JP2002517232A

JP2002517232A - 新規マンナナーゼ

Info

Publication number: JP2002517232A
Application number: JP2000553563A
Authority: JP
Inventors: スリークリシュナ，コティカンヤダナム; ジョンストン，ケビン; サウンダーズ，チャールズ; ベッティオ，ジャン−ルーク
Original assignee: ノボザイムスアクティーゼルスカブ
Priority date: 1998-06-10
Filing date: 1999-06-07
Publication date: 2002-06-18
Also published as: AU4256299A; EP1086210A1; WO1999064573A1; US6060299A

Abstract

(57)【要約】新規なマンナナーゼが例えばバチルス・ズブチリス１６８株から得られ、又は配列番号１に示すヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子によりコードされる。このマンナナーゼに、クリーニング又は洗剤組成物において、植物材料の修飾のために、又はセルロース繊維の処理のために、有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、微生物マンナナーゼ、より具体的には、中性及びアルカリpH範囲で
それらの主要酵素活性としてマンナナーゼ活性を示す微生物酵素；そのような酵
素を生成する方法；及びパルプ、布、清浄、洗濯、洗剤及びセルロース繊維加工
産業へのそのような酵素の使用方法に関する。

【０００２】発明の背景：マンナン含有多糖類は、木材におけるヘミセルロース画分、及び多くのマメ科
種子及び非マメ科植物のいくつかの成熟種子における内胚乳の主要成分である。
実質的に置換されていない線状β−１、４−マンナンは、いくつかの非マメ科植
物に見出される。例えば、ゾウゲヤシに存在する置換されていないβ−１、４−
マンナンは、個々の多糖鎖の配座においてセルロースに似ており、そして水不溶
性である。

【０００３】マメ科種子において、水溶性ガラクトマンナンは、合計乾量の20％までを構成
する主要貯蔵炭水化物である。ガラクトマンナンは、単一のα−１，１，６−ガ
ラクトースにより置換された、任意にはアセチル基により置換された線状β−１
，４−マンナン主鎖を有する。マンナンはまた、いくつかの単子葉植物にも見出
され、そしてヤシ種子粉における細胞壁材料において最も豊富な多糖である。

【０００４】グルコマンナンは、多かれ少なかれ、規則的な態様で交互にβ−１，４−結合
のマンノース及びグルコースの主鎖を有する線状多糖類であり、前記主鎖は任意
には、ガラクトース及び/又はアセチル基により置換されている。マンナン、ガ
ラクトマンナン、グルコマンナン及びガラクトグルコマンナン（すなわち、枝分
かれガラクトースを有するグルコマンナン主鎖）は、軟木ヘミセロースの50％以
上に寄与する。さらに、多くの赤藻類のセルロースは、有意な量のマンノースを
含む。

【０００５】マンナナーゼは、いくつかのバチルス生物に同定されている。例えば、Talbot
など., Appl. Environ. Microbiol., Vol.56, N.11, pp.3505-3510 (1990) は、
162kDaの分量及び5.5〜7.5の最適pHを有するダイマー形での、バチルス・ステア
ロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）に由来するβ−マンナナー
ゼを記載する。Mendozaなど., World J. Microbiol. Biotech., Vol. 10, No.5,
pp.551-555 (1994) は、38kDaの分子量、pH5.0及び55℃での最適pH及び4.8のpI
を有する、バチルス・サブチリスに由来するβマンナナーゼを記載する。

【０００６】日本特許出願公開第03047076号は、ゲル濾過により測定される37±3kDaの分子
量、３〜８の最適pH及び5.3〜5.4のpIを有する、バチルスsp. に由来するβマン
ナナーゼを開示する。日本特許出願公開第63056289号は、例えばマンナンのβ−
１，４−D−マンノピラノシド結合を加水分解し、そしてマンノ−オリゴ糖を生
成するアルカリ性熱安定βマンナナーゼの生成を記載する。日本特許出願公開第
63036775号は、アルカリ性pHでβ−マンナナーゼ及びβ−マンノシダーゼを生成
するバチルス微生物FERM P−8856を言及する。日本特許出願公開第08051975号
は、43±kDa及び57±3kDaの分子量及び８〜10の最適pHを有する、好アルカリバ
チルスsp. AM-001に由来するアルカリβ−マンナナーゼを開示する。

【０００７】パルプ及び紙の漂白において有用なバチルス・アミロリクエファシエンスから
の精製されたマンナナーゼ、及びその生成方法が、WO97/11164に開示される。WO
91/18974号は、極端なpH及び温度で活性的なヘミセルラーゼ、例えばグルカナー
ゼ、キシラナーゼ又はマンナナーゼを記載する。WO94/25576号は、植物又は藻類
細胞壁材料の分解又は変性のために有用であるマンナナーゼ活性を示す、アスペ
ルギラス・アキュレアタス（Aspergillus aculeatus）CBS101.43からの酵素を開
示する。WO93/24622号は、リグノセルロース性パルプの漂白のために有用なトリ
コダーマ・レセイ（Trichoderma reseei）から単離されたマンナナーゼを開示す
る。

【０００８】 WO95/35362号は、植物起源のしみの除去のためのペクチナーゼ及び/又はヘミ
セルラーゼ及び任意にはセルラーゼ活性を有する植物細胞壁酵素を含む清浄組成
物を開示し、そしてさらに、C11SB.G17株からのアルカリマンナナーゼを開示す
る。例えば、清浄組成物又は異なった産業工程に適用される場合、またはアルカリ
性pH範囲においてマンナナーゼ活性を示す新規且つ効果的な酵素を提供すること
が、本発明の目的である。

【０００９】発明の要約：本発明者は、実質的なマンナナーゼ活性を有する新規酵素、すなわちバチルス
属、より特定には、バチルス・サブチリス株の細菌株から得られるマンナナーゼ
活性を示す酵素を、そのような酵素をコードするDNAを同定することによって現
在見出した。前記DNA及び推定されるアミノ酸は、それぞれ配列番号1及び２とし
て列挙される配列で列挙される。新規酵素は、酵素分類EC 3.2.1.78 における酵
素命名法に従って分類されるであろうと思われる。

【００１０】第１の観点において、本発明は、ｉ）配列番号２の位置１〜位置336に示され
るようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドを含んで成り；ii) 前記ポリペ
プチドと少なくとも80％相同であるｉ）に定義されるポリペプチドの類似体を含
んで成り；iii) １又はいくつかのアミノ酸の置換、欠失又は付加により前記ポ
リペプチドから誘導される前記ポリペプチドの突然変異又は変異を含んで成り；
又はiV) 精製された形で前記ポリペプチドに対して生じたポリクローナル抗体と
免疫学的に反応する、マンナナーゼ（EC 3.2.1.78）に関する。

【００１１】１つの観点において、本発明は、（ａ）配列番号１のヌクレオチド１〜ヌクレ
オチド1011に示されるようなヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分
子；（ｂ）上記（ａ）の種相同体；（ｃ）配列番号２の位置１〜位置336のアミ
ノ酸配列に対して少なくとも80％相同であるポリペプチドをコードするポリヌク
レオチド分子；（ｄ）上記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に対して相補的な分子；及
び（ｅ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の縮重ヌクレオチド配列；から
成る群から選択された、マンナナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単
離されたポリヌクレオチド分子の使用に関する。

【００１２】本発明のもう１つの観点においては、次の作用可能に結合される要素：転写プ
ロモーター；（ａ）配列番号１の位置１〜位置1011に示されるようなヌクレオチ
ド配列を含んで成るマンナナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド分子、（ｂ）上記（ａ）の種相同体、（ｃ）配列番号２の位置１〜位
置336のアミノ酸配列に対して少なくとも80％相同であるマンナナーゼ活性を有
するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子、及び（ｄ）上記（ａ）、
（ｂ）又は（ｃ）の縮重ヌクレオチド配列から成る群から選択されたDNAセグメ
ント；並びに転写ターミネーター；を含んで成る発現ベクターが提供される。

【００１３】本発明のさらにもう１つの観点においては、上記のような発現ベクターを導入
されている、前記DNAセグメントによりコードされるポリヌクレオチドを発現す
る細胞が提供される。本発明のさらなる観点は、（ａ）配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を
含んで成るポリペプチド分子；及び（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列に対して少
なくとも80％同一であるポリペプチド分子から成る群から選択された、マンナナ
ーゼ活性を有する単離されたポリペプチドを提供する。

【００１４】本発明のもう１つの観点においては、任意には他のポリペプチド又は酵素と組
合して、本発明の精製されたポリペプチドを含んで成る酵素調製物が提供される
。本発明のもう１つの観点においては、上記の発現ベクターを導入されている細
胞を培養し、それにより、前記細胞がDNAセグメントによりコードされるポリペ
プチドを発現し；そして前記ポリペプチドを回収する；ことを含んで成る、本発
明のポリペプチドを生成するための方法が提供される。

【００１５】本発明の新規酵素は、セルロース材料、特にセルロース含有ファイバー、糸、
織布又は不織布の処理、機械紙−製造パルプ、クラフト紙又は再循環された故紙
の処理、及び繊維の浸水のために有用である。前記処理は、紙、又は被服又は布
の製造の準備のための材料へのセルロース材料の加工の間（後者は、例えば糊抜
き又は精練段階において存在する）；又はそのような布又は被服の産業用又は家
庭用洗浄の間に実施され得る。従って、さらなる観点においては、本発明は、本発明の酵素を含んで成る清浄
又は洗剤組成物；及びセルロース含有ファイバー、糸、織布又は不織布、及び合
成又は一部合成布の処理、例えば清浄のためへの本発明の酵素の使用に関する。

【００１６】本発明の酵素は、続く染色操作における正しい応答のためのセルロース材料の
調製における酵素精練工程及び/又は糊抜き（マンナン糊剤の除去）において有
用である。前記酵素又は、マンナン含有プリント用ペーストの除去のためにも有
用である。さらに、新規酵素を含んで成る洗剤組成物は、洗濯物上に存在する土
壌又はしみ、特にマンナン含有食品、植物及び同様のものに起因する土壌及びス
ポトを除去し又は漂白することができる。さらに、新規酵素を含んで成る清浄又
は洗剤組成物による処理は、白色度を改良し、そしてセルロース材料への土壌の
結合を妨げる。

【００１７】従って、本発明はまた、本発明のマンナナーゼを含んで成る清浄組成物、例え
ば洗濯、皿洗い、硬質表面クリーナー、身辺用クレンジング及び経口/歯用組成
物にも関する。さらに、本発明は、マンナナーゼ、及びセルラーゼ、プロテアー
ゼ、リパーゼ、アミラーゼ、ペクチン分解酵素及びキシログルカナーゼから選択
された酵素を含んで成るそのような清浄組成物にも関し、そのような組成物は、
卓越した清浄性能、すなわち卓越したしみの除去、ディンギー清浄又は白色性維
持を付与する。

