JP2002518035A - 新しい嗅覚受容体とそれらの使用法 - Google Patents

新しい嗅覚受容体とそれらの使用法

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JP2002518035A JP2000555933A JP2000555933A JP2002518035A JP 2002518035 A JP2002518035 A JP 2002518035A JP 2000555933 A JP2000555933 A JP 2000555933A JP 2000555933 A JP2000555933 A JP 2000555933A JP 2002518035 A JP2002518035 A JP 2002518035A
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クレモン ジャン−リュック
ティラル アラン
レヌッチ マリエル
ベレック アンヌ
マタラッゾ ヴァレリ
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サントル ナショナル ドゥラ ルシェルシュ シオンティフィック
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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規な嗅覚レセプター、及び前記レセプターをコードする遺伝子に関する。また本発明は、芳香の検出、量の制御、サンプルの分析、臭いの比較、毒物の検出や臭気の捕集に対する前記レセプターの利用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、マーモットの新しい嗅覚受容体の解明、これらの受容体をコードす
る遺伝子のクローニングと配列決定、ならびにリガンドのスクリーニングとバイ
オセンサーの作製のためのこれらの利用に関する。
【０００２】 脊椎動物の嗅覚受容体の最近の発見は、物理化学的センサーによる人工鼻の設
計と製造について当初予定されていた方針を覆すものである。事実、1990年代の
始め、生物学者らは哺乳類の嗅覚上皮から嗅覚受容体(3)を構成する最初のタン
パク質を分離し且つ配列決定することに成功したが、最初の嗅覚受容体が発現さ
れたのは1993年であった (7)。ところで、ヒトは限定的な嗅覚を持っていて、10
,000種以上の芳香性分子を区別することができる。そして、嗅覚のゲノムの1%が
嗅覚受容体をコードする遺伝子で構成されている (1)。従って、本発明は潜在的
な生物学的センサーに関する研究者らに素晴らしい研究分野を開くと考えられる
。また、これらの生物学的センサーは既存の物理化学的センサーより約100,000
倍すぐれた感度を持つことがすでに分かっている（4、6）。より最近の研究はこ
れらの感知器が非生物分子にも感応することを示した (5)。
【０００３】 すべての生物は、その知覚情報に依存して生存している。知覚は、物理的刺激
を受け取る感覚器官（視覚、聴覚、触覚）及び化学的刺激を受け取る感覚器官（
味覚、嗅覚）を通じて伝達される。ほとんどの種に於いて、化学的刺激の認知は
、食物の場所の特定や配偶者の識別、捕食者その他の危険の検知等の生存に必要
な多くの行為に基本的なことである。いくつかの種では、嗅覚は数キロメートル
の距離にも及ぶ個体間の通信をも可能にし、また集団の糾合、攻撃や防禦反応、
生殖活動及び授乳を可能にする。また、芳香性分子は生理的変化を誘発すること
もある。
【０００４】 ほとんどの場合、臭いは複数の分子が複雑に組合わさった結果もたらされるも
のである。この複雑さが、10-12Mという低い濃度であっても無数の芳香性分子（
10,000以上と推定される）の認識を可能にするという受容体の性質に関する興味
深い諸問題を提起する。認識は数百又は数千の下位タイプを含む嗅受容体の大き
な多重遺伝子族によるものと思われる。芳香信号は敏感な嗅覚ニューロン中のG
タンパク質に結合した連続反応により形質導入されるとの仮説から、これらの受
容体は7つの膜透過性ドメインを含むと想定される。この形質導入は、環状ヌク
レオチドやイノシトール三燐酸などの第二メッセンジャーを増加させ、さらにこ
れらのメッセンジャーがイオン依存性の管状通路（canaux）及び嗅受容体自身を
含む複数のタンパク質のホスホリル化を促進する。
【０００５】 BuckとAxel（3）は、まず、増幅（PCR）技術、及びGタンパク質に結合した受
容体の最も保存されたドメインに縮重（degenerees）を起こす技術を用いて、ラ
ットの嗅受容体を特定した。この最初の研究以降、ヒト、犬、マウス、鶏、2種
類の魚類、2種類の両生類及び1種類の線虫類の339個以上の受容体について、多
くは部分的であるが、その配列を決定した。しかしながら、多くの種が依然とし
て研究を要し、また1000個（即ちゲノムの1%）以上の遺伝子が嗅覚受容体のスー
パー遺伝子群のためにコードすると考えられる。嗅覚的認知の基本的メカニズム
は他の感覚系と比較して独特且つユニークであり、これらのタンパク質の同定に
ついて重大な影響を持つこの分野でのより詳細な研究が必要である。
【０００６】 アルプスのマーモットについての多くの研究が、嗅覚能の重要性を強調する(2
)。行動生態学的及び分析的研究は、テリトリーをマークし且つ社会的集団を同
定するのに、頬腺で生成される40個の化合物群が使用されたことを示している。
アルプスのマーモットの嗅覚上皮に関して、本発明の一環として行われた研究は
、主に、あらかじめ決定された脊椎動物の配列との有意的比較ができるように、
充分な数の嗅覚受容体の配列を入手することを目的としている。マーモットの嗅
覚受容体の推定上の配列を同定するのに、RT-PCR法を利用した。嗅覚受容体の第
