JP2002533132A - α−１，４−グルカン鎖含有多糖およびその製造方法 - Google Patents
α−１，４−グルカン鎖含有多糖およびその製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、α−１，４−グルカン鎖を含有する多糖の製造方法に関する。本発明の方法によると、グルコシル基受容体は、アミロスクラーゼの存在下でサッカロースと反応させて、変換させることによって鎖伸長反応を受ける。反応混合物中におけるグルコシル基受容体の量は、グルコシル基受容体の利用可能な末端とサッカロースとのモル比が少なくとも１：１，０００であり、および／またはグルコシル基受容体とサッカロースとの重量比が少なくとも１：５０であるように選択される。
Description
【０００１】
本発明は、α−１，４−グルカン鎖含有多糖およびその製造方法に関する。
【０００２】
多糖は、多数のグリコシド結合した単糖から構成されるポリマーである。多糖
は、高等生物および細菌などの微生物の両方に存在し、例えば、貯蔵および骨格
物質の機能を果たしている。多糖は、特に、食品産業、軽工業、健康管理および
分析における補助剤および添加物として商業的に使用されている。
は、高等生物および細菌などの微生物の両方に存在し、例えば、貯蔵および骨格
物質の機能を果たしている。多糖は、特に、食品産業、軽工業、健康管理および
分析における補助剤および添加物として商業的に使用されている。
【０００３】 グルカンは、グルコースモノマーのみからなる多糖である。α−１，４−グル
カンにおいて、これらのグルコース基はα−１，４−グリコシド結合で互いに連
結されている。α−１，４−グルカンは、その物理化学的性質のために、無色無
臭無味で、非毒性かつ生分解性であるフィルムを製造するために使用することが
できる。既に、例えば、食品産業、繊維産業およびガラス繊維産業においてその
ようなフィルムに関する適用が多数なされている。
カンにおいて、これらのグルコース基はα−１，４−グリコシド結合で互いに連
結されている。α−１，４−グルカンは、その物理化学的性質のために、無色無
臭無味で、非毒性かつ生分解性であるフィルムを製造するために使用することが
できる。既に、例えば、食品産業、繊維産業およびガラス繊維産業においてその
ようなフィルムに関する適用が多数なされている。
【０００４】 最も高頻度に存在する天然のα−１，４−グルカンは、デンプンの構成成分で
あるアミロースである。アミロースは、その性質が天然のセルロース繊維の性質
と類似し、かつその性質により製紙においてその部分的な代替または完全な代替
が可能である繊維を製造するために既に使用されている。薬学では、アミロース
は、錠剤、ペースト剤に対する充填剤として、皮膚保護物質への添加物として使
用されている。食品産業では、アミロースは、プディング、スープ、ソース、マ
ヨネーズ、クリーム充填のための増粘剤および結合剤として、ゼラチン代用品と
して使われている。アミロースは、また、遮音壁パネルを製造する際に結合剤と
して使用されている。
あるアミロースである。アミロースは、その性質が天然のセルロース繊維の性質
と類似し、かつその性質により製紙においてその部分的な代替または完全な代替
が可能である繊維を製造するために既に使用されている。薬学では、アミロース
は、錠剤、ペースト剤に対する充填剤として、皮膚保護物質への添加物として使
用されている。食品産業では、アミロースは、プディング、スープ、ソース、マ
ヨネーズ、クリーム充填のための増粘剤および結合剤として、ゼラチン代用品と
して使われている。アミロースは、また、遮音壁パネルを製造する際に結合剤と
して使用されている。
【０００５】 デンプンの主要な構成成分であるアミロペクチンおよびグリコーゲンは、その
主鎖がα−１，４−グリコシド結合を有するグルコース基からなるさらなる多糖
である。これらの多糖は、α−１，６−グリコシド結合を介して主鎖に連結して
いる側鎖を有する。これらの多糖もまた産業界では広範囲に使用されている。
主鎖がα−１，４−グリコシド結合を有するグルコース基からなるさらなる多糖
である。これらの多糖は、α−１，６−グリコシド結合を介して主鎖に連結して
いる側鎖を有する。これらの多糖もまた産業界では広範囲に使用されている。
【０００６】 デンプンおよびグリコーゲンなどのα−１，４−グルカンを植物および動物か
ら単離することは複雑で、費用がかかり、そして再現可能な性質を有する製品に
は必ずしも至っていない。このため、そのようなグルカンを産生し得る細菌がま
すます注目されている。
ら単離することは複雑で、費用がかかり、そして再現可能な性質を有する製品に
は必ずしも至っていない。このため、そのようなグルカンを産生し得る細菌がま
すます注目されている。
【０００７】 大部分の細菌において、多糖は、ヌクレオチドで活性化された糖を介して、高
等生物の場合と類似した方法で合成されている。従って、例えば大部分の細菌で
は、グリコーゲンの生合成には３つの酵素が関与する。すなわち、グルコース−
１−リン酸およびＡＴＰからのＡＤＰ−グルコースの生成を触媒するＡＤＰ−グ
ルコースホスホリラーゼ、グルコースをＡＤＰ−グルコースから成長中のグルカ
ン鎖に転移するグリコーゲンシンターゼ、およびα−１，６−結合を線状のα−
１，４−グルカン鎖に導入する分枝酵素。しかし、細菌の中には、多糖の合成が
、活性化された糖が関与することなく行われるものがいくつかある。
等生物の場合と類似した方法で合成されている。従って、例えば大部分の細菌で
は、グリコーゲンの生合成には３つの酵素が関与する。すなわち、グルコース−
１−リン酸およびＡＴＰからのＡＤＰ−グルコースの生成を触媒するＡＤＰ−グ
ルコースホスホリラーゼ、グルコースをＡＤＰ−グルコースから成長中のグルカ
ン鎖に転移するグリコーゲンシンターゼ、およびα−１，６−結合を線状のα−
１，４−グルカン鎖に導入する分枝酵素。しかし、細菌の中には、多糖の合成が
、活性化された糖が関与することなく行われるものがいくつかある。
【０００８】 ヌクレオチド糖が関与することなく多糖を合成し得る細菌システムの１つが、
ナイセリア属の細菌で見出された。これらの細菌では、グリコーゲンに類似した
構造を有する多糖が、酵素の天然基質であるスクロースからアミロスクラーゼ酵
素により直接的に合成されている［Ｏｋａｄａ，Ｇ．およびＥ．Ｊ．Ｈｅｈｒｅ
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９：１２６〜１３５（１９７４）；ＭａｃＫｅ
ｎｚｉｅ，Ｃ．Ｒ．ら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２３：１３０３〜１
３０７（１９７７）；ＭａｃＫｅｎｚｉｅ，Ｃ．Ｒ．ら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．２４：３５７〜３６２（１９７８）］。 アミロスクラーゼ（スクロース：１，４−α−グルカン ４−α−グルコシルト
ランスフェラーゼ、Ｅ．Ｃ．２．４．１．４．）は、下記の反応式に従ってＤ−
フルクトースの遊離を伴ってスクロース分子のグルコシル基を成長中のポリマー
鎖に転移し、α−１，４−グリコシド結合グルカンの生成を触媒する： スクロース＋（α−１，４−Ｄ−グルコシル）ｎ→Ｄ−フルクトース＋（α−１
，４−Ｄ−グルコシル）ｎ＋１
ナイセリア属の細菌で見出された。これらの細菌では、グリコーゲンに類似した
構造を有する多糖が、酵素の天然基質であるスクロースからアミロスクラーゼ酵
素により直接的に合成されている［Ｏｋａｄａ，Ｇ．およびＥ．Ｊ．Ｈｅｈｒｅ
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９：１２６〜１３５（１９７４）；ＭａｃＫｅ
ｎｚｉｅ，Ｃ．Ｒ．ら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２３：１３０３〜１
３０７（１９７７）；ＭａｃＫｅｎｚｉｅ，Ｃ．Ｒ．ら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．２４：３５７〜３６２（１９７８）］。 アミロスクラーゼ（スクロース：１，４−α−グルカン ４−α−グルコシルト
ランスフェラーゼ、Ｅ．Ｃ．２．４．１．４．）は、下記の反応式に従ってＤ−
フルクトースの遊離を伴ってスクロース分子のグルコシル基を成長中のポリマー
鎖に転移し、α−１，４−グリコシド結合グルカンの生成を触媒する： スクロース＋（α−１，４−Ｄ−グルコシル）ｎ→Ｄ−フルクトース＋（α−１
，４−Ｄ−グルコシル）ｎ＋１
【０００９】 ヌクレオチド活性化糖または補助因子は、この反応では必要とされない。しか