【００１８】定義：本発明を、さらに詳細に論じる前、次の用語をまず定義するであろう。用語“オルト体（ortholog）”（又は“種相同体”）とは、異なった種からの
類似するポリペプチド又はタンパク質に対して相同性を有する１つの種から得ら
れたポリペプチド又はタンパク質を示す。用語“パラ体（paralog）”とは、同じ種からの異なったポリペプチド又はタ
ンパク質に対して相同性を有する所定の種から得られたポリペプチド又はタンパ
ク質を示す。

【００１９】用語“発現ベクター”とは、その転写を提供する追加のセグメントに作用可能
的に連結された対象ポリペプチドをコードするセグメントを含んで成る、線状又
は環状DNA分子を示す。そのような追加のセグメントは、プロモーター及びター
ミネーター配列を包含することができ、そして任意には、１又は複数の複製起点
、１又は複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、及び同
様のものを含むことができる。発現ベクターは一般的に、プラスミド又はウィル
スDNAに起因し、又は両要素を含むことができる。

【００２０】本発明の発現ベクターは、組換えDNA方法に便利にゆだねられるいずれかの発
現ベクターであり得、そしてベクターの選択はしばしば、それが導入される予定
である宿主細胞に依存するであろう。従って、ベクターは、自律的に複製するベ
クター、すなわちその複製が染色体複製に無関係である、染色体外実存体として
存在するベクター、例えばプラスミドであり得る。他方では、ベクターは、宿主
細胞中に導入される場合、宿主細胞ゲノム中に組込まれ、そしてそれが組込まれ
ている染色体と共に複製されるベクターであり得る。

【００２１】用語“組換え発現される”又は“組換え的に発現される”とは、ポリペプチド
又はタンパク質の発現に関して本明細書において使用される場合、当業界におけ
る標準の定義に従って定義される。タンパク質の組換え的発現は一般的に、上記
に記載されるような発現ベクターを用いることによって行われる。

【００２２】用語“単離される”とは、ポリヌクレオチド分子に適用される場合、そのポリ
ヌクレオチドがその天然の遺伝子環境から除去されており、そして従って他の外
来の又は不所望のコード配列を有さず、そして遺伝子的に構築されたタンパク質
生成システム内での使用のために適切な形で存在することを示す。そのような単
離された分子は、それらの天然の環境から分離され、そしてcDNA及びゲノムクロ
ーンを含むそれらの分子である。

【００２３】本発明の単離されたDNA分子は、それらが通常関連する他の遺伝子を有さない
が、しかし天然に存在する5'及び3'側の未翻訳領域、例えばプロモーター及びタ
ーミネーターは含むことができる。関連する領域の同定は、当業者に明らかであ
ろう（例えば、Dynan and Tijan, Nature 319: 774-78, 1985を参照のこと）。
用語“単離されたポリヌクレオチド”とは他方では、“クローン化されたポリヌ
クレオチド”とも称することができる。

【００２４】タンパク質/ポリペプチドに適用される場合、用語“単離された”とは、タン
パク質がその天然の環境以外の条件において見出されることを示す。好ましい形
においては、単離されたタンパク質は、他のタンパク質、特に他の相同タンパク
質（すなわち“相同不純物”（下記参照のこと））を実質的に有さない。40％よ
りも高い純粋な形、より好ましくは60％よりも高い純粋な形でタンパク質を提供
することが好ましい。

【００２５】さらにより好ましくは、SDS−PAGEにより決定される場合、高く精製された形
、すなわち80％以上、より好ましくは95％以上、及びさらにより好ましくは99％
以上の純粋な形でタンパク質を提供することが好ましい。用語“単離されたタンパク質/ポリペプチド”とは、他方では、“精製された
タンパク質/ポリペプチド”とも呼ばれ得る。用語“相同不純物”とは、本発明のポリペプチドが最初に得られる相同細胞に
起因するいずれかの不純物（例えば、本発明のポリペプチド以外の他のポリペプ
チド）を意味する。

【００２６】用語“〜から得られた”とは、特定の微生物源に関して本明細書において使用
される場合、ポリヌクレオチド及び/又はポリペプチドが特定源（相同発現）に
より、又はその源からの遺伝子が挿入されている細胞（非相同発現）により生成
されることを意味する。用語“作用可能に連結される”とは、DNAセグメントを言及する場合、そのセ
グメントが、それらの意図された目的に関して機能するよう、例えば転写がプロ
モーターにおいて開始し、そしてコードセグメントを通してターミネーターに進
行するよう配列されることを意味する。

【００２７】用語“ポリヌクレオチド”とは、5'から3'末端に読み取られるデオキシリボヌ
クレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーを示す。ポリ
ヌクレオチドはRNA及びDNAを包含し、そして天然源から単離され、インビトロで
合成され、又は天然及び合成分子の組み合わせから調製され得る。用語“ポリヌクレオチド分子の相補体”とは、対照配列に比較して、相補的な
塩基配列及び逆の配向を有するポリヌクレオチドを示す。例えば、配列5' ATGCA
CGGG 3'は、5' CCCGTGCAC 3'に対して相補的である。

【００２８】用語“縮重ヌクレオチド配列”とは、１又は複数の縮重コドンを含むヌクレオ
チドの配列を示す（ポリペプチドをコードする対照ポリヌクレオチド分子に比較
して）。縮重コドンは、異なったヌクレオチドトリプレットを含むが、しかし同
じアミノ酸残基をコードする（すなわち、GAU及びGACトリプレットはそれぞれ、
Aspをコードする）。用語“プロモーター”とは、RNAポリメラーゼの結合及び転写の開始を提供す
るDNA配列を含む遺伝子の部分を示す。プロモーター配列は通常、遺伝子の5'非
コード領域に検出されるが、しかし必ずしもそうではない。

【００２９】用語“分泌シグナル配列”とは、より大きなポリペプチドの成分として、それ
が合成される細胞の分泌経路を通してそのより大きなポリペプチドを方向づける
ポリペプチド（“分泌ペプチド”）をコードするDNA配列を示す。大きなペプチ
ドは、通常、分泌経路を通して、遷移の間、分泌ペプチドを除去するために分解
される。

【００３０】用語“マンナナーゼ”又は“ガラクトマンナナーゼ”とは、マンナンエンド
−１，４−β−マンノシダーゼと公的に命名され、そして他の名称β−マンナナ
ーゼ及びエンド−１，４−マンナナーゼを有し、そしてマンナン、ガラクトマン
ナン、グルコマンナン及びガラクトグルコマンナンにおける１，４−β−D−マ
ンノシドの結合の加水分解を触媒するものとして当業界において定義されている
マンナナーゼ酵素を示し、この酵素はEC3.2.1.78としての酵素命名法（http://w ww.expasy .ch/enzyme）に従って分類される。

【００３１】発明の特定の記載：他の関連する配列を得るためへの本発明の配列の使用法：本発明のマンナナー
ゼをコードするポリヌクレオチド配列に関連する本発明に開示される配列情報が
他の相同マンナナーゼを同定するための手段として使用され得る。例えば、ポリ
メラーゼ鎖反応（PCR）が、種々の微生物源、特に異なったバチルス種からの他
の相同マンナナーゼをコードする配列を増幅するために使用され得る。活性試験についてのアッセイ：

【００３２】マンナナーゼ活性を有する本発明のポリペプチドは、当業界において知られて
いる標準の試験方法に従って、例えば0.2％のAZCLガラクトマンナン（carob）、
すなわちMegazymeの会社（Megazymeのインターネットアドレス：http://www.meg
azyme.com/Purchase/Index.html）からカタログNo.I-AZGMAとして入手できるエ
ンド−１，４−D−マンナナーゼのアッセイのための基質を含む寒天プレートに
押しぬかれた4mmの直径の穴に試験されるべき溶液を適用することによって試験
され得る。

【００３３】ポリヌクレオチド：本発明の好ましい態様においては、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、
少なくとも中位の緊縮条件下で、配列番号1の類似する大きさの領域又はそれに
対して相補的な配列にハイブリダイズするであろう。

【００３４】特に、本発明の有用なポリヌクレオチドは、配列番号１に示される全配列又は
少なくとも約100個の長さの塩基対を有する、配列番号1の副配列を含んで成るい
ずれかのプローブに対して、少なくとも中位の緊縮条件下で、しかし好ましくは
、下記に詳細な説明されるような高い緊縮性条件下でハイブリダイズするであろ
う。

【００３５】ヌクレオチドプローブと相同DNA又はRNA配列の間の、中位又は高い緊縮下での
ハイブリダイゼーションを決定するための適切な実験条件は、５×SSC（塩化ナ
トリウム/クエン酸ナトリウム、Sambrook など., 1989）において、ハイブリダ
イズするDNAフラグメント又はRNAを含むフィルターの10分間のプレソーキング、
及び５×SSC、５×Denhardtの溶液（Sambrookなど., 1989）、0.5％SDS及び100
μg/mlの変性され、音波処理されたサケ精子DNA（Sambrookなど., 1989）の溶液
におけるフィルターのプレハイブリダイゼーション、続いて、10ng/mlの濃度の
ランダム−プライムされた（Feinberg, A. P. and Vogelstein, B. (1983) Anal
. Biochem. 132: 6-13）、³²P−dCTP−ラベルされた（１×10⁹cpm/μgよりも高
い比活性）プローブを含む同じ溶液における約45℃で12時間のハイブリダイゼー
ションを包含する。

【００３６】次に、フィルターは、２×SSC, 0.5％SDSにより、少なくとも60℃（中位の緊
縮性）、さらにより好ましくは少なくとも65℃（中位/た化位緊縮性）、さらに
より好ましくは少なくとも70℃（高い緊縮性）、及びさらにより好ましくは少な
くとも75℃（非常に高い緊縮性）で、30分間、2度洗浄される。オリゴヌクレオチドプローブがそれらの条件下でハイブリダイズする分子は、
X−線フィルムを用いて検出される。

【００３７】前で示されたように、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、DNA及びRNAを
包含する。DNA及びRNAを単離するための方法は、当業界において良く知られてい
る。興味ある遺伝子をコードするDNA及びRNAは、当業界において知られている方
法により、Gene Banks 及びDNAライブラリーにおいてクローン化され得る。

【００３８】次に、本発明のマンナナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドが同定され、そして、例えばハイブリダイゼーション又はPCRにより単
離される。本発明はさらに、異なった細菌株からの相対ポリペプチド及びポリヌクレオチ
ド（オルト体又はパラ体）を提供する。バチルスの種を包含するグラム−陽性好
アルカリ菌株からのマンナナーゼポリペプチドが特に興味あるものである。

【００３９】本発明のマンナナーゼ活性を有するポリペプチドの種相同体（species homolo
gue）は、従来のクローニング技法と組合せて、本発明より提供される情報及び
組成物を用いてクローン化され得る。例えば、本発明のDNA配列は、タンパク質
を発現する細胞型から得られる染色体DNAを用いて、クローン化され得る。適切
なDNA源は、本明細書に開示される配列から企画されたプローブによりノザン又
はサザンブロットをプローブすることによって同定され得る。次にライブラリー
が、陽性細胞系の染色体DNAから調製される。