二膜透過性ドメイン、第２細胞内側層（seconde boucle intracellulaire）、
及び第7膜透過性ドメイン内に保存されたドメインの配列に相当するように縮重
したオリゴヌクレオチドをPCR用のプライマーとして、マーモット鼻上皮のmRNA
を用いて得られた相補DNAとの対で使用した。
【０００７】 本発明の一環として行われた研究作業は、このように、マーモットの新しい嗅
覚受容体の同定、クローン化及び配列決定を初めて可能にした。これらの受容体
はバイオセンサーの設計と作製又は感染された細胞の調製に有益である。よって
、種々のバイオセンサー中で使用されるであろう人工膜に独自のタイプの複数の
受容体を配置し、それぞれがパラレルに反応するように組合わせると、そのバイ
オセンサーが生体電子工学的センサーである電子工学的タイプの鼻の感知システ
ムを構成するために、各受容体を形式的神経回路網のソフトウェアにより管理す
ることができる。
【０００８】 よって、本発明はマーモットの精製された嗅覚受容体に関する。
【０００９】 数万の臭いの区別は鼻上皮の神経樹状突起の表面に位置付けられる無数の受容
体に依存する。アルプス・マーモットの鼻上皮及び臭気受容体のコンセンサス配
列に相当するように縮重したプライマーを用いて、研究者らは臭気受容体をコー
ドする遺伝子の23の新しい合成物を逆PCR（RT-PCR）により増幅し、クローン化
及び部分的な配列決定に成功した。NCBIのデータバンクの芽株プログラムによる
検索の結果、それらを翻訳したアミノ酸配列がこそれまでに報告されている臭気
受容体のタンパク質配列によく似ていたことから、それらを7つの膜透過性ドメ
インを有する同じ受容体のスーパー遺伝子群に分類されることに疑いない。膜透
過性螺旋域III、IV及びV、ならびに細胞内側層及び細胞外側層（boucles intra
et extracellulaire）は、ハイドロパス（hydropathie）プロフィールの作成
及び二次構造の計算機による予想により定義された。臭気固定部位のカルトグラ
フィーの最初の試みとして、本発明者らは、免疫グロブリンの相補性（CDR）の
決定域についてWuとKabat（8）により開示された細胞タイプの変異度分析を行っ
た。変異度の主な4つのピークは、予想されたように、第1細胞外側層、第3細胞
外側層（boucles extracellulaires）、第4膜透過性ドメイン、及び第5膜透過
性ドメインの中にあると位置付けられた。よって、これらの位置は芳香性分子の
結合の特異的部位の一部をなす。他種の嗅覚受容体の配列との比較から、本研究
で決定されたマーモットの配列が3つの異なる族に属することを示す。
【００１０】 よって、本発明はより具体的には、添付の配列リストに示されているSEQ ID N
o:1〜SEQ ID No: 23から選択されるアミノ酸配列、又は機能的にこれらに相当す
る誘導体、又はそのアミノ酸配列を含む精製された嗅覚受容体に関する。ここで
、これらの配列に相当する誘導体とは、1個又は複数のアミノ酸残基の修飾（mod
ification）及び/又は抑圧（supression）及び/又は付加された配列で、且つ誘
導される配列と約75%、好ましくは少なくとも95%の相同性を有する配列を意味す
る。本発明の受容体は非常に保存された領域と非常に異質な領域とを有している
。非常に保存された領域は、タンパク質にその受容体としての性質を付与する領
域であるのに対して、非常に異質な領域は各受容体にその特殊性を付与する領域
であると考える。従って、予想される使用法によれば、特殊性が修飾（modifiee
）されているが本発明の範囲内に留まるような本発明の受容体の誘導体を調製す
ることが可能である。
【００１１】 また本発明は、少なくとも本発明の１つの受容体、それらの１つの誘導体又は
１つの断片に向けられるポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の提供も目
的とする。これらの抗体は文献に記述された諸方法で調製することができる。ポ
リクローナル抗体は、上皮から抽出した又は宿主の遺伝子転換により生成したタ
ンパク質を動物に注入し、それから抗血清又はアフィニティークロマトグラフィ
ーによる抗体の回収などの従来公知の技術に基づいて得ることができる。モノク
ローナル抗体は、望ましくは本発明の受容体を使用して免疫化された動物の脾臓
と骨髄腫細胞とを融合することにより得ることができる。これらの抗体は他の哺
乳類の新しい嗅覚受容体やこれらの受容体の同族体を研究するのに、あるいはさ
らに異なる個体や種の受容体の間の類似性を研究するのに有益である。
【００１２】 また本発明は、前記に定義したような受容体をコードする1つの核酸配列を含
むか又はそれで構成される核酸分子にも関する。より具体的には、本発明は添付
の配列リストのSEQ ID No: 1 〜 SEQ ID No: 23の番号で示されている受容体の
アミノ酸配列それぞれをコードする添付の配列リストのSEQ ID No: 24 〜 No: 4
7の番号で示されたものから選択される１つの配列を含むか又はそれで構成され
る核酸分子に関する。
【００１３】 勿論、本発明は、例えば遺伝暗号の縮重（degenerescence）により上述の配列
から誘導され、且つ嗅覚受容体の性質と特性を持つタンパク質をコードするヌク
レオチド配列にも関する。
【００１４】 同様に、本発明は、望ましくは適当な対照配列に結合した上記の核酸分子を少
なくとも1個含むベクター、ならびに本発明の受容体又はその断片を宿主細胞内
で合成又は発現する方法に関する。これらのベクターの調製ならびに宿主内での
本発明のタンパク質の合成又は発現は、専門家にはよく知られた分子生物学及び
遺伝子工学の技術により実現することができる。
