JP2002523110A - 核酸で被覆された反応室、その製造方法及び使用 - Google Patents
核酸で被覆された反応室、その製造方法及び使用Info
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Abstract
Description
容器を被覆することによる前記反応容器の製造方法、本発明方法によって製造さ
れる標準ストリップを含む試験キット、その目的に適した少なくとも2種類のオ
リゴヌクレオチドのセット、担体核酸、及び生物学的物質中における選択された
核酸の定量的検出に関する複数の利用可能性に関する。
で、分析すべきサンプルにおいて、決定した核酸(デオキシリボ核酸[DNA]
又はリボ核酸[RNA])の濃度の正確な認識が要求される。分析対象物の濃度
が非常に低い測定に対しては、酵素による増幅法がしばしば用いられる。これに
関して、特に、以下の方法:すなわち、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR,USP
4683195及び4683202,EP0201184;Hoffmann−
La Roche)、リガーゼ連鎖反応(LCR,Abbott Diagno
stics,North Chicago,イリノイ州,米国)、ストランド置
換増幅(SDA,Walkerら,[1993],PCR Methods A
ppl..3:1−6 Becton−Dickinson Resarch
Center)、及び転写媒介増幅(TMA,Gen−Probe Inc.,
San Diego,カリフォルニア州)を挙げることができ、これらによって
、分析対象核酸の濃度を非常に高感度で測定することができる。全ての前記技術
を定量に使用するための必要条件は、正確に規定された濃度の、適当な合成又は
天然核酸標準物の入手可能性であり、これらの標準物は、いずれも、外部標準物
として使用される、すなわち、平行アッセイにおいて増幅されるか、又は内部標
準物として、すなわち、同じアッセイにおいて同時に増幅される、いわゆる競合
物として使用される。適当な標準物の製造は、当業者に公知である(Zimme
rmann and Mannhalter 1996,Biotechniq
ues 21:268−279,Koehlerら,1995,Quantit
ation of mRNA by polymerase chain re
action − nonradioactive PCR methods,
Heidelberg,Springer−Verlag)。しかしながら、こ
れらの標準物を、安定で利用が容易な形態に変換させる場合に、工程技術の点で
今まで未解決の問題が存在し、このことは、未知の核酸濃度に関して再現性を有
する測定を行うための基本的な必要条件である。特に、高度に希釈した核酸を、
可能な限り最良に貯蔵する場合に、問題がある。これらの問題は、実際に、非常
に低濃度の標準物希釈シリーズ〔反応アッセイ当たり約1〜100000分子数
;これは、−20℃〜−80℃の温度で貯蔵した場合であっても、しばしば不安
定である(Koehlerら,1997,Biotechniques 23:
722−726)〕について、ほとんどの場合に実際的に実施される点に本質的
に基づいている。この問題の解消は、検出すべき核酸配列に対する配列相同性が
可能な限り少ないことを特徴とする特定の担体核酸の規定量を低濃度核酸希釈物
に添加した形態で、前記の低濃度核酸希釈物を安定化することによる(DE K
antら,1994,Biotechniques 17:934−942;K
oehlerら,1997,Biotechniques 23:722−72
6)。しかしながら、これは、常に成功するとは限らず(図1参照)、従って、
一般的に、毎日規定濃度の原液から新たに出発して、全ての必要な希釈工程を実
施することが推奨されている。しかしながら、これは、使用する前記の標準物を
労働集約的方法で調製しなければならず、ピペット作業の精度が変化し、そして
高価な希釈バッチを部分的にしか使用することができないという欠点をもたらし
ている。こうして、費やされる経費及び時間が自動的に増加すると同時に、その
方法論の再現性及び信頼性が減少する。利用技術の観点から言えば、前記手順は
不経済であって、いくつかの攪乱因子に支配され、従って、診断上の定型的実験
室用としては不適切である。
が容易であり、そして品質を変えずに長期間貯蔵することができ、更に、試験キ
ットの構成員であることもできる容器(Gefaesse)及び方法を開発する
ことにある。
