JP2002532088A - 肝臓細胞および膵臓細胞に共通の幹細胞／前駆細胞を同定するための動物モデル - Google Patents

肝臓細胞および膵臓細胞に共通の幹細胞／前駆細胞を同定するための動物モデル

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＫＧＦ、ＥＧＦまたは両方の異所性発現が膵臓特異的プロモーター（例えば、インスリンプロモーター）の制御下にある、動物モデルを提供する。ランゲルハンスのｉｎｓ−ＫＧＦ膵島におけるＫＧＦの発現は、島集団中の管細胞の実質的な増殖ならびにｉｎｓ−ＫＧＦ膵島におけるアルブミンおよびαフェトプロテイン産生肝細胞の存在により、島を増大させる。開示される組成物および方法は、肝細胞および膵臓細胞についての共通の幹細胞／前駆体細胞を含む、膵臓の幹細胞／前駆体細胞を同定および単離するために有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、一般に、膵臓幹細胞を同定および単離するためのモデルに、そして
１つの実施形態では、肝細胞および膵臓細胞を生じる共通の幹細胞／前駆細胞を
同定または単離するためのモデルに関する。
【０００２】 （発明の背景） 健常成人の膵臓は、通常、発生上安定な器官であるが、標的細胞の損失または
異常な細胞増殖および発達は、病理学的な結果を有する。例えば、ヒトでのイン
スリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）において、自己免疫機構は、ランゲルハンス島
のインスリン産生β細胞の選択的かつ永続的な破壊を生じる。失われた細胞は、
インビボでは回復されないが、Ｓａｒｖｅｔｎｉｃｋら、Ｃｅｌｌ ５２：７７
３〜７８２（１９８８）は、β細胞が再生する能力を有することを示している。
一方、管細胞（ｄｕｃｔ ｃｅｌｌ）の増殖は、膵臓疾患の病理（例えば、慢性
膵炎、膵臓癌、および嚢胞性線維症）に寄与し得る。膵管細胞の増殖および分化
はまた、膵島の再生のトランスジェニックマウスモデルにおいて、重要な役割を
果たすことが、Ａｒｎｕｓｈら、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ ７４：９８５〜９９０
（１９９５）に示されている。さらに、内分泌細胞の分化は、膵臓管細胞癌腫に
おいて頻繁に見られており、このことは、管細胞の増殖が膵島の新生を導き得る
ことを示唆する。
【０００３】 増殖因子は、細胞の増殖および分化を調節するために重要である。膵臓増殖を
調節しかつ促進する増殖因子は、十分に特徴付けられていないが、線維芽細胞増
殖因子ファミリーのメンバーであるケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）は、創傷
治癒および多くの上皮組織の分化に関与することが公知である。ＫＧＦは、ラッ
トにおいて、上皮細胞増殖および膵臓管細胞増殖を上方制御する。また、上皮増
殖因子（ＥＧＦ）およびトランスホーミング増殖因子β−１（ＴＧＦβ−１）は
、それぞれ、管細胞発達および内分泌細胞発達を誘導し得る。上皮細胞および線
維芽細胞の増殖を刺激することが公知のＥＧＦはまた、膵臓増殖についての分裂
促進的特性を有する。ＥＧＦおよびＥＧＦレセプター（ＥＧＦ−Ｒ）の過剰発現
は、慢性膵炎および悪性の膵臓増殖の両方に関連している。
【０００４】 Ｙｉら（Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １４５：８０〜８５，１９９４）は、ラッ
トへのＫＧＦの全身投与が膵臓管細胞増殖を誘導することを示した。ＫＧＦは、
１〜２週間の毎日の全身的注射後、ラットにおいて、膵管上皮細胞の増殖を刺激
した。管細胞増殖は、優先的にランゲルハンス島に隣接するか、またはその中で
あり、そして膵臓に対する物理的傷害の非存在下で生じた。しかし、ＫＧＦを欠
くノックアウトマウスは、有意な発達異常性を示さず、そして膵臓および肝臓の
発達は完全に正常であるようである（Ｇｕｏら、ＥＭＢＯ Ｊ．１２：９７３〜
９８６、１９９３）。
【０００５】 明白に、ＫＧＦは、膵臓増殖になんらかの方法で影響し得、そしてこのプロセ
スにおけるその役割を検討するために設計されたさらなる研究は、かなり有用で
ある。従って、肝臓および膵臓の増殖および発達、ならびに関連する疾患状態の
研究を可能にする動物モデルを提供することにより、これらの増殖因子に対する
我々の知識を拡大することが重要である。
【０００６】 （発明の要旨） 本発明は、膵臓幹細胞／膵臓前駆細胞、そして１つの実施形態において、肝臓
細胞（肝細胞）および膵臓細胞を生じる共通の幹細胞／前駆細胞を同定するため
の動物モデル系を提供する。この動物モデルは、膵臓特異的プロモーター（例え
ば、インスリンプロモーター（ｉｎｓ−ＫＧＦ））からＫＧＦを異所的に発現す
る。膵臓のランゲルハンス島においてＫＧＦを発現するトランスジェニック動物
は、膵島塊内の管細胞の実質的な増殖をともなって膵島を増大させる。この動物
はまた、この膵島において、アルブミンおよびα−フェトプロテイン産生肝細胞
を有する。トランスジェニック動物は、ＫＧＦ発現に関連する病理、高血糖症、
または低血糖症をなんら示さない。
【０００７】 本発明は、さらに、トランスジェニックＥＧＦおよびＥＧＦ×ＫＧＦ動物を提
供する。この両方における増殖因子の異所性発現は、膵臓特異的プロモーターの
制御下である。ＥＧＦのβ細胞標的化発現を有する動物は、細胞性増殖およびラ
ンゲルハンス島増殖の混乱を含む有意な形態学的変化を示す。ＥＧＦ×ＫＧＦト
ランスジェニック動物は、単一のトランスジェニック動物で経験するよりも、膵
臓の形態学においてより著明な変化を経験する。二重トランスジェニック動物は
また、膵臓細胞および広範な膵島内線維症の増殖を示す。これは、時間とともに
重篤度を増す。本発明の動物は、膵臓の増殖および発達に対するＥＧＦおよびＫ
ＧＦの効果の研究、およびＥＧＦまたはＫＧＦの異常な過剰発現に関連する病理
の研究に有用である。
【０００８】 本発明は、肝臓細胞および膵臓細胞への共通の幹細胞／前駆細胞に由来する膵
臓の肝細胞を含む、いくつかの明白な細胞型を提供する。本発明はまた、トラン
スジェニック管細胞、およびトランスジェニックアミラーゼ産生細胞を提供する
。本発明はさらに、トランスジェニック細胞の作製の方法および増殖の方法、な
らびにこのトランスジェニック細胞を用いる方法を提供する。
【０００９】 本発明は、インビボにおいて、共通の幹細胞／前駆細胞の増殖および分化を提
供する。肝細胞および膵臓細胞への共通の幹細胞／前駆細胞は、インビボで、発
生上有効な量の増殖因子と接触させられる。この増殖因子は、増殖因子応答性細
胞の分化を誘導する。遺伝子改変が生物学的に活性な物質の産生のためである場
合、この物質は、一般に、所定の傷害の処置のために有用である物質である。従
って、本発明は、特異的な細胞型（肝細胞、管細胞およびアミラーゼ産生細胞を
含む）を誘導するための方法を提供する。本発明のこれらの方法の興味深い局面
は、膵臓中の特定の細胞の発達に関する基礎的な科学的情報である。この有用な
科学的情報は、本発明の動物モデルの生成から生じる。
【００１０】 本発明は、肝臓細胞および膵臓細胞への共通の幹細胞／前駆細胞のトランスフ
ェクションのための、増殖因子または増殖因子レセプターの遺伝子産物を発現し
得るベクターを用いた方法を提供する。
【００１１】 本発明は、膵管の培養を提供する。膵管の培養は、膵島における共通の幹細胞
／前駆細胞を同定するための幹細胞アッセイの開発のために有用である。
【００１２】 本発明は、肝臓細胞および膵臓細胞への共通の幹細胞／前駆細胞を同定するた
めのマーカーとして、ホメオボックスタンパク質ＰＤＸ−１を用いるための方法
を提供する。ＰＤＸ−１に対する抗体は、管腔を縁取る管細胞のサブセット、お
よび管腔周囲の管細胞のサブセットにおけるＰＤＸ−１核染色の存在を示すため
に用いられる。ＰＤＸ−１を発現したこれらの管細胞と、ＰＤＸ−１を発現しな
い管細胞との間の形態において差異は観察されなかったが、新しく形成された膵
島構造の特徴であるインスリン発現が、ＰＤＸ−１発現管細胞の小集団において
存在する。
【００１３】 （詳細な説明） （はじめに）本発明は、ＥＧＦ、ＫＧＦ、またはＥＧＦおよびＫＧＦの両方の
発現が膵臓特異的プロモーター（例えば、インスリンプロモーター）の制御下で
ある動物を提供する。従って、本発明は、膵臓の幹細胞／前駆細胞を同定および
単離するための動物モデル系、ならびに肝臓細胞（肝細胞）および膵臓細胞につ
いて共通の幹細胞／前駆細胞である細胞を同定および単離するための動物モデル
系を提供する。
【００１４】 「幹細胞」の定義は、ＰｏｔｔｅｎおよびＬｏｅｆｆｌｅｒ、Ｄｅｖｅｌｏｐ
ｍｅｎｔ，１１０：１００１（１９９０）に提供される。彼らは、幹細胞を、「
（ａ）増殖、（ｂ）自己維持、（ｃ）異なる機能の多数の子孫を生成、（ｄ）損
傷後の組織の再生、および（ｅ）これらの選択肢の使用における可撓性、をなし
得る未分化の細胞」と定義している。幹細胞は、身体中で用いられ、天然の細胞
の死、傷害または疾患により損失する細胞と入れ代わる。特定の型の組織におけ
る幹細胞の存在は、通常、高い代謝回転の細胞を有する組織と関連するが、幹細
胞はまた、組織、例えば、高い代謝回転の細胞を有さない肝臓（Ｔｒａｖｉｓ、
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：１８２９，１９９３）に存在する。「前駆細胞」は、
代表的に、いくつかの世代にわたって分割する（しかし、自己新生はしない）能
力を有するとして定義される。前駆細胞はまた、代表的には、種々の異なる細胞
型に分化され得ることが定義される。
【００１５】 本明細書において用いる場合、肝臓細胞および膵臓細胞への共通の幹細胞／前
駆細胞は、本発明の方法を用いて増殖するように誘導され得、そして分化の際に
、膵臓細胞（例えば、膵臓管細胞を含む）および肝臓細胞（例えば、肝細胞を含
む）を形成し得る未分化の細胞である。このような細胞は、「多能性」である。
なぜなら、この子孫は、多数の分化の経路を有するからである。本発明の動物モ
デルは、共通の幹細胞および前駆細胞の両方を同定するために有用である。
【００１６】 本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、以下の添付の記載中に示される。本明
細書において記載される方法および材料に類似または等価の方法および材料は、
本発明の実施または試験において用いられ得るが、ここで、好ましい方法および
材料が記載されている。本発明の他の特徴、目的、および利点は、この記載およ
び特許請求の範囲から明白である。本明細書および添付の特許請求の範囲におい
て、単数形は、本文脈が明白に他を示さない限りは、複数の対象物を含む。他に
規定しない限りは、本明細書において用いられる全ての技術および科学用語は、
本発明が属する当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に
おいて引用されるすべての特許および刊行物は、参考として援用される。
【００１７】 （本発明の動物モデルを作製するための分子生物学的方法）本発明は、ＥＧＦ
コードポリヌクレオチド、ＫＧＦコードポリヌクレオチド、またはＥＧＦコード
ポリヌクレオチドおよびＫＧＦコードポリヌクレオチドの両方の発現が、膵臓特
異的プロモーターの制御下であるトランスジェニック細胞およびトランスジェニ
ック動物を提供する。この動物は、任意の非ヒト動物、好ましくはげっ歯類、そ
して最も好ましくはマウスであり得る。
【００１８】 用語「トランスジェニック」を用いることにより、外因性遺伝子物質を含む細
胞、または動物のほとんどの細胞内に外因性遺伝子物質を含む動物を記載する。
導入遺伝子は、人工的に細胞に挿入され、そして細胞から発生する生物体のゲノ
ムの一部（安定に組み込まれるかまたは安定な染色体外エレメントとしてのいず
れか）になるＤＮＡのピースである。用語「トランスジェニック」はまた、導入
された導入遺伝子を運搬する細胞または動物を産生し得る、当業者に公知の任意
のトランスジェニック技術を記載する。ＤＮＡに転写されるＲＮＡの提供により
作製され、次いでゲノムに組み込まれる導入遺伝子は、この定義内に含まれる。
【００１９】 本発明の導入遺伝子は、インスリン産生細胞（すなわち、膵臓のβ細胞）にお
ける発現のためにインスリンプロモーターに作動可能に連結された、ＥＧＦおよ
びＫＧＦをコードするＤＮＡポリヌクレオチドを含む。「作動可能に連結された
」とは、近位をいい、ここでポリヌクレオチド成分は、それらの通常の機能を実
施するように構成される。従って、コードポリヌクレオチドに作動可能に連結し
たプロモーターは、コードポリヌクレオチドの発現をもたらし得る。「プロモー
ター」は、転写を指向するのに十分な配列である。「作動可能に連結した」コー
ドポリヌクレオチドおよびプロモーターは、適切な分子（例えば、転写アクチベ
ータタンパク質）が調節配列に結合している場合、遺伝子発現を可能にするよう
な方法で連結されている。プロモーター依存性の遺伝子発現を誘導可能にするの
に十分であるこれらのプロモーター成分は、本発明に含まれる。
【００２０】 膵臓特異的プロモーターは、作動可能に連結しているコードポリヌクレオチド
を発現するように膵臓内で優先的に作用するプロモーターである。膵臓プロモー
ターの中には、インスリンプロモーター、グルカゴンプロモーター、グルカゴン
レセプタープロモーター、およびＧＬＰ−１レセプタープロモーターがある。イ
ンスリンプロモーターは、実施例１、２、３および４において用いられる。
【００２１】 グルカゴンは、膵臓のヒトＡ細胞内に産生された２９アミノ酸のホルモンであ
る。グルカゴンは、糖原分解および糖生成を促進する。これは、インスリン産生
細胞上で見出される特異的細胞表面レセプターへの結合により、血糖のレベルの
上昇を生じる。次にこれは、インスリンのレベルを上昇させる。インスリンのレ
ベルが上昇すれば、インスリンは、グルカゴンの産生を下方制御し、これがフィ
ードバック回路を完了させる。グルカゴンは、６３０塩基対の遺伝子から翻訳さ
れ、前駆体プレプログルカゴンを形成する。これは、引き続き、プログルカゴン
に翻訳後短縮される。プログルカゴンは、３つの別個の非常に相同な個々のペプ
チド（グルカゴン、グルカゴン様タンパク質１、およびグルカゴン様タンパク質
２と呼ばれる）に切断される。ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−２は、それぞれ、３７
アミノ酸および３４アミノ酸であり、そして膵臓中に見出される。ＧＬＰ−１は
、おそらく特徴付けられる最も強力なインスリン分泌性ホルモンであり、そして
ＩＩ型糖尿病の処置のための可能性のある首尾良い新薬として広くみなされてい
る。なぜなら、その活性は、この疾患を有する患者において保存されているから
である。いくつかの試験が、ヒト患者における糖尿病性高血糖症の制御における
、ＧＬＰ−１の治療能力を評価している（例えば、Ｇｕｔｎｉａｋら、Ｎ．Ｅｎ
ｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２６：１３１６〜１１（１９９２）を参照のこと）。
【００２２】 「トランスジェニック動物」は、ゲノムがすでにヒトの手によって変更されて
いる動物である。本発明の「トランスジェニック動物」は、動物の生殖細胞系列
へ「導入遺伝子」を導入することによって産生される。トランスジェニック動物
は、さらに、生殖において使用される細胞内に外因性遺伝物質を含む、雑種の２
つのキメラ動物によって産生され得る。得られた子孫の２５％は、トランスジェ
ニック（すなわち、両方の対立遺伝子がこれらの細胞の全てにおいて外因性遺伝
物質を含む動物）であり；得られた動物の５０％は、１つの対立遺伝子内に外因
性遺伝物質を含み；そして２５％は、外因性遺伝物質を含まない。
【００２３】 種々の発生段階における胚性標的細胞は、その段階において導入遺伝子を導入
するために使用され得る。異なる方法は、胚性標的細胞の発生の段階に依存して
使用される。接合体は、微量注入のための最善の標的である。遺伝子移入のため
の標的としての接合体の使用は、注射されたＤＮＡが最初の切断の前に宿主遺伝
子に組み込まれ得るという、主要な利点を有する。トランスジェニック非ヒト動
物の細胞のほとんどまたは全ては、組み込まれた導入遺伝子を保有する。これは
また、創始体の子孫に対する導入遺伝子の効率的な伝達に反映される。なぜなら
、生殖細胞の５０％が、導入遺伝子を有するからである。
【００２４】 レトロウイルス感染はまた、導入遺伝子を動物へ導入するために使用され得る
。発生中の胚は、インビトロにおいて胚盤胞段階まで培養され得、その間、割球
は、レトロウイルス感染についての標的であり得る。割球の効率的な感染は、ｚ
ｏｎａ ｐｅｌｌｕｃｉｄａを除去するための酵素的処理によって得られる。導
入遺伝子を導入するために使用されるウイルスベクター系は、代表的に、導入遺
伝子を保有する複製欠損レトロウイルスである。トランスフェクションは、ウイ
ルス産生細胞の単層上で割球を培養することによって、容易でかつ効率的に得ら
れる。あるいは、感染は、後期段階で実施され得る。ウイルスまたはウイルス産
生細胞は、胞胚腔（ｂｌａｓｔｃｏｅｌ）へ注射され得る。創始体のほとんどは
、導入遺伝子についてモザイクである、なぜなら、組み込みが、トランスジェニ
ック動物を形成する細胞のサブセットにおいてのみ生じるからである。さらに、
創始体は、ゲノム中の異なる位置で導入遺伝子の種々のレトロウイルス挿入を含
み得、これは、一般に、子孫において分離される。これはまた、低い効率性にも
かかわらず、子宮内の中期妊娠胚のレトロウイルス感染によって、生殖細胞系へ
導入遺伝子を導入することが可能である。
【００２５】 導入遺伝子導入のための標的細胞の第３の型は、胚性幹細胞（ＥＳ）である。
ＥＳ細胞は、インビトロで培養された、移植前（ｐｒｅ−ｉｍｐｌａｎｔａｔｉ
ｏｎ）胚から得られ、そして胚と融合される。導入遺伝子は、ＤＮＡトランスフ
ェクションによるかまたはレトロウイルス媒介形質導入によって、ＥＳ細胞へ効
率的に導入され得る。その後、形質転換されたＥＳ細胞は、動物由来の胎盤胚細