し、この酵素は、α−１，４−グルカン鎖の伸長に関する上記の反応式に従って
スクロースのグルコシル基が転移されるグルコシル基受容体（またはプライマー
）、例えば、オリゴ糖およびアミロースまたはグリコーゲンなどの多糖の存在に
よって刺激される［Ｏｋａｄａ，Ｇ．およびＥ．Ｊ．Ｈｅｈｒｅ、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２４９：１２６〜１３５（１９７４）；Ｒｅｍａｕｄ−Ｓｉｍｅｏ
ｎ，Ｍ．ら、Ｓ．Ｂ．Ｐｅｔｅｒｓｅｎ、Ｂ．ＳｖｅｎｓｏｎおよびＳ．Ｐｅｄ
ｅｒｓｅｎ（編者）、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎ
ｇ、３１３〜３２０頁（１９９５）；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂ．
Ｖ．、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ］。
し、この酵素は、α−１，４−グルカン鎖の伸長に関する上記の反応式に従って
スクロースのグルコシル基が転移されるグルコシル基受容体（またはプライマー
）、例えば、オリゴ糖およびアミロースまたはグリコーゲンなどの多糖の存在に
よって刺激される［Ｏｋａｄａ，Ｇ．およびＥ．Ｊ．Ｈｅｈｒｅ、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２４９：１２６〜１３５（１９７４）；Ｒｅｍａｕｄ−Ｓｉｍｅｏ
ｎ，Ｍ．ら、Ｓ．Ｂ．Ｐｅｔｅｒｓｅｎ、Ｂ．ＳｖｅｎｓｏｎおよびＳ．Ｐｅｄ
ｅｒｓｅｎ（編者）、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎ
ｇ、３１３〜３２０頁（１９９５）；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂ．
Ｖ．、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ］。
【００１０】 アミロスクラーゼは、今日まで、ナイセリア属の細菌にのみ見出されている。
細菌において構成的に発現する該酵素は極めて安定であり、その重合生成物に非
常に強固に結合している。調べた大部分の種において、該酵素は細胞内に局在化
しているが、ナイセリアポリサッカレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｐｏｌｙｓａｃ
ｃｈａｒｅａ）の場合、アミロスクラーゼが分泌される。ナイセリアポリサッカ
レアのアミロスクラーゼ遺伝子がそのうちに単離され、遺伝子工学的方法を使用
して発現されている。該酵素は、高い確率で線状のα−１，４−グルカン鎖の形
成だけを触媒することが見出されている（ＷＯ９５／３１５５３）。
細菌において構成的に発現する該酵素は極めて安定であり、その重合生成物に非
常に強固に結合している。調べた大部分の種において、該酵素は細胞内に局在化
しているが、ナイセリアポリサッカレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｐｏｌｙｓａｃ
ｃｈａｒｅａ）の場合、アミロスクラーゼが分泌される。ナイセリアポリサッカ
レアのアミロスクラーゼ遺伝子がそのうちに単離され、遺伝子工学的方法を使用
して発現されている。該酵素は、高い確率で線状のα−１，４−グルカン鎖の形
成だけを触媒することが見出されている（ＷＯ９５／３１５５３）。
【００１１】
線状のα−１，４−グルカンを製造するために、Ｎ．ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒ
ｅａのアミロスクラーゼを使用することは、既にＷＯ９５／３１５５３に提案さ
れている。しかし、多糖を製造するためにアミロスクラーゼを使用する際の問題
は、アミロスクラーゼが存在するもとで通常形成される多糖は分子量が非常に変
動しやすいということ、すなわち、大きな多分散度または広い分子量分布を有す
ることである。しかし、工業的に応用する場合、その物理化学的性質がより均質
であるため、できる限り均一な分子量、すなわち小さい多分散度を有する多糖調
製物が望ましい。
ｅａのアミロスクラーゼを使用することは、既にＷＯ９５／３１５５３に提案さ
れている。しかし、多糖を製造するためにアミロスクラーゼを使用する際の問題
は、アミロスクラーゼが存在するもとで通常形成される多糖は分子量が非常に変
動しやすいということ、すなわち、大きな多分散度または広い分子量分布を有す
ることである。しかし、工業的に応用する場合、その物理化学的性質がより均質
であるため、できる限り均一な分子量、すなわち小さい多分散度を有する多糖調
製物が望ましい。
【００１２】 従って、本発明の目的は、多分散度が小さいα−１，４−グルカン鎖含有多糖
を提供することである。
を提供することである。
【００１３】
この目的は、請求項に記載される方法および多糖によって達成される。
【００１４】 従って、本発明は、アミロスクラーゼの存在下におけるスクロースとの反応に
よる鎖伸長反応を受けるグルコシル基受容体を含み、反応混合物中におけるグル
コシル基受容体の量が、鎖の伸長に利用可能なグルコシル基受容体末端とスクロ
ースとのモル比が少なくとも１：１０００であり、および／またはグルコシル基
受容体とスクロースとの重量比が少なくとも１：５０であるように選択されてい
る方法に関する。
よる鎖伸長反応を受けるグルコシル基受容体を含み、反応混合物中におけるグル
コシル基受容体の量が、鎖の伸長に利用可能なグルコシル基受容体末端とスクロ
ースとのモル比が少なくとも１：１０００であり、および／またはグルコシル基
受容体とスクロースとの重量比が少なくとも１：５０であるように選択されてい
る方法に関する。
【００１５】 本発明はまた、アミロスクラーゼの存在下において、フルクトースが添加され
た状態でスクロースとの反応による鎖伸長反応をグルコシル基受容体に受けさせ
る方法に関する。
た状態でスクロースとの反応による鎖伸長反応をグルコシル基受容体に受けさせ
る方法に関する。
【００１６】 これらの方法により得られるα−１，４−グルカン鎖含有多糖もまた本発明の
主題である。
主題である。
【００１７】
本発明において使用されるグルコシル基受容体は、α−１，４−グルカン鎖の
合成、すなわちα−１，４−グルカン鎖の伸長が、スクロースに由来するα−Ｄ
−グルコシル基のアミロスクラーゼにより触媒される転移のもとで進行できる化
合物である。好適なグルコシル基受容体は、特に、α−１，４−グリコシド結合
を介して連結している末端グルコース基を有する短鎖およびより長い鎖のオリゴ
糖および多糖である。好ましくは、本発明において使用されるグルコシル基受容
体は、線状のオリゴ糖または多糖であり、特に好ましくは分枝のあるオリゴ糖ま
たは多糖である。本発明のグルコシル基受容体の例としては、マルトペンタオー
ス、マルトヘキサオースまたはマルトヘプタオースなどのマルトオリゴ糖である
。
合成、すなわちα−１，４−グルカン鎖の伸長が、スクロースに由来するα−Ｄ
−グルコシル基のアミロスクラーゼにより触媒される転移のもとで進行できる化
合物である。好適なグルコシル基受容体は、特に、α−１，４−グリコシド結合
を介して連結している末端グルコース基を有する短鎖およびより長い鎖のオリゴ
糖および多糖である。好ましくは、本発明において使用されるグルコシル基受容
体は、線状のオリゴ糖または多糖であり、特に好ましくは分枝のあるオリゴ糖ま
たは多糖である。本発明のグルコシル基受容体の例としては、マルトペンタオー
ス、マルトヘキサオースまたはマルトヘプタオースなどのマルトオリゴ糖である
。
【００１８】 好ましいグルコシル基受容体は、例えばトウモロコシおよびジャガイモから得
られるデキストリン、アミロペクチン、アミロースおよびアミロース様多糖、お
よび、例えば筋肉組織、イガイまたは細菌から得られるグリコーゲンおよびグリ
コーゲン様多糖である。
られるデキストリン、アミロペクチン、アミロースおよびアミロース様多糖、お
よび、例えば筋肉組織、イガイまたは細菌から得られるグリコーゲンおよびグリ
コーゲン様多糖である。
【００１９】 特に、好ましいグルコシル基受容体は、グリコーゲンなどの分枝状多糖である
。そのような分枝状のグルコシル基受容体は、鎖を伸長させることができる末端
を２つ以上有する。従って、グリコーゲン鎖は、グルコシル基が転移し得る分枝
を約７から１２％有する。
。そのような分枝状のグルコシル基受容体は、鎖を伸長させることができる末端
を２つ以上有する。従って、グリコーゲン鎖は、グルコシル基が転移し得る分枝
を約７から１２％有する。
【００２０】 驚くべきことに、今回、アミロスクラーゼにより触媒されるα−１，４−グル
