JP2002527067A - ポリケチドまたはヘテロポリケチド化合物の酵素的合成のためのｄｎａ配列 - Google Patents
ポリケチドまたはヘテロポリケチド化合物の酵素的合成のためのｄｎａ配列Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、（１）クローニングしたSorangium cellulosumポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）生合成クラスターＤＮＡおよび（２）該クローニングしたＤＮＡのヌクレオチド配列および予測されるタンパク質コード配列からなる。本発明は、これらに限られるものではないが、（ａ）Sorangium cellulosumでのＰＫＳ産物の収量を増大させるために（たとえば、エポチロン遺伝子クラスターまたはその構成成員の増幅または遺伝子修飾により）、（ｂ）対応遺伝子クラスターまたはその構成成員を移し、ついでＰＫＳ遺伝子クラスターまたはその構成成員を増幅または遺伝子修飾することにより、異種系でのポリケチド産物の収量を増大させるために、（ｃ）ポリケチド産物の化学構造をSorangium cellulosum中でかまたは異種宿主中で修飾するために（たとえば、エポチロン遺伝子クラスターまたはその構成成員の遺伝子修飾により）、および（ｄ）他の生物でポリケチドまたは関連分子の産生に関与している遺伝子および遺伝子産物を検出するために（たとえば、ハイブリダイゼーションアッセイまたは相補アッセイにより）用いることができる。以下のコスミドおよびプラスミドのためにＤＮＡ配列および分析が提示される：−Ａ２コスミド−ｐＥＰＯｃｏｓ６領域（ｐＥＰＯｃｏｓ６とｐＥＰＯｃｏｓ７との重複）−ｐＥＰＯｃｏｓ８コスミド−Ａ５コスミド−Ｓａｕ４（１０ｋｂプラスミド）。
Description
【０００１】 （技術分野） 本発明は、細菌のSorangium cellulosumによって産生されるポリケチド（poly
ketide）またはヘテロポリケチド（heteropolyketide）化合物の酵素的合成のた
めのＤＮＡ配列に関する。
ketide）またはヘテロポリケチド（heteropolyketide）化合物の酵素的合成のた
めのＤＮＡ配列に関する。
【０００２】 （背景技術） この特許出願は、粘液細菌（myxobacterium）のSorangium cellulosumによっ
て合成されるポリケチドおよび／またはヘテロポリケチド構造の酵素的合成のた
めのＤＮＡ配列を記載する。これら化合物の幾つかは、細胞毒性、免疫抑制、抗
生物質および抗真菌的な生物学的活性を有することが知られており、なかでもエ
ポチロン（epothilones）は最もよく研究され特徴付けられている。微生物、と
りわけ粘液細菌からの大量の二次代謝産物の発酵は長時間を要する困難なプロセ
スであり、複雑さ（たとえば、汚染、生成物の低収量、困難な単離および精製）
を伴うことが多い。それゆえ、そのような発酵にはよく特徴付けられた生物を使
用するのが有利である。所望の生合成遺伝子をクローニングした後、遺伝子操作
によりそのような生物を作製し、化合物の生合成を操作することができる。同定
された配列を最適の発現ベクター中にクローニングし、ポリケチド構造を過剰産
生する組換え細胞株を作製することができる。
て合成されるポリケチドおよび／またはヘテロポリケチド構造の酵素的合成のた
めのＤＮＡ配列を記載する。これら化合物の幾つかは、細胞毒性、免疫抑制、抗
生物質および抗真菌的な生物学的活性を有することが知られており、なかでもエ
ポチロン（epothilones）は最もよく研究され特徴付けられている。微生物、と
りわけ粘液細菌からの大量の二次代謝産物の発酵は長時間を要する困難なプロセ
スであり、複雑さ（たとえば、汚染、生成物の低収量、困難な単離および精製）
を伴うことが多い。それゆえ、そのような発酵にはよく特徴付けられた生物を使
用するのが有利である。所望の生合成遺伝子をクローニングした後、遺伝子操作
によりそのような生物を作製し、化合物の生合成を操作することができる。同定
された配列を最適の発現ベクター中にクローニングし、ポリケチド構造を過剰産
生する組換え細胞株を作製することができる。
【０００３】 ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）および非リボソームペプチドシンテターゼ（
ＮＲＰＳ）は、モジュール構造（modular architecture）を特徴とする高分子で
多機能の酵素を代表する。ＰＫＳは活性化炭酸（通常、酢酸およびプロピオン酸
）を縮合させ、その結果得られる２−ケト酸中間体を脂肪酸生合成のような仕方
で段階的に還元する。各反応段階に関与するのは、炭酸を認識し、活性化し、縮
合し、ついで還元する特定のドメインである。対応モジュール中のこれらドメイ
ンの存在に依存して、すべての還元段階は最終生成物で起こりうる（Rawlings,
Nat. Prod. Reports 14, 523-556 [1997]；概説としてはChem. Rev. 97, 2463-2
760 [1997]を参照）。ポリケチドの生合成の典型例は、マクロライド系抗生物質
のエリスロマイシンである（StauntonおよびWilkinson, Chem. Rev. 97, 2611-2
630 [1997]）。
ＮＲＰＳ）は、モジュール構造（modular architecture）を特徴とする高分子で
多機能の酵素を代表する。ＰＫＳは活性化炭酸（通常、酢酸およびプロピオン酸
）を縮合させ、その結果得られる２−ケト酸中間体を脂肪酸生合成のような仕方
で段階的に還元する。各反応段階に関与するのは、炭酸を認識し、活性化し、縮
合し、ついで還元する特定のドメインである。対応モジュール中のこれらドメイ
ンの存在に依存して、すべての還元段階は最終生成物で起こりうる（Rawlings,
Nat. Prod. Reports 14, 523-556 [1997]；概説としてはChem. Rev. 97, 2463-2
760 [1997]を参照）。ポリケチドの生合成の典型例は、マクロライド系抗生物質
のエリスロマイシンである（StauntonおよびWilkinson, Chem. Rev. 97, 2611-2
630 [1997]）。
【０００４】 ＮＲＰＳもまたモジュール酵素であり、ペプチド結合によりアミノ酸を縮合し
てバシトラシンやチロシジンのような低分子量の生物学的に活性な物質とする。
これらの系の典型的なドメインはアミノ酸を活性化し、ペプチド鎖を伸長しなが
らアミノ酸を縮合させる。さらなるタンパク質ドメインによるメチル化、エピマ
ー化および修飾も可能である（StachelhausおよびMarahiel, FEMS Microbiol. L
ett. 125, 3-14 [1995]）。両タイプの酵素（ＮＲＰＳおよびＰＫＳ）ともにタ
ンパク質のモジュール構成を有しており、単一の伸長ユニットの認識、活性化、
縮合および修飾には特定の触媒ドメインが関与している。アミノ酸および／また
は炭酸の伸長鎖は、１つのユニットを付加する１つのモジュールの作用により伸
長される。各モジュールのドメインは、生合成の酵素的段階に関与する活性中心
を有している。
てバシトラシンやチロシジンのような低分子量の生物学的に活性な物質とする。
これらの系の典型的なドメインはアミノ酸を活性化し、ペプチド鎖を伸長しなが
らアミノ酸を縮合させる。さらなるタンパク質ドメインによるメチル化、エピマ
ー化および修飾も可能である（StachelhausおよびMarahiel, FEMS Microbiol. L
ett. 125, 3-14 [1995]）。両タイプの酵素（ＮＲＰＳおよびＰＫＳ）ともにタ
ンパク質のモジュール構成を有しており、単一の伸長ユニットの認識、活性化、
縮合および修飾には特定の触媒ドメインが関与している。アミノ酸および／また
は炭酸の伸長鎖は、１つのユニットを付加する１つのモジュールの作用により伸
長される。各モジュールのドメインは、生合成の酵素的段階に関与する活性中心
を有している。
【０００５】 粘液細菌からの生物学的に活性なポリケチドおよびポリペプチドの生合成につ
いては殆どわかっていない。ソラフェン（soraphen）およびサフラマイシンの生
合成遺伝子クラスターの断片が、Sorangium cellulosum So ce26およびMyxococc
us xanthusからのものがそれぞれ記載されている（Schuppら、J. Bacteriol. 17
7, 3673-3679 [1995]およびPospiechら、Microbiology 141, 1793-1803 [1995]
）。本発明者らは、エポチロン産生菌であるSorangium cellulosum So ce90のゲ
ノムライブラリーを構築した。ＰＫＳ遺伝子およびＰＳ遺伝子に基づく遺伝子プ
ローブを用いて組換えコスミドを単離し、ついでこれらをシークエンシングし、
特徴付けた。ＰＫＳ、ＰＳあるは両タイプの遺伝子の組合せを含む幾つかの独特
の経路が同定され、この生物が新規な生物学的に活性な化合物の豊かな採取源と
なる可能性が示された。
いては殆どわかっていない。ソラフェン（soraphen）およびサフラマイシンの生
合成遺伝子クラスターの断片が、Sorangium cellulosum So ce26およびMyxococc
us xanthusからのものがそれぞれ記載されている（Schuppら、J. Bacteriol. 17
7, 3673-3679 [1995]およびPospiechら、Microbiology 141, 1793-1803 [1995]
）。本発明者らは、エポチロン産生菌であるSorangium cellulosum So ce90のゲ
ノムライブラリーを構築した。ＰＫＳ遺伝子およびＰＳ遺伝子に基づく遺伝子プ
ローブを用いて組換えコスミドを単離し、ついでこれらをシークエンシングし、
特徴付けた。ＰＫＳ、ＰＳあるは両タイプの遺伝子の組合せを含む幾つかの独特
の経路が同定され、この生物が新規な生物学的に活性な化合物の豊かな採取源と
なる可能性が示された。
【０００６】 （発明の開示） それゆえ、本発明の目的は請求項１に記載のＤＮＡ配列を提供することであり
、その発現産物はポリケチドまたはヘテロポリケチド化合物の酵素的生合成、変
異合成（mutasynthesis）または部分合成を行っているかまたは関与している。
これらＤＮＡ配列は分子生物学の通常の技術によりよく知られかつ最適の発現ベ
クター中に挿入でき、かくして細胞の形質転換、選択およびクローニングが可能
となり、ついで該細胞を発酵させることによりポリケチドまたはヘテロポリケチ
ド化合物を合成することができる。過剰に産生するクローンを使用することによ
り、所望のポリケチドまたはヘテロポリケチド化合物を容易に産生し大量に回収
することができる。さらに、調節ＤＮＡセグメントおよび個々の構造遺伝子の配
置（localization）の知見は、遺伝子操作のための通常の技術を用いた「部位特
異的な突然変異誘発」を可能とし、かくしてポリケチドまたはヘテロポリケチド
化合物の発酵合成のために最適化された酵素が構築できる（「プロテインエンジ
ニアリング」）。
、その発現産物はポリケチドまたはヘテロポリケチド化合物の酵素的生合成、変
異合成（mutasynthesis）または部分合成を行っているかまたは関与している。
これらＤＮＡ配列は分子生物学の通常の技術によりよく知られかつ最適の発現ベ
クター中に挿入でき、かくして細胞の形質転換、選択およびクローニングが可能
となり、ついで該細胞を発酵させることによりポリケチドまたはヘテロポリケチ
ド化合物を合成することができる。過剰に産生するクローンを使用することによ
り、所望のポリケチドまたはヘテロポリケチド化合物を容易に産生し大量に回収
することができる。さらに、調節ＤＮＡセグメントおよび個々の構造遺伝子の配
置（localization）の知見は、遺伝子操作のための通常の技術を用いた「部位特
異的な突然変異誘発」を可能とし、かくしてポリケチドまたはヘテロポリケチド
化合物の発酵合成のために最適化された酵素が構築できる（「プロテインエンジ
ニアリング」）。
【０００７】 それゆえ、本発明はさらに、請求項１６に記載の組換え発現ベクター、請求項
１７に記載の該組換え発現ベクターで形質転換した細胞、および請求項２３に記
載のポリケチドまたはヘテロポリケチド化合物の酵素的生合成、変異合成または
部分合成の方法に関する。 本発明の好ましいおよび／または有利な態様は、従属請求項に記載のものであ
る。
１７に記載の該組換え発現ベクターで形質転換した細胞、および請求項２３に記
載のポリケチドまたはヘテロポリケチド化合物の酵素的生合成、変異合成または
部分合成の方法に関する。 本発明の好ましいおよび／または有利な態様は、従属請求項に記載のものであ
る。
【０００８】 簡単には、本発明は、（１）クローニングしたSorangium cellulosumポリケチ
ドシンターゼ（ＰＫＳ）および／またはペプチドシンテターゼ（ＰＳ）生合成ク
ラスターＤＮＡおよび（２）該クローニングしたＤＮＡのヌクレオチド配列およ
び予測されるタンパク質コード配列からなる。本発明は、たとえば、これらに限
られるものではないが、（ａ）Sorangium cellulosumでのＰＫＳ産物の収量を増
大させるために（たとえば、エポチロン遺伝子クラスターまたはその構成成員の
増幅または遺伝子修飾により）、（ｂ）対応遺伝子クラスターまたはその構成成
員を移し、ついでＰＫＳおよび／またはＰＳ遺伝子クラスターまたはその構成成
員を増幅または遺伝子修飾することにより、異種系でのポリケチドおよび／また
はペプチドシンテターゼ産物の収量を増大させるために、（ｃ）ポリケチドおよ
び／またはペプチドシンテターゼ産物の化学構造をSorangium cellulosum中でか
または異種宿主中で修飾するために、および（ｄ）他の生物でポリケチドまたは
関連分子の産生に関与している遺伝子および遺伝子産物を検出するために（たと
えば、ハイブリダイゼーションアッセイまたは相補アッセイにより）用いること
ができる。
ドシンターゼ（ＰＫＳ）および／またはペプチドシンテターゼ（ＰＳ）生合成ク
ラスターＤＮＡおよび（２）該クローニングしたＤＮＡのヌクレオチド配列およ
び予測されるタンパク質コード配列からなる。本発明は、たとえば、これらに限
られるものではないが、（ａ）Sorangium cellulosumでのＰＫＳ産物の収量を増
大させるために（たとえば、エポチロン遺伝子クラスターまたはその構成成員の
増幅または遺伝子修飾により）、（ｂ）対応遺伝子クラスターまたはその構成成
員を移し、ついでＰＫＳおよび／またはＰＳ遺伝子クラスターまたはその構成成
員を増幅または遺伝子修飾することにより、異種系でのポリケチドおよび／また
はペプチドシンテターゼ産物の収量を増大させるために、（ｃ）ポリケチドおよ
び／またはペプチドシンテターゼ産物の化学構造をSorangium cellulosum中でか
または異種宿主中で修飾するために、および（ｄ）他の生物でポリケチドまたは
関連分子の産生に関与している遺伝子および遺伝子産物を検出するために（たと
えば、ハイブリダイゼーションアッセイまたは相補アッセイにより）用いること
ができる。
【０００９】 以下のコスミドおよびプラスミドのためにＤＮＡ配列および分析が提示される
： −請求項６に記載のＡ２コスミド −請求項７に記載のｐＥＰＯｃｏｓ６領域（ｐＥＰＯｃｏｓ６とｐＥＰＯｃｏｓ
７との重複） −請求項１０に記載のｐＥＰＯｃｏｓ８コスミド −請求項１２に記載のＡ５コスミド −請求項１４に記載のＳａｕ４（１０ｋｂプラスミド）
： −請求項６に記載のＡ２コスミド −請求項７に記載のｐＥＰＯｃｏｓ６領域（ｐＥＰＯｃｏｓ６とｐＥＰＯｃｏｓ
７との重複） −請求項１０に記載のｐＥＰＯｃｏｓ８コスミド −請求項１２に記載のＡ５コスミド −請求項１４に記載のＳａｕ４（１０ｋｂプラスミド）
【００１０】 つぎに、本発明を実施例によりさらに詳細に記載するが、あくまでも説明のた
めであって本発明の範囲を限定することを意図するものではない。 Ａ２コスミドからのＤＮＡ配列データを請求項６に記載する。 表１は、Ａ２コスミド上に認められるＯＲＦ１〜１６を各生物学的機能（レギ
ュレーター、酵素）と関連付けたものである。 表１
めであって本発明の範囲を限定することを意図するものではない。 Ａ２コスミドからのＤＮＡ配列データを請求項６に記載する。 表１は、Ａ２コスミド上に認められるＯＲＦ１〜１６を各生物学的機能（レギ
ュレーター、酵素）と関連付けたものである。 表１
【００１１】実施例 Ａ．Sorangium cellulosumコスミドライブラリーの構築 １．S. cellulosum So ce90からのゲノムＤＮＡの単離 ａ．Sorangium cellulosum So ce90を固形ＣＡ−２アガー上に広げ、３０℃で５
〜７日間インキュベートした。ＣＡ−２アガーは、１８ｇのバクト−アガー（Di
fco Laboratories、デトロイト、ミシガン）を８００ｍｌのｄＨ２Ｏ中、１２１
℃で２０分間オートクレーブにかけ、水浴中で５０〜５５℃に冷却することによ
り調製する。下記濾過滅菌溶液をアガーに加える：２０％（ｗ／ｖ）グルコース
、５０ｍｌ；溶液Ａ（７.５％［ｗ／ｖ］ＫＮＯ３、７.５％Ｋ２ＨＰＯ４）、１
０ｍｌ；溶液Ｂ（１.５％［ｗ／ｖ］ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）、１０ｍｌ；溶液
Ｃ（０.２％［ｗ／ｖ］ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０.１５％［ｗ／ｖ］ＦｅＣｌ３ ）、１０ｍｌ；１Ｍ ＨＣｌ、１ｍｌ；オートクレーブして４日経ったSorangium
cellulosumブロス、１００ｍｌ。
〜７日間インキュベートした。ＣＡ−２アガーは、１８ｇのバクト−アガー（Di
fco Laboratories、デトロイト、ミシガン）を８００ｍｌのｄＨ２Ｏ中、１２１
℃で２０分間オートクレーブにかけ、水浴中で５０〜５５℃に冷却することによ
り調製する。下記濾過滅菌溶液をアガーに加える：２０％（ｗ／ｖ）グルコース
、５０ｍｌ；溶液Ａ（７.５％［ｗ／ｖ］ＫＮＯ３、７.５％Ｋ２ＨＰＯ４）、１
０ｍｌ；溶液Ｂ（１.５％［ｗ／ｖ］ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）、１０ｍｌ；溶液
Ｃ（０.２％［ｗ／ｖ］ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０.１５％［ｗ／ｖ］ＦｅＣｌ３ ）、１０ｍｌ；１Ｍ ＨＣｌ、１ｍｌ；オートクレーブして４日経ったSorangium
cellulosumブロス、１００ｍｌ。
【００１２】 菌体の試料を滅菌ループを用いてプレートから取り出し、２５０ｍｌ容エーレ
ンマイヤーフラスコに入れた５０ｍｌのＧ５１ｔ培地に接種した。Ｇ５１ｔは、
０.５％デンプン（Cerestar）、０.２％トリプトン、０.１％酵母エキス、０.０
５％ＣａＣｌ２、０.０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１.２％ ４−(２−ヒドロキ
シエチル)−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、０.２％グルコー
ス、ｐＨ７.６からなる。フラスコを、密集したオレンジ色の細菌増殖が得られ
るまで（約５〜７日）３０℃、１６０ｒｐｍにて振盪した。菌体を６,０００×
ｇで遠心分離することによりペレット化し、直ちに用いるか、または−２０℃で
凍結貯蔵した。
ンマイヤーフラスコに入れた５０ｍｌのＧ５１ｔ培地に接種した。Ｇ５１ｔは、
０.５％デンプン（Cerestar）、０.２％トリプトン、０.１％酵母エキス、０.０
５％ＣａＣｌ２、０.０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１.２％ ４−(２−ヒドロキ
シエチル)−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、０.２％グルコー
ス、ｐＨ７.６からなる。フラスコを、密集したオレンジ色の細菌増殖が得られ
るまで（約５〜７日）３０℃、１６０ｒｐｍにて振盪した。菌体を６,０００×
ｇで遠心分離することによりペレット化し、直ちに用いるか、または−２０℃で
凍結貯蔵した。
【００１３】 ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）を用いて菌体から
染色体ＤＮＡを単離するのに用いたプロトコールは以前に記載されている（Ausu
belら、Current Protocols in Molecular Biology、ジョン・ウィリー・アンド
・サンズ、ニューヨーク、１９９０）。沈殿したＤＮＡを曲がったパスツールピ
ペットで回収し、７０％および９５％のエタノールで洗浄し、空気乾燥し、０.