【００１５】 例えば、本発明に基づく受容体の生成方法は下記工程を含む： - 本発明の核酸分子又は当該分子を含むベクターを一つの宿主細胞中に伝達
（transferer）する工程、 ‐受容体を構成するタンパク質の合成を可能にする条件で当該宿主細胞を培養
する工程、 ‐当該タンパク質を何らかの適切な方法で分離する工程。
【００１６】 例えば、本発明に基づく受容体の発現方法は下記工程を含む: ‐本発明の核酸分子又は当該分子を含むベクターを宿主細胞内に伝達（transf
erer）する工程、 ‐宿主表面での当該受容体の発現を可能にする条件で当該宿主細胞を培養する
工程。
【００１７】 前記の方法で使用される宿主細胞としては、原核細胞から真核細胞、特に細菌
、酵母、哺乳類、植物類又は昆虫類の細胞から選択することができる。
【００１８】 受容体が翻訳後にそれらの機能に必要な修飾を受ける場合には、真核細胞内で
発現させることが望ましい。
【００１９】 本発明に基づく嗅覚受容体又はベクターをコードする核酸分子もまた動物を形
質転換して、形質転換動物の血統を確立するのに使用することができる。
【００２０】 使用されるベクターとしては、伝達される宿主によって選択される；プラスミ
ド等のあらゆるベクターが選択され得る。
【００２１】 よって、本発明はまた上記方法で得られた嗅覚受容体を発現する宿主細胞にも
関する。
【００２２】 本発明はまた、本発明の核酸分子から調製された核酸のプローブ及びオリゴヌ
クレオチドのプローブにも関する。
【００２３】 これらのプローブは、他の個体や種の受容体の同様の配列を、ハイブリダイゼ
ーションによる検出のために標識されることが望ましい。従来より公知の技術に
従って、これらのプローブを生物学的試料と接触させる。ブロッティングハイブ
リダイゼーション（Dot-Blot法）やレプリカハイブリダイゼーション（サザン法
）、その他（DNAチップ）、種々のハイブリダイゼーション技術を用いることが
できる。このようなプローブは嗅覚受容体をコードする遺伝子における相補性あ
る配列を迅速に検出することができ、これによりタンパク質の存在、起源及び保
存の研究を可能にする。
【００２４】 例えば他の種であることの診断や遺伝子検索の目的のために、オリゴヌクレオ
チドはPCR実験用として有益である。
【００２５】 先に述べたように、嗅覚受容体は、Gタンパク質に結合した7つの膜透過性ドメ
インのタンパク質である。受容体にリガンドが結合して受容体のコンホメーショ
ンの変化を引起こし、細胞内では、この信号が第二メッセンジャーの仲介により
形質導入される。結果として、本発明の目的は、一つの化合物と一つ又は複数の
当該受容体とを接触させること及び何らかの適切な方法により当該化合物と当該
受容体との間の親和性を測定することよりなる、前述の受容体用リガンドを構成
し得る化合物のスクリーニング方法を提供することにある。
【００２６】 被検化合物と本発明の嗅覚受容体との接触は、前述の宿主を使用して又は宿主
表面に当該受容体を発現させることにより行える。被検化合物と本発明の嗅覚受
容体との接触は、宿主表面に且つ高レベルに機能的な組換え嗅覚受容体を発現で
きるcDNAを持つベクターに感染させた嗅覚であるかどうにかかわらず、不死化さ
れた細胞の血統で起こり得る。被検化合物がリガンドを構成する場合、被検化合
物が形質転換された細胞と接触すると、当該化合物の受容体への固定に由来する
細胞内信号を誘発する。
【００２７】 被検化合物と本発明の受容体との接触は、1個又は複数の受容体を1個又は複数
の膜上に固定することによっても実施できる。よって本発明の嗅覚受容体はバイ
オセンサーに統合することもできる。このようなシステムでは、被検化合物と受
容体間の相互作用をリアルタイムで可視化することが可能である。受容体/リガ
ンド対のパートナーのひとつを、脂肪族鎖で被われたマトリックスを含む境界面
上に固定する。この疎水性のマトリックスは、接触時にリポソームの自発的融合
により脂質の層により容易に被われて注入される。このようにして、リポソーム
や小胞内に挿入された嗅覚受容体がバイオセンサーに統合される。そして1個又
は異なる複数の受容体によりリガンドを分析する。
【００２８】 上記の方法は、ある化合物が受容体を活性化するか又は抑制することを決定し
得る。この方法の実現には、競合による測定を可能にする既知のリガンドを用い
ることが有利である。
【００２９】 よって本発明は、上記の方法により同定され且つ選択された嗅覚受容体のリガ
ンドを構成する未知の化合物にも関する。
【００３０】 本発明の受容体は下記のように種々の分野に利用される： ‐農産物産業での、香りの検出、品質管理、試料分析用、 ‐化粧品製造業での、香料の分析と比較用、 ‐環境での、ガスなど有毒物質の検出又は捕臭、 本発明のその他の利点と性質は、マーモットの嗅覚受容体の同定とクローン化
に関し、下記の付属図を参考とする以下の例に於いて述べられる： ‐図１は、3セットのプライマー（c‐t、4‐1及び3‐2）を有する2種類のcDNA
（RとT）から作られたPCR合成物の分析結果である。反応合成物は、下記の材料
と方法の欄で述べるように、2%アガローズゲル上の電気泳動により分析した。断
片の大きさは既知の大きさ（右側）の標準との比較により推定した。
【００３１】 ‐図２は、マーモットの推定上の嗅覚受容体の23配列のうち14の配列を示す。
14個の異なる配列（AMOR1〜AMOR14）をClustalwソフトウェアを使用して分析し
た。影の領域はほとんど（.）又は完全に（*）保存されたアミノ酸を含む共通ド
メインを示す。膜透過性ドメイン（DII〜DVII）、細胞外側層（boucles extrac
ellulaires）（E1〜E3）及び細胞内側層（boucles intracellulaires）（i2〜i
3）は疎水性ドメインの決定後に境界を確定した。