胞と結合され得る。その後、ＥＳ細胞は、胚をコロニー形成し、そして得られた
キメラ動物の生殖細胞系に寄与する（総説については、Ｊａｅｎｉｓｃｈ、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２４０：１４６８〜１４７４、１９８８を参照のこと）。
【００２６】 当該分野で周知の組換え遺伝子技術は、本発明の方法を実施するために使用さ
れ得、この技術としては、ＤＮＡ含有量の測定、サザンブロッティング、ノーザ
ンブロッティング、ＰＣＲ分析、および放射性ヌクレオチドまたは蛍光性ヌクレ
オチドの取り込みが挙げられる。本特許において使用される場合、用語「組換え
」は、いつも、ヒトの手による産生をいう。分子生物学的技術についての文献の
出典としては、以下が挙げられる：Ｂｅｒｇｅｒ＆Ｋｉｍｍｅｌ（Ｇｕｉｄｅ
ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）；Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ − Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ、第２版、第１〜３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９）；ならびにＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、１９９４、補遺）。有用な情報はまた、生物学的
試薬および実験機器の製造業者（例えば、ＳＩＧＭＡ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ
ｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ
（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫ
Ｂ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅ
ｙ）、ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌ Ａ
ｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、Ｃｈｅｍ Ｇｅｎｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ａｌｄ
ｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓｃ
ｏｎｓｉｎ）、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｃａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ Ａｎａｌ
ｙｔｉｋａ（Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌ
ａｎｄ）、およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉ
ｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））からの製品情報において見出される。ポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβ−レプリカーゼ増
幅および他のＲＮＡポリメラーゼ媒介技術（例えば、ＮＡＳＢＡ）についての方
法は、また、Ｍｕｌｌｉｓら（米国特許第４，６８３，２０２号）；ＰＣＲ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌ
ｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．
、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、１９９０）、Ａｒｎｈｅｉｍら
（Ｃ＆ＥＮ、３６−４７、１９９０年１０月１日）；Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
Ｏｆ ＮＩＨ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（３：８１−９４、１９９１）；Ｋｗｏｈら（
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：１１７３、１９８９）
；Ｇｕａｔｅｌｌｉら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７
：１８７４、１９９０）；Ｌｏｍｅｌｌら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ、３５：１
８２６、１９８９）；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７
７〜１０８０、１９８８）；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
８：２９１〜２９４、１９９０）；ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ（Ｇｅｎｅ ４
：５６０、１９８９）；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒら（Ｇｅｎｅ ８９：１１７、１９
９０）；ならびにＳｏｏｋｎａｎａｎおよびＭａｌｅｋ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ １３：５６３〜５６４、１９９５）を参照のこと。
【００２７】 Ｉｎｓ−ＫＧＦ動物。本発明は、トランスジェニック動物および細胞を提供し
、ここで、ＫＧＦコードポリヌクレオチドの発現は、膵臓特異的プロモーター（
例えば、インスリンプロモーター）の制御下にある。ｉｎｓ−ＫＧＦ動物は、膵
臓のランゲルハンス島のインスリン産生細胞（例えば、β細胞）に対するＫＧＦ
発現を指向する。
【００２８】 ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）は、上皮細胞に特異的な潜在的マイトジェ
ンとして作用する、間葉由来のマイトジェンである。インビボにおいて、ＫＧＦ
はまた、上皮細胞増殖の間葉性刺激を誘導し得る。さらに、ＫＧＦは、創傷治癒
プロセスおよび内皮細胞分化において重要である。
【００２９】 ＫＧＦは、線維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバーである。このファミリー
のメンバーは、多くのプロセス（細胞増殖、移動および分化を含む）に影響を及
ぼす。ＫＧＦは、ｃＤＮＡ配列から推定される１９４アミノ酸長を有する、２２
．５ｋＤａのタンパク質である。ヒトＫＧＦは、１６３アミノ酸残基を含む、１
９キロダルトン（ｋＤａ）のタンパク質である。ＫＧＦ遺伝子は、少なくとも、
チンパンジー、ゴリラ、テナガザル、アフリカミドリザル、マカクザル、マウス
およびニワトリのように多様な動物のゲノムにおいて存在する。ＫＧＦは、ＨＢ
ＧＦ−７（ヘパリン結合増殖因子−７）とも呼ばれ、そして推奨される新たな名
前は、ＦＧＦ−７（線維芽細胞増殖因子−７）である。ＫＧＦのウシ対応物は、
ＳＤＧＦ−３（脾臓由来増殖因子）である。ＫＧＦレセプターは、最近クローニ
ングされた。ＫＧＦレセプターは、チロシンをコードし、そしてレセプター結合
ａＦＧＦおよびｂＦＧＦのファミリーのメンバーである。
【００３０】 β細胞は、膵臓のランゲルハンス島に位置するインスリン産生細胞である。膵
臓は、腹部（胃の後ろ）に位置される。膵臓の内側は、ランゲルハンス島と呼ば
れる、細胞の小さなクラスターである。島の内部はβ細胞であり、これは、イン
スリンを産生する。インスリンは、血液中の糖の量を調節するホルモンである。
β細胞において、インスリン発現は、インスリンプロモーターの制御下でのイン
スリンコードポリヌクレオチドの発現から生じる。
【００３１】 先行技術は、発生の間の肝臓においてＫＧＦのトランスジェニック発現が、肝
臓、膵臓および他の部位に対する実質的な形態学的変化、ならびに複数の器官系
での上皮増殖における変化を生じることを示す（Ｎｇｕｙｅｎら、Ｏｎｃｏｇｅ
ｎｅ １２：２１０９〜２１１９、１９９６）。これは、本発明のｉｎｓ−ＫＧ
Ｆ動物と対照的であり、ここで、ＫＧＦのトランスジェニック発現は、膵臓に指
向され、そしてここで、有意な形態学的障害は、膵臓の外側に示されない。
【００３２】 本発明のｉｎｓ−ＫＧＦ動物は健常であり、膵臓ＫＧＦ発現に起因する明白な
毒性効果を有さない。例えば、年齢が一致する同腹子コントロールマウスと比較
して、ｉｎｓ−ＫＧＦマウスの血液グルコースレベルにおいて見出される有意な
差異は、検出されない（実施例１を参照のこと）。確かに、有意であるかまたは
病理を生じる膵臓の活性における任意の変化が存在することを示唆する証拠はな
い。
【００３３】 いくつかの興味深い特徴は、本発明のｉｎｓ−ＫＧＦ動物を特徴付け、この特
徴は、ランゲルハンス島における肝細胞の発生を含む。ランゲルハンス島は、膵
臓全体に位置するα細胞、β細胞、δ細胞およびポリペプチド細胞のクラスター
である。ｉｎｓ−ＫＧＦ肝細胞は、この島の末梢に位置され、そしてアルブミン
およびα−フェトプロテインの発現によって同定される。肝臓および膵臓の両方
は、前腸由来の共通の内胚葉膨出に由来する。この点において、これらのｉｎｓ
−ＫＧＦ肝細胞が、α−フェトプロテイン（肝細胞がちょうど発生している場合
を除いて、成体膵臓において通常見出されない、胚特異的タンパク質）を産生す
ることが重要である。全てのｉｎｓ−ＫＧＦ肝細胞は、α−フェトプロテインを
発現するが、一方、２／３のみがアルブミンを発現する。α−フェトプロテイン
は、アルブミンよりも、発生の間の初期に発現されるので、アルブミンではなく
α−フェトプロテインを発現する細胞は、二重陽性細胞よりも、初期の胚細胞前
駆体を提示する。さらに、島構造内の肝細胞の局在は異常であり、そして発生中
の膵臓において肝臓細胞および膵臓細胞に対して共通の幹／前駆体の存在を示す
。
【００３４】 本発明のｉｎｓ−ＫＧＦ動物におけるＫＧＦによる肝細胞の誘導は、予期され
なかった。ＫＧＦは、インビトロおよびインビボで肝細胞の増殖を誘導すること
が示されている（Ｈｏｕｓｌｅｙら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９４：１７
６４〜１７７７、１９９４；Ｉｔｏｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ
ｅｓ．Ｃｏｍｍｕ．１９２：１０１１〜１０１５、１９９３）。肝細胞はまた、
ランゲルハンス島においてＩＦＮγを過剰発現するトランスジェニックマウスの
膵臓において誘導される（Ａｒｎｕｓｈら、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ ７４：９８
５〜９９０、１９９５）。これらのモデルとは対照的に、本発明のｉｎｓ−ＫＧ
Ｆ動物の肝細胞のほとんどは、この島の外縁で膵臓内に位置される。
【００３５】 本発明のｉｎｓ−ＫＧＦ動物の、別の興味深い特徴は、トランスジェニック動
物の膵臓における管細胞（ｄｕｃｔ ｃｅｌｌ）の過増殖である。正常な膵臓に
おいて、介在導管が存在し、そして腺房管腔（ａｃｉｎａｒ ｌｕｍｅｎ）内に
及ぶ。外分泌膵臓の管は、以下を含む：（１）低い立方上皮によって形成される
介在導管；（２）小葉内管（これは、直径が変化し、そして単純な立方上皮によ
って裏打ち（ｌｉｎｅ）される）；そして（３）より大きな小葉内管（単純な立
方上皮によって裏打ちされ、そして膠原性組織の層によって覆われる）。２つの
主要な管は、ＳａｎｔｏｒｉｎｉおよびＷｉｒｓｕｎｇの管である；これらは、
基底核を有する、背の高い円柱上皮を有する。
【００３６】 正常（非トランスジェニック）膵臓において、消化酵素を産生する細胞は、腺
房と呼ばれる群に群がり、この群は、酵素が十二指腸に送達される管に至る。管
内の細胞は、管細胞である。腺房内の細胞（腺房細胞）は、膵臓の大部分を構成
する。腺房細胞の先端部分は、好酸球酵素原顆粒で充填される。腺房細胞は、先
端表面を通して腺房管腔へ直接分泌する。腺房細胞による前酵素の分泌は、セク
レチン、コレシストキニン、および迷走神経（ｖａｇｕｓ）からの神経刺激によ
って調節される。
【００３７】 増殖管細胞は、炭酸脱水酵素ＩＩ（ＣＡＩＩ）の発現によって、管細胞として
同定される。この増殖管細胞は、全ての内分泌ホルモンの正常な産生を示すラン
ゲルハンス島内に位置する。
【００３８】 Ｙｉら（Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １４５：８０−８５，１９９４）による以
前の研究とは対照的に、本発明のｉｎｓ−ＫＧＦ動物モデルの膵臓は、継続的な
処置または付加的な処置を必要とせずに、ＫＧＦを連続的に発現する。管細胞増
殖は、病理学的な結果を伴わずに、本発明のｉｎｓ−ＫＧＦ動物の生存の間に進
行するプロセスである。興味深いことに、本発明のｉｎｓ−ＫＧＦ動物における
管細胞増殖に対するＫＧＦの影響は、ラットにおけるＫＧＦの全身投与後に観察
される事象の多くに並行する。実際に、ランゲルハンス島に隣接するか、または
ランゲルハンス島内の小葉内管が、増殖する小葉内管であることは印象的である
。
【００３９】 （Ｉｎｓ−ＥＧＦ動物）本発明は、ＥＧＦの発現が膵臓に標的化される、トラ
ンスジェニック動物および細胞を提供する。１つの実施形態において、ＥＧＦの
発現は、ランゲルハンス島内のβ細胞に標的化される。上皮増殖因子（ＥＧＦ）
は、内胚葉、中胚葉および外胚葉起源の種々の細胞についての強力なマイトジェ
ンである。ＥＧＦはまた、ケラチノサイトの増殖および移動を促進し、そして線
維芽細胞および胚性細胞の増殖を増強する。従って、ＥＧＦは、創傷治癒および
器官形成において重要な役割を果たす。
【００４０】 ＥＧＦは、５３アミノ酸からなる６．４ｋＤａの球状タンパク質である。これ
は、生物学的活性に必須の、３つの分子内ジスルフィド結合を含む。ＥＧＦタン
パク質は、進化的に緊密に保存される。ヒトＥＧＦおよびマウスＥＧＦは、共通
の３７アミノ酸を有する。マウスＥＧＦは、雄性マウス顎下腺から６．１ｋＤａ
タンパク質として精製される。ヒト組換えＥＧＦは、Ｅ．ｃｏｌｉ中で、５３ア
ミノ酸残基を含む６ｋＤａタンパク質として産生され得る。ヒトＥＧＦおよびマ
ウスＥＧＦは、種交差反応性である。約７０％の相同性が、ヒトＥＧＦと他の種
から単離されたＥＧＦとの間で見出される。システイン残基の相対的な位置は、
保存される。
【００４１】 ＥＧＦは、管細胞発生を誘導することが公知である。ＥＧＦが上皮細胞および
線維芽細胞の増殖を刺激する能力は、よく実証されているが、ＥＧＦはまた、膵
臓増殖のためのマイトジェン特性を有する。さらに、ＥＧＦおよびそのレセプタ
ー（ＥＧＦレセプター、ＥＧＦ−Ｒ）の過剰発現が、慢性膵炎および悪性の膵臓
増殖の両方に関連する証拠が存在する。例えば、ｉｎｓ−ＩＦＮγマウスの顕著
な増殖および分化のパターン、ＥＧＦおよびＥＧＦ−Ｒが、Ａｒｎｕｓｈら、Ｌ
ａｂ Ｉｎｖｅｓｔ ７４：９８５−９９０（１９９５）によって上方調節され
ることが見出されている。ＥＧＦレセプターは、内因性チロシンキナーゼ活性を
有する、１７０ｋＤａの単量体糖タンパク質である。レセプターキナーゼ活性の
刺激は、ＥＧＦがレセプターの細胞外ドメインに結合する場合に生じ、これは、
レセプターの細胞質テールの自己リン酸化およびＥＧＦ増殖シグナルの伝達を生
じる。
【００４２】 Ｉｎｓ−ＥＧＦ動物は、非トランスジェニック動物と比較した場合に、膵臓に
おける劇的な形態学的変化を有する。膵臓細胞増殖は、ｉｎｓ−ＥＧＦ動物にお
いて生じる。ｉｎｓ−ＥＧＦ動物はまた、島の組織崩壊および島内の繊維化を示
す。
【００４３】 （Ｉｎｓ−ＥＧＦ ｘ ＫＧＦ動物）本発明は、ＫＧＦおよびＥＧＦの発現が
膵臓に標的化された、トランスジェニック動物を提供する。１つの実施形態にお
いて、ＫＧＦおよびＥＧＦの発現は、ランゲルハンス島におけるβ細胞に標的化
される。ＫＧＦおよびＥＧＦの両方は、膵臓発生において重要な役割を果たす。
低い基底レベルのＥＧＦは、非トランスジェニックマウスの島において通常発現
されるが、ＫＧＦは、ランゲルハンス島において通常見出されない。ｉｎｓ−Ｅ
ＧＦ ｘ ＫＧＦ動物は、ＥＧＦおよびＫＧＦの局在化された過剰発現が膵臓の
増殖および機能に対して有する協同的効果に取り組むために有用であり、一方ｉ
ｎｓ−ＥＧＦおよびｉｎｓ−ＫＧＦトランスジェニックマウスは、それらの影響
を独立して評価するために有用である。
【００４４】 本発明のｉｎｓ−ＥＧＦ ｘ ＫＧＦ動物は、島β細胞におけるＥＧＦおよび
ＫＧＦの発現が、内分泌組織および外分泌組織のの両方に対して、促進的かつ広
範な一連の変化を生じることを示す。例えば、有意な島内管細胞増殖は、ｉｎｓ
−ＫＧＦ動物の膵臓で生じる。また、肝細胞が、ｉｎｓ−ＥＧＦ ｘ ＫＧＦ動
物の島内で生じる。ｉｎｓ−ＥＧＦ ｘ ＫＧＦ動物は、島の組織崩壊および島
内の繊維化を有し、これらの両方は、ｉｎｓ−ＫＧＦ動物においてより、ｉｎｓ
−ＥＧＦ ｘ ＫＧＦ動物においてより広範である。両方の単一トランスジェニ
ック動物によって共有される多くの特徴（例えば、膵臓細胞増殖、島のサイズお
よび組織崩壊の増加、ならびに繊維化）は、その二重トランスジェニック動物に
おいて、より高い程度で生じる。興味深いことに、二重トランスジェニック動物
におけるアミラーゼ陽性細胞は、いずれの単一トランスジェニック動物において
も見出されず、これは、β細胞におけるＥＧＦおよびＫＧＦの両方の局在化され
た過剰発現が、この独特の表現型を生じるために必要であることを示す。
【００４５】 増殖因子トランスジェニック動物の膵臓における広範な形態学的変化に関わら
ず、膵臓機能の不全は、検出されない。正常な内分泌ホルモンおよび外分泌酵素
が、これらのトランスジェニック動物において存在する。血糖レベルは、それら
の動物の生存中を通して正常なままである。従って、これらの動物において明ら
かである物理的変化は、正常な膵臓機能を干渉しない。
