JP2001504450A

JP2001504450A - 脂質生成を調節するヒト組織からのシクリトール含有炭化水素

Info

Publication number: JP2001504450A
Application number: JP51336898A
Authority: JP
Inventors: ウイリアムラーデマーカー，トーマス; カロ，ヒューゴ
Original assignee: ラーデマーカーグループリミテッド
Priority date: 1996-09-11
Filing date: 1997-09-11
Publication date: 2001-04-03
Also published as: US6303580B1; GB9618930D0; DE69701812T2; AU713103B2; EP0925305B1; WO1998011116A1; ATE192161T1; ES2147996T3; EP0925305A1; AU4130797A; US20010039027A1; CA2264938A1; DE69701812D1

Abstract

(57)【要約】この出願は、ヒト肝臓及び胎盤からのＡ−タイプのイノシトールホスホグリカン（ＩＰＧｓ）ファミリーの精製及び特性化に関する。これらの物質は、Ａ−タイプＩＰＧ分画に伴う生物学的活性、即ち、脂質生成活性の調整及びｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼの阻害を有することが示される。これらの化合物の特性化は、金属イオン、特にＺｎ²⁺を含有し、ホスフェートを含むことがあることを示した。これらの化合物及びそれらのアンタゴニストは、例えば、糖尿病のための医薬、及び、合成類似物のスクリーニングにおける用途を有している。

Description

【発明の詳細な説明】脂質生成を調節するヒト組織からのシクリトール含有炭化水素発明の分野本発明は、インシュリン及び脂質精製を調節する他の成長因子の第２のメッセンジャーの特性化に関する。特に、本発明は、Ｚｎ²⁺イオンも含むシクリトール (cyclitol)含有炭化水素である物質、ヒト肝臓またはヒト胎盤から得られるシクリトール含有物質、これらの物質を含む組成物、及びこれらの物質の医療的処理方法における使用に関する。発明の背景成長因子の細胞に対する作用の多くは、イノシトールホスホグリカン（ＩＰＧ）第２メッセンジャーのファミリーに媒介されると考えられている（TW Rademac her等，Brazilian J．Med．Biol．Res.，27，327-341(1994)）。ＩＰＧの源は、胞膜に存在する”フリー”形態のグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）であると考えられている。ＩＰＧは、成長因子の細胞表面のレセプターへのリゲーション(ligation)に続くホスファチジルイノシトール−特異的ホスホリパーゼの作用によって放出されると考えられている。ＩＰＧが多くの成長因子作用を媒介するという証拠があり、その成長因子には、インシュリン、神経成長因子、肝実質細胞成長因子、インシュリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、線維芽細胞成長因子、形質転換成長因子β、ＩＬ−２のＢ細胞及びＴ細胞への作用、副腎皮質細胞のＡＣＴＨシグナリング、顆粒層細胞のＩｇＥ、ＦＳＨ及びｈＣＧ刺激、チロイド細胞のチロトロビン刺激、初期発育耳での細胞増殖、及びラットホ乳類腺が含まれる。しかし、今日まで、この領域の研究は、インシュリンに応じて細胞によって放出される第２メッセンジャーに集中していた。例えば、インシュリンは、筋細胞、脂肪細胞、ヘパトーム細胞及びＴ細胞における膜結合ＧＰＩ分子の迅速な加水分解を刺激する。近年、少なくともインシュリンが関与しているところでは、放出されたＩＰＧが第２メッセンジャーとしての実質的役割を演じ、実際にホルモンの不存在下でインシュリンの多くの効果を模擬することができることが明らかになった。可溶性ＩＰＧ分画は、ラット組織（肝臓、腎臓、筋肉脳、脂肪、心臓）及びウシ肝臓を含む種々の動物組織から得られていた。また、ＩＰＧ生物学的活性は、マラリア寄生されたＲＢＣ及びミコバクテリウムにおいても検出されている。抗イノシトールグリカン抗体の、インシュリンのヒト栄養膜細胞層及びＢＣ３Ｈ１筋細胞に対する作用またはウシ由来ＩＰＧのラット横隔膜及びトリ神経節に対する作用を阻害する能力は、幾つかの三次元的特徴の種を越えた変換を示唆している。しかし、種特異的な複合糖質が共通の特性であり、非ヒト由来のいＰＧに決定された構造的特性がヒト由来の物質には見られないことは周知のとなっている。我々は、ＩＰＧ第２メッセンジャーのファミリーを、それらの生物学的活性に基づいて、明確なＡ−タイプとＰ−タイプのサブファミローに分類した。ラットにおいて、Ａ−タイプ及びＰ−タイプのメディエータは、組織特異的であることが示された（Kunjara等，Biopolymers and Bioproducts:Structure，Function a nd Application，J．Svast等，(編)，Dokya Publications，301-306，（1995））。以前は、組織由来のＩＰＧ分画から単一の精製された成分を単離するのは不可能であり、構造的特性化するのに十分な量より極めて少なかったが、代謝ラベル及び切断技術からの間接的証拠に基づくＩＰＧ含有分画の生物学的活性の研究及び非ヒト源の分画からの活性成分を同定する推量が行われていた。生物学的活性の研究は、Ａ−タイプメディエータが、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（活性化）、ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ（阻害）、アデニレートシクラーゼ（阻害）、及びｃＡＭＰホスホジエステラーゼ（刺激）といった多くのインシュリン依存性代謝効果の活性を変化させることを示した。これに対して、Ｐ−タイプメディエータは、ビルベートデヒドロゲナーゼホスファターゼ（刺激）及びグリコーゲンシンターゼホスファターゼ（刺激）等の酵素の活性を変化させる。Ａ−タイプメディエータは、インシュリンの脂肪細胞に対する脂質生成活性を模擬するが、Ｐ−タイプメディエータは、インシュリンの筋肉に対するグリコーゲン仮性を模擬する。Ａ−タイプ及びＰ−タイプの両方のメディエータは、血清フリー媒質中の線維芽細胞に添加されたときマイトジェンである。メディエータの線維芽細胞増殖を刺激する能力は、細胞がＥＧＦ−レセプターでトランスフェクションされると向上する。Ａ−タイプメディエータは、トリ(chick) 蝸牛前庭の神経節における細胞増殖を刺激することができる。これらの研究にも関わらず、ヒトにおけるインシュリン作用の主要な標的器官における可溶性のＩＰＧタイプメディエータのファミリーは未だに確立されていない。さらに、この領域の研究は、分画中のＡ−及びＰ−タイプＩＰＧの能力の制限によって厳格に束縛され、Ａ−及びＰ−タイプ生物学的活性を有するＩＰＧ分画の活性成分の同定、単離及び特性化において実験的な困難性が存在する。即ち、chiro及びmyoイノシトールの尿素の測定に関する研究は、内因性ＩＰＧと糖の食事源の両方の破壊が存在するという事実によって複雑化される。従って、この領域の従来の研究は、Ｐ−タイプメディエータがchiro-イノシトールを含み、Ａ−タイプメディエータがmyo-イノシトールを含むと仮定しており、注意して解釈しなければならない。著者が、chiro-イノシトールではなくビニトールであるＰ−タイプメディエータにおいてイノシトールを誤って同定したと報告しているFonteles，MC，Huang，LC，Larner，J，Diabetologia，39:731-734，(1996) を参照。ビニトールは、炭化水素分析に用いられる酸性条件でchiro-イノシトールに変換されないので、これは誤同定である。さらに、放射性ヌクレオシドでの代謝性ラベルによって単離した物質の分析、または抽出した物質の単離後ラベル化は、化学的活性物質と関連づけられない。それは、ラベルした物質に従うだけで、実際の活性物質はともに単離されるがラベルされていないからである。さらに、構造特性の決定に用いられる化合物の種々の酵素または化学的な処理は、化合物を不活性化し、さらなる構造段階に進むことを不可能にする。それは、もはや活性及び構造に関係しないからである。また、Ａ−及びＰ−タイプＩＰＧ分画の活性成分はタンパク質ではなく炭化水素であると考えられるので、組み換えＤＮＡ技術では製造できない。よって、この分野においてこれらの成分の化学的同定の推量が今日までなされているが、活性成分の単離はなされておらず、それがＡ−あるいはＰ−タイプ生物学的活性を有することは示されていない。発明の概要ここに報告するヒトの組織からの我々の精製物は、非−放射ラベルの化合物を生成し、それはDionexクロマトグラフィ及びマススペクトルで可視化される。ラットにおいて、我々は、組織のインシュリン刺激に対して提示される化合物の量における変化を関連づけることができた。ラット化合物は、ヒト化合物の単離に用いられるのと同じプロトコールで単離されるので、類推により、ここに記載するヒト物質は、インシュリン刺激に応じて放出される。このことにより、それらはインシュリン応答性化合物と定義される。