【００３２】 ‐図３は、プライマー・セットc‐tで得られた長い配列（AMOR1〜AMOR7）及び
プライマー・セット3-2で得られた短い配列（AMOR8〜AMOR14）のハイドロパス（h
ydropathie）プロフィールであり、材料と方法の欄で述べられているようにして
得た。長い配列はより親水性に該当する5つの谷により分離される疎水性の高い
領域（ピーク）を6つ含んでいる。短い配列は疎水性の高い領域４つと親水性領
域を３つしか示していない。これらのグラフから、長い配列に６つの膜透過性ド
メインが存在しすること、短い配列に４つの膜透過性ドメインが存在することに
対応する。このアーキテクチャーはPHDプログラムの膜透過性へリックス構造の
予測により確認される。
【００３３】 図４は、マーモットの嗅覚受容体の新しい連続した14配列の変異度を示す。上
側グラフ：図２の系列について計算した残基の変異度。ピーク（変異度の最も高
い位置）の位置とカーブの全体的形状は使用した式に依存しない（Wu＆Kabat、
考慮した残基の複合性と数）。下側グラフ：系列の配列の平均ハイドロパス（hy
dropathie）指数。ピークは親水性領域（層（boucles））に相当し、谷は疎水性
領域（膜透過性ドメイン）に相当する。このグラフは断片1〜59の疎水性を最小
限に押さえている。何故ならこれらの位置では半分の配列が欠けているからであ
る。位置210が露出した親水性層（boucles）の通常の変異度を示す一方、位置14
8は分子の疎水性の強い領域（螺旋）での驚くほど強い変異度を示す。
【００３４】 図５は、様々の種の嗅覚受容体の間の類似性を示す樹状図である。他の種の嗅
覚受容体の配列はNCBIデータバンクに由来する。5つの族（左に注記）が存在す
る。星印は種の間の類似の割合が70%を超える配列を意味する。略記号：H:ヒト
、F:魚、C:鶏、N:線虫類、B:蜜蜂、A:両生類、D:犬、M:マウス及びMM:マーモッ
ト。
【００３５】 I‐材料と方法 １）組織の準備 嗅覚上皮は死んだ野生マーモットから採取した。解剖中、頭部はドライアイス
中に冷凍状態に維持した。組織は使用するまで−80℃で保存した。
【００３６】 ２）mRNAの分離 冷凍した組織を乳鉢内で乳棒を用いて粉末に砕いた。乳棒と乳鉢をドライアイ
ス中で冷却し、すべての装置を殺菌した。Micro-Fast Track Kitを用いてmRNA
ポリ(A)+を分離してから（インビトロ）、DNA Dipstick Kitで試験した（インビ
トロ）。
【００３７】 ３）cDNAの転写 逆転写酵素を使用してmRNA ポリ(A)+をcDNAに転写してから、PCRで増幅した。
完全なcDNAの最初の合成量を増大させるために、cDNA サイクルキットを使用し
た。逆転写はオリゴ dTプライマー又はランダム・プライマーを使用して150 ngの
mRNA ポリ(A)+から行った。フェノール／H2O／EDTA（v/v/v：1/20/80）で抽出後
、水相のcDNAを、−80℃の結晶化したエタノール中に、酢酸アンモニア及びグリ
コーゲン・キャリアの存在下で沈殿させた。
【００３８】 ４）PCR 嗅覚受容体の特異的に縮重した（degeneres）オリゴヌクレオチドの3セットを
、マーモットのこれらの受容体を増幅するために合成した。
【００３９】 ラットで得られた以前の結果（3）から、嗅覚受容体の第2及び第7膜透過性ド
メインの保存された領域に対して2セットのプライマーを合成した。
【００４０】 プライマー4： 5'-CC(CT) ATG TA(TC) TTI TT(TC) CT (CT) I(GC) (CT) AA(TC
) (TC)TI TC。
【００４１】 プライマーC: 5'-CC(CT) ATG TA(TC) TTG TT(TC) CT(CT) G(GC) (CT) AA(TC)
(TC)TG TC-。
【００４２】 プライマー1： 5'-(AG)TT (TC)C(TG) IA(AG) (AG)(CG)(AT) (AG)TA IAT (GA)A
(AT) IGG (AG)TT。
【００４３】 プライマーT: 5'−GCA CTG CAG AT(AG) AAI GG(AG) TTI A(AG) ATI GG。
【００４４】 これらのプライマーの組合せはおよそ720 bpの合成物を増幅するために設計さ
れた。
【００４５】 ラットで以前得られた結果（3）から、第2細胞内側層（boucle intracellula
ire）と第7膜透過性ドメインの保存された領域から縮重オリゴヌクレオチドの3
番目のセットを合成した。
【００４６】 プライマー3： 5'-CAC AAG CTT TIG CIT A(TC)G A(CT)A G(AG)T (TA) (TC) (T
CG) TIG C。
【００４７】 プライマー2： 5'-GCA CTG CAG AT(AG) AAI GG(AG) TTI A(AG)C ATI GG。
【００４８】 これらのプライマーの組合せは、およそ520 bpの合成物を増幅するのに設計さ
れたものである。
【００４９】 増幅はcDNAを5マイクロリットル、dNTPを2 mM、各変性プライマーを100 pmol
、ポリメラーゼTaqを1.5 U（Boehringer Mannheim、ドイツ）、KClを50mM、MgCl
2を2.5 mM、トリス/HCl（pH8.3）を10 mM及びゼラチンを0.01含んだ溶液50マイ
クロリットル中で行った。蒸発を避けるため、混合表面は35マイクロリットルの
鉱物油（Sigma、フランス）で被った。PCRは以下のプロトコルに基づく加熱サイ
クル（Hybaid、Omnigene、アメリカ）で行った：94℃で90秒間を1サイクル、94
℃で20秒間、50℃で25秒間及び72℃で90秒間を40サイクル、及び72℃で120秒間
を1サイクル。
【００５０】 PCRのあと、断片（Tebu）の存在を確認するため、反応合成物5マイクロリット