って前記生成物の正確な濃度を決定し、 ・規定量の担体核酸を加えた前記の検量標準物から希釈シリーズを調製し、 ・増幅反応に適した反応室上に、前記の標準/担体核酸化合物を本発明により吸
着させる(こうすることによって、標準物として使用可能で規定どおりに被覆さ
れた容器は、品質を下げずに、長期間に亘って耐久性を有する形態に転換するこ
とができる)ことを含んで、規定の標準核酸濃度で反応室(reaumen)を
被覆することによって、解決することができる。
定型的実験室の要求を満たす試験キット、及び前記方法の多くの使用可能性であ
る。 続いて、本発明を、分子生物学的方法に関して説明する。すなわち、予備的酵
素増幅と組み合わせて種々の生物学的材料中の最小量の分析対象核酸の量を(好
ましくは自動的に)定量的に測定するための基礎を説明する。本発明の方法は、
定量的な酵素的増幅反応の標準化に適した形態に核酸を転換することを含む。驚
くべきことに、本発明の方法によると、核酸で被覆され、いわゆる“使用準備の
できた(ready−to−use)”標準反応室を製造することができること
が分かった。これは、簡単に使用するように生産されたものであり、長期間に亘
って問題なく、品質を変化させずに貯蔵することができ、そして試験キット用の
成分として用いることができる。従って、定型的診断実験室の要件を、特に自動
化分析の観点から良好に満たすことができる。
あるいはDNA及びRNAの合成同等物、並びにDNAにおける天然のデオキシ
チミジン(dT)塩基を、完全に又は部分的にデオキシウラシル(dU)によっ
て置換したDNAを意味する。適当な核酸標準物を調製し、好ましくは特定のプ
ライマーヌクレオチドを用いるPCRによって、当業者に公知の形態にする(実
施例1,項目1A−B)。核酸標準物としては、酵素的に調製した天然増幅生成
物、又は合成核酸を使用し、その核酸配列は、決定すべき配列に相同性があるか
、あるいは好ましくは同一であるか、あるいは1又は複数の点突然変異、欠失、
若しくは挿入(これらは、そのプライマー又はプローブが結合する位置よりも外
側に位置することが好ましい)により特徴付けられる。DNA標準物は、標的配
列を酵素的に(好ましくはPCRによって)増幅することによって調製するのに
対し、RNA断片は、RNAポリメラーゼを用いるイン・ビトロRNA合成によ
って、公知の方法で得ることができる(実施例2,項目2.1.,C参照)。こ
の調製された核酸断片に対して、次に、精製手順を適用する。好ましくは、アガ
ロースゲル電気泳動で処理し、次に分離したゲルから標準核酸を抽出することに
よってDNAを精製する(実施例1,項目1B)。これに対し、イン・ビトロで
調製したRNAは、当業者に公知の方法で前記のイン・ビトロ合成アッセイから
抽出する(実施例2,項目2.1.,C参照)。精製した核酸生成物の濃度の正
確な測定は、好ましくはHPLCによって得られる(Koehlerら.199
7,BioTechniques 23:722−726,実施例1,項目2)
。次に、前記の測定した標準核酸の希釈シリーズを調製する。DNA標準物の希
釈には、好ましくは、約1〜2キロ塩基(kb)の断片に超音波処理(5×1分
間持続)することによって、ラムダファージ(例えば、株:ラムダcl857S
am7,48502bp,ラムダDNA)のDNAを形質転換することによって
調製されるDNA溶液を使用する(実施例1,項目3;アガロースゲル電気泳動
によってフラグメントの平均長さを決定)。この工程は、凍結乾燥工程の間に吸
着の向上をもたらし、そして反応室中の標準核酸の耐久性の増加に貢献するもの
と考えられる。また、前記ラムダDNAを修正せずに用いること、又はラムダD
NAの代わりにE.coliのtRNAを用いることもできる。RNA標準物の
希釈には、好ましくは、トランスポートRNA(tRNA)溶液を使用する(K
oehlerら,1995,Quantitation of mRNA by
polymerase chain reaction−Nonradioa
ctive PCR methods.Heidelberg,Springe
r−Verlag,実施例2,項目2.2.)。
項目3;実施例2,項目2.2)。これらの希釈物により、測定すべき分析対象
の完全な生理学的又は技術的濃度範囲を好適に測定することができる。それらの
アリコートは、反応室を被覆するために使用され、その反応室内で、例えば、検
量グラフの確立に必要な酵素的核酸増幅が実施されることになる。好ましくは、
別々の反応室8個を、8種類の標準希釈物で被覆する〔いわゆる、八重ストリッ
プ(8−er strip)〕。本発明によると、前記担体核酸を補った前記の
それぞれの標準核酸希釈物のアリコートを、使用する反応室内で直接穏和に乾燥
させることによって前記被覆を実施する(実施例1,項目4;実施例2,項目2