５ｍｌのＴＥ緩衝液（０.０１Ｍトリス−ＨＣｌ、０.００１Ｍエチレンジアミン
四酢酸［ＥＤＴＡ］、ｐＨ８.０）に再懸濁した。
染色体ＤＮＡを単離するのに用いたプロトコールは以前に記載されている（Ausu
belら、Current Protocols in Molecular Biology、ジョン・ウィリー・アンド
・サンズ、ニューヨーク、１９９０）。沈殿したＤＮＡを曲がったパスツールピ
ペットで回収し、７０％および９５％のエタノールで洗浄し、空気乾燥し、０.
５ｍｌのＴＥ緩衝液（０.０１Ｍトリス−ＨＣｌ、０.００１Ｍエチレンジアミン
四酢酸［ＥＤＴＡ］、ｐＨ８.０）に再懸濁した。
【００１４】 ｂ．別法として、Midi Qiagen Blood & Cell Culture ＤＮＡ精製キット（Qiage
n、ヒルデン、ドイツ）を用い、細菌ＤＮＡの単離のためのQiagenゲノムＤＮＡ
ハンドブックプロトコール（１９９７、Qiagen、ヒルデン、ドイツ、２９頁以下
）に従って、セクションＡ.１の記載と同様にして培養したS. cellulosum菌体か
らゲノムＤＮＡを単離した。高分子量の染色体ＤＮＡを得るため、沈殿したＤＮ
ＡをセクションＡ.１の記載と同様にして曲がったパスツールピペットで回収し
た。
n、ヒルデン、ドイツ）を用い、細菌ＤＮＡの単離のためのQiagenゲノムＤＮＡ
ハンドブックプロトコール（１９９７、Qiagen、ヒルデン、ドイツ、２９頁以下
）に従って、セクションＡ.１の記載と同様にして培養したS. cellulosum菌体か
らゲノムＤＮＡを単離した。高分子量の染色体ＤＮＡを得るため、沈殿したＤＮ
ＡをセクションＡ.１の記載と同様にして曲がったパスツールピペットで回収し
た。
【００１５】２．プラスミドＤＮＡの単離 ａ．ｐＦＤ６６６：ｐＦＤ６６６は、２機能性の大腸菌−Streptomycesコスミド
クローニングベクターである（DenisおよびBrzezinski, Gene 111, 115-118 [19
92]を参照）。大きな挿入物の安定性を維持するため、大腸菌で複製させたとき
に低−中位のコピー数で存在する。この理由から、クローニング実験を行うため
に充分な純粋なＤＮＡを単離することは標準プロトコールの市販のキットでは困
難であった。それゆえ、ｐＦＤ６６６ ＤＮＡを得るために改変した手順を用い
た。ＤＨ１０Ｂ（ｐＦＤ６６６）の１０ｍｌの培養液を、５０μｇ／ｍｌの硫酸
カナマイシンを含有するＬＢ（１％トリプトン、０.５％酵母エキス、０.５％Ｎ
ａＣｌ、ｐＨ７.０）培地で３７℃にて２０時間増殖させた。５０μｌのＬＢ＋
カナマイシンを開始時のＯＤ６００が約０.２５で接種し、ＯＤ６００が約０.６
に達するまで３７℃、３００ｒｐｍにて振盪した。この培養液２５ｍｌを２Ｌ容
のフラスコに入れた５００ｍｌのＬＢ＋カナマイシンに接種し、同じ条件下で２
.５時間インキュベートした。
クローニングベクターである（DenisおよびBrzezinski, Gene 111, 115-118 [19
92]を参照）。大きな挿入物の安定性を維持するため、大腸菌で複製させたとき
に低−中位のコピー数で存在する。この理由から、クローニング実験を行うため
に充分な純粋なＤＮＡを単離することは標準プロトコールの市販のキットでは困
難であった。それゆえ、ｐＦＤ６６６ ＤＮＡを得るために改変した手順を用い
た。ＤＨ１０Ｂ（ｐＦＤ６６６）の１０ｍｌの培養液を、５０μｇ／ｍｌの硫酸
カナマイシンを含有するＬＢ（１％トリプトン、０.５％酵母エキス、０.５％Ｎ
ａＣｌ、ｐＨ７.０）培地で３７℃にて２０時間増殖させた。５０μｌのＬＢ＋
カナマイシンを開始時のＯＤ６００が約０.２５で接種し、ＯＤ６００が約０.６
に達するまで３７℃、３００ｒｐｍにて振盪した。この培養液２５ｍｌを２Ｌ容
のフラスコに入れた５００ｍｌのＬＢ＋カナマイシンに接種し、同じ条件下で２
.５時間インキュベートした。
【００１６】 クロラムフェニコール（１００％ＥｔＯＨ中の３４ｍｇ／ｍｌ溶液を２.５ｍ
ｌ）を加え、インキュベーションをさらに１６〜２０時間続けた。（それ以前の
工程はManiatisら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、コールド・スプ
リングス・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニュー
ヨーク、１９８９に従って行った）菌体を１０分間、１６,０００×ｇでペレッ
ト化した。ペレット化した菌体を９ｍｌの５０ｍＭグルコース／２５ｍＭトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）／１０ｍＭ ＥＤＴＡ中に再浮遊させ、５０ｍｌ容の使い
捨て遠心管に移した。１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.０中の新たに調製した
１０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム溶液１ｍｌを加え、菌体の浮遊液を３７℃の水浴で
１０分間インキュベートした。２０ｍｌの新たに調製した０.２ ＮａＯＨ／１％
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液を加え、遠心管を５〜７回穏やかに逆さ
にして内容物を混合した。
ｌ）を加え、インキュベーションをさらに１６〜２０時間続けた。（それ以前の
工程はManiatisら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、コールド・スプ
リングス・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニュー
ヨーク、１９８９に従って行った）菌体を１０分間、１６,０００×ｇでペレッ
ト化した。ペレット化した菌体を９ｍｌの５０ｍＭグルコース／２５ｍＭトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）／１０ｍＭ ＥＤＴＡ中に再浮遊させ、５０ｍｌ容の使い
捨て遠心管に移した。１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.０中の新たに調製した
１０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム溶液１ｍｌを加え、菌体の浮遊液を３７℃の水浴で
１０分間インキュベートした。２０ｍｌの新たに調製した０.２ ＮａＯＨ／１％
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液を加え、遠心管を５〜７回穏やかに逆さ
にして内容物を混合した。
【００１７】 室温で５分後、１５ｍｌの５Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ４.８）を加え、遠心管を
３〜４回素早く逆さにした。遠心管を６,０００×ｇ、４℃にて１０分間遠心分
離にかけ、上澄み液を２層の滅菌チーズクロスを通して新たな５０ｍｌ容の使い
捨て遠心管中に注いだ。イソプロパノールを最終濃度０.６％にて加え、遠心管
の中身を数回混合した。沈殿した核酸を６,０００×ｇ、４℃にて１０分間遠心
分離にかけた。ペレットを７０％ＥｔＯＨで洗浄し、過剰のＥｔＯＨをペレット
から吸引除去し、ペレットを５分間空気乾燥させた。これを５ｍｌの５０ｍＭ
３−(Ｎ−モルホリノ)プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）／７５０ｍＭ ＮａＣｌ
、ｐＨ７.０中に再懸濁し、平衡化したQIAfilter Midiカラム（Qiagen、チャッ
ツワース、カリフォルニア）に加えた。プラスミドＤＮＡの洗浄および溶出は、
製造業者のプロトコールに従った。 ｂ．ＳｕｐｅｒＣｏｓ：ＳｕｐｅｒＣｏｓプラスミドＤＮＡをStratagene（ラジ
ョラ、カリフォルニア）から購入した。
３〜４回素早く逆さにした。遠心管を６,０００×ｇ、４℃にて１０分間遠心分
離にかけ、上澄み液を２層の滅菌チーズクロスを通して新たな５０ｍｌ容の使い
捨て遠心管中に注いだ。イソプロパノールを最終濃度０.６％にて加え、遠心管
の中身を数回混合した。沈殿した核酸を６,０００×ｇ、４℃にて１０分間遠心
分離にかけた。ペレットを７０％ＥｔＯＨで洗浄し、過剰のＥｔＯＨをペレット
から吸引除去し、ペレットを５分間空気乾燥させた。これを５ｍｌの５０ｍＭ
３−(Ｎ−モルホリノ)プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）／７５０ｍＭ ＮａＣｌ
、ｐＨ７.０中に再懸濁し、平衡化したQIAfilter Midiカラム（Qiagen、チャッ
ツワース、カリフォルニア）に加えた。プラスミドＤＮＡの洗浄および溶出は、
製造業者のプロトコールに従った。 ｂ．ＳｕｐｅｒＣｏｓ：ＳｕｐｅｒＣｏｓプラスミドＤＮＡをStratagene（ラジ
ョラ、カリフォルニア）から購入した。
【００１８】３．S. cellulosum染色体ＤＮＡの約３８〜４７ｋｂ Ｓａｕ３Ａ１断片の調製 ａ．セクションＡ.１.ａの記載に従って調製したS. cellulosumの染色体ＤＮＡ
を、５０μｇの染色体ＤＮＡ、５単位の酵素（Promega、マジソン、ウイスコン
シン）、０.００６Ｍのトリス−ＨＣｌ、０.００６ＭのＭｇＣｌ２、０.１０Ｍ
のＮａＣｌ、および０.００１Ｍのジチオトレイトールからなる１０００μｌの
反応容量（ｐＨ７.５）中、３７℃にて５分間、制限エンドヌクレアーゼＳａｕ
３Ａ１で部分開裂した。反応混合物を等容量の１：１フェノール：クロロホルム
で１回抽出した。遠心分離後、上層の水性相を取り、これに０.１容量の３Ｍ酢
酸ナトリウムおよび０.６容量のイソプロパノールを加えた。ミクロ遠心管中で
１６,０００×ｇで５分間遠心分離することによりＤＮＡをペレット化し、０.５
ｍｌの７０％ＥｔＯＨで１回洗浄した。SpeedVac（Savant Instruments、ファー
ミングデール、ニューヨーク）中で５分間乾燥させた後、ペレットを０.１ｍｌ
のＴＥ緩衝液中に再懸濁した。ＤＮＡをＴＥ緩衝液中で調製した１２ｍｌの１０
〜４０％ショ糖勾配の上部に重層し、Beckman SW40Tiローター（Beckman Instru
ments、パロアルト、カリフォルニア）を用いて１１３,６００×ｇ、１０℃にて
１６時間遠心分離にかけた。勾配の５００μｌのアリコートを、ピペッターを遠
心管の上部から開始して用いて取り出した。
を、５０μｇの染色体ＤＮＡ、５単位の酵素（Promega、マジソン、ウイスコン
シン）、０.００６Ｍのトリス−ＨＣｌ、０.００６ＭのＭｇＣｌ２、０.１０Ｍ
のＮａＣｌ、および０.００１Ｍのジチオトレイトールからなる１０００μｌの
反応容量（ｐＨ７.５）中、３７℃にて５分間、制限エンドヌクレアーゼＳａｕ
３Ａ１で部分開裂した。反応混合物を等容量の１：１フェノール：クロロホルム
で１回抽出した。遠心分離後、上層の水性相を取り、これに０.１容量の３Ｍ酢
酸ナトリウムおよび０.６容量のイソプロパノールを加えた。ミクロ遠心管中で
１６,０００×ｇで５分間遠心分離することによりＤＮＡをペレット化し、０.５
ｍｌの７０％ＥｔＯＨで１回洗浄した。SpeedVac（Savant Instruments、ファー
ミングデール、ニューヨーク）中で５分間乾燥させた後、ペレットを０.１ｍｌ
のＴＥ緩衝液中に再懸濁した。ＤＮＡをＴＥ緩衝液中で調製した１２ｍｌの１０
〜４０％ショ糖勾配の上部に重層し、Beckman SW40Tiローター（Beckman Instru
ments、パロアルト、カリフォルニア）を用いて１１３,６００×ｇ、１０℃にて
１６時間遠心分離にかけた。勾配の５００μｌのアリコートを、ピペッターを遠
心管の上部から開始して用いて取り出した。
【００１９】 これら画分の試料（５μｌ）を０.５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する
ＴＡＥ緩衝液（０.０４ＭのTrizma塩基、０.０２Ｍの酢酸、および０.００１Ｍ
のＥＤＴＡ、ｐＨ８.３）中の０.５％アガロースゲルに１００Ｖで６時間、電気
泳動にかけて分析した。約４０〜４５ｋｂのＤＮＡ断片を含む画分は、高分子量
のＤＮＡ標準（Life Technologies、ゲイサーズバーグ、メリーランド）と比較
することにより同定した。０.５容量のＴＥを加えることによりショ糖を対応の
０.５ｍｌ画分から希釈した。ついで、０.１容量の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび０
.６容量のイソプロパノールを加えてＤＮＡを沈殿させた。ミクロ遠心管中、１
６,０００×ｇにて１０分間遠心分離にかけてＤＮＡをペレット化した。ＤＮＡ
を０.５ｍｌの７０％ＥｔＯＨで洗浄し、SpeedVac中で中位の加熱にて１０分間
乾燥させた。最後にＤＮＡを蒸留水中に０.５μｇ／ｍｌの濃度で再懸濁した。
ＴＡＥ緩衝液（０.０４ＭのTrizma塩基、０.０２Ｍの酢酸、および０.００１Ｍ
のＥＤＴＡ、ｐＨ８.３）中の０.５％アガロースゲルに１００Ｖで６時間、電気
泳動にかけて分析した。約４０〜４５ｋｂのＤＮＡ断片を含む画分は、高分子量
のＤＮＡ標準（Life Technologies、ゲイサーズバーグ、メリーランド）と比較
することにより同定した。０.５容量のＴＥを加えることによりショ糖を対応の
０.５ｍｌ画分から希釈した。ついで、０.１容量の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび０
.６容量のイソプロパノールを加えてＤＮＡを沈殿させた。ミクロ遠心管中、１
６,０００×ｇにて１０分間遠心分離にかけてＤＮＡをペレット化した。ＤＮＡ
を０.５ｍｌの７０％ＥｔＯＨで洗浄し、SpeedVac中で中位の加熱にて１０分間
乾燥させた。最後にＤＮＡを蒸留水中に０.５μｇ／ｍｌの濃度で再懸濁した。
【００２０】 ｂ．別法として、Ａ.１.ｂの記載と同様にして調製した１０μｇのS. cellulosu
m染色体ＤＮＡを、供給者の推奨する４００μｌの反応緩衝液中、３７℃にて１
時間、０.３ＵのＳａｕ３Ａ１（New England Biolabs、ビバリー、マサチューセ
ッツ）で処理した。サイズが約４０ｋｂのＤＮＡ断片の生成は、０.３％アガロ
ースゲル電気泳動後に高分子量ＤＮＡ標準と移動度の挙動を比較することにより
チェックした。等容量のフェノール：クロロホルム（１：１）を加え、混合し、
遠心分離にかけた。上部の水性相を回収し、０.１容量の３Ｍ酢酸ナトリウムお
よび０.６容量のイソプロパノールを加えた。遠心分離後、沈殿したＤＮＡを０.
５ｍｌの７０％氷冷エタノールで洗浄し、最後に空気乾燥した。ＤＮＡ断片を１
００μｌのエビ（shrimp）アルカリホスファターゼ反応緩衝液中に再懸濁し、２
Ｕのエビアルカリホスファターゼ（Amersham Life Science、クリーブランド、
オハイオ）を用いて３７℃で１５０分間脱リン酸化した。ついで、上記のように
フェノール：クロロホルム抽出を行った。最後に０.１容量の３Ｍ酢酸ナトリウ
ムおよび０.６容量のイソプロパノールを加えてＤＮＡを沈殿させ、乾燥し、Ｔ
Ｅ緩衝液に溶解した。
m染色体ＤＮＡを、供給者の推奨する４００μｌの反応緩衝液中、３７℃にて１
時間、０.３ＵのＳａｕ３Ａ１（New England Biolabs、ビバリー、マサチューセ
ッツ）で処理した。サイズが約４０ｋｂのＤＮＡ断片の生成は、０.３％アガロ
ースゲル電気泳動後に高分子量ＤＮＡ標準と移動度の挙動を比較することにより
チェックした。等容量のフェノール：クロロホルム（１：１）を加え、混合し、
遠心分離にかけた。上部の水性相を回収し、０.１容量の３Ｍ酢酸ナトリウムお
よび０.６容量のイソプロパノールを加えた。遠心分離後、沈殿したＤＮＡを０.
