え、１００μｌの完全増殖培地をポジティブ
コントロールに加え、１００μｌの培地をＨ４ＩＩＥ調製培地で補った。

【００６８】（ｅ）細胞を、３７℃で１８時間５％ＣＯ₂環境のインキュベーターでインキュ
ベートし、次いで１ｍＣｉの³Ｈ−チミジンを各ウェルに加えた。４時間のイン
キュベーションの後、放射性活性培地を除去し、５０μｌのトリプシン−ＥＤＴ
Ａ溶液で置換した。細胞を１０分間インキュベートし、細胞回収器(SKETRON 12
ウェル／細胞回収器）を使用して、フィルター(Helis Bio Ltd. Cat. No. 11731
)上に細胞を回収した。フィルターをシンチレーションバイアルに移し、２ｍｌ
のシンチレーションカクテルを各バイアルに加え、Beckmanシンチレーションカ
ウンターで１分間カウントした。

【００６９】アッセイリン酸分析とＰＤＨ活性化アッセイを、Caro等, 1997に記載されたように実施
した。

【００７０】結果セルロースカラムクロマトグラフィーによる調製培地の分画「方法」に記載されたように得られた、それぞれ1.35E5、2.85E5及び2.50E5ｃ
ｐｍで³Ｈmyo-イノシトール（四角）、グルコサミン（黒丸）若しくはガラクト
ース（白丸）で生合成的にラベルされた調製培地を、セルロースカラムクロマト
グラフィーによって分離し、５ｍｌの分画を回収して、２００μｌをBeckman液
体シンチレーションカウンターでカウントした。結果が、分画当たりの分当たり
のカウント（ｃｐｍ）として、図１に示される。矢印は、特定の分画で使用され
た溶媒系を示す。図１の結果は、これらの放射性構成成分が、上清から得られた
ＴＡＦ分画内に取り込まれ、且つ、ＴＡＦ分画が、ＩＰＧと同じ方法によって単
離できることを示す。

【００７１】調製培地のＤＮＡ合成に対する効果二つの異なる濃度（１０％及び２０％）の調製培地を、「方法」に記載された
ように、試験ＦａＯ細胞における活性の刺激についてアッセイした。セルロース
カラムクロマトグラフィーによる調製培地（２ｍｌ）の精製によって得られた分
画を乾燥物に濃縮し、水中に溶解し（２００μｌ）、活性について評価した（４
μｌ）。その結果が、コントロール（血清の添加なし）、ＦＣＳ（5％胎児子ウ
シ血清＋５％胎児ウシ血清の添加）、及び得られた分画についての、ＤＮＡ中へ
の３Ｈ−チミジンの取り込み後に得られた放射性活性（ｃｐｍ）として、図２に
示される。矢印は、特定の分画で使用された溶媒系を示す。該結果は、分画のい
くつか、特に分画２１が、調製培地の添加と同様にＦａＯ細胞の増殖を導くこと
を示す。

【００７２】調製培地のリン酸分析調製培地を、「方法」に記載されたようにセルロースを使用するカラムクロマ
トグラフィーにより分画した。分画（５ｍｌ）を回収し、乾燥物に濃縮し、水中
に溶解し（２００μｌ）、その一部（１０μｌ）をCaro等, 1997に記載されたよ
うにリン酸についてアッセイした。略記すると、サンプルを乾燥物に蒸発し、過
塩酸（７０容量％）で１８０℃で３０分加水分解した。室温に冷却した後、希釈
水（２５０μｌ）を加えた。それぞれ３及び７２ｍＭの最終濃度を生じるように
、モリブデン酸アンモニウムとアスコルビン酸を連続して加えた。発色の形成を
、９５℃で１５分加熱することによって達成した。光学吸光度を６５０ｎｍで測
定した。その結果が、分画当たりで得られたＯＤとして図３に示される。矢印は
、特定の分画で使用された溶媒系を示す。この結果は、ＴＦＡ活性と共精製され
た分画がリン酸を含むことを示し、ＴＦＡがＩＰＧであることを示唆する。