カンの合成において、反応混合物中における鎖の伸長に利用可能なグルコシル基
受容体末端のスクロースに対するモル比および／またはグルコシル基受容体のス
クロースに対する重量比を規定された最小値にした場合、多分散度が小さい多糖
が得られることが見出された。鎖伸長反応は、この最小値では、多分散度が大き
い多糖調製物をもたらす副反応よりも優先すると考えられる。多分散度は、スク
ロース濃度が一定の場合、受容体の濃度が増大するにつれて低下する傾向を示す
。
カンの合成において、反応混合物中における鎖の伸長に利用可能なグルコシル基
受容体末端のスクロースに対するモル比および／またはグルコシル基受容体のス
クロースに対する重量比を規定された最小値にした場合、多分散度が小さい多糖
が得られることが見出された。鎖伸長反応は、この最小値では、多分散度が大き
い多糖調製物をもたらす副反応よりも優先すると考えられる。多分散度は、スク
ロース濃度が一定の場合、受容体の濃度が増大するにつれて低下する傾向を示す
。
【００２１】 便宜上、反応混合物中における鎖の伸長に利用可能なグルコシル基受容体末端
とスクロースとのモル比は、少なくとも１：１０００である。好ましくは、モル
比は少なくとも５：１０００であり、特に好ましくは少なくとも１：１００であ
る。鎖の伸長に利用可能なグルコシル基受容体末端とスクロースとのモル比の上
限はあまり重要ではなく、便宜的には約１：５０から１：２５である。
とスクロースとのモル比は、少なくとも１：１０００である。好ましくは、モル
比は少なくとも５：１０００であり、特に好ましくは少なくとも１：１００であ
る。鎖の伸長に利用可能なグルコシル基受容体末端とスクロースとのモル比の上
限はあまり重要ではなく、便宜的には約１：５０から１：２５である。
【００２２】 グルコシル基受容体とスクロースとの重量比は、便宜的には少なくとも１：５
０であり、例えば少なくとも２：５０であり、あるいは少なくとも５：５０であ
る。最適な重量比は受容体のタイプに依存する。分枝状の多糖受容体の場合、与
えられたスクロース濃度での反応混合物において必要とされる受容体の量は、一
般に、非分枝の多糖受容体またはほんのわずかに分枝している多糖受容体の場合
よりも少ない。従って、重量平均分子量Ｍｗが約１６００００ｇ／ｍｏｌである
グリコーゲンが使用される場合、受容体とスクロースとの比が少なくとも２．５
：５０であることが好都合であることが証明され、一方、Ｍｗが約５０００から
６０００ｇ／ｍｏｌであるデキストリンの場合、受容体とスクロースとの重量比
が少なくとも５：５０から１０：５０であることが好ましい。
０であり、例えば少なくとも２：５０であり、あるいは少なくとも５：５０であ
る。最適な重量比は受容体のタイプに依存する。分枝状の多糖受容体の場合、与
えられたスクロース濃度での反応混合物において必要とされる受容体の量は、一
般に、非分枝の多糖受容体またはほんのわずかに分枝している多糖受容体の場合
よりも少ない。従って、重量平均分子量Ｍｗが約１６００００ｇ／ｍｏｌである
グリコーゲンが使用される場合、受容体とスクロースとの比が少なくとも２．５
：５０であることが好都合であることが証明され、一方、Ｍｗが約５０００から
６０００ｇ／ｍｏｌであるデキストリンの場合、受容体とスクロースとの重量比
が少なくとも５：５０から１０：５０であることが好ましい。
【００２３】 所定のスクロース濃度および所定のグルコシル基受容体の場合、選ばれたグル
コシル基受容体の濃度が高いほど、本発明の方法により得られる多糖の分子量は
小さくなる。このようにグルコシル基受容体のスクロースに対する重量比を好適
に選ぶことによって、最終生成物の分子量もまた制御することができる。
コシル基受容体の濃度が高いほど、本発明の方法により得られる多糖の分子量は
小さくなる。このようにグルコシル基受容体のスクロースに対する重量比を好適
に選ぶことによって、最終生成物の分子量もまた制御することができる。
【００２４】 反応混合物におけるアミロスクラーゼの基質として使用されるスクロースの絶
対的な濃度は重要ではない。しかし、使用量は、便宜的には５０％（ｗ／ｖ）を
超えない。これは、この濃度を超えると、溶液の粘度が大きくなりすぎ、反応速
度が急激に低下するからである。好ましくは、反応混合物中のスクロース濃度は
１から３０％（ｗ／ｖ）の間である。
対的な濃度は重要ではない。しかし、使用量は、便宜的には５０％（ｗ／ｖ）を
超えない。これは、この濃度を超えると、溶液の粘度が大きくなりすぎ、反応速
度が急激に低下するからである。好ましくは、反応混合物中のスクロース濃度は
１から３０％（ｗ／ｖ）の間である。
【００２５】 鎖伸長反応のための最適な条件、例えば反応混合物中における鎖の伸長に利用
可能なグルコシル基受容体末端のスクロースに対するモル比、反応混合物中にお
けるグルコシル基受容体のスクロースに対する重量比、および反応混合物中にお
けるスクロース濃度は、簡単な実験によって問題なく決定することができる。
可能なグルコシル基受容体末端のスクロースに対するモル比、反応混合物中にお
けるグルコシル基受容体のスクロースに対する重量比、および反応混合物中にお
けるスクロース濃度は、簡単な実験によって問題なく決定することができる。
【００２６】 アミロスクラーゼにより触媒されるα−１，４−グルカンの合成において、フ
ルクトースを反応混合物に添加したときに、多分散度が小さい多糖が得られるこ
とがさらに見出された。これは、フルクトースの添加により、多分散度が大きい
多糖調製物を生じさせる妨害的な副反応が阻害されていると考えられる。フルク
トースが存在することにより導入される効果は、グルコシル基受容体のスクロー
スに対するモル比および重量比が上記に規定された最小値であるか否かに関係な
く認められる。フルクトースの添加は分子量分布をさらにより狭くし、すなわち
、結果として生じる最終生成物の多分散度をより小さくする。しかし、その代わ
り、収率が若干低くなる。
ルクトースを反応混合物に添加したときに、多分散度が小さい多糖が得られるこ
とがさらに見出された。これは、フルクトースの添加により、多分散度が大きい
多糖調製物を生じさせる妨害的な副反応が阻害されていると考えられる。フルク
トースが存在することにより導入される効果は、グルコシル基受容体のスクロー
スに対するモル比および重量比が上記に規定された最小値であるか否かに関係な
く認められる。フルクトースの添加は分子量分布をさらにより狭くし、すなわち
、結果として生じる最終生成物の多分散度をより小さくする。しかし、その代わ
り、収率が若干低くなる。
【００２７】 便宜上、フルクトースは、少なくとも１０ｍＭの濃度で反応混合物に添加され
る。好ましくは、フルクトースは、少なくとも５０ｍＭの濃度で、好ましくは１
００から８００ｍＭの濃度で添加される。
る。好ましくは、フルクトースは、少なくとも５０ｍＭの濃度で、好ましくは１
００から８００ｍＭの濃度で添加される。
【００２８】 本発明の方法により、使用されるグリコシル基受容体の分子量を２倍から３倍
に大きくすることが問題なく達成される。従って、本発明の方法において使用さ
れる受容体の分子量もまた、最終生成物の所望する分子量に依存する。しかし、
鎖伸長反応の反応速度は受容体の重合度の増大とともに大きくなるため、便宜的
には、重量平均分子量Ｍｗが少なくとも０．５×１０3ｇ／ｍｏｌ、好ましくは
少なくとも４×１０3ｇ／ｍｏｌ、特に好ましくは少なくとも１×１０5から１×
１０6ｇ／ｍｏｌである受容体が使用される。結果として生じる反応生成物の多
分散度は、使用される受容体物質の均一性によっても損なわれるため、できる限
り小さい多分散度を有する受容体分子を使用することもまた勧められる。
に大きくすることが問題なく達成される。従って、本発明の方法において使用さ
れる受容体の分子量もまた、最終生成物の所望する分子量に依存する。しかし、
鎖伸長反応の反応速度は受容体の重合度の増大とともに大きくなるため、便宜的
には、重量平均分子量Ｍｗが少なくとも０．５×１０3ｇ／ｍｏｌ、好ましくは
少なくとも４×１０3ｇ／ｍｏｌ、特に好ましくは少なくとも１×１０5から１×
１０6ｇ／ｍｏｌである受容体が使用される。結果として生じる反応生成物の多
分散度は、使用される受容体物質の均一性によっても損なわれるため、できる限
り小さい多分散度を有する受容体分子を使用することもまた勧められる。
【００２９】 下記の反応式： スクロース＋（α−１，４−Ｄ−グルコシル）ｎ→Ｄ−フルクトース＋（α−１
，４−Ｄ−グルコシル）ｎ＋１ に従って、Ｄ−フルクトースを遊離して、スクロース分子のグルコシル基を受容
体分子に転移し、α−１，４−グルカン鎖を生成し得る酵素はすべて、アミロス