５ｍｌの７０％氷冷エタノールで洗浄し、最後に空気乾燥した。ＤＮＡ断片を１
００μｌのエビ（shrimp）アルカリホスファターゼ反応緩衝液中に再懸濁し、２
Ｕのエビアルカリホスファターゼ（Amersham Life Science、クリーブランド、
オハイオ）を用いて３７℃で１５０分間脱リン酸化した。ついで、上記のように
フェノール：クロロホルム抽出を行った。最後に０.１容量の３Ｍ酢酸ナトリウ
ムおよび０.６容量のイソプロパノールを加えてＤＮＡを沈殿させ、乾燥し、Ｔ
Ｅ緩衝液に溶解した。
【００２１】４．コスミドライブラリーの調製 ａ．ｐＦＤ６６６を用いて：ベクターｐＦＤ６６６を、２μｇのプラスミドＤＮ
Ａ、１０単位のＢａｍＨＩ（Promega）、０.００６Ｍのトリス−ＨＣｌ、０.０
０６ＭのＭｇＣｌ２、０.０５ＭのＮａＣｌ、および０.００１Ｍのジチオトレイ
トールからなる０.０２ｍｌの反応容量（ｐＨ７.５）中、３７℃で９０分間、制
限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで開裂した。５μｌの１０×アルカリホスファ
ターゼ緩衝液（０.５Ｍのトリス−ＨＣｌ［ｐＨ９.３］、０.０１ＭのＭｇＣｌ
２、０.００１ＭのＺｎＣｌ２、０.０１Ｍのスペルミジン）を反応液に加え、つ
いでアルカリホスファターゼ（０.０１単位／ピコモル最終；Promega）および蒸
留水を最終容量０.０５ｍｌで加えた。
Ａ、１０単位のＢａｍＨＩ（Promega）、０.００６Ｍのトリス−ＨＣｌ、０.０
０６ＭのＭｇＣｌ２、０.０５ＭのＮａＣｌ、および０.００１Ｍのジチオトレイ
トールからなる０.０２ｍｌの反応容量（ｐＨ７.５）中、３７℃で９０分間、制
限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで開裂した。５μｌの１０×アルカリホスファ
ターゼ緩衝液（０.５Ｍのトリス−ＨＣｌ［ｐＨ９.３］、０.０１ＭのＭｇＣｌ
２、０.００１ＭのＺｎＣｌ２、０.０１Ｍのスペルミジン）を反応液に加え、つ
いでアルカリホスファターゼ（０.０１単位／ピコモル最終；Promega）および蒸
留水を最終容量０.０５ｍｌで加えた。
【００２２】 試料を３７℃にて３０分間インキュベートし、ホスファターゼの第二のアリコ
ートを加えた。さらに３７℃で３０分後、０.３ｍｌの停止緩衝液（０.０１Ｍの
トリス−ＨＣｌ［ｐＨ７.５］、０.００１ＭのＥＤＴＡ、０.２ＭのＮａＣｌ、
０.５％のＳＤＳ）および０.３５ｍｌの１：１フェノール：ＣＨＣｌ３を反応液
に加えた。試料を数回、逆さにして穏やかに混合し、１６,０００×ｇで３分間
遠心分離にかけて相を分離した。水性層を取り出して新たな遠心管に入れた。０
.１容量の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２容量の１００％ＥｔＯＨを加え、沈殿し
たＤＮＡを１６,０００×ｇで１０分間遠心分離にかけることによりペレット化
した。液体を吸引除去し、ペレットを０.５ｍｌの７０％ＥｔＯＨで１回洗浄し
た。ＤＮＡをSpeedVac中で乾燥させ、ＴＥ緩衝液に０.５ｍｇ／ｍｌに再懸濁し
た。
ートを加えた。さらに３７℃で３０分後、０.３ｍｌの停止緩衝液（０.０１Ｍの
トリス−ＨＣｌ［ｐＨ７.５］、０.００１ＭのＥＤＴＡ、０.２ＭのＮａＣｌ、
０.５％のＳＤＳ）および０.３５ｍｌの１：１フェノール：ＣＨＣｌ３を反応液
に加えた。試料を数回、逆さにして穏やかに混合し、１６,０００×ｇで３分間
遠心分離にかけて相を分離した。水性層を取り出して新たな遠心管に入れた。０
.１容量の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２容量の１００％ＥｔＯＨを加え、沈殿し
たＤＮＡを１６,０００×ｇで１０分間遠心分離にかけることによりペレット化
した。液体を吸引除去し、ペレットを０.５ｍｌの７０％ＥｔＯＨで１回洗浄し
た。ＤＮＡをSpeedVac中で乾燥させ、ＴＥ緩衝液に０.５ｍｇ／ｍｌに再懸濁し
た。
【００２３】 消化しホスファターゼ処理したｐＦＤ６６６を、１μｇのｐＦＤ６６６、１μ
ｇのS. cellulosum ＤＮＡ、０.０３Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.８）、０.０
１ＭのＭｇＣｌ２、０.０１Ｍのジチオトレイトール、および０.０００５Ｍのア
デノシン−５'−三リン酸および１.５Weiss単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Promega
）からなる０.００５ｍｌの反応液中、部分的に開裂した染色体ＤＮＡ（セクシ
ョンＡ.３.ａおよびＢ.１.ａを参照）にライゲートした。反応は室温で２時間行
った。全反応液を、Packagene抽出（Promega）を用い、製造業者の指示に従って
バクテリオファージλ中にインビトロでパッケージングした。全パッケージング
反応液（０.５ｍｌ）を４.５ｍｌのＳＭ緩衝液（１リットル当たり：５.８ｇの
ＮａＣｌ、２ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１Ｍのトリス−ＨＣｌ［ｐＨ７.５］
、５ｍｌの２％ゼラチン溶液）で希釈した。
ｇのS. cellulosum ＤＮＡ、０.０３Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.８）、０.０
１ＭのＭｇＣｌ２、０.０１Ｍのジチオトレイトール、および０.０００５Ｍのア
デノシン−５'−三リン酸および１.５Weiss単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Promega
）からなる０.００５ｍｌの反応液中、部分的に開裂した染色体ＤＮＡ（セクシ
ョンＡ.３.ａおよびＢ.１.ａを参照）にライゲートした。反応は室温で２時間行
った。全反応液を、Packagene抽出（Promega）を用い、製造業者の指示に従って
バクテリオファージλ中にインビトロでパッケージングした。全パッケージング
反応液（０.５ｍｌ）を４.５ｍｌのＳＭ緩衝液（１リットル当たり：５.８ｇの
ＮａＣｌ、２ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１Ｍのトリス−ＨＣｌ［ｐＨ７.５］
、５ｍｌの２％ゼラチン溶液）で希釈した。
【００２４】 ０.０１ＭのＭｇＳＯ４および０.２％のマルトースを含有するＬＢ培地で増殖
させた大腸菌ＤＨ５αの一夜培養液１０ｍｌを希釈したファージに加え、３７℃
で２０分間インキュベートすることによりトランスフェクションを行った。０.
８ｍｌのＬＢを加え、菌体を２２５ｒｐｍで３７℃にて１時間振盪させた。菌体
をペレット化し、ＬＢ中に再浮遊し、１５０ｍｍのＬＢ＋カナマイシンアガープ
レート上に広げた。３０℃で３日後、約８００のコロニーを２０％グリセロール
を含有する２.０ｍｌのＬＢ＋カナマイシン培地に摘み入れ、ドライアイス上で
凍結し、−７０℃で貯蔵することによりコロニーを回収した。さらに、６つのカ
ナマイシン耐性コロニーを２ｍｌのＬＢ＋カナマイシン液体培地に接種し、３７
℃、２５０ｒｐｍで１８〜２４時間インキュベートした。１.５ｍｌの培養から
開始する標準アルカリ溶解法を用いてコスミドＤＮＡを調製した。ＤＮＡを制限
エンドヌクレアーゼＰｓｔＩで消化し、試料を０.８％ＴＡＥアガロースゲルで
１００Ｖにて１.５時間、電気泳動にかけた。各試料に独特の制限パターンが認
められ、挿入物の全体のサイズは４０〜４５キロドルトンと計算された。
させた大腸菌ＤＨ５αの一夜培養液１０ｍｌを希釈したファージに加え、３７℃
で２０分間インキュベートすることによりトランスフェクションを行った。０.
８ｍｌのＬＢを加え、菌体を２２５ｒｐｍで３７℃にて１時間振盪させた。菌体
をペレット化し、ＬＢ中に再浮遊し、１５０ｍｍのＬＢ＋カナマイシンアガープ
レート上に広げた。３０℃で３日後、約８００のコロニーを２０％グリセロール
を含有する２.０ｍｌのＬＢ＋カナマイシン培地に摘み入れ、ドライアイス上で
凍結し、−７０℃で貯蔵することによりコロニーを回収した。さらに、６つのカ
ナマイシン耐性コロニーを２ｍｌのＬＢ＋カナマイシン液体培地に接種し、３７
℃、２５０ｒｐｍで１８〜２４時間インキュベートした。１.５ｍｌの培養から
開始する標準アルカリ溶解法を用いてコスミドＤＮＡを調製した。ＤＮＡを制限
エンドヌクレアーゼＰｓｔＩで消化し、試料を０.８％ＴＡＥアガロースゲルで
１００Ｖにて１.５時間、電気泳動にかけた。各試料に独特の制限パターンが認
められ、挿入物の全体のサイズは４０〜４５キロドルトンと計算された。
【００２５】 ｂ．ＳｕｐｅｒＣｏｓを用いて：３０μｇのベクターＳｕｐｅｒＣｏｓを１００
μｌの推奨反応液緩衝液中、３７℃にて２１０分間、ＸｂａＩ（New England Bi
olabs、ビバリー、マサチューセッツ）で消化した。この溶液を１６,０００×ｇ
で３０分間遠心分離にかける前に１０μｌの酢酸ナトリウムおよび６０μｌのイ
ソプロパノールを加えた。沈殿したＤＮＡを５００μｌの氷冷７０％エタノール
で２回洗浄した。ベクターＤＮＡを沈殿させて空気乾燥し、１３５μｌのエビア
ルカリホスファターゼ反応緩衝液中に溶解し、２.５Ｕのエビアルカリホスファ
ターゼで１５０分間処理した。７５℃で２０分間、酵素を加熱により不活化した
後、フェノール：クロロホルム抽出をセクション１.ｃの記載と同様にして行っ
た。１００μｌのＢａｍＨＩ制限緩衝液中に再懸濁したＤＮＡを１５ＵのＢａｍ
ＨＩ（New England Biolabs、ビバリー、マサチューセッツ）で１８０分間加水
分解した。ついで、フェノール：クロロホルム抽出を行った（セクションＡ.３
を参照）。０.１容量の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび０.６容量のイソプロパノール
を加えてＳｕｐｅｒＣｏｓ ＤＮＡを沈殿させ、１６,０００×ｇで遠心分離にか
け、ついで５０μｌのＴＥ緩衝液中に溶解した。
μｌの推奨反応液緩衝液中、３７℃にて２１０分間、ＸｂａＩ（New England Bi
olabs、ビバリー、マサチューセッツ）で消化した。この溶液を１６,０００×ｇ
で３０分間遠心分離にかける前に１０μｌの酢酸ナトリウムおよび６０μｌのイ
ソプロパノールを加えた。沈殿したＤＮＡを５００μｌの氷冷７０％エタノール
で２回洗浄した。ベクターＤＮＡを沈殿させて空気乾燥し、１３５μｌのエビア
ルカリホスファターゼ反応緩衝液中に溶解し、２.５Ｕのエビアルカリホスファ
ターゼで１５０分間処理した。７５℃で２０分間、酵素を加熱により不活化した
後、フェノール：クロロホルム抽出をセクション１.ｃの記載と同様にして行っ
た。１００μｌのＢａｍＨＩ制限緩衝液中に再懸濁したＤＮＡを１５ＵのＢａｍ
ＨＩ（New England Biolabs、ビバリー、マサチューセッツ）で１８０分間加水
分解した。ついで、フェノール：クロロホルム抽出を行った（セクションＡ.３
を参照）。０.１容量の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび０.６容量のイソプロパノール
を加えてＳｕｐｅｒＣｏｓ ＤＮＡを沈殿させ、１６,０００×ｇで遠心分離にか
け、ついで５０μｌのＴＥ緩衝液中に溶解した。
【００２６】 ４μｇの消化したベクターＤＮＡを、２ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼおよび適当な
反応緩衝液（Gibco BRL、エッゲンシュタイン、ドイツ）を用い、最終容量２０
μｌにてS. cellulosumからの部分的に加水分解した１０μｇのゲノムＤＮＡ（
セクションＡ.３,ｂに記載）とライゲートした。反応を１６℃にて一夜行った。
反応混合物を、Gigapack III XLパッケージング抽出キット（Stratagene）を用
い、製造業者のプロトコールに従ってファージ粒子にパッケージングした。パッ
ケージング反応混合物の処理および大腸菌ＳＵＲＥ（Stratagene）のトランスフ
ェクションを４.ａの記載と同様にして行った。トランスフェクションした菌体
を遠心分離により濃縮し、新たなＬＢ培地中に再浮遊させ、５０μｇ／ｍｌ−１ のカナマイシンを入れたＬＢアガープレート上に分散させた。プレートを３０℃
にて一夜インキュベートした。１６００の組換えクローンを１ウエル当たり５０
μｇ／ｍｌ−１のカナマイシンを含有する８０μｌのＬＢ培地を入れた９６ウエ
ルマイクロタイタープレートに移し、３０℃にて一夜増殖させた。翌日、組換え
クローンの写しを得るためにマイクロタイタープレートの第二のセットを用いて
接種した。マイクロタイタープレートの最初のセットの各ウエルに８０μｌの５
０％グリセロールを加え、全プレートを−７０℃で貯蔵した。
反応緩衝液（Gibco BRL、エッゲンシュタイン、ドイツ）を用い、最終容量２０
μｌにてS. cellulosumからの部分的に加水分解した１０μｇのゲノムＤＮＡ（
セクションＡ.３,ｂに記載）とライゲートした。反応を１６℃にて一夜行った。
反応混合物を、Gigapack III XLパッケージング抽出キット（Stratagene）を用
い、製造業者のプロトコールに従ってファージ粒子にパッケージングした。パッ
ケージング反応混合物の処理および大腸菌ＳＵＲＥ（Stratagene）のトランスフ
ェクションを４.ａの記載と同様にして行った。トランスフェクションした菌体
を遠心分離により濃縮し、新たなＬＢ培地中に再浮遊させ、５０μｇ／ｍｌ−１ のカナマイシンを入れたＬＢアガープレート上に分散させた。プレートを３０℃
にて一夜インキュベートした。１６００の組換えクローンを１ウエル当たり５０
μｇ／ｍｌ−１のカナマイシンを含有する８０μｌのＬＢ培地を入れた９６ウエ
ルマイクロタイタープレートに移し、３０℃にて一夜増殖させた。翌日、組換え
クローンの写しを得るためにマイクロタイタープレートの第二のセットを用いて
接種した。マイクロタイタープレートの最初のセットの各ウエルに８０μｌの５
０％グリセロールを加え、全プレートを−７０℃で貯蔵した。
【００２７】 Qiagenプラスミド抽出キット（Qiagen、ヒルデン、ドイツ）を用いてプラスミ
ドＤＮＡを単離するため、２０のランダムに選んだ形質転換体を５０μｇ／ｍｌ −１ のカナマイシンを含有する３ｍｌのＬＢ培地に接種し、３７℃で一夜インキ
ュベートした。制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩおよびＢｇｌＩＩを用いた組換
えコスミドの制限断片分析は、これらコスミドがサイズが約３５〜４２ｋｂの挿
入物を含むことを示していた。
ドＤＮＡを単離するため、２０のランダムに選んだ形質転換体を５０μｇ／ｍｌ −１ のカナマイシンを含有する３ｍｌのＬＢ培地に接種し、３７℃で一夜インキ
ュベートした。制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩおよびＢｇｌＩＩを用いた組換
えコスミドの制限断片分析は、これらコスミドがサイズが約３５〜４２ｋｂの挿
入物を含むことを示していた。
【００２８】Ｂ．S. cellulosumプラスミドライブラリーの構築 １．S. cellulosum染色体ＤＮＡの８〜１２ｋｂ断片の調製 セクションＡ.１.ａの記載と同様にして調製したS. cellulosum染色体ＤＮＡ
を、５μｇの染色体ＤＮＡ、５単位の酵素（Promega、マジソン、ウイスコンシ
ン）、０.００６Ｍのトリス−ＨＣｌ、０.００６ＭのＭｇＣｌ２、０.１０Ｍの
ＮａＣｌ、および０.００１Ｍのジチオトレイトールからなる１００μＬの反応
容量（ｐＨ７.５）中、３７℃で４分間、制限エンドヌクレアーゼＳａｕ３Ａ１
で部分開裂した。消化したＤＮＡを１１×４ｃｍの０.８％ＴＡＥ−アガロース
ゲルで１７Ｖにて１８時間電気泳動にかけた。８〜１２ｋｂの断片をゲルから切
り出し、QIAquickゲル抽出キットを用い、製造業者のプロトコール（Qiagen）を
用いて精製した。
を、５μｇの染色体ＤＮＡ、５単位の酵素（Promega、マジソン、ウイスコンシ
ン）、０.００６Ｍのトリス−ＨＣｌ、０.００６ＭのＭｇＣｌ２、０.１０Ｍの
ＮａＣｌ、および０.００１Ｍのジチオトレイトールからなる１００μＬの反応
容量（ｐＨ７.５）中、３７℃で４分間、制限エンドヌクレアーゼＳａｕ３Ａ１
で部分開裂した。消化したＤＮＡを１１×４ｃｍの０.８％ＴＡＥ−アガロース
ゲルで１７Ｖにて１８時間電気泳動にかけた。８〜１２ｋｂの断片をゲルから切
り出し、QIAquickゲル抽出キットを用い、製造業者のプロトコール（Qiagen）を
用いて精製した。
【００２９】２．プラスミドライブラリーの調製 プラスミドｐＺｅｒｏ２.１（Invitrogen、カールスバード、カリフォルニア
）を、１μｇのプラスミドＤＮＡ、１０単位のＢａｍＨＩ（Promega）、０.００
６Ｍのトリス−ＨＣｌ、０.００６ＭのＭｇＣｌ２、０.０５ＭのＮａＣｌ、およ
び０.００１Ｍのジチオトレイトールからなる０.０２ｍｌの反応容量（ｐＨ７.
５）中、３７℃で２０分間、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで開裂した。０
.０８ｍｌのｄＨ２Ｏおよび０.１ｍｌの１：１フェノール：ＣＨＣｌ３を加えた
。試料をしばらく回転攪拌し、１６,０００×ｇにて２分間遠心分離にかけた。
水性層を取り出し、新たなミクロ遠心管に入れた。０.１容量の３Ｍ酢酸ナトリ
ウムおよび２容量の１００％ＥｔＯＨを加え、沈殿したＤＮＡを１６,０００×
ｇにて１０分間ペレット化した。液体を吸引除去し、ペレットを０.５ｍｌの７
０％ＥｔＯＨで１回洗浄した。ＤＮＡをSpeedVac中で乾燥させ、ＴＥ緩衝液中に
０.００４μｇ／ｍｌにて再懸濁した。消化したｐＺｅｒｏ２.１を、０.００４
μｇのｐＺｅｒｏ２.１、０.０５μｇのS. cellulosum ＤＮＡ、０.０３Ｍのト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ７.８）、０.０１ＭのＭｇＣｌ２、０.０１Ｍのジチオトレ
イトール、および０.０００５Ｍのアデノシン−５'−三リン酸および１.５Weiss
単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Promega）からなる０.０１ｍｌの反応液中、部分的
に開裂した染色体ＤＮＡにライゲートした。反応は室温で２時間行った。
）を、１μｇのプラスミドＤＮＡ、１０単位のＢａｍＨＩ（Promega）、０.００
６Ｍのトリス−ＨＣｌ、０.００６ＭのＭｇＣｌ２、０.０５ＭのＮａＣｌ、およ
び０.００１Ｍのジチオトレイトールからなる０.０２ｍｌの反応容量（ｐＨ７.
