JP2002530337A - １，６−ジメチル−８ベータ−ヒドロキシメチル−１０アルファ−メトキシエルゴリンの新規な治療使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は１，６−ジメチル−８ベータ−ヒドロキシメチル−１０アルファ−メトキシエルゴリンを運動ニューロン病の予防および／または治療で用いることに関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエル
ゴリン（ｅｒｇｏｌｉｎｅ）を運動ニューロン病（ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ
ｄｉｓｅａｓｅｓ）の予防および／または治療で用いることに関する。

【０００２】 １，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエルゴリンま
たは１−メチル−１０α−メトキシ−９，１０−ジヒドロリセルゴールはニセル
ゴリン（ｎｉｃｅｒｇｏｌｉｎｅ）の代謝物の１つである（Ｆ．ＡＲＣＡＭＯＮ
Ｅ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ.，２１（１６），２２０５−２０
１３（１９７２））。そのような化合物は、低い度合ではあるがニセルゴリンと
同様にα１−アドレナリン作用性および５ＨＴ１ａ−セロトニン作用性を示す。
これはまたニセルゴリンを製造する時の中間体として用いるに有用である（フラ
ンス特許第２６１６７８８号）。

【０００３】 今回、１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエルゴ
リンが運動ニューロンの生存性を高め、従ってそれを運動ニューロン病の予防お
よび／または治療で用いることができることを見いだした。

【０００４】 運動ニューロン病には特に筋委縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌ
ａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、進行性脊髄筋萎縮（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉ
ｖｅ ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）、小児筋萎縮（ｉｎ
ｆａｎｔｉｌｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）および原発性側索硬化症
（ｐｒｉｍａｒｙ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）が含まれる。

【０００５】 運動ニューロンの培養物に神経栄養因子であるＢＤＮＦまたはＧＤＮＦが供給
する栄養支持物（ｔｒｏｐｈｉｃ ｓｕｐｐｏｒｔ）を存在させると、そのよう
な培養物は、長い分枝を有する軸索を伴う幅広い均一なニューロンを含有するよ
うになる。しかしながら、この培養を栄養支持物の存在無しに実施すると運動ニ
ューロンが細胞消滅で死滅する。

【０００６】 従って、１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエル
ゴリンの効果の測定を、培養した運動ニューロンから神経栄養因子を取り除くこ
とで誘発した変性モデルを用いて行った。

【０００７】 更に、運動ニューロンの生存に適切な環境の維持管理に星状細胞が重要な役割
を果たす。

【０００８】 従って、１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエル
ゴリンの試験をまた運動ニューロンと星状細胞の共培養物を用いることでも行っ
た。

【０００９】 下記のプロトコルを用いた：運動ニューロンが豊富な培養物： Ｒ．Ｌ．ＳＣＨＮＡＡＲおよびＡ．Ｅ．ＳＣＨＡＦＦＮＥＲ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏ
ｓｃｉ.，１，２０４−２１７（１９８１）が記述しそしてＷ．ＣＡＭＵおよび
Ｃ．Ｅ．ＨＥＮＤＥＲＳＯＮ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，４４，
５９−７０（１９９２）が修飾した遠心分離方法を用いて運動ニューロンが豊富
な培養物を調製する。この運動ニューロンを、Ａ．Ｇ．ＥＳＴＥＶＥＺ他、Ｊ．
Ｎｅｕｒｏｓｃｉ.，１８（３），９２３−９３１（１９９８）の方法に従って
ラミニン／オルニチンで前以て覆っておいた３５ｍｍの培養板に板１枚当たり２
５００個の細胞から成る密度で広げる。次に、この培養物を重炭酸ナトリウム（
２２ｍＭ）、コナルブミン（０．１ｍｇ／ｍｌ）、プトレシン（０．１ｍＭ）、
インシュリン（５μｇ／ｍｌ）、亜セレン酸ナトリウム（３１ｍＭ）、グルコー
ス（２０ｍＭ）、プロゲステロン（２１ｎＭ）、ペニシリン（１００（ＩＵ／ｍ
ｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬ１５培地（Ｇ
ＩＢＣＯ ＢＲＬ）で維持する。