ルをアガローズ・ゲルSeaplaque 2%上で分析した。断片（Tebu）が存在する場合
、残りの45マイクロリットルを電気泳動にかけ、QIARX IIキット（Qiagen）を使
用してアガローズ・ゲルからcDNAを抽出した。抽出したcDNAをpMOSBlueベクター
に挿入し、これを使って、メーカー（Amersham）のプロトコルに基づきpMOSBlue
T-ベクター・キットを使用してコンピテント細胞E.coli MOSBlueに感染させた。
次に感染させた細菌を選択分離培地(Xgal/IPTG)上で培養した。
【００５１】 組換えクローンはコロニー上で直接PCRにより試験した。簡単に言うと、各ブ
ランク・コロニーを10マイクロリットルの緩衝液TE中に再懸濁した。PCRは、0.25
UのポリメラーゼTaq入りのトリスHCl 緩衝液（pH 8.3）中に1マイクロリットル
のコロニー懸濁液、U19とT7の汎用プライマーをそれぞれ3 pmol、KClを50 mM及
びMgCl2を2.5 mM含む溶液10マイクロリットル中で行った。PCR用のプロトコルは
下記の通りである：94℃で270秒間を1サイクル、94℃で30秒間、その後48℃で30
秒間、その後72℃で50秒間を30サイクル、及び72℃で120秒間を1サイクル。PCR
のあと、反応合成物10マイクロリットルを2%アガローズ・ゲル上で分析した。陽
性のクローンを0.1 mg/mlのアンピシリンを含んだ液体LB培地で培養した。
【００５２】 ５）cDNA断片の抽出と精製 プラスミドcDNAをWizard miniprepキット（Promega）を使用して抽出し精製し
た。試料はGenome Express（グルノーブル、フランス）により配列した。
【００５３】 ６）配列の分析 本発明のマーモット嗅覚受容体の配列とGenbank/GenPeptにある他の配列との
比較は、NCBIサーバー上でBlastプログラムを用いて行った。多重系列を構築し
て系統発生学的分析を行うについてはClustalwを使用した。疎水性ドメインは単
純なハイドロパス（hydropathie）プロフィルを使用して画定し、またα-螺旋形
膜透過性ドメインの予想はPHDサーバーを使用して行った。さらに、マーモット
系列の14配列の変異度、ならびにそれらの平均ハイドロパス（hydropathie moye
nne）はRav3プログラムを使用してグラフの形で決定し示した。膜透過性ドメイ
ンはTop Pred IIソフトウェアで予想した。
【００５４】 II‐結果 １）mRNAの分離 マーモットの冷凍した頭部から、主として嗅覚上皮とそれを支える軟骨からな
る約2gの試料を採取した。この試料を用いて材料と方法の欄で述べた方法でmRNA
の精製及び試験を行った。合計1.95マイクログラムのmRNAが得られた。嗅覚受容
体のクローン化の可能性を増大させるため、mRNAの半分をオリゴdプライマー(T)
の存在下で、残る半分をランダムプライマー(R)の存在下で転写した。
【００５５】 ２）嗅覚受容体の配列の増幅 PCRによる増幅は、材料と方法の欄で述べた3セットの特異的縮重プライマー（
c-t、4-1、3-2）を用いて、150 ngのmRNAで行った。PCR合成物のアリコート（al
iqotes）5マイクロリットルを用いて行った電気泳動分析は、期待通りの大きさ
を示す固有のバンドを示した（図１）。cDNA "T"は、3-2プライマーでは520 bp
のバンド、c-tプライマーでは720 bpのバンドが得られた。cDNA "R"は、c-tプラ
イマーを使用して720 bpのバンドが得られた。他の3コースでは如何なるバンド
も得られなかった。ただ一つのプライマーを使用した対照PCR中では、期待した
長さの如何なるバンドも観察されなかった。試料の残り45マイクロリットルを使
用して電気泳動を繰り返し、550bpと720 bpの断片を抽出した。嗅覚受容体の多
様性に鑑み、1バンド中のcDNA個体群は不均質であると考えたため、PCRにより増
幅したcDNA断片の直接的な配列化は試みなかった。これらの断片は前述のように
E.coli中でクローン化した。
【００５６】 ３）クローン化 ベクターp-Mosblue内への挿入とE.coli MOSBlueへの感染後、合計139個のクロ
ーン細菌を得たが、そのうち58個はｃDNA "R" c-tプライマーを用いてPCRで合成
し（R c-tクローン）、31個はｃDNA "T" c-tプライマーを用いてPCRで合成し（T
c-tクローン）、50個はcDNA "T" 3-2プライマーを用いてPCRで合成した（T 3-2
クローン）。予想した断片の存在を確認するために、その断片の両側に位置する
ベクターのゾーンに相当するプライマーを用いて139個のクローンそれぞれにつ
いて別にPCRを行った。そのPCR合成物をアガローズ・ゲル上で電気泳動すると、5
個のR c-tクローン、10個のT c-tクローン及び22個のT 3-2クローンが予想通り
の断片を持つことを示した。これら37個の陽性クローンを新たに大量生産するた
めに培養した。
【００５７】 ４）シーケンシング プラスミドDNAを前述のように抽出して精製した。ヌクレオチド配列をデータ
バンク内にあるものと比較した。嗅覚受容体との類似性の高い点数のもの28配列
のうち14配列が異なっていて、この14配列は連続的であり（AMOR1〜14）、また
嗅覚受容体をコードすることができた。他の14配列は同一（n=8）又は使用不能
（n=3）又は実験条件について不完全（116、153、159アミノ酸）であった。使用
可能な14配列は、アミノ酸への翻訳を可能にする唯一の開いた読取フレームを持
っていた。正しい読取配列の割当ては、これらの推定上の翻訳とGen Bank/GenPe
pt内で使用可能な他の嗅覚受容体との類似性により確認した。最善の系列（alig