５）中、３７℃で２０分間、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで開裂した。０
.０８ｍｌのｄＨ２Ｏおよび０.１ｍｌの１：１フェノール：ＣＨＣｌ３を加えた
。試料をしばらく回転攪拌し、１６,０００×ｇにて２分間遠心分離にかけた。
水性層を取り出し、新たなミクロ遠心管に入れた。０.１容量の３Ｍ酢酸ナトリ
ウムおよび２容量の１００％ＥｔＯＨを加え、沈殿したＤＮＡを１６,０００×
ｇにて１０分間ペレット化した。液体を吸引除去し、ペレットを０.５ｍｌの７
０％ＥｔＯＨで１回洗浄した。ＤＮＡをSpeedVac中で乾燥させ、ＴＥ緩衝液中に
０.００４μｇ／ｍｌにて再懸濁した。消化したｐＺｅｒｏ２.１を、０.００４
μｇのｐＺｅｒｏ２.１、０.０５μｇのS. cellulosum ＤＮＡ、０.０３Ｍのト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ７.８）、０.０１ＭのＭｇＣｌ２、０.０１Ｍのジチオトレ
イトール、および０.０００５Ｍのアデノシン−５'−三リン酸および１.５Weiss
単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Promega）からなる０.０１ｍｌの反応液中、部分的
に開裂した染色体ＤＮＡにライゲートした。反応は室温で２時間行った。
【００３０】 ０.０１５ｍｌのｄＨ２Ｏおよび０.２５ｍｌの１−ブタノールを加え、試料を
しばらく回転攪拌し、１６,０００×ｇにて１０分間遠心分離にかけた。液体を
ペレットから吸引除去し、試料をSpeedVac中で５分間乾燥させた。ライゲートし
たＤＮＡを０.００５ｍｌのｄＨ２Ｏ中に再懸濁し、０.０４ｍｌの電気的にコン
ピテントな（electrocompetent）大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞（GIBCO/BRL、ゲイサー
ズバーグ、メリーランド）と混合した。試料を前以て冷却した０.２ｍｍ空隙（g
ap）のエレクトロポレーションキュベットに入れ、BioRad Gene Pulser IIユニ
ット（BioRad、ハーキュールズ、カリフォルニア）を２５μＦおよび２００Ωに
て用いたエレクトロポレーションにより細菌中に形質転換した。０.９６ｍｌの
ＳＯＣ培地（０.５％の酵母エキス、２％のトリプトン、１０ｍＭのＮａＣｌ、
２.５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのＭｇＳＯ４、２０ｍＭ
のグルコース）を菌体と混合し、１.５ｍｌ容のミクロ遠心管に移した。試料を
３７℃、２２５ｒｐｍにて１時間インキュベートした。菌体のアリコートをＬＢ
アガー＋カナマイシン上に広げ、３７℃で２０時間インキュベートして得られた
形質転換体の数を評価した。６のカナマイシン耐性クローンがセクションＡ.４.
ａに記載したように予測されたサイズの挿入物を含むことが確認された。
しばらく回転攪拌し、１６,０００×ｇにて１０分間遠心分離にかけた。液体を
ペレットから吸引除去し、試料をSpeedVac中で５分間乾燥させた。ライゲートし
たＤＮＡを０.００５ｍｌのｄＨ２Ｏ中に再懸濁し、０.０４ｍｌの電気的にコン
ピテントな（electrocompetent）大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞（GIBCO/BRL、ゲイサー
ズバーグ、メリーランド）と混合した。試料を前以て冷却した０.２ｍｍ空隙（g
ap）のエレクトロポレーションキュベットに入れ、BioRad Gene Pulser IIユニ
ット（BioRad、ハーキュールズ、カリフォルニア）を２５μＦおよび２００Ωに
て用いたエレクトロポレーションにより細菌中に形質転換した。０.９６ｍｌの
ＳＯＣ培地（０.５％の酵母エキス、２％のトリプトン、１０ｍＭのＮａＣｌ、
２.５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのＭｇＳＯ４、２０ｍＭ
のグルコース）を菌体と混合し、１.５ｍｌ容のミクロ遠心管に移した。試料を
３７℃、２２５ｒｐｍにて１時間インキュベートした。菌体のアリコートをＬＢ
アガー＋カナマイシン上に広げ、３７℃で２０時間インキュベートして得られた
形質転換体の数を評価した。６のカナマイシン耐性クローンがセクションＡ.４.
ａに記載したように予測されたサイズの挿入物を含むことが確認された。
【００３１】Ｃ．ポリケチドシンターゼ遺伝子を含むコスミドの同定 １．ｐＦＤ６６６でコスミドライブラリーを用いたコロニーブロットハイブリダ
イゼーション Duralon ＵＶメンブレンの２０×２０ｃｍシート（Stratagene）を、２５０ｍ
ｌのＬＢアガー＋カナマイシンを入れた２４.５×２４.５ｃｍの正方形バイオア
ッセイディッシュの上に置いた。１ｍｌのＬＢ培地中の凍結コスミドライブラリ
ーのアリコートをフィルター上に広げた。プレートを３７℃で２４時間インキュ
ベートした。コロニーを２つの新たなフィルター上に複写し、これをＬＢ＋カナ
マイシンアガー培地上に置き、２８℃で１８時間インキュベートした。菌体の溶
解および放出されたＤＮＡの中和を、フィルターに添付された指示に従って行っ
た。ＤＮＡを自動架橋モードのＵＶ Stratalinker 2400ユニット（Stratagene）
を用いてフィルターに架橋させた。３×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣは、１リットル当
たり１７３.５ｇのＮａＣｌ、８８.２ｇのクエン酸ナトリウムを含み、ｐＨを１
０Ｎ ＮａＯＨで７.０に調節してある）、０.１％ＳＤＳの溶液を入れた容器に
フィルターを置き、溶解したコロニーをKimwipeで擦り取ることにより菌体破砕
物を除去した。ついで、フィルターを同洗浄溶液とともに６５℃にて少なくとも
３時間インキュベートした。プラスミドライブラリーも、８０ｍＬ ＬＢアガー
＋カナマイシンを入れた１５０ｍｍのペトリ皿の上に置いた１３７ｍｍの円形Du
ralon ＵＶメンブレン上に菌体を広げた他は同様に処理した。
イゼーション Duralon ＵＶメンブレンの２０×２０ｃｍシート（Stratagene）を、２５０ｍ
ｌのＬＢアガー＋カナマイシンを入れた２４.５×２４.５ｃｍの正方形バイオア
ッセイディッシュの上に置いた。１ｍｌのＬＢ培地中の凍結コスミドライブラリ
ーのアリコートをフィルター上に広げた。プレートを３７℃で２４時間インキュ
ベートした。コロニーを２つの新たなフィルター上に複写し、これをＬＢ＋カナ
マイシンアガー培地上に置き、２８℃で１８時間インキュベートした。菌体の溶
解および放出されたＤＮＡの中和を、フィルターに添付された指示に従って行っ
た。ＤＮＡを自動架橋モードのＵＶ Stratalinker 2400ユニット（Stratagene）
を用いてフィルターに架橋させた。３×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣは、１リットル当
たり１７３.５ｇのＮａＣｌ、８８.２ｇのクエン酸ナトリウムを含み、ｐＨを１
０Ｎ ＮａＯＨで７.０に調節してある）、０.１％ＳＤＳの溶液を入れた容器に
フィルターを置き、溶解したコロニーをKimwipeで擦り取ることにより菌体破砕
物を除去した。ついで、フィルターを同洗浄溶液とともに６５℃にて少なくとも
３時間インキュベートした。プラスミドライブラリーも、８０ｍＬ ＬＢアガー
＋カナマイシンを入れた１５０ｍｍのペトリ皿の上に置いた１３７ｍｍの円形Du
ralon ＵＶメンブレン上に菌体を広げた他は同様に処理した。
【００３２】 ハイブリダイゼーションのため、S. cellulosumポリケチドシンターゼ遺伝子
の一部を表す６５０塩基対（ｂｐ）のポリメラーゼチェーン（ＰＣＲ）断片から
なるプローブを用いた。この断片を１型（マクロライド）ポリケチドシンターゼ
（ＰＫＳ）遺伝子のコンセンサス領域に対するプライマーを用いて増幅した（Sw
anら、Mol. Gen. Genetics 242, 358-362 [1994]）。下記表２に示すように一連
のセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドをＰＣＲ研究のために調製した
。
の一部を表す６５０塩基対（ｂｐ）のポリメラーゼチェーン（ＰＣＲ）断片から
なるプローブを用いた。この断片を１型（マクロライド）ポリケチドシンターゼ
（ＰＫＳ）遺伝子のコンセンサス領域に対するプライマーを用いて増幅した（Sw
anら、Mol. Gen. Genetics 242, 358-362 [1994]）。下記表２に示すように一連
のセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドをＰＣＲ研究のために調製した
。
【００３３】 表２
【表１】
【００３４】 コドンの第三位に必要なＣまたはＧの選択は、S. cellulosumの全体としての
非常に高いＧ＋Ｃ含量（約７０％）を反映している。ＰＣＲの条件は以下のとお
りであった：０.０５ｍｌの反応容量中に０.０１Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９.
０）、０.０５ＭのＫＣｌ、０.００３ＭのＭｇＣ２、０.１％のTriton X-100、
２００μＭの各プライマー、２.５ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Promega）
、５.０％のジメチルスルホキシド（Sigma）、および０.０１μｇのS. cellulos
um ＤＮＡ。反応は、Perkin-Elmer Model 480サーモサイクラー（Perkin-Elmer
Corporation、フォスターシティー、カリフォルニア）で以下の条件で行った：
９４℃で１分間；５０℃で１分間；７２℃で１.５分間を全体で３０サイクル。
センスプライマーとアンチセンスプライマーとの可能な組合せを試みた。６５０
ｂｐおよび３５０ｂｐの断片を、それぞれオリゴ１２０＋１２４および１２３＋
１２４を用いて増幅した。これら断片の配列をALFexpress AutoReadキットを用
いて決定してＤＮＡを蛍光標識し、これをALFexpressシークエンシング装置（Ph
armacia）で分析した。データは、両ＰＣＲ断片が１型抗生物質のポリケチドシ
ンターゼ遺伝子に対して有意のホモロジーを有することを示していた。６５０ｂ
ｐの断片をハイブリダイゼーション実験のために選択した。
非常に高いＧ＋Ｃ含量（約７０％）を反映している。ＰＣＲの条件は以下のとお
りであった：０.０５ｍｌの反応容量中に０.０１Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９.
０）、０.０５ＭのＫＣｌ、０.００３ＭのＭｇＣ２、０.１％のTriton X-100、
２００μＭの各プライマー、２.５ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Promega）
、５.０％のジメチルスルホキシド（Sigma）、および０.０１μｇのS. cellulos
um ＤＮＡ。反応は、Perkin-Elmer Model 480サーモサイクラー（Perkin-Elmer
Corporation、フォスターシティー、カリフォルニア）で以下の条件で行った：
９４℃で１分間；５０℃で１分間；７２℃で１.５分間を全体で３０サイクル。
センスプライマーとアンチセンスプライマーとの可能な組合せを試みた。６５０
ｂｐおよび３５０ｂｐの断片を、それぞれオリゴ１２０＋１２４および１２３＋
１２４を用いて増幅した。これら断片の配列をALFexpress AutoReadキットを用
いて決定してＤＮＡを蛍光標識し、これをALFexpressシークエンシング装置（Ph
armacia）で分析した。データは、両ＰＣＲ断片が１型抗生物質のポリケチドシ
ンターゼ遺伝子に対して有意のホモロジーを有することを示していた。６５０ｂ
ｐの断片をハイブリダイゼーション実験のために選択した。
【００３５】 この断片をＮＥＢｌｏｔキット（New England Biolabs、ビバリー、マサチュ
ーセッツ）を用いて３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識し、Bio-Spin 6カラム（BioRad、ハ
ーキュールズ、カリフォルニア）上で精製した。２複写のブロットを３×ＳＳＣ
（１×ＳＳＣは０.１５Ｍの塩化ナトリウムおよび０.０１５Ｍのクエン酸ナトリ
ウムを含む、ｐＨ７.０）、４×デンハルト溶液（１００×は２％フィコール［
タイプ４００］、２％ポリビニルピロリドン、および２％ウシ血清アルブミン［
画分Ｖ］）、および１００μｇ／ｍｌの切断した変性サケ精子ＤＮＡ中でプレハ
イブリダイズした（試薬はすべてSigma Chemicals、セントルイスから購入した
）。標識したＤＮＡを沸騰水中で５分間加熱して鎖を変性させ、氷上で冷却し、
プレハイブリダイゼーション溶液に加えた。フィルターをローラーボトルハイブ
リダイゼーションオーブンで少なくとも１８時間インキュベートした。これらフ
ィルターを新たなボトルに移し、ついで２×ＳＳＣで２回洗浄し、０.１％ＳＤ
Ｓ中で７０℃にて３０分間保持した（中くらいのストリンジェンシー）。メンブ
レンをWhatman ３ＭＭ紙上に置いて過剰の液体を除去し、サランラップで覆い、
２つの強化（intensifying）スクリーンを有するオートラジオグラフィーフィル
ム（Kodak X-OMAT LS）に暴露した。カセットを−７０℃で置き、適当な間隔で
現像した。
ーセッツ）を用いて３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識し、Bio-Spin 6カラム（BioRad、ハ
ーキュールズ、カリフォルニア）上で精製した。２複写のブロットを３×ＳＳＣ
（１×ＳＳＣは０.１５Ｍの塩化ナトリウムおよび０.０１５Ｍのクエン酸ナトリ
ウムを含む、ｐＨ７.０）、４×デンハルト溶液（１００×は２％フィコール［
タイプ４００］、２％ポリビニルピロリドン、および２％ウシ血清アルブミン［
画分Ｖ］）、および１００μｇ／ｍｌの切断した変性サケ精子ＤＮＡ中でプレハ
イブリダイズした（試薬はすべてSigma Chemicals、セントルイスから購入した
）。標識したＤＮＡを沸騰水中で５分間加熱して鎖を変性させ、氷上で冷却し、
プレハイブリダイゼーション溶液に加えた。フィルターをローラーボトルハイブ
リダイゼーションオーブンで少なくとも１８時間インキュベートした。これらフ
ィルターを新たなボトルに移し、ついで２×ＳＳＣで２回洗浄し、０.１％ＳＤ
Ｓ中で７０℃にて３０分間保持した（中くらいのストリンジェンシー）。メンブ
レンをWhatman ３ＭＭ紙上に置いて過剰の液体を除去し、サランラップで覆い、
２つの強化（intensifying）スクリーンを有するオートラジオグラフィーフィル
ム（Kodak X-OMAT LS）に暴露した。カセットを−７０℃で置き、適当な間隔で
現像した。
【００３６】 約１００のクローンが２複写のフィルター上でハイブリダイズしたことが認め
られた。これらクローンのうちの１４のクローンをマスタープレートから単離し
、４ｍｌのＬＢ＋カナマイシン培地中、３７℃、２５０ｒｐｍで２０〜２４時間
増殖させた。プラスミドＤＮＡを標準アルカリ溶解法を用いて調製し、制限エン
ドヌクレアーゼＰｓｔＩで消化した。消化したＤＮＡをＴＡＥ中の０.８％アガ
ロースゲル上、１００Ｖで３時間、電気泳動にかけた。断片をVacuGene XLバキ
ュームブロッティングユニット（Pharmacia）および推奨されるアルカリ変性プ
ロトコールを用いてDuralon ＵＶに移した。放射性標識したＰＣＲ断片のハイブ
リダイゼーションおよび洗浄は上記と同様にして行った。２つの顕著なタイプの
コスミドが観察された；一つはプローブにハイブリダイズした約７.０、５.０お
よび１.１ｋｂのＰｓｔＩ断片を含んでいた（ｐＥＰＯｃｏｓ６およびｐＥＰＯ
ｃｏｓ７）；他のタイプはプローブに相同な約６.０および３.６ｋｂの断片を有
していた（ｐＥＰＯｃｏｓ８およびｐＥＰＯｃｏｓ１３）。制限分析は、同一の
ハイブリダイゼーションパターンを示すコスミドは同一もしくは重複した挿入物
を有することを確認した。
られた。これらクローンのうちの１４のクローンをマスタープレートから単離し
、４ｍｌのＬＢ＋カナマイシン培地中、３７℃、２５０ｒｐｍで２０〜２４時間
増殖させた。プラスミドＤＮＡを標準アルカリ溶解法を用いて調製し、制限エン
ドヌクレアーゼＰｓｔＩで消化した。消化したＤＮＡをＴＡＥ中の０.８％アガ
ロースゲル上、１００Ｖで３時間、電気泳動にかけた。断片をVacuGene XLバキ
ュームブロッティングユニット（Pharmacia）および推奨されるアルカリ変性プ
ロトコールを用いてDuralon ＵＶに移した。放射性標識したＰＣＲ断片のハイブ
リダイゼーションおよび洗浄は上記と同様にして行った。２つの顕著なタイプの
コスミドが観察された；一つはプローブにハイブリダイズした約７.０、５.０お
よび１.１ｋｂのＰｓｔＩ断片を含んでいた（ｐＥＰＯｃｏｓ６およびｐＥＰＯ
ｃｏｓ７）；他のタイプはプローブに相同な約６.０および３.６ｋｂの断片を有
していた（ｐＥＰＯｃｏｓ８およびｐＥＰＯｃｏｓ１３）。制限分析は、同一の
ハイブリダイゼーションパターンを示すコスミドは同一もしくは重複した挿入物
を有することを確認した。
【００３７】 １型ＰＫＳ遺伝子のコンセンサス配列を表すプライマーを用いたＰＣＲ反応を
、０.０１μｇのコスミドＤＮＡを鋳型として含めた他は上記と同じ条件下で単
離コスミドＤＮＡを鋳型として用いて行った。コスミドｐＥＰＯｃｏｓ６および
ｐＥＰＯｃｏｓ８はオリゴヌクレオチド１２０＋１２４を用いたときに認められ
た６５０ｂｐの断片を増幅させ、一方、ｐＥＰＯｃｏｓ８およびｐＥＰＯｃｏｓ
１３はオリゴ１２２および１２４での１１００ｂｐのＰＣＲ断片の増幅を支持し
た。後者の断片をシークエンシングしたところ、Ｉ型ＰＫＳ遺伝子に対して強い
類似性を有することが確認された。これらのデータから、組換えコスミドは互い
に関連しており、すべての組換えコスミドがＰＫＳ様遺伝子を含むことが確認さ
れた。
、０.０１μｇのコスミドＤＮＡを鋳型として含めた他は上記と同じ条件下で単
離コスミドＤＮＡを鋳型として用いて行った。コスミドｐＥＰＯｃｏｓ６および
ｐＥＰＯｃｏｓ８はオリゴヌクレオチド１２０＋１２４を用いたときに認められ
た６５０ｂｐの断片を増幅させ、一方、ｐＥＰＯｃｏｓ８およびｐＥＰＯｃｏｓ
１３はオリゴ１２２および１２４での１１００ｂｐのＰＣＲ断片の増幅を支持し
た。後者の断片をシークエンシングしたところ、Ｉ型ＰＫＳ遺伝子に対して強い
類似性を有することが確認された。これらのデータから、組換えコスミドは互い
に関連しており、すべての組換えコスミドがＰＫＳ様遺伝子を含むことが確認さ
れた。
【００３８】２．ｐＺｅｒｏ２.１でのプラスミドライブラリーのコロニーブロットハイブリ
ダイゼーション ７５ｍｌのＬＢアガー＋カナマイシンを入れた１５０ｍｍの上に１３７ｍｍの
円形Duralon ＵＶメンブレンを置いた。０.５ｍｌのＬＢ培地中のプラスミドラ
イブラリー（約２０００の組換えコロニーを表す）のアリコートをフィルター上
に広げた。プレートを３７℃で２０時間インキュベートした。コロニーを２つの
新たなフィルター上に複写し、これをＬＢ＋カナマイシンアガー培地上に置き、
３７℃で６時間インキュベートした。フィルターをセクションＣ.１の記載と同
様にしてハイブリダイゼーションのために処理した。検出した８つの陽性クロー
ンのうち、一つはｐＥＰＯｃｏｓ６かまたはｐＥＰＯｃｏｓ８のいずれによって
もコードされないＤＮＡ領域を有するプラスミドを含んでいた。このプラスミド
をＳａｕ４と名づけ、さらに詳細に特徴付けた。
ダイゼーション ７５ｍｌのＬＢアガー＋カナマイシンを入れた１５０ｍｍの上に１３７ｍｍの
円形Duralon ＵＶメンブレンを置いた。０.５ｍｌのＬＢ培地中のプラスミドラ