クラーゼとして使用することができる。好ましくは、原核生物から得られるアミ
ロスクラーゼが使用され、特にナイセリア属の細菌から得られるアミロスクラー
ゼが使用される。好適なアミロスクラーゼは、例えば、Ｎ．ｓｉｃｃａ、Ｎ．ｃ
ａｎｉｓ、Ｎ．ｃｉｎｅｒｅａ、Ｎ．ｐｅｒｆｌａｖａ、Ｎ．ｓｕｂｆｌａｖａ
、Ｎ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓおよびＮ．ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｅａの細
菌種に存在するアミロスクラーゼである。好ましくは、Ｎ．ｐｏｌｙｓａｃｃｈ
ａｒｅａから得られるアミロスクラーゼが使用される。例えば、Ｎ．ｐｏｌｙｓ
ａｃｃｈａｒｅａ ＡＴＣＣ４３７６８から得られるアミロスクラーゼが使用さ
れる。
，４−Ｄ−グルコシル）ｎ＋１ に従って、Ｄ−フルクトースを遊離して、スクロース分子のグルコシル基を受容
体分子に転移し、α−１，４−グルカン鎖を生成し得る酵素はすべて、アミロス
クラーゼとして使用することができる。好ましくは、原核生物から得られるアミ
ロスクラーゼが使用され、特にナイセリア属の細菌から得られるアミロスクラー
ゼが使用される。好適なアミロスクラーゼは、例えば、Ｎ．ｓｉｃｃａ、Ｎ．ｃ
ａｎｉｓ、Ｎ．ｃｉｎｅｒｅａ、Ｎ．ｐｅｒｆｌａｖａ、Ｎ．ｓｕｂｆｌａｖａ
、Ｎ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓおよびＮ．ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｅａの細
菌種に存在するアミロスクラーゼである。好ましくは、Ｎ．ｐｏｌｙｓａｃｃｈ
ａｒｅａから得られるアミロスクラーゼが使用される。例えば、Ｎ．ｐｏｌｙｓ
ａｃｃｈａｒｅａ ＡＴＣＣ４３７６８から得られるアミロスクラーゼが使用さ
れる。
【００３０】 使用されるアミロスクラーゼは、アミロスクラーゼが自然界で合成される生物
（ＭａｃＫｅｎｚｉｅ，Ｃ．Ｒ．ら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２４
：３５７〜３６２；１９７８）から直接単離することができ、あるいはＷＯ９５
／３１５５３に記載されているように、アミロスクラーゼは遺伝子工学的方法に
より産生することができる（組換えアミロスクラーゼ）。この酵素はまた、転写
および翻訳のインビトロシステムを使用して無細胞条件下で産生させることもで
きる。
（ＭａｃＫｅｎｚｉｅ，Ｃ．Ｒ．ら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２４
：３５７〜３６２；１９７８）から直接単離することができ、あるいはＷＯ９５
／３１５５３に記載されているように、アミロスクラーゼは遺伝子工学的方法に
より産生することができる（組換えアミロスクラーゼ）。この酵素はまた、転写
および翻訳のインビトロシステムを使用して無細胞条件下で産生させることもで
きる。
【００３１】 アミロスクラーゼは、粗酵素として、あるいは部分精製された形態だけでなく
、高度に精製された形態でも使用することができる。好ましくは、高度に精製さ
れたアミロスクラーゼが使用される。「高度に精製されたアミロスクラーゼ」と
いう用語は、特に、純度が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、特
に好ましくは少なくとも９５％であるアミロスクラーゼを表すために用いられる
。
、高度に精製された形態でも使用することができる。好ましくは、高度に精製さ
れたアミロスクラーゼが使用される。「高度に精製されたアミロスクラーゼ」と
いう用語は、特に、純度が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、特
に好ましくは少なくとも９５％であるアミロスクラーゼを表すために用いられる
。
【００３２】 高度に精製されたアミロスクラーゼを本発明の方法において使用することは、
酵素が単離された菌株、例えば微生物の残渣が酵素に含まれないという利点を有
する。例えば、高度に精製されたアミロスクラーゼは、他の望ましくない酵素、
例えばアミラーゼなどの多糖分解酵素を含まない。高度に精製されたアミロスク
ラーゼの使用は、また、不必要な構成成分を含まない規定された反応媒体が、ま
た、より精密に規定された生成物を提供するので、食品産業および製薬産業にお
ける使用には好都合である。これにより、食品産業および製薬産業におけるこれ
らの生物工学的に製造された生成物に関する認可過程が、特に、これらの生成物
が遺伝子組換え微生物の何らかの痕跡を有さない場合、あまり複雑にならない。
酵素が単離された菌株、例えば微生物の残渣が酵素に含まれないという利点を有
する。例えば、高度に精製されたアミロスクラーゼは、他の望ましくない酵素、
例えばアミラーゼなどの多糖分解酵素を含まない。高度に精製されたアミロスク
ラーゼの使用は、また、不必要な構成成分を含まない規定された反応媒体が、ま
た、より精密に規定された生成物を提供するので、食品産業および製薬産業にお
ける使用には好都合である。これにより、食品産業および製薬産業におけるこれ
らの生物工学的に製造された生成物に関する認可過程が、特に、これらの生成物
が遺伝子組換え微生物の何らかの痕跡を有さない場合、あまり複雑にならない。
【００３３】 好ましくは、組換えアミロスクラーゼは、例えばＷＯ９５／３１５５３に記載
されているように使用される。そのような組換えアミロスクラーゼは、発現した
タンパク質の規定された性質を改変するために、適する場合には変異、例えば挿
入、欠失および置換によってもまた自然界に存在するアミロスクラーゼに関して
遺伝子的に改変することができる。従って、例えば、アミロスクラーゼは、例え
ば親和性クロマトグラフィによるその特異的な結合特性により融合タンパク質の
精製をより容易にできるポリペプチド配列を伴った融合タンパク質として発現さ
せることができる（例えば、Ｈｏｐｐら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６（
１９８８）、１２０４〜１２１０；Ｓａｓｓｅｎｆｅｌｄ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌ．８（１９８０）、８８〜９３を参照のこと）。特に好ましく
は、宿主細胞によって栄養培地に分泌されるアミロスクラーゼが使用される。そ
の結果、分泌された酵素を上清から得ることができるので、細胞消化および酵素
のさらなる精製が不必要である。アミロスクラーゼは、Ｎ．ｐｏｌｙｓａｃｃｈ
ａｒｅａのように自然に分泌させることができ、あるいは酵素をシグナルペプチ
ドと一緒に発現させることによって分泌させることができる。これは、シグナル
ペプチドの助けによって、酵素が宿主生物の細胞膜を通過できるからである。
されているように使用される。そのような組換えアミロスクラーゼは、発現した
タンパク質の規定された性質を改変するために、適する場合には変異、例えば挿
入、欠失および置換によってもまた自然界に存在するアミロスクラーゼに関して
遺伝子的に改変することができる。従って、例えば、アミロスクラーゼは、例え
ば親和性クロマトグラフィによるその特異的な結合特性により融合タンパク質の
精製をより容易にできるポリペプチド配列を伴った融合タンパク質として発現さ
せることができる（例えば、Ｈｏｐｐら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６（
１９８８）、１２０４〜１２１０；Ｓａｓｓｅｎｆｅｌｄ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌ．８（１９８０）、８８〜９３を参照のこと）。特に好ましく
は、宿主細胞によって栄養培地に分泌されるアミロスクラーゼが使用される。そ
の結果、分泌された酵素を上清から得ることができるので、細胞消化および酵素
のさらなる精製が不必要である。アミロスクラーゼは、Ｎ．ｐｏｌｙｓａｃｃｈ
ａｒｅａのように自然に分泌させることができ、あるいは酵素をシグナルペプチ
ドと一緒に発現させることによって分泌させることができる。これは、シグナル
ペプチドの助けによって、酵素が宿主生物の細胞膜を通過できるからである。
【００３４】 アミロスクラーゼは、遊離形態で使用するか、あるいは支持体に固定化するこ
とができる。アミロスクラーゼの固定化は、酵素が簡便な方法で反応媒体から回
収することができ、かつ反復的に使用できるという利点をもたらす。酵素の精製
は一般に費用および時間がかかるため、酵素の固定化および再使用はかなりのコ
スト節約を可能にする。さらなる利点は、タンパク質残渣を含有しない反応生成