我々は、Vidac ＨＰＬＣクロマトクラフィを用いてＡ−タイプ分画を精製し、得られた化合物がＡ−タイプ生物学的活性を有することを示した。広くは、本発明はヒト肝臓からのＡ−タイプＩＰＧ分画の活性成分の単離に基づき、それは、このＡ−タイプ物質の最初の特性化に十分な量で単離される。特に、この特性化は、この物質がＺｎ²⁺イオンを含有し、Ａ−タイプＩＰＧ分画に伴う生物学的活性、即ち、脂質生成活性の調節及びｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼの阻害を有することを示した。従って、本発明は、一態様において、Ｚｎ²⁺イオンを含み、脂質生成活性の調整及びｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ阻害の活性を有するシクリトール含有炭化水素である、ヒトの肝臓または胎盤から得られる単離されたＡ−タイプ物質を提供する。この発見は、Vydac ＨＰＬＣクロマトグラフィを用いて単離されたＡ−タイプ分画の幾つかがホスフェートを含まないが生物学的に活性であることによってなされ、ホスフェートが生物学的活性に必須ではないことを示している。従って、本発明において、”イノシトールホスホグリカン”又は”ＩＰＧ”で表されるものは、ホスフェートを含まない化合物も包含する。これらの化合物は、イノシトールグリカン（ＩＧ）とも呼ばれる。さらに我々は、Ａ−タイプ物質が以下の特性を有することも見いだした。１．４／１／１のブタノール／エタノール／水を溶媒として用いた下降ペーパークロマトグラフィにおいて起点近くに泳動すること。２．物質の幾つかは、活性に直接関係するホスフェートを含むこと。３．Dowex AG50（Ｈ＋）カチオン交換樹脂に結合すること。４．Ｃ１８親和性カラムに結合しないこと。５．ＡＧ３Ａアニオン交換樹脂に結合すること。６．活性がプロナーゼ耐性であること。７．これらは、DionexクロマトグラフィシステムまたはVidac HPLCクロマトグラフィを用いて検出されること（図７から９参照）。また、この物質は、Ａ−タイプＩＰＧ分画に伴う以下の活性の一つ又はそれ以上を具備する。（ａ）アデニレートシクラーゼを阻害すること；（ｂ）血清フリー媒質中のＥＧＦ−トランスフェクションした線維芽細胞に添加したときマイトジェン性であること；または、（ｃ）脂肪絹胞において脂肪生成を刺激すること。即ち、従来技術ではＡ−タイプＩＰＧに伴う生物学的活性はウシ及びラット組織から得られた分画で検出されることが開示されているが、その分画から単離及び特性化されておらず、Ａ−タイプＩＰＧ生物学的活性を有することは示されていない。さらなる態様において、本発明は、シクリトール含有炭化水素である物質を提供し、当該物質はＺｎ²⁺イオンも含み、任意にホスフェートを含んでいてもよく、ヒト肝臓または胎盤から、（ａ）液体窒素中で即座に凍結させた組織から加工した肝臓ホモジネートを加熱及び酸処理することにより抽出物を作製し、（ｂ）得られた溶液を、遠心分離及び木炭処理の後、ＡＧ１−Ｘ８（ギ酸形態）アニオン交換樹脂と終夜相互作用させ、（ｃ）カラムを５０ｍＭのＨＣｌで溶離することによりＡ−タイプＩＰＧ活性を持つ分画を回収し、（ｄ）ｐＨ４．０に（ｐＨ７．８を越えないように）中和し、分画を凍結乾燥して物質を単離し、（ｅ）４／１／１のブタノール／エタノール／水を溶媒として用いた下降ペーパークロマトグラフィを採用し、（ｆ）ピリジン／酢酸／水中で高電圧ペーパー電気泳動を用いて精製し、そして、（ｇ）Dionexアニオン交換クロマトグラフィを用いた精製、またはVida c ＨＰＬＣクロマトグラフィによる精製により得られる。さらなる態様において、本発明は、Ｚｎ²⁺イオンを含み、脂質生成活性の調整及びｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ阻害の活性を有する、シクリトール含有炭化水素である単離されたＡ−タイプ物質を提供し、この物質は、（ａ）ネガティブモードＭＡＬＤＩマススペクトルを用いて決定された表３及び４に示すような分子量、あるいは、２１１ｍ／ｚの構造単位の一つまたはそれ以上の付加またはサブトラクションによって表３及び４に記載した分子量の一つに関連する分子量を有する、または、（ｂ）ボジテイブモードＭＡＬＤＩマススペクトルを用いて決定された表５に示すような分子量、あるいは、２１１ｍ／ｚの構造単位の一つまたはそれ以上の付加またはサブトラクションによって表５に記載した分子量の一つに関連する分子量を有する。さらなる態様では、本発明は上記の物質を含有し、同時または続けて問うよされるインシュリンまたはＰ−タイプ物質と組み合わせてもよい製薬組成物を提供する。これらの組成物は、患者の脂質生成反応が、何らかの経路で、インシュリンなどの成長因子に応じたＡ−タイプＩＰＧの生成が相対的に低下するように影響されている疾患の治療に用いられる。さらなる態様において、本発明は、上記の物質に対するアンタゴニスト及びそのアンタゴニストを含有する製薬組成物を提供する。これらの組成物は、Ａ−タイプＩＰＧが過剰生成されている病状、例えば肥満ＮＩＤＤＭ患者の治療、及び／またはＡ−タイプＩＰＧの活性のひとつにに拮抗させるのに有効である。そのようなアンタゴニストは、Ａ−タイプと競合するが、ほかでもなくその生物学的活性は持たない関連ＩＰＧであってもよい。さらなる態様では、本発明は、医療的処理方法における、上記の物質またはアンタゴニストを提供。Ａ−タイプＩＰＧの活性成分の一部又は全部を含む合成化合物は、治療薬として有用であると考えられる。図面の簡単な説明図１は、ヒト肝臓からのメディエータの精製したＡ−タイプファミリーのDX50 0 HPLCを示す。図２は、ＥＧＦＲＴ１７線維芽細胞及びＰＤＨホスファターゼの刺激を示す。ストックしたヒト肝臓由来のタイプ−Ａ及びタイプ−Ｐの連続希釈液を、それらの増殖刺激能力について検定した。コントロールは、ＩＰＧを添加した血清フリー媒質中での線維芽細胞の増殖を示す。図３は、下降ペーパークロマトグラフィによるＩＰＧの精製を示す。パネルＡ及びＢは各々コントロール及びプロナーゼＥ−処理ＩＰＧタイプ−Ａ及びタイプ −Ｐの下降ペーパークロマトグラフィのプロフィールで、次いでホスフェート含有量を分析された。パネルＣ及びＤは、同じクロマトグラフ分画におけるフリーのアミノ酸分析を示す。明確にするために、各パネルにおいて、プロナーゼ処理サンプルについて最初の１０の分画のみを記載した。非処理メディエータについてのプロフィールも同じであった。溶媒フロントは＋３５ｃｍであった。図４は、ＩＰＧタイプ−Ａ及びタイプ−Ｐメディエータの高電圧電気泳導を示す。図４ａは、ＩＰＧタイプ−Ｐ（ブラック）ＨＶＥの代表的な電気泳導グラフ及び引き続くホスフェート検出を示す。ブロモフェノールブルー（ＢＢ）、イノシトールモノホスフェート（ＩＰＩ）及びイノシトールジ／トリホスフェートの泳導位置は矢印で示した。図５は、インシュリン吸入に続くＩＰＧ放出の量的増加を示す。図６は、DX500アニオン交換クロマトグラフィによって検出したインシュリン応答性のＩＰＧのファミリーである。＊を付したピークは、プレ−インシュリン刺激したラット肝臓には存在しない。図７は、Vydac HPLCクロマトグラフィを用いて単離及び精製したＡ−タイプ物質のファミリーのホスファターゼ含有量を示す。図８は、Vydac HPLCクロマトグラフィを用いて単離及び精製した、選択されたＡ−タイプ物質の生物学的活性を示す。図９は、Vydac HPLCクロマトグラフィを用いて単離及び精製したＡ−タイプ物質のDionexピークを示し、この分画が図１及び６におけるピーク２３に相当することを示している。図１０及び１１は、インシュリン刺激後に肝臓から単離したＡ−タイプＩＰＧのファミリーの高分解能MALDIマススペクトル（ネガティブモード）を示す。スペクトルの主要なピークは、表３及び４に示した。図１２は、Ａ−タイプＩＰＧのファミリーの対応する高分解能HALDIマススペクトル（ポジティブモード）を示す。主要なピークは表５に示した。詳細な説明模擬的設計周知の製薬的活性化合物の模擬物(mimetics)の設計は、”先行(lead)”化合物に基づく医薬の開発の知られた手法である。これは、活性化合物が合成困難又は高価である場合や、例えばペプチドが消化管においてプロテアーゼによって即座に分解されてしまうため、経口組成物には適していないように、特定の投与方法に適していない場合に望ましい方法である。模擬的設計、合成及び試験は、一般に、目的とする特性のための大量の分子のランダムなスクリーニングを避けるために行われる。与えられた目的とする特性を有する化合物からの模擬物の設計において、共通に用いられる幾つかの段階がある。まず、目的とする特性を決定するのに重要な特定の部分を決定する。活性領域を構成する化合物のこれらの部分は、その”薬剤中心(pharmacophre)”と呼ばれる。薬剤中心が一度見いだされれば、その構造は、例えばスペクトル技術、Ｘ線回折データ及びＮＭＲ等の広範な出所からのデータを用いて、物理的特性、例えば立体化学、結合、サイズ、及び／または電荷に従ってモデル化される。このモデル化過程には、コンピュータ分析、類似性マッピング（原子間の結合ではなく、薬剤中心の電荷及び／またば容積のモデル化）、及び他の技術を用いることができる。この試みの変形方法では、リガンドの三次元構造及びその結合相手がモデル化される。