.3.)。特に好ましい方法では、前記凍結乾燥は、真空遠心分離又は冷凍乾燥
機によってもたらされる。別の態様においては、前記乾燥は、同等の乾燥法、例
えば、マイクロ波(例えば、GWE mbH,Leunaにより販売されている
)による過加熱を伴わない生成物乾燥法によって実施する。製造した被覆反応室
(例えば、前記のもの)は、吸着した核酸標準物が、被覆に使用した反応室の内
部表面上に強固に接着するので、例えば、郵便による出荷が問題を起こさないこ
とを保証することができるという特徴を有する。図1〜図4では、ある典型的な
態様において、本発明の方法により調製した核酸標準物によって品質的要求が満
たされることが示されている。前記の方法に基づく製造物の実施−関連試験には
、ABI PRISM(商標)7700配列検出システム[Sequence
Detection System](PE Applied Biosyst
ems)(これが、現在最良であり、非常に再現性のある結果を生じる)が用い
られた。本発明を使用し、検出自動装置により、−0.99より大きい相関関係
を含有し、本質的に高い再現性がある検量グラフを確立することができる(図1
)。本発明によりDNAで被覆された反応室(実施例1)〔例えば、いわゆる“
光学的”PCR管〕は、従来から使用されているPCR標準物と比較して明らか
に高い安定性を有し(図2)、また、室温においてさえ1年を超えて品質を損な
わずに貯蔵することができる(図3)ので、当業界の現状のものよりも優れてい
る。イン・ビトロで合成したRNAで被覆した反応室は、−20℃及び室温にお
いて、少なくとも6ヶ月間安定である(図4,実施例2)。
しており、自己接着フィルム(例えば、プラスチックフィルム、アルミホイル、
又はパラフィルム[parafilm])で密閉して、貯蔵及び輸送の間に外部
の核酸により汚染することを回避する。1つの八重ストリップは、それぞれ、一
つのフィルム/ホイルで閉鎖されており、従って、1つのストリップは、被覆に
使用する8種類の濃度の核酸を含んでおり、これを“ゼプトストリップ(Zep
toStrip)”と称する。
として作用する標識されているか又は標識されていない特異的なオリゴヌクレオ
チド少なくとも2種、並びに酵素的増幅に要求される更なる反応成分を、凍結乾
燥形態で含有することができる。あるいは、使用される反応室は、プライマー又
はプローブとして作用する前記の特異的なオリゴヌクレオチド、前記担体核酸、
又は酵素的増幅に要求される更なる反応成分を、凍結乾燥形態で、単独で含有す
ることもできる。本発明の試験キットは、“ゼプトストリップ”少なくとも1組
み、オリゴヌクレオチド少なくとも2個、及び担体核酸1種類からなる。
あり、そして今では、使用上の利点及び所望の成功をもたらす前記の新規の全効
果(これは、生物学的物質における選択された核酸の定量的検出用の使用準備が
できている標準反応室からなる)を得ることができるようになった。
の利点を特徴とする: 1.使用される反応区画中に、標準化に用いる希釈した酸を、手動で又は自動的
に移動させることが不必要である、なぜなら、それらの酸が凍結乾燥形態で既に
反応容器中に存在しているからである。これによってユーザーフレンドリー性が
大きく増加している、なぜなら、必要なことが、前記の使用準備のできた標準ス
トリップを取り出して、96ウェル担体プレート中に挿入するだけであるからで
ある。続く増幅反応用の前記の好ましい予備混合試薬を添加するだけで、これ以
上の操作は必要ない。従って、この簡易化によって、定量的酵素反応の一貫した
自動化が可能である。 2.今後は、濃縮した標準物をピペッティング操作することがなくなるので、そ
の結果、潜在的な汚染源が排除され、従って不正確な陽性結果の危険性が非常に
減少する。 3.非水性培体中に前記標準核酸を移動することにより、(a)標準物として用
いる核酸が微生物によって望ましくない分解をうける可能性が、制限又は予防さ
れ、そして(b)非常に低濃度の核酸においてさえ、室温においてでさえ、非常
に長期にわたる貯蔵能力が達成される(図2〜4)。この利点は、出荷及びこの
方法に基づく試験キットの適用を、非常に大幅に促進する。 4.使用する前記担体核酸は、希釈シリーズの調製に使用する一方通行(Ein
weg)材料中への標準物の非特異的な吸着を予防し、また(PCRアッセイへ
添加することにより検出可能となり)同時に、前記の酵素増幅に対する強力な「
増強剤(enhancer)」である。
e minute−2)核酸標準物を用い〔或る標準ストリップ、すなわち、8
種類の凍結乾燥したmdm−2標準核酸濃縮物を使用〕、ABI PRISM(