【００４６】 興味深いことに、観察されたいくつかの形態はまた、いくつかの膵臓疾患を特
徴付ける。例えば、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）のＧＫラットモデ
ルは、島の組織崩壊、有意な繊維化、および結合組織の線維によって分離される
β細胞のクラスターによって特徴付けられる（Ｍｏｖａｓｓａｔら、Ｄｉａｂｅ
ｔｅＭｅｔａｂ ２１：３６５−３７０，１９９５）。慢性膵炎は、炎症および
繊維化によって特徴付けられる。興味深いことに、慢性膵炎およびいくつかのヒ
ト膵臓癌において、ＥＧＦ、ＥＧＦ−ＲおよびＫＧＦは、しばしば過剰発現され
る。
【００４７】 （特定の肝臓細胞型および膵臓細胞型に対する共通の幹細胞／前駆細胞の、イ
ンビボでの増殖および分化）本発明は、特定の細胞型（肝細胞、管細胞、および
アミラーゼ産生細胞を含む）を誘導するための方法を提供する。肝臓細胞および
膵臓細胞に対する共通の幹細胞／前駆細胞は、発生に有効な量の増殖因子をイン
ビボで接触される。ここで、増殖因子は、この増殖因子応答性細胞の、とりわけ
肝細胞、増殖管細胞、またはアミラーゼ産生細胞への発生を誘導する。細胞型の
増殖因子依存性発生に関連して、「発生に有効な量」とは、その細胞型の発生を
引き起こすのに十分な量の増殖因子をいう。発生に有効な量は、公知の細胞培養
技術を使用して、当業者によって決定され得る。
【００４８】 増殖因子は、当該分野で公知の任意の増殖因子を含む。薬学的組成物は、抑制
性の影響をブロックするか、または共通の幹細胞／前駆細胞の増殖および最終分
化を刺激する、任意の物質を含む。従って、インビトロで共通の幹細胞／前駆細
胞を増殖、分化および遺伝子改変するための技術は、インビボ技術に適用され、
類似の結果を達成し得る。これらの細胞のこのようなインビボでの操作および改
変は、動物中の細胞（損傷または疾患に起因して損なわれている）が内因的に置
換されるのを可能にし、従って、外来細胞を患者に移植する必要性を排除する。
さらに、本発明の細胞は、インビボで改変または遺伝子操作され得、その結果、
これらは、神経学的障害の処置に有用な種々の生物学的因子を発現する。
【００４９】 増殖因子の被験体への投与は、任意の方法によってなされ得、これらには、注
入カニューレ、増殖ホルモン発現ベクターでの細胞のトランスフェクション（例
えば、ｉｎｓ−ＥＧＦ細胞、ｉｎｓ−ＫＧＦ細胞、およびｉｎｓ−ＥＧＦ ｘ
ＫＧＦ細胞）、注入、所望の部位に物質を投与し得る時限放出装置などが挙げら
れる。薬学的組成物は、任意の方法によって投与され得、これらには、注入カニ
ューレ、注射、経口投与、時限放出装置などが挙げられる。共通の幹細胞／前駆
細胞は、それらの増殖および分化を誘導する特定の増殖因子または薬学的組成物
での誘導後に、インビボで増殖および分化する。従って、この後者の方法は、移
植および外来細胞に対する免疫反応に関連する問題を回避する。任意の増殖因子
、特にＥＧＦおよびＫＧＦが使用され得る。
【００５０】 共通の幹細胞／前駆細胞のインビボ細胞集団の通常の運命（すなわち、細胞死
）は、Ｂｃｌ−２を投与するか、またはｂｃｌ−２遺伝子を用いて細胞を遺伝子
改変することによって変化され得る。Ｂｃｌ−２および関連の遺伝子産物は、種
々の細胞型におけるプログラムされた細胞死（アポトーシス）を妨げることが公
知である。ＥＧＦ投与に類似して、肝臓細胞および膵臓細胞への共通の幹細胞／
前駆細胞のクローン増殖は、ｂｃｌ−２の感染後に達成され得る。
【００５１】 従って、本発明は、肝臓再生間の肝細胞増殖および分化した機能を調節するイ
ンビボ機構を特徴付けるための動物モデル系を提供する。肝臓損傷は、細胞増殖
活性を調節する複数の因子の放出を生じる。これらの因子は、肝臓および他の組
織の両方によって生成され、そして他の状況下では、それらの栄養性作用は、肝
臓細胞に限定されない。しかし、細胞メカニズムは、その後の損傷した肝臓への
細胞増殖を制限し、その結果、細胞増殖は、他の損傷器官において増加しない。
これらの異なる増殖調節因子の各々は、肝細胞の表面上の固有のレセプターと相
互作用し、そして複雑な（しかし順序正しい）細胞内事象のカスケードを誘発し
、これらは、ともに肝細胞遺伝子発現の「再プログラミング」において頂点に達
し、次いで、これは、細胞が増殖阻止を回避するのを可能にさせる。細胞増殖の
基本的研究は、しばしば、単純化された培養系において単離された細胞を用いて
行われる。しかし、このストラテジーは、生存動物における細胞の増殖および分
化を調節する他の重要な影響（例えば、細胞−細胞相互作用および細胞−環境相
互作用）を無視する。後者は、器官構造をインタクトに残すモデルにおいて、よ
り良好に研究される。さらに、後者のモデルは、損傷後の肝臓の再構成にまた関
与する、他の肝臓構成要素（胆管細胞、血管および結合組織を含む）の応答を同
定するために必要である。
【００５２】 （共通の幹細胞／前駆細胞の肝臓細胞および膵臓細胞へのインビボ遺伝子改変
）遺伝子改変の任意の適切な方法は、共通の幹細胞／前駆細胞の肝臓細胞および
膵臓細胞への遺伝子改変に使用され得る。用語「遺伝子改変」とは、外来ＤＮＡ
の意図的な導入による、細胞の遺伝子型の安定または一過的な変化を意味する。
ＤＮＡは、合成的であり得るか、または天然に由来し得、そして遺伝子、遺伝子
の部分または他の有用なＤＮＡ配列を含み得る。用語「遺伝子改変」は、天然の
ウイルス活性、天然の遺伝子組換えなどを介して生じるような、天然に存在する
変化を含まない。遺伝子改変が、生物学的に活性な物質の産生のためのものであ
る場合、その物質は、一般的に、所定の障害の処置のために、例えば、特定の増
殖因子産物を分泌するために有用な物質である。用語「増殖因子産物」とは、成
長効果、増殖効果、分化効果または栄養効果を有する、タンパク質、ペプチド、
マイトジェンまたは他の分子を意味する。
【００５３】 肝臓細胞および膵臓細胞に対する共通の幹細胞／前駆細胞は、インビボで改変
され得る。遺伝子改変は、発現ベクターを使用して達成され得る。当該分野で公
知の任意の発現ベクターが、それが、細胞中で活性なプロモーター、ならびに適
切な終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルを有する限り、増殖因子を発現
するために使用され得る。
【００５４】 哺乳動物被験体宿主のために、いくつかの可能なベクター系が、標的化された
転写物に特異的なポリヌクレオチドの発現に利用可能である。いくつかのベクタ
ーは、自立複製する染色体外プラスミド（一般に、動物ウイルスに由来する）を
提供するＤＮＡエレメントを使用する。他のベクターとしては、ワクシニアウイ
ルス発現ベクターが挙げられる。なお他のベクターは、宿主染色体に導入された
ＤＮＡを組み込む。その染色体中へ導入されたＤＮＡを安定に組み込んだ細胞は
、その発現ベクターを含む宿主細胞の選択を可能にする、１以上のマーカー（例
えば、外来遺伝子）をまた導入することによって選択され得る。マーカーは、栄
養要求性宿主に対する栄養原（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｙ）、殺生剤（ｂｉｏｃｉｄ
ｅ）（例えば、抗生物質、または重金属（例えば、銅））耐性などを提供する。
選択マーカー遺伝子は、発現されるべきＤＮＡ配列に直接的に連結され得るか、
または同時形質転換によって同じ細胞に導入され得るかのいずれかである。さら
なるエレメントもまた、ｍＲＮＡの最適な合成に必要とされ得る。これらのエレ
メントは、スプライシングシグナルならびに転写終結シグナルを含み得る。
【００５５】 多くのストラテジーが、ドナー細胞を標識するために使用されている。これら
には、トリチウム化標識、蛍光色素、デキストラン、およびウイルスベクター保
有レポーター遺伝子が挙げられる。しかし、これらの方法は、毒性、安定性また
は長期にかけての希釈の固有の問題に苦しむ。トランスジェニック動物由来の細
胞の使用は、移植された神経細胞の同定が達成され得る、改善された手段を提供
し得る。トランスジェニック標識系は、細胞標識のためのより安定かつ効率的な
方法を提供する。この系において、プロモーターエレメントは、トランスジェニ
ックマウスにおけるＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子の発
現を指向し得る。これらの系において、レポーター遺伝子の細胞特異的発現は、
発生的に調節される様式で生じる。Ｒｏｓａ２６トランスジェニックマウスは、
トランスジェニック標識系の１例であり、ここで、全ての細胞は、遍在的にβ−
ガラクトシダーゼを発現する。胚性または成体のＲｏｓａ２６マウスは、Ｃ５７
／ＢＬ／６マウス由来のトランスジェニックマウスであり、このＣ５７／ＢＬ／
６マウスは、全ての細胞においてβ−ガラクトシダーゼを発現し、従って、移植
された細胞が宿主組織において容易に検出されるのを可能にする。
【００５６】 ウイルス様ベクターは、細胞における組換えポリヌクレオチド構築物の組み込
みおよび発現のためのビヒクルとして有用である。ウイルス由来のベクターは、
外来核酸をレシピエント細胞に安全に送達し得る。標的細胞にゲノム成分を送達
するウイルスの天然の能力を利用するための、異種遺伝子（導入遺伝子）を保持
するウイルス由来のベクターは、遺伝性疾患を矯正するため、または治療分子を
送達するための遺伝子治療に有用であり、そして一般的に、ウイルス（例えば、
レトロウイルス長末端反復（ＬＴＲＲ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ））プロモーター；あるいは肝臓細胞特異的プロ
モーター（例えば、アルブミンプロモーター；Ｃｏｎｎｅｌｌｙら、Ｈｕｍ Ｇ
ｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６（２）：１８５−９３（１９９５）およびＭｉｌｏｓおよ
びＺａｒｅｔ、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．６（６）：９９１−１００４（１９９２）
を参照のこと）または膵臓細胞特異的プロモーター（例えば、インスリンプロモ
ーター）を含む。
【００５７】 哺乳動物細胞のための組換えウイルスベクターを産生するために、いくつかの
ウイルスが、開発されている。これらには、組換えワクシニアウイルスベクター
および種々のより小さいウイルス由来のベクターが挙げられる。以下の４つの型
に関心が集められた；レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイル
ス、アデノ随伴ウイルスおよび単純ヘルペスウイルス１型（Ｄａｖｉｄ Ｐｅｅ
ｌ，Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ＆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｐｒｏｂｌ
ｅｍｓ，Ｐｒｏｍｉｓｅｓ ＆ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ（ＭＢＣｈＢ Ｓｐｅｃｉ
ａｌ Ｓｔｕｄｙ Ｍｏｄｕｌｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｒｅｐｏｒｔ，Ｄｅｐａｒ
ｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒ，１９９８）を参照のこと）。
【００５８】 一般的に、このようなベクターは、インビボで複製せず、非標的細胞の意図し
ない任意の感染を防止する。このような場合、ヘルパー細胞株が提供され、これ
は、インビトロで欠失している複製機能を提供し、これによって、そのポリヌク
レオチドをコードするベクターの増幅およびパッケージングを可能にする。非標
的細胞の偶発的感染に対するさらなる予防は、標的細胞特異的調節配列の使用を
含む。このような配列の制御下にある場合、ポリヌクレオチド構築物は、正常な
組織中で発現されない（Ａｒｍｅｎｔａｎｏらに対して、１９９８年１０月２０
日に公布された米国特許第５，８２４，５４４号を参照のこと。これは、インビ
トロ増幅および臨床的使用の間の複製コンピテントなアデノウイルスの生成を妨
げる、遺伝子治療における使用のためのアデノウイルスベクターを提供する）。
【００５９】 レトロウイルスは、一本鎖ＲＮＡ分子をゲノムとして含有するエンベロープウ
イルスのクラスである。レトロウイルスベクターは、頻繁に、それらの細胞ゲノ
ムへの組み込む能力に起因して、遺伝子治療に使用される（Ｊｏｌｌｙ、Ｃａｎ
ｃｅｒＧｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５１−６４（１９９４）；Ｈｏｄｇｓｏ
ｎ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：２２２−２２５（１９９５））。レト
ロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）に基づ
き得る。Ｍｏ−ＭＬＶは、アンホトロピックウイルスであり、マウス細胞および
ヒト細胞の両方を感染し得る。この能力は、マウスモデルおよびヒト細胞の両方
においてベクターの発生を可能にし、従ってヒト処置を可能にする。このウイル
ス遺伝子は、目的の導入遺伝子と置換され、そしてパッケージング細胞株におい
てプラスミド上で発現される。
【００６０】 アデノウイルスは、直鎖状二本鎖ＤＮＡゲノムを含む、エンベロープで取り囲
まれていないウイルスであり、このウイルスは、古典的な遺伝学および分子生物
学の研究を通して充分に特徴付けられている（Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ，第２版，Ｆｉｅｌｄｓら編（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，
１９９０）。サブグループＣの血清型２または血清型５は、通常ベクターとして
用いられる。その生活環は通常、宿主ゲノムへの組み込みを含まず、むしろアデ
ノウイルスは、宿主細胞の核においてエピソーム性エレメントとして複製する。
アデノウイルスに基づくベクターは、分裂中の細胞および分裂していない細胞の
両方への向性、最少の病原性可能性、ベクターストックの調製のために高力価に
複製する能力、および大きな挿入物を保有する可能性を含む、いくつかの特有の
利点を提供する（Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．１５８：３９−６６（１９９２）；Ｊｏｌｌｙ，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ １：５１−６４（１９９４））。アデノウイルスベクターは
、細胞をインビトロおよびインビボでトランスフェクトする際に非常に効率的で
あり、そして高力価で産生され得る。初期に開発されたベクターからのインビボ
での導入遺伝子発現は、一過性の傾向があった。ウイルスのコード配列を含まな
い、「遺伝子のない（ｇｕｔｌｅｓｓ）」ベクターとなる、より少ない遺伝子を
含むベクターの開発は、肝臓組織における、インビボでの長期の導入遺伝子発現
をもたらした（Ｓｃｈｉｅｄｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １８：
１８０−１８３（１９９８））。
【００６１】 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、増殖するためにはヘルパーウイルスに依存
する、非病原性ヒトパルボウイルスである。ＡＡＶは、分裂中の細胞および分裂
していない細胞の両方に感染し得、そしてヘルパーウイルスの非存在下で、宿主
ゲノムの特定の点（染色体１９ｑ １３−ｑｔｅｒ）に高頻度で組み込まれる。
組換えＡＡＶはまた、宿主ゲノム中に効率的に組み込まれ得、分裂していない細
胞を形質導入し得、そしてトランスフェクトされた細胞を破壊する免疫応答を誘
導しない。ＡＡＶベクターにおける重要性は、長期の導入遺伝子発現を可能にす
る、宿主ゲノムへのＡＡＶ組み込みに起因する。肝臓細胞への遺伝子移入は、Ｓ
ｎｙｄｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６：２７０−２７５（１９
９７）によって報告されている。
【００６２】 レトロウイルス構築物を用いて通常の幹細胞／前駆細胞を遺伝子改変する場合
、これらの細胞は、例えば、浸透圧注入ポンプを用いて、レトロウイルスでの感
染の数日前に増殖因子を膵臓に送達することにより増殖され得る。
【００６３】 通常の幹細胞／前駆細胞の遺伝子改変は、当該分野で公知の、以下を含む方法
を用いたトランスフェクションによって達成され得る：ＣａＰＯ4トランスフェ
クション、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、プロトプラスト融合
、エレクトロポレーション、リポフェクションなど。直接ＤＮＡトランスフェク
ションを用いて、細胞は、パーティクルボンバードメント、レセプター媒介送達
およびカチオン性リポソームによって改変され得る。
【００６４】 非ウイルス性ポリヌクレオチド構築物はまた、細胞における目的のポリペプチ
ドの輸入および発現のためのビヒクルとして有用である。ポリヌクレオチド構築
物は、組織に直接注射され得る。組織へのポリヌクレオチドの直接注射方法は、
ＢｌａｕおよびＳｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３３３（２３）
：１５５４−６（１９９５）によって記載される。また、ＢｌａｕおよびＫｈａ
ｖａｒｉ，Ｎａｔ Ｍｅｄ ３（６）：６１２−３（１９９７）を参照のこと。
ポリヌクレオチド構築物は、Ｗｕら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４（２９）
：１６９８５−７（１９８９）により記載されるように、トランスフェクション
のために化学的にカプセル化され得る。Ｗｕらは、天然の哺乳動物調節エレメン
トによって駆動される外来遺伝子が、肝細胞に標的化され得、そして得られる遺
伝子発現が永続性になり得ることを示した。可溶性ＤＮＡキャリア系は、共有結