【００１０】 このようにして得た運動ニューロンは、長い分枝の軸索を有する大き（２５−
３０μｍ）くて均一なニューロンから成る。その細胞の７０％を越える細胞がニ
ューロトロフィンｐ７５レセプタおよび脊髄運動ニューロンのＩｓｌｅｔ １／
２マーカーに免疫反応性を示す。そのような培養を栄養因子の存在無しに実施す
ると、広げて２４時間後に運動ニューロンの約７０％が細胞消滅で死滅する。脊髄星状細胞の培養： Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ
（Ａ．Ｊ．ＴＵＲＮＥＲおよびＨ．Ａ．Ｓｔ ＪＯＨＮ） ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ
，Ｏｘｆｏｒｄ−Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣの２７−６３頁に記述されている
ようにＲ．Ｐ．ＳＡＮＥＴＯおよびＪ．ＤＥ ＶＥＬＬＩＳの方法を若干修飾し
た方法を用いて、１日令の若いラットから星状細胞を得る。脊髄を無菌条件下の
解剖で取り出して髄膜と背側神経節を除去する。ＰＢＳ（燐酸塩緩衝食塩水）に
脊髄を５から１０個移した後、切断して、トリプシンを０．２５％添加しておい
たＰＢＳに入れて３７℃で２５分間インキュベートする。ウシ胎児血清（ＦＣＳ
）を１０％添加しておいたＤｕｌｂｅｃｃｏの修飾Ｅａｇｌｅ媒体（ＤＭＥＭ）
を１０ｍｌ添加して酵素処理を停止させた後、細胞を遠心分離で集める。１ｍｌ
ピペットの末端部を用いて別の機械的分解段階も実施する。この細胞をＦＣＳが
１０％入っているＤＭＥＭに培地２５ｃｍ²当たり１．５−２ｘ１０⁶個のセルか
ら成る密度で広げる。インビトロで２日後から培養物に毎日餌を与える。目で見
て細胞の単層の形成が完了した時点で培養物を２５０ｒｐｍで４８時間撹拌し、
そして次の日、前記単層をシトシンアラビノシド（１０^-5Ｍ）で４８時間処理す
る。次に、この星状細胞単層を最初２５ｃｍ²の培養フラスコの３５ｍｍの培養
板上で密度が５になるまで増幅させる。

【００１１】 前記脊髄星状細胞培養物は９８％を越える度合で神経膠原線維酸蛋白質（ＧＦ
ＡＰ）に免疫反応を示す平らな多角形の細胞を含有する。前記単層を試験を受け
させるべき製品に接触させた後、運動ニューロン培地と一緒にインキュベートす
ることで、条件付けした培地を得る。この培地を移していろいろな希釈度で試験
を行うことで、それがニューロン生存に対して示す効果を測定する。免疫化学 前記細胞をＰＢＳ中４％のパラホルムアルデヒドと０．１％のグルタルアルデ
ヒド（ｐＨ７．４）に４℃で１５分間入れそして冷メタノール溶液に入れること
で固定する。次に、この培養物をＰＢＳ中１０％のヤギ血清と２％のウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）で洗浄して非特異的部位を遮断した後、弱い親和力を有する
ｐ７５ニューロトロフィンレセプタまたは２００ｋＤのニューロフィラメント蛋
白質（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に対する抗体を製造業者の指示で用いかつアビジン−
ビオチン−ＤＡＢ／過酸化水素増強反応を用いた免疫化学処理を行う。１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエルゴリンによ る星状細胞の処理 １，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエルゴリンに
よる星状細胞の処理を下記の様式で行う：この製品をメタノールに溶解させ、濾
過で滅菌し、そして調製後直ちに用いる。試験を受けさせるべき製品が入ってい
る溶液を一定分量でＬ１５培地に添加して広げることで、運動ニューロンが豊富
な培養物に適用する処理を行う。前記星状細胞の単層を媒体にか或は試験を受け
させるべき化合物がいろいろいな濃度で入っている溶液に２４時間接触させる。
星状細胞の単層をＤＭＥＭで３回洗浄した後、完全Ｌ１５培地と一緒にインキュ
ベートする。２４時間後に星状細胞条件付け培地（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ−ｃｏｎ
ｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）を回収しそして遠心分離に１８００ｇで１５
分間かけた後、直ちに用いるか、或は−７０℃で栄養活性が失われないならば最
大で２週間貯蔵する。細胞の計数および統計学的解析 ニューロフィラメントに免疫反応性を示しかつ細胞の直径よりも大きな軸索を
示す細胞は生存能力のある運動ニューロンであると見なす。２００倍に拡大した
顕微鏡下で０．４−１ｃｍ²の面積に存在する標識付き細胞の数を数えることで
運動ニューロンの数を推定する。この値を、全てのケースで、栄養因子を用いて
維持した培養物に存在する運動ニューロンの数のパーセントとして表す。このよ
うな実験を少なくとも３回実施する。