nements）における同一残基の割合は84%（AMOR4とXenopus laevis の部分配列
受入番号#：1617233の間）から46%（AMOR5とRattus norvegicusの配列 受入番号
#：AC1016362の間）の範囲であった。マーモットの14配列のうち7配列がラット
の異なる受容体と、3配列がヒトの同じ受容体（受入#：AC002988）と、3配列が
犬の同じ受容体（受入#：X89660）と、及び1配列が前述のXenopeの配列という最
善の系列を示した。同一残基の平均割合は64%であった。マーモットの新しい配
列のうち7配列（AMOR1〜7）を膜透過性ドメインIIとVIIから設計されたプライマ
ー対を用いて増幅したが、長さは234〜237残基である。残る7配列（AMOR8〜14）
は、細胞内側層2（boucle intracellulaire２）（i2）と膜透過性ドメインVII
から設計されたプライマーで得られ、176残基を含んでいる。これらの14の新し
い配列間の同一残基の割合は33%（AMOR4/AMOR8）と79%（AMOR8/AMOR11）の間で
ある。
【００５８】 ５）マーモットの推定上の嗅覚受容基のドメインの構造 マーモットの14の新しい配列と以前に同定された受容体の配列との間の全体的
相同から、7つの膜透過性ドメインを有する受容体が同じスーパー遺伝子群に属
することについてはほとんど疑いない。増幅のために使用されたプライマーの位
置付けに基づき、部分配列AMOR1〜7及びAMOR8〜14はそれぞれ6つ又は4つの膜透
過性ドメインを示すはずである。添付図3は、これらの配列の疎水性プロフィー
ルが斯かる組織と適合していることを示す。a-螺旋形膜透過性領域をより正確に
画定するため、図２の系列をPHDサーバーにもかけた。図２の領域DIII、DIV、DV
、DVI及びDVIIに相当する各領域（38-62）、（86-103）、（140-164）、（186-2
03）及び（216-232）内で、曖昧さなく、5つの膜透過性領域が割当てられた。
【００５９】 本発明者らはまた、抗原と結合する分子用に以前導入された分析を適用して、
臭気の特異的な固定部位内で関係する位置を特定することを試みた。ここでの論
拠は、これらの受容体が芳香性分子を特異的に結合すると仮定すれば、結合の特
異的部位を構成する残基が、コア構造内及び機能を有するシグナルに関係する残
基よりもより大きい変異度を示す可能性を持つことにある。
【００６０】 図４は、図２の系列で得られた変異度の分布を示す。変異度の4つのピークが
明確に分かる。並列して示されているハイドロパス（hydropathie）の平均プロ
フィール（平均ハイドロパスプロット）（図２と図４）は、予想したように、親
水性の層（boucle）内（位置210）が変異していただけでなく、疎水性領域内（
例:位置148）も変異していることを示す。最も変異度の大きいセグメントの中心
は30、100、148及び210の位置であり、それぞれのカルトグラフィーは第1細胞質
外側層（boucle extracytoplasmique）E1、第4膜透過性領域DIV、第5膜透過性
領域DV、及び第3細胞質外側層（boucle extracytoplasmique）E3の中央である
。私たちはこれらの位置の残基は、これらの受容体に相当する未知の芳香性分子
の結合部位に関係する可能性を持つことを提案する。これらの位置は、膜透過性
領域が芳香性分子を受取ることのできる外部に向かって開いた保護膜に集合する
可能性があるとの仮説と適合している。斯かるモデルはまた、多くの芳香性分子
が疎水性を持つという事実とも一致している。
【００６１】 ６） 嗅覚受容体の構造的分類 私たちはマーモットのクローン化した受容体を、すでに述べた他の種の配列に
対して分類することを試みた。図５は、様々の種で見出されたEMBLデータバンク
の122の嗅覚受容体の構造的分類ならびに本発明の一環としてマーモットで同定
された14の完全な配列と3つの不完全な配列を示す。魚の受容体を除き、これら
の受容体は種ごとに集められていない。異なる数の受容体を含んでいる5つの族
が存在する。マーモットの嗅覚受容体は亜族1、2及び5に分類される。亜族2には
12の配列が並んでいる。
【００６２】 受容体間の最も高い種間相同割合（同一残基が70%以上）は星印で示した9ケー
スで観察された：ラットとマウスとの間で5ケース（95%まで）、ラットとヒトと
の間で1ケース（80%）、犬とヒトとの間で2ケース（85%まで）、及びマーモット
の受容体とラットの受容体との間で1ケース（73%）。ヒトとマーモット間の受容
体の相同性は同一残基で決して75%を超えない。
【００６３】 III‐ディスカッション 嗅覚受容体は大きな多重遺伝子族を含んでいる。それらの研究は複数のアプロ
ーチの組合せを必要とする。複数の異なるプライマーでの逆PCR方式が本発明の
一環として実施された。このアプローチは成功をおさめた。何故なら、嗅覚受容
体の推定上の28配列が得られ、そのうち14配列が比較分析可能だったからである
。PCRの条件を変えるだけでより多くの配列を入手できる。本発明の一環として
クローン化された遺伝子族は2つの理由から嗅覚受容体をコードすると言える。
１つは、これらの配列のハイドロパス（hydropathie）プロフィールが7つの膜透
過性ドメインの受容体スーパー遺伝子群の受容体と一致していること。２つ目は
、データバンクの配列との比較から以前に同定された配列と高度の類似性を示す
ことである。
【００６４】 マーモットの推定上の嗅覚受容体上のリガンドの潜在的認識部位が同定された
。嗅覚能は多種多様な芳香性分子の特異的認識を必要とするため、嗅覚受容体の
リガンド結合部位は、配列のコア構造及び形質導入機能に関係する他の部分より
も残基間の変異度がより大きいと仮定した。2つの膜透過性ドメイン（DIVとDV）