合的に連結された以下の２つの成分から構築された：（１）ポリカチオンである
ポリ−Ｌ−リジン（これは、強力に、しかし損傷を与えない相互作用で、ＤＮＡ
に結合し得る）、および（２）この細胞型に特有の細胞表面アシアロ糖タンパク
質レセプターによって肝細胞に特異的に標的化され得るアシアロ糖タンパク質。
Ｗｕらは、マウスアルブミン調節配列（この系を、本発明の方法での使用に魅力
的にする）を含み、そして静脈内注射のためにキャリア系に複合体化されたプラ
スミドを用いた。この系によって、このポリヌクレオチド構築物は、可溶性ＤＮ
Ａキャリア系を用いたインビボでの静脈内注射によって肝細胞に送達され得る。
この様式で標的化された遺伝子発現は、肝細胞複製の刺激によって持続するよう
にされ得る。
【００６５】 このポリヌクレオチド構築物はまた、Ｋａｎｅｄａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４
３（４８８９）：３７５−８（１９８９）の方法によって細胞へと導入され得る
。この方法によって、ポリヌクレオチド構築物および核タンパク質は、細胞へと
効率的に移入される。このポリヌクレオチド構築物は、培養細胞の核内へと迅速
に輸送される。さらに、このポリヌクレオチド構築物および核タンパク質が、ラ
ット肝臓中の分裂していない細胞内へと、ラット門脈への注射によって同時導入
される場合、このポリヌクレオチド構築物は、ラット肝臓における発現のために
、核タンパク質によって肝臓細胞核へと効率的に運ばれる。
【００６６】 あるいは、このポリヌクレオチド構築物は、Ｒｅｍｙら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２（５）：１７４４−８（１９９５）の方法（
エンベロープで囲まれたウイルスを思わせる脂質コートポリヌクレオチド粒子に
基づくモジュラートランスフェクション系）によって細胞内に導入され得る。こ
の粒子コアは、重要なウイルス特性を有する他の合成脂質が疎水的に吸着される
、電気的に中性の比にある、リポポリアミン凝縮ポリヌクレオチドから構成され
る。良好なトランスフェクションレベルは、中性のコア粒子を用いて簡便に達成
され得る。但し、両性イオン脂質（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミ
ン）は、組換えポリヌクレオチドを完全にコーティングするために添加される。
三分岐（ｔｒｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）ガラクトシル残基を有する脂質の添加は、
中性核脂質粒子を肝臓細胞のアシアロ糖タンパク質レセプターへと駆動する：ト
ランスフェクションは、２５％ガラクトリピドを用いて約１０００倍増加する。
これらの電気的にサイレントな粒子は、インビボでの遺伝子移入のための魅力的
な溶液を提供し、ここで外部糖コートは、粒子が生物体内に拡散し、そして標的
細胞に到達するのを可能にする。
【００６７】 別の実施形態では、通常の幹細胞／前駆細胞は、トランスジェニック動物に由
来し、従って、ある意味では既に遺伝的に改変されている。トランスジェニック
動物を作製するために現在用いられるいくつかの方法が存在する。最も頻繁に用
いられる技術は、単一細胞期の受精卵へのＤＮＡの直接マイクロインジェクショ
ンである。他の技術としては、レトロウイルス媒介移入、または胚幹細胞への遺
伝子移入が挙げられる。これらの技術および他の技術は、Ｈｏｇａｎら，Ｍａｎ
ｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｅｄ．，１９８６）によって詳述される。これらのトランスジェニッ
ク動物の使用は、健常な神経球（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）をトランスフェクト
する必要性がないという事実を含む特定の利点を有する。トランスジェニック動
物に由来する肝臓細胞および膵臓細胞に対する通常の幹細胞／前駆体は、安定な
遺伝子発現を示す。トランスジェニック動物を用いて、新たな遺伝的組み合わせ
が交配され得る。このトランスジェニック動物では、そのゲノムに、肝臓細胞ま
たは膵臓細胞によって発現される任意の有用な遺伝子が組み込まれて存在し得る
。
【００６８】 目的のポリペプチドの長期の高収率産生については、安定な発現が好ましい。
ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを用いるよりは、宿主細胞は、適切な発
現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネ
ーターなど）によって制御されるｃＤＮＡ、および選択マーカーで形質転換され
得る。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、そし
て細胞がこのプラスミドをその染色体内に安定に組み込み、そして増殖してフォ
ーカスを形成し、これが次いでクローニングされ得、そして細胞株へと拡大され
得るのを可能にする。例えば、外来ＤＮＡの導入に続いて、操作された細胞を、
富化された培地内で１〜２日間増殖させ、次いで選択培地へと切り替え得る。
【００６９】 以下を含むがこれらに限定されない、用いられ得る多数の選択系が、それぞれ
、ｔｋ-細胞、ｈｇｐｒｔ-細胞またはａｐｒｆ細胞において用いられ得る：単純
ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシル
トランスフェラーゼ、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子
。また、代謝拮抗物質耐性が、以下についての選択の基礎として用いられ得る：
メトトレキサートに対する耐性を付与する、ｄｈｆｒ；ミコフェノール酸に対す
る耐性を付与する、ｇｐｔ；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与す
る、ｎｅｏ；およびハイグロマイシン遺伝子に対する耐性を付与する、ｈｙｇｒ
ｏ。さらなる選択可能な遺伝子が記載されている。すなわち、細胞がトリプトフ
ァンの代わりにインドールを利用するのを可能にする、ｔｒｐＢ；細胞がヒスチ
ジンの代わりにヒスチノールを利用するのを可能にする、ｈｉｓＤ；およびオル
ニチンデカルボキシラーゼインヒビターである２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ
−オルニチン（ＤＦＭＯ）に対する耐性を付与する、ＯＤＣ（オルニチンデカル
ボキシラーゼ）。
【００７０】 増加した発現は、当該分野で周知の増幅方法を用いてベクターのコピー数を増
加または増幅することにより達成され得る。このような増幅方法としては、例え
ば、ＤＨＦＲ増幅（例えば、Ｋａｕｆｍａｎら，米国特許第４，４７０，４６１
号を参照のこと）またはグルタミンシンテターゼ（「ＧＳ」）増幅（例えば、米
国特許第５，１２２，４６４号を参照のこと）が挙げられる。ジェネティシン（
Ｇ４１８）またはハイグロマイシン薬物選択遺伝子を含む発現ベクターもまた有
用である。これらのベクターは、目的のコードポリヌクレオチドおよび毒素（例
えば、Ｇ４１８またはハイグロマイシンＢ）を用いた選択に対する耐性を付与す
る遺伝子の両方を発現し得る。Ｇ４１８耐性遺伝子は、培養培地に添加されたＧ
４１８を酵素的に不活化するアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰ
Ｈ）をコードする。ＡＰＨ遺伝子を発現する細胞のみが、薬物選択を生き抜き、
通常、第２の生物学的遺伝子の発現をももたらす。ハイグロマイシンＢホスホト
ランスフェラーゼ（ＨＢＨ）遺伝子は、ハイグロマイシン毒素を特異的に改変し
、これを不活化する酵素をコードする。ハイグロマイシンＢホスホトランスフェ
ラーゼ遺伝子と同時にトランスフェクトされる遺伝子またはハイグロマイシンＢ
ホスホトランスフェラーゼ遺伝子を同じプラスミドに含まれる遺伝子は、ハイグ
ロマイシンＢの存在下で優先的に発現される。
【００７１】 膵管のインビトロ培養。膵島を培養する技術および方法は、当業者に公知であ
る。例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，前出およびその中に引用される参考文献；Ｈｕ
ｍａｎｓｏｎ（Ａｎｉｍａｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第４版，
Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９７９）；ならびにＲｉ
ｃｃｉａｒｄｅｌｌｉら（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２
５：１０１６−１０２４，１９８９）を参照のこと。１つの実施形態では、トラ
ンスジェニックマウスおよび非トランスジェニックマウスからの管の精製は、Ｋ
ｅｒｒ Ｃｏｎｔｅら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４５（８）１１０８−１４（１９９
６）の手順を用いて達成される。膵臓組織は抽出され、そしてコラーゲンゲル中
に置かれる。嚢構造がインビトロで形成される。別の実施形態では、管の培養物
を用いて、管上皮細胞の培養物を発生させる。特定の実施形態は、実施例５およ
び６に提供される。
【００７２】 島は、当業者に公知の方法によって膵臓組織から単離され得る。例えば、Ｂｅ
ａｔｔｉｅおよびＨａｙｅｋ，ＰＣＴ国際特許出願第ＷＯ ９８／２６０４４号
を参照のこと。用語「島」とは、本明細書中で、成体ランゲルハンス島および島
様細胞クラスターの両方を含むように用いられる。
【００７３】 膵管培養は、液体組織培養培地中で行われ得る。液体組織培養培地としては、
生存細胞および組織を保持するために適切な溶質を含む任意の液体溶液が挙げら
れる。多くの型の哺乳動物組織培養培地が、以下のような商業的供給源から入手
可能である：Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ ＭＯ
；Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．；Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ
，ＷＩ；およびＧｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉ
ｎｃ．，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ ＮＹ。市販の培養培地の例は、以下である
：基本培地イーグル（Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）、ＣＲＣＭ−３
０培地、ＣＭＲＬ培地−１０６６、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、
フィッシャー培地、グラスゴー最少必須培地、ハムＦ−１０培地、ハムＦ１−１
２培地、高密度配置、イスコフ改変ダルベッコ培地、レイボビッツ（Ｌｅｉｂｏ
ｖｉｔｚ）Ｌ−１５培地、マッコイ５Ａ培地（改変）、培地１９９、最初必須培
地イーグル、α最少必須培地、アール最少必須培地、培地ＮＣＴＣ １０９、培
地ＮＣＴＣ １３５、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ウィリアム培地Ｅ、ウェイマウ
ス（Ｗａｙｍｏｕｔｈ）ＭＢ ７５２／１培地、およびウェイマウスＭＢ ７０
５／１培地。本発明の方法において使用するために適切な他の培地は、Ａｔｌａ
ｓら（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ
，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂａｏｃａ，Ｒａｔｏｎ，Ｌｏｕｉｓｉａｎａ，１９９
３）およびＦｒｅｓｈｎｅｙ（Ｃｕｔｌｅｒ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ
，Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第３版，Ｗｉｌ
ｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４）に列挙される。本発明の方法に
おいて使用するために適切な培地には、適切な場合、インスリンが補充され得る
。インスリンは、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｉｎｄｉａｎ
ａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）およびＮｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ｐｈａｒｍ
ａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｄｅｎｍａｒｋ）を含むいくつかの供給源から市販され
る。
【００７４】 インキュベーションは一般に、細胞増殖に最適であることが公知の条件下で行
われる。このような条件は、例えば、約３７℃の温度および約５％のＣＯ2を含
む湿潤雰囲気を含み得る。インキュベーションの持続時間は、所望の結果に依存
して、広範に変化し得る。一般に、インキュベーションは好ましくは、細胞が、
それらの有用性に有意な限界を与えるに充分にそれらのインスリン分泌機能を失
い始めるまで続けられる。おおよその原則として、新鮮な細胞と比較して２５％
を超えるインスリン分泌の割合の喪失は、限界とみなされ得る。増殖の程度は、
細胞集団のＤＮＡ含量の増加として便利に表され、そして好ましい増殖程度は、
ＤＮＡ含量における約３倍以上高い増加である。範囲として表される、好ましい
増殖程度は、約３倍から約１２倍のＤＮＡ含量の増加である。
【００７５】 膵管培養はまた、Ｈａｌｂｅｒｓｔａｄｔらに対して１９９７年１０月２８日
に発行された米国特許第５，６８１，５８７号の方法を用いて実施され得る。こ
の方法は、成体膵島細胞を、ラミニン５細胞外マトリックスと接触させることに
より、この細胞の数を増加させる。島細胞を、ラミニン５を含む沈着したマトリ
ックスと接触させる場合、細胞数の増加が観察される。増殖した島細胞はインス
リンを含み、そしてグルコースチャレンジに応答する。
【００７６】 ＩＦＮγトランスジェニックマウスの再生中の膵臓におけるＰＤＸ−Ｉ+内分
泌前駆細胞の同定。別の局面では、本発明は、肝臓細胞および膵臓細胞に対する
通常の幹細胞／前駆細胞を含む、膵臓幹細胞／前駆細胞についてのマーカーとし
てのホメオボックスタンパク質ＰＤＸ−１の使用のための方法を提供する。ＰＤ
Ｘ−１は、膵臓発達に明らかに関与し、そして個体発生の間の胎仔膵臓において
発現される。実施例７では、組織学的分析により、管の増殖および島の再生を担
う前駆細胞を特徴付けた。
【００７７】 有意なＰＤＸ−１発現はまた、トランスジェニック膵臓を再生する際に管上皮
細胞のサブセットを生じ、それらの細胞は管上皮細胞の形態学的および組織学的
な特性を有する。ＰＤＸ−１の発現は、管腔管上皮細胞および管腔周辺管上皮細
胞の両方において見い出された。新しく形成された島構造の特性であるインスリ
ンの発現はまた、ＰＤＸ−１発現管細胞の亜集団において存在する。ＰＤＸ−１
発現管細胞は、管腔周辺および管腔部位の両方において見い出され、そしてＰＤ
Ｘ−１発現細胞のサブセットはまた、インスリンを発現する。従って、ＩＦＮγ
トランスジェニックマウスの管再生におけるＰＤＸ−１の発現は、個体発生の間
のＰＤＸ−１についての必要性を要約し、そして膵臓の再生における重要な膵臓
の前駆細胞マーカーとして、ＰＤＸ−１を定義する。有意なＰＤＸ−１の発現を
示す管由来の新しい内分泌細胞の誘導は、管上皮の再生においてＰＤＸ−１の発
現と共役し、ＩＦＮγトランスジェニックマウスにおけるＩＦＮγ媒介再生の間
、新形成が、胎児発達の間に活性な機構に類似の機構を通じて進行し得ることを
示す。
【００７８】 以下の実施例を、本発明の好ましい実施形態をより十分に例示するために提示
する。これらの実施例には、添付した特許請求の範囲によって定義される本発明
の範囲を限定するように解釈される余地はない。
【００７９】 （実施例１ 膵臓の肝細胞の再生および管細胞増殖をもたらすランゲルハンス
島におけるＫＧＦの発現） 膵臓発達におけるＫＧＦの役割をより理解するために、膵臓の成長および発達
に対して局在化したＫＧＦの発現の影響が評価可能なモデルシステムを確立した
。ヒトインスリンプロモーターによって制御されるマウスＫＧＦコードポリヌク
レオチドの発現が、ランゲルハンス島におけるβ細胞内のＫＧＦ発現を生じるト
ランスジェニックマウスモデルを構築した。異所性のＫＧＦ発現は、以下に記載
されるように、膵臓に対するいくつかの変化を生じた。従って、ｉｎｓ−ＫＧＦ
マウスは、膵臓の成長および発達の理解を高めるためにデザインされた研究のた
めの有益なシステムを提供する。
【００８０】 ｉｎｓ−ＫＧＦトランスジェニックマウスの産生。ｉｎｓ−ＫＧＦトランスジ
ェニックマウスを産生するために、５８５塩基対（ｂｐ）のＫＧＦ ｃＤＮＡを
、マウス唾液腺由来のｍＲＮＡの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
によって得た。ＫＧＦ ｃＤＮＡを、ヒトインスリンプロモーターおよびＢ型肝
炎の３’非翻訳ポリヌクレオチドを含むベクターにクローン化した。そのベクタ
ーのｉｎｓ−ＫＧＦフラグメントを低融解アガロースによって単離し、Ｇｅｎｅ
ｃｌｅａｎ（ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）およびＮＡ
ＣＳ Ｐｒｅｐａｃ ＤＮＡ精製カラム（ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，
ＭＤ）を使用して精製し、そしてＢＡＬＢ／ｃ×Ｃ５７ＢＬ／６ Ｆ２マウス由
来の受精接合体に微量注入した。導入遺伝子陽性マウスをさらに、ＢＡＬＢ／ｃ