これは、リガンド及び／またば結合相手が結合のコンホメーションを変化させる場合に特に有用であり、模擬物の設計にこれを考慮してモデル化することができる。次いで、薬剤中心を模擬する化学的基がグラフトされるテンプレート分子が選択される。テンプレート分子及びそれにグラフトされる化学的基は、模擬物が合成しやすく、製薬上許容され、in vivoで分解しない一方、先行化合物の生物学的活性は維持するように便利に選択される。この手法で見いだされた模擬物は、次いで、それらが目的とする特性を有しているか、あるいは、それをどの程度発揮するかについてスクリーニングされる。次に、さらなる最適化または修正が行われ、in vivoまたは臨床試験のための最終的な１つ又はそれ以上の模擬物に到達する。本発明の場合、Ａ−タイプＩＰＧの活性成分の全部または一部を含有する合成化合物は、治療薬として有効であると考えられる。アンタゴニストＡ−タイプ物質のアンタゴニストは、以下の特性の一つ又はそれ以上を具備する物質を含む。（ａ）Ａ−タイプメディエータの放出を阻害することのできる物質；（ｂ）結合物質を介してＡ−タイプメディエータのレベルを低下させることのできる物質（例えば、抗体または特異的結合性タンパク質）；及び／または、（ｃ）Ａ−タイプメディエータの効果を低下させることのできる物質。一つの実施態様では、ＩＰＧアンタゴニストは、特異的結合性タンパク質である。天然の特異的結合性タンパク質は、生物学的サンプルのＩＰＧに結合するタンパク質についてのスクリーニングによって得られる。さらなる実施態様では、アンタゴニストは、Ａ−タイプＩＰＧに特異的に結合することのできる抗体である。ポリクローナル及びモノクローナル抗体の製造は、この分野で確立されている。モノクローナル抗体は、組み換えＤＮＡ技術の技術を施して、元の抗体の特異性を保持した他の抗体またはキメラ分子を製造することもできる。このような技術は、抗体の免疫グロブリン可変領域または相補的決定領域（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの固定領域または固定領域プラスフレームワーク領域に導入することを含む。例えば、EP-A-1 84187、GB-A-2188638、及びEP-A-239400参照。モノクローナル抗体を製造するハイブリドーマは、遺伝子突然変異または他の変化を施され、製造される抗体の結合特異性を変化させることも変化させないこともある。抗体は、この分野で標準的な技術を用いて得られる。抗体製造方法は、ホ乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、又はサル）のタンパク質又はそのフラグメントでの免疫化を含む。抗体は、免疫化した動物から、この分野で周知の多くの技術を用いて得ることができ、好ましくは抗体の目的とする抗原に対する結合を用いてスクリーニングされる。例えば、ウェスタンブロット技術または免疫沈降法を用いることができる（Armitage等，Nature，357:80-8 2，1992）。動物からの抗体及び／または応対産生細胞の単離は、その動物の殺傷段階を含むこともある。動物の免疫化に換えてまたはそれに付け加えて、タンパク質に特異的な抗体は、発現された免疫グロブリンの可変ドメインの組み換えで製造されたライブラリから、例えば、表面に機能的免疫グロブリン結合ドメインを表現しているラムダバクテリオファージまたは糸状バクテリオファージを用いて得ることもできる；例えば、W092/01047参照。ライブラリは無傷、即ち、如何なるタンパク質（またはフラグメント）でも免疫化されていない生物から得られる配列からなるものであってもよく、あるいは、目的とする抗原にさらされた生物からえた配列を用いて構成してもよい。本発明の抗体は、多くの方法で修飾してよい。確かに、”抗体”なる用語は、要求される特異性を有する結合ドメインを持つ任意の結合物質を包含するものとして解釈すべきである。即ち、本発明は、抗体フラグメント、抗体の誘導体、機能的等価物、及び相同体を包含し、形状が抗体に類似して抗原またはエピトープに結合できる合成分子を含む。抗原または他の結合相手と結合できる抗体フラグメントの例は、Ｖ_L、Ｖ_H、Ｃｌ、ＣＨ１ドメインからなるＦａｂフラグメント；Ｖ_H及びＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；抗体の一本腕のＶ_L及びＶ_HからなるＦ_Vフラグメント；ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント；単離されたＣＤＲ領域及びＦ（ａｂ ’）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合した２つのＦａｂフラグメントを含む変性フラグメントである。一本類フラグメントもまた含まれる。非ヒト源からのＣＤＲがヒトのフレームワーク領域にグラフトされたヒト化抗体は、典型的に、フレームワークのアミノ酸残基の幾つかの繰り返しを持ち、親である非ヒト抗体より低い免疫原性を持つ抗体を提供するが、それも本発明の範囲に含まれる。本発明のモノクローナル抗休を製造するハイブリドーマは、遺伝子的突然変異又は他の変化を施されてもよい。当業者は、モノクローナル抗体が組み換えＤＮＡ技術を施され、元の抗体の特異性を保持する他の抗体又はキメラ分子を製造することができるのを理解するであろう。このような技術は、抗体の免疫グロブリン可変領域または相補的決定領域（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの固定領域または固定領域プラスフレームワーク領域に導入することを含む。例えば、EP-A-184187、GB-A-2188638、及びEP-A-239400参照。キメラ抗体のクローニング及び発現は、EP-A-0120694、及び、EP-A-0125023に記載されている。要求される結合特性を有する抗体を産生するハイブリドーマも本発明の範囲内であり、宿主細胞としての、真核細胞または原核細胞は、抗体（抗体フラグメントを含む）をコードする核酸を含み、それらを発現できる。本発明は、抗体が産生される、好ましくは分泌される条件下で抗体を産生することのできる細胞の成長を含む抗体の製造方法も提供する。上記の抗体は、それらを直接的または間接的に検出可能であり、好ましくは測定可能であるシグナルを生ずるラベルまたはリポーター分子でタグ付けすることにより本発明の診断的態様に用いることもできる。リポーター分子の結合は、直接的又は間接的、共有結合的、例えばペプチド結合、または非共有結合である。ペプチド結合を介した結合は、抗体及びリポーター分子をコードする遺伝子融合の組み換え発現の結果であってもよい。一つの好ましいモードは、各抗体に、スペクトル的に離れた吸収又は放出特性を持つ個々の蛍光色素、リン光体又はレーザー色素を共有結合させることである。好ましい蛍光色素は、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリスリン及びテキサスレッドを含む。好ましい色素染料は、ジアミノベンジジンを含む。他のリポーターは、高分子コロイド粒子またはラテックスなどの粒子状材料を含み、それらは着色され、磁性化または常磁性化され、そして生物学的または化学的に活性な試薬であり、直接的または間接的に検出可能な、目で観察される、電気的に検出される、または他の方法で記録されるシグナルを生ずる。これらの分子は、例えば、発色又は変色させる、あるいは電気的特性を変化させる反応を触媒する酵素であってもよい。これらは、分子的に励起され、エネルギー状態ｎ変移を起こす結果、特徴的なスペクトル吸収又は放出をする。これらは、バイオセンサーとともに用いられる化学的実体物であってもよい。ビオチン／アビディンまたはビオチン／ストレプトアビディン及びアルカリホスファターゼ検出システムを用いることもできる。更なる実施態様では、ＩＰＧアンタゴニストは合成化合物である。これらは、従来の化学的技術によって、または組み合わせ化学を用いて製造され、次いで、ＩＰＧ活性についてスクリーニングされる。これらの化合物は、それ自体有用であるか、またはもぎ物の設計において用いられ、医薬としての開発のための候補となる先行化合物を提供する。合成化合物は、合成が比較的簡単であるか、または、医薬としての投与に適したものにする特性を持っているとき有用であり、例えばペプチドであるアンタゴニストは消化管でプロテアーゼによって分解されるならば、経口投与に適していないであろう。模擬設計、合成及び試験は、一般的に、目的とする特性について大量の分子をランダムにスクリーニングすることを回避するのに用いられる。製薬組成物本発明のメディエータ及びアンタゴニストは、製薬組成物中に処方することができる。これらの組成物は、１つまたはそれ以上のメディエータ又はアンタゴニストに加えて、制約上許容される賦形剤、キャリア、バッファー、安定化剤または当業者に周知の他の物質を含んでもよい。このような物質は、非毒性でなければならず、活性成分の効果を阻害してはならない。キャリア又は他の物質の正確な性質は、投与経路、例えば経口、静脈内、皮膚または皮下、鼻、筋肉内、腹膜内経路に依存していてよい。経口投与用の製薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末又は液体形状としてよい。錠剤は、ゼラチンなどの固体キャリアとアジュバントを含む。