イブラリー（約２０００の組換えコロニーを表す）のアリコートをフィルター上
に広げた。プレートを３７℃で２０時間インキュベートした。コロニーを２つの
新たなフィルター上に複写し、これをＬＢ＋カナマイシンアガー培地上に置き、
３７℃で６時間インキュベートした。フィルターをセクションＣ.１の記載と同
様にしてハイブリダイゼーションのために処理した。検出した８つの陽性クロー
ンのうち、一つはｐＥＰＯｃｏｓ６かまたはｐＥＰＯｃｏｓ８のいずれによって
もコードされないＤＮＡ領域を有するプラスミドを含んでいた。このプラスミド
をＳａｕ４と名づけ、さらに詳細に特徴付けた。
【００３９】 ３．ＳｕｐｅｒＣｏｓでのコスミドライブラリーのコロニーブロットハイブリダ
イゼーション ＰＫＳ遺伝子およびＰＳ遺伝子を有するコスミドを同定するため、マイクロタ
イタープレートからの組換え大腸菌クローン（セクション４.ｂを参照）を用い
てハイブリダイゼーションフィルターの２つの同一のセットを製造した。組換え
クローンを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを入れた２セットの２２×２２ｃｍの
ＬＢアガープレート上に加えた。それゆえ、各プレートは４マイクロタイタープ
レートを表す３８４クローンを含んでいた。これらクローンを３０℃で一夜イン
キュベートした。４℃で約３時間前以て冷却した後、２０×２０ｃｍのHybond N + ナイロンメンブレン（Amersham、ブラウンシュベイク、ドイツ）をアガー表面
上に置いた。２分後、メンブレンを取り出し、中和溶液（１Ｍのトリス−ＨＣｌ
、ｐＨ７.５、１.５ＭのＮａＣｌ）で飽和したWhatman 3MM紙（Whatman paper L
td.、メイドストーン、イングランド）上に移す前に変性溶液（０.５ＮのＮａＯ
Ｈ、１.５ＭのＮａＣｌ）を沁み込ませたWhatman 3MM紙上に１５分間置いた。そ
の後、メンブレンを２×ＳＳＣ（０.３ＭのＮａＣｌ、０.０３Ｍのクエン酸ナト
リウム、ｐＨ７.２）を沁み込ませたWhatman 3MM紙上に１０分間置いた。メンブ
レンを８５℃で４０分間焼いた。ついで、各メンブレンに５ｍｌのプロテイナー
ゼＫ溶液（２×ＳＳＣ中の２ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ）を重層し、３７℃
で９０分間インキュベートした。最後に、２×ＳＳＣで前以て濡らしたKimwipe
でメンブレンを拭き取ることにより菌体破砕物を取り除いた。
イゼーション ＰＫＳ遺伝子およびＰＳ遺伝子を有するコスミドを同定するため、マイクロタ
イタープレートからの組換え大腸菌クローン（セクション４.ｂを参照）を用い
てハイブリダイゼーションフィルターの２つの同一のセットを製造した。組換え
クローンを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを入れた２セットの２２×２２ｃｍの
ＬＢアガープレート上に加えた。それゆえ、各プレートは４マイクロタイタープ
レートを表す３８４クローンを含んでいた。これらクローンを３０℃で一夜イン
キュベートした。４℃で約３時間前以て冷却した後、２０×２０ｃｍのHybond N + ナイロンメンブレン（Amersham、ブラウンシュベイク、ドイツ）をアガー表面
上に置いた。２分後、メンブレンを取り出し、中和溶液（１Ｍのトリス−ＨＣｌ
、ｐＨ７.５、１.５ＭのＮａＣｌ）で飽和したWhatman 3MM紙（Whatman paper L
td.、メイドストーン、イングランド）上に移す前に変性溶液（０.５ＮのＮａＯ
Ｈ、１.５ＭのＮａＣｌ）を沁み込ませたWhatman 3MM紙上に１５分間置いた。そ
の後、メンブレンを２×ＳＳＣ（０.３ＭのＮａＣｌ、０.０３Ｍのクエン酸ナト
リウム、ｐＨ７.２）を沁み込ませたWhatman 3MM紙上に１０分間置いた。メンブ
レンを８５℃で４０分間焼いた。ついで、各メンブレンに５ｍｌのプロテイナー
ゼＫ溶液（２×ＳＳＣ中の２ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ）を重層し、３７℃
で９０分間インキュベートした。最後に、２×ＳＳＣで前以て濡らしたKimwipe
でメンブレンを拭き取ることにより菌体破砕物を取り除いた。
【００４０】 本発明者らは特にＰＫＳ遺伝子およびＰＳ遺伝子の両者を含む生合成経路を同
定しようとしているので、以下のハイブリダイゼーション戦略をとった：スクリ
ーニングを最初はＩ型ＰＫＳからのケトシンターゼドメインおよびＰＳからのア
デニル化ドメインに焦点を合わせた。標的特異的なプライマーを用い、S. cellu
losumの染色体ＤＮＡからの対応遺伝子のＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅した。
ついで、得られた断片をクローニングし、シークエンシングし、導かれたアミノ
酸配列をＰＫＳおよびＰＳの既知のケトシンターゼドメインおよびアデニル化ド
メインとそれぞれ比較した。第二の段階として、これらＰＣＲ断片を遺伝子プロ
ーブとして用いてS. cellulosumコスミドライブラリーの組換えコスミドを検出
した。
定しようとしているので、以下のハイブリダイゼーション戦略をとった：スクリ
ーニングを最初はＩ型ＰＫＳからのケトシンターゼドメインおよびＰＳからのア
デニル化ドメインに焦点を合わせた。標的特異的なプライマーを用い、S. cellu
losumの染色体ＤＮＡからの対応遺伝子のＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅した。
ついで、得られた断片をクローニングし、シークエンシングし、導かれたアミノ
酸配列をＰＫＳおよびＰＳの既知のケトシンターゼドメインおよびアデニル化ド
メインとそれぞれ比較した。第二の段階として、これらＰＣＲ断片を遺伝子プロ
ーブとして用いてS. cellulosumコスミドライブラリーの組換えコスミドを検出
した。
【００４１】 種々のＩ型ＰＫＳからのケトシンターゼドメインの保存されたアミノ酸配列に
基づくオリゴヌクレオチドを、既知の粘液細菌生合成遺伝子クラスター（Schupp
ら、J. Bacteriol. 177, 3673-3679 [1995]）と比較することによって粘液細菌
ＤＮＡに対して最適化し、プライマーＫＳ１Ｕｐ
基づくオリゴヌクレオチドを、既知の粘液細菌生合成遺伝子クラスター（Schupp
ら、J. Bacteriol. 177, 3673-3679 [1995]）と比較することによって粘液細菌
ＤＮＡに対して最適化し、プライマーＫＳ１Ｕｐ
【化２６３】 およびＫＳＤ１
【化２６４】 が得られた。アデニル化モジュールをコードする遺伝子に向けられたＰＣＲプラ
イマーＴＧＤ
イマーＴＧＤ
【化２６５】 およびＬＧＧ
【化２６６】 は、Turgayら（Pept. Res. 7, 238-241 [1994]）によって記載されている。
【００４２】 ２５μｌの最終容量を有するＰＣＲ反応混合物には、０.１μｇの鋳型ＤＮＡ
、０.２ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Gibco BRL、エッゲンシュタイン、ド
イツ）、５μモルのｄＮＴＰ、５％のジメチルスルホキシド（Sigma）、１.５ｍ
ＭのＭｇＣｌ２、２５ピコモルの各プライマーおよびGibco BRLによって供給さ
れた適当な反応緩衝液が含まれていた。S. cellulosumの染色体ＤＮＡを鋳型と
して用いた。さらに、Myxococcus fulvusの染色体ＤＮＡをＰＳプライマーとと
もに用いた。反応は以下の条件を用いてエッペンドルフマスターサイクルグラジ
エント（Eppendorf、ドイツ）中で行った：９７℃で３０秒間の変性、５５℃で
３０秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の伸長を全部で３０サイクル。ＫＳ
プライマーを用いて約７００ｂｐの断片およびＰＳプライマーを用いて約３５０
ｂｐの断片の生成が０.８％アガロースゲル電気泳動により確認された。
、０.２ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Gibco BRL、エッゲンシュタイン、ド
イツ）、５μモルのｄＮＴＰ、５％のジメチルスルホキシド（Sigma）、１.５ｍ
ＭのＭｇＣｌ２、２５ピコモルの各プライマーおよびGibco BRLによって供給さ
れた適当な反応緩衝液が含まれていた。S. cellulosumの染色体ＤＮＡを鋳型と
して用いた。さらに、Myxococcus fulvusの染色体ＤＮＡをＰＳプライマーとと
もに用いた。反応は以下の条件を用いてエッペンドルフマスターサイクルグラジ
エント（Eppendorf、ドイツ）中で行った：９７℃で３０秒間の変性、５５℃で
３０秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の伸長を全部で３０サイクル。ＫＳ
プライマーを用いて約７００ｂｐの断片およびＰＳプライマーを用いて約３５０
ｂｐの断片の生成が０.８％アガロースゲル電気泳動により確認された。
【００４３】 独立のＰＣＲ反応の断片を、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（Invitrogen
、リーク、オランダ）を用い、製造業者のプロトコールに従ってベクターｐＣＲ
２.１ＴＯＰＯ中にライゲートし、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに形質転換した。得
られたプラスミドのシークエンシングおよびそれから導かれるアミノ酸配列の分
析は、ｐＭ００８.４、ｐＭ００８.６およびｐＭ００８.７と称する３つの異な
るＫＳ断片、S. cellulosumに対応する一つのＰＳ断片（ｐＡＰｓ１）およびM.
fulvusの染色体ＤＮＡで得られた一つのＰＳ断片（ｐＤＰｓ１）を明らかにした
。ＥｃｏＲＩで消化することによりｐＭ００８.４、ｐＭ００８.６およびｐＭ０
０８.７からＰＣＲ断片を再単離し、標識し、プールし、以下に記載するハイブ
リダイゼーション実験において遺伝子プローブとして用いた。同じ手順をｐＡＰ
ｓ１およびｐＤＰｓ１のＰＳ断片でも行った。
、リーク、オランダ）を用い、製造業者のプロトコールに従ってベクターｐＣＲ
２.１ＴＯＰＯ中にライゲートし、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに形質転換した。得
られたプラスミドのシークエンシングおよびそれから導かれるアミノ酸配列の分
析は、ｐＭ００８.４、ｐＭ００８.６およびｐＭ００８.７と称する３つの異な
るＫＳ断片、S. cellulosumに対応する一つのＰＳ断片（ｐＡＰｓ１）およびM.
fulvusの染色体ＤＮＡで得られた一つのＰＳ断片（ｐＤＰｓ１）を明らかにした
。ＥｃｏＲＩで消化することによりｐＭ００８.４、ｐＭ００８.６およびｐＭ０
０８.７からＰＣＲ断片を再単離し、標識し、プールし、以下に記載するハイブ
リダイゼーション実験において遺伝子プローブとして用いた。同じ手順をｐＡＰ
ｓ１およびｐＤＰｓ１のＰＳ断片でも行った。
【００４４】 ＰＫＳおよびＰＳ特異的なＤＮＡプローブ（上記参照）とのハイブリダイゼー
ションを、ＤＩＧ非放射性標識および検出キット（Boehringer Mannheim、ドイ
ツ）を用いて行い、５０％ホルムアミドを含有する緩衝液を用いて供給者のマニ
ュアルに従って実施した。約１０ｍｌのハイブリダイゼーション溶液を入れたプ
ラスチックバッグ中、３９℃で一夜、メンブレンをハイブリダイズした。プロー
ブの非特異的な結合を、２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳを用いた室温での２０分間
の２回の洗浄工程および０.５×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳを用いた６０℃での２０
分間の１回のストリンジェントな洗浄工程により除去した。ハイブリダイズした
ＤＮＡ断片の検出は、上記システムを用い、ＣＳＰＤを化学ルミネセンス基質と
して用いた製造業者のプロトコールに従って行った。シグナルの記録は処理した
メンブレンをHyperfilm ECL（Amersham Life Science、リトルチャルフォント、
イングランド）に暴露することにより行い、これを適当な時間間隔で現像した。
ションを、ＤＩＧ非放射性標識および検出キット（Boehringer Mannheim、ドイ
ツ）を用いて行い、５０％ホルムアミドを含有する緩衝液を用いて供給者のマニ
ュアルに従って実施した。約１０ｍｌのハイブリダイゼーション溶液を入れたプ
ラスチックバッグ中、３９℃で一夜、メンブレンをハイブリダイズした。プロー
ブの非特異的な結合を、２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳを用いた室温での２０分間
の２回の洗浄工程および０.５×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳを用いた６０℃での２０
分間の１回のストリンジェントな洗浄工程により除去した。ハイブリダイズした
ＤＮＡ断片の検出は、上記システムを用い、ＣＳＰＤを化学ルミネセンス基質と
して用いた製造業者のプロトコールに従って行った。シグナルの記録は処理した
メンブレンをHyperfilm ECL（Amersham Life Science、リトルチャルフォント、
イングランド）に暴露することにより行い、これを適当な時間間隔で現像した。
【００４５】 ７１のシグナルがＰＫＳ特異的な遺伝子プローブで検出された。２複写のフィ
ルター上で、３５のシグナルがＰＳ特異的な遺伝子プローブで得られ、そのうち
７つはＰＫＳハイブリダイゼーション実験から既に知られていた。これら組換え
コスミドは、ＰＫＳ遺伝子およびＰＳ遺伝子を有していた。これら結果を確認す
るため、鋳型としてのこれら７つの組換えコスミドのＤＮＡおよびＰＫＳ特異的
なプライマー（ＫＳ１Ｕｐ、ＫＳＤ１）およびＰＳ特異的なプライマー（ＴＧＤ
、ＬＧＧ）を用いてＰＣＲ実験を行い、それぞれ約７００ｂｐおよび３５０ｂｐ
の予測されたサイズの断片が得られた（プライマーおよび反応条件は上記を参照
）。
ルター上で、３５のシグナルがＰＳ特異的な遺伝子プローブで得られ、そのうち
７つはＰＫＳハイブリダイゼーション実験から既に知られていた。これら組換え
コスミドは、ＰＫＳ遺伝子およびＰＳ遺伝子を有していた。これら結果を確認す
るため、鋳型としてのこれら７つの組換えコスミドのＤＮＡおよびＰＫＳ特異的
なプライマー（ＫＳ１Ｕｐ、ＫＳＤ１）およびＰＳ特異的なプライマー（ＴＧＤ
、ＬＧＧ）を用いてＰＣＲ実験を行い、それぞれ約７００ｂｐおよび３５０ｂｐ
の予測されたサイズの断片が得られた（プライマーおよび反応条件は上記を参照
）。
【００４６】 ＰＫＳ遺伝子およびＰＳ遺伝子を有するこれら７つの組換えコスミドからのＤ
ＮＡをＢａｍＨＩにより消化して得られる制限断片パターンの比較は、これらコ
スミドを３つのグループに整理するのを容易にした。これらはＡ２およびＡ５と
称するコスミドにより表された。残りのグループはｐＥＰＯｃｏｓ６によって表
された。それゆえ、Ａ２およびＡ５はさらなるＤＮＡ配列分析の良好な候補を表
していた。なぜなら、これらはＰＫＳ遺伝子とＰＳ遺伝子の両者を有しているか
らである。
ＮＡをＢａｍＨＩにより消化して得られる制限断片パターンの比較は、これらコ
スミドを３つのグループに整理するのを容易にした。これらはＡ２およびＡ５と
称するコスミドにより表された。残りのグループはｐＥＰＯｃｏｓ６によって表
された。それゆえ、Ａ２およびＡ５はさらなるＤＮＡ配列分析の良好な候補を表
していた。なぜなら、これらはＰＫＳ遺伝子とＰＳ遺伝子の両者を有しているか
らである。
【００４７】 Ｄ．組換えコスミドおよびプラスミドのランダム「ショットガン」シークエンシ
ング１．ライブラリーの構築 ａ．ｐＥＰＯｃｏｓ６、ｐＥＰＯｃｏｓ８、Ａ５、およびＳａｕ４： ｐＥＰＯｃｏｓ６およびｐＥＰＯｃｏｓ７を完全にシークエンシングし、これ
ら重複コスミドについての隣接配列データおよび分析を「ｃｏｓ６領域」につい
て以下に示す（請求項７および９を参照）。コスミドＡ５、ｐＥＰＯｃｏｓ８お
よびプラスミドＳａｕ４のシークエンシングは、S. cellulosumの挿入物を表す
大きな隣接配列（コンティグ）まで行った；配列および分析を以下に示す（請求
項１０〜１５参照）。
ング１．ライブラリーの構築 ａ．ｐＥＰＯｃｏｓ６、ｐＥＰＯｃｏｓ８、Ａ５、およびＳａｕ４： ｐＥＰＯｃｏｓ６およびｐＥＰＯｃｏｓ７を完全にシークエンシングし、これ
ら重複コスミドについての隣接配列データおよび分析を「ｃｏｓ６領域」につい
て以下に示す（請求項７および９を参照）。コスミドＡ５、ｐＥＰＯｃｏｓ８お
よびプラスミドＳａｕ４のシークエンシングは、S. cellulosumの挿入物を表す
大きな隣接配列（コンティグ）まで行った；配列および分析を以下に示す（請求
項１０〜１５参照）。
【００４８】 ランダムに切断したライブラリーの構築を、Fleischmannら、1995（Science 2
69, 496）と同様だがFraserら、1995（Science 370, 397）により改変したプロ
トコールを用いて目的コスミドおよびプラスミドに対して行った。簡単に説明す
ると、Qiagen−カラム精製したコスミドＤＮＡ（〜１０μｇ）を約２ｋｂのサイ
ズに切断し、ＢＡＬ３１ヌクレアーゼを用いてＤＮＡ末端修復した。このＤＮＡ
を１×ＴＡＥ緩衝液中に０.５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する０.７５％
の低融点アガロースゲルにより８０Ｖで２時間行った電気泳動後にゲル精製した
。低融点アガロースゲルスライスの容量を該ゲルスライスをミクロ遠心管に加え
秤量することによって推計し、ついで０.１容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ７
）を加え、アガロースを６０℃でインキュベートした。温度を３７℃に平衡化し
、等容量の緩衝フェノール（Life Technologies）を用いてＤＮＡを２回抽出し
た。
69, 496）と同様だがFraserら、1995（Science 370, 397）により改変したプロ
トコールを用いて目的コスミドおよびプラスミドに対して行った。簡単に説明す
ると、Qiagen−カラム精製したコスミドＤＮＡ（〜１０μｇ）を約２ｋｂのサイ
ズに切断し、ＢＡＬ３１ヌクレアーゼを用いてＤＮＡ末端修復した。このＤＮＡ
を１×ＴＡＥ緩衝液中に０.５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する０.７５％
の低融点アガロースゲルにより８０Ｖで２時間行った電気泳動後にゲル精製した
。低融点アガロースゲルスライスの容量を該ゲルスライスをミクロ遠心管に加え
秤量することによって推計し、ついで０.１容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ７
）を加え、アガロースを６０℃でインキュベートした。温度を３７℃に平衡化し
、等容量の緩衝フェノール（Life Technologies）を用いてＤＮＡを２回抽出し
た。
【００４９】 水性相を移し、等容量のクロロホルムで１回抽出し、ついで２容量の冷１００
％エタノールを加えることによりエタノール沈殿した。ミクロ遠心管で１６,０
００×ｇにて回転させることによりＤＮＡを濃縮した。得られたＤＮＡペレット
を１ｍｌの７０％エタノール洗浄し、１００μｌの０.１×ＴＥ中に再懸濁した
。このＤＮＡをＳｍａＩ消化しホスファターゼ処理したｐＵＣ１８ベクター（Ph
armacia）にライゲートし、ベクターと単一の挿入物とを含むバンドのゲル精製
により単一挿入組換え体を単離し、ついでＴ４ポリメラーゼで仕上げをし（poli
shing）、最後にベクターと単一の挿入物とのＤＮＡを分子内ライゲーションし
た。この最後のライゲーションは約２ｋｂの非常にランダムな断片のライブラリ