マウスと交配した。
【００８１】 ｉｎｓ−ＫＧＦマウスの島における導入遺伝子メッセージの発現。ｉｎｓ−Ｋ
ＧＦトランスジェニックマウスの２系統から採取した膵臓切片のインサイチュハ
イブリダイゼーションより、導入遺伝子メッセージの発現がランゲルハンス島に
おいて集中したことが示された。インサイチュハイブリダイゼーションを、Ａｒ
ｎｕｃｈら、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ ７４：９８５−９９０（１９９５）によっ
て記載されるように行った。アンチセンスリボプローブおよびセンスリボプロー
ブを、［35Ｓ］−ＵＴＰを使用するＫＧＦ ｃＤＮＡを含む線状化されたプラス
ミドのインビトロ転写によって調製した。インサイチュハイブリダイゼーション
の後、切片を、写真乳剤で覆い、そして現像の前に、４週間露出した。
【００８２】 組織学的分析および免疫組織化学によって明らかにされたｉｎｓ−ＫＧＦマウ
スの島における膵臓の肝細胞の出現。ｉｎｓ−ＫＧＦトランスジェニックマウス
のこれら２系統は、さらに特徴づけられた。膵臓および脾臓を、１０％の中性緩
衝化されたホルマリン（３．６％ホルムアルデヒド）において一晩固定し、そし
てパラフィンで包埋した。脾臓切片を、膵臓特異的抗体のためのコントロールと
して膵臓切片と共に染色した。５μｍのパラフィン切片を、従来の組織学的評価
のためにヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）を用いて染色するか、または
ＧｕおよびＳａｒｖｅｔｎｉｃｋ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１８：３３−４
６（１９９４）によって記載される免疫細胞化学的技術を使用して、インスリン
、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド、アミラーゼ、ＣＡＩＩ、Ｐ
ＤＸ−１、アルブミン、α−フェトプロテイン、またはブロモデオキシウリジン
（ＢｒｄＵ）の存在について染色するかのいずれかを行った。簡単には、切片を
脱パラフィン化し、そしてインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン（全てはＤ
ＡＫＯ，Ｃａｒｐｅｔａｒｉａ，ＣＡより）、ＰＤＸ−１、膵臓ペプチドまたは
α−フェトプロテイン（両方は、ＩＣＮ Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ｓ，Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ，ＣＡより）、アルブミン（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗｅ
ｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）、アミラーゼ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｓｉ，ＭＯ）、
ＢｒｄＵ（Ａｃｃｕｒａｔｅ／Ｓｅｒａ−Ｌａｂ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）、
またはＣＡＩＩ（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｋｅｎｎ
ｅｂｕｎｋ，ＭＥ）に対する第１抗体を適用する前に、２％正常ヤギ血清を用い
てブロックした。第１抗体の結合を、適切な第２抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）および西洋ワサビペルオキシダーゼ
（ＨＲＰ）標識アビジン−ビオチン複合体（ＡＢＣ ｋｉｔ，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して検出した。ＨＲＰを、基質として３，３’
−ジアミノベンジジンを使用して可視化した。Ｇｉｌｌ’ｓヘマトキシリンを全
ての切片のための対比染色として使用した。
【００８３】 ｉｎｓ−ＫＧＦにおける島構造への形態学的な変化は、典型的に、５〜７ヶ月
の間の齢のｉｎｓ−ＫＧＦマウスにおいて現れ、そして若いマウスにおいて最小
である。興味深いことに、明確な変化を、島の細胞成分において見い出した。い
くつかの正常な内分泌細胞（β細胞、δ細胞、およびＰＰ細胞）が存在したが、
トランスジェニック膵臓の多くの島の中の多くの細胞は、典型的な膵臓細胞では
なかった。大きな核を有する非常に大きな細胞を、島の約１／３〜１／２の末梢
において観察した。ｉｎｓ−ＫＧＦトランスジェニックマウスおよび陰性同腹子
マウスにおける島の相対的な大きさを決定するために、抗インスリン染色切片を
調べた。島を１０×倍率で測定し（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｓｃｏｐｅ）、比較のた
めに、１０×倍率での既知の１００μｍの長さの十字線を使用した。島の大きさ
を、小（＜直径１００μｍ）、中（２００〜４００μｍ）または大（＞４００μ
ｍ）のいずれかとして評価した。１６のｉｎｓ−ＫＧＦマウスおよび１２の陰性
同腹子マウスを評価し、そして１０の島を、各々のマウスについて数えた。若年
（３ヶ月より下）のマウスの島の大きさ、および老齢（３ヶ月より上）のマウス
の島の大きさを比較した。
【００８４】 島の約１／３〜１／２において見出されそしてこの島の周辺に局在して、これ
らの新規の細胞は、しばしば島の面積の１／２より大きな面積を含むことが見出
された。これらの細胞は、細胞が均一の大きさである非トランスジェニックコン
トロールマウスの島と比較して、それら全体の大きさおよびそれらの核の大きさ
の両方に関して大きかった。この大きな細胞は、島の周辺に生じるか、または島
と密接に結合して一列縦隊に生じる。この大きな細胞は、トランスジェニック膵
臓の他の領域においては、観察されなかった。この大きな細胞は、インスリンも
、グルカゴンも、ソマトスタチンも、膵ポリペプチドも、アミラーゼも、ＣＡＩ
ＩもＰＤＸ−１（成体におけるβ細胞系列およびδ細胞系列のマーカーである）
も発現せず、これらは、内皮細胞に対するマーカーであるＭｅｃａ−３２もまた
発現しなかった。これらの細胞は、内分泌、外分泌、管、または内皮ではないよ
うであるが、形態において肝細胞に類似であり、そして肝臓タンパク質のアルブ
ミンを発現した。
【００８５】 α−フェトプロテインおよびアルブミン染色により、ｉｎｓ−ＫＧＦマウスの
島内の膵臓の肝細胞として大きな細胞を同定した。アルブミンは通常、成体肝細
胞によって発現されるが、α−フェトプロテインは、肝発生および肝再生の間に
肝細胞によって発現される。α−フェトプロテインは、代表的には、正常成体膵
臓内に見出されないが、これは、Ｈ＆Ｅによって初めて同定されたこの大きな細
胞において強くアップレギュレートされた。α−フェトプロテイン発現細胞は、
非トランスジェニック同腹仔コントロールマウスにおいて検出されなかった。よ
り大きな細胞の全ては、α−フェトプロテイン発現に関して陽性であり、より大
きな細胞の２／３は、アルブミン発現に関して陽性であった。アルブミンに関し
て陽性であった大きな細胞は、強烈に染色され、そしてバックグラウンドを越え
て明らかに可視であった。従って、この実施例は、ＫＧＦ発現トランスジェニッ
クマウスの島に局在した肝細胞の存在を示す。
【００８６】 （ＫＧＦ発現マウスにおける増強された管細胞（ｄｕｃｔ ｃｅｌｌ）増殖） さらなる形態学的変化もまた、トランスジェニックの膵臓の島中に見出された
。一般的に、マウスが加齢するにつれ、島は、徐々に大きくなり、そして島内の
場所を占める拡大しかつ折り畳まれた上皮細胞塊が観察された。そのような形態
学的変化は、非トランスジェニック同腹仔コントロールマウスにおいては観察さ
れなかった。平均して、非トランスジェニック同腹仔においてよりも、有意によ
り大きな島（直径が４００μｍより大きい）が、３月齢以上のｉｎｓ−ＫＧＦマ
ウスに見出された（ｐ＝０．０１７）。トランスジェニックマウスの島が、非ト
ランスジェニックマウスによって産生されるプロトタイプの膵島ホルモン（イン
スリン、グルカゴン、ソマトスタチン、および膵ポリペプチド）を発現すること
は明らかであるが、トランスジェニックマウスのホルモン染色細胞は、この拡大
した細胞塊を取り囲む小さなクラスターの中にある。
【００８７】 重要なことに、この拡大した上皮は、膵管細胞において高く発現されるカルボ
ニックアンヒドラーゼＩＩ（ＣＡＩＩ）のこれらの発現によって管細胞として同
定された。成体マウスの島内に発現されることが公知の転写因子ＰＤＸ−１は、
管細胞の連続切片内に見出されないが、ＣＡＩＩ陽性細胞は、ｉｎｓ−ＫＧＦマ
ウスの島内管を構成することを見出された。島は、ＰＤＸ−１について陽性に染
色されたが、拡大された上皮は、染色されなかった。これらの上皮細胞は、いず
れの内分泌ホルモンも発現することが見出されず、これらはまた、腺房細胞によ
って通常発現されるアミラーゼも発現しなかった。島内のこれらの拡大した管の
領域の存在は、管細胞集団における進行中の増幅を示唆した。
【００８８】 確かに、過剰増殖（ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）活性は、細胞増
殖をモニターするためにＢｒｄＵを用いた実験において明らかに証明された。細
胞増殖の評価に関しては、屠殺する１６時間前に１００ｍｇ／ｇ体重ＢｒｄＵ（
Ｓｅｒｖａ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）をマウスの腹腔内に注射
した。パラフィン包埋した膵臓を切片に切断し、そして、１５分間、２．８Ｎ
ＨＣｌを用いて処置した後、抗ＢｒｄＵ抗体（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）を用いて上記のように染色した。トランスジェ
ニックマウスおよび非トランスジェニックマウス（各遺伝子型についてｎは６で
ある）中のＢｒｄＵ陽性細胞をカウントした。各膵臓において少なくとも５つの
無作為に選択した視野において、管の壁（ｄｕｃｔ ｗａｌｌ）を含む細胞の陽
性に染色された核の数を核／管の壁の総数で割ることにより、有糸分裂指数（ｍ
ｉｔｏｔｉｃ ｉｎｄｅｘ）を計算した。管細胞を形態およびＣＡＩＩ染色によ
り同定した。
【００８９】 ｉｎｓ−ＫＧＦトランスジェニックマウスの膵臓内の増加した増殖を、それが
ＢｒｄＵを取り込んだことを示す、褐色に染色されている、増殖している細胞に
よって測定した。非トランスジェニック同腹仔の有糸分裂指数は０．１６％であ
ったのに対し、ｉｎｓ−ＫＧＦマウスに関しては、１．６％の有糸分裂指数が測
定された。この後の値は、Ｇｉｔｈｅｎｓ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｄｉａ
ｔｒｉｃ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ
７：４８６−５０６，１９８８）によって以前に報告された値に匹敵する。これ
らの有糸分裂指数における差は、統計学的に有意である（ｐ＜０．００１）。さ
らに、ＢｒｄＵ陽性（増殖している）細胞の大多数は管細胞であったが、非トラ
ンスジェニックマウスと比較して増加した数のＢｒｄＵ陽性細胞は、内分泌組織
および外分泌組織内の両方に存在した。
【００９０】 従って、この実施例は、膵臓の島におけるＫＧＦの発現が、島の塊内の管細胞
の実質的な増殖を生じることを示す。トランスジェニックマウスの膵臓における
形態学的際差異にもかかわらず、病理も、高血糖も低血糖も、トランスジェニッ
クマウスの島におけるＫＧＦ発現と関連していることは見出されなかった。形態
学的な変化は、ｉｎｓ−ＫＧＦトランスジェニックマウスの肝臓でも、腎臓でも
腸でも観察されなかった。
【００９１】 （実施例２） （膵β細胞におけるＥＧＦのトランスジェニック発現は、実質的な形態学的変
化を生じる） ＥＧＦを、ヒトインスリンプロモーターを用いて、トランスジェニックマウス
において、異所的に発現させた。ＥＧＦのβ細胞標的化発現は、細胞増殖および
無秩序なランゲルハンス島の増殖を含む、有意な形質学的変化を生じた。マウス
は正常血糖であった。興味深いことに、インスリン産生β細胞は、より老齢のｉ
ｎｓ−ＥＧＦトランスジェニックマウスの管のいくつかにおいて見出された。従
って、本実施例は、ＥＧＦが膵臓の発達および増殖の両方に影響を及ぼし得るこ
とを示す。
【００９２】 （ｉｎｓ−ＥＧＦトランスジェニックマウスの作製） 膵臓のβ細胞におけるＥＧＦ発現の影響を決定するために、マウスＥＧＦをヒ
トインスリンプロモーターの制御下で発現するトランスジェニックマウスを、作
製した（ｉｎｓ−ＥＧＦ）。２８０−ｂｐのＥＧＦ ｃＤＮＡを用いて、ｉｎｓ
−ＥＧＦトランスジェニックマウスを作製した。ｃＤＮＡを、ヒトインスリンプ
ロモーターおよびＢ型肝炎３’非翻訳ポリヌクレオチドを含むベクター中にクロ
ーン化した。ｉｎｓ−ＥＧＦフラグメントを、低融点アガロースにより単離し、
Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ（ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｌｏｌｌａ，ＣＡ）お
よびＮＡＧＳ Ｐｒｅｐａｃ ＤＮＡ精製カラム（ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂ
ｕｒｇ，ＭＤ）を使用して精製し、そして（Ｂａｌｂ／ｃ×Ｃ５７ＢＬ１６）Ｆ 2 マウス由来の受精した接合体中に微量注入した。後代を、導入遺伝子の存在に
ついて、プロテイナーゼＫの消化を用いて一晩抽出された、尾ＤＮＡのＰＣＲタ
イピングによりスクリーニングした。ＰＣＲを、ヒトインスリンプロモーターに
特異的な２つの２４マープライマーを用いて行った。導入遺伝子陽性マウスを、
ＢＡＬＢ／ｃマウスとさらに交配した。
【００９３】 トランスジェニックマウスを、ＰＣＲによりスクリーニングし、そしてオリジ
ナルの（Ｂａｌｂ／ｃ×Ｃ５７ＢＬ／６）Ｆ2マウスからの４世代にわたって、
ＢＡＬＢ／ｃマウスと、さらに交配した。トランスジェニックマウスは、正常か
つ健康であり、平均的な寿命を有するように見えた。
【００９４】 （ｉｎｓ−ＥＧＦマウスの島における導入遺伝子メッセージの発現） ＥＧＦの発現パターンを、免疫組織化学により特徴付けた。膵臓を、１０％中
性緩衝化ホルマリン（３．６％ホルムアルデヒド）中で一晩固定し、そしてパラ
フィンに包埋した。５μｍパラフィン切片を、組織学的評価のためにＨ＆Ｅを用
いて好都合に染色するか、または免疫細胞化学の技術を用いて、インスリン、グ
ルカゴン、ソマトスタチン、アミラーゼ、またはＢｒｄＵの存在について染色す
るかのいずれかとした。インスリン、グルカゴン、アミラーゼ、またはソマトス
タチン（全てＤＡＫＯ，Ｃａｒｐｅｎｔａｒｉａ，ＣＡから）、あるいはＢｒｄ
Ｕ（Ａｃｃｕｒａｔｅ／Ｓｅｒａ−Ｌａｂ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）について
の一次抗体を適用する前に、切片を、パラフィン除去（ｄｅｐａｒａｆｆｉｎｉ
ｚｅ）し、そして２％正常ヤギ血清でブロッキングした。一次抗体の結合を、適
切な二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍ
ｅ，ＣＡまたはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏ
ｌｉｓ，ＩＮ）、および西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識したアビ
ジン−ビオチン複合体（ＡＢＣキット、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ）を用いて検出した。基質として３，３’−ジアミノベンジジンを用いて、Ｈ
ＲＰを視覚化した。Ｇｉｌｌのヘマトキシリンを対比染料として用いた。
【００９５】 ＥＧＦの発現は、全てのトランスジェニック島において、有意にアップレギュ
レートされた。期待されたように、ＥＧＦは、非トランスジェニック同腹子コン
トロールの島において低レベルで発現した。ＥＧＦレセプター（ＥＧＦ−Ｒ）の
レベルは、このレセプターについて以前、Ｄａｍｊａｎｏｖら（Ｌａｂ Ｉｎｖ
ｅｓｔ ５５：５８２−５９２，１９８６）により観察された構成的発現レベル
と同等であるようであったが、トランスジェニック膵臓の管の上皮において、Ｅ
ＧＦ−Ｒのアップレギュレーションが検出された。
【００９６】 （ｉｎｓ−ＥＧＦマウスの形態学的変化） Ｉｎｓ−ＥＧＦトランスジェニックマウスは、それらの膵臓において、劇的な
形態学的変化を有した。膵管は、トランスジェニックマウスにおいて正常なよう
であったが、マウスが加齢するにつれて島は大きさを増した。三ヶ月齢の後は、
マウスは、非トランスジェニックな同腹仔が有する（非トランスジェニックな同
腹仔では、ほとんどの島は＜１００μｍであった）よりも有意に多く、より大き
い（＞４００μｍ）サイズの島を有した（ｐ＜０．００８）。
【００９７】 さらに、トランスジェニック島は、実質的な離解を示した。島構造の解体は、
ｉｎｓ−ＥＧＦマウスにおいて、齢と共に増加した。Ｈ＆Ｅで染色された３ヶ月
齢および１７ヶ月齢のｉｎｓ−ＥＧＦマウスは、老化するにつれてサイズが増し
かつ複雑になる、不規則な形をした島への単核細胞の浸潤をほとんど示さなかっ
た。Ｈ＆Ｅで染色された、齢および性別が一致した非トランスジェニックコント
ロール同腹仔は、代表的な島の形態を明示し、免疫浸潤を全く示さなかった。
【００９８】 著しい線維症が島の周りで生じた。膵臓リンパ球の浸潤は少なく、そして島の
解体された構造を説明するには十分ではなかった。驚くべきことに、３ヶ月での
リンパ球の浸潤は、齢と共に有意には増加しなかった。観察されたリンパ球の浸
潤および島における構造変化は、非トランスジェニック同腹仔においては観察さ
れなかった。
【００９９】 ｉｎｓ−ＥＧＦマウスにおけるインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、お