液体製薬組成物は、一般に、水、鉱油、動物又は植物油、鉱油または合成油といった液体キャリアを含む。生理食塩溶液、デキストロースまたは他の多糖類溶液、あるいはエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコール類を含んでもよい。静脈内、皮膚及び皮下注射用、または病変部位での注射用では、活性成分は非経口的に許容され、発熱物質を含まず、適当なｐＨを有し、等張性及び安定性である水溶液の形態とすることができる。関連分野の当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射剤、リンガー注射剤、乳酸リンガー注射剤などの等張媒質を用いて良好に調製することができるであろう。必要ならば、防腐剤、安定化剤、バッファ、酸化防止剤及び／または他の添加剤を含んでいてもよい。個体に与えられるのが、本発明のポリペプチド、抗体、ペプチド、小分あるいは他の製薬上有用な化合物であるか否かに関わらず、投与は、”予防的有効量” または”治療的有効量”とするのが好ましく（場合によっては、予防は治療と考えられる）、これは、個体に対する利益を示すのに十分である。投与される正確な量、投与の割合及び時間経過は、処理すべきものの性質及び重篤さに依存し、例えば、投与量などの決定は、一般実施者及び医師の責任範囲であり、典型的には、処理すべき疾患、患者個人の病状、輸送部位、投与方法及び実施者に知られた他の要因が考慮される。上記の技術及びプロトコールの例は、Remington's Ph armaceutical Sciences，16th eddition，Osol，A．(編)，1980に見ることができる。好ましい実施態様では、投与レベルは、オイグリセミック状態を生ずる用に決定される。組成物は、単独で、または、処理すべき状態に依存して同時または連続のいずれかで、他の処理と組み合わせて投与される。診断方法個体からの生物学的サンプル中の被分析物濃度の測定方法は、この分野で知られており、本発明の内容において、患者からの生物学的サンプル中のＰ−タイプ及びＡ−タイプイノシトールホスホグリカン（ＩＰＧ）の比率を測定するのに用いられる。これは翻って、内科医が、Ｐ−及びＡ−タイプＩＰＧのレベルの比率が、患者及び試験される状態についてのバランスを逸脱しているか否かを決定するのを可能にする。診断方法の例は、下記の実験部に記載される。好ましい診断方法は、Ｐ−及びＡ−タイプＩＰＧの比率の決定に依る。この方法は、血液、血清、組織サンプルまたは尿などの生物学的サンプルを用いうる。Ｐ−及びＡ−タイプＩＰＧ濃度を測定ためのアッセイ方法は、典型的には、Ｐ −またはＡ−タイプＩＰＧの１つまたはそれ以上、好ましくは他の分子に特異的に結合できる結合部位を持つ結合試薬を用いる。結合試薬の例は、抗体、レセプター、及びＩＰＧに徳地的に結合する他の分子を含む。便利には、結合試薬は固支持体上に、例えば区画された領域に固定化され、アッセイの間の操作を容易にする。サンプルは通常、適当な条件下で結合試薬と接触させ、サンプル中に存在するＰ−及びＡ−タイプＩＰＧを結合試薬に結合させる。次いで、結合試薬の結合部位の占有率を現像試薬を用いて測定する。典型的には、現像試薬は（例えば、放射活性、蛍光または酵素ラベルで）ラベルされ、この分野で周知の技術を用いて検出できるようにする。即ち、放射活性ラベルはシンチレーションカウンター又はやの放射計数装置を用いて、蛍光ラベルはレーザー及び共焦顕微鏡を用いて、酵素ラベルは酵素ラベルの典型的には色の変化を生ずる基質に対する作用によって検出される。現像試薬は、現像試薬が、結合試薬の結合部位を占有するために被分析物と競争する競合方法、あるいは、ラベルされた現像試薬が結合試薬に結合した被分析物または占有された結合部位に結合する非競合方法て用いられる。どちらの方法も、分析物に占有された結合部位の数を示し、従って、例えば、既知濃度の分析物を含むサンプルを用いた標準との比較により、サンプル中の分析物濃度が示される。好ましい実施態様では、これは、次いでＰ：Ａタイプの比率の測定に用いられる。方法イノシトールホスホグリカンの単離及び特性化イノシトールホスホグリカン（ＩＰＧ）は、以下のようにヒト肝臓から精製された。凍結組織（90g）を液体窒素下で粉砕し、1mMのＥＤＴＡ及び1mMの２-メルカプトエタノールを含む沸騰した50mMギ酸中に直接配置した（組織1グラム（湿式重量）当たり3mLのバッファ）。polytronミキサー（Kinematica，Littau，Switzer land)での１分間の均質化の後、溶液をさらに５分間煮沸した。次いで溶液を氷で冷却し、29,500ｇで２時間、４℃で遠心分離した。上清を10mg/mLの活性炭で３０分間４℃で攪拌しながら処理した。活性炭懸濁物を、29,500ｇで１時間、４ ℃で遠心分離し、透明な上清を回収した。次いで溶液を蒸留水で１０倍に希釈し、10%のＮＨ₄ＯＨ溶液でｐＨ6.0に調節し、次いで、ＡＧｌ−Ｘ８（ギ酸塩形態）樹脂（溶液1mL当たり0.3mLの樹脂）とともに室温で優しく振とうした。次に、樹脂をクロマトグラフィカラム（2.5×60cm）に充填し、水（２ベッド容量）及び1mMのＨＣｌ（２ベッド容量）で連続して洗浄した。次に、物質を50mMのＨＣｌ（５ベッド容量）で溶離し、ＩＰＧのＡ−タイプ分画を得た。この分画は、10 ％のＮＨ４ＯＨ溶液でｐＨ4.0に調節し、次いでロータリーエバポレータで乾燥させた。乾燥した物質を蒸留酒に再溶解させ、２回リポフィライズ(lypophilise )し、化学的及び生物学的分析のために５つのアリコートに分けた。分析のために、Ａ−タイプ調製物のアリコートを200μLのハンクス媒体に溶解させ、1MのＫＯＨでpH7.0に調節した。ヒト組織について、16g（湿式重量）の等しい組織から抽出したメディエータを、200μLの最終容量で溶解させた（ストック溶液）。従って、ストック溶液10μLは、800gの出発組織から回収されたＡ−タイプメディエータの量を示す。プロナーゼ処理ＩＰＧは、他に記載されているプロナーゼＥで処理した。簡単に言えば、酵素のストック溶液(10mg/mL）を、100mMのTris-HClバッファ、pH7.8中、６０℃で３０分間プレインキュベーションし、存在している可能性のある混入酵素を不活性化した。サンプルの設計は、プロナーゼ溶液（30μL）を、100mMのTris-HClバッファ200μL中のＩＰＧサンプルに、ｐＨ8.0、３７℃で添加することによって開始した。２時間後、３分間煮沸することにより反応を停止させ、酸析出によって除去した。ペーパークロマトグラフィによるＩＰＧ精製ＩＰＧを、最小量の水に溶解させ、3MMクロマトグラフィペーパー（3×50cm、起点は8.5cm）に適用した。下降(descending)ペーパークロマトグラフィは、ｎ- ブタノール／エタノール／水（４：１：１、v/v/v）を用いて行い、クロマトグラムを９時間展開させた。乾燥後、ペーパーをセンチメートル毎に切断し（起点から、−１から＋３５ｃｍ）、各分画に含まれる物質を水（60μL、５洗浄）で溶離した。各分画は、蒸発させて乾燥し、水又ばハンクス媒体（60μL）中に再溶解させて、フリーのアミノ基、ホスフェート含有量の測定、または生物学的活性のアッセイの前に、1NのＫＯＨで中性化した。高電圧ペーパー電気泳動クロマトグラフイの後、分画１から６から溶離された物質は、少量の水に再溶解させ、3MM電気泳動ペーパーに適用した。ブロモフェノールブルー及びトリチウム化イノシトールホスフェート混合物を標準として添加した。サンプルは、ピリジン／酢酸／水（３：１：３８７、v/v/v）、ｐＨ5.4中、80Vcm^-1で３０分間電気泳動させた。中性化合物は適した点に残ったが、負に荷電した化合物はアノード側に移動した。ペーパーを乾燥させた後、分画を1cm毎に切断し、水を用いて溶離させた。 VydacＨＰＬＣクロマトグラフィこの技術は、メディエータを含む個々の分画の単離及び精製に用いた。Ａ−タイプＩＰＧは、Vydac 301 PLX575 HPLCカラムに適用した。カラムは以下のように溶離した：溶媒：酢酸アンモニウム500mM pH5.5 勾配条件 0-5% １２分以上 5-21% 次の１３分以上 21-80% 25分以上 80-100% ５分以上。次いで、ＥＧＦ−トランスフェクション線維芽細胞を用いて、分画のホスフェート及び成長促進活性についてアッセイした。フリーなアミノ基の測定フリーなアミノ基の測定は、以下のように実施した。サンプル及び標準（0-10 0nmolのＤ-（＋）-グルコサミン塩酸塩、Sigma）を、超純水（50μL）に溶解させ、続いてホウ酸ナトリウム（0.14M、pH9）及びフルオレサミン（乾燥アセトン中で調製された0.75mg/ml）を添加した。390nmでの励起の後、475nmでの蛍光発光を分光偏光計を用いて観察した。ホスフェート含有量の測定全ホスフェートレベルは、以下のようにしてアッセイされた。サンプル及び標準（0-100nmolのＮａ₂ＨＰＯ₄）を蒸発させて乾燥させ、180℃で３０分過塩素酸（70％）で加水分解した。室温まで冷却した後、超純水（250μL）、（ＮＨ₄）₂ ＭｏＯ₄(2.5%溶液100μL)及びアスコルビン酸（10％溶液100μL）を順次添加した。サンプルを９５℃で１５分間加熱して発色させた。マイクロプレートリーダーで、655nmでの光学的吸収を測定した。