物の純度である。好適な支持体は、例えば、アガロース、アルギン酸塩、セルロ
ース、ポリアクリルアミド、シリカまたはナイロンであり、支持体に対する結合
は共有結合または非共有結合を介する。
とができる。アミロスクラーゼの固定化は、酵素が簡便な方法で反応媒体から回
収することができ、かつ反復的に使用できるという利点をもたらす。酵素の精製
は一般に費用および時間がかかるため、酵素の固定化および再使用はかなりのコ
スト節約を可能にする。さらなる利点は、タンパク質残渣を含有しない反応生成
物の純度である。好適な支持体は、例えば、アガロース、アルギン酸塩、セルロ
ース、ポリアクリルアミド、シリカまたはナイロンであり、支持体に対する結合
は共有結合または非共有結合を介する。
【００３５】 使用されるアミロスクラーゼの量は、通常、０．１から１００Ｕ／ｍｌの間で
あり、好ましくは１から５０Ｕ／ｍｌの間であり、特に好ましくは２から２５Ｕ
／ｍｌの間である。
あり、好ましくは１から５０Ｕ／ｍｌの間であり、特に好ましくは２から２５Ｕ
／ｍｌの間である。
【００３６】 本発明の多糖は、便宜的には、インビトロにおいて、４から９の間のｐＨ、好
ましくは５．５から７．５の間のｐＨを有する緩衝剤を含まない水系または緩衝
剤で処理された水系で製造される。好適な緩衝剤系は、例えば、クエン酸塩緩衝
剤、マレイン酸塩緩衝剤および酢酸塩緩衝剤である。
ましくは５．５から７．５の間のｐＨを有する緩衝剤を含まない水系または緩衝
剤で処理された水系で製造される。好適な緩衝剤系は、例えば、クエン酸塩緩衝
剤、マレイン酸塩緩衝剤および酢酸塩緩衝剤である。
【００３７】 反応温度は、便宜的には１０から６０℃の間であり、好ましくは２５から４５
℃の間である。
℃の間である。
【００３８】 反応は、便宜的には、スクロースの変換が完了するまで行われる。通常、これ
に必要な反応時間は１から１５０時間の間であり、例えば、１０から１００時間
の間である。
に必要な反応時間は１から１５０時間の間であり、例えば、１０から１００時間
の間である。
【００３９】 本発明により生成される多糖は、多くの場合、水にやや溶けにくい。従って、
例えば、遠心分離によって容易に反応混合物から分離することができる。水溶性
多糖または部分的に水に可溶な多糖は、例えば、エタノール沈殿によって、ある
いは凍結させることによって単離することができる。
例えば、遠心分離によって容易に反応混合物から分離することができる。水溶性
多糖または部分的に水に可溶な多糖は、例えば、エタノール沈殿によって、ある
いは凍結させることによって単離することができる。
【００４０】 本発明の方法により、多分散度が小さいα−１，４−グルカン鎖含有多糖の簡
便で安価な製造が可能になる。本発明の方法は、最終生成物の分子量が良好に制
御されることおよび優れた再現性において抜群である。これにより、一定した均
一性および純度、従って高品質の製品を製造することが可能になる。これは、さ
らなる工業的使用には非常に重要である。結果として生じた生成物は、処理に必
要とされる工程パラメータを各処理バッチに関して新たに最適化する必要がない
ので、安価に処理することができる。
便で安価な製造が可能になる。本発明の方法は、最終生成物の分子量が良好に制
御されることおよび優れた再現性において抜群である。これにより、一定した均
一性および純度、従って高品質の製品を製造することが可能になる。これは、さ
らなる工業的使用には非常に重要である。結果として生じた生成物は、処理に必
要とされる工程パラメータを各処理バッチに関して新たに最適化する必要がない
ので、安価に処理することができる。
【００４１】 本発明をより詳しく下記の実施例によって説明する。
【００４２】 実施例１： アミロスクラーゼの精製 アミロスクラーゼを産生させるために、ナイセリアポリサッカレア（Ｎｅｉｓ
ｓｅｒｉａ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｅａ）のアミロスクラーゼを含有するベク
ターｐＮＢ２で形質転換された大腸菌細胞を使用した（ＷＯ９５／３１５５３）
。 ナイセリアポリサッカレアのアミロスクラーゼを分泌するこの大腸菌細胞の一
晩培養物を遠心分離して、細胞を約１／２０容量の５０ｍＭのクエン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ６．５）、１０ｍＭのＤＴＴ（ジチオスレイトール）、１ｍＭの
ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフッ化物）に再懸濁した。次いで、細胞を
、フレンチプレスを１６０００ｐｓｉで使用して２回分解した。次いで、１ｍＭ
のＭｇＣｌ2、および１２．５ユニットｍｌ-1の最終濃度でのベンゾナーゼ（Ｍ
ｅｒｃｋ；１０００００ユニット；２５０ユニットμｌ-1）を細胞抽出物に加え
た。次いで、混合物を、３７℃で穏やかに攪拌しながら少なくとも３０分間イン
キュベーションした。抽出物を氷上に少なくとも１．５時間静置した。次いで、
上清が比較的透明になるまで、約４００００ｇで３０分間遠心分離した。ポア径
が０．４５μｍのＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社の「Ｄｕｒａｐｏｒｅ」ま
たは類似品）による予備濾過を行った。抽出物を４℃で一晩静置した。疎水性相
互作用（ＨＩ）クロマトグラフィを行うために、固体のＮａＣｌを抽出物に加え
、濃度を２ＭのＮａＣｌにした。混合物を約４００００ｇにおいて４℃で３０分
間再び遠心分離した。次いで、抽出物を、ポア径が０．２２μｍであるＰＶＤＦ
膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社の「Ｄｕｒａｐｏｒｅ」または類似品）で濾過するこ
とによって大腸菌の最終残渣を除いた。濾過した抽出物をブチルセファロース−
４Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（カラム容量：９３ｍｌ、長さ：１７．５ｃ
ｍ）で分離した。１から５ユニット-1のアミロスクラーゼ活性を有する約５０ｍ
ｌの抽出物をカラムに加えた。次いで、非結合タンパク質を１５０ｍｌの緩衝液
Ｂ（緩衝液Ｂ；５０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ６．５、２ＭのＮａＣｌ）で
カラムから洗浄した。次いで、自動ポンプシステム（ＦＰＬＣ、Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）を使用して生成される減少する線状ＮａＣｌ勾配（１．５ｍｌ ｍｉｎ-1 の流速での、４３３ｍｌの容量で、５０ｍＭクエン酸ナトリウムにおける２Ｍか
ら０ＭへのＮａＣｌ）を使用してアミロスクラーゼを溶出した。アミロスクラー
ゼは０．７から０．１Ｍの間のＮａＣｌで溶出された。この画分を集め、ＰＤ−
１０−Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で脱塩し、８．７％グリ
セロールで安定化し、アミロスクラーゼ活性について試験し、その後、貯蔵緩衝
液（８．７％グリセロール、５０ｍＭクエン酸塩）において凍結した。
ｓｅｒｉａ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｅａ）のアミロスクラーゼを含有するベク
ターｐＮＢ２で形質転換された大腸菌細胞を使用した（ＷＯ９５／３１５５３）
。 ナイセリアポリサッカレアのアミロスクラーゼを分泌するこの大腸菌細胞の一
晩培養物を遠心分離して、細胞を約１／２０容量の５０ｍＭのクエン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ６．５）、１０ｍＭのＤＴＴ（ジチオスレイトール）、１ｍＭの
ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフッ化物）に再懸濁した。次いで、細胞を
、フレンチプレスを１６０００ｐｓｉで使用して２回分解した。次いで、１ｍＭ
のＭｇＣｌ2、および１２．５ユニットｍｌ-1の最終濃度でのベンゾナーゼ（Ｍ
ｅｒｃｋ；１０００００ユニット；２５０ユニットμｌ-1）を細胞抽出物に加え
た。次いで、混合物を、３７℃で穏やかに攪拌しながら少なくとも３０分間イン
キュベーションした。抽出物を氷上に少なくとも１．５時間静置した。次いで、
上清が比較的透明になるまで、約４００００ｇで３０分間遠心分離した。ポア径
が０．４５μｍのＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社の「Ｄｕｒａｐｏｒｅ」ま
たは類似品）による予備濾過を行った。抽出物を４℃で一晩静置した。疎水性相