商標)7700配列検出システムにおいて、実時間(リアルタイム)PCR生成
物測定によって得られる典型的な検量グラフを示す(実施例1,項目5)。この
場合に計算された相関係数は、−0.996であった。
、当業界の現状との比較を、グラフ形態で示す。種々の濃度(PCRアッセイ当
たりの分子数50、250、2500、10000、及び50000)の従来の
、すなわち水性培体中で貯蔵し、試験当日にアリコートし、担体DNAを補足し
たmdm−2標準DNAフラグメントを、同じ濃度の凍結乾燥標準物と比較した
。従来の方法により貯蔵し、特に非常に低濃度(アッセイ当たりの分子数50又
は250)の標準物は、14日間の貯蔵及び4回の冷凍/解凍サイクルの後、完
全に分解されている(これは、増幅能力0に相当する閾値サイクル40に到達す
ることによって示されており、グラフ中に反映されている)。一方、凍結乾燥標
準物(ゼプトストリップ)を使用すると、最も低い核酸濃度を使用した場合であ
っても、欠損は全く検出されない。
トリップを使用して得られたPCRの結果を示す。前記貯蔵温度とは無関係に、
全く同一のPCRの結果、すなわち、CT値(すなわち、平行曲線)が得られた
ことを認めることができる。これらの結果から、前記の固定化したmdm−2−
DNAは、アッセイ濃度や貯蔵温度に関わらず、全試験期間に亘って安定なまま
で維持されると推察することができる。
ストリップを使用して得られたTaqMan PCRの結果を示す。mdm−2
−DNAに対する結果と類似して、前記の固定化したbcl2−cRNAもまた
、アッセイ濃度や貯蔵温度に関わらず、全試験期間に亘って安定であった。
された核酸を検出するキットにおいて実施する。前記試験キットは、オリゴヌク
レオチド少なくとも2種類及び担体核酸1種類をフィルム/ホイルで閉鎖した八
重ストリップ少なくとも一組を含有する。 以下の実施例は、本発明を説明するために提供するものであり、それらに限定
されるものではない。
的管[optical tube]”)の被覆》 1.1,PCRによるmdm−2−特異的標準DNA断片の調製 A.ADR5000T−リンパ腫細胞系から単離された全RNAからのcDNA
の調製(培養培体1mL当たりアドリアマイシン5μgを用いた耐性選択) RNA1μgを、AMV逆転写酵素緩衝液(トリス/HCl250mmol/
L,pH8.3;KCl250mmol/L,MgCl250mmol/L,ジ
チオトレイトール50mmol/L,スペルミジン2.5mmol/L)、AM
V逆転写酵素5U、dNTPそれぞれ0.5mmol/L(Promega,M
adison,ウイスコンシン州,米国)、組換えRNアーゼ阻害剤10U(A
GS,Heidelberg,FRG)、オリゴ(dT)200ng(Amer
sham,Pharmacia Biotech,Uppsala,Swede
n)からなる標準反応アッセイ20μL中のRNAzol(商標)“B”(Te
l−Test,Friendswood,テキサス州,米国)によって精製して
、1時間かけて42℃でcDNA中に転写した。
600Thermalcycler(Perkin−elmer)中で、3’プ
ライマー又は5’プライマーのいずれかそれぞれ100ng、10×Taqポリ
メラーゼ緩衝液(トリス/HCl100mmol/L,pH8.3;MgCl2
500mmol/L,ゼラチン0.01%[wt/vol])、AmpliTa
q(商標)ポリメラーゼ1.5U(Norwalk,コネチカット州,米国,P
erkin−Elmer)、及びdNTP8μL(dTTPに換えてdUTPを
使用した各ヌクレオチド0.2mmol/L)からなる6個の同一の50μL標
準PCRアッセイ中で増幅する。
ion Code:I25341)の配列〉 MDM2PR1(1245−1264) 5’−GCC.AAG.AAG.AT
G.TGA.AAG.AG−3’ MDM2PR2(1439−1455) 5’−ACT.GGG.CAG.GG
C.TTA.TT−3’ 〈増幅されたDNA断片の長さ〉 211bp
S,Heidelberg]を調製する。すなわち、ゲルスロットは、6つのカ
ム状物(kamm)を有し、その部屋にTAE緩衝液(サブマリンゲル)を充填
する。 調製したPCRアッセイを貯蔵し、そして定量的に適用する。 100Vで45分間、前記電気泳動を実施する。 UV光中で見ることができる臭化エチジウム着色バンドを製造し、それらをメ
スを用いて可能な限り正確に及びすばやく切り取り、1.5mLエッペンドルフ
容器中に入れる。 指示に従ってQIAquick Gel Extraction Kit(Q
iagen,Hilten)を用いて(H2Oで溶出)、ゲル塊からDNAを精
製した。
リジェントHPLCポンプ,低圧力勾配形成器,UV−975 UV/VIS検