【００７３】抗ＩＰＧモノクローナル抗体で処理された調製培地のＦａＯ細胞の増殖に対する
効果ウェル当たり１μｇの濃度で抗ＩＰＧモノクローナル抗体２Ｄ１、５Ｈ６及び
２Ｆ１の存在下で、「方法」に記載された調製培地の刺激活性を測定するために
、試験ＦａＯ細胞を使用した。図４に示された結果は、コントロール（血清の添
加なし）、ＦＣＳ（５％胎児子ウシ血清＋５％胎児ウシ血清の添加）及び抗体を
含むサンプルについての、ＤＮＡ中への³Ｈ−チミジンの取り込み後に得られた
放射性活性（ｃｐｍ）として表される。この結果は、全ての三種の抗体が、Ｆａ
Ｏ細胞に対する調製培地の添加によって導かれる増殖活性に対してアンタゴニス
トとして機能し、抗体２Ｆ１は最大の阻害効果を有することを示す。

【００７４】ラット肝臓Ａ及びＰ分画プロフィール二つのラット肝臓から得られたＩＰＧを、「方法」に記載されたようにセルロ
ースカラムクロマトグラフィーを使用して分画した。得られた分画を乾燥物に蒸
発し、水中に溶解し（２００μｌ）溶液の一部（１．２５μｌ）を三重で生物学
的活性についてアッセイした。その結果が、コントロール（血清の添加なし）、
ＦＣＳ（１０％胎児ウシ血清の添加）及び分画についての、3T3EFGTRI7のＤＮＡ
中の³Ｈ−チミジンの取り込み後に得られた放射性活性（ｃｐｍ）として表され
る。全ての分画は、ＩＰＧ−Ｐの分画２６を除いて（図５）、１／８０の最終濃
度でアッセイされ、分画２６は１／４０及び１／１６０の最終濃度で試験された
。矢印は、特定の分画で使用された溶媒系を示す。この結果は、セルロースクロ
マトグラフィーが、ＩＰＧ、例えば天然ソース物質から得られたＩＰＧの単離及
び精製のための有効な手段であることを示す。

【００７５】ＩＰＧ−Ｐ型の分画２６のＰＤＨ活性ＰＤＨ活性を、Caro等, 1997に記載されたように測定した。分画２２，２６及
び２７の一部（１０ｍｌ）をアッセイした。その結果が、組織のグラム当たりの
ユニットとして表されたＰＤＨ複合体の活性として表される。１ユニットのＩＰ
ＧＰＤＨ活性は、５０％までＮＡＤＨ生産の規定の割合を増大するにのに必要
とされる量である。分画２２＝０．１２３ユニット／ｇ分画２６＝２．０９ユニット／ｇ分画２７＝０．５２３ユニット／ｇ。

【００７６】この結果は、セルロースクロマトグラフィーを使用してラット肝臓から精製さ
れたＩＰＧが、特徴的なＰ型ＩＰＧの生物学的活性を有することを示す。

【００７７】ラット肝臓ＩＰＧ−Ｐのリン酸分析二つのラット肝臓から得られたＩＰＧ−Ｐを、「方法」に記載されたセルロー
スを使用するカラムクロマトグラフィーにより分画した。分画（５ｍｌ）を回収
し、一部（１００μｌ）をCaro等, 1997に記載されたようにリン酸についてアッ
セイした。各分画を乾燥物に蒸発し、１８０℃で３０分過塩酸（７０容量％）で
加水分解した。室温に冷却後、希釈水（２５０μｌ）を加えた。それぞれ３及び
７２ｍＭの最終濃度を生ずるように、モリブデン酸アンモニウムとアスコルビン
酸を連続して加えた。発色の形成を、９５℃で１５分加熱することによって達成
した。光学的な吸光度を６５０ｎｍで測定した。図８の結果は、分画当たりで得
られたＯＤとして示された。矢印は、特定の分画で使用された溶媒系を示す。こ
の結果は、セルロースクロマトグラフィーを使用して精製されたＰ型ＩＰＧがリ
ン酸を含むことを示す。