【００４０】次に、マンナナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする本発明のDNA配列
が、種々の方法により、例えば本明細書に開示される配列から企画されたプロー
ブにより、又は開示される配列に基づいて1又は複数組みの変性プローブにより
プローブすることによって単離され得る。本発明のDNAはまた、ポリメラーゼ鎖
反応（PCR）（Mullis, アメリカ特許第4,683,202号）を用いて、又は本明細書に
開示される配列からの企画されたプライマーを用いてクローン化され得る。

【００４１】さらなる方法においては、DNAライブラリーは、宿主細胞を形質転換し、又は
トランスフェクトするために使用され得、そして興味あるDNAの発現が、材料及
び方法、及び例１に記載のようにして、バチルス・サブチリス株169からクロー
ン化されたマンナナーゼに対して生ぜしめられた抗体（モノクローナル又はポリ
クローナル）により、又はマンナナーゼ活性を有するポリペプチドに関連する活
性試験により検出され得る。

【００４２】本発明のDNA配列及び／又は類似するDNA配列のマンナナーゼコード部分は、マ
ンナン分解活性を有する酵素を精製する、細菌種バチルス・サブチリス、好まし
くは株168、又は本明細書に記載されるようなもう1つの又は関連する生物からク
ローン化され得る。

【００４３】他方では、類似する配列は、前記DNA配列、例えばその副配列に基づいて、前
記DNA配列によりコードされるマンナナーゼのもう1つのアミノ酸配列を生ぜしめ
ないが、しかし酵素の生成のために意図された宿主生物のコドン使用法に対応す
るヌクレオチド置換の導入により、又は異なったアミノ酸配列（すなわち、本発
明のマンナン分解酵素の変異体）を生ぜしめることができるヌクレオチド置換の
導入により構成され得る。

【００４４】ポリペプチド：配列番号２のアミノ酸の配列は，成熟マンナナーゼ配列である。本発明はまた、配列番号２のポリペプチドに対して実質的に相同であるマンナ
ナーゼポリペプチド、及びそれらの種相同相（パラ体又はオルト体）を提供する
。用語“実質的に相同である”とは、配列番号２に示される配列、又はそれらの
オルト体又はパラ体に対して、70％、好ましくは少なくとも80％、より好ましく
は少なくとも85％、及びさらにより好ましくは少なくとも90％の配列同一性を有
するポリペプチドを示すために、本明細書において使用される。

【００４５】そのようなポリペプチドは、配列番号２に示される配列、又はそのオルト体又
はパラ体に対して、より好ましくは少なくとも95％及び最も好ましくは98％又は
より以上に同一であろう。％配列同一性は、従来の方法、すなわち当業者におい
て知られているコンピュタープログラムパッケージプログラム、例えば引用によ
り本明細書に組込まれる、Needleman, S. B. and Wunsch, C. D., (1970), Jour
nal of Molecular Biology, 48: 443-453において開示されるようなGCGプログラ
ムパッケージ（Program Manual for the Wisconsin Package, Version8, August
1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, U
SA 53711）に提供されるGAPにより決定される。GAPは、ポリペプチド配列比較の
ために次の設定を用いて使用される：3.0のGAP創造ペナルティー及び0.1のGAP延
長ペナルティー。

【００４６】ポリヌクレオチド分子の配列同一性は、DNA配列比較に関して次の設定でのGAP
を用いて類似する方法により決定される：5.0のGAP創造ペナルティー及び0.3のG
AP延長ペナルティー。本発明の酵素調製物は好ましくは、微生物、好ましくは細菌、原始生物又は菌
類、特に細菌、例えばバチルス、好ましくは種バチルス・サブチリス及びすべて
の種が、好ましくは、整列された16S rDNA配列に基づいてバチルス・サブチリス
に対して少なくとも95％、さらにより好ましくは少なくとも98％相同である高い
関連性のバチルス種から成る群から選択され得るバチルス株に属する細菌に由来
する。

【００４７】実質的に相同のタンパク質及びポリペプチドは、１又は複数のアミノ酸置換、
欠失又は付加を有するものとして特徴づけられる。それらの変化は好ましくは、
保存性アミノ酸置換（表２を参照のこと）及びタンパク質又はポリペプチドの折
りたたみ又は活性に対して実質的に影響を与えない他の置換であるマイナーな性
質のもの；典型的には、１〜約30個の少数のアミノ酸の欠失；及び短いアミノ−
又はカルボキシル−末端延長、例えば、アミノ酸−末端メチオニン残基、約20〜
25個までの残基の小さなリンカーペプチドの延長、又は精製を促進する小さな延
長（親和性標識）、例えばポリ−ヒスチジン路、プロテインAの延長である（Nil
sson など., EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson など., Methods Enzymol. 198:
3, 1991）。

【００４８】一般的には、Fordなど., Protein Expression and Purification 2: 95-107,
1991 (引用により本明細書に組込まれる)を参照のこと。親和性標識をコードす
るDNAは、商業的供給者（例えば、Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ; New En
gland Biolabs, Beverly, MA）から入手できる。しかしながら、上記変更が好ましくは，マイナーな性質のものであったとして
も、そのような変更はまた、大きな性質のもの、例えば、本発明のマンナナーゼ
ポリペプチドへの、300個までのアミノ酸の大きなポリペプチドの融合、又は両
アミノ−又はカルボキシル−末端延長としての融合でもあり得る。

【００４９】

【表１】

【００５０】 20個の標準のアミノ酸の他に、非標準のアミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプ
ロリン、６−N−メチルリシン、２−アミノイソ酪酸、イソバリン及びα−メチ
ルセリン）は、本発明のポリペプチドのアミノ酸残基により置換され得る。制限
された数の非保存性アミノ酸、遺伝子コードによりコードされないアミノ酸、及
び不自然なアミノ酸が、アミノ酸残基により置換され得る。“不自然なアミノ酸
”は、タンパク質合成の後、修飾され、そして/又は標準のアミノ酸の側鎖とは
異なるそれらの側鎖に化学的構造を有する。不自然なアミノ酸は、化学的に合成
され得、又は好ましくは、市販されており、そしてピペコリン酸、チアゾリジン
カルボン酸、デヒドロプロリン、３−及び４−メチルプロリン及び３,３−ジメ
チルプロリンを包含する。

【００５１】本発明のマンナナーゼポリペプチドにおける必須アミノ酸は、当業界において
知られている方法、例えば特定部位の突然変異誘発、又はアラニン−走査突然変
異誘発に従って同定され得る（Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085
, 1989）。後者の技法においては、単一のアラニンの突然変異が分子におけるあ
らゆる残基に導入され、そして得られる変異体分子は、分子の活性に対して決定
的であるアミノ酸残基を同定するために、生物学的活性（すなわち、マンナナー
ゼ活性）について試験される。また、Hilton など., J. Biol. Chem. 271: 4699
-4708, 1996を参照のこと。

【００５２】酵素又は他の生物学的相互作用の活性部位はまた、推定上の接触部位アミノ酸
の突然変異に関して、核磁気共鳴、結晶学、電子回折、又は光親和性ラベリング
のような技法により決定されるように、構造の物理的分析によっても決定され得
る。例えば、de Vos など., Science 255: 306-312, 1992; Smith など., J. Mo
l. Biol. 224: 899-904, 1992; Wlodaver など., FEBS Lett. 309: 59-64, 1992
を参照のこと。必須アミノ酸の本体はまた、本発明のポリペプチドに関連するポ
リペプチドとの相同性の分析からも推定され得る。

【００５３】複数のアミノ酸置換は、突然変異誘発、組換え及び/又はシャフリング、続く
適切なスクリーニング方法、例えばReidhaar-Olson and Sauer (Science 241: 5
3-57, 1988), Bowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156,
1989), WO95/17413号又はWO95/22625号により開示される既知の方法を用いて、
生成され、そして試験され得る。

【００５４】手短に言及すれば、それらの著者は、ポリペプチドにおける複数位置の同時ラ
ンダム化、又は組換え/異なった突然変異のシャフリング（WO95/17413号、WO95/
22625号）、続いての機能的ポリペプチドについての選択、及び次に、個々の位
置での可能な置換の範囲を決定するために、突然変異誘発されたポリペプチドの
配列決定のための方法を開示する。使用され得る他の方法は、ファージ表示（例
えば、Lowman など., Biochem. 30: 10832-10837, 1991; Ladner など., アメリ
カ特許第5,223,409号；Huse, WIPO Publication WO92/06204号）及び特定領域の
突然変異誘発（Derbyshire など., Gene 46: 145, 1986; Ner など., DNA 7: 12
7, 1988）を包含する。

【００５５】上記に開示されるような突然変異誘発/シャフリング方法は、宿主細胞におい
てクローン化され、突然変異誘発されたポリペプチドの活性を検出するために、
高い処理量の自動化されたスクリーニング方法と組み合わされ得る。活性ポリペ
プチドをコードする突然変異誘発されたDNA分子は、宿主細胞から回収され、そ
して近代装置を用いて急速に配列決定され得る。それらの方法は、興味あるポリ
ペプチドにおける重要な個々のアミノ酸残基の急速な決定を可能にし、そして未
知の構造体のポリペプチドに適用され得る。上記で論じられた方法を用いて、当業者は、配列番号２の残基１〜336に対し
て実質的に相同であり、そして野生型タンパク質のマンナナーゼ活性を保持する
種々のポリペプチドを同定し、そして/又は調製することができる。

【００５６】本発明のマンナナーゼ酵素は、触媒的活性ドメインを含んで成る酵素コアの他
に、また、セルロース結合ドメイン（CBD）を含んで成り、前記酵素のセルロー
ス結合ドメイン及び酵素コア（触媒的活性ドメイン）は作用可能に連結される。
そのセルロース結合ドメイン（CBD）はコードされた酵素の内部部分として存在
することができ、又は他の起源からのCBDはマンナン分解酵素中に導入され、従
って酵素ハイブリッドを創造する。

【００５７】この場合、用語“セルロース−結合ドメイン”とは、Peter Tommeなど.,“Cel
lulose-Binding Domains: Classification and Properties” in “Enzymatic D
egradation of Insoluble Carbohydrates”, John N, Saddler and Michael H.
Penner (Eds.), ACS Symposium Series, No.618, 1996により定義されるとおり
であるものとして理解されるべきである。この定義は、120よりも多くのセルロ
ース−結合ドメインを10種のファミリー（I−X）に分類し、そしてCBDが種々の
酵素、例えばセルラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、アラビノフラノシダー
ゼ、アセチルエステラーゼ及びキチナーゼに見出されることを示す。

【００５８】 DBDはまた、藻類、例えば赤藻類ポルフィラ・パーピュレア（Porphyra purpur
ea）において、非加水分解性多糖−結合タンパク質として見出されている（Tomm
eなど.,前記を参照のこと）。しかしながら、CBDのほとんどは、セルラーゼ及び
キシラナーゼであり、CBDはタンパク質のN及びC末端で見出され、又は内部に存
在する。酵素ハイブリッドは当業界において知られており（例えば、WO90/00609
号及びWO95/16782号を参照のこと）、そしてマンナン分解酵素をコードするDNA
配列に、リンカーを伴って又は伴わないで、連結されるセルロース−結合ドメイ
ンをコードするDNAのフラグメントを少なくとも含んで成るDNA構造体を用いて、
宿主細胞を形質転換し、そして融合された遺伝子を発現するために宿主細胞を増
殖することによって調製され得る。