出器,AS−950インテリジェントサンプラー,Column−Thermo
stat Jetstream 2(Jasco Labor und Dat
erntechinik GmbH,Gross−Umstadt,FRG) 〈固定相〉 TSK DEAE−NPRカラム(4.6mmID,長さ:35mm)及びD
EAE−NPRプレカラム(4.6mmID,長さ:5mm)(TosoHaa
s GmbH,Gross−Umstadt,FRG) 〈移動相〉 緩衝液A:トリス/HCl25mmol/L,NaCl1mol/L;pH9
.0 緩衝液B:トリス/HCl25mmol/L;pH9.0
、すなわち、実施例(どの例でも二重検出)ごとに20μLを注射する。 標準(別々に実施):緩衝液B36μL及びLow Mass DNA La
dder(商標)4μL(Life Technologies,Gaithe
rsburg,メリーランド州,米国)〔100〜2000bpの平滑末端DN
A断片6種類(バンド当たりのDNA最終濃度:5〜100ng)からなる〕を
合わせ、実施例ごとに20μLを注射(二重検出)する。 以下に記載の方法で、不連続勾配プログラムを25分間実施する: 1.緩衝液B中25%緩衝液Aで、カラムを平衡化 2.B中25%A:0.5分の時点までサンプルを適用 3.B中25〜43%A:直線勾配0.5〜4.5分 4.B中43〜60%A:直線勾配4.5〜20分 5.B中60〜100%A:直線勾配20〜22分 6.B中100〜25%A:直線勾配22〜24分 7.B中25%A:平衡24〜25分
ウェア,バージョン1.20(IMBS Developpements,フラ
ンス)によってピークを積分する。精製DNA標準物の正確な濃度を測定するた
めに、個々のピークを下回る表面を評価した。Low Mass DNA La
dder(商標)によって得た検量グラフを用いて、未知濃度の標準核酸を計算
した。
した10ODラムダ(dam+)DNA(起源:バクテリオファージ・ラムダc
l857 Sam7,AGS GmbH,Heidelberg)を、5x1分
の間隔で約1〜2kbの断片中に転移し、そして最大出力の超音波浴(Tran
ssonic T570,Ultrasonics)によって氷上で中間冷却し
;それらの10ng/mL希釈物(1:100)〔以下、ラムダDNAと称する
〕を調製した。
トトップバイアル(Sorenson Bio Science,Salt L
ake City,ユタ州,米国;distributor:Carl Rot
h GmbH:カタログ番号:8184.1)中にピペットで入れて、使用準備
のできた標準溶液を調製する。更に19種類の標準物(標準核酸当たり、それぞ
れ5μL)を加え、そして必要であれば、ラムダDNAを補給して最終体積10
0μLにすることによって、多機能ストリップ(すなわち、複数の異なる核酸配
列を順々に又は同時に定量的に測定することに適したストリップ)を生成する。
別々の“光学的管”(Perkin−Elmer,カタログ番号:N80109
35)中に(A1の位置からA8の位置に亘って次第に濃度が減少するように)
ピペットで入れる。このアリコート化は、ピペッティングロボット(例えば、B
iomek 2000,Beckman社)によって実施すると、品質が向上す
るので好ましい。 増幅容器を黒色エッペンドルフ遠心アダプター(0.2mL)中に挿入し、そ
して完全な乾燥が達成されるまで、ローター逆加熱がある真空遠心分離機(例え
ば、Unijet Refrigerated Aspiratorを備えたU
nivapo 100H,UniEquip社)中で、30分間かけて前記サン
プルを凍結乾燥する。
列検出システムによる試験 《最適化mdm−2TaqMan(商標)法》 〈プログラム〉 2工程−PCR 95℃ 10:00分,連続的 40サイクル 95℃ 00:15分 60℃ 01:00分
R Core Reagents Kitに入っているもの) アッセイ体積:50μL
Accession Code:I25341)〉 mdm2Pr11(1295−1318) 5’−GAG.AGT.GTG.G
AA.TCT.AGT.TTG.CCC−3’ mdm2Pr21(1352−1373) 5’−TGC.AAC.CAT.T
TT.TAG.GTC.GAC.C−3’ mdm2プローブ(1320−1350) 5’−FAM−TTA.ATG.C
CA.TTG.AAC.CTT.GTG.TGA.TTT.GTC.A−XT−
3’−TAMRA
(“光学的管”)の被覆》 2.1,天然bcl2mRNAに配列が相同的なbcl2標準cRNAの調製 (Grassi G.,Zentilin L.,Tafuro S.,Div