互作用（ＨＩ）クロマトグラフィを行うために、固体のＮａＣｌを抽出物に加え
、濃度を２ＭのＮａＣｌにした。混合物を約４００００ｇにおいて４℃で３０分
間再び遠心分離した。次いで、抽出物を、ポア径が０．２２μｍであるＰＶＤＦ
膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社の「Ｄｕｒａｐｏｒｅ」または類似品）で濾過するこ
とによって大腸菌の最終残渣を除いた。濾過した抽出物をブチルセファロース−
４Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（カラム容量：９３ｍｌ、長さ：１７．５ｃ
ｍ）で分離した。１から５ユニット-1のアミロスクラーゼ活性を有する約５０ｍ
ｌの抽出物をカラムに加えた。次いで、非結合タンパク質を１５０ｍｌの緩衝液
Ｂ（緩衝液Ｂ；５０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ６．５、２ＭのＮａＣｌ）で
カラムから洗浄した。次いで、自動ポンプシステム（ＦＰＬＣ、Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）を使用して生成される減少する線状ＮａＣｌ勾配（１．５ｍｌ ｍｉｎ-1 の流速での、４３３ｍｌの容量で、５０ｍＭクエン酸ナトリウムにおける２Ｍか
ら０ＭへのＮａＣｌ）を使用してアミロスクラーゼを溶出した。アミロスクラー
ゼは０．７から０．１Ｍの間のＮａＣｌで溶出された。この画分を集め、ＰＤ−
１０−Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で脱塩し、８．７％グリ
セロールで安定化し、アミロスクラーゼ活性について試験し、その後、貯蔵緩衝
液（８．７％グリセロール、５０ｍＭクエン酸塩）において凍結した。
【００４３】 実施例２： アミロスクラーゼ活性の測定 精製タンパク質または粗タンパク質抽出物を、５％スクロース、０．１％グリ
コーゲンおよび１００ｍＭクエン酸塩ｐＨ６．５を含有する１ｍｌのアッセイ溶
液に様々な希釈度で加え、３７℃でインキュベーションした。５分後、１０分後
、１５分後、２０分後、２５分後および３０分後に、それぞれ１００μｌをこの
アッセイ溶液から取り出し、９５℃で１０分間直ちに加熱することによってアミ
ロスクラーゼ酵素活性を停止させた。共役した酵素試験を使用して、アミロスク
ラーゼによりスクロースから放出されたフルクトースの量を光度測定法で求めた
（Ｍ．Ｓｔｉｔｔら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１７４：
５１８〜５５２；１９８９）。このために、１μｌから１０μｌの不活化サンプ
ルを、５０ｍＭのイミダゾール緩衝液ｐＨ６．９、２ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭ
のＡＴＰ、０．４ｍＭのＮＡＤおよび０．５Ｕ／ｍｌのヘキソキナーゼの１ｍｌ
に加えた。グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｌｅｕｋｏｎｏｓｔｏｃ
ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来）およびホスホグルコースイソメラーゼを続
いて加えた後、３４０ｎｍにおける吸光度変化を測定した。次いで、放出された
グルコースの量を、ランベルト−ベール則を使用して計算した。得られた結果が
サンプリング時点と関係付けられれば、酵素ユニット数Ｕを決定することができ
る。
コーゲンおよび１００ｍＭクエン酸塩ｐＨ６．５を含有する１ｍｌのアッセイ溶
液に様々な希釈度で加え、３７℃でインキュベーションした。５分後、１０分後
、１５分後、２０分後、２５分後および３０分後に、それぞれ１００μｌをこの
アッセイ溶液から取り出し、９５℃で１０分間直ちに加熱することによってアミ
ロスクラーゼ酵素活性を停止させた。共役した酵素試験を使用して、アミロスク
ラーゼによりスクロースから放出されたフルクトースの量を光度測定法で求めた
（Ｍ．Ｓｔｉｔｔら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１７４：
５１８〜５５２；１９８９）。このために、１μｌから１０μｌの不活化サンプ
ルを、５０ｍＭのイミダゾール緩衝液ｐＨ６．９、２ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭ
のＡＴＰ、０．４ｍＭのＮＡＤおよび０．５Ｕ／ｍｌのヘキソキナーゼの１ｍｌ
に加えた。グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｌｅｕｋｏｎｏｓｔｏｃ
ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来）およびホスホグルコースイソメラーゼを続
いて加えた後、３４０ｎｍにおける吸光度変化を測定した。次いで、放出された
グルコースの量を、ランベルト−ベール則を使用して計算した。得られた結果が
サンプリング時点と関係付けられれば、酵素ユニット数Ｕを決定することができ
る。
【００４４】 １Ｕは、上記の条件下で１μｍｏｌ／分のフルクトースを遊離させるアミロス
クラーゼの量として定義される。
クラーゼの量として定義される。
【００４５】 実施例３： 多糖の製造 ３．１ 多糖調製物を製造するために、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６
．５、０．０２％アジ化ナトリウムの１０ｍｌ中において、アミロスクラーゼを
、グルコシル基受容体としてのグリコーゲン（Ｍｅｒｃｋ；１６００００のＭｗ
、約１．４の多分散度）および基質としてのスクロースの様々な濃度で、スクロ
ースの変換が完了するまで、すなわち少なくとも４８時間、３７℃でインキュベ
ーションした。アミロスクラーゼを５から２０Ｕ／ｍｌの濃度で加えた。グリコ
ーゲンを用いない平行したコントロールサンプルを、それ以外は同一の条件のも
とで処理した。
．５、０．０２％アジ化ナトリウムの１０ｍｌ中において、アミロスクラーゼを
、グルコシル基受容体としてのグリコーゲン（Ｍｅｒｃｋ；１６００００のＭｗ
、約１．４の多分散度）および基質としてのスクロースの様々な濃度で、スクロ
ースの変換が完了するまで、すなわち少なくとも４８時間、３７℃でインキュベ
ーションした。アミロスクラーゼを５から２０Ｕ／ｍｌの濃度で加えた。グリコ
ーゲンを用いない平行したコントロールサンプルを、それ以外は同一の条件のも
とで処理した。
【００４６】 沈殿した多糖を遠心分離して除き（１５分、１２００ｇ）、水に再懸濁するこ
とによって洗浄し、遠心分離した。これを２回繰り返した。ペレットを−２０℃
で凍結し、０．３４ｍｂａｒおよび２５℃の周囲温度で凍結乾燥した（Ａｌｐｈ
ａ１．４凍結乾燥器、Ｃｈｒｉｓｔ）。乾燥時のサンプル温度は−２５℃であっ
た。
とによって洗浄し、遠心分離した。これを２回繰り返した。ペレットを−２０℃
で凍結し、０．３４ｍｂａｒおよび２５℃の周囲温度で凍結乾燥した（Ａｌｐｈ
ａ１．４凍結乾燥器、Ｃｈｒｉｓｔ）。乾燥時のサンプル温度は−２５℃であっ
た。
【００４７】 結果として生じた生成物をゲル透過クロマトグラフィ（ＧＰＣ）によって分析
した。
した。
【００４８】 操作は、ＤＩＮ５５６７２−１に規定される通りに行った。すべての測定は、
溶離液として０．０９ＭのＮａＮＯ3を使用して、ジメチルスルホキシド（ＤＭ
ＳＯ）中で行った。ＧＰＣは、ＰＳゲルカラム（１０3、１０5および１０6Å；
ＰＳＳ、Ｍａｉｎｚ、「ＳＤＶ １０μ」型）のカラム組合せを使用した。質量
画分を検出するために、Ｓｈｏｄｅｘの「ＲＩ７１」型示差屈折計を使用した。
ＢｉｓｃｈｏｆｆのＨＰＬＣ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｐｕｍｐ型ポンプを使用した。
流速は１ｍｌ／分であった。ＰＳＳ、Ｍａｉｎｚ、の線状プルランを検量に使用
した（サンプルは分枝状構造を有しているので、測定結果は絶対値ではなく、相
対的な大きさである。しかし、その相対的な大きさは、サンプルの一定した分枝
度の範囲内で比較可能である）。ＰＳＳ、「Ｗｉｎ−ＧＰＣ ｓｃｉｅｎｔｉｆ
ｉｃ ４．０２」のＧＰＣソフトウエアは、ＤＩＮ５５６７２−１に完全に準拠
しており、その妥当性を完全に確認した。従って、データ処理工程の正しさは、
システムとは無関係に再現性があった。１０００ｇ／ｍｏｌ未満の値を有するモ
ル質量は、評価の際には考慮しなかった。
溶離液として０．０９ＭのＮａＮＯ3を使用して、ジメチルスルホキシド（ＤＭ