及び2つの細胞外側層（boucles extracellulaires）（E1とE3）内で最も強い変
異度が観察された。よって、これらの領域はリガンドの認識に関係する可能性を
持つと結論付けた。
【００６５】 膜透過性保護膜に深い結合部位が存在することは嗅覚受容体の特異的な特徴で
はなく、生物起源の7つの膜透過性ドメインの受容体に共通の特徴である。
【００６６】 7つの膜透過性ドメインの受容体と関係するGタンパク質との間の主要な相互作
用部位は、第3細胞内側層（boucle intracellulaire）である。本書で紹介する
配列では、最も保存されたセグメントは位置180〜193の間、即ちこの膜（boucle
）の終端と第6膜透過性ドメインの始端との間に位置付けられる。
【００６７】 得られた結果はマーモットの嗅覚受容体とネズミの嗅覚受容体との間の注目す
べき類似性を指摘する。第3細胞内側層（boucle intracellulaire）（i3）の長
さ（18残基）は短かった。コンセンサス配列IVSSI（又は近い配列）は本発明の
クローンの75%で第3細胞内側層のN-末端の先端であった。第3細胞内側層（boucl
e intracellulaire）はセリン残基に富んでいて、GRK用にホスホリル化部位を
構成することができる。7つの膜透過性ドメインの受容体は複数のグループに分
類される。嗅覚受容体は嗅覚受容体はグループIに属すると想定され、これはi2
のN‐末端側に強く保存されたDRY配列が存在することを特徴とする。DRY配列は
本発明の４つのクローンに存在するが、残る10個のクローンではDRF配列により
置換される。
【００６８】 異なる種による同じ香りの認識は興味深い問題を提起する。これらの種はオル
ソロガス(orthologues)受容体を持つと予想できる。Clustalwソフトウェア（図
５）を使用して、本発明者らはマーモットの嗅覚受容体のいくつかが他の種、特
に他の齧歯類の嗅覚受容体の真正のオルソロガス(orthologues）であるかを決定
しようとした。Gタンパク質に結合した受容体では、異なる種のオルソロガス(or
thologues）受容体との間の同一割合は68%（犬とヒトのCSN受容体について）か
ら98%（ラットとヒトのカンナビノイド（cannabinoide）受容体について）であ
った。この程度の類似割合の嗅覚受容体がラットとマウス、ラットとヒト、及び
犬とヒトとの間で観察された。マーモットの唯一の嗅覚受容体がラットとの間で
この程度の類似割合を示した（AMOR14 73%）。一般的に、強い相同性は見ら
れなかった。この発見は、真のオルソロガス(orthologues）受容体の同定を行う
には嗅覚受容体数が少なすぎたか、あるいはオルソロガス(orthologues）受容体
間の類似割合が68%以下になり得ることを指摘する可能性がある。
【００６９】 もう一つの仮説は、野生動物が実験室の動物よりも多くの臭気について受容体
を発現することである。自然での生存には嗅覚能が重要であるから嗅覚能が強く
発達しているとの仮説に基づき、本研究のモデルとしてアルプスのマーモット（
Marmota marmota）が選ばれた。アルプスのマーモットは頬腺によって作られる
分泌物でその縄張りを印す。さらに、非常に高い社会性を備えたこの動物にとっ
て、嗅覚の重要性は実に高い：マーモットは繁殖力のある定住性の成体の一組と
2才又はそれ以上まで生まれた集団に留まる継続的な複数の出産の子孫により形
成される家族集団で生息する。各マーモットは同じ集団又は他の集団の構成員が
嗅ぐことのできる芳香性分子の異なる組合せを持つ。
【００７０】 他の感覚組織と違い、嗅覚組織は無数の異なる受容体を必要とする。哺乳類は
一般的に約千個の遺伝子を持つと想定されるから、本研究で同定されたクローン
はおそらくマーモットの嗅覚受容体の一部にしか過ぎない。私たちの成果は、同
定された受容体数を増やすのに貢献することに加えて、諸種の間のオルソロガス
(orthologues）受容体の存在及びいくつかの膜透過性ドメインで観察される局部
的変異が受容体の特異性にとって最も重要であるという考え方を支持する。千個
の受容体でどうして自然に存在する何万もの臭気を区別できるのかは未だ分から
ない。これらの受容体の性質と嗅覚的特殊性の最終的な確認は、完全な配列が得
られない限り、また1個又は複数の芳香性分子との特異的な結合が解明されない
限り不可能である。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ２種類のｃＤＮＡから作られたＰＣＲ合成物の分析結果である。
【図２Ａ】 マーモットの推定上の嗅覚受容体の１４の配列を示す。
【図２Ｂ】 マーモットの推定上の嗅覚受容体の１４の配列を示す。
【図２Ｃ】 マーモットの推定上の嗅覚受容体の１４の配列を示す。
【図２Ｄ】 マーモットの推定上の嗅覚受容体の１４の配列を示す。
【図３Ａ】 プライマー・セットｃ−ｔで得られた長い配列のハイドロパスプロフィール及
びプライマー・セット3−2で得られた短い配列のハイドロパスプロフィールであ
る。
【図３Ｂ】 プライマー・セットｃ−ｔで得られた長い配列のハイドロパスプロフィール及
びプライマー・セット3−2で得られた短い配列のハイドロパスプロフィールであ
る。
【図３Ｃ】 プライマー・セットｃ−ｔで得られた長い配列のハイドロパスプロフィール及
びプライマー・セット3−2で得られた短い配列のハイドロパスプロフィールであ
る。
【図３Ｄ】 プライマー・セットｃ−ｔで得られた長い配列のハイドロパスプロフィール及
びプライマー・セット3−2で得られた短い配列のハイドロパスプロフィールであ
る。
【図３Ｅ】 プライマー・セットｃ−ｔで得られた長い配列のハイドロパスプロフィール及
びプライマー・セット3−2で得られた短い配列のハイドロパスプロフィールであ
る。