【００７８】寄託この出願にサポートされるハイブリドーマ２Ｆ７、２Ｄ１及び５Ｈ６の寄託が
、Rademacher Group Limited (RGL), The Windeyer Building, 46 Cleveland St
reet, London WIP 6DB, UKにより、ブタペスト条約の下でEuropean Collection
of Cell Cultures (ECACC)になされた。寄託は、1998年5月12日('201)及び1998
年3月9日('212及び'901)に、登録番号98051201、98031212及び98030901を与えら
れた。ＲＧＬは、ＥＰＣ規則２８及び２８ａのように、これらの物質の寄託を支
配する適切な国内法に従って、この物質を公衆に入手可能とされる物質の無制限
で無制約な承諾を与える。この結果として、ＥＰＣ規則２８（４）の下での専門
家の意見が要求される。

【００７９】「参考文献」

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】図１Ａは、セルロースカラムクロマトグラフィーによる調製
培地の分画を示す（０〜４００ｃｐｍ）。分画当たりの分ごとのカウント（ｃｐ
ｍ）として、結果が示される。矢印は、特定の分画で使用された溶媒系を示す。

【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａの縦軸を０〜５０ｃｐｍに修正したもので
ある。

【図２】図２は、調製培地のＤＮＡ合成に対する効果を示す。二つの異
なる濃度（１０％及び２０％）での調製培地を、試験Ｆａｏ細胞における活性の
刺激についてアッセイした。コントロール（血清の添加なし）、ＦＣＳ（５％胎
児子ウシ血清＋５％胎児ウシ血清の添加）、及び得られた分画について、ＤＮＡ
中への３Ｈ−チミジンの取り込み後に得られた放射性活性（ｃｐｍ）として、結
果が示される。矢印は、特定の分画で使用された溶媒系を示す。

【図３】図３は、セルロースカラムクロマトグラフィーによって分画さ
れた調製培地のリン酸分析を示す。分画当たり得られたＯＤとして、結果が示さ
れる。矢印は、特定の分画で使用された溶媒系を示す。

【図４】図４は、抗ＩＰＧモノクローナル抗体で処理された調製培地の
Ｆａｏ細胞の増殖に対する効果を示す。コントロール（血清の添加なし）、ＦＣ
Ｓ（５％胎児子ウシ血清＋５％胎児ウシ血清の添加）、及び抗体を含むサンプル
について、ＤＮＡ中への３Ｈ−チミジンの取り込み後に得られた放射性活性（ｃ
ｐｍ）として、結果が示される。

【図５】図５は、ラット肝臓ＩＰＧＡ及びＰ分画プロフィールを示す
。コントロール（血清の添加なし）、ＦＣＳ（１０％胎児子ウシ血清の添加）、
及び分画について、3T3EFGTR17細胞のＤＮＡ中への３Ｈ−チミジンの取り込み後
に得られた放射性活性（ｃｐｍ）として、結果が示される。全ての分画は、１／
８０の最終ＩＰＧ−Ｐ濃度でアッセイされ、ＩＰＧ−Ｐの分画２６だけは、１／
４０と１／１６０の最終濃度で試験された。矢印は、特定の分画で使用された溶
媒系を示す。

【図６Ａ】図６Ａは、ラット肝臓ＩＰＧＡ及びＰ分画プロフィールを
示す。コントロール（血清の添加なし）、ＦＣＳ（１０％胎児子ウシ血清の添加
）、及び分画について、3T3EFGTR17細胞のＤＮＡ中への３Ｈ−チミジンの取り込
み後に得られた放射性活性（ｃｐｍ）として、結果が示される。全ての分画は、
１／８０の最終ＩＰＧ−Ａ濃度でアッセイされた。矢印は、特定の分画で使用さ
れた溶媒系を示す。