ＳＯ）中で行った。ＧＰＣは、ＰＳゲルカラム（１０3、１０5および１０6Å；
ＰＳＳ、Ｍａｉｎｚ、「ＳＤＶ １０μ」型）のカラム組合せを使用した。質量
画分を検出するために、Ｓｈｏｄｅｘの「ＲＩ７１」型示差屈折計を使用した。
ＢｉｓｃｈｏｆｆのＨＰＬＣ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｐｕｍｐ型ポンプを使用した。
流速は１ｍｌ／分であった。ＰＳＳ、Ｍａｉｎｚ、の線状プルランを検量に使用
した（サンプルは分枝状構造を有しているので、測定結果は絶対値ではなく、相
対的な大きさである。しかし、その相対的な大きさは、サンプルの一定した分枝
度の範囲内で比較可能である）。ＰＳＳ、「Ｗｉｎ−ＧＰＣ ｓｃｉｅｎｔｉｆ
ｉｃ ４．０２」のＧＰＣソフトウエアは、ＤＩＮ５５６７２−１に完全に準拠
しており、その妥当性を完全に確認した。従って、データ処理工程の正しさは、
システムとは無関係に再現性があった。１０００ｇ／ｍｏｌ未満の値を有するモ
ル質量は、評価の際には考慮しなかった。
【００４９】 結果を下記の表１に示し、図１に図示する（ｗｉおよびＷｉは、ｉ番目のポリ
マー画分の正規化質量画分および相対的質量画分を表す）。垂直な点線は、グル
コシル基受容体として使用されたグリコーゲンの初期分子量を示す。
マー画分の正規化質量画分および相対的質量画分を表す）。垂直な点線は、グル
コシル基受容体として使用されたグリコーゲンの初期分子量を示す。
【００５０】
【表１】
【００５１】 これらの結果は、結果として生じた多糖の多分散度が、スクロース濃度が一定
で、グリコーゲン濃度が増大している場合に急激に低下していることを示してい
る。
で、グリコーゲン濃度が増大している場合に急激に低下していることを示してい
る。
【００５２】 ３．２ さらなる実験において、アミロスクラーゼ（５Ｕ／ｍｌ）を、０．１
Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５、０．０２％アジ化ナトリウム、５％スクロ
ース（ｗ／ｖ）の１０ｍｌにおいて、様々な濃度のグリコーゲンとととも、フル
クトース（４００ｍＭの初期濃度）の存在下またはフルクトースの非存在下、ス
クロースの変換が完了するまで（少なくとも４８時間）３７℃でインキュベーシ
ョンした。酵素を含まない平行したコントロールサンプルを、それ以外は同一条
件のもとで処理した。結果として生じた多糖生成物を、３．１に記載されている
ように遠心分離して除き、洗浄し、凍結乾燥して、ＧＰＣで分析した。結果を図
２ａに図示する。図２ａにおいて、Ｗｉは上記の意味を有する。垂直な点線は、
グルコシル基受容体として使用されたグリコーゲンの初期分子量を示す。
Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５、０．０２％アジ化ナトリウム、５％スクロ
ース（ｗ／ｖ）の１０ｍｌにおいて、様々な濃度のグリコーゲンとととも、フル
クトース（４００ｍＭの初期濃度）の存在下またはフルクトースの非存在下、ス
クロースの変換が完了するまで（少なくとも４８時間）３７℃でインキュベーシ
ョンした。酵素を含まない平行したコントロールサンプルを、それ以外は同一条
件のもとで処理した。結果として生じた多糖生成物を、３．１に記載されている
ように遠心分離して除き、洗浄し、凍結乾燥して、ＧＰＣで分析した。結果を図
２ａに図示する。図２ａにおいて、Ｗｉは上記の意味を有する。垂直な点線は、
グルコシル基受容体として使用されたグリコーゲンの初期分子量を示す。
【００５３】 これらの結果は、結果として生じた多糖の多分散度が、スクロース濃度が一定
で、グリコーゲン濃度が増大している場合に低下していることを示している。フ
ルクトースが存在する場合、多分散度のさらなる低下が認められる。
で、グリコーゲン濃度が増大している場合に低下していることを示している。フ
ルクトースが存在する場合、多分散度のさらなる低下が認められる。
【００５４】 ３．３ ３．２に記載されている実験を、グリコーゲンの代わりに、デキスト
リン（Ｓｉｇｍａ、Ｎｏ．Ｄ−４８９４、タイプＩＶ、ジャガイモ由来、Ｍｗ６
６５０）を使用した以外は同一条件のもとで繰り返した。フルクトースの存在下
および非存在下でスクロースの変換が完了するまで（少なくとも４８時間）３７
℃でインキュベーションした後、結果として生じた多糖生成物を、上記に記載さ
れているように遠心分離して除き、洗浄して凍結乾燥した。酵素を含まない平行
したコントロールサンプルを、それ以外は同一条件のもとで処理し、上記のよう
に処理して分析した。結果を図２に図示する。図２において、ＷＩは上記の意味
を有する。垂直な点線は、グルコシル基受容体として使用されたデキストリンの
初期分子量を示す。
リン（Ｓｉｇｍａ、Ｎｏ．Ｄ−４８９４、タイプＩＶ、ジャガイモ由来、Ｍｗ６
６５０）を使用した以外は同一条件のもとで繰り返した。フルクトースの存在下
および非存在下でスクロースの変換が完了するまで（少なくとも４８時間）３７
℃でインキュベーションした後、結果として生じた多糖生成物を、上記に記載さ
れているように遠心分離して除き、洗浄して凍結乾燥した。酵素を含まない平行
したコントロールサンプルを、それ以外は同一条件のもとで処理し、上記のよう
に処理して分析した。結果を図２に図示する。図２において、ＷＩは上記の意味
を有する。垂直な点線は、グルコシル基受容体として使用されたデキストリンの
初期分子量を示す。
【００５５】 これらの結果は、結果として生じた多糖の多分散度が、スクロース濃度が一定
で、デキストリン濃度が増大している場合に低下していることを示している。フ
ルクトースが存在する場合、多分散度のさらなる低下が認められる。
で、デキストリン濃度が増大している場合に低下していることを示している。フ
ルクトースが存在する場合、多分散度のさらなる低下が認められる。
【図１】 図１は、アミロスクラーゼの存在下でのグルコシル基受容体としてのグリコー
ゲンとスクロースとの反応における、グリコーゲン濃度およびスクロース濃度を
関数とするα−１，４−グルカン鎖含有多糖の分子量分布を示す。
ゲンとスクロースとの反応における、グリコーゲン濃度およびスクロース濃度を
関数とするα−１，４−グルカン鎖含有多糖の分子量分布を示す。
【図２】 図２ａは、アミロスクラーゼ存在下でのグリコーゲンとスクロースとの反応に
おける、フルクトースの存在下および非存在下でのグリコーゲン濃度およびスク
ロース濃度を関数とするα−１，４−グルカン鎖含有多糖の分子量分布を示す。 図２ｂは、アミロスクラーゼ存在下でのデキストリンとスクロースとの反応に
おける、フルクトースの存在下および非存在下でのデキストリン濃度およびスク
ロース濃度を関数とするα−１，４−グルカン鎖含有多糖の分子量分布を示す。
おける、フルクトースの存在下および非存在下でのグリコーゲン濃度およびスク
ロース濃度を関数とするα−１，４−グルカン鎖含有多糖の分子量分布を示す。 図２ｂは、アミロスクラーゼ存在下でのデキストリンとスクロースとの反応に
おける、フルクトースの存在下および非存在下でのデキストリン濃度およびスク
ロース濃度を関数とするα−１，４−グルカン鎖含有多糖の分子量分布を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 プロヴァールト、ニコラス ドイツ国 デー−14163 ベルリン パル フォリエハイデ 31 Ｆターム(参考） 4B050 CC03 DD02 FF05 FF09 FF11 LL05 4B064 AF12 CA21 CB30 CC03 CC24 CD09 CD19 DA10
Claims (12)
- 【請求項１】 α−１，４−グルカン鎖含有多糖の製造方法であって、アミ
ロスクラーゼの存在下におけるスクロースとの反応による鎖伸長反応を受けるグ
ルコシル基受容体を含み、反応混合物中におけるグルコシル基受容体の量が、鎖
の伸長に利用可能なグルコシル基受容体末端とスクロースとのモル比が少なくと
も１：１０００であり、および／またはグルコシル基受容体とスクロースとの重
量比が少なくとも１：５０であるように選択されているα−１，４−グルカン鎖
含有多糖の製造方法。 - 【請求項２】 鎖の伸長に利用可能なグルコシル基受容体末端とスクロース
とのモル比が少なくとも５：１０００であり、好ましくは少なくとも１：１００
である請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 フルクトースが反応混合物に添加される請求項１または２の
いずれか１項に記載の方法。 - 【請求項４】 α−１，４−グルカン鎖含有多糖の製造方法であって、グル
コシル基受容体がアミロスクラーゼの存在下において、フルクトースが添加され