ＩＰＧとイオン交換樹脂及びSep-Pak C18カートリッジとの相互作用ストック溶液（上記参照）の30マイクロリットルを、ＡＧ３−Ｘ４（ＨＯ^-）、Ａｇ５０−Ｘ１２（Ｈ⁺）のいずれかを600μL含むカラム、あるいは、Sep Pack C18カートリッジに導入し、次いで、水（５ベッド容量）で溶離した。溶液を濃縮して乾燥させ、得られた残さを30μLのハンクスに溶解させ、ｐＨ7.0に調節した。ｃＡＭＰ−依存性タンパク質キナーゼ活性の評価ＩＰＧ分画の際クリックＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼの活性阻害能力を、基質としてヒストンＩＩＡを用いて評価した。反応混合物（100μL）は、25mMのＨＥＰＥＳバッファ（pH7.6）、10μMのＭｇＡＴＰ（10⁶cpm［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ）、ヒストンＩＩＡ（50μgタンパク質）、及びＰＫＡの触媒単位（60単位/mL）を含んでいた。全ての決定において、10μLのＩＰＧ溶液（上記参照）を反応混合物に添加した。３７℃で１０分間のインキュベーションの後、反応を止め、10 %トリクロロ酢酸（100μL）及び2%ウシ血清アルブミン（10μL）でタンパク質を析出させ、タンパク質中への³²Ｐ取り込みを測定した。ビルベートデヒドロゲナーゼホスファターゼ（ＰＤＨ）活性の評価プルベートデヒドロゲナーゼ複合体（ＰＤＣ）及びＰＤＨホスファターゼは、使用するまで−８０℃に保存した。インシュリンメディエータの存在下または不存在下での、両方のＰＤＨホスファターゼのアッセイは、不活性化したリン酸化ＰＤＨ複合体の初期活性化速度に基づく。ＰＤＣの初期活性は、8-13単位/ml（酵素１谷が１μmolのＮＡＤＨ／分を生成する）であり、ＡＴＰとのインキュベーション後は、0.3-0.5単位/ml（不活性化ＰＤＣ）であった。ホスファターゼ活性の定量には２段階アッセイを用いた。不活性化ＰＤＣ（50μL）のサンプルを、ｐＨ７．０の20mMリン酸カリウムバッファ中の1mg/mLの脂肪抜きＢＳＡ、10mM のＭｇＣｌ₂、0.1mMのＣａＣｌ₂、及び1mMのＤＴＴとともに、３０℃で３分間プレインキュベーションした（全容量250μL）。この時点で、10μLのＰＤＨホスファターゼ及び10μLのＩＰＧを添加し、インキュベーションをさらに２分間続けた。この時間の最後に、200μLの混合物を回収して、300mMのＮＡＤＨ100μL に添加した。活性化ＰＤＨは、第２段階でＮＡＤＨの製造速度を測定することにより光学的に測定した。100マイクロリットルの反応停止溶液を、ｐＨ８．０の50mMリン酸カリウムバッファ、2.5mMのβ-ＮＡＤ⁺、0.2mMのＴＰＰ、0.13mMのコエンザイムＡ、0.32mMのＤＴＴ及び2mMのナトリウムビルベートを含む1mLの反応混合物に添加した。ＮＡＤＨの製造は、340nmで５分間続けた。ラット脂肪細胞における脂質生成の活性化これは、若いラットの精巣上体脂肪パッドから単離した脂肋細胞について実施した。簡単に言えば、２匹のラット精巣上体脂肪パッドからの脂肪絹胞を、8ml のクレブス・リンガー重炭酸塩中に懸濁させ、250μLの細胞懸濁物を３７℃で２時間、1%アルブミン及び5mM［Ｕ−¹⁴Ｃ］−グルコース（1μＣｉ／サンプル）を含み、インシュリン（1nM）又は10μLのＩＰＧ溶液を含むあるいは含まないクレブス・リンガー重炭酸塩中でインキュベーションした。均一にラベルされたグルコースの胞肪酸への取り込み速度を、脂質生成の測定に使用した。線維芽細胞における細胞増殖の測定ＥＧＦＲＴ１７線維芽細胞を、10%v/vのウシ血清、2mMのＬ−グルタミン、100 単位/mLのペニシリン及び100μg/mLのストレプトマイシンを含むダルベッコの変性イーグル媒質（ＤＭＥＭ）中、5%ＣＯ₂の加湿した雰囲気内で、３７℃で日常的に成長させた。細胞は、80%の占有率に達したら二次培養した。ＥＧＦＲＴ１７細胞は、ヒト内皮成長因子レセプターでトランスフェクションされたＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞である［32,35］。線維芽細胞増殖を評価するために、細胞を9 6-ウェルのミクロタイターウェルに、10%ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中ウェル当たり１０⁴ 細胞の密度でプレートした。２４時間後、媒質を除去し、細胞をハンクス媒体で２回洗浄し、血清フリーの媒体を添加し、さらに２４時間に渡って細胞をインキュベーションした。この時点において、細胞を、血清、ＩＰＧ製剤または適当なコントロールで刺激した。１８時間後、［３Ｈ］チミジン（1μＣｉ／ウェル）を各ウェルに４時間添加した。この処理の最後に、細胞をハンクス溶液で２回洗浄し、トリプシン化し、細胞ＤＮＡに伴う放射活性を細胞収穫機(harvester)を用いて測定した。細胞増殖アッセイのために、希釈は最終希釈であった。例えば、2. 5μLのストック溶液が、最終容量100μLに添加された、即ち1/40希釈。サンドイッチＥＬＩＳＡのためのプロトコール以下のプロトコールは、ヒト血清等の生物学的流体におけるイノシトールホスホグリカン（ＩＰＧ）の定量のための、間接的、非競合、固相酵素免疫アッセイ（サンドイッチＥＬＩＳＡ）を規定する。このアッセイでは、モノクローナルＩｇＭ抗体を固相に固定化した。組織培養上清、ハイブリドーマ細胞及び精製したモノクローナル抗体を腹膜に注射して誘発した腹膜腫瘍を持つマウスの腹水液を、免疫アッセイに用いた。Ｆ９６Maxiso rp Nunc-Immunoプレートを、これらのアッセイに用いた。Maxisorp表面は、タンパク質、特に抗体などの糖タンパク質がプラスチックに結合している場合に推奨される。固定化された抗体は、試験サンプル（ポジティブコントロールとして用いられるヒト血清またはＩＰＧ）からの抗原を捕捉する。架橋抗体（ウサギからの精製したポリクローナルＩＰＧ抗体）は、ビオチニル化抗−抗体を抗原に結合させるために必要とされる。検出方法は、抗−ウサギＩｇ、ビオチニル化種特異的全抗体（ロバから）、及びストレプトアビディン−ビオチニル化西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（Am ersham）、ＡＢＴＳ及びＡＢＴＳ用バッファ(Boehringer Mannheim）を用いる。ＥＬＩＳＡアッセイは、以下のように行うことができる：１．全ての段階での100μl/ウェルの添加。２．F96 Maxisorp Nunc-ImmunoプレートにおいてＰＢＳで１：１００に希釈されたモノクローナル抗体の添加。４℃で少なくとも２日間のインキュベーション。３．ＰＢＳで３回洗浄。４．蒸留水中（１：９）、室温で２時間の、ＥＬＩＳＡのブロッキング試薬（Bo ehringer Nannheim）の添加。５．ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（0.1%）で３回洗浄。６．精製したポリクローナル抗体（ＰＢＳ中１：１００希釈）、４℃で終夜の添加。７．ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（0.1%）で３回洗浄。８．抗−ウサギいｇ、ビオチニル化種−特異的全抗体（ロバから）（Amersham）の、ＰＢＳ中１：１０００希釈したものの、室温で１時間３０分の添加。９．ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（0.1%）で３回洗浄。１０．ストレプトアビディン−ビオチニル化西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（Amersham）のＰＢＳ中１：５００希釈したものの、室温で１時間３０分の添加。１１．ＰＢＳで３回洗浄。１２．２，２-アジノ-ジ-（３−エチルベンズチアゾリンスルホネート（６））ジアンモニウム塩血漿（ＡＢＴＳ）（Boehringer Mannheim）の、ＡＢＴＳ（ＢＭ）用バッファへの添加：ＡＲＴＳ用バッファは、蒸留水に添加される（１：９ v/v）。1mgのあＢＴＳを、1mlの希釈されたＡＢＴＳ用バッファに添加する。１３．405mmフィルターを用い、Multiscan Plus P 2.01の吸収を、5-15分間読む。結果ＩＰＧ単離及び生物学的活性ＩＰＧは、以下のようにヒト肝臓及び胎盤から抽出した。簡単に言えば、抽出物は、患者から取り出した後即座に液体窒素で凍結させた、従って、ホスファタ一ゼの作用を防止した組織から加工した肝臓ホモジネートの熱及び酸処理により調製した。遠心分離及び活性炭処理の後、溶液をアニオン交換樹脂（AGI-X8,ギ酸塩形態）と終夜相互作用させた。樹脂は、水と希塩酸で続けて洗浄した。50mM のＨＣｌで溶離することによりＡ−タイプ分画を生成し、それは脂肪細胞の脂質生成を刺激し、ＥＧＦレセプターでトランスフェクションした線維芽細胞の増殖を刺激した。この分画は、次いで溶媒として４／１／１ブタノール／エタノール／水を用いた下降ペーパークロマトグラフィを施し、ヒリジン／酢酸／水中での高電圧電気泳動を用いて精製し、最後にDioneex(商品名)アニオン交換クロマトグラフィを用いて精製した。図１は、鋭いスパイク（分画番号１５）を示し、これは主要なＡ−タイプ物質を示している。この分画は、次いで中性化し、数回凍結乾燥させた。