【図４】 マーモットの嗅覚受容体の新しい連続した１４配列の変異度を示すグラフであ
る。
【図５Ａ】 様々な種の嗅覚受容体の間の類似性を示す樹状図である。
【図５Ｂ】 様々な種の嗅覚受容体の間の類似性を示す樹状図である。
【図５Ｃ】 様々な種の嗅覚受容体の間の類似性を示す樹状図である。 参考文献 (1)Axel R.（1995年）。匂いの分子論理。Scientific American 10月号154〜 159。 (2)Bel M.C.、Porteret C.及びCoulon J.（1995年）。フランス・アルプスの
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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ 33/50 Ｐ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 マリエル レヌッチ フランス国 Ｆ−13008 マルセイユ リ ュ デュモンド ヴィール 11 (72)発明者 アンヌ ベレック フランス国 Ｆ−13009 マルセイユ リ ュ フロラリア 33 ヴィラ ８ (72)発明者 ヴァレリ マタラッゾ フランス国 Ｆ−13360 ロックベール リュ ドゥ カルベール ４ Ｆターム(参考） 2G045 AA35 AA40 BB20 CB01 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB03 4B024 AA11 AA19 BA63 CA04 GA11 4B064 AG20 CA01 CA19 CC24 DA13 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA40 DA50 EA50 FA72 FA73 FA74 HA05

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 マーモットの精製されたことを特徴とする嗅覚受容体。
  2. 【請求項２】 添付配列リストの番号SEQ ID No.1〜SEQ ID No.23から選択
    されるアミノ酸配列で構成されるか又はそれを含むことを特徴とする嗅覚受容体
    、またはこれらに機能的に相当する誘導体。
  3. 【請求項３】 添付配列リストの番号SEQ ID No.1〜SEQ ID No.23から選択
    されるアミノ酸配列と、約75%好ましくは少なくとも95%の相同性を示すアミノ酸
    配列で構成されるか又はそれを含むことを特徴とする請求項２に記載の受容体。
  4. 【請求項４】 添付配列リストの番号SEQ ID No.1〜SEQ ID No.23から選択
    されるアミノ酸配列の１つ又は複数の領域が修飾されているアミノ酸配列で構成
    されるか又はそれを含むことを特徴とする請求項2又は3のいずれかに記載の受容
    体。
  5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれかに記載の少なくとも1受容体に対し
    て向けられたポリクローナルまたはモノクローナル抗体を有することを特徴とす
    る臭覚受容体。
  6. 【請求項６】 請求項１〜４のいずれかに記載の1受容体をコードする核酸
    配列を含むことを特徴とするか又はそれで構成される核酸分子。
  7. 【請求項７】 添付配列リストの番号SEQ ID No.24〜SEQ ID No.47から選択
    される配列を含むか又はそれで構成される請求項６に記載の核酸分子。
  8. 【請求項８】 好ましくは対照配列に結合された、請求範囲6又は7のいずれ
    か一つに記載の少なくとも1核酸分子を含むベクター。
  9. 【請求項９】 請求項１〜４のいずれか一つに記載の受容体の合成方法であ
    って、下記工程を含む： 請求項6又は7のいずれかに記載の1核酸分子又は請求項8に記載の1ベクターを
    宿主内に伝達する工程、 当該宿主細胞を受容体を構成するタンパク質の合成が可能な条件で培養する工
    程、 何らかの適当な手段により上記のタンパク質を分離する工程。
  10. 【請求項１０】 請求項１〜４のいずれかに記載の1受容体を宿主に発現す
    る方法であって、 請求項６または７のいずれかに記載の1核酸分子又は請求項8に記載の1ベクタ
    ーを宿主内に伝達する工程、 宿主表面に当該受容体を発現させることが可能な条件で当該宿主を培養する工
    程 を含む方法。
  11. 【請求項１１】 請求項６又は7のいずれかに記載の1核酸分子によるか又は
    請求項８に記載の1ベクターにより形質転換された宿主。
  12. 【請求項１２】 ある化合物と一つ又は複数の当該受容体とを接触させてか
    ら、何らかの適切な手段で当該化合物と当該受容体の間の類縁関係を測定するこ
    とを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の1受容体のリガンドを構成する
    可能性のある化合物のスクリーニング方法。
  13. 【請求項１３】 請求項１２に記載の方法を実施するのに有効な請求項１〜
    ４のいずれかに記載の１または複数の受容体がその上に固定される膜。
  14. 【請求項１４】 請求項１３に記載の方法により同定され且つ選択される嗅
    覚受容体のリガンドを構成する化合物。
  15. 【請求項１５】 芳香の検出、品質の管理、試料の分析、香料の分析又は比
    較、有毒物質の検出、又は捕臭のために用いられる請求項１〜４のいずれかに記
    載の受容体、請求項１１に記載の宿主または請求項１３に記載の膜の利用。
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