【００１２】 Ｓｔｕｄｅｎｔの試験（ｔテスト）を用いて統計学的解析を実施する。

【００１３】 下記の結果を得た： １ − １，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエルゴ
リンが星状細胞／運動ニューロン共培養物中のニューロン生存に対して示す効果
：

【００１４】

【表１】

【００１５】 前記結果は、１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシ
エルゴリン（０．１−１μＭ）が前記共培養物に含まれるニューロンの死滅を防
止しかつ大型運動ニューロンの数を多くすることを示している。 ２ − 脊髄星状細胞がもたらす運動ニューロン神経栄養活性に対する１，６−
ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエルゴリンの効果：

【００１６】

【表２】

【００１７】 前記結果は、脊髄星状細胞単層がもたらす運動ニューロン栄養活性を１，６−
ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエルゴリンが刺激するこ
とを示している。 ３ − 星状細胞単層と運動ニューロンの共培養に対する１，６−ジメチル−８
β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエルゴリンの効果：

【００１８】

【表３】

【００１９】 前記結果は、１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシ
エルゴリンが星状細胞による運動ニューロン栄養活性を刺激してそれを産出させ
る効力を有することを示している。 ４ − １，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエルゴ
リンが運動ニューロンが豊富な培養物に入っているニューロンの死滅に対して栄
養因子の存在無しに示す神経栄養様効果： １，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエルゴリンは
栄養因子無しで運動ニューロンの生存率を６０％高く（ｐ＜０．００１）する一
方でニューロンの分枝および細胞の形態は良好に保存されたままである。

【００２０】 このような結果は、１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メ
トキシエルゴリンが前記変性モデル（培養した運動ニューロンから栄養因子を取
り除くことで誘発）で神経栄養効果を及ぼしそして更に星状細胞による前記神経
栄養因子の産出を刺激することを示唆している。

【００２１】 本発明は、また、１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メト
キシエルゴリンを運動ニューロン病、特に筋委縮性側索硬化症、進行性脊髄筋萎
縮、小児筋萎縮および原発性側索硬化症の予防および／または治療で用いられる
薬剤を製造する目的で用いることにも関する。

【００２２】 １，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエルゴリンの
製造はフランス特許第２６１６７８８号に記述されている方法を用いて実施可能
である。

【００２３】 そのような薬剤に少なくとも１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１
０α−メトキシエルゴリンを高純度の状態または薬学的に適合していて不活性で
あるか或は生理学的活性を示す他の任意製品と組み合わせた組成物の形態で含め
る。本発明に従う薬剤は特に経口または非経口で使用可能である。