金属イオン分析金属イオン分析は、DX500システムにおいて520nmでの目に見える検出で実施した。分離は、ピリジン-２，６-ジカルボン酸溶離液を持つIonpac混合ベッドイオン交換カラム及びビリジアルアゾレゾルシノールとのポストカラム反応によって行った。Ａ−タイプサンプル（Ａ１、Ａ２及びＡ３）は、100μlの水中に再構成した。この溶液10μlを取り、10μlの濃ＨＣｌを添加し、サンプルを終夜放置した。次いで、80μlの水を混合物に添加し、この溶液10μlを分析した。ブランクＨＣｌサンプルは、コントロールとして作用する。 μg/ml Zn μg/ml Mn μg/ml Fe 平均Ａ１＃１ 8.83 0.91 19.84 8.72μg/ml Zn ＃２ 8.75 1.00 19.26 0.96μg/ml Hn ＃３ 8.58 0.97 19.58 19.56μg/ml Fe Ａ２＃１ 7.74 0.91 18.88 7.66μg/ml Zn ＃２ 7.64 0.86 18.40 0.88μg/ml Mn ＃３ 7.61 0.88 19.12 18.80μg/ml Fe ブランク＃１ - - 10.24 ＃２ - - 10.26 10.28μg/ml Fe ＃３ - - 10.33 ブランク＃１ - - 8.42 8.32μg/ml Fe ＃２ - - 8.21 ブランク１及び２の平均＝9.3μg/ml Fe これは、まず最初にヒト肝臓から単離されたＡ−タイプＩＰＧがＺｎ²⁺を含むことを示している。ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼの阻害ＩＰＧのｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼを阻害する能力は、洗浄したヒストンＩＩＡに取り込まれた³²Ｐで測定した。１／１０希釈したＡ−タイプＩＰＧ分画の添加は、キナーゼ活性の78.5±9.5(n=4)パーセントの阻害を生じた。この効果は投与量依存的であり、典型的な実験では、キナーゼ活性の重大な阻害は、最終濃度１／１００以下のＡ−タイプ分画で達成された（50%阻害Ａ−タイプ）。この実験は、Ａ−タイプ分画がｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼに対する主要な阻害活性を含むことを示したラット由来ＩＰＧについての我々の以前のデータに一致する。我々は以前に、50mM分画中に存在する化合物のＩＰＧファミリーを示すのに、この活性を際だたせるためにＡ−タイプなる用語を用いていた。ＰＤＨホスファターゼの刺激Ａ−タイプ分画の、ウシ心臓から単離したビルベートデヒドロゲナーゼホスファターゼを刺激する能力を測定した。いずれのヒト肝臓もＡ−タイプ溶離液に抑制されたレベルのＰＤＨホスファターゼ刺激活性を有し、従来技術のラットの研究結果に従うと、ラットＰ−タイプＩＰＧ分画に比較して平均２．８倍低い活性を持つ。脂質生成への影響Ａ−タイプと推定されるＩＰＧを含む分画をラット脂肪細胞に添加し、この分画の脂質生成を刺激する能力を測定した。表１は、Ａ−タイプ分画が脂質生成活性を有することを示している。ヒト肝臓は、インシュリン刺激したラット肝臓と同量の脂質生成活性を有することがわかった。ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞増殖への影響Ａ−タイプＩＰＧ分画を、血清なしでの線維芽細胞増殖を支持する能力についてアッセイした。ラット組織では、いずれのＡ−タイプメディエータもアッセイにおいて活性なので、このアッセイは２つのメディエータの相対数を評価するのに用いられた［10,26,27］。Ａ−タイプヒト由来分画は、血清フリーの媒質中でＥＧＦレセプターでトランスフェクションされた線維芽細胞に添加されたとき、マイトジェン性であることが見いだされた。図２は、分画について得られた投与量依存性の効果を示す。用いた最高濃度においても飽和は得られなかった。しかし、分画は少なくともＦＣＳ単独より2-2.5倍大きな増殖を有する。下降ペーパークロマトグラフィ得られたＡ−タイプ物質の一部をプロナーゼＥで２時間処理し、次いでプロナーゼを酸析出により除去した。残った溶液を濃縮し、水に再溶解し、ｎ−ブタノール／エタノール／水を用いた下降ペーパークロマトグラフィで精製した。９時間の展開の後、ホスフェート及びフリーなアミノ基の存在を検出した。図３ａは推定Ａ−タイプメディエータの以下のホスフェート分析のクロマトグラムプロフィールを示す。ホスフェートを含む化合物が起点及び〜5cmの間に泳動するのがみられた。ペーパークロマトグラムは、図３ｃ及びｄに示すようにフリーなアミノ基の存在の分析についても分析した。フリーなアミノ基を持つ化合物も起点と 5cmの間に泳動した。プロナーゼとのインキュベーションは、図３ａに示したようなホスフェート分析で評価した化合物の泳動に相違をもたらさなかった。イオン交換膜及びSep-Pak C18カートリッジとのインキュベーションＩＰＧの、２つの異なるイオン交換樹脂及び逆相C18カラムとの相互作用における挙動を、溶離液のＥＧＦＴＲ１７ＤＮＡセルへのチミジン取り込み誘発の能力によって測定した。結果を表２に示す。逆相の場合、約80-85%の生物学的活性がＡ−タイプＩＰＧの水溶離によって回収された。これらの結果は、Ａ−タイプメディエータが親水性であることを示している。表２は、Ａ−タイプメディエータがカチオン交換カラム（AG50-X12）またはアニオン交換カラム（AG3-X4）からも回収できることを示している。これは、フリーなアミノ基及びホスフェート部分といった２つの官能基の存在と一致する。活性は金属イオンを必要とするＩＰＧはジチゾン(dithizone)とともに抽出され（補足１、２部参照）すべての金属イオンが除去される。抽出に続いて、Ａ−タイプＩＰＧは脂質生成アッセイにおいて不活性であった。ＩＰＧ含有炭化水素ヒト肝臓からの精製したＩＰＧのＡ−タイプのクロマトグラムは、パルス−アンペロメトリー検出によって検出した（条件は、補足１、４部に与えた）。イノシトールの種々の形態（myo-イノシトール、chiro-イノシトール、ピニトール）の存在は、DX500システム及びCarbo Pac MA1カラム及びパルス化アンペロメトリー検出で確認した（方法は補足１、６部に与えた）。高電圧電気泳動（ＨＶＥ）による精製下降クロマトグラフィの後にペーパーから溶離される物質に、高電圧ペーパー電気泳動をｐＨ５．４で施した。これらの条件下で、ホスフェート、カルボキシ、または硫酸基などの負電荷化合物はアノードに向けて泳動する。ホスフェート分析に続く３つの実験における代表的なペーパー電気泳動を図４に示した。ホスフェートは、起点及び、5cmから20cm泳動距離に渡る分解できないピークとして見られた。起点におけるホスフェートの存在は、この位置での化合物の回収が全電荷を中和する正電荷部分と等しい数を持たねばならないことを示す。いずれかに泳動するこれらの化合物は、正に荷電した部分（例えばアミノ、金属）を越える過剰な負電荷基（例えばホスフェート）を持つ。ＨＶＥによるＡ−タイプメディエータの活性プロフィールは、起点及び20cmにのびる広いバンドに存在する活性を持つ図４ａにしましたホスフェート分析と極めて近い鏡像をなす。 Vydac HPLCクロマトグラフィ図１に示した化合物のファミリーを含むサンプルからＡ−タイプメディエータを単離精製できることを示すために、Vydac 301 PLX575 HPLCカラムから得られた分画を、ホスフェート及び成長促進活性について分析した。図７は、種々の分画のホスフェートレベルを示し、図８は、５、１４、２５、２８、３５及び３９を含む選択された分画の生物活性(bioactivity)を示す。主要な成長促進活性は、分画２５−３９に見られた。主な活性分画のDIonex HPLCプロフィールを図９に示した。この分画は、図１及び６に示した主要ピーク２３を持つ。ＭＡＬＤＩマススペクトル図１０及び１１は、肝臓から単離されたＡ−タイプ分子の高分解能ＭＡＬＤＩマススペクトル（ネガティブモード）を示し、図１２は、同じサンプルについての対応するボジティブＭＡＬＤＩマススペクトルを示す。構造のファミリーは、 211m/z構造単位の付加によって関連づけられる、例えば、808m/z⇒1019m/z⇒123 9m/z⇒1441m/z。即ち、各低分子量ピークから、この関係は、そのファミリーの他のＡ−タイプメディエータの分子量を見いだすのに用いられる。Ａ−タイプ物質の分子量は表３から５に示す。ネガティブモードＭＡＬＤＩマススペクトルによって測定した分子量は、Ｈ⁺ の除去によってＡ−タイプ物質の実際の分子量と異なる、即ち、実際の分子量は、表３及び４の重量に＋１を加えれば得られる。ポジティブモードは、ネガティブモードと比較して５９だけm/zが増加しており、１つのＮａ⁺及びＫ⁺原子を各成分に付加することが２つのプロトンの喪失と共同していることを示す（即ち、３９＋２２−２＝５９）。即ち、Ｐ−タイプ物質の分子量は、表５に示した分子量から５７を減じれば決定できる。よって、表の結果から直接分子量を決定することができる。モノクローナル抗体ラット肝臓から連続薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）によって精製したイノシトールホスホグリカン（ＩＰＧ）を、ニュージーランドウサギ及びＢａｌｂ／ｃを従来の手法で免疫化するのに用いた。