【図６Ｂ】図６Ｂは、図６Ａの縦軸を０〜６０００ｃｐｍに修正したも
のである。

【図７Ａ】図７Ａは、セルロースカラムクロマトグラフィーによるラッ
ト肝臓から分画されたラット肝臓ＩＰＧ−Ｐのリン酸分析を示す。分画当たりで
得られたＯＤとして、結果が示される。矢印は、特定の分画で使用された溶媒系
を示す。

【図７Ｂ】図７Ｂは、図７Ａの縦軸を０．０〜４．０ＯＤに修正したも
のである。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年２月１３日（２００１．２．１３）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００３６】さらなる実施態様として、ＩＰＧアンタゴニストは、例えば腫瘍細胞の増殖を
促進するようなＴＦＡ活性を有しないＩＰＧといった、関連する性質において生
物学的に不活性であるＩＰＧ若しくは合成分子のような、競合的アンタゴニスト
である。この後者のタイプのアンタゴニストの例は、GB-A-9828560.4(WO00/3869
8)及び関連出願に記載されたヒトにおけるブタ肝臓Ａ型ＩＰＧの使用である。合
成化合物は、化学的方法によって若しくはコンビナトリアルケミストリーを使用
して生産され、次いでＩＰＧアンタゴニスト活性についてスクリーニングされて
もよい。これらの化合物はそれ自体有用であり、若しくは類似体のデザインにお
いて使用され、医薬品の開発のための候補リード化合物を提供してもよい。合成
化合物は、それらが比較的合成が容易である場合、若しくはそれらが医薬品とし
て投与するのに適したものとする特性を有する場合に望ましく、例えばペプチド
であるアンタゴニストが、胃腸におけるプロテアーゼによって分解されるのであ
れば、経口組成物のための不適切な活性剤であろう。類似体のデザイン、合成及
び試験は一般的に、標的特性のための数多くの分子をランダムにスクリーニング
することを避けるために使用される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 43/00 Ａ６１Ｐ 43/00 １１１１１１Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｔ 33/50 33/50 ＵＺ 33/53 33/53 Ｓ 33/531 33/531 Ａ 33/574 33/574 Ｚ 33/577 33/577 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 2G045 BB20 CA25 CA26 CB01 CB03 CB21 DA30 DA80 FB01 FB03 FB06 FB07 GC10 JA20 4C084 AA17 NA14 ZB262 ZC412 4C085 AA13 AA14 4C206 AA01 AA02 CA09 MA01 MA04 NA14 ZB26 ZC41