【００２４】 経口投与用固体状組成物として錠剤、ピル、粉剤（ゼラチンカプセルおよび錠
剤）、経口用凍結乾燥品［Ｌｙｏｃ（商標）］または顆粒を用いることができる
。このような組成物では、活性素を１種以上の不活性希釈剤、例えば澱粉、酒石
酸、アラビアゴム、サッカリンナトリウム、バニリン、セルロース、スクロース
、ラクトースまたはシリカなどと一緒にアルゴン流下で混合する。このような組
成物にまた希釈剤以外の物質、例えば１種以上の滑剤、例えばステアリン酸マグ
ネシウムまたはタルクなど、染料、コーティング（糖衣錠剤）またはワニスなど
を含めることも可能である。

【００２５】 不活性希釈剤、例えば水、エタノール、グリセロール、植物油またはパラフィ
ン油などを含有する薬学的に受け入れられる溶液、懸濁液、乳液、シロップおよ
びエリキシルを経口投与用液状組成物として用いることができる。このような組
成物に希釈剤以外の物質、例えば湿潤用、甘味用、増粘用、香気用または安定化
用製品を含めることも可能である。

【００２６】 非経口投与用無菌組成物は好適には水性もしくは非水性溶液、懸濁液または乳
液であり得る。水、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、
特にオリーブ油、注射可能有機エステル、例えばオレイン酸エチルなど、または
他の適切な有機溶媒などを溶媒または媒体として用いることができる。そのよう
な組成物にまたアジュバント、特に湿潤剤、等張剤（ｉｓｏｔｏｎｉｚｉｎｇ
ａｇｅｎｔ）、乳化剤、分散剤および安定剤を含めることも可能である。殺菌は
いろいろな方法で実施可能であり、例えば無菌濾過、当該組成物への殺菌剤の添
加、照射または加熱などで実施可能である。そのような組成物をまた無菌固体組
成物の形態で調製してそれを使用時に無菌水または他の何らかの注射可能無菌媒
体に溶解させることも可能である。

【００２７】 調合実施例： カプセル：１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエル
ゴリンを１０ｍｇ、そして賦形剤としてタルク、ラクトースおよびステアリン酸
マグネシウム。 経口用凍結乾燥品：１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メト
キシエルゴリンを１０ｍｇ、そして賦形剤として酒石酸、ラクトース、アラビア
ゴム、サッカリンナトリウムおよびバニリン。 非経口使用用粉剤：１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メト
キシエルゴリンを１０ｍｇ、そして賦形剤として酒石酸およびラクトース。

【００２８】 投薬量は求められる効果、治療期間および用いられる投与経路に依存し、成人
の場合の経口による投薬量は一般に１日当たり３０から２００ｍｇであり、この
場合、１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエルゴリ
ンの単位投薬量を５から５０ｍｇの範囲にしてもよい。

【００２９】 一般的様式において、医者は治療を受けさせる被験者の体重および他の特別な
要因全部に応じて適切な投薬量を決定するであろう。

【００３０】 本発明は、また、運動ニューロン病、特に筋委縮性側索硬化症、進行性脊髄筋
萎縮、小児筋萎縮および原発性側索硬化症の予防および／または治療方法にも関
し、この方法は、１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキ
シエルゴリンを患者に投与することにある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＭ，ＥＥ，Ｇ Ｄ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＡ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 運動ニューロン病の予防および／または治療で用いられる薬
   剤を製造するための、１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メ
   トキシエルゴリンの使用。
2. 【請求項２】 筋委縮性側索硬化症、進行性脊髄筋萎縮、小児筋萎縮および
   原発性側索硬化症を予防および／または治療するための請求項１記載の使用。
3. 【請求項３】 １，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メト
   キシエルゴリンを５から５０ｍｇ含んで成る薬剤を製造するための請求項１また
   は２いずれか記載の使用。