【００５９】酵素ハイブリッドは、次の式： CBD−MR−X により記載され、ここで前記CBDは少なくともセルロース−結合ドメインに対応
するアミノ酸配列のN−末端又はC−末端領域であり；MRは中間領域（リンカー）
であり、そして結合、又は好ましくは、約２〜約100個の炭素原子、より好まし
くは２〜40個の炭素原子の短い結合基であり得；又は好ましくは約２〜約100個
のアミノ酸、より好ましくは２〜40個のアミノ酸であり得；そしてXは本発明の
マンナナーゼ分解酵素のN−末端又はC−末端の領域である。

【００６０】好ましくは、本発明のマンナナーゼ酵素は、５〜７のpHでその最大の触媒活性
を有し；そして好ましくは、酵素の最大活性は、少なくとも30℃、より好ましく
は少なくとも40℃の温度で得られる。タンパク質生成：十分な長さのタンパク質、そのフラグメント及び融合タンパク質を包含する本
発明のタンパク質及びポリペプチドは、従来の技法に従って、遺伝子的に構築さ
れた宿主細胞において生成され得る。適切な宿主細胞は、外因性DNAにより形質
転換され、又はトランスフェクトされ、そして培養において増殖され得るそれら
の細胞型であり、そして細菌、菌類細胞、及び培養された高等真核細胞を包含す
る。細菌細胞、特に、グラム−陽性生物の培養された細胞が好ましい。

【００６１】バチルス属からの次のグラム−陽性細胞が特に好ましい：バチルス・スブチリ
ス（Bacillus subtilis）、バチルス・レンタス（Bacillus lenntus）、バチル
ス・クラウジ（Bacillus clausii）、バチルス・アガラドハエレンス（Bacillus
agaradhaerens）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・ステ
アロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・アルカロフ
ィラス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bac
illus amyloliquefaciens）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）
、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・ラウタス（Ba
cillus lautus）、バチルス・スリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）、
バチルス・リケニホルミス、特にバチルス・サブチリス。

【００６２】クローン化された分子を操作し、そして種々の宿主細胞中に外因性DNAを導入
するための技法は、次の文献に開示されている：Sambrook など., Molecular Cl
oning: A Laboratory Manual, 2^nd ed., Cold spring Harbor Laboratory Press
, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausubel など. (eds.), Current Protocols
in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987; 及びBacillus
subtilis and Other Gram-Positive Bacteria, Sonensheim など., 1993, Ameri
can Society for Microbiology, Washington D.C. (それらは引用により本明細
書中に組込まれる)。

【００６３】一般的に、本発明のマンナナーゼをコードするDNA配列は、一般的に発現プロ
モーター内に転写プロモーター及びターミネーターを含む、その発現のために必
要とされる他の遺伝子要素に操作可能的に連結される。前記ベクターはまた、通
常、１又は複数の選択マーカー及び１又は複数の複製の起点を含むが、但し当業
者は、一定のシステム内において、選択マーカーが別々のベクター上に供給され
得、そして外因性DNAの複製が宿主ゲノムへの組み込みにより提供され得ること
を認識するであろう。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクター
及び他の要素の選択は、当業者のレベル内の通常のことである。多くのそのよう
な要素は、文献に記載されており、そして商業的供給者から入手できる。

【００６４】宿主細胞の分泌経路中にポリペプチドを向けるためには、分泌シグナル配列（
リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られている）が、発現ベク
ターに提供される。分泌シグナル配列はポリペプチドの配列であり得、又は他の
分泌されたタンパク質に起因し、又は新たに合成され得る。多くの適切な分泌シ
グナル配列が当業界において知られており、そして特に、バチルス宿主細胞にお
ける分泌のための適切な分泌シグナル配列のさらなる記載については、次の文献
を参照のこと：Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria, Sonens
heim など., 1993, American Society for Microbiology, Washington D.C.;及
びCutting, S. M. (eds.) "Molecular Biological Methods for Bacillus", Joh
n Wiley and Sons, 1990。

【００６５】分泌シグナル配列は、DNA配列に正しく読み取り枠を整合して連結される。分
泌シグナル配列は、通常、興味あるポリペプチドをコードするDNA配列の５'側に
位置し、但しあるシグナル配列は興味のDNA配列の他の場所に位置することがで
きる（例えば、Welch など., アメリカ特許第5,037,743号；Holland など., ア
メリカ特許第5,143,830号を参照のこと）。

【００６６】形質転換された又はトランスフェクトされた宿主細胞は、栄養物、及び選択さ
れた宿主細胞の増殖のために必要とされる他の成分を含む培養培地において、従
来の方法に従って培養される。定義された培地及び複合培地を包含する種々の適
切な培地が、当業界において知られており、そして一般には、炭素源、窒素源、
必須アミノ酸、ビタミン及び鉱物を含む。培地はまた、必要な場合、成長因子の
ような成分を含むことができる。薬物選択、又は発現ベクター上に担持され、又
は宿主細胞中に同時にトランスフェクトされる選択マーカーにより補充される必
須栄養物における栄養不足により、増殖培地は、外因的に付加されたDNAを含む
細胞を選択するであろう。

【００６７】タンパク質単離：発現された組換えポリペプチドが分泌される場合、そのポリペプチドは増殖培
地から精製され得る。好ましくは、発現宿主細胞は、ポリペプチドの精製の前、
培地から除かれる（例えば、遠心分離による）。発現された組換えポリペプチドが宿主細胞から分泌されない場合、宿主細胞は
好ましくは、破壊され、そしてポリペプチドは、そのような精製技法の第１段階
である水性“抽出物”中に開放される。好ましくは、発現宿主細胞は、細胞破壊
の前、培地から除去される（例えば遠心分離による）。

【００６８】細胞破壊は、従来の技法、例えばリゾチーム消化により、又は細胞に高圧力を
付与することにより行われ得る。そのような細胞破壊技法のさらなる説明のため
には、Robert K. Scobes, Protein Purification, Second edition, Springer-V
erlagを参照のこと。発現された組換えポリペプチド（又はキメラポリペプチド）が分泌されても又
はされなくても、それは、分別及び/又は従来の精製方法を用いて、精製され得
る。

【００６９】硫酸アンモニウム沈殿及び酸又はカオトロープ抽出が、サンプルの分別のため
に使用され得る。典型的な精製段階は、ヒドロキシアパタイト、サイズ排除、FP
LC及び逆相高性能液体クロマトグラフィーを包含する。適切なアニオン交換媒体
は、誘導体化されたデキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミ
ド、特殊シリカ及び同様のものを含む。PEI, DEAE, QAE及びQ誘導体が好ましく
、そしてDEA Fast-Flow セファロース（Pharmacia, Piscataway, NJ）が特に好
ましい。

【００７０】典型的なクロマトグラフィー媒体は、フェニル、ブチル、又はオクチル基によ
り誘導体化されたそれらの媒体、例えばフェニル−セファロース FF（Pharmaci
a）、Toyopearlブチル650（Toso Haas, Montgomeryville, PA）、オクチル−セ
ファロース（Pharmacia）及び同様のもの；又はポリアクリル酸樹脂、例えばAmb
erchrom CG71 (Toso Haas)及び同様のものを包含する。適切な固体支持体は、ガ
ラスビーズ、シリカ基材のビーズ樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架
橋されたアガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋されたポリアクリルアミ
ド樹脂、及びそれらが使用される条件下で不溶性である同様のものを包含する。

【００７１】それらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキ
シル基及び/又は炭水化物成分によるタンパク質の結合を可能にする反応性基に
より変性され得。カップリング化学の例は、臭化シアン活性化、N−ヒドロキシ
スクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド
活性化、及びカルボジイミドカップリング化学のためのカルボキシル及びアミノ
誘導体を包含する。それらの及び他の固体媒体が、良く知られており、そして当
業界において広く使用されており、そして商業的供給者から入手できる。

【００７２】特定方法の選択は、日常のことであり、そして選択された支持体の性質により
一部決定される。例えば、Affinity Chromatography: Principles & Methods, P
harmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988を参照のこと。本発明のポリペプチド又はそのフラグメントはまた、化学合成を通して調製さ
れ得る。本発明のポリペプチドは、モノマー又はマルチマーであり；グリコシル
化され又は非グリコシル化され得；ペギル化され（pegylated）又は非ペギル化
され得；そして最初のメチオニンアミノ酸残基を含んでも又は含まなくても良い
。本明細書に開示される配列情報に基づけば、本発明のマンナナーゼをコードし
、そして配列番号１に示されるDNA配列含んで成る十分な長さのDNA配列がクロー
ン化され得る。

【００７３】クローニングは、当業界において知られている標準の方法により、例えば、 −バチルス株、特にバチルス・サブチリス168株を調製し； −そのようなライブラリーを、適切な基質プレート上にプレートし； −配列番号1に基づいてのプローブを用いて、標準のハイブリダイゼーション
技法により、本発明のポリヌクレオチド配列を含んで成るクローンを同定し；又
は −配列番号1からの配列情報に基づいてのプライマーを用いて、逆PCR法により
、前記バチルス・サブチリス168のゲノムライブラリーからクローンを同定する
ことによって行われる。逆PCRに関する追加の詳細は、M.J. MCPherson など：（
“PCR A Practical Appraach" Information Press,Ltd, Oxford England) に言
及される。

【００７４】本明細書に開示される配列情報（配列番号1及び 2）に基づいて、本発明の相
同マンナナーゼをコードする相同ポリヌクレオチド配列を、関連する微生物、特
にバチルス属の他の株、例えばバチルスの好アルカリ種からのゲノムライブラリ
ーを用いて、類似する方法により単離することは、当業者のための日常の作業で
ある。

【００７５】本明細書において、用語“酵素調製物”とは、微生物の単一種から、たぶん単
離され、そして精製された従来の酵素発酵生成物（そのような調製物は通常、多
くの異なった酵素活性を含んで成る）；又は単一成分酵素、好ましくは細菌又は
菌類種から従来の組換え技法を用いることによって誘導された酵素の混合物（前
記酵素は、発酵され、そしてたぶん単離され、そして別々に精製されており、そ
して異なった種、好ましくは菌類又は細菌種に起因する）；又は組換えマンナナ
ーゼ酵素の発現のための宿主細胞として作用するが、しかし他の酵素、例えばペ
クチン分解酵素、プロテアーゼ又はセルラーゼを同時に生成する微生物の発酵生
成物（微生物の天然に存在する発酵生成物、すなわちその対応する天然に存在す
る微生物により従来通りに生成される酵素複合体である）のいずれかを意味する
。