よびアミラーゼについての免疫染色は、齢および性別が一致した非トランスジェ
ニックコントロールと類似した、島および外分泌組織において代表的な発現パタ
ーンを示した。形態学的変化は、ｉｎｓ−ＥＧＦ×ＫＧＦマウスにおいてよりも
遅い齢で生じ、そして二重トランスジェニックマウスにおいてよりもひどくない
。非トランスジェニックは、一重トランスジェニックよりも遅くかつ少ない表現
型の変化を示した。さらに、これらのタンパク質を産生する細胞は、大部分が、
代表的な数および位置で存在した。しかし、１７ヶ月で、インスリン陽性細胞の
稀な存在が、いくつかの管において検出された。このことは、膵管内での、新し
く形成されたβ細胞の産生を意味する。β細胞は通常、島の外側では見出されな
い。ｉｎｓ−ＥＧＦマウスの全体的な健康および生存率は、非トランスジェニッ
ク同腹仔の全体的な健康および生存率と一致した。
【０１００】 種々の年齢のマウスについての血糖値を、２週間の間隔で得た。血液を尾から
得、そして血糖レベルを、Ｇｌｕｃｏｆｉｌｍ血糖試験ストリップ（Ｍｉｌｅｓ
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ，Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ）を使用して、決定した。本発
明者らのコロニーにおける非トランスジェニックＢａｌｂ／ｃマウスの非絶食血
糖値は、８０〜１６０ｍｇ／ｄｌの範囲であった。いずれのマウスも、１５０ｍ
ｇ／ｄｌの血糖正常値を超えず、またいずれのマウスも、低血糖であることが、
見出されなかった。
【０１０１】 （実施例３ 膵臓β細胞におけるＥＧＦおよびＫＧＦのトランスジェニック発
現が、実質的な形態変化を生じる） 膵臓の発生についての２つの重要な増殖因子である、ＥＧＦおよびＫＧＦが、
ヒトインスリンプロモーターを用いて、トランスジェニックマウスにおいて異所
的に発現された。ＥＧＦまたはＫＧＦのいずれかの、β細胞に標的化された発現
が、有意な形態変化（細胞増殖および無秩序なランゲルハンス島の増殖を含む）
を生じた。両方の場合において、マウスは正常血糖であった。ＩｎｓＥＧＦ×Ｋ
ＧＦマウスを産生するための、個々のｉｎｓ−ＥＧＦおよびｉｎｓ−ＫＧＦトラ
ンスジェニックマウスの同系交配（ｉｎｔｅｒｂｒｅｅｄ）は、いずれかの増殖
因子単独について見られたものよりも深甚な膵臓形態の変化を有するトランスジ
ェニックマウスを生じた。膵臓細胞の増殖がまた、広範な島内線維症（ｉｎｔｒ
ａ−ｉｓｌｅｔ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）と同様に、二重トランスジェニックマウス
において観察され、この増殖は、時間が経つにつれて重篤度が増すことが見出さ
れた。興味深いことに、インスリンを産生するβ細胞は、より老齢のｉｎｓ−Ｅ
ＧＦおよびｉｎｓ−ＥＧＦ×ＫＧＦトランスジェニックマウスの管のいくつかに
おいて見出され、そしてアミラーゼを産生する細胞が、二重トランスジェニック
マウスの島構造の内部で観察された。
【０１０２】 従って、本実施例は、ＥＧＦおよびＫＧＦの両方が、膵臓の発達および増殖に
、影響を及ぼし得ることを示す。これらの増殖因子の同時発現は、膵臓の機能に
おける明らかな異常をまったく引き起こさずに、協力して作用して膵臓における
著しい形態変化を生じた。
【０１０３】 （ｉｎｓ−ＥＧＦ×ＫＧＦトランスジェニックマウスの作製） β細胞のＥＧＦおよびＫＧＦ発現が、膵臓の発達および機能に対して有する効
果を決定するために、ｉｎｓ−ＥＧＦマウスを、ｉｎｓ−ＫＧＦマウスと交配し
、そしてｉｎｓ−ＥＧＦ×ＫＧＦの後代を同系交配して、両方の導入遺伝子につ
いてホモ接合性にした。一旦、両方の系統が４世代にわたってＢａｌｂ／Ｃマウ
スと戻し交配されたら、個々のホモ接合体のｉｎｓ−ＥＧＦマウスとｉｎｓ−Ｋ
ＧＦマウスとを交配し、そして後代を同系交配して、ホモ接合体の二重トランス
ジェニック（ｉｎｓ−ＥＧＦ×ＫＧＦ）マウスを作製する。
【０１０４】 （膵臓形態に対する、合わせたＥＧＦおよびＫＧＦの相乗効果） 二重トランスジェニックマウスの特徴付けは、膵臓形態における異常な変化を
明らかにし、この膵臓形態は、各々の個々の導入遺伝子の効果を、単に反映する
わけではなかった。ｉｎｓ−ＥＧＦ×ＫＧＦマウスは、単一のｉｎｓ−ＥＧＦト
ランスジェニックマウスまたはｉｎｓ−ＫＧＦトランスジェニックマウスのいず
れについて見られた島よりも初期に、大きく、広くそしてコンフルエントではな
い島を発達させた。さらに、３ヶ月齢以上のトランスジェニックマウスのすべて
は、非トランスジェニックマウスが有するよりも多くの、顕著により大きなサイ
ズ（直径＞４００μｍ）の島を有した（非トランスジェニックマウスでは、大半
の島は、＜１００μｍであった）（ｐ＜０．０２）。この事については、二重ト
ランスジェニックマウスは、ｉｎｓ−ＫＧＦトランスジェニックマウスが有する
よりも多くの、より大きなサイズの島を有し（ｐ＜０．０２）、そして二重トラ
ンスジェニックマウスでは、ｉｎｓ−ＥＧＦマウスよりも多くの、より大きなサ
イズの島が存在するようであったが、差は有意ではなかった（ｐ＜０．０７）。
島に対する形態変化は、マウスの加齢にともなって発達し続けた。すなわち、島
のネットワークおよび小管の発達は、一重トランスジェニックマウスのいずれよ
りも、二重トランスジェニックマウスにおいて顕著であった。さらに、島内小管
数の増加が存在するようであった。島は、大きく、広くそして小葉に分かれ、各
々のトランスジェニックマウスについてその程度が変化したが、個々のβ細胞は
、インスリン染色によって実証されるように、インタクトかつ機能的なままであ
った。興味深いことに、ｉｎｓ−ＥＧＦマウスについてのように、インスリン陽
性細胞がまた、より遅い齢（６ヶ月）で、ｉｎｓ−ＥＧＦ×ＫＧＦトランスジェ
ニックマウスの管のうちのいくつかにおいて観察された。さらに、正常な血糖レ
ベルが、この動物の一生にわたって測定された（９０〜１５０ｍｇ／ｄｌ）。
【０１０５】 ｉｎｓ−ＥＧＦマウスにおけるインスリン、グルカゴン、ソマトスタチンおよ
びアミラーゼについての免疫染色が、齢および性別の一致した非トランスジェニ
ックコントロールと類似した、島および外分泌組織の内部の代表的な発現パター
ンを明らかにした。形態変化は、ｉｎｓ−ＥＧＦ×ＫＧＦマウスにおいて、より
早い齢で生じ、そして一重トランスジェニックマウスよりも重症であった。抗イ
ンスリン抗体で染色し、そして青色ヘマトキシリンで対比染色した３ヶ月齢およ
び６ヶ月齢のｉｎｓ−ＥＧＦ×ＫＧＦマウスは、ますますより大きくかつ無秩序
な、島のネットワークを示す。非トランスジェニックは、一重トランスジェニッ
クマウスにおいて遅延かつより少ない表現型の変化を示し、そして非トランスジ
ェニックコントロールにおいて正常な形態を示した。さらに、これらのタンパク
質を産生する細胞は、大部分が、代表的な数および配置で存在した。しかし、イ
ンスリン陽性細胞のまれな存在は、１７ヶ月でいくつかの管において検出され、
これは膵管の内部で新規に形成されたβ細胞の産生を意味した；β細胞は、通常
は島の外側で見出されない。リンパ球浸潤および異常な島形態にもかかわらず、
ｉｎｓ−ＥＧＦマウスの全体的な健康および生存率は、非トランスジェニック同
腹仔の健康および生存率と一致した。
【０１０６】 （細胞増殖に対する、合わせたＥＧＦおよびＫＧＦの相乗効果） 細胞増殖に対するＥＧＦおよびＫＧＦの効果を評価するために、マウスにＢｒ
ｄＵを注射した。膵臓細胞へのＢｒｄＵの取り込みを、免疫組織化学によって決
定した。細胞増殖を、屠殺の１５時間前に、マウスに、１００ｍｇ／ｇ体重のＢ
ｒｄＵ（Ｓｅｒｖａ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を腹腔内注射す
ることにより定量した。パラフィンで包理された膵臓を切片に切断し、そして１
５分間、２．８Ｎ ＨＣｌでの処理後に、上記のように抗ＢｒｄＵ抗体（Ａｃｃ
ｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）で染色した。増殖の
程度を、２０倍の対物レンズを用いて、２０の視野内のすべてのＢｒｄＵ陽性細
胞を数えることによって決定した。これらの２０の視野は、１つの膵臓切片当た
りのすべてのＢｒｄＵ陽性細胞の代表であるが、各々のマウスについて測定した
面積についてもまた、標準化された。各々の遺伝子型の少なくとも５匹のマウス
を、１つの膵臓切片当たりのＢｒｄＵ陽性細胞の平均の数の定量のために数えた
。
【０１０７】 平均して、ｉｎｓ−ＥＧＦマウスおよびｉｎｓ−ＫＧＦマウスは、それぞれ、
６．８＋１−２（ｎ＝５）のＢｒｄＵポジティブ細胞および１１．０＋１−３．
８（ｎ＝６）のＢｒｄＵポジティブ細胞を有した。対照的に、この二重トランス
ジェニックマウスは、１５．３＋／３．１（ｎ＝８）のポジティブ細胞を有し、
そして非トランスジェニック同腹子は、０．７＋１／−０．３（ｎ＝６）のポジ
ティブ細胞を有した。トランスジェニックマウスのすべての３系列は、このコト
ロールマウスが有するよりも有意なより多くの膵臓細胞増殖を有した（ｐ＜０．
０１）。大多数のｉｎｓ−ＫＧＦマウスの増殖細胞は、実施例１において管とし
て同定されたが、形態学的試験は、ｉｎｓ−ＥＧＦマウスおよびｉｎｓ−ＥＧＦ
×ＫＧＦマウスの増殖細胞は、腺房組織、島組織、および管組織内に見出される
ことを示した。
【０１０８】 ｉｎｓ−ＥＧＦマウスに関して、膵臓リンパ球浸潤は重大ではなく、そして二
重トラスジェニックｉｎｓ−ＥＧＦ×ＫＧＦマウスにおいて、年齢につれて増加
しなかった。島内（ｉｎｔｒａ−ｉｓｌｅｔ）線維症を、ｉｎｓ−ＥＧＦ×ＫＧ
Ｆの島において見出したが、免疫浸潤を見出さなかった。Ｈ＆Ａ染色は、高齢で
さえｉｎｓ−ＥＧＦ×ＫＧＦトランスジェニックマウスに対して、低いレベルの
免疫浸潤を示した。興味深いことに、ｉｎｓ−ＥＧＦマウスにおいて観察するよ
り、ずっとより広範な島内線維症をこの二重トランスジェニックマウスにおいて
観察した。この線維症は、細長い核を有する紡錘状（ｓｐｉｎｄｌｅ ｓｈａｐ
ｅ）細胞によって特徴づけられる。線維症のレベルは、この二重トランスジェニ
ックマウスにおいて、年齢につれて実質的に増加する。
【０１０９】 （外分泌細胞の導入に対する合わされたＥＧＦおよびＫＧＦの相乗効果） 予期せず、アミラーゼについてポジティブに染色する外分泌細胞が、二重トラ
ンスジェニックマウスの島内に存在した。このようなポジティブ染色を、単一ト
ランスジェニックマウスまたは非トランスジェニックコントロールマウスのいず
れの島組織内でも観察しなかった。青のヘマトキシリン後染色に対する茶色クロ
モゲンで染色される抗アミラーゼ抗体は、異型内分泌ならびにｉｎｓ−ＥＧＦ×
ＫＧＦマウスの膵臓内の予期された外分泌染色を示した。この現象の進展におけ
る進行ステージにおいて、アミラーゼポジティブ細胞を、最初、隣接する島が巻
き込む。アミラーゼについてポジティブに染色されている腺房細胞を、島組織お
よび線維細胞が囲んだ。その後、別個の線房細胞の形態学を有さないアミラーゼ
ポジティブ細胞もまた、島組織中で見出した。重要なことに、ｉｎｓ−ＥＧＦ×
ＫＧＦ二重トランスジェニックマウスの膵臓内で起こる形態的な変化は、この膵
臓の正常な機能を妨げるようではない。
【０１１０】 （実施例４） （ＫＧＦは、管上皮細胞由来内分泌細胞の分化を誘導する） ＩＦＮγを膵臓β細胞において発現するトランスジェニックマウス系列は、成
体生活の間中で生じる新しい内分泌細胞の継続的な発生を表す（Ｇｕ＆Ｓａｒｖ
ｅｎｔｎｉｃｋ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１８：３３−４６（１９９４））
。 β細胞の個体発生は、胎児発生と全く類似しているようである。ＩＦＮγが、こ
の再生プロセスを容易にする成長因子の発現を誘導することを示すために、ｉｎ
ｓ−ＩＦＮγトランスジェニックマウスを構築した。このｉｎｓ−ＩＮＦγトラ
ンスジェニックマウスは、管上皮細胞（その管の壁面に隣接して、上昇したレベ
ルのＫＧＦを発現する細胞）から管の内腔の中に成長する島を再生した。ＫＧＦ
レセプター（ＫＧＦＲ）を発現する細胞をまた、トランスジェニックマウスの管
の壁面内に見出す。これらのマウスの中和α−ＫＧＦ抗体処理は、再生プロセス
を調節し、β細胞の機能不全および高血糖症を生じる。中和α−ＫＧＦ抗体に曝
露される胎児膵臓もまた、異常な島発生を示す。従って、ＫＧＦは、ｉｎｓ−Ｉ
ＦＮγ／ＮＯＤトランスジェニックマウスにおいて観察される島再生を仲介し、
膵臓発生に関与し、そして内分泌膵臓のための機能的前駆体細胞に分化可能な管
由来細胞の維持および拡大を増強する。
【０１１１】 （導入）膵臓は、内胚葉起源の上皮構成要素および中胚葉起源の間葉構成要素
の両方から発生する。これらの２つの構成要素の組み合わせが、古典的な上皮−
間葉相互作用を生じる。複数の研究が、この膵臓の上皮の維持に必要とされる可
溶性の「内胚葉因子」を含んでいる。膵臓の個体発生、膵臓の癌腫、および制限
された膵臓の再生の研究が、外分泌の発生および内分泌の発生を起こす部位とし
て管上皮を指摘する。
【０１１２】 膵臓の島の発生における成長因子の役割は、実験的に検討するのは難しい。な
ぜなら、β細胞は妊娠中期の間に生じ、このことが胚段階の間に適切な成長因子
の決定を可能にするからである。このβ細胞の数は、誕生後安定である。それに
も関わらず、膵臓の島細胞の再生は、膵臓の島細胞の分化に関与する調節因子を
研究するのに重要である。
【０１１３】 （インスリンの制御下のＩＦＮγを発現するトランスジェニックマウス）膵臓
の島の発生を調節する成長因子を同定するため、成長因子の発現を、島細胞の再
生が継続的に起こるモデルにおいて評価した。このモデルにおいて、上昇したＫ
ＧＦ ＲＮＡレベルならびに管上皮細胞の集団によるＫＧＦレセプターの発現を
見出す。
【０１１４】 ＩＦＮγを発現するトランスジェニックマウスを、Ｓａｒｖｅｎｔｎｉｃｋら
、Ｃｅｌｌ ５２：７７３−７８２（１９８８）が以前に記載している。この系
列由来の子孫を、ＮＯＤ／Ｓｈｉマウスに対して１２世代より多く、戻し交雑し
た。子孫を、テイルＤＮＡのＰＣＲタイピングによって、導入遺伝子の存在につ
いてスクリーニングし、プロテイナーゼＫ消化を用いて、一晩で抽出した。ＰＣ
Ｒを、ヒトインスリンプロモーターに対して特異的な２つの２４−ｍｅｒプライ
マーを用いて行った。
【０１１５】 インサイチュハイブリダイゼーション。トランスジェニックマウスにおける観
察された増殖および分化を媒介し得る、潜在的な増殖因子についてスクリーニン
グするために、ｉｎｓ−ＩＦＮγトランスジェニックマウスの膵臓を、インサイ
チュハイブリダイゼーションにより、９つの潜在的に関連する増殖誘導因子の増
加した発現についてスクリーニングした。インサイチュハイブリダイゼーション
は、Ａｒｎｕｓｈら、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ ７４：９８５−９９０（１９９５
）により記載されるように行った。アンチセンスリボプローブおよびセンスリボ
プローブを、ＫＧＦ ｃＤＮＡを含む直鎖化プラスミドの、35Ｓ−ＵＴＰを用い
るインビトロでの転写により調製した。インサイチュハイブリダイゼーションの
後に、切片を写真乳剤でおおい、そして現像の前に４週間曝した。
【０１１６】 ｉｎｓ−ＩＦＮγトランスジェニックマウス由来の膵臓切片のこれらのインサ
イチュハイブリダイゼーションアッセイは、活発に複製している管付近（これら
の大きさにより判断されるように）および再生した島の近く（これらが管に近い
ことにより判断されるように）のＫＧＦ ＲＮＡの発現を明らかにした。これは
、管壁に近接する細胞（おそらく線維芽細胞である）が、ＫＧＦを産生すること
を示す。
【０１１７】 ＫＧＦを検出する能力は、管の近くにある細胞がこの増殖因子からのシグナル
に応答し得ることを意味した。ＫＧＦマイトジェンシグナルに応答する膵臓細胞
は、ＫＧＦレセプターを発現することが予測された。免疫グロブリン分子のＩｇ
Ｇ1 Ｆｃ部分と融合したＫＧＦ分子からなる抗体プローブ（α−ＫＧＦＲ）を
用いて、ＫＧＦＲ発現についてスクリーニングすることにより、ＫＧＦに応答し
得る膵臓細胞を同定した。
【０１１８】 α−ＫＧＦＲ分子の結合は、ｉｎｓ−ＩＦＮγ／ＮＯＤトランスジェニックマ
ウス膵臓の管壁中の細胞のサブカテゴリーにおいて示された。これらの細胞は、
主に管腔周囲の位置、および時折、管腔の縁に見出された。ＫＧＦＲは細胞質に
局在化し、細胞表面へのレセプターの潜在的な輸送またはＫＧＦへの結合による
活性化後のレセプターの内部移行を示す。ＫＧＦＲを発現するレセプターポジテ
ィブな管細胞はまた、他の管細胞の立方形の外観と比較して球形であり、そして
この管腔周囲の位置は、管腔から離れる移動を示し、この移動はこのモデルにお
けるβ細胞個体発生の間に起こる。非トランスジェニック同腹仔の膵臓組織の管
壁においては、ＫＧＦＲポジティブな細胞は見出されなかった。この実施例は、
分化している上皮内のＫＧＦ活性に応答し得るが、正常な成体の膵臓の上皮にお
いては検出されない細胞を示した。
【０１１９】 α−ＫＧＦ中和抗体。ＫＧＦがこのモデルにおいて島新生のために必要とされ
たことを決定するために、トランスジェニックマウスをα−ＫＧＦ中和抗体で処
置した。ｉｎｓ−ＩＦＮγ／ＮＯＤトランスジェニックマウスのα−ＫＧＦ中和
抗体処置は、膵島細胞の再生に関連する細胞複製を減少させ、そして糖尿病の発
症を導く。α−ＫＧＦ中和抗体で処置した胎仔の膵臓は、管の正常な発達および
島のシーディングにおいて明らかに不完全であった。
【０１２０】 ｉｎｓ−ＩＦＮγ／ＮＯＤトランスジェニックマウスは、ＩＦＮγトランスジ
ェニックマウスをＮＯＤマウス系統と７回戻し交配することにより誘導した。こ
れらのマウスを、中和抗体またはコントロール抗体のいずれかで短期間（２週間
）処置し、トランスジェニックマウスから増殖因子を一時的に枯渇させた。この
マウスを、抗体処置の間および後の膵臓細胞の複製および糖尿病についてモニタ
ーした。
【０１２１】 ｉｎｓ−ＩＦＮγ／ＮＯＤトランスジェニックマウスを、ＩＧ４α−ＫＧＦモ
ノクロナール中和抗体で処置した（Ｂｏｔｔａｒｏら、１９９３；Ａｌａｒｉｄ