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ガンの治療のための医薬の調製のための、腫瘍細胞の増殖を
減少する特性を有するイノシトールホスホグリカン（ＩＰＧ）アンタゴニストで
ある物質の使用。
【請求項２】該物質が、炭水化物を含むシクリトールであり、且つ腫瘍細
胞の増殖を導く生物学的活性を有する、Ａ型物質のアンタゴニストである、請求
項１記載の使用。
【請求項３】該アンタゴニストが、（ａ）ＩＰＧの放出を阻害可能である物質、若しくは（ｂ）ＩＰＧに結合することによってＩＰＧの濃度を減少可能な物質、若しくは
（ｃ）ＩＰＧの作用を減少可能な競合的試薬である物質である、請求項１または２記載の使用。
【請求項４】該アンタゴニストが、競合的ＩＰＧアンタゴニストである、
請求項３記載の使用。
【請求項５】該ＩＰＧアンタゴニストが、ＩＰＧを特異的に結合可能であ
る抗ＩＰＧ抗体である、請求項３記載の使用。
【請求項６】該抗体が、ＩＰＧの活性を中和可能である、請求項５記載の
使用。
【請求項７】ＩＰＧの活性が、腫瘍細胞の増殖である、請求項６記載の使
用。
【請求項８】該抗体が、ECACCに登録番号98051201、98031212及び9803090
1の下で寄託された、ハイブリドーマ２Ｆ７、２Ｄ１若しくは５Ｈ６によって生
産されるモノクローナル抗体である、請求項５から７のいずれか一項記載の使用
。
【請求項９】該アンタゴニストが、グリコシルホスファチジルイノシトー
ル特異的ホスホリパーゼＣタイプ（ＧＰＩ−ＰＬＣ）のインヒビターである、請
求項３記載の使用。
【請求項１０】ガンの診断及び／または予後のための、患者から得たサン
プル中のイノシトールホスホグリカン（ＩＰＧ）の存在若しくは量の使用。
【請求項１１】患者から得たサンプル中のイノシトールホスホグリカンの
存在若しくは量を測定することを含む、ガンの診断及び／または予後のための方
法。
【請求項１２】ＩＰＧの存在若しくは量が、Ａ型物質の生物学的活性を測
定することによって決定される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】Ａ型物質の生物学的活性が、ｃＡＭＰ依存性プロテインキ
ナーゼの阻害若しくは腫瘍細胞の増殖を誘導である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】以下の工程：（ａ）ＩＰＧが結合剤に結合する条件の下で、ＩＰＧに特異的に結合可能である
結合部位を有する結合剤を固定化している固体の支持体と、患者から得たサンプ
ルを接触させる工程；並びに（ｂ）結合剤に結合したＩＰＧの存在若しくは量を測定する工程；を含む、請求項１１から１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】工程（ｂ）が、（ｉ）占有された結合部位、占有されてい
ない結合部位、若しくは結合したＩＰＧに結合可能であり、ラベルを含む検出剤
と、固体の支持体を接触させる工程、並びに（ｉｉ）ラベルを検出し、サンプル
中のＩＰＧの存在若しくは量を表す値を得る工程を含む、請求項１４記載の方法
。
【請求項１６】さらに、健康な組織若しくはガン性の組織から得たスタン
ダードと、上記値を比較する工程を含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】上記ラベルが、放射性活性ラベル、化学発光ラベル、蛍光
物質、燐光物質、レーザー色素、発色色素、高分子コロイド状物質、発色性、磁
性若しくは常磁性であるラテックスビーズ、検出可能な結果を生ずる反応を触媒
する酵素である、請求項１４から１６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】固体の支持体に固定化された結合剤が、ＩＰＧに結合可能
な抗体である、請求項１４から１７のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】結合剤が、固体の支持体の所定の位置で固定化されている
、請求項１４から１８のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】Ｐ若しくはＡ型物質を精製若しくは単離するためのセルロ
ースクロマトグラフィーの使用であって、該物質が：（ｉ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）ホスファターゼを活性化する生物
学的活性を有するＰ型物質；若しくは（ｉｉ）ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼを阻害する生物学的活性を有するＡ
型物質；である炭水化物を含むシクリトールである使用。
【請求項２１】該使用が、セルロースを含むカラムと、Ｐ若しくはＡ型物
質を含むサンプルを接触させ、カラムから該物質を溶出することを含む、請求項
２０記載の使用。
【請求項２２】カラムが微結晶性セルロースを含む、請求項２０または２
１記載の使用。
【請求項２３】Ｐ若しくはＡ型物質を精製若しくは単離する方法であって
、該物質が：（ｉ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）ホスファターゼを活性化する生物
学的活性を有するＰ型物質；若しくは（ｉｉ）ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼを阻害する生物学的活性を有するＡ
型物質；である炭水化物を含むシクリトールであり、（ａ）Ｐ若しくはＡ型物質を含むサンプルを、セルロースを含むカラムに乗せ、
Ｐ若しくはＡ型物質をカラムに結合させる工程；並びに（ｂ）カラムからＰ若しくはＡ型物質を溶出する工程；を含む方法。
【請求項２４】セルロースが、微結晶性セルロースである、請求項２３記
載の方法。
【請求項２５】さらに、カラムに乗せる前に、４／１／１のブタノール／
水／エタノール（Ｂ：Ｗ：Ｅ）中に、Ｐ若しくはＡ型物質を含むサンプルを溶解
する工程を含む、請求項２３または２４記載の方法。
【請求項２６】さらに、Ｂ：Ｗ：Ｅ及びメタノールでカラムを洗浄する工
程を含む、請求項２３から２５のいずれか一項記載の方法。