【００７６】本発明のマンナナーゼ調製物はさらに、下記から成る群から選択された１又は
複数の酵素を含んで成る：プロテアーゼ、セルラーゼ（エンド−β−１,４−グ
ルカナーゼ）、β−グルカナーゼ（エンド−β−１,３（４）−グルカナーゼ）
、リパーゼ、クチナーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、グルコ
アミラーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダ
ーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、ヘミセルラーゼ、キシログルナナ−ゼ、キ
シラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、

【００７７】ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノ
ガラクツロナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンリアーゼ、ペクチンメチルエ
ステラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、トランスグルタミナーゼ又はそれらの混合
物。好ましい態様においては、調製物中の1又は複数の、又はすべての酵素は、
組換え技法を用いて生成され、すなわち酵素は所望する酵素ブレンドにより酵素
調製物を形成するために、他の酵素と共に混合される単一成分酵素である。

【００７８】さらなる観点においては、本発明はまた、本発明の酵素調製物を生成するため
の方法にも関し、ここで前記方法は、マンナナーゼを生成することができる微生
物，例えば野生型株を前記酵素の生成を可能にする条件下で培養し、そして培養
物から酵素を回収することを含んで成る。培養は、従来の発酵技法、例えばマン
ナナーゼ酵素の生成を誘発する増殖培地を十分に確保するために撹拌しながら、
振盪フラスコ又は発酵器においての培養を用いて実施され得る。

【００７９】増殖培地は、従来のN−源、例えばペプトン、酵母抽出物又はカザミノ酸、低
められた量の従来のC−源、例えばデキストロース又はスクロース、及びインデ
ューサー、例えばグアーガム又はイナゴマメガムを含むことができる。回収は、
従来の技法、例えばバイオマス及び上清液の遠心分離又は濾過による分離、上清
液の回収、又は興味ある酵素が細胞内に存在する場合、細胞の破壊、たぶん続い
て、ヨーロッパ特許第0406314号に記載されるようなさらなる精製、又はWO97/15
660号に記載のような結晶化により実施され得る。

【００８０】本発明の酵素又は酵素調製物を生成する有用な細菌の例は、好ましくはバチル
ス/ラクトバチルス細分からのグラム−陽性細菌、好ましくはバチルス・サブチ
リスの株、特にバチルス・サブチリス168の株である。さらにもう1つの観点においては、本発明は、上記に記載される性質を有し、
そして相同不純物を有さず、そして従来の組換え技法を用いて生成される、単離
されたマンナナーゼに関する。

【００８１】免疫学的交差反応性：免疫学的交差反応性の決定に使用されるべきポリクローナル抗体は、精製され
たマンナナーゼ酵素の使用により調製され得る。より特定には、本発明のマンナ
ナーゼに対する抗血清が、N. Axelsen など., A Manual of Quantitative Immun
oelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Chapter 23,
又はA. Johnstone and R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell S
cientific Publications, 1982 (より詳しくは、p.27-31) に記載される方法に
従って、ウサギ（又は他のゲッ歯動物）を免疫化することによって生ぜしめられ
得る。

【００８２】精製された免疫グロブリンは、例えば塩沈殿（(NH₄)₂ SO₄）、続いて透析、及
びDEAE−Sephadex上でのイオン交換クロマトグラフィーにより、抗血清から得ら
れる。タンパク質の免疫化学特徴化が、Outcherlony 二重拡散分析（O. Ouchter
lony, Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir, Ed.), Blackwell S
cientific Publication, 1967, pp.655-706）、架橋された免疫電気泳動（N. Ax
elsen など., 前記, Chapters 3and 4)、又はロケット免疫電気泳動（N. Axelse
n など., Chapter 2）のいずれかにより行われ得る。

【００８３】洗剤産業への使用：さらなる観点においては、本発明は、本発明のマンナナーゼ又はマンナナーゼ
調製物を含んで成る洗剤組成物、本発明のマンナナーゼ又はマンナナーゼ調製物
を含む洗浄溶液により、機械洗浄の洗浄サイクルの間、布を処理することを含ん
で成る、布の機械処理のための方法、及び卓越した清浄性能、すなわち卓越した
しみの除去性能、黒ずんだ物の清浄及び白色度の維持を提供する、本発明のマン
ナナーゼ及び任意には、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、ペ
クチン分解酵素及びキシログルカナーゼから選択されたもう１つの酵素を含んで
成る清浄組成物、例えば洗濯、皿洗い、硬質表面クリーナー、個人用洗浄及び経
口/歯用組成物に関する。

【００８４】論理的ではないが、本発明のマンナナ−ゼは、ガラクトマンナンを含む土壌又
はしみを効果的に分解し、又は加水分解することができ、そして従って、そのよ
うな土壌又はしみを含んで成る洗濯物を清浄することができると思われる。本発明の清浄組成物は、少なくとも１つの追加の洗剤成分を含むべきである。
それらの追加の成分の正確な性質、及びその導入のレベルは、組成物の物理形、
及びそれが使用される洗浄操作の性質に依存するであろう。

【００８５】本発明の清浄組成物は好ましくは、選択された界面活性剤、他の酵素ビルダー
及び/又は漂白系から選択された洗浄成分をさらに含んで成る。本発明の清浄組成物は、液体、ペースト、ゲル、棒状、錠剤、スプレー、発泡
体、粉末又は粒質物であり得る。粒状組成物はまた、“圧縮”形でも存在するこ
とができ、そして液体組成物はまた、“濃縮された”形でも存在することができ
る。

【００８６】本発明の組成物は、手動及び機械皿洗い組成物、手動及び機械洗濯洗剤組成物
、例えば洗濯用添加剤組成物、及び染色された布のソーキング及び/又は前処理
への使用のために適切な組成物、添加されるすすぎ用布軟化剤組成物、及び一般
的な家庭用硬質表面洗浄操作への使用のための組成物として配合され得る。その
ようなカルボヒドラーゼを含む組成物はまた、衛生用製品、コンタクトレンズ清
浄剤、及び健康及び美容ケアー製品、例えば経口/歯用ケアー及び身辺用洗浄組
成物としても配合され得る。

【００８７】手動皿洗い方法のための組成物として配合される場合、本発明の組成物は、好
ましくは、界面活性剤、及び好ましくは、有機ポリマー化合物、石鹸水増強剤、
第II族金属イオン、溶媒、ヒドロトロープ及び追加の酵素から選択された他の洗
剤化合物を含む。

【００８８】洗濯機洗浄方法への使用のために適切な組成物として配合される場合、本発明
の組成物は好ましくは、界面活性剤及びビルダー化合物の両者、及びさらに、好
ましくは、有機ポリマー化合物、漂白剤、追加の酵素、石鹸水の泡抑制剤、分散
剤、石灰石鹸分散剤、土壌懸濁及び抗−再沈殿剤、及び腐食防止剤から選択され
た１又は複数の洗剤成分を含む。洗濯組成物はまた、追加の洗剤成分として軟化
剤も含むことができる。カルボヒドラーゼを含むそのような組成物は、洗濯洗剤
組成物として配合される場合、布の清浄、しみの除去、白色度の維持、軟化、発
色、染料移行の阻害、及び消毒を提供することができる。

【００８９】本発明の組成物はまた、固体又は液体形で、洗剤添加剤製品としても使用され
得る。そのような添加剤製品は、従来の洗剤組成物の性能を補充し、又は高める
ことが意図され、そして清浄工程のいずれの段階ででも添加され得る。必要とされる場合、洗濯洗剤組成物の密度は、20℃で測定される組成物１ｌ当
たり400〜1200g、好ましくは500〜950gの範囲である。

【００９０】本明細書における組成物の“圧縮”形は、密度により、及び組成物に関しては
、無機充填剤塩の量により最良に影響され；無機充填剤塩は、粉末形での洗剤組
成物の従来の成分であり；従来の洗剤組成物においては、充填剤塩は、実質的な
量で、典型的には、合計組成物の17〜35重量％で存在する。圧縮組成物において
は、充填剤塩は、合計組成物の15重量％を越えない量で、好ましくは10重量％を
越えない量で、最も好ましくは５重量％を越えない量で存在する。無機充填剤塩
は、本発明の組成物に存在する場合、アルカリ及びアルカリ土類金属の硫酸塩及
び塩化物塩から選択される。好ましい充填剤塩は、硫酸ナトリウムである。

【００９１】本発明の液体洗剤組成物は、“濃縮された形”でも存在することができ、その
ような場合、本発明の液体組成物は、従来の液体洗剤に比較して、低量の水を含
むであろう。典型的には、濃縮された液体洗剤中の水含有率は、洗剤組成物中、
40重量％以下、より好ましくは30重量％以下、最も好ましくは20重量％以下であ
る。本発明において使用するための適切な特定の洗剤化合物は、引用により本明細
書に組み込まれるWO 97/01629 に記載されるような特定の化合物から成る群から
選択される。

【００９２】マンナナ−ゼは、本発明の洗浄又は洗剤組成物中に、好ましくは、0.0001〜２
重量％、より好ましくは0.0005〜0.5重量％、最も好ましくは0.001〜0.1重量％
のレベルで、純粋な酵素形で導入され得る。本発明の清浄組成物はさらに、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、アミラ
ーゼ、ペクチン分解酵素及びキシログルカナーゼから成る群から選択された第２
酵素を必須要素として含むことができる。好ましくは、本発明の清浄組成物は、
マンナナーゼ、アミラーゼ、及び、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ペク
チン分解酵素及びキシログルカナーゼから成る群から選択された第３酵素を含む
であろう。

【００９３】本発明において使用できるセルラーゼは、細菌又は菌類セルラーゼを含む。好
ましくは、それらは、５〜12のpH最適値及び50CEVU/mg（セルラーゼ粘度単位）
以上の比活性を有するであろう。適切なセルラーゼは、アメリカ特許第4,435,30
7号、J61078384号及びWO96/02653号に開示されており、それらの特許はそれぞれ
、ヒューミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、トリコダーマ（Trichod
erma）、チエラビア（Thielavia）及びスポロトリカム（Sporotrichum）から生
成される菌類セルラーゼを開示する。EP739982号は、新規バチルス種から単離さ
れたセルラーゼを記載する。適切なセルラーゼはまた、GB−A−2075028号；GB−
A−2095275号；DE−OS−2247832号及びWO95/26398号にも開示される。

【００９４】そのようなセルラーゼの例は、ヒューミコラ・インソレンスの株（Humicola g
risea var. thermgidea）、特に株ヒューミコラ・インソレンスDSM1800により生
成されるセルラーゼである。他の適切なセルラーゼは、約50kDの分子量、5.5の
等電点を有し、そして415個のアミノ酸を含むヒューミコラ・インソレンス起源
のセルラーゼ；及びヒューミコラ・インソレンス、DSM1800に由来する約43kDの
エンド−β−１,４−グルカナーゼであり；好ましいセルラーゼはPCT特許出願WO
91/17243号に開示されるアミノ酸配列を有する。