iacco S.,Ventura A.,Falaschi A.,Giac
ca M.,A rapid procedure for the quan
titation of low abundance RNAs by co
mpetitive reverse transcription−poly
merase chain reaction.Nucleic Acids
Res 1994;22:4547−4549による変形した方法に従う)
、例えば実施例1.1,Bに記載のとおりに、TRIO−Thermobloc
k(商標)48Thermal Cycler(Biometra,Goett
ingen)中で増幅した。 温度プロフィールPCR1:94℃で30秒間,55℃で30秒間,72℃で1
分間(40サイクル)
ion Code:M14747)の配列〉 BCL2PR1(3498−3516): 5’−CTT.TTG.CTG.T
GG.GGT.TTT.G−3’ BCL2PR2(3896−3915): 5’−CTT.CTC.CTT.T
TG.GGG.CTT.TT−3’ 〈増幅したDNA断片の理論的長さ〉 418bp
配列の挿入》
間,72℃で1分間,(1回)72℃,5分,4℃で∞
ac.tat.agg.gag.aCT.TTT.GCT.GTG.GGG.T
TT.TG−3’ 〈増幅したDNA断片の理論的長さ〉 455bp
施した。 cRNAの収率を増加させるために、前記インキュベーションの終了後に、更
にT7ポリメラーゼ20Uを加え、その後、更に37℃で1時間インキュベーシ
ョン(恒温振とう器)した。 続いて、全ての3個のアッセイを混合し、そしてDNase I60U(RN
アーゼ不含,Boehringer Mannheim)を用いて37℃で50
分間消化した。
.,Rost A.−K.,Thamm B.,Pustowoit B.,R
emke H.,Eds.:Quantitation of mRNA by
polymerase chain reaction−nonradioa
ctive PCR methods,Springer−Verlag He
idelberg,p.36−37」に記載の通常のフェノール−クロロホルム
−イソアミルアルコール(25:24:1)抽出によって実施した。 前記cRNAの沈殿は、−20℃で約3時間かけて実施し、その後、78%エ
タノール300μLで3回洗浄し、次に遠心分離し、そしてそのペレットを96
%エタノール100μL下で−20℃で一晩貯蔵した。
レットを乾燥し、その乾燥したペレットをDEPC−H2O25μL中に入れ;
2×2μLアリコートをUV260/280で測定してから、石英セル500μ
L中で濃度を検出した。 全ての3個のアッセイの全収量は、260/280>1.8の割合のcRNA
23μLであった。
Daly B.,Kolberg J.A.,Cha T.A.,Irvine
B.D.,Tucker J.,Urdea M.S.,Preparati
on and characterization of RNA stand
ards for use in quantitative branche
d DNA hybridization assays.Anal.Bioc
hem.1995;226:120−129による変形した方法に従う)
によってミニゲルチャンバー〔Easy−Cast(商標),AGS Heid
elberg〕からRNアーゼを除去し、続いてDEPC H2Oで2回濯いだ
。 〈ゲルの調製〉 1xTAE緩衝液(原液をDEPC H2Oで50倍にしたもの)(臭化エチ
ジウム[10%EtBr1.6μL]を注ぎ入れる)を用いて1%アガロースゲ
ル(Qualex−Gold−Agarose, AGS)を調製し、10個づ
つまとめる;作業用緩衝液:1xTAE(4μL EtBr/100mL)。
約1μL)、及び0.16〜1.77KbRNAラダー(Gibco BRL)
4μLに加え、続いて65℃で5分間インキュベートした。 それから、氷上で急速に冷却し、続いて管ごとに(RNアーゼを含まない)ゲ
ル状緩衝液1μLを加えた。前記の完了したアッセイからのアリコート4μLを
、試験ゲル溝(スロット)中にピペットで入れる(外側の溝にマーカーを入れ、
内側の溝にcRNAサンプルを入れた)。
気泳動を実施した。前記作業用緩衝液を断続的に動かすことによって緩衝液の循
環を実施した。 前記RNアーゼ不含に関する結果のドキュメンテーションは、ONE−Dsc
an(商標)ソフトウェア(Scanalytics,Billerica,マ
サチューセッツ州,米国)を用いて、GelPrintビデオ・ドキュメンテー
ション・ワークステーション(MWG−Biotech,Ebersberg)