ーを表すものであり、これを約４０ｋｂのコスミドまたは約１０ｋｂのプラスミ
ドのショットガンシークエンシングに用いた。
％エタノールを加えることによりエタノール沈殿した。ミクロ遠心管で１６,０
００×ｇにて回転させることによりＤＮＡを濃縮した。得られたＤＮＡペレット
を１ｍｌの７０％エタノール洗浄し、１００μｌの０.１×ＴＥ中に再懸濁した
。このＤＮＡをＳｍａＩ消化しホスファターゼ処理したｐＵＣ１８ベクター（Ph
armacia）にライゲートし、ベクターと単一の挿入物とを含むバンドのゲル精製
により単一挿入組換え体を単離し、ついでＴ４ポリメラーゼで仕上げをし（poli
shing）、最後にベクターと単一の挿入物とのＤＮＡを分子内ライゲーションし
た。この最後のライゲーションは約２ｋｂの非常にランダムな断片のライブラリ
ーを表すものであり、これを約４０ｋｂのコスミドまたは約１０ｋｂのプラスミ
ドのショットガンシークエンシングに用いた。
【００５０】 ｂ．コスミドＡ２： S. cellulosumの挿入物を有するコスミドＤＮＡをアルカリ溶解法により単離
し、Macherey Nagelカラム（Machery und Nagel GmbH und CoKG、デューレン、
ドイツ）を用い、製造業者の推奨に従って精製した。精製したコスミドＤＮＡを
超音波処理し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（Boehringer Mannheim、ドイツ）を用
いて末端修復した。ゲル精製後、約２ｋｂのサイズの断片をＳｍａＩ消化しホス
ファターゼ処理したｐＴＺ１８Ｒベクター（Pharmacia）中にライゲートした。
このライゲーションは約２ｋｂの非常にランダムな断片のライブラリーを表すも
のであり、これを約４０ｋｂのコスミドのショットガンシークエンシングに用い
た。
し、Macherey Nagelカラム（Machery und Nagel GmbH und CoKG、デューレン、
ドイツ）を用い、製造業者の推奨に従って精製した。精製したコスミドＤＮＡを
超音波処理し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（Boehringer Mannheim、ドイツ）を用
いて末端修復した。ゲル精製後、約２ｋｂのサイズの断片をＳｍａＩ消化しホス
ファターゼ処理したｐＴＺ１８Ｒベクター（Pharmacia）中にライゲートした。
このライゲーションは約２ｋｂの非常にランダムな断片のライブラリーを表すも
のであり、これを約４０ｋｂのコスミドのショットガンシークエンシングに用い
た。
【００５１】２．シークエンシングおよび組み立て ａ．ｐＥＰＯｃｏｓ６、ｐＥＰＯｃｏｓ８、Ｓａｕ４、およびＡ５： ＤＮＡ（ライブラリー中の全部で１００μｌのうちの１μｌ）をエレクトロポ
レーションにより大腸菌に形質転換し（Life TechnologiesからのElectromax Ｄ
Ｈ１０Ｂ細胞を２０μｌ）、菌体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬ
Ｂプレート上に広げた。３７℃で一夜増殖させた後、形質転換体（全部で約３０
０〜３０００ＣＦＵ）を９６ウエル増殖ブロックに移し、５０μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含む１.３ｍｌのＬＢ培地中、３７℃で一夜振盪した。これら菌体か
らアルカリ溶解法（Qiagen QiaQuick Turbo Prep）により精製した二本鎖のプラ
スミドＤＮＡを得ることにより鋳型を調製した。ユニバーサルフォアウォードお
よびリバースプライマーおよびBigDyeターミネーターシークエンシングキット（
Applied Biosystems）を用い、製造業者の推奨に従ってプラスミド鋳型のサイク
ルシークエンシングを行い、ついでABI 377自動シークエンサーを用いて解析し
た。配列をPhredを用いて編集し、ついでPhrap（Phil Green、University of Wa
shington、セントルイス、ミズーリ）を用いてより大きな隣接配列に組み立てた
。
レーションにより大腸菌に形質転換し（Life TechnologiesからのElectromax Ｄ
Ｈ１０Ｂ細胞を２０μｌ）、菌体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬ
Ｂプレート上に広げた。３７℃で一夜増殖させた後、形質転換体（全部で約３０
０〜３０００ＣＦＵ）を９６ウエル増殖ブロックに移し、５０μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含む１.３ｍｌのＬＢ培地中、３７℃で一夜振盪した。これら菌体か
らアルカリ溶解法（Qiagen QiaQuick Turbo Prep）により精製した二本鎖のプラ
スミドＤＮＡを得ることにより鋳型を調製した。ユニバーサルフォアウォードお
よびリバースプライマーおよびBigDyeターミネーターシークエンシングキット（
Applied Biosystems）を用い、製造業者の推奨に従ってプラスミド鋳型のサイク
ルシークエンシングを行い、ついでABI 377自動シークエンサーを用いて解析し
た。配列をPhredを用いて編集し、ついでPhrap（Phil Green、University of Wa
shington、セントルイス、ミズーリ）を用いてより大きな隣接配列に組み立てた
。
【００５２】 ｂ．コスミドＡ２： ＤＮＡ（ライゲーション中の全部で２０μｌのうちの１μｌ）をエレクトロポ
レーションにより大腸菌ＤＨ１０Ｂに形質転換し、菌体を５０μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含有するＬＢアガー培地上に広げた。３７℃で１８時間増殖させた後
、形質転換体を９６ウエル増殖ブロックに移し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン
を含む１.３ｍｌの２×ＹＴ培地中、３７℃で一夜振盪した。これら菌体からア
ルカリ溶解法（Qiagen QiaQuick Turbo Prep）により精製した二本鎖のプラスミ
ドＤＮＡを得ることにより鋳型を調製した。ユニバーサルフォアウォードおよび
リバースプライマーおよびBig Dyeターミネーターシークエンシングキット（PE
Biosystems）またはThermo Sequenase蛍光標識プライマーサイクルシークエンシ
ングキット（Amersham Pharmacia Biotech）を用い、製造業者のプロトコールを
用いてプラスミド鋳型のサイクルシークエンシングを行った。コスミドのショッ
トガン相では、同一量の試料をダイ−プライマーかまたはダイ−ターミネーター
化学（Pharmacia、PE Biosystems）のいずれかによりシークエンシングした。デ
ータをLicorおよびABI 377自動シークエンサーを用いて回収し、ＧＡＰ４プログ
ラム（Bonfield, Smith, Staden, Nucl. Acids Res. 23, 4992-4999 [1995]）を
用いて組み立てた。プラスミド鋳型またはＰＣＲ生成物に対して特別注文のプラ
イマー（MWG-Biotech）をダイ−ターミネーターと組み合わせて用いてギャップ
を埋めた。
レーションにより大腸菌ＤＨ１０Ｂに形質転換し、菌体を５０μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含有するＬＢアガー培地上に広げた。３７℃で１８時間増殖させた後
、形質転換体を９６ウエル増殖ブロックに移し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン
を含む１.３ｍｌの２×ＹＴ培地中、３７℃で一夜振盪した。これら菌体からア
ルカリ溶解法（Qiagen QiaQuick Turbo Prep）により精製した二本鎖のプラスミ
ドＤＮＡを得ることにより鋳型を調製した。ユニバーサルフォアウォードおよび
リバースプライマーおよびBig Dyeターミネーターシークエンシングキット（PE
Biosystems）またはThermo Sequenase蛍光標識プライマーサイクルシークエンシ
ングキット（Amersham Pharmacia Biotech）を用い、製造業者のプロトコールを
用いてプラスミド鋳型のサイクルシークエンシングを行った。コスミドのショッ
トガン相では、同一量の試料をダイ−プライマーかまたはダイ−ターミネーター
化学（Pharmacia、PE Biosystems）のいずれかによりシークエンシングした。デ
ータをLicorおよびABI 377自動シークエンサーを用いて回収し、ＧＡＰ４プログ
ラム（Bonfield, Smith, Staden, Nucl. Acids Res. 23, 4992-4999 [1995]）を
用いて組み立てた。プラスミド鋳型またはＰＣＲ生成物に対して特別注文のプラ
イマー（MWG-Biotech）をダイ−ターミネーターと組み合わせて用いてギャップ
を埋めた。
【００５３】Ｅ．バイオインフォーマティック（Bioinformatic）法 １．オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の同定 Oxford Molecular LimitedからのＯＭＩＧＡ１.１.２（ＧＣＧ ０.４Ｄ）プロ
グラムを用い、ｐＥＰＯｃｏｓ６領域中でＯＲＦを同定した。デフォールト値（
Default values）を用いて（標準遺伝子コード、すべてのＯＲＦは５０塩基を超
える）ＯＲＦを生成した；これら結果の分析は、請求項９に記載するような１４
の最高品質のＯＲＦのリストに導いた。他のＯＲＦ、遺伝子、または遺伝子エレ
メントは、未だ注釈の付けられていないｐＥＰＯｃｏｓ６挿入物中に認めること
ができる。ＯＭＩＧＡで生成したデータを手動で編集することに加えて、ＭＡＧ
ＰＩＥ自動ゲノム分析手段： （http://genomes.rockefeller.edu/magpie/magpie.html） を用いてシークエンシングした全てのコスミドおよびプラスミドの遺伝子を同定
した。このようにして同定したＯＲＦは、以下にヌクレオチドおよびペプチドの
両ファイルとして示してある。
グラムを用い、ｐＥＰＯｃｏｓ６領域中でＯＲＦを同定した。デフォールト値（
Default values）を用いて（標準遺伝子コード、すべてのＯＲＦは５０塩基を超
える）ＯＲＦを生成した；これら結果の分析は、請求項９に記載するような１４
の最高品質のＯＲＦのリストに導いた。他のＯＲＦ、遺伝子、または遺伝子エレ
メントは、未だ注釈の付けられていないｐＥＰＯｃｏｓ６挿入物中に認めること
ができる。ＯＭＩＧＡで生成したデータを手動で編集することに加えて、ＭＡＧ
ＰＩＥ自動ゲノム分析手段： （http://genomes.rockefeller.edu/magpie/magpie.html） を用いてシークエンシングした全てのコスミドおよびプラスミドの遺伝子を同定
した。このようにして同定したＯＲＦは、以下にヌクレオチドおよびペプチドの
両ファイルとして示してある。
【００５４】 コスミドＡ２およびＡ５については、［http://www.nih.go.jp/-jun/cgi-bin/
frameplot.pl］の下に公的に入手可能なIshikawaおよびHotta（FEMS Microbiol.
Lett., 174, 251-253 [1999]）からのFramePlot分析プログラム（高いＧ＋Ｃ含
量のゲノムを有する生物に典型的なコドンでの位置に基づく塩基の嗜好（prefer
ence）（Bibbら、Gene 30, 157-166 [1984]）に基づく）を用いてＡ５およびＡ
２のＤＮＡ配列内でＯＲＦを同定した。開始コドンとしてＡＴＧおよびＧＴＧを
用いたデフォールトパラメーター（Default parameters）を用いた。予測された
ＯＲＦから導かれたアミノ酸配列を、ＢＬＡＳＴＰ（Altschulら、Nucleic Acid
s Res., 25, 3389-3402 [1997]）を用いてタンパク質データベース（GenBank, C
DS translations, PDB, SwissProt, PIR, PRF）と比較した。さらに、高スコア
のアミノ酸配列をPfamプログラム［http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/］
を用いて分析したところ、提出したタンパク質の特定のドメイン構造が同定され
た（Batemanら、Nucleic Acids Res., 27, 260-262 [1999]）。
frameplot.pl］の下に公的に入手可能なIshikawaおよびHotta（FEMS Microbiol.
Lett., 174, 251-253 [1999]）からのFramePlot分析プログラム（高いＧ＋Ｃ含
量のゲノムを有する生物に典型的なコドンでの位置に基づく塩基の嗜好（prefer
ence）（Bibbら、Gene 30, 157-166 [1984]）に基づく）を用いてＡ５およびＡ
２のＤＮＡ配列内でＯＲＦを同定した。開始コドンとしてＡＴＧおよびＧＴＧを
用いたデフォールトパラメーター（Default parameters）を用いた。予測された
ＯＲＦから導かれたアミノ酸配列を、ＢＬＡＳＴＰ（Altschulら、Nucleic Acid
s Res., 25, 3389-3402 [1997]）を用いてタンパク質データベース（GenBank, C
DS translations, PDB, SwissProt, PIR, PRF）と比較した。さらに、高スコア
のアミノ酸配列をPfamプログラム［http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/］
を用いて分析したところ、提出したタンパク質の特定のドメイン構造が同定され
た（Batemanら、Nucleic Acids Res., 27, 260-262 [1999]）。
【００５５】 ２．ＢＬＡＳＴサーチ 質問（query）配列として上記ＯＦＲ同定戦略からのペプチドファイルを用い
、ＢＬＡＳＴＰ２類似性（similarity）サーチを行った。サーチは、Bristol-My
ers Squibb Pharmaceutical Research Instituteのインストール済みの（in-hou
se）Bioinformatics BLASTP2（バージョン：BLASTP 2.0a19MP-WashU）ウエブペ
ージ（BlastN2、BlastP2、BlastX2、TblastN、およびTBlastXサーチが可能）を
用いて行った。さらに、ＭＡＧＰＩＥ分析により生成したペプチドファイルは、
ＦＡＳＴＡアルゴリズムを用いて自動的にサーチした。
、ＢＬＡＳＴＰ２類似性（similarity）サーチを行った。サーチは、Bristol-My
ers Squibb Pharmaceutical Research Instituteのインストール済みの（in-hou
se）Bioinformatics BLASTP2（バージョン：BLASTP 2.0a19MP-WashU）ウエブペ
ージ（BlastN2、BlastP2、BlastX2、TblastN、およびTBlastXサーチが可能）を
用いて行った。さらに、ＭＡＧＰＩＥ分析により生成したペプチドファイルは、
ＦＡＳＴＡアルゴリズムを用いて自動的にサーチした。
【００５６】３．最適な適合（best match）および蓋然的な同定 ＢＬＡＳＴＰ２およびＦＡＳＴＡの結果の分析は、最適な適合および蓋然的な
機能の割り当てへと導いた。最適な適合は通常、スコアの最も高い適合であった
が、しばしば他の適合もそれがより関連のあるホモログであるゆえに最適な適合
を与えたか、または＞ｅ−４よりも大きな有意の適合が認められなかった。蓋然
的な機能はＢＬＡＳＴデータおよび最適な適合に関して刊行された文献の最初の
分析を仮定して機能の最良の推定を表すものであり、必ずしも遺伝子産物の真実
の機能を表すものではない（仮想的なタンパク質は未知の機能のものである）。
高い蓋然性スコアは、蓋然的な機能が最適な適合のものに対応する可能性の高い
ことを示す；たとえば、ポリケチドシンターゼの適合はすべてｅ−１００を超え
るものであり、非常に高い有意さを仮定すれば、スコアはポリケチドシンターゼ
として機能すると推定される（高スコアのペプチドシンテターゼがそうであるよ
うに）。 以下にｐＥＰＯｃｏｓ６領域、ｐＥＰＯｃｏｓ８、Ａ５、Ｓａｕ４およびＡ２
からの配列データをまとめて示す。
機能の割り当てへと導いた。最適な適合は通常、スコアの最も高い適合であった
が、しばしば他の適合もそれがより関連のあるホモログであるゆえに最適な適合
を与えたか、または＞ｅ−４よりも大きな有意の適合が認められなかった。蓋然
的な機能はＢＬＡＳＴデータおよび最適な適合に関して刊行された文献の最初の
分析を仮定して機能の最良の推定を表すものであり、必ずしも遺伝子産物の真実
の機能を表すものではない（仮想的なタンパク質は未知の機能のものである）。
高い蓋然性スコアは、蓋然的な機能が最適な適合のものに対応する可能性の高い
ことを示す；たとえば、ポリケチドシンターゼの適合はすべてｅ−１００を超え
るものであり、非常に高い有意さを仮定すれば、スコアはポリケチドシンターゼ
として機能すると推定される（高スコアのペプチドシンテターゼがそうであるよ
うに）。 以下にｐＥＰＯｃｏｓ６領域、ｐＥＰＯｃｏｓ８、Ａ５、Ｓａｕ４およびＡ２
からの配列データをまとめて示す。
【００５７】ａ．ｐＥＰＯｃｏｓ６領域からのデータ ： まとめ：大きなＰＫＳ／ＰＳクラスターが複数のコスミドにまたがる：ＩＳエ
レメント（ここではＩＳ−Ｓｃ１と称する）が該クラスターに認められる−これ
はSorangiumの遺伝子分析のための潜在的な手段である。 統計：配列を２０００以上のランダムな配列（得られた約２ｋｂのクローニン
グ断片の順の（forward）および逆の（reverse）読取り）から組み立てた。 ４７,７１３ヌクレオチドの隣接配列（ｐＦＤ６６６ベクターは含まず） ＤＮＡ配列データは請求項７に記載のとおり。 付記：ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ７配列（請求項９を参照）：ＯＲＦ７の予測
されたＮ末端はＯＲＦ６と１４５ヌクレオチドの重複を示した。 付記：ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ８配列（請求項９を参照）：＞ｐＥＰＯｃｏ
ｓ６ ＯＲＦ８.ｓｅｑ（図２では「ＯＲＦ９ ｕｐ」） ６７.３％Ｇ＋Ｃ 表３は、ＯＲＦデータをまとめて示す。付記：ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ１.
ｓｅｑはその５'末端が切り取られている；これと対応してｐＥＰＯｃｏｓ６
ＯＲＦ１.ｐｅｐはそのＮ末端が切り取られている。
レメント（ここではＩＳ−Ｓｃ１と称する）が該クラスターに認められる−これ
はSorangiumの遺伝子分析のための潜在的な手段である。 統計：配列を２０００以上のランダムな配列（得られた約２ｋｂのクローニン
グ断片の順の（forward）および逆の（reverse）読取り）から組み立てた。 ４７,７１３ヌクレオチドの隣接配列（ｐＦＤ６６６ベクターは含まず） ＤＮＡ配列データは請求項７に記載のとおり。 付記：ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ７配列（請求項９を参照）：ＯＲＦ７の予測
されたＮ末端はＯＲＦ６と１４５ヌクレオチドの重複を示した。 付記：ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ８配列（請求項９を参照）：＞ｐＥＰＯｃｏ
ｓ６ ＯＲＦ８.ｓｅｑ（図２では「ＯＲＦ９ ｕｐ」） ６７.３％Ｇ＋Ｃ 表３は、ＯＲＦデータをまとめて示す。付記：ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ１.