【００９５】また、適切なセルラーゼは、WO94/21801号に記載されるトリコダーマ・ロンギ
ブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）からのBGIIIセルラーゼである。
特に適切なセルラーゼは、色彩保護利点を有するセルラーゼである。そのような
セルラーゼの例は、WO96/29397号、EP−A−0495257号、WO91/17243号、WO91/172
44号及びWO91/21801号に記載されるセルラーゼである。布の保護及び/又は洗浄
性質についての他の適切なセルラーゼは、WO96/34092号、WO96/17994号及びWO95
/24471号に記載される。

【００９６】前記セルラーゼは通常、洗剤組成物の0.0001〜２重量％の純粋な酵素のレベル
で洗剤組成物に導入される。本発明のための好ましいセルラーゼは、アルカリセルラーゼ、すなわち７〜12
の範囲のpHで、それらの最大活性の少なくとも25％、より好ましくは少なくとも
40％の活性を有する酵素である。より好ましいセルラーゼは、７〜12の範囲のpH
で、それらの最大活性を有する酵素である。好ましいアルカリセルラーゼは、商
標Carezyme（商標）としてNovo Nordisk A/Sから市販されるセルラーゼである。

【００９７】アミラーゼ（α及び/又はβ）は、炭水化物基材のしみの除去のために含まれ
得る。1994年２月３日に公開されたWO94/02597号、Novo Nordisk A/Dは、変異体
アミラーゼを組込む清浄組成物を記載する。また、1995年４月20日に公開された
WO95/10630号、Novo Nordisk A/Sも参照のこと。清浄組成物への使用のための既
知の他のアミラーゼは、α−及びβ−アミラーゼの両者を包含する。α−アミラ
ーゼは当業界において知られており、そして次の特許に開示されるものを包含す
る：アメリカ特許第5,003,257号；EP252,666号；WO91/00353号；FR2,676,456号
；EP285,123号；EP525,610号；EP368,341号；及びイギリス特許出願第1,296,839
号（Novo）。

【００９８】他の適切なアミラーゼは、1994年８月１８日に公開されたWO94/18314号及び19
94年２月22日に公開されたWO96/05295（Genencor）に記載される安定性−増強さ
れたアミラーゼ、及び1995年４月に公開されたWO95/10603号に公開される、Novo
Nordisk A/Sから入手できる特許における、追加の修飾を有するアミラーゼ変異
体である。また適切なアミラーゼは、EP277216号及びWO96/23873号（すべては、
Novo Nordisk による）に記載される。

【００９９】市販のα−アミラーゼ生成物の例は、GenencorからのPurafect OX AM（商標）
，及びTermamyl（商標），Ban（商標），Fuugamyl（商標），及びDuramyl（商標
）（すべては、Novo Nordisk A/S Denmark から入手できる）である。WO95/2639
7号は、他の適切なアミラーゼ、すなわちPhadebas（商標）α−アミラーゼ活性
アッセイにより測定される場合、25℃〜55℃の温度範囲、及び８〜10の範囲のpH
値で、Termamyl（商標）の比活性よりも少なくとも25％高い比活性を有すること
によって特徴づけられるα−アミラーゼを記載する。WO96/23873号（Novo Nordi
sk）に記載される上記酵素の変異体が適切である。活性レベルに関して、改良さ
れた性質、及び熱安定性及びより高い活性レベルの組み合わせを有するほかのデ
ンプン分解酵素が、WO95/35382号に記載される。

【０１００】本発明のための好ましいアミラーゼは、商標Termamyl, Duramyl 及びMaxamyl
として市販さえているアミラーゼ、及び/又はWO96/23873号において配列番号２
として開示される、高められた熱安定性を示すα−アミラーゼ変異体である。特定の用途のための好ましいアミラーゼは、アルカリアミラーゼ、すなわち７
〜12の範囲のpHで、それらの最大活性の少なくとも10％、好ましくは少なくとも
25％、より好ましくは少なくとも40％の酵素活性を有する酸素である。より好ま
しいアミラーゼは、７〜12に範囲のpHでそれらの最大活性を有する酵素である。

【０１０１】デンプン分解酵素は、組成物の0.0001〜２重量％、好ましくは0.00018〜0.06
重量％、より好ましくは0.00024〜0.048重量％の純粋の酵素レベルで、本発明の
洗剤組成物に組込まれる。

【０１０２】用語“ペクチン分解酵素”とは、次のものを包含することが意図される：ポリ
ガラクツロナーゼ（EC 3.2.1.15）、エキソ−ポリガラクツロナーゼ（EC 3.2.1.
67）、エキソ−ポリ−α−ガラクツロニダーゼ（EC 3.2.1.82）、ペクチンリア
ーゼ（EC 4.2.2.10）、ペクチンエステラーゼ（EC 3.2.1.11）、ペクチン酸リア
ーゼ（EC 4.2.2.2）、エキソ−ポリガラクツロナーゼリアーゼ（EC 4.2.2.9）及
びヘミセルラーゼ、例えばエンド−１,３−β−キシロシダーゼ（EC 3.2.1.32）
、アラビナナーゼ（EC 3.2.1.99）、ガラクタナーゼ（EC 3.2.1.89）、キシラン
−１，４−β−キシロシダーゼ（EC 3.2.1.37）及びα−L−アラビノフラノシダ
ーゼ（EC 3.2.1.55）。

【０１０３】ペクチン分解酵素は、上記酵素活性の天然の混合物である。従って、ペクチン
酵素は、ペクチンエチルエステル結合を加水分解するペクチンメチルエステラー
ゼ、ガラクツロン酸分子間グリコシド結合を分解するポリガラクツロナーゼ、及
びガラクツロン酸の不飽和誘導体を形成するためにα−１→４グリコシド結合の
非加水分解性切断をもたらすようペクチン酸に対して作用するペクチントランス
エリミナーゼ又はリアーゼを包含する。ペクチン分解酵素は、好ましくは合計組合物の0.0001〜２重量％、より好まし
くは0.0005〜0.5重量％、最も好ましくは0.001〜0.1重量％（純粋な酵素）のレ
ベルで、本発明に従って組成物中に導入される。

【０１０４】特定の用途のための好ましいペクチン分解酵素は、アルカリペクチン分解酵素
、すなわち７〜12のpHで、それらの最大活性の少なくとも10％、好ましくは少な
くとも25％、より好ましくは少なくとも40％の酵素活性を有する酵素である。よ
り好ましいペクチン分解酵素は、７〜12のpHでそれらの最大活性を有する酵素で
ある。アルカリペクチン分解酵素は、好アルカリ微生物、例えば細菌、菌類及び
酵素、例えばバチルス種により生成される。

【０１０５】好ましい微生物は、日本特許公開第56131376号及び第56068393号に記載される
ように、バチルス・ファーマス（Bacillus firmus）、バチルス・サーキュラン
ス（Bacillus circulans）及びバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）で
ある。アルカリペクチン分解酵素は、ガラクツラン−１，４−α−ガラクツロナ
ーゼ（EC 3.2.1.6.7）、ポリ−ガラクツロナーゼ活性（EC 3.2.1.15）、ペクチ
ンエステラーゼ（EC 3.1.1.11）、ペクチン酸リアーゼ（EC 4.2.2.2）及びそれ
らのイソ酵素を包含し、そしてそれらはエルウィニア（Erwinia）種により生成
され得る。

【０１０６】日本特許公開第59066588号、日本特許公開第63042988号、及びWorld J. Micro
biol. Microbiotechnol. (8, 2, 115-120) 1992に記載されるように、E.クリサ
ンテミ（E. chrysanthemi）、E.カロトボラ（E. carotovora）、E.アミロボラ（
E. amylovora）、E.ヘルビコラ（E. herbicola）、E.ジソルベンス（E. dissolv
ens）が好ましい。前記アルカリペクチン酵素はまた、日本特許公開第73006557
号及びAgr. Biol. Chem. (1972), 36 (2) 285-93に開示されるように、バチルス
種によって生成され得る。

【０１０７】用語キシログルカナーゼは、Vincken and Voragen at Wageningen University
[vincken など. (1994) Plant Physiol., 104, 99-107] により記載される酵素
ファミリーを包含し、そしてHayashiなど. (1989) Plant Physiol. Plant Mol.
Biol., 40, 139-168に記載されようなキシログルカンを分解できる。Vincken な
どは、トリコダーマ・ビリデ（Trichoderma viride）から精製されたキシログル
カナーゼ（エンド−IV−グルカナーゼ）による、単離されたリンゴ細胞壁のセル
ラーゼからのキシログルカン被膜の除去を示した。この酵素は、細胞壁−埋封さ
れたセルロースの酵素分解を増強し、そしてペクチン酵素と共同して作用する。
Gist−BrcadesからのRapidase LIQ＋は、キシログルカナーゼ活性を含む。

【０１０８】このキシログルカナーゼは、好ましくは、組成物の0.0001〜２重量％、より好
ましくは0.0005〜0.5重量％、最も好ましくは0.001〜0.1重量％の純粋な酵素レ
ベルで、本発明の清浄組成物中に導入される。特定用途のための好ましいキシログルカナーゼは、アルカリキシログルカナー
ゼ、すなわち７〜12の範囲のpHで、それらの最大活性の少なくとも10％、好まし
くは少なくとも25％、より好ましくは40％の酵素活性を有する酵素である。より
好ましいキシログルカナーゼは、７〜12の範囲のpHで、それらの最大活性を有す
る酵素である。

【０１０９】上記酵素は、いずれか適切な起源のもの、例えば植物、動物、細菌、菌類及び
酵母起源のものであり得る。起源はさらに、中温性又は高温性（extremphilic）
（好冷性、向冷性、好熱性、好圧性、好アルカリ、好酸性、好ハロゲン性、等）
であり得る。それらの酵素の精製された又は精製されない形が使用され得る。現
在、本発明の清浄組成物において野生型酵素の性能効率を最適化するためにタン
パク質又は遺伝子工学技法を通してそれらの酵素を修飾することは、通常の実施
である。例えば、変異体は、そのような組成物中の通常遭遇する成分に対する酵
素の適合性が高められるように企画され得る。他方では、変異体は、酵素変異体
の最適pH、漂白剤又はキレート剤安定性、触媒活性及び同様のものが特定の清浄
用途に適合するよう調整され得る。

【０１１０】特に、漂白剤安定性の場合、酸化に対して敏感なアミノ酸に対して、及び表面
適合性のための表面の電荷に対して注意が払われるべきである。そのような酵素
の等電点はいくつかの荷電されたアミノ酸の置換により修飾され、例えば等電点
の上昇はアニオン性界面活性剤との適合性の改良を助けることができる。酵素の
安定性は、キレート剤安定性を高めるために、例えば追加の塩架橋及び強い金属
結合部位の創造によりさらに高められ得る。製紙用パルプ産業への使用：