によって実施した。 合成したbcl2cRNAの理論的な分子量は418bであるが、実験により
決定された分子量は約400bであった。
hringer Mannheim)を用いて、前記の精製したbcl2cRN
Aの希釈を実施した。
の被覆 前記の各bcl2cRNA希釈物(表2−3参照)から150μLを得て、そ
してBiomek(商標)2000ピペッティング・ワークステーション(Be
ckman Instruments Inc.Fullerton,カリフォ
ルニア州,米国)の調製した冷却可能な棚に配置した。 96ウェル担体板に96“光学的管”を入れ、そして前記ワークステーション
中の意図した位置に平等に挿入した。 適当なプラグを備えた一方通行ピペットノズルを用いて、前記ロボットにより
、標準“1”5μLを、それぞれ、A1〜A12の位置の“光学的管”にピペッ
トで入れ、標準“2”5μLを、それぞれ、B1〜B12の管に入れ、標準“3
”5μLを、それぞれ、C1−C12の管に入れるなどを実施する。
蔵されているので、中間解凍を避けて、すぐに、予め冷却しておいたLyova
c GT2(AMSCO Finn−Aqua GmbH, Huerth)中
で1時間かけて凍結乾燥される。 続いて、前記の管を、自己接着ホイル〔例えば、Biomek(商標)シール
&サンプルアルミニウムホイル,Beckman Instruments〕を
用いて手で閉じる。次に、管に接着している前記ホイルを垂直に切断して、A1
〜H1、A2〜H2、A3〜H3などの位置の連続したストリップ(いずれも、
或る濃度の各bcl2cRNA希釈物を含む)を形成することによって、前記“
RNA”ゼプトストリップを製造した。 前記で調製したストリップ12個から、6個を、それぞれ−20℃又は室温に
おいて、試験期間に亘って貯蔵した。
bcl2cRNAストリップの分析 A.材料 5×TaqMan EZ緩衝液:Bicine250mM、K−アセテート5
75mM、EDTA0.05mM,ROX(6−カルボキシテトラメチル ロー
ダミン)300nM、グリセロール40%(w/v);pH8.2。 Mn(OAc)2(25mM)。 dNTP:体積比1:1:1:1でdATP(10mM)、dCTP(10m
M)、dGTP(10mM)、及びdUTP(20mM)を混合したもの
CC.ACA.ATA.CT−3’ bcl2プローブ(3547−3568) 5’−FAM−CAG.TTC.T
GG.GGC.CAA.GAG.GCT.GTXT−3’−TAMRA (FAM=6−カルボキシフルオレセイン,TAMRA=6−カルボキシテトラ
メチルローダミン)
ms)を用いて組み合わせた逆転写とPCR(RT−PCR) それぞれの試験日に、−20℃又は室温で別々に貯蔵した前記の各bcl2c
RNAストリップ中に、以下の反応成分をピペットで加えた。 (表2−4において、S=標準番号であり、アッセイ体積は、50μLである)
ール〉 59℃,30分間(逆転写) 95℃,5分間 40サイクル 95℃,15秒間 59℃,1分間 7、14、28、90、及び180日間の(−20℃及び室温における)貯蔵
後に、それぞれの場合について本発明によるbcl2cRNAストリップの安定
性をPCR3(表2−4)により分析した。その結果を図4にまとめる。
(ZeptoStrip)”を用いてABI PRISM(商標)7700配列
検出システムにおけるPCR生成物の測定によって確立された典型的な検量グラ
フである(実施例1,項目5参照)〔r=−0.996〕。
ップ(ZS)の標準核酸と比較する上での利点を示す。破線は、従来の貯蔵を表
し;連続線は、ゼプトストリップを表す。記号の説明(Legend)は、最初
のPCRアッセイ当たりの核酸分子数を表す。
りの核酸分子数を表す。連続線は、+25℃における貯蔵を表し、破線は、−2
0℃における貯蔵を表す。
NA”ゼプトストリップの貯蔵性を示す。−20℃及び+25℃における貯蔵の
それぞれの場合において得られた全ての測定値を鑑みた各標準濃度に対して計算
した回帰線が表されている。記号の説明は、反応室中に固定化したbcl2cR
NAの濃度を、アッセイ当たりのゼプトモル(zeptomol)で表す。
する、請求項6に記載の方法。
対象の配列に特異的で標量化した核酸(必要であれば、異なる細胞の又は異なる
生物起源の、あるいは異なる種が起源の核酸)で同時に被覆することを特徴とす
る、請求項6〜10に記載の方法。
室の被覆を、測定すべき分析対象核酸の予測される全濃度範囲をカバーし、徐々
に減少する濃度の配列−特異的標準核酸少なくとも12×8個を用いて実施する
ことを特徴とする、請求項6〜11に記載の方法。
適当な担体箱中に直立して閉鎖されている、請求項6〜12に記載の方法。