ｓｅｑはその５'末端が切り取られている；これと対応してｐＥＰＯｃｏｓ６
ＯＲＦ１.ｐｅｐはそのＮ末端が切り取られている。
【００５８】ｂ．ｐＥＰＯｃｏｓ８領域からのデータ ： まとめ：２つのＰＫＳ遺伝子がコスミド上に見出された。Ｔｎ１０００挿入も
また見出される（大腸菌の増殖の際に生じた）。ペプチドシンテターゼ遺伝子は
見出されなかった；一つのＰ４５０ヒドロキシラーゼが同定された。 統計：ｐＥＰＯｃｏｓ８ライブラリーからの１９５２のランダムな配列の読取
りをphrapを用いて組み立て、１０２４の配列を５７のコンティグに組み立てた
。これらコンティグの中から１２のコンティグ（合計５６,５３７ｂｐ）を選ん
だ；これらはそれぞれ＞６の読取りを含み、約１０００ｂｐもしくはそれ以上か
らなっていた。これら１２のコンティグおよび関連するＯＲＦの配列を以下に示
す。 コンティグからのＤＮＡ配列データは請求項１０に記載のとおりである。表４
はさらなるデータを示す。 ｐＥＰＯｃｏｓ８タンパク質データは、請求項１１に記載のとおりである、す
なわち、選択したＯＲＦ（ポリケチドシンターゼ、ペプチドシンテターゼ、また
は既知の遺伝子と高い類似性を有するＯＲＦ）について。
また見出される（大腸菌の増殖の際に生じた）。ペプチドシンテターゼ遺伝子は
見出されなかった；一つのＰ４５０ヒドロキシラーゼが同定された。 統計：ｐＥＰＯｃｏｓ８ライブラリーからの１９５２のランダムな配列の読取
りをphrapを用いて組み立て、１０２４の配列を５７のコンティグに組み立てた
。これらコンティグの中から１２のコンティグ（合計５６,５３７ｂｐ）を選ん
だ；これらはそれぞれ＞６の読取りを含み、約１０００ｂｐもしくはそれ以上か
らなっていた。これら１２のコンティグおよび関連するＯＲＦの配列を以下に示
す。 コンティグからのＤＮＡ配列データは請求項１０に記載のとおりである。表４
はさらなるデータを示す。 ｐＥＰＯｃｏｓ８タンパク質データは、請求項１１に記載のとおりである、す
なわち、選択したＯＲＦ（ポリケチドシンターゼ、ペプチドシンテターゼ、また
は既知の遺伝子と高い類似性を有するＯＲＦ）について。
【００５９】ｃ．コスミドＡ５挿入からのデータ ： まとめ：ＰＫＳ遺伝子およびＰＳ遺伝子のクラスターが該コスミド上で見出さ
れた。この二次的な代謝産物の生成に関与しているかもしれない他の遺伝子とし
ては、真核生物のオーソログ（orthologs）に極めて類似する下流リポキシゲナ
ーゼ遺伝子が挙げられる。 統計：Ａ５ライブラリーからの８８０のランダムな配列の読取りをphrapを用
いて組み立て、５３０の配列を１２のコンティグに組み立てた。これらコンティ
グの中から３つのコンティグ（合計４１,５５６ｂｐ）を選んだ；これらはそれ
ぞれ＞１００の読取りを含み、約９０００ｂｐもしくはそれ以上からなっていた
。これら３つのコンティグおよび関連するＯＲＦの配列を以下に示す。 コンティグからのＤＮＡ配列データは請求項１２に記載のとおりである。表５
はさらなるデータを示す。 選択したＡ５ ＯＲＦからのタンパク質配列データは、請求項１３に記載のと
おりである。
れた。この二次的な代謝産物の生成に関与しているかもしれない他の遺伝子とし
ては、真核生物のオーソログ（orthologs）に極めて類似する下流リポキシゲナ
ーゼ遺伝子が挙げられる。 統計：Ａ５ライブラリーからの８８０のランダムな配列の読取りをphrapを用
いて組み立て、５３０の配列を１２のコンティグに組み立てた。これらコンティ
グの中から３つのコンティグ（合計４１,５５６ｂｐ）を選んだ；これらはそれ
ぞれ＞１００の読取りを含み、約９０００ｂｐもしくはそれ以上からなっていた
。これら３つのコンティグおよび関連するＯＲＦの配列を以下に示す。 コンティグからのＤＮＡ配列データは請求項１２に記載のとおりである。表５
はさらなるデータを示す。 選択したＡ５ ＯＲＦからのタンパク質配列データは、請求項１３に記載のと
おりである。
【００６０】ｄ．プラスミドＳａｕ４挿入からのデータ ： まとめ：挿入は２つの大きなコンティグ上にＰＫＳ遺伝子を含む−Sorangium
からのsoraphen ＰＫＳ遺伝子と最も類似。 統計：Ｓａｕ４ライブラリーからの５６５のランダムな配列の読取りをphrap
を用いて組み立て、８４の配列を１８のコンティグに組み立てた。これらコンテ
ィグの中から２つのコンティグ（合計６５９６ｂｐ）を選んだ；これらはそれぞ
れ＞１０の読取りを含み、約１０００ｂｐもしくはそれ以上からなっていた。こ
れら２つのコンティグおよび関連するＯＲＦの配列を以下に示す。 プラスミドＳａｕ４コンティグからのＤＮＡ配列データは請求項１４に記載の
とおりである。表６はさらなるデータを示す。 選択したプラスミドＳａｕ４ ＯＲＦからのタンパク質配列データは、請求項
１５に記載のとおりである。ｅ．コスミドＡ２からのデータ ： 表７はＯＲＦデータをまとめて示す。
からのsoraphen ＰＫＳ遺伝子と最も類似。 統計：Ｓａｕ４ライブラリーからの５６５のランダムな配列の読取りをphrap
を用いて組み立て、８４の配列を１８のコンティグに組み立てた。これらコンテ
ィグの中から２つのコンティグ（合計６５９６ｂｐ）を選んだ；これらはそれぞ
れ＞１０の読取りを含み、約１０００ｂｐもしくはそれ以上からなっていた。こ
れら２つのコンティグおよび関連するＯＲＦの配列を以下に示す。 プラスミドＳａｕ４コンティグからのＤＮＡ配列データは請求項１４に記載の
とおりである。表６はさらなるデータを示す。 選択したプラスミドＳａｕ４ ＯＲＦからのタンパク質配列データは、請求項
１５に記載のとおりである。ｅ．コスミドＡ２からのデータ ： 表７はＯＲＦデータをまとめて示す。
【００６１】Ｆ．適当な組換え発現ベクターの構築 １．粘液細菌での発現 図１に示すＯＲＦの異種発現を、プラスミドｐＳＵＰ１０２の誘導体を用いて
行った（Simon, R., Priefer, U., Puhler, A., Methods in Enzymology (1986)
, vol. 118, pp. 643-659）。このプラスミドでは、クロラムフェニコール耐性
の遺伝子を、ストレプトマイシン耐性の遺伝子およびＴｎ５トランスポゾンのプ
ロモーターエレメントを含むカセットに変えてある。宿主生物からの短い相同ゲ
ノムＤＮＡセグメントを、図１のＤＮＡ配列および有効な調節エレメントととも
に、たとえば該ベクターのＥｃｏＲＩ制限部位にライゲートする。大腸菌中での
該ベクターの増幅後、ＤＮＡを宿主細胞のエレクトロポレーションによるかまた
は大腸菌Ｓ１７−Ｉとの接合により移動させる（Simon, R., Priefer, U., Puhl
er, A., Biotechnology (1983), vol. 1, pp. 784-791）。 該ベクターによって媒介されるテトラサイクリン耐性またはストレプトマイシ
ン耐性により、相同組換えによる組換えプラスミドＤＮＡの染色体中への組み込
みについて宿主細胞をチェックする。
行った（Simon, R., Priefer, U., Puhler, A., Methods in Enzymology (1986)
, vol. 118, pp. 643-659）。このプラスミドでは、クロラムフェニコール耐性
の遺伝子を、ストレプトマイシン耐性の遺伝子およびＴｎ５トランスポゾンのプ
ロモーターエレメントを含むカセットに変えてある。宿主生物からの短い相同ゲ
ノムＤＮＡセグメントを、図１のＤＮＡ配列および有効な調節エレメントととも
に、たとえば該ベクターのＥｃｏＲＩ制限部位にライゲートする。大腸菌中での
該ベクターの増幅後、ＤＮＡを宿主細胞のエレクトロポレーションによるかまた
は大腸菌Ｓ１７−Ｉとの接合により移動させる（Simon, R., Priefer, U., Puhl
er, A., Biotechnology (1983), vol. 1, pp. 784-791）。 該ベクターによって媒介されるテトラサイクリン耐性またはストレプトマイシ
ン耐性により、相同組換えによる組換えプラスミドＤＮＡの染色体中への組み込
みについて宿主細胞をチェックする。
【００６２】２．Streptomyces菌体での発現 図１に示すＯＲＦの異種発現を、２機能性のStreptomyces−大腸菌コスミドｐ
ＫＵ２０６およびｐＯＪ４６６を用いて行う。３．大腸菌菌体での発現 図１に示すＯＲＦの異種発現を、「細菌人工染色体」、コスミド（たとえば、
Ｓｕｐｅｒｃｏｓ、Stratagene GmbH、ハイデルベルク）およびＴ７発現系（Str
atagene GmbH、ハイデルベルク；New England Biolabs、シュバルツバッハ、Ｆ
ＲＧ）を用いて行う。組換え酵素の発現は、ホロ酵素のポリケチドシンテターゼ
およびポリペプチドシンテターゼの生成に必要なホスホパンテテイニルトランス
フェラーゼを構成的に発現する大腸菌菌体で起こる。
ＫＵ２０６およびｐＯＪ４６６を用いて行う。３．大腸菌菌体での発現 図１に示すＯＲＦの異種発現を、「細菌人工染色体」、コスミド（たとえば、
Ｓｕｐｅｒｃｏｓ、Stratagene GmbH、ハイデルベルク）およびＴ７発現系（Str
atagene GmbH、ハイデルベルク；New England Biolabs、シュバルツバッハ、Ｆ
ＲＧ）を用いて行う。組換え酵素の発現は、ホロ酵素のポリケチドシンテターゼ
およびポリペプチドシンテターゼの生成に必要なホスホパンテテイニルトランス
フェラーゼを構成的に発現する大腸菌菌体で起こる。
【００６３】表３．ｐＥＰＯｃｏｓ６領域遺伝子の注釈のまとめ（続き）
【表２】 ａ 予想されるＯＲＦ１遺伝子および遺伝子産物は、ＤＮＡのコスミドベクター
中へのクローニングのために末端欠失している。ｂ ７３１は最後のアミノ酸コードコドンの最後のヌクレオチドである；７３２
−７３５はＴＧＡ（終止コドン）である。終止コドンは注釈から外してある。ｃ 注：ＯＲＦ７の予想されるＮ末端は、ＯＲＦ６と１４５ヌクレオチドの重複
を示す。ｄ 注：反対鎖上のＯＲＦ − Agrobacterium tumefaciensからのＩＳ１１３１
（ＩＳ−６６様エレメント、２７７３ｂｐ、４ＯＲＦ、１１ｂｐインバーテッド
リピート）と同様のｂｐ１６８６３−１４１３０からの転位性因子（２７３３ｂ
ｐ、１１ｂｐターミナルインバーテッドリピート）を構成。
中へのクローニングのために末端欠失している。ｂ ７３１は最後のアミノ酸コードコドンの最後のヌクレオチドである；７３２
−７３５はＴＧＡ（終止コドン）である。終止コドンは注釈から外してある。ｃ 注：ＯＲＦ７の予想されるＮ末端は、ＯＲＦ６と１４５ヌクレオチドの重複
を示す。ｄ 注：反対鎖上のＯＲＦ − Agrobacterium tumefaciensからのＩＳ１１３１
（ＩＳ−６６様エレメント、２７７３ｂｐ、４ＯＲＦ、１１ｂｐインバーテッド
リピート）と同様のｂｐ１６８６３−１４１３０からの転位性因子（２７３３ｂ
ｐ、１１ｂｐターミナルインバーテッドリピート）を構成。
【００６４】表４．ｐＥＰＯｃｏｓ８の組み立て分析のまとめ（続き） ａ．ｐＥＰＯｃｏｓ８の組み立て組み立て サイズ（ＢＰ） コンティグ４３ １０１７ コンティグ４４ １２４６ コンティグ４８ ９７８ コンティグ４９ １９６９ コンティグ５０ ２８７７ コンティグ５１ ２３１９ コンティグ５２ １８８３ コンティグ５３ ４８７１ コンティグ５４ ７２５７ コンティグ５５ ５０２１ コンティグ５６ １０９４５ コンティグ５７ １６１５４
【００６５】 ｂ．ｐＥＰＯｃｏｓ８のコンティグ５６および５７からの選択したＯＲＦ
【表３】
【表４】
【００６６】表５：Ａ５の組み立て分析のまとめ（続き） ａ．ｐＥＰＯｃｏｓ８の組み立て
【表５】
【００６７】 表５． ｂ．コスミドＡ５からの選択したＯＲＦ
【表６】
【表７】
【表８】
【００６８】表６．Ｓａｕ４組み立て分析のまとめ ａ．プラスミドＳａｕ４の組み立て組み立て サイズ（ｂｐ） コンティグ１７ ２５８１ コンティグ１８ ４０１５ ｂ．コスミドＡ５からの選択したＯＲＦ
【表９】
【００６９】表７．Ａ２挿入からのＯＲＦデータのまとめ
【表１０】
【図１】 本発明のＤＮＡ配列の一つ（コスミドＡ２挿入物）の制限地図で
あって、調節ＤＮＡセグメントおよび個々の構造遺伝子（「オープンリーディン
グフレーム」またはＯＲＦ）１〜１６の配置をも示す。
あって、調節ＤＮＡセグメントおよび個々の構造遺伝子（「オープンリーディン
グフレーム」またはＯＲＦ）１〜１６の配置をも示す。
【図２】 ｐＥＰＯｃｏｓ６領域上に認められるオープンリーディングフレ
ームを示す。
ームを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:465） Ｃ１２Ｒ 1:465） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ヘルムート・ブレッカー ドイツ連邦共和国デー−38124ブラウンシ ュヴァイヒ、マッシェローダー・ヴェーク １番 (72)発明者 ペトラ・ブラント ドイツ連邦共和国デー−38124ブラウンシ ュヴァイヒ、マッシェローダー・ヴェーク １番 (72)発明者 ポール・エム・チノ アメリカ合衆国08805ニュージャージー州 バウンド・ブルック、クレスト・ドライブ ４番 (72)発明者 ブライアン・エイ・ドガーティ アメリカ合衆国06419コネチカット州キリ ングワース、ローズマリー・レイン10番 (72)発明者 スティーブン・エル・ゴールドバーグ アメリカ合衆国07920ニュージャージー州 バスキング・リッジ、コンプトン・コート 25番 (72)発明者 ゲルハルト・ホフレ ドイツ連邦共和国デー−38124ブラウンシ ュヴァイヒ、マッシェローダー・ヴェーク １番 (72)発明者 ロルフ−ヨアヒム・ミューラー ドイツ連邦共和国デー−38124ブラウンシ ュヴァイヒ、マッシェローダー・ヴェーク １番 (72)発明者 ハンス・ライヒェンバッハ ドイツ連邦共和国デー−38124ブラウンシ ュヴァイヒ、マッシェローダー・ヴェーク １番 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 BA07 CA04 DA05 DA06 DA08 EA04 EA06 GA11 HA01 4B050 CC03 DD02 LL05 4B064 AC31 CA02 CA19 CC24 DA16 4B065 AA01X AA01Y AA26X AA50X AB01 AC14 BA02 CA09 CA13 CA27 CA44 【要約の続き】 る。以下のコスミドおよびプラスミドのためにＤＮＡ配 列および分析が提示される：−Ａ２コスミド−ｐＥＰＯ ｃｏｓ６領域（ｐＥＰＯｃｏｓ６とｐＥＰＯｃｏｓ７と の重複）−ｐＥＰＯｃｏｓ８コスミド−Ａ５コスミド− Ｓａｕ４（１０ｋｂプラスミド）。
Claims (24)
- 【請求項１】 その発現産物がポリケチドまたはヘテロポリケチド化合物の
酵素的生合成、変異合成または部分的合成を引き起こすかまたは関与している、
ＤＮＡ配列。 - 【請求項２】 該ポリケチドまたはヘテロポリケチド化合物がエポチロンで
ある、請求項１に記載のＤＮＡ配列。 - 【請求項３】 該ＤＮＡが粘液細菌に由来する、請求項１または２に記載の
ＤＮＡ配列。 - 【請求項４】 該ＤＮＡがSorangium株に由来する、請求項１ないし３のい
ずれかに記載のＤＮＡ配列。 - 【請求項５】 該ＤＮＡがSorangium cellulosumに由来する、請求項１ない
し４のいずれかに記載のＤＮＡ配列。 - 【請求項６】 該ＤＮＡが、 （ａ）下記ＤＮＡ配列： 配列番号１（Ａ２コスミド） 【化１】 【化２】 【化３】 【化４】 【化５】 【化６】 【化７】 【化８】 【化９】 【化１０】 【化１１】 【化１２】 【化１３】 【化１４】 【化１５】 【化１６】 【化１７】 【化１８】 【化１９】 【化２０】 【化２１】 またはその相補鎖、 （ｂ）タンパク質をコードする（ａ）に記載のＤＮＡ配列の領域にストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列または該ＤＮＡ配列の断片、 （ｃ）遺伝子コードの縮重のために（ａ）および（ｂ）に記載のＤＮＡ配列にハ
イブリダイズするＤＮＡ配列、 （ｄ）（ａ）〜（ｃ）に記載のＤＮＡ配列のヌクレオチドの置換、挿入または欠
失またはヌクレオチドセグメントの転位の結果得られるアレル変異体および突然
変異体であって、該変異体および突然変異体がイソ機能的な発現産物を与えるも
の よりなる群から選ばれたものである、請求項１ないし５のいずれかに記載のＤＮ
Ａ配列。 - 【請求項７】 該ＤＮＡが、 （ａ）下記ＤＮＡ配列： 配列番号２（＞ｐＥＰＯｃｏｓ６領域） 【化２２】 【化２３】 【化２４】 【化２５】 【化２６】 【化２７】 【化２８】 【化２９】 【化３０】 【化３１】 【化３２】 【化３３】 【化３４】 【化３５】 【化３６】 【化３７】 【化３８】 【化３９】 【化４０】 【化４１】 【化４２】 【化４３】 【化４４】 【化４５】 【化４６】 【化４７】 またはその相補鎖、 （ｂ）タンパク質をコードする（ａ）に記載のＤＮＡ配列の領域にストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列または該ＤＮＡ配列の断片、 （ｃ）遺伝子コードの縮重のために（ａ）および（ｂ）に記載のＤＮＡ配列にハ
イブリダイズするＤＮＡ配列、 （ｄ）（ａ）〜（ｃ）に記載のＤＮＡ配列のヌクレオチドの置換、挿入または欠
失またはヌクレオチドセグメントの転位の結果得られるアレル変異体および突然
変異体であって、該変異体および突然変異体がイソ機能的な発現産物を与えるも
の よりなる群から選ばれたものである、請求項１ないし５のいずれかに記載のＤＮ
Ａ配列。 - 【請求項８】 下記のもの （ａ）オープンリーディングフレーム： ヌクレオチド位置 ＯＲＦ１ １６６６−１ 配列番号３ ＯＲＦ２ １６０５−３３３８ 配列番号４ ＯＲＦ３ ６１００−３３９８ 配列番号５ ＯＲＦ４ ７１１０−６３７４ 配列番号６ ＯＲＦ５ ９５９０−８４３３ 配列番号７ ＯＲＦ６ １１３９３−９８５５ 配列番号８ ＯＲＦ７ １３６５６−１２７１２ 配列番号９ ＯＲＦ８ １５３７４−１８９８４ 配列番号１０ ＯＲＦ９ ２０００３−２７８８９ 配列番号１１ ＯＲＦ１０ ２８２５１−２９４０２ 配列番号１２ ＯＲＦ１１ ３１７２０−３０４０１ 配列番号１３ ＯＲＦ１２ ３１９８２−３２９３２ 配列番号１４ ＯＲＦ１３ ３３１２８−３３６１３ 配列番号１５ ＯＲＦ１４ ３３６６１−３４００７ 配列番号１６ ＯＲＦ１５ ３５６１１−３５２５５ 配列番号１７ ＯＲＦ１６ ３７８５６−３５７３０ 配列番号１８ または該オープンリーディングフレームに相補的なＤＮＡ配列、 （ｂ）タンパク質をコードする（ａ）に記載のＤＮＡ配列の領域にストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列または該ＤＮＡ配列の断片、 （ｃ）遺伝子コードの縮重のために（ａ）および（ｂ）に記載のＤＮＡ配列にハ
イブリダイズするＤＮＡ配列、 （ｄ）（ａ）〜（ｃ）に記載のＤＮＡ配列のヌクレオチドの置換、挿入または欠
失またはヌクレオチドセグメントの転位の結果得られるアレル変異体および突然
変異体であって、該変異体および突然変異体がイソ機能的な発現産物、 および該オープンリーディングフレームに対応するペプチド配列 配列番号１９（＞ＯＲＦ１） 【化４８】 配列番号２０（＞ＯＲＦ２） 【化４９】 配列番号２１（＞ＯＲＦ３） 【化５０】 配列番号２２（＞ＯＲＦ４） 【化５１】 配列番号２３（＞ＯＲＦ５） 【化５２】 配列番号２４（＞ＯＲＦ６） 【化５３】 配列番号２５（＞ＯＲＦ７） 【化５４】 配列番号２６（＞ＯＲＦ８） 【化５５】 配列番号２７（＞ＯＲＦ９） 【化５６】 【化５７】 配列番号２８（＞ＯＲＦ１０） 【化５８】 配列番号２９（＞ＯＲＦ１１） 【化５９】 配列番号３０（＞ＯＲＦ１２） 【化６０】 配列番号３１（＞ＯＲＦ１３） 【化６１】 配列番号３２（＞ＯＲＦ１４） 【化６２】 配列番号３３（＞ＯＲＦ１５） 【化６３】 配列番号３４（＞ＯＲＦ１６） 【化６４】 を与えるもの よりなる群から選ばれたものである、請求項６に記載のＤＮＡ配列。 - 【請求項９】 下記のもの （ａ）オープンリーディングフレーム、および該オープンリーディングフレーム