【０１１１】さらに、本発明のマンナナーゼは、製紙用パルプの白色度を高めるために、そ
のパルプ（化学パルプ、半化学パルプ、機械パルプ又はクラフトパルプ）のため
に塩素を含まない漂白工程において有用であり、従って、漂白工程における過酸
化水素の必要性を低めるか又は排除する。紡織及びセルロース繊維加工産業への使用：本発明のマンナナーゼは、繊維の調製のためには、又は繊維の清浄のためには
、洗剤と組合して、他の炭水化物分解酵素（例えば、キシログルカナーゼ、キシ
ラナーゼ、種々のマンナナーゼ）と組合して使用され得る。

【０１１２】本明細書においては、用語“セルロース材料”とは、繊維、縫われ及び縫われ
ていない布、例えば編物、織物、デニム、糸及びタオル（綿から製造される）、
綿ブレンド、又は天然又は人工的セルロース系誘導物（例えば、キシラン−含有
セルロース繊維、例えば木材パルプに起因する）、又はそれらのブレンドを意味
する。ブレンドの例は、綿又はレーヨン/ビスコースと１又は複数の類似する材
料、例えば毛、合成繊維（例えば、ポリアミド繊維、アクリル繊維、ポリエステ
ル繊維、ポリビニルアルコール繊維、ポリ塩化ビニル繊維、ポリ塩化ビニリデン
繊維、ポリウレタン繊維、ポリウレア繊維、アラミド繊維）、及びセルロース含
有繊維（例えば、レーヨン/ビスコース、ラミー、大麻、亜麻/リネン、ジュート
、酢酸セルロース繊維、ライオセル（lyocell））のブレンドである。

【０１１３】綿繊維に関して、紡織産業のためのセルロース材料の被服製造のために容易な
材料への加工は、次のいくつかの段階を包含する：繊維の糸への紡糸；糸からの
織物又は編物の構成、及び続く調製、染色及び最終操作。織物製品は、一連の縦
糸間に横糸を織り込むことによって構成され；糸は２種の異なったタイプのもの
である。

【０１１４】糊抜き：例えばマンナン、スターチ、CMC又はPVAのようなポリマー糊剤は、整
経速度を早めるために、整経の前に添加される。この材料は、さらなる加工の前
に除去されるべきである。本発明の酵素は、マンナン含有糊剤の除去のために有
用である。

【０１１５】増粘剤の分解：ガラクトマンナン、例えばグァーガム及びイナゴマメガムは、食品、及び捺染
、例えば、T−シャツ上へのプリントのためのプリント用ペーストにおいて増粘
剤として広く使用される。本発明の酵素又は酵素調製物は、加工装置における残
留食品の粘土を低めるために使用され得、そしてそれにより、加工の後の洗浄を
促進する。さらに、本発明の酵素又は酵素調製物は、プリント用ペーストの粘土
を低めるために有用であり、それにより捺染の後、表面のプリント用ペーストの
洗浄を促進する。

【０１１６】植物材料の分解又は変性：本発明の酵素又は酵素調製物は、好ましくは、植物に起因するマンナン、ガラ
クトマンナン、グルコマンナン又はガラクトグルコマンナン含有材料の分解又は
変性のための剤として使用される。そのような材料の例は、グアーガム及びイナ
ゴマメガムである。本発明のマンナナーゼは、植物由来の材料の物理−化学性質、例えば粘土の調
節に使用され得る。例えば、マンナナーゼは、マンナンを含む飼料又は食品の粘
度を低くするために、及び粘性マンナン含有材料の加工を促進するために使用さ
れ得る。

【０１１７】コーヒー抽出：本発明の酵素又は酵素調製物はまた、液体コーヒー抽出物に存在するガラクト
マンナンを加水分解するために、好ましくはコーヒー（インスタントコーヒー）
の凍結乾燥の間、ゲル形成を阻害するためにも使用され得る。好ましくは、本発
明のマンナナーゼは、酵素消費を低め、そしてコーヒーの汚染を回避するために
固定される。この使用は、さらにEP-A-676145号に開示される。マンナナーゼの触媒活性（MauU）の決定：

【０１１８】比色アッセイ：基質：0.1Mのグリシン緩衝液（pH10.0）中、Carobからの0.2％AZCL−Galactom
annan（Megazyme, Ireland）。アッセイは、撹拌及び40℃の温度制御下でサーモミキサー上の1.5mlのEppendo
rf Micro 管において行われる。0.05mlの酵素と共に0.750mlの基質のインキュベ
ーション、15000rpmで４分間の遠心分離による停止。上清液の色彩が、1cmのキ
ュベットにおいて600nmで測定される。１ManU（マンナナーゼ単離）は、1cmで0.24の吸光度を付与する。

【０１１９】実施例例１．バチルス・サブチリス株168マンナナーゼの生成、精製及び特性決定バチルス・サブチリスβ−マンナナーゼを次の通りにして生成し、そして特徴
づけた：バチルス・サブチリスゲノムを、既知のバチルスsp. β−マンナナーゼ遺伝子
配列との相同性のついて調べた（Mendozaなど., Biochemica et Biophysixa Act
a 1243 : 552-554, 1995）。次のオリゴヌクレオチドを、推定上のβ−マンナナ
ーゼの成熟部分をコードする配列を増幅するために企画した：５'−GCT CAA TTG
GCG CAT ACT GTG TCG CCT GTG−３' 及び５'−GAC GGA TCC CGG ATT CAC TCA A
CG ATT GGC G−３'。

【０１２０】バチルス・サブチリス株１A95からの全ゲノムDNAを、前記プライマ−を用いて
ydhT成熟部分を増幅するために鋳型として使用した。PCRを、AMPLITAO DNA Poly
merase (Perkin Elmer, Applied Biosystems, Foster City, CA) と共にGENE−A
MP PCRキットを用いて行った。95℃で５分間の初期溶融、続いて、次のプログラ
ムの25サイクルを伴う：95℃で１分間の溶融、55℃での２分間のアニーリング、
及び72℃で２分間の延長。最後のサイクルの後、反応を72℃で10分間維持し、延
長を完結した。PCR生成物を、QIAquick PCR精製キット（Qiagen, Chatsworth, C
A）を用いて精製した。

【０１２１】バチルス・サブチリス株１A95から増幅されたydhT成熟領域を、次の通りに発
現ベクターpPG1524（前に記載されている）中に挿入した。その増幅された1028b
pのフラグメントを、MfeI及びBamHIにより消化した。発現ベクターpPG1527をEco
RI及びBamHIにより消化した。その制限生成物を、QIAquick PCR精製キット（Qia
gen, Chatsworth, CA）を用いて精製した。２つのフラグメントを、T4 DNAリガ
ーゼを用いて連結し（13時間、16℃）、そしてコンピテントE.コリ株DH5−αを
形質転換するために使用した。アンピシリン耐性コロニーを、DNA調製のために
培養した。次に、DNAを、制限分析により特徴づけた。プラスミドpPG3200は、yd
hT遺伝子の成熟領域を含む。次に、プラスミドpPG3200を用いて、コンピテント
バチルス・サブチリス株PG632を形質転換した（Saundersなど., 1992）。

【０１２２】 7個のカナマイシン耐性バチルス・サブチリスクローン及び１つのPG632対照ク
ローンを取り、そして１mlの25％マルトリン、120μlの10mMのMnCl₂及び20μlの
50mg/mlのカナマイシンにより補充された20/20/5培地（20g/lのトリプトン、20g
/lの酵母抽出物、5g/lのNaCl）20mlにおいて増殖した。クローンを、タンパク質
の発現のために、250rpm及び37℃で振盪する250mlのそらせ板付きフラスコにお
いて一晩、増殖した。

【０１２３】細胞を14,000rpmで15分間、回転せしめた。個々の上清液１μlを、50mMの酢酸
ナトリウム（pH6.0）99μlに希釈した。この希釈溶液１μlを、製造業者の説明
書に従って、エンド−１，４−β−マンナナーゼ−β−Mannazyme Tabs (Megazy
me, Ireland)を用いてアッセイした。吸光度を、Beckman DU640分光計上で590nm
で読み取った。クローン７は、1.67の最高の吸光度を示した。PG632対照は590nm
で吸光度を示さなかった。

【０１２４】上清液を、10〜20％のトリス−グリシンゲル（Novex, San Diego, CA）上で、
SDS−PAGEにより分析し，38ｋDaの予測されるタンパク質サイズを確かめた。サ
ンプルを次の通りにして調製した。ydhTクローン７及びPG632上清液のサンプル
を500μlを、55.5μlの100％トリクロロ酢酸（Sigma）により沈殿せしめ、５％
のトリクロロ酢酸100μlにより洗浄し、トリス−グリシンSDSサンプル緩衝液（N
ovex）50μlに再懸濁し、そして５分間、煮沸した。個々のサンプル１μlを、30
mAで90分間、ゲル上で電気泳動した。大きなバンドのタンパク質を、観察し、yd
hTクローン７について38kDaで実験した。

【０１２５】バチルス・サブチリスydhTクローン7の10ｌの発酵を、B. Braun Biostat C発
酵器において行った。発酵条件は次の通りであった。細胞を、20/20/5に類似す
る富化培地において37℃で18時間、増殖した。発酵実験の最後で、細胞を除去し
、そして上清液を、正接流濾過システムを用いて、１ｌに濃縮した。その濃縮さ
れた上清液におけるβ−マンナナーゼの最終収率は、３g/lであることが決定さ
れた。

【０１２６】発酵上清液からのβマンナナーゼの精製を次の通りにして行った：上清液を50
0mlを10,000rpmで10分間4℃で遠心分離した。次に、遠心分離された上清液を、S
pectrapor 12,000〜14,000分子量カットオフ膜（Spectrum）を通して、10mMのリ
ン酸カリウム（pH7.2）４l（×２）により４℃で一晩、透析した。その透析され
た上清液を、４℃で10分間、10,000rpmで遠心分離した。200mlのQ Sepharose (P
harmacia)ファーストフローアニオン交換カラムを、10mMのリン酸カリウム（pH7
.2）１lにより20℃で平衡化し、そして上清液300mlをカラム上に負荷した。

【０１２７】 210ml（サンプルA）及び175ml（サンプルB）の２種の画分を集めた。それらの
２種の画分を前記のようにしてアッセイし、但しサンプルは50mMの酢酸ナトリウ
ム（pH6.0）199μlにより希釈し、そしてそれらはそれぞれ、0.38及び0.52の吸
光度を示した。個々のサンプル２μlを、8μlのトリス−グリシンSDSサンプル緩
衝液（Novex, CA）に添加し、そして５分間、煮沸した。得られるサンプルを、3
0mAで90分間、10〜20％のトリス−グリシンゲル（Novex, CA）上で電気泳動した
。

【０１２８】 38kDaに対応する主要バンドが個々のサンプルに存在し、そして合計タンパク
質の95％以上を占めた。BCAタンパク質アッセイ（Pierce）を、標準としてウシ
血清アルブミンを用いて、製造者の説明書に従って、両サンプルに対して行った
。サンプルA及びBは、それぞれ1.3mg/ml及び1.6mg/mlのβ−マンナナーゼを含ん
だ。タンパク質の同一性を、イオンスプレー質量分析計により確かめた。