作用する特異的に標識化した又は標識化していないオリゴヌクレオチド少なくと
も2種類、担体核酸、及び酵素的増幅に要求される別の反応成分を前記反応室中
に凍結乾燥した形態で含むか、あるいは、プライマー又はプローブとして作用す
る特異的に標識化した又は標識化していないオリゴヌクレオチド、担体核酸、及
び酵素的増幅に要求される別の反応成分を、核酸標準物を含まない別々の容器中
に凍結乾燥した形態で含む、請求項6〜13に記載の方法。
反応室の、生物学的物質中の選択された核酸の検出に対する使用。
及び担体核酸1種類をフィルム/ホイルで閉鎖したゼプトストリップ(8種の核
酸濃度で被覆されている閉鎖された反応室の八重ストリップ)少なくとも1個を
含む、請求項15に記載の使用。
Claims (13)
- 【請求項1】 天然の核酸、合成的に製造した核酸、又は酵素的に製造した
核酸で被覆された反応室であって、その被覆が、前記反応室の内壁の化学的に又
は生化学的に改変されていない表面上に、非共有的方法で設けられていることを
特徴とする、前記の反応室。 - 【請求項2】 天然の核酸、合成した核酸、又は部分的に合成した核酸(D
NA、RNA、DNA及び/又はRNAの合成同等物、dU含有DNA)で被覆
されたガラス容器若しくはプラスチック容器、又はガラス毛細管であることを特
徴とする、請求項1に記載の反応室。 - 【請求項3】 標準核酸を使用して請求項1及び2に記載の反応室を製造す
る方法であって、酵素的増幅に適した反応室中に、規定量の溶解した天然の核酸
、合成した核酸、又は部分的に合成した核酸(DNA、RNA、DNA及び/又
はRNAの合成同等物、dU含有DNA)をアリコート化して直接入れること、
続いて、サンプルを穏和に凍結乾燥させることによって前記反応室の内壁中に前
記核酸を非共有的に直接吸着させることを特徴とする、前記製造方法。 - 【請求項4】 容器又はガラス毛細管を被覆することを特徴とする、請求項
3に記載の方法。 - 【請求項5】 被覆に使用される核酸希釈工程の実施前に、吸着すべき核酸
の濃縮原液を、適当な分析技術によって正確に測定することを特徴とする、請求
項3及び4に記載の方法。 - 【請求項6】 前記凍結乾燥工程の間に、規定量の特異的担体核酸と前記の
吸着すべき標準核酸とを混合し、 前記の特異的担体核酸を、予め、物理的方法(例えば、超音波処理)によって平
均の長さが約1〜2kbの断片中に変換させておくか、又は前記の担体核酸を、
改変せずに使用し、そして 前記の特異的担体核酸が、検出すべき核酸配列に対して可能な限り小さい配列相
同性を示す ことを特徴とする、請求項3〜5に記載の方法。 - 【請求項7】 ラムダファージのDNA又はE.coliのtRNAのDN
Aを用いることを特徴とする、請求項3〜6に記載の方法。 - 【請求項8】 相当する反応室を、複数(少なくとも2種)の異なる分析対
象の配列に特異的で標量化された核酸(必要であれば、異なる細胞の又は異なる
生物起源の、あるいは異なる種が起源の核酸)で同時に被覆することを特徴とす
る、請求項3〜7に記載の方法。 - 【請求項9】 マイクロタイター形式で配置した少なくとも96個の反応室
の被覆を、測定すべき分析対象核酸の生理学的な又は技術的な全濃度範囲をカバ
ーし、徐々に減少する濃度の配列−特異的標準核酸少なくとも12×8種類を用
いて実施することを特徴とする、請求項3〜8に記載の方法。 - 【請求項10】 前記の被覆した反応室が、少なくとも96個の容器が入る
適当な担体箱中に直立して閉鎖されている、請求項3〜9に記載の方法。 - 【請求項11】 標量化した核酸とは別に、プライマー又はプローブとして
作用する特異的に標識化した又は標識化していないオリゴヌクレオチド少なくと
も2種類、担体核酸、及び酵素的増幅に要求される別の反応成分を前記反応室中
に凍結乾燥した形態で含むか、あるいは、プライマー又はプローブとして作用す
る特異的に標識化した又は標識化していないオリゴヌクレオチド、担体核酸、及
び酵素的増幅に要求される別の反応成分を、核酸標準物を含まない別々の容器中
に凍結乾燥した状態で含む、請求項3〜10に記載の方法。 - 【請求項12】 試験キット中の請求項1〜11に記載の核酸で被覆された
反応室の、生物学的物質中の選択された核酸の検出に対する使用。 - 【請求項13】 前記試験キットが、オリゴヌクレオチド少なくとも2種類
及び担体核酸1種類をフィルム/ホイルで閉鎖したゼプトストリップ(8種の核
酸濃度で被覆されている閉鎖された反応室の八重ストリップ)少なくとも1個を
含む、請求項12に記載の使用。
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