ら、１９９４）。抗体処置を、以下のように行った：抗ＫＧＦ中和抗体を含む腹
水を、Ｌｏｆｓｔｒａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍ
Ｄ）から購入した。この抗体を、プロテインＧカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）で精製し、そしてＫＧＦ中和活性を分析
した。動物に３０μｇ／ｇ体重の抗ＫＧＦ中和抗体、ＩｇＧもしくは滅菌ＰＢＳ
を屠殺前２週間にわたって、１週間に２回注射したかまたは何も注射しなかった
（４匹のマウスを、さらなる処置なしで１週間後に屠殺した）。
【０１２２】 興味深いことに、α−ＫＧＦ中和抗体処置は、血糖レベルの急速な増加を生じ
た。血糖測定を、以下のように行った：規則正しい間隔で、尾部から血液を得、
血糖レベルを、Ｇｌｕｃｏｆｉｌｍ血糖試験ストリップ（Ｍｉｌｅｓ Ｄｉａｇ
ｎｏｓｔｉｃ，Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ）を用いて決定した。血糖レベルの増加は
、抗ＫＧＦ処置動物におけるインスリン産生β細胞の質量の減少を意味し、ＫＧ
Ｆが再生プロセスに関与するという理論と一致する。
【０１２３】 ＢｒｄＵ標識。ＫＧＦの除去が、管壁内の前駆細胞における増殖活性の減少に
関連することを決定するために、抗ＫＧＦ処理したトランスジェニックＮＯＤマ
ウスをＢｒｄＵを用いて標識した。細胞増殖の評価のために、１００μｇ／ｇ体
重のＢｒｄＵ（Ｓｅｒｖａ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、屠殺
の１２時間前にマウスに腹腔内注射した。パラフィン包埋した膵臓を切片に切断
し、そして２．８Ｎ ＨＣｌで１５分間処理した後に、抗ＢｒｄＵ抗体（Ａｃｃ
ｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）を用いて、上記のよ
うに染色した。有糸分裂指数を、各々の膵臓において少なくとも５つのランダム
に選択した視野において、管壁を含む細胞の陽性に染色された核の数を、核／管
壁の総数で割ることにより計算した。免疫組織化学技術を、ＢｒｄＵ標識された
複製している細胞を可視化するために使用し、そしてこの細胞を数えた。Ｂｒｄ
Ｕ取り込みは、ａ−ＫＧＦ（９％）で処置したマウスの管において、ＩｇＧ（１
４％）で処置したコントロールにおけるＢｒｄＵ取り込みより低かった（Ｐ＜０
．０５）。この減少は、管の中間にある細胞のサブカテゴリーの分裂の阻止を示
す。従って、ＫＧＦは、トランスジェニックモデルにおける膵島の再生において
、ある役割を果たしている。
【０１２４】 胎仔の研究。ＫＧＦが胎仔の島の分化のために必要であるか否かを決定するた
めに、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、妊娠１０日目にα−ＫＧＦ中和抗体（胎盤を容易
に通過するＩｇＧアイソタイプ）を用いて処置した。ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウス
を交尾させ、妊娠０日目は膣栓の存在により示された。妊娠したマウスに、９日
目に１．５μｇのα−ＫＧＦ中和抗体を注射し、１７日目に胎仔を取り出し、全
体をパラフィンで包埋し、切片に切断し、そして上記のような免疫細胞化学によ
り分析した。
【０１２５】 Ｅ１０段階でＫＧＦを枯渇させた胎仔の膵臓は、インスリン産生細胞数の減少
およびインスリン産生細胞の異常なクラスター形成を示し、これは島の形成の欠
損を示す。コントロールＩｇＧで処置したマウスの島は、主要な管から離れて分
散されるようであり、一方、α−ＫＧＦ中和抗体で処置したマウスにおいては、
島は管様細胞により縁取りされた。この研究は、胎仔の正常な島発生の間のＫＧ
Ｆの必要性を示唆する。
【０１２６】 まとめ。この実施例は、トランスジェニックモデルにおける少なくとも膵島再
生の間の、β細胞新生におけるＫＧＦの栄養活性を示す。ＫＧＦプローブを用い
るインサイチュハイブリダイゼーションは、ｉｎｓ−ＩＦＮγトランスジェニッ
クマウスにおけるＫＧＦメッセージのアップレギュレーションを示した。ＫＧＦ
Ｒ発現は、管の上皮細胞のサブセットにおいて同様に見出され、ＫＧＦ作用に対
する標的細胞を同定する。ＫＧＦは、トランスジェニックマウスモデルにおける
島細胞再生のために必要であった。なぜなら、その欠乏は、トランスジェニック
マウスにおける管細胞の複製の減少および高血糖症を導くからである。さらに、
この因子を発現するトランスジェニックマウスの研究は、上皮および細管に関連
する島の拡大を示した。
【０１２７】 先行技術と本実施例の結果との間に、いくつかの重大な違いが存在する。ＫＧ
Ｆにより刺激されるべき通常の幹細胞／前駆細胞の入手可能性は、１つの重要な
問題である。ＫＧＦ注入研究における、トランスジェニックマウスにおける通常
の幹細胞／前駆細胞の入手可能性は、この点で、正常な成体動物よりも、非常に
大きい。トランスジェニックマウスにおいては、ＫＧＦシグナルに独特に感受性
であり得る成体動物に、中間細胞が存在する。従って、この増殖因子の栄養効果
は、通常の幹細胞／前駆細胞の適切な集団が存在する状況においてのみ明らかに
され得る。島細胞の産生において、管上皮の増殖に続いて分化が起きて、階層的
な関係を形成する。従って、再生モデルにおいて、島細胞の発達は、管上皮を通
して影響を受け、これは新生のプロセスの間に島細胞を除外する。
【０１２８】 （実施例５） （膵管のインビトロ培養） （マウス膵管の単離および培養） 組換え分泌液および非組換え分泌液由来の管上皮の精製を、Ｋｅｒｒ Ｃｏｎ
ｔｅら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４５（８）：１１０８−１４（１９９６）の手順を
用いて、達成した。膵臓組織を、抽出して、そしてコラーゲンゲルに置いた。
【０１２９】 （インビトロで形成された嚢構造） 約１０個の嚢を、単離条件の最適化をしないで、各組換えマウスまたは非組換
えマウスから得た。１つの膵臓あたりの管嚢のよりよい収量（各組換えマウスま
たは非組換えマウスから約４０個の嚢）を、単離手順の最適化の後に得ることが
出来る。
【０１３０】 精製された管をインビトロで１０日間まで培養した。組織学的分析は、管の同
一性および完全性を証明した。この組織学的分析に関して、この管をゲル内の皿
から除去し、１０％中性緩衝化ホルマリン中で固定し、そしてパラフィン中に包
埋した。顕微鏡分析のために切片を作製し、そしてスライドガラス上に置いた後
、管を個々の細胞を識別するためにヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染
色することにより染色した。切片にした管をまたインスリン、炭酸脱水素酵素、
およびグルカゴンの発現について免疫染色により分析した。これらの単離手順は
、多種多様の大きさの直径の管の精製を生じた。
【０１３１】 培養された管をＢｒｄＵで標識し、組織培養において増殖する管細胞の比率を
決定した。
【０１３２】 （精製された管の移植） 精製された共通の幹集団／前駆集団を提供するために、単離し、精製した生存
可能な膵管を移植する技術を開発した。
【０１３３】 原理的な証拠を明らかにするために、インビトロで増殖された管嚢全体を、マ
ウスに移植した。精製された膵管を、肝臓に首尾よく移植する。３ｍＭの幅およ
び３ｍＭの深い切開を肝臓の下葉に作製した。１つの管嚢を切開に置いた。膵管
を、この移植手順に従い、少なくとも１週間移植部位に維持した。
【０１３４】 精製された膵管を、さらなる幹細胞研究のために肝臓および他の部位に移植し
得る。
【０１３５】 （結果） 精製された膵管を、上記されたように腎臓嚢に移植した。次いで、移植された
管を、管の移植された細胞の細胞系統が発達しているのを決定するために調査し
た。顕微鏡による腎臓嚢の調査は、細胞形態学により決定されたように、管細胞
の存在を示した。また、抗インスリン抗体を用いた腎臓の免疫学的染色は、イン
スリン産生細胞の存在を示した。さらに、抗アルブミン抗体を用いた腎臓の免疫
学的染色は、肝細胞の存在を示した。
【０１３６】 （実施例６） （幹細胞アッセイ） 本発明は、肝臓細胞および膵臓細胞に対して共通の幹／前駆体の存在および活
性のためのアッセイを提供する。
【０１３７】 造血系中の幹細胞を実証するために、精製されたマウス骨髄造血幹細胞（ＨＳ
Ｃ）を使用し、致命的に照射されたマウスにおける全ての血液細胞型を再構築し
た（Ｓｐａｎｇｒｕｄｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１（４８６１）：５８−６２
（１９８８））。その後、有意な進歩は、単一ｍＣＤ３４10/-ｃ−ｋｉｔ+細胞
、Ｓｃａ−Ｉ+Ｌｉｎ−細胞がＯｓａｗａら（１９９６）による全ての血液細胞
型の長期間の再構築を生じた、的確な実験を導いた。さらに、研究は、単一のＬ
ｉｎ細胞、ＩＬ−７Ｒ+Ｔｈｙ−１細胞、Ｓｃａ−Ｉ+ｃ−ｋｉｔ+細胞が、Ｔ細
胞およびＢ細胞の両方を生成し得ることが示されている。これらの細胞型は、マ
ウス骨髄において、最も早く公知となったリンパ球関連前駆細胞として同定され
ている（Ｋｏｎｄｏら、Ｃｅｌｌ ９１（５）：６６１−７２（１９９７））。
【０１３８】 単一細胞クローン分析をまた、使用し、インビトロで幹細胞活性を特徴付けた
。研究は、単一哺乳動物神経堤細胞が、多能であり、そして培養における神経細
胞およびシュワン細胞を生じさせる能力があることを実証した（Ｓｔｅｍｐｌｅ
およびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃｅｌｌ ７１（６）：９７３−８５（１９９２））
。さらに、胚のＣＮＳの単一細胞分析は、精製された幹細胞が、培養において、
ＣＮＳの３つ全ての主要な細胞型（ニューロン、星状細胞、および稀突起膠細胞
）を産生し得ることが示された（ＤａｖｉｓおよびＴｅｍｐｌｅ，１９９４；Ｒ
ｅｙｎｏｌｄｓおよびＷｅｉｓｓ，１９９６；Ｋａｌｙａｎｉら、１９９７）。
幹細胞はまた、ドナーマウスの精巣において示されている；単離された細胞は、
レシピエントマウスの無菌精巣を再集団化し得、精子の産生を導く（Ｂｒｉｎｓ
ｔｅｒおよびＡｖａｒｂｏｃｋ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳ
Ａ ９１（２４）：１１３０３−７（１９９４）；ＢｒｉｎｓｔｅｒおよびＺｉ
ｍｍｅｒｍａｎ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１（２４
）：１１２９８−３０２（１９９４））。
【０１３９】 細胞外マトリクス成分への差次的接着に基づいて、ヒト表皮幹細胞はまた、Ｊ
ｏｎｅｓ、Ｃｌｉｎ Ｓｃｉ（Ｃｏｌｃｈ）．９１（２）：１４１−６（１９９
６）によって単離され、そして特徴付けられた。この場合において、培養された
表皮から単離された幹細胞はクローン原性であり、自己複製し得、そしてインビ
ボで分化したケラチノサイトを生成し得る。培養された表皮幹細胞は、ヌードマ
ウスに移植される場合に、完全な表皮を再構成し得る。
【０１４０】 肝臓細胞および膵臓細胞に対する共通の幹細胞／前駆細胞の活性を批判的に評
価するために、細胞をランゲルハンス島または肝細胞を再構成する能力について
試験する。この幹細胞アッセイは、精製された管細胞をインビボの同系レシピエ
ントの異所的部位に配置し、移植された膵臓の共通の幹細胞／前駆細胞に由来す
る新しいランゲルハンス島または肝細胞の接種を検出する。
【０１４１】 幹細胞のアッセイは、トランスジェニック胎児膵臓または非トランスジェニッ
ク胎児膵臓を使用して行う。この移植片は、ｉｎｓ−ＫＧＦトランスジェニック
マウスまたは非トランスジェニックＢＡＬＢ／ｃドナーのいずれかに由来し、Ｂ
ＡＬＢ／ｃ ＳＣＩＤレシピエントに移植される。次に、精製された膵管全体を
、幹細胞アッセイにおいて使用する。続いて、管フラグメントを、幹細胞アッセ
イにおいて使用する。最後に、精製され、分散され、分別された管細胞を、幹細
胞アッセイにおいて使用し、肝臓細胞および膵臓細胞に対して共通の幹細胞／前
駆細胞を単離する。
【０１４２】 新しく接種される島は、そのインビボでの移植部位の位置から同定される。新
しく接種された島はまた、高感度標識技術を使用しても同定される。ＫＧＦトラ
ンスジェニックマウスを、ＲＯＳＡ２６系統と交雑し、その細胞の全てにおいて
β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現する二重トランスジェニック子孫を作製する
。これらの二重トランスジェニック膵管を、幹細胞アッセイにおけるドナーとし
て使用して、ｉｎｓ−ＫＧＦトランスジェニックマウスの管における肝臓細胞お
よび膵臓細胞に対する共通の幹細胞／前駆細胞の存在を示す。
【０１４３】 トランスジェニックな胎児の膵臓および非トランスジェニックな胎児の膵臓は
、腎臓嚢の下に移植され、移植の３週間以内に、成熟した島の増殖を生じる。細
胞培養物は、これらの腎臓嚢から産生された。
【０１４４】 （実施例７） （ＩＦＮγトランスジェニックマウスの再生している膵臓におけるＰＤＸ−１
内分泌前駆細胞の同定） 本実施例を、島細胞を生じるＩＦＮγトランスジェニックマウスの管における
内分泌前駆細胞をさらに規定および特徴付けるため、ならびにこれらの細胞に関
連する新規な細胞マーカーを同定するために開始した。
【０１４５】 ＩＦＮγトランスジェニック膵臓における内分泌前駆細胞に関連する新規なマ
ーカーの同定は、これらの前駆細胞の規定および再構成プロセスにの分析におい
ての両方に関して、明らかに価値がある。従って、本実施例は、その発現がＩＦ
Ｎγトランスジェニックマウスの再生している管において増大され得るタンパク
質を同定することを求められる。最初の分析は、ホメオボックス含有タンパク質
、ＰＤＸ−１に焦点を合わせる。
【０１４６】 ＰＤＸ−１を選択した。なぜなら、このタンパク質は、個体発生の間の膵臓の
発達に関係するためである。ＰＤＸ−１（ＩＤＸ−１、ＩＰＦ−１、またはＳＴ
Ｆ−１とも称される）は、膵臓の発達および内分泌細胞の形成にとって重大な転
写因子である。ＰＤＸ−１は、インスリンの発現を調節する。ＰＤＸ−１は、成
体のランゲルハンス島において発現されるが、管細胞には存在しない。ＰＤＸ−
１を発現しないマウスは、膵臓が欠如しており、そして生後まもなく死ぬ。ＰＤ
Ｘ−１は、共通の前駆細胞の膵臓同一性の決定および維持において、またはその
増殖の調節において機能する。ＩＦＮγマウスの大規模な管細胞の増殖および新
しい島増殖の特徴という理由で、ＰＤＸ−１は、ＩＮＦγマウスで発生する再生
に関与していることが推測された。個体発生の間の内分泌細胞の発達のために重
要であるタンパク質はまた、再生している膵臓における新しい島形成の間のこの
プロセスについて重要であり得る。
【０１４７】 トランスジェニックマウスモデル。トランスジェニックマウスモデル（ここで
のＩＦＮγ発現が、存在する島の破壊を生じる）は、Ｓａｒｖｅｔｎｉｃｋら、
Ｃｅｌｌ ５２：７７３−７８２（１９８８）によって以前に記載されている。
ランゲルハンス島のβ細胞中でＩＦＮγを発現するＩｎｓ−ＩＦＮγトランスジ
ェニックマウスは、導管の過形成および浸潤したリンパ球による島の破壊を示し
、この特徴は、Ｉ型糖尿病マウスモデルにおいて見られる。これらのマウスの興
味深い表現型は、腺房の組織における「新しい」島の再生と、前に存在した島の
破壊との間の平衡である。新しく形成される島は、管の管腔中に発芽し、ここで
、これらは浸潤および破壊から保護される。膵管の積極的な増殖および成体生存
の間の新しい内分泌細胞の連続的な分化は、この著しい再増殖の原因である前駆
細胞がトランスジェニック膵臓に存在することを示す。
【０１４８】 １０世代より多くＮＯＤ／Ｓｈｉ系統（ｉｎｓ−ＩＦＮγ／ＮＯＤ）に戻し交
雑されたＩｎｓ−ＩＦＮγマウスは、糖尿病の非常に低い発生率（雌については
８０％まで、そして雄については２５％までの発生率を有するＮＯＤマウスと比
較して、２０％未満）を有する。有意な膵管細胞の増殖および島の再生は、これ
らのマウスにおいて観察される。内分泌細胞による有意な再生能力の欠如は、新
しい島の増殖が、トランスジェニックマウスの膵臓における前駆細胞によって媒
介されることを示す。なぜなら、新しい島細胞は、膵管中の細胞から誘導される
からである。
【０１４９】 免疫電子顕微鏡。免疫電子顕微鏡（ＩＥＭ）を使用して、マウス中に存在する
ＰＤＸ−１を発現する細胞を特徴付けた。膵臓組織を、１０％の通常緩衝化ホル
マリン（３．６％のホルムアルデヒド）に２５℃で２時間固定した。固定した組
織を、１．５Ｍのショ糖−ＰＢＳに、穏やかな反転周期で０．５時間浸した。浸
した組織を、液体窒素中で急速凍結し、Ｏ．Ｃ．Ｔ．および２−メチルブタン中
に包埋し、そして３０〜４０μｍの厚さに切り出した。これらの切片を、グリシ
ン−ＰＢＳ中でインキュベートし、アルデヒドで０．５時間クエンチし、１０％
正常ヤギ血清中で０．５時間ブロックし、１％のグルタルアルデヒド−ＰＢＳ中
で０．２５時間再固定する前に、ＰＤＸ−１（１次抗体）およびヤギ抗ウサギ２
次抗体中でそれぞれ１時間インキュベートし、そしてＰＢＳで洗浄した。反応産
物を、１％ＯｓＯ4で処理する前に、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）で７分間、
そしてＤＡＢ+Ｈ2Ｏ2で４分間可視化した。組織を段階的なエタノールで脱水し
、プロピレンオキシドで洗浄し、そして液体Ｓｐｕｒｒ樹脂で包埋する。薄い切
片を、Ｈｉｔａｃｈｉ ＨＵ １２Ａ電子顕微鏡で調べた。
【０１５０】 免疫組織化学。マウス中に存在するＰＤＸ−１を発現する細胞をまた、免疫組
織化学によって特徴付けた。膵臓を、１０％中性緩衝化ホルマリン（３．６％ホ
ルムアルデヒド）中で一晩固定し、パラフィン中に包埋する。５μｍのパラフィ
ン切片を、組織学的評価のためにヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で慣
習的に染色するか、または、免疫細胞学的技術を用いて、インスリン、ＰＤＸ−
１の存在について染色するかのいずれかを行った。手短に言うと、インスリン（