【０１２９】精製されたβ−マンナナーゼサンプルを用いて、次の通りに酵素活性を特徴づ
けた。すべてのアッセイは、上記のように、エンド−１，４−β−マンナナーゼ
β−Mannazyme Tabs (Megazyme Ireland) を使用した。pH範囲3.0〜9.0での活性
決定を50mMのクエン酸塩−リン酸塩緩衝液において行い、pH9.5での活性決定を5
0mMのCAPSO (Sigma)において行い、そして10.0〜11.0のpH範囲に関しては、CAPS
緩衝液を使用した。バチルス・サブチリスβ−マンナナーゼについての最適pHは
、6.0〜6.5であることが見出された。

【０１３０】温度活性プロフィールを、50mMのクエン酸塩−リン酸塩緩衝液（pH6.5）にお
いて測定した。バチルス・サブチリスβ−マンナナーゼは、15℃以下及び80℃以
上で有意な活性を保持した。β−１，４−ガラルトマンナンに対する比活性は、
エンド−１，４−β−マンナナーゼβ−Mannazyme Tabs (Megazyme, Ireland)
を用いて、製造業者の説明書に従って、160,000μモル/分・mgのβ−マンナナー
ゼであることが決定された。本発明のバチルス・サブチリスβ−マンナナーゼの成熟領域をコードするヌク
レオチド配列は、配列番号１に示され、そしてその誘導されたアミノ酸配列は配
列２に示される。

【０１３１】例２．洗剤への本発明の酵素の使用例１に記載のように得られた、精製された酵素は、従来のヨーロッパの条件下
で、従来の市販の液体洗剤を用いてのミニ洗浄試験において、１ppmのレベルで
試験される場合、改良された清浄性能を示した。同時に、精製された酵素１は、従来の北アメリカ洗浄条件下で、従来の市販の
液体洗剤を用いてのミニ洗浄試験において、10ppmのレベルで試験される場合、
改良された清浄性能を示した。

【０１３２】参考文献： Lever, M, (1972) A new reaction for colormetric determination of carbo
hydrates. Anal. Biochem. 47, 273-379. N.C. Carpita and D.M. Gibeaut (1993) The Plant Journal 3:1-30. Didarichsen, B., Wedsted, U., Hedegaard, L., Jensen, B. R., Sjoholm, C
. (1990) Cloning of aldB, which encodes alpha-acetolactate decarboxylase
, an exoenzyme from Bacillus brevis. J. Bacteriol. 172: 4315-4321.

【配列表】

【手続補正書】

【提出日】平成１３年２月１６日（２００１．２．１６）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 (Ｃ１２Ｎ 9/42 9/42 Ｃ１２Ｒ 1:125） //(Ｃ１２Ｎ 9/42 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:125） 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者サウンダーズ，チャールズアメリカ合衆国，オハイオ 45014，フェアフィールド，カールスバッドコート 5561 (72)発明者ベッティオ，ジャン−ルークベルギー国，ベ−1200 ブリュックセル，アブニュスレジェール 93

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ｉ）配列番号２の位置１〜位置336に示されるアミノ酸配列
を含んで成るポリペプチドを含んで成り； ii) 前記ポリペプチドと少なくとも80％相同であるｉ）に定義されるポリペプ
チドの類似体を含んで成り； iii) １又はいくつかのアミノ酸の置換、欠失又は付加により前記ポリペプチ
ドから誘導される前記ポリペプチドの突然変異又は変異を含んで成り；又は iV) 精製された形で前記ポリペプチドに対して生じたポリクローナル抗体と免
疫学的に反応する；マンナナーゼ（EC 3.2.1.78）。
【請求項２】バチルス（Bacillus）、好ましくはバチルス・サブチリス（
Bacillus subtilis）に属する株から得られる請求項１記載の酵素。
【請求項３】バチルス・サブチリス株168から単離されたDNA配列によりコ
ードされる請求項２記載の酵素。
【請求項４】（ａ）配列番号１のヌクレオチド１〜ヌクレオチド1011に示
されるヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子；（ｂ）上記（ａ）の種相同体；（ｃ）配列番号２の位置１〜位置336のアミノ酸配列に対して少なくとも80％
相同であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；（ｄ）上記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に対して相補的な分子；及び（ｅ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の縮重ヌクレオチド配列；から成る群から選択された、マンナナーゼ活性を有するポリペプチドをコード
する単離されたポリヌクレオチド分子の使用。
【請求項５】前記単離されたポリヌクレオチド分子がDNAである請求項４
記載の使用。
【請求項６】中位の緊縮条件下で変性された二本鎖DNAプローブに対して
ハイブリダイズする、マンナナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離
されたポリヌクレオチド分子の使用であって、ここで前記プローブが、配列番号
１の位置１〜位置1011に示される配列を含んで成るDNAプローブ、及び配列番号
１の位置１〜位置1011の少なくとも約1000個の長さの塩基対を有するいずれかの
副配列を含んで成るDNAプローブ、から成る群から選択されることを特徴とする
使用。
【請求項７】次の作用可能に結合された要素：転写プロモーター；（ａ）
配列番号１の位置１〜位置1011に示されるヌクレオチド配列を含んで成るマンナ
ナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子、（ｂ）上
記（ａ）の種相同体、（ｃ）配列番号２の位置１〜位置336のアミノ酸配列に対
して少なくとも80％相同であるマンナナーゼ活性を有するポリペプチドをコード
するポリヌクレオチド分子、及び（ｄ）上記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の縮重ヌ
クレオチド配列、から成る群から選択されたDNAセグメント；並びに転写ターミ
ネーターを含んで成る発現ベクター。
【請求項８】請求項７記載の発現ベクターが導入されている、前記DNAセ
グメントによりコードされるポリヌクレオチドを発現する培養された細胞。
【請求項９】（ａ）配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を含んで成
るポリペプチド分子；及び（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一であるポリペプ
チド分子；から成る群から選択された、マンナナーゼ活性を有する単離されたポリペプチ
ド。
【請求項１０】バチルス・サブチリスにより生成される請求項９記載のポ
リペプチド。
【請求項１１】請求項９記載の精製されたポリペプチドを含んで成る酵素
調製物。
【請求項１２】マンナナーゼ活性を有するポリペプチドを製造するための
方法であって、請求項７記載の発現ベクターを導入されている細胞を培養し、そ
れにより、前記細胞がDNAセグメントによりコードされるポリペプチドを発現し
；そして前記ポリペプチドを回収することを含んで成る方法。
【請求項１３】プロテアーゼ、セルラーゼ（エンドグルカナーゼ）、β−
グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、α
−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、
オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、ペクチ
ン酸リアーゼ、キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラ
ーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ペクチンリアーゼ、他
のマンナナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、トラン
スグルタミナーゼ又はそれらの混合物から成る群から選択された１又は複数の酵
素をさらに含んで成る請求項11記載の調製物。
【請求項１４】（i）同種不純物を有さず、そして（ii）請求項12記載の
方法により生成される、マンナナーゼ活性を有する単離された酵素。
【請求項１５】有効量の請求項11記載の調製物又は有効量の請求項１記載
の酵素により処理される、セルロース、又は合成ファイバー、糸、織布又は不織
布の性質を改良するための方法。
【請求項１６】前記酵素調製物又は酵素が糊抜工程段階に使用される請求
項１５記載の方法。
【請求項１７】植物材料の変性又は修飾のための方法であって、前記植物
材料を有効量の請求項11記載の調製物又は有効量の請求項１記載の酵素により処
理する方法。
【請求項１８】前記植物材料が、リサイクルされた故紙；機械的、化学的
、半化学的クラフト又は他のクラフト紙製造用パルプ；浸水工程にゆだねられた
ファイバー；又はグアーガム又はイナゴマメ（locust bean) ガム含有材料であ
る請求項17記載の方法。
【請求項１９】液体コーヒー抽出物を処理するための方法であって、前記
コーヒー抽出物を有効量の請求項11記載の調製物又は有効量の請求項１記載の酵
素により処理する方法。
【請求項２０】請求項11記載の酵素調製物又は請求項１記載の酵素を含ん
で成るクリーニング組成物。
【請求項２１】プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、ペク
チン分解酵素及びキシログルカナーゼから選択された第２酵素；並びに従来の洗
剤成分をさらに含んで成る請求項20記載のクリーニング組成物。
【請求項２２】前記酵素又は酵素調製物が、合計組成物の0.0001〜２重量
％、好ましくは0.0005〜0.5重量％、より好ましくは0.001〜0.1重量％（純粋な
酵素）のレベルで存在する請求項20記載のクリーニング組成物。
【請求項２３】前記第２酵素又は酵素調製物が、合計組成物の0.0001〜２
重量％、好ましくは0.0005〜0.5重量％、より好ましくは0.001〜0.1重量％（純
粋な酵素）のレベルで存在する請求項21記載のクリーニング組成物。
【請求項２４】前記第２酵素がアミラーゼである請求項２１記載の清浄組
成物。
【請求項２５】プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ペクチン分解酵素
及びキシログルカナーゼから成る群から選択された第３酵素をさらに含んで成る
請求項２１記載のクリーニング組成物。
【請求項２６】前記第２酵素がアルカリ性である請求項２１記載のクリー
ニング組成物。
【請求項２７】アニオン性、非イオン性、カチオン性界面活性剤、及び/
又はそれらの混合物から選択された界面活性剤を含んで成る請求項２１記載のク
リーニング組成物。
【請求項２８】漂白剤を含んで成る請求項２１記載のクリーニング組成物
。
【請求項２９】ビルダーを含んで成る請求項２１記載の清浄組成物。
【請求項３０】２つの長い鎖を含んで成るカチオン性界面活性剤を含んで
成る請求項２１記載の繊維製品軟化組成物。
【請求項３１】繊維製品の機械処理のための方法であって、請求項１１記
載の酵素調製物又は請求項１記載の酵素を含む洗浄溶液により、機械洗浄工程の
洗浄サイクルの間、繊維製品を処理することを含んで成る方法。
【請求項３２】プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、ペク
チン分解酵素及びキシログルカナーゼから選択された第２酵素と共に、請求項１
１記載の酵素調製物又は請求項１記載の酵素の、清浄及び/又は繊維製品しみ除
去のためのクリーニング組成物への使用。
【請求項３３】プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、ペク
チン分解酵素及びキシログルカナーゼから選択された第２酵素と共に、請求項１
１記載の酵素調製物又は請求項１記載の酵素の、硬質表面、例えば床、壁、浴室
のタイル及び同様のものを清浄するためのクリーニング組織物への使用。
【請求項３４】プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、ペク
チン分解酵素及びキシログルカナーゼから選択された第２酵素と共に、請求項１
１記載の酵素調製物又は請求項１記載の酵素の、手動及び機械皿洗いのためのク
リーニング組成物への使用。
【請求項３５】プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、ペク
チン分解酵素及びキシログルカナーゼから選択された第２酵素と共に、請求項１
１記載の酵素調製物又は請求項１記載の酵素の、経口、歯、コンタクトレンズ及
び身辺清浄用途のためのクリーニング組成物への使用。