免疫化の後、モノクローナル抗体を、マウス脾臓細胞（5×10⁶細胞/ml）と突然変異骨髄細胞（10⁶細胞/ml）とを融合させる技術を用いて調製した。用いた骨髄細胞系は、ヒポキサンチン−グアニンホスホリバシルトランスフェラーゼを欠くものである。ハイブリドーマ細胞のスクリーニング方法は、抗原（ＩＰＧ）が固相に固定された非競合固相酵素免疫アッセイである。培地上清を添加し、ポジティブハイブリドーマ細胞を選択した。単一細胞クローニングを制限希釈により行った。３つのモノクローナル抗体（２Ｄ１、５ＨＧ及び２Ｐ７）についてのハイブリドーマを選択した。すべてのモノクローナル抗体は、EK-5050キット（Hyclone）を用いてＩｇＭであると決定された。すべてのモノクローナル抗体がＩＰＧに認識されることを試験するために、非競合固相酵素免疫アッセイを用いた。アッセイのために、F96 Polysorp Nunc-Im monoプレートを用いた。ある種の抗原が固定化されるアッセイには、ポリソープ表面が推奨される。１：８００に希釈された固定化抗原（ＩＰＧ）は、精製された抗体が用いられた場合、組織培養上清、腹水液からのモノクローナル抗体を捕捉した。検出方法は、抗−マウスＩｇＭ、ビオチニル化全抗体（ヤギから）、及びストレプトアビディン−ビオチニル化西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（Amersham ）、ＡＢＴＳ及びＡＢＴＳ用バッファ（Boehringer Mannheim）を用いた。ポリクローナル抗体の評価にも同じ免疫アッセイを用いた。このアッセイでは、検出方法に、抗−ウサギＩｇ、ビオチニル化種−種全抗体（ロバから）を採用した。抗体は以下の方法で精製できる。勾配プログラマーGP-250Plusを備えた高速タンパク質液体クロマトグラフィ（Pharmacia FPLC system）及び高精度ポンプp-5 00を、ポリクローナルＩＰＧ抗体の精製に用いた。ウサギ血清からポリクローナルＩＰＧを精製するのに、HiTrapプロテインＡ親和性カラムを用いた。タンパク質定量は、Micro BCAタンパク質試薬キット（Pie rce）を用いて行った。モノクローナルＩｇＭ抗体は２段階で精製した。硫酸アンモニウム析出が第１段階に選択された方法である。組織培地上清を硫酸アンモニウム（50%飽和）で処理した。第２段階の前にＰＢＳで希釈したペレットを透析チューブに移した。硫酸アンモニウム析出は一段階精製には適さないので、次いでゲル濾過を行い、ＰＢＳ中の抗体溶液をPharmacia Sepharose 4Bカラムに通した。タンパク質定量は、Perkin-Elmerラムダ1 UV/VIS分光計において220-280nmの吸収を読むことにより行った。即ち、この実施例は、Ａ及びＰ−タイプ物質に対するモノクローナル及びポリクローナル抗血清を生じさせることが可能であることを示す。これらは、アンタゴニストまたは結合試薬として用いられる。議論 50mMのＨＣｌでの溶離で単離された物質（Ａ−タイプＩＰＧ）は、ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼを阻害し、ラット脂肪細胞での脂質生成を刺激した。この分画は、ＥＧＦ−レセプターでトランスフェクションされた３Ｙ３細胞の増殖を刺激した。ヒト肝臓から単離されたＡ−タイプ分画の生物学的特性は、プロナーゼでの処理後に回復し、その活性がタンパク質またはペプチドによるものでないことを示した。ホスフェート及びフリーなアミノ基の存在は、これらの化合物がその構造にヘキソース及びヘキサミンを含むと報告されているものに類似していた。これらの化合物の炭化水素の性質は、下降ペーパークロマトグラフィにおける挙動、炭化水素含有化合物の特性、及びインシュリン刺激したラット組織から単離したＩＰＧとの類似によって支持された。すべての実験は、50mM分画におけるＡ−タイプのインシュリン模擬イノシトールホスホグリカンの存在と符合する。ヒトにおいて、グルコース代謝のポスト−レセプター組織インシュリン耐性は、非インシュリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）及び他の疾患である。耐性はインシュリンシグナル化経路の急性疾患の結果でもあり得るし、インシュリン作用の循環阻害剤でも起こりうるし、その両方である可能性もある。ＩＰＧ関連メディエータ経路の疾患は、ＮＩＤＤＭの病原学に関する実験の鍵となる標的である。インシュリンシグナル化でのＩＰＧの重要性は、in vitro及びin vivoのデータからわかる。例えば、突然変異細胞はチロシンリン酸化によってインシュリンに対してＩＰＧを製造することができないが、代謝的影響は無く[１]、キナーゼ欠乏インシュリンレセプターを持つ細胞は、インシュリン刺激に次いてＧＰＩを加水分解する[２]。また、インシュリンレセプターレベルとインシュリン作用及びＧＰＩ破壊との関係もある[３]。ＧＰＩ合成及び放出に欠陥を持つ糖尿病ＧＫラットからの細胞のインシュリン耐性は、ウシ肝臓からのＩＰＧで解消できる[ ４]。同様に、Trypanosoma bruceiから単離した酵素的及び科学的に修飾したイノシトールホスフェートグリカンに対する抗体は、インシュリンの効果をブロックする[5,6,7,8]。ストレプトゾトシン糖尿病ラットからの脂肪細胞でのＧＰＩのインシュリン刺激加水分解の障害及びビルベートデヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）及びグルコース利用の減損したインシュリン活性化が存在[５]。補足１：１．ＩＰＧ加水分解ＩＰＧ（LIA，LCA，LIP，LCP，及びブランク）、１匹のラット肝臓から得た物質について、2NのHCl（Pierce）下記のようにジチゾンで抽出）＠を用い、１１０℃で９０分間処理した。加水分解後、サンプルは２回凍結乾燥し、Ｈ₂Ｏ（200 μl）に再溶解し、もう一度凍結乾燥した。得られた物質は、200μl（Ｈ₂Ｏ）に再溶解し、10μlサンプルを、記載したイノシトール、単糖類及び金属の存在の実験に用いた。２．ＨＣｌのジチゾン処理ジフェニルチオカルバゾン（Aldrich）を記載されたようにクロロホルムから再結晶させた(Zief and Mitchel，p127)。結晶精製したジチゾンを、次いでＣｌ₃ ＣＨ＠10mg/mlに溶解させ、定沸点の6NのＨＣｌから金属混入物を抽出するのに用いた（Pierce）。 1mlのＨＣｌを500μlのジチゾン溶液で３回抽出し、次いで上記のＩＰＧ加水分解に用いた。３．胎盤ＩＰＧ。ジチゾンでの抽出 50μlのストックＩＰＧ溶液を200μlに希釈し、次いで200μlのジチゾンのクロロホルム溶液(0.1g/l)で抽出した。（用いたクロロホルムは、ジチゾン溶液調製の直前にH₂O/1N NaOH/H₂Oで抽出した。）ＩＰＧ溶液をジチゾンで抽出（２回）した後、水相をＣl₃ＣＨ（200μl、３回）で抽出した。有機相はプールし、次いで水で洗浄し、乾燥させ、Ｃｌ₃ＣＨ（2 00μl）に再溶解させた。溶液は3NのＨＣｌ（100μl）で抽出して金属を測定した。最初の水性ＩＰＧ溶液は、Dionexプロフィール及びＰＤＨアッセイでの変化を測定するのに用いた。４．Dionex方法ＩＰＧカラムとガードカラム： PA100 溶離液Ａ＝100mM NaOH Ｂ＝500mM NaOAc ＋ 100mM NaOH 勾配：＠最初： 100%Ａ、0%Ｂ＠３０分： 25%A、75%Ｂ＠３０．１分： 100%Ａ１０分間維持流速： 1ml/分検出器： ED40 ５．金属分析カラムとガードカラム： HPIC-CS5 溶離液： PDCA(6mm PDCA，50mM AcOH， 50mM NaOAc，pH4.57) 流速： 1ml/分ポストカラム試薬： 0.3mM PAR，1MAcOH，3M NH₄OH 試薬流速：〜0.8ml/分検出器 AD40 ＠ 520mm ６．イノシトール分析カラム及びガードカラム＝CarboPac MAl 溶離液；Ａ＝500mM NaOH Ｂ＝H₂O 条件：時間流速％Ａ％Ｂ最初 0.25 25 75 0.00 0.25 25 75 15.10 0.25 25 75 20 0.40 100 0 25 0.40 100 0 34 0.40 25 0 35 0.40 25 75 40 0.40 25 75 検出器： ED40 ７．単糖類分析検出器： ED40 カラム及びガードカラム＝Carbo Pac PAl 溶離液：Ａ=100mM NaOH;Ｂ＝H₂O 条件：流速：1ml/分時間％Ａ％Ｂ最初 16 84 0 16 84 17 16 84 18 100 0 23 100 0 24 16 84 30 16 84 表１の脚注＋活性の単位：活性の単位は試験系の基本レベルの50%活性化を生ずる量で定義した。 ±ラット肝臓データについては、ｎ数は別々の肝臓調製物の異なる独立した抽出物を示す。通常２匹の動物（肝臓）は抽出前にプールされる。各脂質生成アッセイは３回行った。疑似注射したラットのコントロールまたはインシュリン５０分注射後２分に抽出された肝臓について２つの値が示される。両方の群とも終夜飢えさせた。￥インシュリン値は、1994年10月から1995年10月までの期間内に実施した２０の独立した脂質生成アッセイ（各々３回測定）のものである。 §ヒト肝臓についての値は、[N]健常[D]疾患の２つの別の肝臓からである。疾患肝臓は、肝臓移植時に得た。健常肝臓は、若い健康な事故犠牲者からのものである。