ＤＡＫＯ，Ｃａｒｐｅｎｔａｒｉａ，ＣＡ）またはＰＤＸ−１に対する１次抗体
を適用する前に、切片を脱パラフィンし、そして２％の正常ヤギ血清でブロック
した。１次抗体の結合を、適切な２次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）、およびセイヨウワサビペルオキシダー
ゼ（ＨＲＰ）標識化アビジン−ビオチン複合体（ＡＢＣ キット，Ｖｅｃｔｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して検出した。３，３’−ジアミノベンジ
ジンを基質として使用して、ＨＲＰを可視化した。対比染色としてジル（Ｇｉｌ
ｌ’ｓ）ヘマトキシリンを使用した。
【０１５１】 （結果）有意なＰＤＸ−１発現は、光学免疫電子顕微鏡（ｌｉｇｈｔ ａｎｄ
ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）により、ＩＦＮγマ
ウスの再生膵臓における管上皮細胞のサブセットにおいて観察された。ＰＤＸ−
１発現は、管腔および管腔周囲の（ｐｅｒｉｌｕｍｅｎａｌ）の両方の管上皮細
胞において見出された。ＰＤＸ−１陽性管細胞とＰＤＸ−１陰性管細胞との間で
、形態学的な差異は明白ではなかった。インスリン発現（新たに形成された島構
造の特徴）もまた、ＰＤＸ−１発現管細胞の部分集団において検出された。
【０１５２】 （ＩＦＮγトランスジェニック膵臓におけるＰＤＸ−１発現）以前の研究は、
ＩＦＮγトランスジェニックマウスの島が正常な内分泌ホルモンを発現すること
を示した（ＧｕおよびＳａｒｖｅｔｎｉｃｋ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１８
：３３−４６（１９９４））。さらに、非トランスジェニック膵臓において観測
されるものと一致して、ＩＦＮγマウス膵臓における管上皮細胞は、アミラーゼ
（腺房細胞に対するマーカー）に関して明白な染色を生じずに、管細胞マーカー
（カルボニックアンヒドラーゼＩＩ（ＣＡＩＩ））を発現する（ＧｕおよびＳａ
ｒｖｅｔｎｉｃｋ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１８：３３−４６（１９９４）
）。明らかに、ＰＤＸ−１は、膵臓の発生に関与し、そして個体発生の間、胎仔
膵臓において発現される。
【０１５３】 ＰＤＸ−１が個体発生と同様に再生に関与するか否かを決定するために、トラ
ンスジェニックマウスおよび非トランスジェニックマウスのＩＦＮγ再生膵臓を
、ＰＤＸ−１に対するポリクローナル抗体を用いて、ＰＤＸ−１発現についてス
クリーニングした。ＰＤＸ−１の著しい発現が、ＩＦＮγマウスの再生管におい
て見出された。この分析は、島細胞の核においては推測通り、しかし管壁内の細
胞の大部分においてもまた、免疫反応性が存在することを明らかにした。トラン
スジェニックマウスの膵管内の全ての細胞が、ＰＤＸ−１について陽性であった
わけではないのに対して、管内島の成長を支持する管は、ＰＤＸ−１発現につい
て強力に陽性であった。インスリンに対する抗体での隣接するセクションの染色
は、これらのＰＤＸ−１陽性管がまた、インスリンについて陽性である細胞の部
分集団を含むことを明らかにした。推測通り、コントロールの非トランスジェニ
ックマウス由来の管は、ＰＤＸ−１もインスリンも発現しなかった。
【０１５４】 ＰＤＸ−１発現は、以前には、膵管細胞においては観測されなかった。
【０１５５】 （ＰＤＸ−１発現管細胞の超微細構造分析）ＩＦＮγ再生管内の細胞は、管上
皮細胞の多くの形態学的特徴を示す。これらの特徴としては、中心に位置した、
不規則な形状の核、細胞の外側面上の多くの嵌合状突起、ミトコンドリアを含む
未分化の細胞質、粗面小胞体の低密度エレメント、ゴルジラメラの散在したスタ
ック、および種々の小胞のプロフィールが挙げられた。さらに、先端の原形質膜
は、接着結合を備えた微絨毛および接合複合体を含む、代表的な先端の超微細構
造分化を有した。
【０１５６】 ＰＤＸ−１に対する抗体は、免疫電子顕微鏡研究において、管腔に接する管細
胞のサブセット、ならびに管腔周囲の管細胞のサブセットにＰＤＸ−１核染色が
存在することを明示した。これらのＰＤＸ−１を発現した管細胞と発現しなかっ
た細胞との間では、形態学において差異は観測されなかった。
【０１５７】 （考察）ｉｎｓ−ＩＦＮγトランスジェニックマウスの膵臓は、島の破壊、包
囲する外分泌組織の崩壊、および管の増殖を伴う大規模な浸潤を示す。この破壊
は、管腔に発展する（ｂｕｄ）島の再生により平衡が保たれ、ここでそれらは、
浸潤するリンパ球による破壊から保護される。この実施例において、組織学的分
析は、著しい管の増殖および島の再生を担う前駆細胞を特徴づけた。
【０１５８】 管上皮（これは、挿入（小）導管、小葉内（中）導管および小葉間（大）導管
からなる）は、膵臓における外分泌および内分泌発生の部位として長い間関係付
けられてきた。膵臓個体発生、膵臓癌および膵臓再生制限のモデルの研究は、管
上皮を成長、分化および増殖の供給源として示す（Ｇｉｔｈｅｎｓ，１９８８；
Ａｒｇｅｎｔら、１９９２；ＭｃＣｌｅａｎおよびＷｅａｖｅｒ、１９９３；Ｐ
ｉｃｔｅｔら、１９７２）。再生膵臓の膵管は、複数のホルモンを発現する内分
泌細胞、外分泌／内分泌細胞、管／外分泌細胞および外分泌細胞を含むいくつか
の型の移行細胞を含む（ＧｕおよびＳａｒｖｅｔｎｉｃｋ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅ
ｎｔ １１８：３３−４６（１９９４））。
【０１５９】 内分泌細胞は、管腔から遊走し得、そして管腔に面する細胞が、「前分化」幹
細胞に関する最良の候補であり得る。再生および新たな島形成の促進において、
これらの前駆細胞は、膵臓の初期発生を反復する。個体発生とＩＦＮγ媒介再生
との間に、並行が存在する。両方の場合とも、内分泌遺伝子発現は、初期の事象
であり、個々の内分泌細胞がまず、管壁に出現する。続けて、これらの細胞が遊
走してクラスターを形成し、このクラスターは、十分に分化した島へ成長する。
従って、内分泌細胞前駆体は、これらが胎仔膵臓に存在するのと同様に、島再生
を経たマウスの管において豊富であり得る。
【０１６０】 （要旨）光学免疫電子顕微鏡を使用して、ＰＤＸ−１発現膵臓細胞が、管上皮
細胞の形態学的および組織学的特徴を有するトランスジェニック膵臓において見
出された。このＰＤＸ−１発現管細胞は、管腔周囲および管腔の両方の位置で見
出され、そしてＰＤＸ−１発現細胞のサブセットもまたインスリンを発現する。
従って、ＩＦＮγトランスジェニックマウスの再生管におけるＰＤＸ−１発現は
、個体発生の間のＰＤＸ−１に関する要求を反復し、そしてＰＤＸ−１を再生膵
臓における重要な膵臓前駆細胞マーカーとして規定する。再生管上皮におけるＰ
ＤＸ−１発現と関連した、ＰＤＸ−１の有意な発現を示す管からの新たな内分泌
細胞の派生は、ＩＦＮγトランスジェニックマウスにおけるＩＦＮγ媒介再生の
間の新たな形成が、胎仔発生の間活動中である機構に類似する機構を通じて進行
し得ることを示す。
【０１６１】 本発明の多くの実施形態が記載されているにも関わらず、種々の改変が、本発
明の精神および範囲から逸脱することななく行われ得る。従って、他の実施形態
は、以下の特許請求の範囲内にある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/16 Ｃ１２Ｎ 1/00 Ｆ 1/18 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 1/00 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｙ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 1/68 5/00 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/00 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 クラコフスキ， ミシェル エル． アメリカ合衆国 カリフォルニア 92014， デル マー， スタンフォード コート 399， アパートメント 127 (72)発明者 クリツィック， マーシー アール． アメリカ合衆国 カリフォルニア 92037， ラ ホヤ， クレイアボーン スクエア 9618 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA21 CA04 EA04 FA02 GA11 HA11 HA20 4B063 QA01 QA05 QA18 QQ08 QR32 QR55 QR59 QS02 QS34 4B065 AA90X AB01 AC14 BB23 BC12 BC46 CA24 CA46 4C084 AA02 AA06 AA13 BA35 CA53 CA56 DB54 NA14 ZA751 ZA811 4C085 AA13 BB11 CC05 DD22 EE01 GG01

Claims (32)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 細胞培養物であって、以下： （ａ）肝臓細胞および膵臓細胞に共通の幹細胞／前駆細胞、および； （ｂ）該共通の幹細胞／前駆細胞を培養するための培養培地、 を含む、培養培地。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の細胞培養物であって、ここで、前記共通の
    幹細胞／前駆細胞が、トランスジェニック非ヒト哺乳動物由来であって、該哺乳
    動物の細胞が、ＫＧＦコードポリヌクレオチドに作動可能に連結された膵臓特異
    的プロモーターを含むポリヌクレオチドを含む、培養物。
  3. 【請求項３】 請求項２に記載の細胞培養物であって、ここで、前記哺乳動
    物の細胞がさらに、ＥＧＦコードポリヌクレオチドに作動可能に連結された膵臓
    特異的プロモーターを含むポリヌクレオチドを含む、培養物。
  4. 【請求項４】 請求項１に記載の細胞培養物であって、ここで、該細胞培養
    培地が、膵管培養物に有用な培地である、培養物。
  5. 【請求項５】 請求項１に記載の細胞培養物であって、ここで、該細胞培養
    培地が、市販の培地である、培養物。
  6. 【請求項６】 請求項１に記載の細胞培養物であって、ここで、該細胞培養
    培地が、インスリンを補填されるである、培養物。
  7. 【請求項７】 肝臓細胞および膵臓細胞に共通の幹細胞／前駆細胞を同定す
    るための方法であって、以下： （ａ）哺乳動物の腎臓嚢に膵管嚢を移植する工程；および （ｂ）該膵管嚢の細胞の発達を検出する工程であって、ここで、該腎臓嚢におけ
    る肝臓細胞および脾臓内分泌細胞の両方の該検出は、肝臓細胞および膵臓細胞に
    共通の幹細胞／前駆細胞を含むものとして、該膵管嚢を同定する、工程、 を包含する、方法。
  8. 【請求項８】 請求項７に記載の方法であって、ここで、前記肝臓細胞の検
    出が、アルブミンを産生する細胞の存在について、前記移植された膵管嚢をアッ
    セイすることによる、方法。
  9. 【請求項９】 請求項８に記載の方法であって、ここで、前記アッセイが、
    免疫組織化学アッセイである、方法。
  10. 【請求項１０】 請求項７に記載の方法であって、ここで、前記膵臓内分泌
    細胞の検出が、インスリンを産生する細胞の存在について、前記移植された膵管
    嚢をアッセイすることによる、方法。
  11. 【請求項１１】 請求項１０に記載の方法であって、ここで、前記アッセイ
    が免疫組織化学アッセイである、方法。
  12. 【請求項１２】 請求項７に記載の方法であって、ここで、前記膵管嚢が、
    トランスジェニック非ヒト哺乳動物由来であって、前記哺乳動物の細胞が、ＫＧ
    Ｆコードポリヌクレオチドに作動可能に連結される膵臓特異的プロモーターを含
    むポリヌクレオチドを含む、方法。
  13. 【請求項１３】 請求項１２に記載の方法であって、ここで、前記哺乳動物
    の細胞がさらに、ＥＧＦコードポリヌクレオチドに作動可能に連結される膵臓特
    異的プロモーターを含むポリヌクレオチドを含む、方法。
  14. 【請求項１４】 肝臓細胞および膵臓細胞に共通の幹細胞／前駆細胞を同定
    するための方法であって、以下： （ａ）培養培地において膵管細胞の集団を培養する工程；および （ｂ）培養物中の該細胞を発達を検出する工程であって、ここで、該細胞培養物
    における肝臓細胞および膵臓内分泌細胞の両方の検出は、肝臓細胞および膵臓細
    胞に共通の幹細胞／前駆細胞を含むものとして膵管細胞の集団を同定する、工程
    、 を包含する、方法。
  15. 【請求項１５】 請求項１４に記載の方法であって、ここで、前記膵管細胞
    が、トランスジェニック非ヒト哺乳動物由来であって、該哺乳動物の細胞が、Ｋ
    ＧＦコードポリヌクレオチドに作動可能に連結される膵臓特異的プロモーターを
    含むポリヌクレオチドを含む、方法。
  16. 【請求項１６】 請求項１５に記載の方法であって、ここで、前記哺乳動物
    の細胞がさらに、ＥＧＦコードポリヌクレオチドに作動可能に連結される膵臓特
    異的プロモーターを含むポリヌクレオチドを含む、方法。
  17. 【請求項１７】 細胞が、ＫＧＦコードポリヌクレオチドに作動可能に連結
    される膵臓特異的プロモーターを含むポリヌクレオチドを含む、トランスジェニ
    ック非ヒト哺乳動物。
  18. 【請求項１８】 請求項１７に記載のトランスジェニック哺乳動物であって
    、ここで、前記膵臓特異的プロモーターがインスリンプロモーターである、トラ
    ンスジェニック動物。
  19. 【請求項１９】 請求項１７に記載のトランスジェニック哺乳動物であって
    、該哺乳動物の細胞がさらに、以下： ＥＧＦコードポリヌクレオチドに作動可能に連結される第二の膵臓特異的プロ
    モーター、 を含むポリヌクレオチドを含む、トランスジェニック哺乳動物。
  20. 【請求項２０】 請求項１９に記載のトランスジェニック哺乳動物であって
    、ここで、前記第二の膵臓特異的プロモーターが、インスリンプロモーターであ
    る、トランスジェニック哺乳動物。
  21. 【請求項２１】 哺乳動物における膵管細胞のインビボ増殖のための方法で
    あって、該哺乳動物に膵臓供給源のＫＧＦを提供する工程を包含し、ここで、該
    膵臓供給源のＫＧＦが、ＫＧＦコードポリヌクレオチドに作動可能に連結される
    膵臓特異的プロモーターを含む組換えＤＮＡ分子の発現によって提供される、方
    法。
  22. 【請求項２２】 哺乳動物における膵臓の肝細胞のインビボ産生のための方
    法であって、該動物に膵臓供給源のＫＧＦを提供する工程を包含し、ここで、該
    膵臓供給源のＫＧＦが、ＫＧＦコードポリヌクレオチドに作動可能に連結される
    膵臓特異的プロモーターを含む組換えＤＮＡ分子の発現によって提供される、方
    法。
  23. 【請求項２３】 膵管細胞を産生するための方法であって、該方法は、以下
    ： 肝臓細胞および膵臓細胞に共通の幹細胞／前駆細胞を、発達的に有効量のＫＧ
    Ｆに接触させる工程であって、ここで、ＫＧＦが、共通の幹細胞／前駆細胞の管
    細胞への発達を誘導する、工程、 を包含する、方法。
  24. 【請求項２４】 アミラーゼ陽性外分泌細胞を産生するための方法であって
    、該方法は、以下： 肝臓細胞および膵臓細胞に共通の幹細胞／前駆細胞を、発達的に有効量のＫＧ
    Ｆに接触させる工程であって、ここで、ＫＧＦが、共通の幹細胞／前駆細胞の外
    分泌細胞への発達を誘導する、工程、 を包含する、方法。
  25. 【請求項２５】 肝臓細胞および膵臓細胞に共通の幹細胞／前駆細胞のイン
    ビボ増殖のための方法であって、該方法は、以下： 哺乳動物に対する増殖誘導増殖因子である膵臓供給源のＫＧＦを提供する工程
    であって、ここで、該増殖因子が、該増殖因子に対するコードポリヌクレオチド
    に作動可能に連結される膵臓特異的プロモーターを有する、ポリヌクレオチドの
    発現産物である、工程、 を包含する、方法。
  26. 【請求項２６】 請求項２５に記載の方法であって、ここで、前記膵臓特異
    的プロモーターが、インスリンプロモーターである、方法。
  27. 【請求項２７】 哺乳動物の膵臓におけるβ細胞の発達を阻害するための方
    法であって、該方法は、以下： 阻害に有効量の中和α−ＫＧＦ抗体を該哺乳動物に注射する工程、 を包含する、方法。
  28. 【請求項２８】 マーカーとしてＰＤＸ−１を用いて、増殖する膵管細胞を
    同定するための方法であって、該方法は、以下の工程： （ａ）増殖する膵管細胞を含む膵管を、ＰＤＸ−１に結合する試薬と接触させる
    工程；および （ｂ）該接触を検出する工程であって、ここで、該検出は、該管を増殖する膵管
    細胞を含むものとして同定する、工程、 を包含する、方法。
  29. 【請求項２９】 請求項２８に記載の方法であって、ここで、前記試薬が抗
    ＰＤＸ−１抗体である、方法。
  30. 【請求項３０】 請求項２８に記載の方法であって、ここで、前記検出が、
    増殖する膵管細胞における前記試薬とＰＤＸ−１との間の接触の検出である、方
    法。
  31. 【請求項３１】 請求項２８に記載の方法であって、ここで、前記増殖する
    膵管細胞が、膵臓の幹細胞／前駆細胞である、方法。
  32. 【請求項３２】 請求項３１に記載の方法であって、ここで、前記検出が、
    膵臓の幹細胞／前駆細胞における前記試薬とＰＤＸ−１との間の接触の検出であ
    る、方法。
JP2000588340A 1998-12-16 1999-12-13 肝臓細胞および膵臓細胞に共通の幹細胞／前駆細胞を同定するための動物モデル Pending JP2002532088A (ja)

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