に対応するペプチド配列： ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ１配列： （１）ヌクレオチド配列 配列番号３５（＞ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ１.ｓｅｑ） 【化６５】 （２）ペプチド配列 配列番号３６（＞ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ１.ｐｅｐ） 【化６６】 ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ２配列： （１）ヌクレオチド配列 配列番号３７（＞ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ２.ｓｅｑ） 【化６７】 【化６８】 （２）ペプチド配列 配列番号３８（＞ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ２.ｐｅｐ） 【化６９】 ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ３配列： （１）ヌクレオチド配列 配列番号３９（＞ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ３.ｓｅｑ） 【化７０】 （２）ペプチド配列 配列番号４０（＞ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ３.ｐｅｐ） 【化７１】 ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ４配列： （１）ヌクレオチド配列 配列番号４１（＞ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ４.ｓｅｑ） 【化７２】 （２）ペプチド配列 配列番号４２（＞ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ４.ｐｅｐ） 【化７３】 ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ５配列： （１）ヌクレオチド配列 配列番号４３（＞ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ５.ｓｅｑ） 【化７４】 【化７５】 【化７６】 【化７７】 【化７８】 【化７９】 （２）ペプチド配列 配列番号４４（＞ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ５.ｐｅｐ） 【化８０】 【化８１】 ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ６配列： （１）ヌクレオチド配列 配列番号４５（＞ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ６.ｓｅｑ） 【化８２】 【化８３】 （２）ペプチド配列 配列番号４６（＞ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ６.ｐｅｐ） 【化８４】 ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ７配列： （１）ヌクレオチド配列 配列番号４７（＞ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ７.ｓｅｑ） 【化８５】 【化８６】 （２）ペプチド配列 配列番号４８（＞ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ７.ｐｅｐ） 【化８７】 ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ７.１配列： （１）ヌクレオチド配列 配列番号４９（＞ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ７.１.ｓｅｑ） 【化８８】 【化８９】 （２）ペプチド配列 配列番号５０（＞ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ７.１.ｐｅｐ） 【化９０】 ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ７.２配列： （１）ヌクレオチド配列 配列番号５１（＞ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ７.２.ｓｅｑ） 【化９１】 （２）ペプチド配列 配列番号５２（＞ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ７.２.ｐｅｐ） 【化９２】 ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ７.３配列： （１）ヌクレオチド配列 配列番号５３（＞ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ７.３.ｓｅｑ） 【化９３】 （２）ペプチド配列 配列番号５４（＞ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ７.３.ｐｅｐ） 【化９４】 ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ８配列： （１）ヌクレオチド配列 配列番号５５（＞ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ８.ｓｅｑ） 【化９５】 （２）ペプチド配列 配列番号５６（＞ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ８.ｐｅｐ） 【化９６】 ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ９配列： （１）ヌクレオチド配列 配列番号５７（＞ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ９.ｓｅｑ） 【化９７】 【化９８】 【化９９】 【化１００】 【化１０１】 （２）ペプチド配列 配列番号５８（＞ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ９.ｐｅｐ） 【化１０２】 【化１０３】 ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ１０配列： （１）ヌクレオチド配列 配列番号５９（＞ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ１０.ｓｅｑ） 【化１０４】 【化１０５】 【化１０６】 （２）ペプチド配列 配列番号６０（＞ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ１０.ｐｅｐ） 【化１０７】 ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ１１配列： （１）ヌクレオチド配列 配列番号６１（＞ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ１１.ｓｅｑ） 【化１０８】 【化１０９】 【化１１０】 （２）ペプチド配列 配列番号６２（＞ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ１１.ｐｅｐ） 【化１１１】 【化１１２】 ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ１２配列： （１）ヌクレオチド配列 配列番号６３（＞ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ１２.ｓｅｑ） 【化１１３】 【化１１４】 【化１１５】 【化１１６】 【化１１７】 （２）ペプチド配列 配列番号６４（＞ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ１２.ｐｅｐ） 【化１１８】 【化１１９】 【化１２０】 ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ１３配列： （１）ヌクレオチド配列 配列番号６５（＞ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ１３.ｓｅｑ） 【化１２１】 【化１２２】 【化１２３】 【化１２４】 （２）ペプチド配列 配列番号６６（＞ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ１３.ｐｅｐ） 【化１２５】 【化１２６】 ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ１３.１配列： （１）ヌクレオチド配列 配列番号６７（＞ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ１３.１.ｓｅｑ） 【化１２７】 （２）ペプチド配列 配列番号６８（＞ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ１３.１.ｐｅｐ） 【化１２８】 ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ１４配列： （１）ヌクレオチド配列 配列番号６９（＞ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ１４.ｓｅｑ） 【化１２９】 （２）ペプチド配列 配列番号７０（＞ｐＥＰＯｃｏｓ６ ＯＲＦ１４.ｐｅｐ） 【化１３０】 または該オープンリーディングフレームに相補的なＤＮＡ配列、 （ｂ）タンパク質をコードする（ａ）に記載のＤＮＡ配列の領域にストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列または該ＤＮＡ配列の断片、 （ｃ）遺伝子コードの縮重のために（ａ）および（ｂ）に記載のＤＮＡ配列にハ
イブリダイズするＤＮＡ配列、 （ｄ）（ａ）〜（ｃ）に記載のＤＮＡ配列のヌクレオチドの置換、挿入または欠
失またはヌクレオチドセグメントの転位の結果得られるアレル変異体および突然
変異体であって、該変異体および突然変異体がイソ機能的な発現産物 よりなる群から選ばれたものである、請求項７に記載のＤＮＡ配列。 - 【請求項１０】 該ＤＮＡが （ａ）下記ＤＮＡ配列： 配列番号７１（＞コンティグ４３） 【化１３１】 配列番号７２（＞コンティグ４４） 【化１３２】 【化１３３】 配列番号７３（＞コンティグ４８） 【化１３４】 【化１３５】 配列番号７４（＞コンティグ４９） 【化１３６】 【化１３７】 配列番号７５（＞コンティグ５０） 【化１３８】 【化１３９】 【化１４０】 配列番号７６（＞コンティグ５１） 【化１４１】 【化１４２】 【化１４３】 配列番号７７（＞コンティグ５２） 【化１４４】 【化１４５】 配列番号７８（＞コンティグ５３） 【化１４６】 【化１４７】 【化１４８】 【化１４９】 【化１５０】 配列番号７９（＞コンティグ５４） 【化１５１】 【化１５２】 【化１５３】 【化１５４】 【化１５５】 【化１５６】 配列番号８０（＞コンティグ５５） 【化１５７】 【化１５８】 【化１５９】 【化１６０】 配列番号８１（＞コンティグ５６） 【化１６１】 【化１６２】 【化１６３】 【化１６４】 【化１６５】 【化１６６】 【化１６７】 【化１６８】 配列番号８２（＞コンティグ５７） 【化１６９】 【化１７０】 【化１７１】 【化１７２】 【化１７３】 【化１７４】 【化１７５】 【化１７６】 【化１７７】 【化１７８】 【化１７９】 【化１８０】 またはその相補鎖、 （ｂ）タンパク質をコードする（ａ）に記載のＤＮＡ配列の領域にストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列または該ＤＮＡ配列の断片、 （ｃ）遺伝子コードの縮重のために（ａ）および（ｂ）に記載のＤＮＡ配列にハ
イブリダイズするＤＮＡ配列、 （ｄ）（ａ）〜（ｃ）に記載のＤＮＡ配列のヌクレオチドの置換、挿入または欠
失またはヌクレオチドセグメントの転位の結果得られるアレル変異体および突然
変異体であって、該変異体および突然変異体がイソ機能的な発現産物 よりなる群から選ばれたものである、請求項１ないし５のいずれかに記載のＤＮ
Ａ配列。 - 【請求項１１】 配列番号８３ ＞コンティグ５６ ００３ ２８９０アミノ酸 ＭＷ＝３０７４２８ Ｄ ｐＩ
＝５.７６ numambig＝１３ 【化１８１】 【化１８２】 【化１８３】 配列番号８４ ＞コンティグ５６ ０２７ ７００アミノ酸 ＭＷ＝８０５６９ Ｄ ｐＩ＝７
.０２ numambig＝０ 【化１８４】 配列番号８５ ＞コンティグ５７ ００１ ３７２アミノ酸 ＭＷ＝３８４１１ Ｄ ｐＩ＝１
２.３９ numambig＝１０ 【化１８５】 配列番号８６ ＞コンティグ５７ ００２ ２２５９アミノ酸 ＭＷ＝２３８２５８ Ｄ ｐＩ
＝５.９２ numambig＝０ 【化１８６】 【化１８７】 配列番号８７ ＞コンティグ５７ ０２７ ４１９アミノ酸 ＭＷ＝４６７３７ Ｄ ｐＩ＝５
.０９ numambig＝０ 【化１８８】 配列番号８８ ＞コンティグ５７ ０４３ ４９２アミノ酸 ＭＷ＝５２６１７ Ｄ ｐＩ＝１
１.５４ numambig＝０ 【化１８９】 よりなる群から選ばれたものである、請求項１０に記載のＤＮＡ配列によりコー
ドされるペプチド。 - 【請求項１２】 （ａ）下記ＤＮＡ配列： 配列番号８９（＞コンティグ１０） 【化１９０】 【化１９１】 【化１９２】 【化１９３】 【化１９４】 【化１９５】 【化１９６】 配列番号９０（＞コンティグ１１） 【化１９７】 【化１９８】 【化１９９】 【化２００】 【化２０１】 【化２０２】 【化２０３】 【化２０４】 【化２０５】 【化２０６】 【化２０７】 【化２０８】 【化２０９】 配列番号９１（＞コンティグ１２） 【化２１０】 【化２１１】 【化２１２】 【化２１３】 【化２１４】 【化２１５】 【化２１６】 【化２１７】 【化２１８】 【化２１９】 【化２２０】 【化２２１】 またはその相補鎖、 （ｂ）タンパク質をコードする（ａ）に記載のＤＮＡ配列の領域にストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列または該ＤＮＡ配列の断片、 （ｃ）遺伝子コードの縮重のために（ａ）および（ｂ）に記載のＤＮＡ配列にハ
イブリダイズするＤＮＡ配列、 （ｄ）（ａ）〜（ｃ）に記載のＤＮＡ配列のヌクレオチドの置換、挿入または欠
失またはヌクレオチドセグメントの転位の結果得られるアレル変異体および突然
変異体であって、該変異体および突然変異体がイソ機能的な発現産物 よりなる群から選ばれたものである、請求項１ないし５のいずれかに記載のＤＮ
Ａ配列。 - 【請求項１３】 配列番号９２ ＞コンティグ１１ ００２ ５９１アミノ酸 ＭＷ＝６３６３９ Ｄ ｐＩ＝５
.８０ numambig＝０ 【化２２２】 配列番号９３ ＞コンティグ１１ ００７ ３６１アミノ酸 ＭＷ＝３８８６２ Ｄ ｐＩ＝１
０.４２ numambig＝０ 【化２２３】 配列番号９４ ＞コンティグ１１ ０１２ ８８２アミノ酸 ＭＷ＝９５０１５ Ｄ ｐＩ＝１
２.６９ numambig＝０ 【化２２４】 【化２２５】 配列番号９５ ＞コンティグ１１ ０２１ １２１３アミノ酸 ＭＷ＝１３１０１７ Ｄ ｐＩ
＝１２.４０ numambig＝０ 【化２２６】 【化２２７】 配列番号９６ ＞コンティグ１１ ０２６ ３０７９アミノ酸 ＭＷ＝３３２９８４ Ｄ ｐＩ
＝５.９７ numambig＝０ 【化２２８】 【化２２９】 配列番号９７ ＞コンティグ１１ ０１１ ５４４アミノ酸 ＭＷ＝６０１６４ Ｄ ｐＩ＝９
.１０ numambig＝０ 【化２３０】 配列番号９８ ＞コンティグ１２ ００１ ５１４アミノ酸 ＭＷ＝５６１４５ Ｄ ｐＩ＝８
.８２ numambig＝０ 【化２３１】 配列番号９９ ＞コンティグ１２ ００９ ５８２アミノ酸 ＭＷ＝６５５５５ Ｄ ｐＩ＝８
.７２ numambig＝０ 【化２３２】 配列番号１００（＞ＯＲＦ１） 【化２３３】 配列番号１０１（＞ＯＲＦ２） 【化２３４】 配列番号１０２（＞ＯＲＦ３） 【化２３５】 配列番号１０３（＞ＯＲＦ４） 【化２３６】 配列番号１０４（＞ＯＲＦ５） 【化２３７】 配列番号１０５（コンティグ１１＞ＯＲＦ１） 【化２３８】 配列番号１０６（コンティグ１１＞ＯＲＦ２） 【化２３９】 配列番号１０７（コンティグ１１＞ＯＲＦ３） 【化２４０】 配列番号１０８（コンティグ１１＞ＯＲＦ５） 【化２４１】 配列番号１０９（コンティグ１１＞ＯＲＦ６） 【化２４２】 【化２４３】 【化２４４】 配列番号１１０（コンティグ１２＞ＯＲＦ１） 【化２４５】 配列番号１１１（コンティグ１２＞ＯＲＦ２） 【化２４６】 配列番号１１２（コンティグ１２＞ＯＲＦ３） 【化２４７】 配列番号１１３（コンティグ１２＞ＯＲＦ４） 【化２４８】 配列番号１１４（コンティグ１２＞ＯＲＦ５） 【化２４９】 配列番号１１５（コンティグ１２＞ＯＲＦ６） 【化２５０】 配列番号１１６（コンティグ１２＞ＯＲＦ７） 【化２５１】 配列番号１１７（コンティグ１２＞ＯＲＦ８） 【化２５２】 配列番号１１８（コンティグ１２＞ＯＲＦ９） 【化２５３】 よりなる群から選ばれたものである、請求項１２に記載のＤＮＡ配列によりコー
ドされるペプチド。 - 【請求項１４】 該ＤＮＡが、 （ａ）下記ＤＮＡ配列： 配列番号１１９（＞コンティグ１７） 【化２５４】 【化２５５】 【化２５６】 配列番号１２０（＞コンティグ１８） 【化２５７】 【化２５８】 【化２５９】 またはその相補鎖、 （ｂ）タンパク質をコードする（ａ）に記載のＤＮＡ配列の領域にストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列または該ＤＮＡ配列の断片、 （ｃ）遺伝子コードの縮重のために（ａ）および（ｂ）に記載のＤＮＡ配列にハ
イブリダイズするＤＮＡ配列、 （ｄ）（ａ）〜（ｃ）に記載のＤＮＡ配列のヌクレオチドの置換、挿入または欠
失またはヌクレオチドセグメントの転位の結果得られるアレル変異体および突然
変異体であって、該変異体および突然変異体がイソ機能的な発現産物 よりなる群から選ばれたものである、請求項１ないし５のいずれかに記載のＤＮ
Ａ配列。 - 【請求項１５】 配列番号１２１ ＞コンティグ１７ ００１ ８２８アミノ酸 ＭＷ＝８６２５９ Ｄ ｐＩ＝５
.６０ numambig＝１ 【化２６０】 配列番号１２２ ＞コンティグ１８ ００２ ５０２アミノ酸 ＭＷ＝５３０１９ Ｄ ｐＩ＝６
.８３ numambig＝１ 【化２６１】 配列番号１２３ ＞コンティグ１８ ０１０ ８４０アミノ酸 ＭＷ＝８８０６２ Ｄ ｐＩ＝５
.７４ numambig＝６ 【化２６２】 よりなる群から選ばれたものである、請求項１４に記載のＤＮＡ配列によりコー
ドされるペプチド。 - 【請求項１６】 請求項１ないし１０、１２および１４のいずれかに記載の
ＤＮＡ配列を含む組換え発現ベクター。 - 【請求項１７】 請求項１ないし１０、１２および１４のいずれかに記載の
ＤＮＡ配列または請求項１６に記載の組換え発現ベクターでトランスフェクショ
ンまたは形質転換した原核または真核細胞。 - 【請求項１８】 該細胞が粘性細菌に由来する、請求項１７に記載の細胞。
- 【請求項１９】 該細胞がSorangium株に由来する、請求項１７に記載の細
胞。 - 【請求項２０】 該細胞がSorangium cellulosumに由来する、請求項１７に
記載の細胞。 - 【請求項２１】 該細胞がStreptomyces株に由来する、請求項１７に記載の
細胞。 - 【請求項２２】 該細胞が大腸菌に由来する、請求項１７に記載の細胞。
- 【請求項２３】 請求項１７ないし２２のいずれかに記載の細胞を適当な培
地中で培養し、ついで該培地からポリケチドまたはヘテロポリケチド化合物を単
離することを特徴とする、ポリペプチドまたはヘテロポリケチド化合物の酵素的
生合成、変異合成または部分的合成方法。 - 【請求項２４】 該ポリケチドまたはヘテロポリケチド化合物がエポチロン
である、請求項２３に記載の方法。
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