た状態でスクロースとの反応による鎖伸長反応を受ける方法。 - 【請求項５】 フルクトースは少なくとも１０ｍＭの濃度で反応混合物に添
加される請求項３または４のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項６】 フルクトースは少なくとも５０ｍＭの濃度で反応混合物に添
加され、好ましくは１００ｍＭから８００ｍＭの濃度で反応混合物に添加される
請求項３から５のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項７】 使用されるアミロスクラーゼはナイセリア属の細菌から得ら
れるアミロスクラーゼである請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項８】 使用されるアミロスクラーゼはナイセリアポリサッカレア（
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｅａ）種の細菌から得られるアミ
ロスクラーゼである請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 使用されるグルコシル基受容体は、デキストリン、アミロー
ス、アミロペクチンまたはグリコーゲンである請求項１から８のいずれか１項に
記載の方法。 - 【請求項１０】 多糖製造時の分子量を制御するための請求項１から９のい
ずれか１項に記載の方法の使用。 - 【請求項１１】 請求項１から９のいずれか１項に記載の方法により得られ
るα−１，４−グルカン鎖含有多糖。 - 【請求項１２】 請求項１１に記載されたα−１，４−グルカン鎖含有多糖
の錠剤充填剤としての使用。
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|---|---|---|---|
| DE19860376A DE19860376A1 (de) | 1998-12-28 | 1998-12-28 | Alpha-1,4 Glucanketten enthaltende Polysaccharide sowie Verfahren zu ihrer Herstellung |
| DE19860376.2 | 1998-12-28 | ||
| PCT/EP1999/009299 WO2000039321A1 (de) | 1998-12-28 | 1999-11-30 | α-1,4-GLUCANKETTEN ENTHALTENDE POLYSACCHARIDE SOWIE VERFAHREN ZU IHRER HERSTELLUNG |
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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| AU (1) | AU1861000A (ja) |
| DE (2) | DE19860376A1 (ja) |
| WO (1) | WO2000039321A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005018678A1 (ja) * | 2003-08-26 | 2005-03-03 | Ezaki Glico Co., Ltd. | 錠剤用添加剤 |
| JP2007508832A (ja) * | 2003-10-24 | 2007-04-12 | バイエル クロップサイエンス ゲーエムベーハー | 耐性デンプンとしての、直鎖ポリ−α−１，４−グルカンの使用 |
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| CA2912012C (en) * | 2005-05-05 | 2018-05-29 | Sensient Flavors Inc. | Production of beta-glucans and mannans |
| TWI466897B (zh) * | 2005-07-19 | 2015-01-01 | Glytech Inc | 癌細胞之檢測方法、糖鏈之構造解析方法，以及糖鏈衍生物 |
| KR100956430B1 (ko) | 2009-02-16 | 2010-05-06 | 세종대학교산학협력단 | 아밀로수크라아제와 글리코겐 가지화 효소의 순차적 첨가에 의한 난소화성 말토덱스트린의 제조방법 |
| CN102796783B (zh) * | 2012-08-23 | 2015-02-11 | 江南大学 | 一种聚合度为3-8功能葡聚糖的生物加工方法 |
| BR112017000345B1 (pt) | 2014-07-09 | 2022-04-26 | Cadena Bio, Inc | Composições de oligossacarídeo, métodos para produção das mesmas e produto alimentar |
| EP4209130A1 (en) | 2015-01-26 | 2023-07-12 | DSM Nutritional Products, LLC | Oligosaccharide compositions for use animal feed and methods of producing thereof |
| ES2659648T3 (es) | 2015-01-26 | 2018-03-16 | Kaleido Biosciences, Inc. | Compuestos terapéuticos de glicano y métodos relacionados de los mismos |
| CN107771083A (zh) | 2015-04-23 | 2018-03-06 | 卡莱多生物科技有限公司 | 聚糖治疗剂和治疗方法 |
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| IL113776A (en) * | 1994-05-18 | 2008-12-29 | Bayer Bioscience Gmbh | Dna sequences coding for enzymes which catalyze the synthesis of linear alpha 1,4 - glucans in plants, fungi and microorganisms |
| JPH0975745A (ja) | 1995-09-14 | 1997-03-25 | Agency Of Ind Science & Technol | 新規な光反応用触媒及びそれを使用する光触媒反応方法 |
| DE19729273C2 (de) * | 1997-07-09 | 2000-08-17 | Aventis Res & Tech Gmbh & Co | Thermoplastische Mischung auf 1,4-alpha-D-Polyglucanbasis, Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung |
-
1998
- 1998-12-28 DE DE19860376A patent/DE19860376A1/de not_active Withdrawn
-
1999
- 1999-11-30 CN CNB998147486A patent/CN1192114C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-11-30 AU AU18610/00A patent/AU1861000A/en not_active Abandoned
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- 1999-11-30 WO PCT/EP1999/009299 patent/WO2000039321A1/de active IP Right Grant
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- 1999-11-30 DE DE59906129T patent/DE59906129D1/de not_active Expired - Fee Related
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| JP4716871B2 (ja) * | 2003-08-26 | 2011-07-06 | 江崎グリコ株式会社 | 錠剤用添加剤 |
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