ｎ値は繰り返し脂質生成アッセイを意味する。−８０℃で凍結保存した疾患肝臓の別の抽出物を、１年に渡ってアッセイした。活性の変化は見られなかった。脚注 +ＥＧＦＲトランスフェクション線維芽細胞への³Ｈチミジン取り込み。Ａ及びＰタイプメディエータは異なる支持体から水で溶離した。ＩＰＧの最終濃度はストック（材料及び方法参照）の１／４０希釈である。１／８０希釈でも同様の結果が得られた。すべてのＩＰＧ刺激は投与量依存性であった。＃Ｐ−タイプの一部回収はC-18で一貫して観察された。結合した物質の回収は行わなかった。＊コントロール−培養媒質のみ、FCS含まない。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年８月１７日（１９９８．８．１７）【補正内容】請求の範囲１．Ｚｎ²⁺イオンを含み、脂質生成活性の調節及びｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ阻害の活性を有するシクリトール含有炭化水素である、ヒトの肝臓または胎盤から得られる単離されたＡ−タイプ物質。２．Ｚｎ²⁺イオンを含み、（ａ）液体窒素中で即座に凍結させた組織から加工した肝臓ホモジネートを加熱及び酸処理することにより抽出物を作製し、（ｂ）得られた溶液を、遠心分離及び活性炭処理の後、ＡＧ１−Ｘ８（ギ酸形態）アニオン交換樹脂と終夜相互作用させ、（ｃ）カラムを５０ｍＭのＨＣｌで溶離することによりＡ−タイプＩＰＧ活性を持つ分画を回収し、（ｄ）ｐＨ４．０に（ｐＨ７．８を越えないように）中和し、分画を凍結乾燥して物質を単離し、（ｅ）４／１／１のブタノール／エタノール／水を溶媒として用いた下降ペーパークロマトグラフィを採用し、（ｆ）ピリジン／酢酸／水中で高電圧ペーパー電気泳動を用いて精製し、そして、（ｇ）Dionexアニオン交換クロマトグラフィを用いた精製、またはVida c ＨＰＬＣクロマトグラフィによる精製により単離されたＡ−タイプ物質を得ることによってヒトの肝臓または胎盤から得られる、シクリトール含有炭化水素である単離されたＡ−タイプ物質。３．（ａ）ネガティブモードＭＡＬＤＩマススペクトルを用いて決定された表３及び４に示す分子量、あるいは、約２１１ｍ／ｚの構造単位の一つまたはそれ以上を付加するまたは減じることによって表３及び４に記載した分子量の一つに関連する分子量、または、（ｂ）ポジテイブモードＭＡＬＤＩマススペクトルを用いて決定された表５に示すような分子量、あるいは、約２１１ｍ／ｚの構造単位の一つまたはそれ以上を付加するまたは減じることによって表５に記載した分子量の一つに関連する分子量を有する、Ｚｎ²⁺イオンを含み、脂質生成活性の調整及びｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ阻害の活性を有する、シクリトール含有炭化水素である、ヒトの肝臓または胎盤から得られる単離されたＡ−タイプ物質。４．物質がホスフェートを含む、請求項１から３のいずれかに記載の物質。５．以下の特性：（ａ）４／１／１のブタノール／エタノール／水を溶媒として用いた下降ペーパークロマトグラフィにおいて起点近くに泳動すること；（ｂ）Ｃ−１８親和性樹脂に結合しないこと；（ｃ）Dowex AG50（Ｈ＋）カチオン交換樹脂に結合すること；（ｄ）ＡＧ３Ａアニオン交換樹脂に結合すること；または、（ｅ）物質の活性がプロナーゼ耐性であることの１つまたはそれ以上を有する、請求項１から４のいずれかに記載の物質。６．物質が、（ａ）アデニレートシクラーゼを阻害すること；（ｂ）血清フリー媒質中のＥＧＦ−トランスフェクションした線維芽細胞に添加したときマイトジェン性であること；または、（ｃ）脂肪細胞において脂肪生成を刺激することという特性を有する、請求項１から５のいずれかに記載の物質。７．請求項１から６のいずれかに記載のＡ−タイプ物質を、製薬上許容される媒体と組み合わせて含有する製薬組成物。８．Ｐ−タイプ物質またはインシュリンをさらに含有する、請求項７記載の製薬組成物。９．医療処理方法で用いるための、請求項１から６のいずれかに物質。１０．請求項１から６のいずれかに記載の物質のアンタゴニストであって、前記物質に特異的に結合できるモノクローナル抗体であるアンタゴニスト。１１．（ａ）Ａ−タイプ物質の放出を阻害すること；（ｂ）Ａ−タイプ物質に結合し、それらのレベルを低下させること；及び／または、（ｃ）Ａ−タイプ物質の生物学的活性を低下させるという特性を有する、請求項１０記載のアンタゴニスト。１２．アンタゴニストが、前記物質に特異的に結合できる抗体、または前記物質に特異的に結合できる結合タンパク質である、請求項１０または１１記載のアンタゴニスト。１３．請求項１０から１２のいずれかに記載のアンタゴニストを含有する製薬組成物。１４．医療処理方法で用いるための、請求項１から６のいずれかに記載の物質のアンタゴニストであって、前記物質に特異的に結合できるモノクローナル抗体であるアンタゴニスト。１５．請求項１から６のいずれかに記載のＡ−タイプ物質に特異的に結合できるモノクローナル抗体。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 3/10 Ｃ０７Ｋ 16/44 Ｃ０７Ｋ 16/44 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/26 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．Ｚｎ²⁺イオンを含み、脂質生成活性の調節及びｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ阻害の活性を有するシクリトール含有炭化水素である、ヒトの肝臓または胎盤から得られる単離されたＡ−タイプ物質。２．Ｚｎ²⁺イオンを含み、（ａ）液体窒素中で即座に凍結させた組織から加工した肝臓ホモジネートを加熱及び酸処理することにより抽出物を作製し、（ｂ）得られた溶液を、遠心分離及び活性炭処理の後、ＡＧ１−Ｘ８（ギ酸形態）アニオン交換樹脂と終夜相互作用させ、（ｃ）カラムを５０ｍＭのＨＣｌで溶離することによりＡ−タイプＩＰＧ活性を持つ分画を回収し、（ｄ）ｐＨ４．０に（ｐＨ７．８を越えないように）中和し、分画を凍結乾燥して物質を単離し、（ｅ）４／１／１のブタノール／エタノール／水を溶媒として用いた下降ペーパークロマトグラフィを採用し、（ｆ）ピリジン／酢酸／水中で高電圧ペーパー電気泳動を用いて精製し、そして、（ｇ）Dionexアニオン交換クロマトグラフィを用いた精製、またはVida c ＨＰＬＣクロマトグラフィによる精製により単離されたＡ−タイプ物質を得ることによってヒトの肝臓または胎盤から得られる、シクリトール含有炭化水素である単離されたＡ−タイプ物質。３．（ａ）ネガティブモードＭＡＬＤＩマススペクトルを用いて決定された表３及び４に示す分子量、あるいは、約２１１ｍ／ｚの構造単位の一つまたはそれ以上を付加するまたは減じることによって表３及び４に記載した分子量の一つに関連する分子量、または、（ｂ）ポジテイブモードＭＡＬＤＩマススペクトルを用いて決定された表５に示すような分子量、あるいは、約２１１ｍ／ｚの構造単位の一つまたはそれ以上を付加するまたは減じることによって表５に記載した分子量の一つに関連する分子量を有する、Ｚｎ²⁺イオンを含み、脂質生成活性の調整及びｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ阻害の活性を有する、シクリトール含有炭化水素である、ヒトの肝臓または胎盤から得られる単離されたＡ−タイプ物質。４．物質がホスフェートを含む、請求項１から３のいずれかに記載の物質。５．以下の特性：（ａ）４／１／１のブタノール／エタノール／水を溶媒として用いた下降ペーパークロマトグラフィにおいて起点近くに泳動すること；（ｂ）Ｃ−１８親和性樹脂に結合しないこと；（ｃ）Dowex AG50（Ｈ＋）カチオン交換樹脂に結合すること；（ｄ）ＡＧ３Ａアニオン交換樹脂に結合すること；または、（ｅ）物質の活性がプロナーゼ耐性であることの１つまたはそれ以上を有する、請求項１から４のいずれかに記載の物質。６．物質が、（ａ）アデニレートシクラーゼを阻害すること；（ｂ）血清フリー媒質中のＥＧＦ−トランスフェクションした線維芽細胞に添加したときマイトジェン性であること；または、（ｃ）脂肪細胞において脂肪生成を刺激することという特性を有する、請求項１から５のいずれかに記載の物質。７．請求項１から６のいずれかに記載のＡ−タイプ物質を、製薬上許容される媒体と組み合わせて含有する製薬組成物。８．Ｐ−タイプ物質またはインシュリンをさらに含有する、請求項７記載の製薬組成物。９．医療処理方法で用いるための、請求項１から６のいずれかに物質。１０．請求項１から６のいずれかに記載の物質のアンタゴニスト。１１．（ａ）Ａ−タイプ物質の放出を阻害すること；（ｂ）Ａ−タイプ物質に結合し、それらのレベルを低下させること；及び／または、（ｃ）Ａ−タイプ物質の生物学的活性を低下させるという特性を有する、請求項１０記載のアンタゴニスト。１２．アンタゴニストが、前記物質に特異的に結合できる抗体、または前記物質に特異的に結合できる結合タンパク質である、請求項１０または１１記載のアンタゴニスト。１３．請求項１０から１２のいずれかに記載のアンタゴニストを含有する製薬組成物。１４．医療処理方法で用いるための、請求項１から６のいずれかに記載の物質のアンタゴニスト。